AMINOCIDOS Y PROTENAS

Arboleda, M.A.1; Montao, D.H.2; Salas, W.R.3

1 alejandra.arboleda.m@correounivalle.edu.co; 2 daruin.montano@correounivalle.edu.co; 3 wilson.salas@correounivalle.edu.co

Departamento de Qumica, Universidad del Valle, Santiago de Cali, Colombia

Entrega: 17 de Septiembre de 2013

Abstract: Several qualitative and quantitative test were applied to different amino acids and proteins, in order to assess their behavior and properties. The average protein content in egg white was 10.8 % w/w, which was in agreement with the reported value. For the separation and identification of an amino acid mixture, paper chromatography was used, successfully resolving leucine, proline and glutamic acid. Finally, hystidine was titred against sodium hydroxide, which allowed the different pKas, isoelectric point (pI) to be calculated: 1.8, 9, and 6.1, for carboxylic, amino, and imidazole side-chain pKs and 2.1 for the pI.
Keywords: Amino acids, egg white protein, Biuret test, Ninhydrin test, Thin-layer chromatography, Acid-base titration, isoelectric point, pKa.

2 1 Introduccin
Las protenas constituyen gran parte del cuerpo animal: lo mantienen como unidad y lo hacen funcionar. Se las encuentra en toda clula viva. Son el material principal de la piel. Los msculos, tendones, nervios y la sangre, enzimas, anticuerpos y muchas hormonas. Desde un punto de vista qumico, las protenas son polmeros grandes. Son poliamidas y los monmeros de los cuales se derivan son los cidos -aminocarboxlicos. Una sola molcula protenica contiene cientos, e incluso miles, de unidades de aminocidos, que pueden ser de unos 20 tipos diferentes [1]. El termino aminocido define a cualquier molcula que contiene un grupo amino y un grupo acido; sin embargo, este trmino casi siempre para designar un -aminocido. [2] El contenido de protena y aminoacidos puede determinarse por varias tcnicas analticas e instrumentales. Como tcnica rutinaria, la espectroscopia de UV-Vis suele ser un mtodo relativamente rpido de anlisis, y un amplio espectro de biomoleculas presenta absorcin en el rango del visible ultravioleta. Las tcnicas cromatogrficas son tcnicas de separacin, basadas en la distribucin de los analitos en 2 fases de polaridad diferentes de acuerdo a las propiedades de los analitos. Para biomoleculas, las tcnicas ms empleadas son la cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) y la cromatografa de capa delgada.

Materiales y mtodos

La metodologa seguida, as como los reactivos empleados, fueron los mismos de las guas de laboratorio. Brevemente, se someti a la prolina y glicina, as como a la albumina y aspartame al test de ninhidrina y Biuret cualitativo. Se cuantific el contenido de protena en la clara de huevo por espectroscopia UV-Vis. Se llev a cabo la separacin de una mezcla de aminoacidos por cromatografa en papel. Finalmente se caracteriz la histidina por medio de una titulacin con hidrxido de sodio.

3 3.1

Resultados y discusin Ensayos cualitativos aminocidos y protenas en

La prdida de los niveles de estructuracin superiores al primario (conformacin y asociacin) se denomina desnaturalizacin de la protena. Se conocen casos de desnaturalizacin reversible e irreversible. Hay numerosos agentes desnaturalizantes, como el calor, pH, sales inorgnicas a concentraciones elevadas, disolventes orgnicos, etc. La desnaturalizacin conlleva cambios drsticos en las propiedades fsicas de las protenas: solubilidad, grado de hidratacin, ndice de refraccin, etc. Sus propiedades biocatalizadores desaparecen al alterarse el centro activo. Las protenas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseadas, en resumen, no son funcionales[3]. Por esta razn se sometieron a diferentes ensayos a 2 protenas y 2 aminocidos:

3.1.1 Reaccin con ninhidrina

En la tabla 1 se presentan los resultados de los diferentes ensayos, as como sus observaciones.
Tabla 1. Observaciones en el anlisis cualitativo de aminocidos y protenas: Reaccin de Ninhidrina

En el esquema 1 se muestra la reaccin general de la ninhidrina con aminocidos que contiene grupos aminos primarios.

