07 - Enzimas en Alimentos

Universidad Nacional de Quilmes
rea Qumica Qumica de los Alimentos
INTRODUCCIN Junto a algunos elementos trazas, las enzimas pueden calificarse como biocatalizadores que son capaces de producir efectos mximos al actuar en cantidades mnimas. En el mbito de la bioqumica de los alimentos la enzimologa es quizs uno de los campos que se ha desarrollado ms rpidamente en los ltimos aos. Los amplios estudios realizados en esta rea han puesto en evidencia la importancia de los procesos enzimticos en la elaboracin y conservacin de los alimentos. Fenmenos tan importantes en la tecnologa actual, como las reacciones de pardeamiento enzimtico (frutas), de rancidez (grasas y aceites), de coloracin (vegetales verdes), de textura (salsa de tomate) son ejemplos muy conocidos de la intervencin de enzimas. Estas sustancias catalizadoras de los procesos vitales pueden presentarse extraordinariamente activas durante el periodo posterior a la cosecha (alimentos vegetales) y los cambios que ellas determinan pueden influir en forma considerable sobre los caracteres organolpticos, textura y presentacin del producto terminado. As como hay enzimas perjudiciales que deben ser inactivadas en el momento oportuno, hay otras que la tecnologa de los alimentos utiliza para una mejor preparacin del alimento, como lo son las enzimas de filtracin o de clarificacin, las enzimas proteoliticas, para ablandar las carnes. La glucosa-oxidasa, que permite eliminar la glucosa de ciertos alimentos, para evitar su pardeamiento posterior. Tambin ha sido motivo de interesantes estudios la adicin de enzimas de accin aromatizante a los alimentos o bebidas que durante su procesamiento han sufrido en su aroma pero han conservado sus precursores, permitiendo, de este modo, restaurar sus componentes aromticos originales. Se ha estimado de inters preparar el presente resumen con el fin de entregar en forma concentrada y sistemtica antecedentes sobre la accin de las enzimas en los alimentos, la aplicacin de las diferentes enzimas en las diversas industrias de alimentos y bebidas y las tcnicas para determinar las principales enzimas en los alimentos, al usarlas para el anlisis y control de los alimentos.
Lic. M. Alejandra Zinni
I. BOSQUEJO HISTRICO DE LA INVESTIGACIN SOBRE ENZIMAS Desde las ruinas de Troya y las pirmides de Egipto vienen evidencias del uso de levaduras como agentes esponjantes para la fabricacin del pan y, por otra parte, tambin en Babilonia y Egipto se saba cmo aplicar la levadura para hacer fermentar la cerveza. La ilustracin que encabeza estas lneas corresponde a un tallado en madera sobre una sepultura egipcia de 2.300 aos a.C., precisamente sobre estos dos productos, en cuya elaboracin intervienen procesos enzimticos. Por otra parte, las palabras en alemn e ingls para pan (Brot-bread) y cerveza (Bier-beer) derivan, segn algunos, etimolgicamente, de una misma antigua raz germnica, que tendra su origen en el proceso de la fermentacin. Esto coincidira, adems, con el hecho de que hasta fines del siglo pasado el desarrollo de ambas tecnologas corra de cierto modo en forma pareja, no siendo raro el caso que un maestro en panificacin entenda tambin en cervecera y al revs. En nuestro continente una primera informacin sobre la aplicacin de enzimas en tecnologa de alimentos proviene de Hernn Corts, al sealar que los indios mexicanos ablandaban sus carnes dejndolas envueltas durante la noche en hojas de papaya (ricas en papana). Durante siglos la fermentacin, la putrefaccin y la digestin fueron consideradas como procesos idnticos. La palabra fermento con que se design en un principio a estas sustancias proviene del trmino latn "fermentum" = levadura o (segn otros) de "fervere" = hervir, debido al desprendimiento gaseoso que acompaa a procesos enzimticos, como la fermentacin alcohlica. Sin embargo, desde hace algo ms de 100 aos el trmino de fermento se ha ido substituyendo, tambin a nivel internacional, por el de "enzima" (aplicado por Khne, en 1878), proveniente del griego "en zyme" = en levadura o, segn otros, del trmino griego: "zymos" = zumo. Esta ltima acepcin de la palabra "enzima" confirma la inexactitud de la antigua clasificacin que se haba hecho entre "fermentos figurados o celulares" y "no figurados, solubles o enzimas". En efecto, fue Eduard Buchner quien comprob mediante su brillante experiencia (que le vali el Premio Nobel de 1907) que la fermentacin alcohlica lograda por el zumo de expresin de la levadura se realizaba por la "zimasa" independientemente de toda clula viva. Actualmente se han aislado doce enzimas que se encuentran involucradas en el complejo proceso de la fermentacin alcohlica. Etapas que constituyen verdaderos hitos en la evolucin progresiva de la investigacin sobre enzimas fueron, sin duda, las siguientes: - descripcin, ya en 1526, de fenmenos relacionados con la fermentacin por el famoso Paracelso, que se adelantara a su poca por sus mltiples y reformadoras ideas cientficas; - observacin hecha en 1783 por el naturalista y fisilogo L. Spallanzani de que la carne era digerida por el jugo gstrico de animales; - descripcin por J. Liebig y F. Whler, en 1837, de la emulsina de las almendras (9 b); - aislamiento, a partir de races vegetales de una primera enzima -peroxidasaLic. M. Alejandra Zinni 2
capaz de azulear la tintura de guayacol, realizado por Planche a comienzos de 1800; - estudio de la invertasa de la miel, hecho por H. Erlenmeyer, en 1874; - elaboracin de un primer preparado enzimtico aminolitico de origen microbiano, patentado por Takamine en Japn, en 1884; - obtencin de una primera enzima en forma cristalina: la ureasa, a partir de la soya, lograda por Sumner en 1926; - mejoramiento de las tcnicas de purificacin y caracterizacin de un centenar de enzimas, lo que condujo a una verdadera "ingeniera enzimtica" en los 30 aos siguientes; - reconocimiento de la secuencia aminoacdica en una serie de enzimas importantes en la dcada del 60. - comprobacin de la estructura tridimensional de la lisozima por anlisis de rayos X, en 1965; - sntesis qumica completa de una enzima con actividad de ribonucleasa, realizada por Merrifield, a fines de la dcada del 60. Con este acontecimiento se ha logrado, en cierto modo, la meta final en la evolucin histrica de la investigacin enzimtica. La importancia actual de las enzimas en la tecnologa alimentara queda de manifiesto por el hecho que, segn las estadsticas de 1976, del volumen del mercado mundial de las enzimas, las dos terceras partes son consumidas para la elaboracin y el control de los alimentos (I). Por otra parte, segn la invitacin al Simposio Internacional sobre la utilizacin de enzimas en Tecnologa Alimentara, que tuvo lugar en Versailles, en mayo de 1982, las biotecnologas enzimticas estn adquiriendo un inters considerable, debido a la especificidad de su accin, la limitacin de sus riesgos de polucin y la posible economa de energa que a veces involucra su aplicacin (2). El carcter biocataltico de las enzimas, se justifica por el hecho de que estos agentes posibilitan, en las condiciones moderadas de su medio ambiente natural, la realizacin de mltiples reacciones que en el laboratorio o en la industria se logran, a velocidad equivalente, slo por aplicacin de agentes fsicos (temperatura, presin) el qumicos (cidos, lcalis) ms o menos violentos. II. GENERALIDADES SOBRE ENZIMAS 1. LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES BIOLGICOS. 1.1. Definiciones y Unidades de actividad (3, 5, 6). Las enzimas son biocatalizadores complejos de gran especificidad y eficiencia, producidos por las clulas de organismos vivos, que aumentan la velocidad de las reacciones biolgicas a travs de vas bien definidas y cuya actividad est sujeta a regulacin. Las sustancias sobre las que actan las enzimas, transformndolas, se denominan sustratos. La actividad de las enzimas se expresa generalmente por la velocidad de la reaccin catalizada, a travs de las siguientes UNIDADES:
UNIDAD INTERNACIONAL DE ACTIVIDAD ENZIMTICA: Es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 micromol de substrato por minuto, bajo condiciones bien definidas (condiciones estndar). Esta es la expresin bsica de la velocidad de la reaccin. Se ha sugerido que la temperatura debe ser, en lo posible, de 30C y que las otras condiciones, tales como pH y concentraciones de sustratos, debieran ser las ptimas para la actividad enzimtica. KATAL (smbolo: kat): Es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 mol de substrato por segundo. Esta unidad ha sido introducida recientemente por la Unin Internacional de Bioqumica 1 kat = 6 x 102 unidades internacionales. La Unidad Anson se ocupa cuando se usa hemoglobina como substrato: 1 Unidad Anson = aquella cantidad de enzima que, bajo las condiciones del test, libera 1 mmol de aminocidos positivos al reactivo de Folin por minuto, calculados como tirosina. (El R. de Folin - Ciocalteu para fenoles contiene tungstato y molibdato de sodio, sulfato de litio, HCl, H3PO4 y bromo y da color violeta con los aminocidos fenlicos) (36,76). ACTIVIDAD ESPECFICA: Es el nmero de unidades de enzima por mg de protena. Es una medida muy utilizada para expresar la actividad de preparaciones enzimticas. ACTIVIDAD MOLECULAR (nmero de recambio): Es el nmero de molculas de substrato, transformadas, por minuto, por una molcula de enzima. Se calcula dividiendo la velocidad mxima de la enzima por el peso molecular; es una caracterstica de las enzimas individuales y no refleja la pureza de la preparacin. Si la enzima respectiva contiene un grupo prosttico, una coenzima o un centro cataltico (vanse stos ms adelante), cuya concentracin sea medible, la actividad enzimtica puede expresarse tambin por el nmero de molculas de substrato, transformadas por minuto, por cada centro cataltico (10). 1.2. Estructura de las enzimas. Son protenas cuyo peso molecular cubre un amplio rango. Por ej., La ribonucleasa, que hidroliza los cidos ribonucleicos, tiene un PM de 13.700 daltons y est constituida por una sola cadena polipeptdica de 124 aminocidos. En cambio, la aldolasa, una enzima implicada en el metabolismo de la glucosa, est constituida por 4 subunidades de 40.000 daltons cada una. 1.3 Cofactores y Coenzimas (4-9). Existen enzimas cuya funcin cataltica se debe exclusivamente a su naturaleza proteica, pero hay otras en que sus propiedades catalticas, aunque relacionadas con su naturaleza proteica, dependen para su actividad ptima de la presencia de una estructura no proteica y termoestable llamada cofactor. Los cofactores pueden ser simples iones inorgnicos o sustancias orgnicas ms o menos complejas. Lic. M. Alejandra Zinni 4
Cuando los cofactores orgnicos estn fuertemente unidos a la protena enzimtica (por enlace covalente) y son especficos para esa enzima, se denominan grupos prostticos (p. ej., el grupo de la hemoglobina). Si los cofactores orgnicos estn ms dbilmente unidos (interaccin no covalente) a la protena y por ello no se asocian a ella permanentemente (generalmente se unen slo en el curso de la reaccin), se denominan coenzimas. La mayora de estas coenzimas derivan de las vitaminas, especialmente las del complejo B. Muchas dishidrogenasas requieren la coenzima nicotinamida-adenina-dinucletido (NAD+) o su derivado de fosfato (NADP+), las cuales provienen de la niacina. El cido pantotnico es un componente esencial de la coenzima A, la cual funciona como un transportador transitorio de grupos acilo en el metabolismo. La biotina es un transportador de dioxido de carbono en las enzimas que catalizan ciertas reacciones de carboxilacin y decarboxilacin. El cido tetrahidroflico, una forma reducida de la vitamina, el cido flico, participa en las reacciones de transferencia de grupos de un tomo. La vitamina B12, en su forma de coenzima, funciona en la transferencia de grupos alquilo de ciertas reacciones enzimticas. En el lenguaje corriente de la enzimologa, el componente proteico se denomina apoenzima y el complejo completo de protena y cofactor se llama holoenzima. Generalmente la apoenzima es inactiva como catalizador. Algunas enzimas requieren dos o tres cofactores distintos y corrientemente uno de ellos es un ion metlico. 1.4. Substratos de Enzimas. Constituyen las sustancias que son transformadas especficamente por las enzimas. Se usan para medir la actividad cataltica de las enzimas y, secundariamente, tambin para determinar el carcter especifico de una accin enzimtica. Para que una sustancia sea apropiada como substrato de una enzima debe reunir los siguientes requisitos: a) Que experimente una transformacin bien definida por la accin cataltica de la enzima; b) Que sea especfica para la enzima respectiva o el grupo muy restringido de enzimas. Ej.: el almidn para las alfa- y beta- amilasas; c) Que segn las condiciones del ensayo, previamente fijadas, no sufra una descomposicin espontnea o produzca otras reacciones no catalizadas por la enzima; d) Que la transformacin del substrato que es catalizada por la enzima. Sea fcilmente medible. Ejemplos son los siguientes: - formacin estequiomtrica de un producto coloreado; - una modificacin definida en la absorcin al ultravioleta - liberacin de un cido o de un lcali que sean medibles por titulacin (ej.: liberacin de carboxilos en la pectina por la pectino-estearasa); - si no se dan estas posibilidades, por acoplamiento con otras reacciones qumicas o enzimticas, llamadas reacciones indicadoras (por ej.: la reaccin qumica (de Lic. M. Alejandra Zinni 5
fosfatasa en leche), del fenol liberado con la dibromoquinon-clorimida para dar indofenol, de color azul). Otro ejemplo de una segunda reaccin enzimtica acoplada es la transformacin especfica de la glucosa por la glucosa-oxidasa en D-glucono-delta-lactona y perxido de hidrgeno. Este ltimo es desdoblado por adicin de peroxidasa con liberacin de oxgeno, reconocible por un reactivo cromgeno, que acta como donador de hidrgeno, como la orto-toluidina o la paraanisidina; midindose, finalmente, la intensidad de la coloracin resultante. Los substratos enzimticos pueden tener dos orgenes: Substratos naturales de las respectivas enzimas, como por ej., El almidn (para amilasas) o el etanol (para la alcohol dehidrogenasa); Derivados de substratos naturales, obtenidos por sntesis con una estructura qumica tal que an son reconocidos y transformados por la respectiva enzima con formacin de productos, ya sea coloreados o fcilmente medibles por otro mecanismo. Ejemplos son: 4-nitroanilidas de aminocidos, para proteasas, y nitrofenil-derivados de azcares, para glucosidasas. 2. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS Ya hemos mencionado que las enzimas, por ser protenas, tienen pesos moleculares altos. Esto hace difcil su caracterizacin por mtodos fsicos o qumicos. 