Muestra

Albumina Prolina

Aspartame

Glicina

Observaciones Al adicionar las gotas de ninhidrina no se observ ningn cambio, pero al calentar esta cambio a un color violeta- rosado combinado con blanco. La prolina cambio de un color cristalino a un color amarillo oscuro al adicionarle ninhidrina calentarse El aspartame cambio de un color turbio a un color cristalino al principio del calentamiento y despus cambio a un color azul oscuro No se observaron cambios fsicos

Esquema 1. Reaccin general en la formacin del purpura de Ruhemann.

La prolina que tiene un grupo amino secundario, reacciono en la prctica, formando un color amarillo, la diferencia radica en que la prolina es una amina secundaria por tanto su reaccin con la ninhidrina no forma el purpura de Ruhemann si no a la formacin de un ion iminio, el cual es el posible causante de la coloracin amarilla en la reaccin, esto hace que tambin se pueda utilizar la ninhidrina para el anlisis de la prolina [7]. En el esquema 2 se presenta la reaccin general de la prolina y la ninhidrina.

La ninhidrina (agente oxidante poderoso) es un reactivo muy til para detectar aminocidos, cuando reacciona con un aminocido forma un compuestos coloreado brillante llamado purpura de Ruhemann, llamado as por su descubridor, Siegfried Ruhemann [4]. El aspartame cambio a un color azul oscuro al calentarse en presencia de la ninhidrina, debido a la formacin del compuesto de Ruhemann. La clara de huevo tambin cambio a un color morado pero muy poco intenso en una parte y un color blanco en otra parte al calentarse, esto es debido a que la mezcla con la ninhidrina fue muy poca debido a su viscosidad adems la albmina protena principal en la clara de huevo sufri una desnaturalizacin por temperatura, cuando cosemos un huevo, el calor no modifica los enlaces covalentes de la estructura primaria de la albmina. Pero si destruye los enlaces ms dbiles de hidrogeno y entonces la protena se desenrolla, opacando el color traslucido de la clara de huevo, causa del color blanco presente en el tubo de ensayo [5]. La glicina no cambio de color esto puede ser debido al pH de la solucin al cual el grupo amino de la glicina nuclefilo en la reaccin se encontraba en + su forma protonada (-NH3 ), por tanto la glicina no reacciono con la ninhidrina, si se hubiese adicionado NaOH, hasta neutralizar la solucin, hasta dejar el grupo (NH2) libre en su forma desprotonada el cual es nuclefilo en la reaccin del aminocido con la ninhidrina posiblemente se hubiese formado el complejo colorido esperado [3, 6]. 2

Esquema 2. Reaccin general de la prolina y la ninhidrina

En el esquema 3 se muestra las reacciones consecutivas as como algunos intermediarios en la formacin de purpura de Ruhemann a partir de la reaccin de ninhidrina con -aminocidos que contienen grupos amino primarios en este caso la glicina el aspartame y aminocidos de la albmina.

Esquema 3. Reacciones en la formacin del purpura de Ruhemann [3].

Los detalles de la mecnica de formacin del purpura de Ruhemann han sido objeto de debate, pero est de acuerdo en que la formacin de (VII) es una reaccin secundaria importante, que resulta de la reaccin de ninhidrina con aminocidos. En presencia de agua, la indantriona (I) existe en equilibrio con la ninhidrina (II). La reaccin inicial puede ser acorde a una base de reaccin de condensacin tipo Schiff en la triona o una simple reaccin SN2 que se traduce en el desplazamiento de hidrxido en la ninhidrina, la condensacin con el aminocido es fundamental para formacin del purpura de Ruhemann, ya que el nitrgeno sin duda proviene de este. El compuesto amino en ltima instancia resulta del ataque inicial en el carbono en posicin dos (C2) de la ninhidrina. El compuesto imino (V) se forma bajo ciertas condiciones de la oxidacin de (III). La formacin oxidativa de la imina es de acuerdo con las observaciones de McCormick y lamothe. Sus estudios sugieren que la (III), que est en equilibrio dinmico con (VIII), esquema 4 es inestable y susceptible a la hidrolisis por ninhidrina en solucin para producir la imina y la enodiol (IV). La imina (V) puede hacerse reaccionara continuacin con ninhidrina para producir el purpura de Ruhemann (VI), etapa final de la reaccin [3]. Solamente el tomo de nitrgeno del colorante proviene del aminocido. El resto del aminocido se convierte en aldehdo y dixido de carbono. Por lo tanto, todos los alfa aminocidos con grupos aminos primarios producen el mismo colorante violeta y la intensidad del color es directamente proporcional a la concentracin del aminocido.

La reaccin de Biuret es un mtodo general para la determinacin de protenas o pptidos. Es una reaccin coloreada debido a la formacin de un 2+ complejo de Cu en medio alcalino con compuestos que tengan dos o ms enlaces peptdicos. Recibe este nombre por el compuesto Biuret, cuya estructura y la del complejo coloreado (violeta) se presentan en el esquema 5.

Esquema 5. Reaccin general en la formacin del complejo de cobre (II) con protenas

Al tener la protenas ms de un grupo CONH- dan positiva la prueba de Biuret, con una intensidad de color que es uniforme para todas las protenas, ya que depende un grupo comn a todas ellas, y no de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta es la principal ventaja de este mtodo, junto con la sencillez de su prctica experimental y el bajo costo de reactivo. El principal inconveniente de este mtodo es su sensibilidad relativamente baja: es aplicable a muestras con cantidades superiores a los 100 microgramos [8]. Los dipptidos y los aminocidos dan esta prueba negativa [9]. Las protenas disuelven el hidrxido de cprico del reactivo y forman compuestos coloreados violeta o violeta-rosado que depende de la naturaleza de las protenas. Para esta prueba se utiliz la clara de huevo se disolvi muy bien con el reactivo de Biuret y cambio a un color violeta como era de esperarse debido a que los pptidos (a partir de los tripptidos) y las protenas reaccionan con el reactivo de Biuret formando un complejo de coordinacin con los pares de electrones no compartidos del nitrgeno, presentes en los aminocidos de las protenas formando el complejo de Biuret mostrado en el esquema 5. El aspartame que cambio de una solucin turbia a una solucin de color verde biche, el blanco, la glicina y la prolina cambiaron a una solucin de color azul cristalino para los cuales se esperaba que fuera esta prueba negativa debido a que no poseen enlaces peptdicos, el color azul observado pudo se debido al reactivo de Biuret que es de color azul y tio la solucin cristalina de los aminocidos o pudo ser un falso positivo debido a que la en la 3

Esquema 4. Equilibrio entre intermediarios en formacin del purpura de Ruhemann.

3.1.2 Biuret Cualitativo

En la tabla 2 se presentan los resultados del test.
Tabla 2. Observaciones del test cualitativo de Biuret

Muestra Albumina

Prolina aspartame Glicina Blanco

Observaciones La albumina se disolvi con el reactivo de Biuret y cambio a un color violeta Cambio a un color azul cristalino Primero cambio a amarillo y despus a un color verde biche. Cambio a un color azul cristalino Cambio a un color azul cristalino

estructuras de los aminocidos anteriormente mencionados el grupo amino posee un par de electrones libres los cuales pueden ser donados y aceptados por el ion cobre (II) coordinando varios aminocidos y generando el complejo de color azul, debido a que sustancia que contienen grupos carbamino, grupos CS(NH), tambin responde a la prueba. Esto implica que compuestos no proteicos que contienen los grupos necesarios responden a la prueba [10]. Por lo que se podra decir que el color verde y el color azul formado en los respectivos tubos de ensayo son falso positivos y esta prueba fue negativa para estos compuestos debido a que no se form el compuesto violeta o el compuesto violeta- rosado esperado en la prueba positiva.

trastornar las interacciones hidrofbicas, generando su desnaturalizacin.