2.1. Efecto de la temperatura sobre las enzimas (3,6). Puesto que la estructura proteica es la que determina la actividad enzimtica, cualquier causa que perturbe esta estructura puede llevar a una prdida de actividad. Aunque el rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimticas es muy estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. La temperatura ptima para la mayora de las reacciones enzimticas est, con pocas excepciones, entre 30C y 40C, en que la actividad es mxima. Al aumentar la temperatura, la velocidad de reaccin aumenta y, para casi todas las enzimas, un incremento de 10C duplica e incluso triplica la velocidad de reaccin. Por otro lado, sin embargo, ese mismo aumento de temperatura acelera tambin la inactivacin de la enzima por desnaturalizacin trmica. Para muchas enzimas la regin de inactivacin trmica extensiva est muy prxima de la temperatura ptima. Las enzimas muestran, a menudo, una marcada fragilidad trmica. Cuando se calientan a temperaturas superiores a los 50C la mayora de las enzimas, pero no todas, se denaturalizan, y unas pocas muestran desnaturalizacin cuando se enfran aproximadamente a 5C. A temperaturas bajas, aunque la actividad enzimtica procede muy lentamente, ella no se detiene del todo, hecho que debe tenerse en cuenta en la industria congeladora de alimentos. A menos que se inactiven previamente las enzimas objetables, la mayora de los alimentos congelados experimentan un considerable deterioro despus de un almacenamiento prolongado, porque a temperaturas tan bajas como -18C algunas reacciones enzimticas siguen teniendo lugar. Habitualmente la desnaturalizacin Lic. M. Alejandra Zinni 6
a alta temperatura es irreversible, debido a que se rompen las fuerzas dbiles de enlace al aumentar la vibracin trmica de los tomos componentes, fenmeno que daa la estructura tridimensional. Es importante sealar que una misma enzima, aislada de tejidos diferentes, puede tener diferente capacidad de resistencia a la desnaturalizacin suave por el calor, hecho que es til con fines de identificacin o de diagnstico. Otras aplicaciones de la desnaturalizacin por el calor son la esterilizacin de alimentos e instrumentos y la pasteurizacin de la leche; ambos procesos dependen de la destruccin rpida por calor de las enzimas esenciales de los microorganismos contaminantes. La mayora de las enzimas son, pues, muy termolbiles y habitualmente es suficiente aplicar una temperatura de 40 a 80C por 2 a 5 minutos, a fin de destruir su actividad. Es este hecho de inactivacin completa de las enzimas el que se utiliza ampliamente en la industria alimentara. En la mayor parte de los casos de preservacin de alimentos, es deseable que no haya continuacin alguna de actividad enzimtica. Si ello ocurriera se podra producir, por ejemplo, un cambio en el color de la clorifila o de los carotenoides, o producirse el pardeamiento de varios alimentos; podra alterarse el sabor de los hidratos de carbono, o producirse la rancidez de las grasas. Tambin la persistencia de actividad enzimtica podra provocar cambios en el aroma o en el valor nutritivo de las protenas (o de las vitaminas) y, finalmente, la presencia de enzimas pectinolticas puede producir un cambio total en la textura de los alimentos. El tratamiento con calor es, sin duda, un mtodo adecuado para la destruccin de microorganismos que alteran los alimentos (esterilizacin por calor y pasteurizacin). De esta manera un procesamiento trmico adecuado puede lograr simultneamente la preservacin microbiolgica y la estabilizacin de los alimentos. A veces la actividad residual de una enzima (no necesariamente objetable) se usa como prueba de la suficiencia de un proceso de tratamiento con calor. As, la ausencia de actividad fosfatasa de la leche es un buen indicador de si la leche ha sido pasteurizada adecuadamente, ya que esta enzima se inactiva completamente por la dosis de tratamiento trmico necesaria para destruir agentes patgenos. Las enzimas difieren ampliamente en su resistencia a la inactivacin trmica. Las peroxidasas vegetales son particularmente estables (120C por unos minutos no son suficientes para destruirlas del todo). La velocidad de inactivacin trmica depende tambin del pH, fuerza inica y del estado fsico de la enzima en el material alimentario: si la enzima est igualmente bien distribuida por todo el producto o adsorbida sobre partculas slidas (como ocurre con las enzimas pectinolticas y las fenolasas, las cuales estn adsorbidas en la pulpa de varios jugos de frutas). Existen situaciones en la tecnologa de alimentos en las que algunas enzimas, a Lic. M. Alejandra Zinni 7
pesar de haber sido inactivadas, se "regeneran" y su actividad se renueva despus de cierto tiempo. Este tipo de regeneracin enzimtica ha sido observada en los casos de peroxidasas (leche, verduras); catalasa (verduras); lipasa (productos de la leche) y enzimas pectinolticas (jugos ctricos). La regeneracin seria el resultado de una reorganizacin, al menos parcial, de la molcula proteica, restablecindose las estructuras de los sitios activos que haban sido alterados por la desnaturalizacin. La reversin de la desnaturalizacin es un proceso lento, pero durante el almacenamiento prolongado de los alimentos procesados habra tiempo suficiente para la regeneracin, detectable, de algunas enzimas. De esta manera, la estabilidad de los alimentos con respecto al dao de stos por las enzimas es una funcin tanto de la "profundidad" de la inactivacin trmica como del tiempo y condiciones de almacenamiento. 2.2. Efecto de las radiaciones (3). Las enzimas se afectan tambin por irradiacin con ondas electromagnticas. La inactivacin por luz ultravioleta se debera a la fotolisis de grupos disulfuro y aromticos de los aminocidos que constituyen las protenas. La inactivacin de la pepsina se atribuye a la oxidacin del grupo fenlico de la tirosina. Estos efectos sobre las enzimas son de escaso rendimiento, por lo que la luz ultravioleta no es de aplicacin prctica, desde este punto de vista, en la tecnologa alimentara. En cambio, la irradiacin de los alimentos con radiaciones ionizantes (radiaciones beta, gamma, etc.) es de considerable importancia en el procesamiento de alimentos y ya est en uso en escala comercial. Uno de los mayores problemas en este campo es el hecho de que la destruccin de las enzimas requiere de dosis de radiacin mucho ms elevadas que para la destruccin de los microorganismos. En algunos casos es ms prctico utilizar en forma combinada calor e irradiacin para inactivar enzimas. La actividad lipoxidasa puede reducirse al 67% de su valor inicial por irradiacin a pH7 con 9x 104 rad. Existe una prdida adicional postradiacin. Si la enzima se irradia y luego se calienta, el efecto de ambos tratamientos es sinrgico. Si la enzima se calienta primero y luego se irradia, el efecto es meramente aditivo. 2.3. Efecto de la humedad (3,4). En los alimentos, al igual que en cualquier sistema biolgico, el agua es uno de los componentes ms importantes. Por ser un solvente, el agua sirve para poner en contacto a las diversas molculas que interactan. Adems, la reactividad de muchas sustancias depende de la disociacin inica y de la configuracin molecular y, por lo tanto, de la hidratacin. El agua es a menudo uno de los reactantes o uno de los productos de la reaccin. Hoy se sabe que la influencia del agua sobre la reactivacin del sistema no est relacionada slo con el contenido real de agua, sino tambin con el estado de las molculas de agua. La disponibilidad de agua es una funcin tanto del contenido como del estado y se expresa adecuadamente por el concepto denominado "actividad del agua" () que Lic. M. Alejandra Zinni 8