3.1.4 Efecto del calor

La desnaturalizacin por temperatura ocurre por el aumento de la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, destruyendo las interacciones dbiles y desorganizando la estructura de la protena, de forma que el interior hidrofbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada. Las interacciones intramoleculares que estabilizan la protena en su forma nativa, son puentes de hidrgeno, interacciones salinas e interacciones hidrofbicas [13].

3.1.3 Interaccin con osmolitos, cidos y bases

En la tabla 3 se presentan los resultados de los diferentes ensayos.
Tabla 3. Observaciones de los ensayos con cidos, bases y osmolitos.

3.2

Cuantificacin del contenido de protena en la clara de huevo.

Orden de reactivos HCl/NaOH NaOH/HCl Sulfato amonio/Urea Urea/Sulfato amonio de de

Observaciones Coagulacin/No se observ cambio Gelatinizacin/Disolucin de gel; coagulacin. Coagulacin Coloracin amarilla/Coagulacin.

La desnaturalizacin debida a variaciones considerables de pH, ya sea por adicin de NaOH o HCl, afectan la envoltura acuosa de las protenas perturbando la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria lo que provoca la precipitacin o coagulacin de la protena [11]. Esta desnaturalizacin es irreversible, por lo que persiste la coagulacin incluso al volver al pH inicial. La precipitacin con sales es un proceso basado en la solubilidad, que es comnmente utilizado para purificar protenas. Las protenas se mantienen disueltas por sus interacciones con el agua, al adicionar sulfato de amonio, las molculas de agua forman enlaces ion-dipolo con los iones de la sal, disminuyendo la disponibilidad de molculas de agua en l medio, lo que aumenta la interaccin hidrofbica entre las protenas.[12] La urea forma puentes de hidrgeno con la protena, estos puentes son ms fuertes que los que existen dentro de la protena por lo que pueden 4

La cuantificacin de protenas por medio de la prueba de Biuret es posible por la formacin del complejo tetra-coordinado resultante de la interaccin de los pares de electrones no compartidos del nitrgeno (presente en los enlaces peptdicos) y los orbitales libres del ion metlico, 2+ Cu . Este complejo de coloracin purpura presenta dos mximos de absorcin de radiacin electromagntica a 330 nm y a 545 nm. La cantidad de luz absorbida por el complejo es proporcional a la intensidad del color producido, el cual, a la vez, es proporcional al nmero de enlaces peptdicos. El color alcanza su intensidad mxima a los 10 minutos del inicio de la reaccin y es estable durante al menos varias horas. [14] Con base en la curva de calibracin de la gua, y con base en el tratamiento de la muestra, se obtuvo una concentracin de 10.8 % p/p. En la tabla 4 se resumen los datos de los grupos del laboratorio.
Tabla 4. Datos grupales para el contenido de protena

# Grupo 2 3 5 s

Concentracin (% p/p) 10.8 6.6 2.2 6.5 4.3

La concentracin promedio para el grupo fue de 6.5% p/p 4.3% p/p. En la literatura se reporta entre 9.7-106% p/p [15]. La alta variacin puede ser atribuida ya sea a manejo de las muestras o diferencias entre los huevos empleados. Solo se tomaron los datos que reportan el contenido en gramos de clara, ya que no es correcto reportar el contenido en mililitros de clara, ya que no se midi la densidad de esta. Por otra parte, resultados

reportados errneamente como ppbs (mg/mL) no pueden ser tomados en cuenta.

3.3

Valoracin de histidina

En la figura 1 se presenta la curva de titulacin de la histidina (His). La curva de titulacin obtenida corresponde efectivamente a la titulacin de una especie triprtica, como lo es la His, porque consta de 3 puntos de equivalencia, determinables por medio de la grfica del pH en funcin de la derivada del pH con respecto a los miliequivalentes de OH (figura 2). Cada punto corresponde a un mximo en dicho grfico, siendo pH de 3.9 a 1.3 meq; 7.7 a 2.1 meq y 10.7 a 2.8 meq los valores determinados. El punto isoelctrico corresponde al 2 punto de equivalencia, siendo 7.6 el valor reportado, por lo que el valor obtenido en la titulacin presenta un %RSD del 1.3% siendo aceptado [16]

Cada equivalencia corresponde a la reaccin entre un miliequivalente de OH con un miliequivalente del aminocido en su forma correspondiente al pH de la solucin, como se muestra en el esquema 6. Para la 1 equivalencia, se requiri una mayor cantidad de OH (1.5 meq) para valorar la His, con respecto al valor terico (1 meq) ya que se emple cido clorhdrico para regular el pH, el cual fue

Esquema 6. Estructuras de la histidina segn el pH[16]

neutralizado en el proceso. Los valores de pK de los grupos ionizables se determinaron por medio del mtodo de los puntos de equivalencia. Este consiste en hallar el pH correspondiente al nmero de equivalentes obtenidos al promediar los equivalentes de 2 puntos de equivalencia sucesivos

Titulacin de Histidina con NaOH

14 12 10

(1)
Para el primer pKa, se toman los meq iniciales, 0, y los de la primera equivalencia, 1.3, obteniendo aproximadamente 0.6 meq. El pH asociado a dicho punto es aproximadamente 1.8, similar al valor terico para el grupo COOH de la histidina, 1.82. De manera similar el pKr fue de 6.1 y el pKNH2 fue de 9. Al ser los RSD% inferiores al 1.1%, 1.7% y 1.9% respectivamente, la titulacin fue exitosa as como la determinacin de los pKs.

pH

8 6

4 1. Valoracin de His (100 mM) con NaOH (100 mM) Figura 2 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Miliequivalentes de OH- (meq)

3.4
Derivada del pH en funcin de meq de OH- vs pH
50 45 40 35 30

Cromatografa de capa delgada

En la Figura 3 se presenta la placa de celulosa empleado para la cromatografa en papel.

pH

25 20 15 10 5 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Figura 3. Separacin de los aminocidos en una mezcla (Leu, Pro, Glu). Fase estacionaria NH4OH 2%, Fase mvil 2-propanol.

dpH/dmeq OHFigura 2. Mtodo de la primera determinacin de los pK de la histidina derivada para la

En la tabla 5 se presentan los resultados de la separacin.

Tabla 5. Clculos del Rf para los patrones de aminocidos y la mezcla problema

Analito Solvente Glu Pro Leu Muestra Mancha 1 Mancha 2 Mancha 3

Desplazamiento 5.7 cm 2.6 cm 4.3 cm 5.3 cm 2.4 cm 3.4 cm 4.9 cm

Rf

RfT [17] 0.30 0.43 0.73

Esquema 7. Estructura del aspartame

0.46 0.75 0.93 0.42 0.60 0.86

La fase estacionaria en este sistema cromatogrfico corresponde al hidrxido de amonio acuoso: El agua ocupa los poros de la celulosa mientras que el hidrxido de amonio asegura un pH bsico para la separacin, razn por la cual el cido glutmico, al ser polar posee una mayor afinidad con el agua, reflejndose en su bajo Rf [18-20]. Por otra parte, el 2-propanol al ser menos polar que el agua, hace de fase mvil, puesto que la prolina y leucina, al ser no-polares poseen una mayor afinidad y por tanto un desplazamiento mayor. La leucina posee un carcter ms hidrofbico que la prolina, por la estructura de su grupo R, lo que se traduce en un mayor Rf. Estos valores son acordes al ndice hidroptico de cada aminocido (Leu > Pro > Glu), soportando cualitativamente los Rf obtenidos. [16] La separacin e identificacin fue exitosa debido a la heterogeneidad de los aminocidos en la mezcla, ya que las marcadas diferencias en sus estructuras se reflejan en los diferentes Rfs obtenidos. De tratarse de molculas muy similares, la separacin sera difcil a causa de la resolucin del centro de la mancha. La diferencia con respecto a los valores tericos encontrados en la literatura, se debe al sistema fase estacionaria/fase mvil empleado, pues cada aminocido se comporta de manera nica ante cada sistema cromatogrfico.