equivale a la relacin entre la presin de vapor de agua sobre el sistema (p) y la presin de vapor del agua pura (Po) a la misma temperatura: = P/Po Si los alimentos fueran simples mezclas de agua con sustancias inertes que no interactan de ninguna manera con las molculas de agua, la actividad del agua seria siempre 1, cualquiera sea el contenido de agua. Los alimentos son sistemas en los cuales parte del agua est fuertemente absorbida sobre la superficie de sustancias polimricas (protenas, carbohidratos macromoleculares). Esto queda claramente establecido por el hecho que la presin de vapor del agua sobre un alimento con un contenido de humedad bajo o intermedio es considerablemente menor que el que predice la Ley de Raoult. Esto se conoce como "agua ligada". En estos casos; la actividad del agua es inferior al valor que le correspondera por su concentracin. Una de las razones para este efecto es el hecho que el "agua libre" est parcialmente atrapada en la estructura porosa del alimento y, por lo tanto, est sujeta a la accin depresora de los capilares sobre la presin de vapor. A niveles ms altos del contenido de humedad el sistema se comporta en realidad como una solucin acuosa. De hecho la concentracin molar de los solutos es habitualmente tan baja que la actividad del agua pronto alcanza valores cercanos a la unidad. La disponibilidad de agua, medida como actividad del agua, tiene una fuerte influencia sobre la velocidad de las reacciones por enzimas, es decir, la actividad enzimtica aumenta al aumentar el contenido de "agua libre" y ello ocurre no slo en las reacciones hidrolticas, en las que el agua es uno de los reactantes obvios, sino tambin en las reacciones no-hidrolticas. La velocidad de las reacciones enzimticas se ve fuertemente influida por la naturaleza y concentracin de los solventes. En la prctica es de gran importancia el efecto de la cantidad de humedad de los alimentos sobre la velocidad de la reaccin enzimtica. Incluso en los alimentos denominados desecados la accin enzimtica procede a una velocidad medible. A niveles muy bajos de humedad, la actividad enzimtica puede ser afectada cualitativamente. Es el caso de la -amilasa que a una humedad del 20 %o (o 4% de "agua libre") produce principalmente glucosa y maltosa a partir de almidn. A niveles ms elevados de humedad se forman tambin otros oligosacridos. Quizs lo que ocurre es que a niveles muy bajos de "agua libre", la rigidez del medio impide la difusin de la enzima o del sustrato, limitndose as la hidrlisis a aquellas porciones del sustrato que estn en contacto inmediato con la enzima. En los cereales y harinas almacenados es posible detectar, fcilmente, actividad lipoltica y proteoltica. A niveles de humedad superiores a 15% esta actividad es debida, generalmente, a las enzimas de los hongos que crecen en el cereal y que pueden participar tambin en las reacciones hidrolticas, desarrollndose amargor o rancidez por la accin enzimtica sobre la fraccin proteoltica o lipdica durante el almacenamiento. Los mtodos modernos de liofilizacin de carnes y verduras han introducido problemas similares a estas industrias. La actividad enzimtica se determina Lic. M. Alejandra Zinni 9
generalmente en estos casos por mtodos autolticos, ya que la velocidad de la reaccin enzimtica es baja. Por ejemplo, en el msculo de cerdo liofilizado se usa la desaparicin del glucgeno muscular como un ndice de actividad enzimtica a diferentes niveles de humedad. 2.4. Efecto del pH y del estado inico (3,6). La actividad enzimtica guarda tambin relacin con el estado inico de la molcula y, especialmente, de la parte proteica, puesto que las cadenas polipeptdicas contienen grupos que pueden ionizarse (principalmente grupos carboxilos y aminos de los aminocidos constituyentes) en un grado que depende del pH existente. Como ocurre con las protenas, las enzimas poseen un punto isoelctrico al cual su carga libre neta es cero. El pH del punto isoelctrico, como regla, no es igual al pH al cual se observa actividad mxima. El pH ptimo de las enzimas varia ampliamente; la pepsina, que existe en el medio cido del estmago, tiene un pH ptimo de alrededor de 1,5, mientras que la arginasa tiene un pH ptimo de 9,7. Sin embargo, la gran mayora de las enzimas tienen un ptimo entre pH 4 y 8. Algunas enzimas muestran una amplia tolerancia a los cambios del pH, pero otras trabajan bien slo en un rango estrecho. Cualquier enzima que se someta a valores extremos de pH, se desnaturaliza. Esta sensibilidad de las enzimas a la alteracin del pH es una de las razones por la que la regulacin del pH del organismo es controlada celosamente y explica por qu las desviaciones de la normalidad pueden implicar graves consecuencias. Muchas enzimas existen en el organismo a un pH ms bien alejado de su valor ptimo. Esto se debe, en parte, a la diferencia del medio ambiente "in vivo" con respecto al "in vitro". Esto recalca tambin que el control, del pH puede representar un importante medio para regular la actividad enzimtica. Las protenas sufren cambios en su solubilidad, presin osmtica y viscosidad a diferentes valores de pH. Es probable que el cambio en la actividad enzimtica, al variar los valores de pH, se deba a los cambios en la ionizacin ya sea de la enzima, del substrato o del complejo enzima-substrato. Al determinar la velocidad de reaccin de una enzima y para cierta concentracin de sustrato, a diferentes valores de pH, se observa que la curva resultante tiene forma de campana. Se le denomina curva de pH: actividad. Esta curva no caracteriza, necesariamente, a una enzima, puesto que el pH ptimo puede variar para diferentes substratos, ni tampoco son similares las curvas de pH: actividad para dos enzimas que hidrolizan el mismo enlace en un substrato. Por ejemplo, las pectinometilesterasas hidrolizan especficamente los enlaces ster de polimetilgalacturonatos. La pectinometilesterasa obtenida de un hongo tiene un pH ptimo de 5,0; la de frijoles tiene su ptima actividad a pH cercano a 8,5. Estas diferencias sobre los pH ptimos de enzimas que actan sobre substratos similares es de la mayor importancia en el procesamiento de alimentos. Una enzima tiene que tener buena actividad proteoltica a un pH de 4,5 a fin de ser una enzima a prueba de congelacin, o a niveles de pH superiores a 5,5 para ser un buen ablandador de carne. Para la mayora de las aplicaciones prcticas, el pH del Lic. M. Alejandra Zinni 10