2) El peso molecular de las protenas es elevado y por razones obvias, no puede determinarse por mtodos normales de la qumica orgnica. El aumento en la presin osmtica es proporcional a la concentracin molar y, en las disoluciones de proteinas es muy pequeo (peso molecular muy alto); solo puede determinarse con aparatos muy sensibles y con mucho error. Algunos mtodos tiles para determinar el peso molecular de una protena se presentan a continuacin. Anlisis qumico. Se usa cuando uno de los componentes (AA, un metal, etc.) puede determinarse con mucha precisin, el peso molecular o submltiplos de l. Ultracentrifugacin. Se usan ultracentrfugas de 60.000 a 70.000 revoluciones por minutos; la velocidad de sedimentacin se relaciona con el peso molecular por la conocida ecuacin de Svedberg. Con velocidades menores se obtiene un equilibrio de sedimentacin de cuya distribucin se deduce tambin el peso molecular (PM). Estos mtodos exigen ultracentrfugas analticas muy costosas, con sistemas pticos muy sofisticados. Columna de excusin. Para la cromatografa en columna de excusin existen tamices moleculares con tamaos de retculos escalonados. Dentro de sus lmites, la velocidad de elucin es una funcion lineal del log(PM). Disponiendo de una grfica (logPM/vol. eluido) obtenida con patrones se puede intercalar el valor del volumen eluido correspondiente al problema y deducir su PM aproximado. Electroforesis. La electroforesis en gel de acrilamida con DSS se basa en unificar la carga de todas las protenas para que la emigracin en el campo elctrico dependa solo del PM. Para ello se hierve la protena con DSS al 2%; de este modo la cadena hidrfoba del detergente se sita sobre las ramas no polares de la protena y la molcula de protena queda cubierta de cargas negativas que tapan sus cargas naturales. La migracin en estas condiciones es proporcional log del PM. 6

Preguntas

1) El aspartame (aspartilfenilalanina metil ester) es un dipptido sinttico, un edulcorante de naturaleza proteica. Es 165 a 2200 veces ms dulce que el azcar (sacarosa) y presenta muchas menos caloras que la sacarosa (16kilocalorias de azcar por cada 1kilocaloria de aspartame). En el esquema 7 se presenta su estructura [24].

3)La albumina es una protenas simple formada por una solo cadena, su aminocido N- terminal es el cido asprtico y el C-termina la leucina en la especie humana, su peso molecular es de 66.000, tiene forma de elipsoide con unas dimensiones de 141 de eje mayor y 41 de eje menor. Por titulacin se comprueba que tiene 180 grupos funcionales con actividad inica, de los que resultan 18 con cargas negativas libres en las condiciones habituales de pH y fuerza inica. Debido a la existencia en sus molculas de puentes disulfuros y grupos -SH libres, las molculas de albumina pueden unirse formando dmeros. Su pequeo tamao y el gran nmero de cargas hacen que se desplace en el primer lugar en el patrn electrofortico, su pH es de 4.7 unidades. La albmina de suero sanguneo o ser albmina se encarga de transportar sustancias de naturaleza qumica muy diversa, como cidos grasos, aminocidos, esteroides, metales (como el calcio), y numerosos frmacos, facilitando la transferencia de muchas de ellas desde la circulacin sangunea a rganos como el hgado, el rin, el intestino y el cerebro [25]. 4) La excrecin diaria de protena en personas sanas suele ser cercana a los 0.15 g; una concentracin mayor se conoce como proteinuria. Algunos ejemplos de estas variaciones de la concentracin de ciertas protenas en la orina son: en el mieloma mltiple, la excesiva produccin de inmunoglobulinas conlleva una excrecin urinaria de la protena Bence-Jones. En la pancreatitis aguda, la elevada concentracin de -amilasa en plasma permite su aparicin en la orina, al igual que hemoglobina en las anemias hemolticas o la lisozima en la leucemia mielomonoctica[26]. 5) 6) Ver discusin de resultados 7) Con una placa de considerable longitud es posible separar los 20 aminocidos, porque el Rf al ser una relacin, en una placa ms grande se pueden resolver con facilidad compuestos con Rf similares. Con respecto a su cuantificacin, existen mtodos tanto ex situ, que consisten en la elucin del componente y su cuantificacin por espectrofotometra, como mtodos in situ, basados en la correlacin matemtica existente en la forma de la forma mancha de la muestra, as como el peso de esta. Los mtodos ex situ, son laboriosos, requieren una manipulacin excesiva de la muestra, hacindolos analticamente poco adecuados, y conllevan a porcentajes de recuperacin entre el 60 y 95 % por ciento. Por su parte, los mtodos in situ son 7

rpidos, simples y evitan la menor manipulacin analtica de la muestra. Estos son aplicables en cromatografa unidimensional y bidimensional. Se emplean las relaciones entre: contenido de la mancha y forma del cromatograma, peso de la muestra y el rea o longitud del punto desarrollado. El adecuado anlisis estadstico permite un control de las variables ms sensibles a los errores. [21-22] 8) Al tratarse de un endulzante, la calidad del aspartame hace referencia a su nivel de degradacin. Por tanto se puede evaluar analizando patrones de cido asprtico y fenilalanina productos de la hidrolisis as como de aspartilfenilalanina. 9) Ver discusin de resultados. 10) La electroforesis es una tcnica analtica basada en las propiedades de una molcula cargada en un medio al cual se le aplica un campo elctrico. El movimiento de la molcula depende proporcionalmente del campo aplicado, as como de su carga, pero es inversamente proporcional a la viscosidad del medio. Puesto que cada molcula en la mezcla posee una relacin nica entre carga y tamao y su movilidad en el campo elctrico, la electroforesis se emplea como anlisis de pureza y tamao de macromolculas. 11) En general, la mezcla se inyecta en una solucin buffer sobre el medio que acta como soporte. Se procede a aplicar una diferencia de potencial, haciendo que el campo elctrico impulse las molculas cargadas a migrar hacia los electrodos. La electroforesis capilar es una versin instrumental de la electroforesis ordinaria, en donde se emplean capilares y menores tamaos de muestra para realizar la separacin; a la salida del capilar se emplea un detector ya sean espectromtricos o electroqumicos, siendo similar entonces a las tcnicas instrumentales de cromatografa. La electroforesis en gel, es empleada para analizar molculas de mayor tamao, como protenas y cidos nucleicos, requiere mayor cantidad de muestra. Al ser un medio ms viscoso, la migracin de molculas pequeas es mayor al de molculas grandes. En ambos casos, el medio soporte (relleno del capilar o gel) puede adecuarse para permitir la migracin de diferentes analitos debido a que se puede controlar el tamao de poro. Actualmente, gracias al desarrollo tecnolgico, se emplea para especiacin de biomoleculas, anlisis de frmacos, anlisis de inhibicin celular, anlisis de ADN y ARN y anlisis de muestras. [20-23]

Conclusiones

Los diferentes ensayos cualitativos permitieron caracterizar los comportamientos de las protenas y aminoacidos estudiados en diferentes condiciones de pH, temperatura, solvente, as como sus reacciones con reactivos especficos para estas biomoleculas. El contenido de protena en clara de huevo fue de 10.8% p/p. El contenido grupal presento una mayor variacin, siendo de 6.5% p/p (%RSD 62.5%), posiblemente a manejo de la muestra, degradacin de la protena, as como diferencias y calidad de los huevos. A pesar de esto, el valor que se obtuvo, est acorde con el reportado en la literatura. La cromatografa en papel permiti la exitosa separacin de los componentes de la mezcla de leucina, prolina y cido asprtico. La titulacin con hidrxido de sodio de la histidina permiti caracterizar su punto isoelctrico as como los pKas de sus grupos carboxilo, amino y cadena lateral.

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