alimento no puede ser ajustado como para adecuarlo al pH ptimo de una enzima determinada. La enzima debe escogerse en base a su actividad al pH natural del alimento. Existen algunas excepciones notables en que es factible y prctico el ajuste del pH. Para la produccin de glucosa, la pasta de almidn se ajusta a un pH entre 5 y 7 para la hidrlisis ptima por la alfa-amilasa bacteriana. En cambio, el pH se ajusta entre 4 y 6 para la ptima sacarificacin por la amilasa de hongos o de cereales. La velocidad de inactivacin de las enzimas vara para los diferentes valores de pH y, por lo tanto, un alza en la temperatura puede cambiar el pH ptimo. As, en la industria de cereales el aumento de temperatura hace variar el pH ptimo de la beta-amilasa hacia valores ms altos de pH. Puede aplicarse una variacin intencional del pH para destruir especficamente una enzima como, por ejemplo, la inactivacin diferencial de alfa-amilasa y proteasas en preparaciones enzimticas de hongos. Es necesario recalcar, sin embargo, que el trmino "pH ptimo" no tiene una significacin fsico-qumica bien definida. Es mejor, en general, referirse a un rango de pH favorable para una reaccin dada. Este rango depende no slo de la naturaleza de la enzima particular, sino tambin del substrato y de la concentracin de ste, de la estabilidad de la enzima, de la temperatura y de la extensin del periodo de reaccin. 2.5. Sitio activo y especificidad enzimtica (5,8). Algunas enzimas tienen una especificidad prcticamente absoluta para un determinado substrato y no atacarn ni siquiera a molculas muy relacionadas. Por ejemplo, la enzima aspartasa cataliza la adicin reversible de amoniaco. Al doble enlace del cido fumrico, pero a ningn otro cido no saturado. La aspartasa tambin presenta una rgida estereoespecificidad y especificidad geomtrica; por eso no desamina D-aspartato ni adiciona amonaco al maleato, que es el ismero geomtrico-cis del fumarato. Otro ejemplo de especificidad absoluta es el de la maltasa verdadera, que slo desdobla al azcar maltosa. En el otro extremo estn las enzimas que tienen una especificidad relativamente amplia y actan sobre muchos compuestos que presentan una caracterstica comn. Por ejemplo, la fosfatasa de rin cataliza la hidrlisis de muchos steres diferentes del cido fosfrico, pero a velocidades variables. Otro ejemplo lo constituyen las lipasas, que pueden romper la unin entre el cido y el alcohol en el lpido, en tanto sta sea una unin ster (desdoblan igual etilbutirato que un triglicrido). Del estudio de la especificidad de las enzimas por el substrato surgi la idea de que existe una relacin complementaria tipo llave-cerradura entre la molcula de substrato y un rea especfica sobre la superficie de la molcula de la enzima, denominada el sitio activo o sitio cataltico, al cual se une la molcula del substrato, mientras experimenta la reaccin cataltica. Dos caractersticas estructurales determinan la especificidad de una enzima por su substrato: a) el substrato debe poseer el enlace qumico especfico o unin, que puede ser atacado por la enzima, y b) el substrato debe tener habitualmente algn Lic. M. Alejandra Zinni 11
otro grupo funcional, un grupo de unin, que se une a la enzima y ubica en posicin a la molcula de sustrato de modo que el enlace susceptible se disponga apropiadamente en relacin al sitio activo de la enzima. 2.6. Isoenzimas (6,9). Los isoenzimas constituyen formas moleculares mltiples de una misma enzima que catalizan fundamentalmente la misma reaccin, pero difieren en sus propiedades qumicas, fsicas, estructurales o inmunoqumicas; Se originan estas diferencias en su biosntesis, debido a causas genticas. Su diferencia radica en la estructura primaria de su protena, ocurriendo como dmeros o tetrmeros, compuestos ya por subunidades idnticas o no. Muchas enzimas existen en la misma especie o tejido y aun dentro de la misma clula. A menudo limitadas a un rgano, pueden pertenecer, sin embargo, tambin a organismos diferentes (enzimas isodinmicas). Uno de los ejemplos ms conocidos de isoenzimas es el de la dehidrogenasa lctica que est presente en los tejidos animales en 5 formas, separables por electroforesis. Estas 5 isoenzimas estn constituidas por la combinacin de dos clases diferentes de cadenas polipeptdicas, de un peso molecular de 33.500 cada una: Las cadenas "M" (de msculo) y "H" (de heart, corazn). Para identificar y diferenciar isoenzimas se usan mtodos cromatogrficos (en columna); electroforticos (en papel o gel); inhibidores qumicos (ditio-treitol) o los respectivos antisueros contra isoenzimas. Estos ltimos representan anticuerpos inhibidores obtenidos por va inmunolgica (de sueros ovinos o caprinos) que actan generalmente por precipitacin en la solucin reactiva, al ser insoluble el complejo enzima - antisuero. La identificacin y diferenciacin de isoenzimas tiene aplicacin en el diagnstico de ciertas enfermedades para poder localizarlas en un determinado rgano como, por ejemplo, en el infarto cardiaco, mediante las isoenzimas de la creatinfosfokinasa (CPK). 3. MECANISMO DE LA CATALISIS ENZIMTICA (5,8). 3.1. La energa de activacin y los efectos de los catalizadores. Una reaccin qumica tal como A que se convierte en P tiene lugar debido a que un cierto nmero de las molculas A, en un momento determinado, poseen ms energa que el resto de la poblacin, suficiente para alcanzar un estado "activado", en el cual puede formarse o romperse un enlace qumico, para formar el producto P. Se denomina energa libre de activacin a la cantidad de energa en caloras que se requiere para llevar todas las molculas de un mol de una sustancia, a una temperatura dada, al estado reactivo. Por estado de transicin se entiende el estado, rico en energa, de las molculas reaccionantes en el tope o cumbre de la barrera de activacin, sobrepasada la cual, se produce la reaccin. La velocidad de una reaccin qumica es proporcional a la concentracin de las molculas en estado de transicin. La velocidad de una reaccin qumica puede Lic. M. Alejandra Zinni 12
acelerarse, subiendo la temperatura (la cual aumenta el movimiento trmico y la energa, aumentando as el nmero de molculas en est estado de transicin) o mediante un catalizador, el cual acta haciendo bajar la energa de activacin. Los catalizadores, como las enzimas, se combinan con los reactantes y producen un estado de transicin que tiene menos energa libre que el estado de transicin de la reaccin no catalizada: Ellos no alteran los equilibrios de reaccin. Una vez formados los productos de la reaccin, el catalizador libre es nuevamente regenerado. 3.2. El mecanismo de la accin enzimtica. No se conoce bien an el mecanismo preciso de la catlisis para ninguna enzima. Sin embargo, se sabe que los cidos y bases (es decir, dadores y aceptores de protones, respectivamente) son catalizadores muy verstiles, que pueden aumentar las velocidades de muchos tipos de reacciones orgnicas, tales como la hidrlisis de steres y de compuestos fosforilados, la adicin de agua a grupos carbonilos, as como la eliminacin de agua de los alcoholes para producir compuestos no saturados. Se puede extrapolar esto a las enzimas, las que contienen grupos dadores de protones (NH3+ carboxilos, sulfhidrilos) as como grupos aceptores de protones (NH2 y carboxilatos -COO). Tambin los grupos nucleoflicos son catalizadores eficaces. Se trata de grupos funcionales ricos en electrones que pueden donar un par de electrones al ncleo de algn otro tomo. Grupos nucleoflicos tpicos son los grupos hidroxilo, sulfhidrilo e imidazol, que se sabe estn tambin presentes en las protenas. Es as que en diferentes enzimas son ciertos grupos funcionales de los aminocidos integrantes de su molcula proteica los que participan como centro activo en el proceso cataltico, como sucede con el grupo epsilon-amino de la lisina (base de la determinacin de la llamada "lisina aprovechable") (11), el grupo sulfhidrlico de la cistena, CH2OH el de la cerina y el resto imidazlico de la histidina. 4. REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA (6,8). 4.1. Mecanismos reguladores. a) Variaciones por accin de masas. Es el mecanismo regulador ms primitivo y mediante l la velocidad de la reaccin puede variarse, alterando la concentracin del substrato, del producto (si la reaccin es lo suficientemente reversible como para que la concentracin del producto afecte significativamente la reaccin opuesta) o de cualquiera de los cofactores que intervienen estequiomtricamente en la reaccin. b) Variacin de la actividad especfica de la enzima por activacin o inhibicin. Se ha hecho evidente que las enzimas estn sujetas a la regulacin de su capacidad cataltica, ya sea en direccin positiva o negativa, o en ambas, mediante molculas pequeas que han sido denominadas efectores o moduladores. Este tipo de sustancias Lic. M. Alejandra Zinni 13
incluye substratos, productos, metabolitos posteriores a una va metablica, precursores de una ruta metablica e incluso metabolitos que participan en una va metablica aparentemente no relacionada. En la mayora de los sistemas multienzimticos, es decir, aquellos en que intervienen secuencialmente varias enzimas y en que el producto de una es el substrato de la siguiente, la primera enzima de la secuencia funciona como reguladora de la velocidad de todo el sistema y se denomina enzima reguladora o enzima alostrica. Habitualmente esta enzima es inhibida por el producto final de la secuencia, de tal modo que cuando se produce acumulacin del producto final por sobre cierta concentracin crtica, ste inhibe a la primera enzima de la secuencia (enzima reguladora), interrumpiendo o cerrando as ese segmento del metabolismo. Este tipo de inhibicin se conoce como inhibicin por producto final o retroinhibicin (inhibicin "feedback"). Las enzimas reguladoras o alostricas estn formadas por dos a ms subunidades, las que tienen sitios de unin no slo para su substrato normal, sino tambin para el metabolito regulador, el cual se denomina efector o modulador alostrico. El sitio de unin para el modulador se denomina sitio alostrico y es altamente especifico para ese metabolito. Cuando el sitio alostrico est desocupado, la enzima funciona con su velocidad cataltica normal; en cambio, si est ocupado por el metabolito regulador, la enzima sufre una modificacin en su conformacin a una forma menos activa o ms activa, dependiendo de s el modulador es inhibidor o estimulador. La inhibicin de la actividad enzimtica por molculas especificas y por iones es importante porque sirve como mecanismo de control mayoritario en los sistemas biolgicos. Tambin muchos frmacos y agentes txicos actan inhibiendo a las enzimas. Es ms, la inhibicin enzimtica puede suministrar una idea acerca del mecanismo de la accin enzimtica. La inhibicin enzimtica puede ser reversible o irreversible. En la inhibicin irreversible, el inhibidor queda covalentemente unido a la enzima o ligado tan fuertemente, que su disociacin de la enzima es lenta; produciendo una modificacin permanente de algn grupo funcional del sitio activo de la enzima. Ejemplos de los inhibidores irreversibles son las sales de metales pesados y el yodoacetato que se fijan en los esenciales grupos sulfhidrlicos de enzimas y, por otra parte, el di-isopropil-fluorofosfato (uno de los potentes gases txicos del sistema nervioso) que inhibe a la enzima acetilcolinoesterasa al unirse a una serina fundamental del sitio activo, bloquendolo. La inhibicin reversible, en cambio, se caracteriza por un rpido equilibrio entre el inhibidor y la enzima. Ejemplos lo constituyen la inhibicin competitiva y la no competitiva. Los inhibidores competitivos son aquellos cuya accin puede ser revertida aumentando la concentracin de substrato. Habitualmente tienen una estructuran con l, por unirse al sitio activo. Un ejemplo es el malonato, que se asemeja al succinato y por ello inhibe e la succinato-deshidrogenase. El inhibidor no competitivo no se une al sitio del substrato, sino a un grupo de la enzima, que es esencial para su funcin. La inhibicin no competitiva no puede ser Lic. M. Alejandra Zinni 14
revertida por el substrato. Un ejemplo lo constituye la inhibicin de algunas enzimas que contienen Fe, por el cianuro, el cual se combina reversiblemente con el tomo de Fe, dando una forma inactiva. c) Variacin de la concentracin de la enzima. Hoy se reconoce que uno de los principales mecanismos reguladores se basa en la alteracin de la cantidad absoluta de enzima en la clula. La concentracin de la enzima es la resultante entre las velocidades que llevan a su sntesis y a su degradacin. Se denomina induccin al aumento de la concentracin de la enzima por aumento de la concentracin de sustrato (slo para el caso de enzimas no constitutivas). d) Importancia de los biorreguladores. La induccin de la sntesis de carotenoides puede lograrse, en teora, en cualquier especie que porte los genes que codifican para las enzimas que sintetizan dichos carotenoides (todas las frutas ctricas, damascos, duraznos, tomates, zanahorias). Esta universalidad de efecto sugiere que los biorreguladores actan a travs de una va comn. La des-represin de un gen especifico, pues, puede revertir los efectos de aquellas sustancias qumicas que se sabe reprimen los genes que codifican la formacin de carotenoides en Ficomices. El nico proceso ligeramente comparable es el del uso del etileno para promover la maduracin de frutas ctricas y tomates; Sin embargo, el etileno es un estimulador amplio, que acelera toda la actividad metablica en la fruta no madura (77). Los biorreguladores, en cambio, estimulan slo vas metablicas especificas en frutas completamente maduras. Podra ser posible encontrar otros biorreguladores para aumentar el contenido de un determinado aminocido en el maz o aumentar la concentracin de protenas en el arroz, etc. en su sntesis y represin a su disminucin por disminuir la sntesis. La sntesis de protenas, y por lo tanto de las enzimas, est regulada primordialmente a nivel de la transcripcin del DNA, para dar RNA mensajero. La transcripcin de un gen o de un grupo coordinado de genes (lo que se llama un opern) puede reprimirse al unirse una sustancia represora a un gen operador que forma parte del opern. Puede des-reprimirse (o sea, producir induccin) por la presencia de ciertos metabolitos reguladores (molculas inductoras), que puede ser un substrato de la enzima codificada por el gen reprimido. Este tipo de mecanismos reguladores que implica alteracin en la velocidad de sntesis de una enzima conlleva una apreciable cantidad de tiempo (desde una hora hasta varios das). 4.2 Importancia de la induccin y represin enzimticas para mejorar la calidad de los alimentos: Los biorreguladores (12). Actualmente es posible mejorar la calidad nutritiva y las caractersticas fsicas de las cosechas de alimentos mediante el uso de biorreguladores, los cuales permiten Lic. M. Alejandra Zinni 15
manipular la expresin gentica de las plantas individuales. El uso de biorreguladores en los frutos ctricos des-reprime genes especficos de los frutos, induciendo la produccin de cantidades adicionales de componentes que aumentan su color, sabor, aroma y calidad nutricional (provitamina A). Hay varias clases de biorreguladores que inducen la formacin de carotenoides (carotenos, licopeno), cuando se aplican en bajas concentraciones a la superficie del fruto ctrico maduro. Entre ellos estn los derivados de las chalconas de la trietilamina y de la dietilnonilamina. Los biorreguladores pueden aportar una nueva arma para aprender ms acerca de los mecanismos que controlan los genes. Su futuro es muy promisorio, como lo demuestran los recientes trabajos de Yokoyama y su grupo en el laboratorio del Depto. de Agricultura en California (12). Ellos han identificado, adems de los biorreguladores ya mencionados, otros que aumentan el aroma, como, por ejemplo, uno que induce 3,5 veces el contenido en citral de los limones maduros, un constituyente de la esencia que contribuye en forma importante al aroma del limn. III. CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS CLASIFICACIN GENERAL. Actualmente, mas de mil enzimas han sido aisladas y clasificadas de acuerdo con el substrato especfico sobre el cual actan. Entre las numerosas clasificaciones, algunas se basan en las reacciones que catalizan las enzimas, otras en el substrato sobre el que actan e incluso muchas enzimas se designan con nombres triviales de origen histrico. La comisin de Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica introdujo en 1964, para uniformar la nomenclatura, la siguiente clasificacin sistemtica, en la cual se consideran 6 grupos principales de enzimas de acuerdo al tipo reaccin implicada: 1. Oxidorreductasas Catalizan una amplia variedad de reacciones de xido-reduccin, empleando coenzimas, tales como NAD+ y NADP+, como aceptor de hidrgeno. Este grupo incluye las enzimas denominadas comnmente como deshidrogenasas, reductasas, oxidasas, oxigenasas, hidroxilasas y catalasas. 2. Transferasas Catalizan varios tipos de transferencia de grupos de una molcula a. otra (transferencia de grupos amino, carboxilo, carbonilo, metilo, glicosilo, acilo, o fosforilo). Ej.: aminotransferasas (transaminasas). 3. Hidrolasas Catalizan reacciones que implican la ruptura hidroltica de enlaces qumicos, tales como C=O, C-N, C-C. Sus nombres comunes se forman aadiendo el sufijo -asa al nombre de substrato. Ejs.: lipasas, peptidasas, amilasa, maltasa, pectinoesterasa, fosfatasa, ureasa. Tambin pertenecen a este grupo la pepsina, tripsina y Lic. M. Alejandra Zinni 16
quimotripsina. 4. Liasas Tambin catalizan la ruptura de enlaces (C-C, C-S y algunos C-N, excluyendo enlaces peptdicos), pero no por hidrlisis. Ejs.: decarboxilasas, citrato-liasa, deshidratasas y aldolasas. 5. Isomerasas Transforman sus substratos de una forma isomrica en otra. Ejs.: Epimerasas, racemasas y mutaras. 6. Ligasas Catalizan la formacin de enlace entre C y O, S, N y otros tomos. Generalmente, la energa requerida para la formacin de enlace deriva de la hidrlisis del ATP. Las sintetasas y carboxilasas estn en este grupo. CLASIFICACIN DE LAS ENZIMAS DE LOS ALIMENTOS Braverman (4) distingue dos importantes grupos de enzimas de los alimentos: las Hidrolasas y las Desmolasas o Enzimas Oxidantes (3, 14). 1. LAS HIDROLASAS comprenden las: 1.1. ESTERASAS, entre las cuales son de importancia en los alimentos: a) Lipasas, que hidrolizan los steres de cidos grasos; b) Fosfatasas, que hidrolizan los steres fosfricos de muchos compuestos orgnicos, como, por ejemplo, glicerofosfatos, almidones fosforilados: c) Clorofilasas. En la industria alimentara debe tratarse de retener el color verde de la clorofila, en el caso de los vegetales deshidratados o en conservas. Por ello puede protegerse el color natural (retencin de clorofila de hasta 60%) por los siguientes tratamientos: - Pretratamiento por inmersin (ej., Arvejas), a temperatura ambiente, en solucin de bicarbonato de sodio al 2% por espacio de 30 a 40 min. - Escaldado en solucin de hidrxido de calcio 0,005 M. - Procesamiento en salmuera, que lleva adicionada hidrxido de magnesio (0,0200,025 M.) . El pH en estos casos se eleva a 8 en el primer tiempo y se mantiene durante el escaldado y la esterilizacin posterior. d) Pectino-esterara, enzima importante en la industria de derivados de frutas (vanse stas) . 1.2 CARBOHIDRASAS, que se clasifican en: a) Hexosidasas, entre las que interesan la invertasa y la lactasa; y b) Poliasas, que comprenden las amilasas, las celulasas y la poligalacturinasa o pectinasa, que acta sobre el cido pctico o poligalacturnico, dando molculas Lic. M. Alejandra Zinni 17
de cido galacturnico, carentes de poder gelificante; de importancia en la elaboracin de zumos y nctares de frutas. 1.3 PROTEASAS, que se clasifican en: a) Proteinasas, endoenzimas que rompen las uniones peptdicas: -CO-NH de las protenas, algunas de las cuales son muy resistentes al ataque de la enzima proteoltica, en su estado nativo; por el calor u otros agentes se puede abrir la molcula proteica, de modo que entonces las uniones peptdicas pueden ser atacadas por estas enzimas; b) Peptidasas, que rompen las uniones de los pptidos hasta la liberacin final de molculas deaminocidos; c) Catepsinas, a cuya accin en el msculo proteico se deben los procesos autolticos en la maduracin de la carne. El tejido vivo tiene un pH desfavorable para la accin de estas enzimas, pero a la muerte del animal baja el pH al acumularse cido lctico por degradacin del glicgeno. Al alcanzar un pH 4,5 se hace ptimo para la liberacin y accin de la enzima, apareciendo los respectivos cambios en la textura y dems caracteres de la carne, y d) Renina, Quimosina o Fermento Lab, que se encuentra en el cuarto estmago del ternero alimentado slo con leche materna y que causa la coagulacin de la leche (Vase en "Aplicacin de enzimas en la Industria Lechera") . 2. DESMOLASAS O ENZIMAS OXIDANTES. Entre ellas son de inters en alimentos: 2.1 Oxidasas, que comprenden: a) Las Oxidasas Frricas: Catalasa, responsable de la prdida de color y olor de vegetales congelados, y Peroxidasa, que se encuentra en verduras y frutas ctricas. Su estudio es de gran inters en la industria de alimentos por ser una de las enzimas ms estables al calor y requerir mayor tiempo de inactivacin, con el agravante de que en ciertas condiciones puede regenerar su actividad con el tiempo; b) A las Oxidasas Cpricas pertenecen la poli fenol-oxidasa, tirosinasa, catecolasa, relacionadas con el Pardeamiento Enzimtico (vase ste) y la ascrbico-oxidasa. 2.2 Dehidrogenasas. Entre stas se encuentran las enzimas siguientes: Xantino-oxidasa, que es una flavoprotena con molibdeno y cataliza la oxidacin de xantina y aldehdos como el frmico, actuando como aceptor de H el azul de metileno, al transformarse en su leuco-derivado; en esto se basa su aplicacin analtica en el control trmico de la leche y en la deteccin de leche de vaca en leche humana, pues esta ltima no contiene esta enzima; Lipoxidasa, que cataliza la oxidacin de cidos grasos poliinsaturados y secundariamente tambin al caroteno de frutas y verduras deshidratadas, a travs de los perxidos formados. 18
V. METODOS GENERALES PARA LA OBTENCIN INDUSTRIAL DE ENZIMAS 1. Durante siglos las enzimas fueron utilizadas, formando parte de clulas o extractos crudos de materiales vegetales, animales y microbianos. As sucedi en forma totalmente emprica, sin conocerse su modo de accin, ni el porqu de su actividad cataltica en la industria de la fermentacin como en la cerveza, vino, pan y queso. An suele emplearse una enzima til producida por una bacteria, una levadura o un trozo de tejido, sin siquiera extraerla de las clulas. Por ejemplo, el Acetobacter aceti puede servir para oxidar el alcohol y convertirlo en cido actico sin purificar antes la oxidasa del alcohol. La levadura fermenta el azcar y lo convierte en alcohol sin que se efecte la extraccin del complejo cimasa; las muchas otras enzimas que contiene la levadura no estorban la reaccin, a causa de que tienen otras actividades especificas. 1.1. El desarrollo de fuentes para producir enzimas de uso en la industria alimentara, de mtodos de aislamiento y purificacin y el diseo de reactores enzimticos, que permiten su aplicacin en diversos procesos, ha evolucionado en forma considerable y ha dado origen a un rea interdisciplinaria conocida hoy da como "ingeniera enzimtica", como nuevo enfoque de la biotecnologa (13, 15). Hoy se ha logrado obtener enzimas ms puras, que tienen las siguientes ventajas sobre los productos de fermentacin: - accin ms especifica en su funcin cataltica; - actividad predecible y controlable, y - es posible utilizar concentraciones ms elevadas del substrato. 1.2. Las principales fuentes de enzimas usadas en la industria de alimentos son de diferente origen: a) Vegetal: Lipasas y pectinoesterasa se elaboran a partir de soya, ricino y frutas ctricas; del germen de trigo se extrae la alfa-amilasa. Las proteasas se obtienen de la papaya, del higo, de la pia y la peroxidasa, del rbano picante; b) Animal: La renina, pepsina, tripsina, quimotripsina, catalasa y lipasa pancretica son de origen animal; c) Microbiano: Las enzimas de los hongos: Aspergillus flavus, orycae y niger y del Bacillus subtilis han demostrado ser de gran uso en la industria alimentara. 2. ELABORACIN DE ENZIMAS (19). 2.1. Elaboracin de enzimas de origen animal o vegetal. Si se trata de enzimas de origen animal la simple trituracin de algunos tejidos especializados, como el pncreas o el hgado, permite formar una papilla, la cual se extrae a continuacin con un solvente adecuado como agua, acetona fra (-20C ), glicerina o una solucin salina. En forma parecida se procede con los tejidos vegetales, previamente sometidos a trituracin o disrupcin (rotura). Tambin puede partirse de los jugos de expresin de los respectivos tejidos, cuya estructura celular se destruye por autolisis, plasmolisis (18) o por congelacin, la cual revienta Lic. M. Alejandra Zinni 19
las paredes celulares. 2.2. Elaboracin de enzimas de origen microbiano (16,17). Actualmente la tendencia industrial es el reemplazo de muchas enzimas provenientes de tejidos por aquellas que resultan de la aplicacin de cultivos de microorganismos seleccionados, que generan la enzima especifica. La produccin de enzimas por microorganismos tiene la ventaja de su costo, generalmente menor, y por realizarse en un periodo relativamente breve: Por ejemplo, 1 a 5 das en el caso de una fermentacin discontinua por lotes ("batch"). Adems, se puede incrementar el rendimiento de una enzima especifica por un determinado organismo, recurriendo a modificar sus condiciones ambientales, o bien, a formar por va gentica cepas mutantes, en las cuales la produccin de la enzima puede ser varias veces superior que en la cepa original (15,74). De este modo procesos de seleccin, adaptacin y mutacin han mejorado considerablemente la produccin de enzimas a partir de microorganismos. Las enzimas elaboradas industrialmente son por lo general del tipo degradativo y extracelular, es decir, que son excretadas al medio por el microorganismo que las genera; pues entonces no precisan de la ruptura de las clulas microbianas para su extraccin como es necesario en las enzimas intracelulares de biosntesis. 2.3. La elaboracin de enzimas de origen microbiano comprende diferentes etapas: 2.3.1. Seleccin de microorganismos: Se empieza generalmente por un cultivo de enriquecimiento de la cepa seleccionada. Cultivos originales pueden obtenerse de la firma American Tipe Culture Collection (ATCC), del Northern Utilization Research Branch o de otro organismo o instituto reconocido. 2.3.2. Cultivo: Las materias primas que sean de costo adecuado y que puedan utilizarse como medio de cultivo varan naturalmente segn la enzima por elaborar y pueden ser de los siguientes orgenes (10) a) Materias azucaradas o amilceas, como melaza, jarabe de glucosa, almidones y afrechos de trigo, arroz o maz; b) Materias proteicas, como hidrolizados proteicos, harina de pescado, casena, gelatina y afrechos de extraccin de semillas oleaginosas; c) Componentes nitrogenados, como sales de amonio, nitratos, urea; d) Sustancias favorecedoras del crecimiento microbiano; como, extractos y autolizados de levadura, sales minerales con inclusin de elementos trazas y eventualmente vitaminas. Fuera de la composicin del medio constituyen parmetros importantes que deben controlarse en el cultivo, las condiciones ptimas del caso, en cuanto a temperatura, pH, aereacin (para suministrar el oxgeno necesario y evitar exceso de calor de reaccin), y velocidad de agitacin. En lo que se refiere a los reactores para realizar la fermentacin se distingue entre los cultivos en superficie de medios lquidos o semislidos, usndose ya sea sartenes Lic. M. Alejandra Zinni 20
o tambores rotatorios, y cultivos en profundidad, actualmente ms usados, mediante tanques agitados, de lecho fijo o de lecho fluidizado (partculas suspendidas y agitadas, lo que facilita su mezcla y circulacin) (10, 17). 2.3.3. Terminada la incubacin del proceso fermentativo se separa la biomasa junto con el resto de las clulas y los componentes slidos del medio de cultivo por filtracin o centrifugacin. El liquido resultante, generalmente an bastante heterogneo, puede utilizarse directamente como preparado enzimtico; Pero, generalmente, se somete a una purificacin y/o aislamiento posteriores, que comprenden diferentes fases y que pueden aplicarse igualmente en las enzimas de origen vegetal o animal. 3. PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE ENZIMAS. 3.1. Sin perjuicio que un preparado enzimtico puede consistir en el mismo extracto o caldo fermentado que slo se somete a una clarificacin y concentracin (preparado liquido) o desecacin (preparado slido) se recurre tambin a mtodos de aislamiento y purificacin de enzimas en gran escala, lo cual se logra principalmente por los siguientes procesos: 3.2. Adsorcin selectiva con hidrxidos de hierro o aluminio coloidales, a cierto pH, pues no todas las protenas son adsorbidas en iguales condiciones. Una vez adsorbida se lava con agua o solucin salina y luego s eluye a pH diferente, generalmente alcalino mediante otra solucin salina, por ejemplo, de fosfato. 3.3. Por precipitacin, en que las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad hasta el punto en que precipitan. Esto se logra por adicin de sales a cierto pH y a elevada concentracin inica o por solventes orgnicos (alcohol, acetona, isopropanol) a baja temperatura. La sal ms usada es el sulfato de amonio por su alta solubilidad, bajo costo, alta atoxicidad para la enzima y por no afectar mayormente la viscosidad de la solucin. 3.4. Dilisis por gradientes de concentracin a travs de membranas semipermeables. 3.5. Ultrafiltracin por aspiracin o presin a travs de membranas de porosidad fina como tamiz molecular. Presenta una alternativa interesante para separar enzimas, pues no hay cambio de fases, ni altos gradientes de temperatura (15). 3.6. Electroforesis sobre soportes de papel, gel de almidn, agar o dextrano. 3.7. Fraccionamiento cromatografico Pico de tipo preparativo, tanto en cada fina, como en columna con intercambiadores inicos, geles o tamices moleculares. Combinando estos procedimientos con otros a base de electroforesis de alta tensin, cataforesis y electrodilisis se logran actualmente separaciones de mezclas complejas de enzimas. 4. El control de todas estas etapas en su forma ms rigurosa, es necesario para asegurar el mximo de rendimiento y reproducibilidad, seguridad y calidad de los productos enzimticos obtenidos. 21
5. ENZIMAS INMOVILIZADAS (1, 20, 21). El enorme nmero de reacciones catalizadas por enzimas y la especificidad de las enzimas individuales significa que stas son potencialmente de gran valor industrial. Sin embargo, su costo se agudiza al aplicarlas como reactivos en forma soluble, pues se produce su prdida, una vez utilizadas. Aunque la enzima por regenerarse en el proceso podra usarse muchas veces, su separacin a partir de la mezcla de reaccin no es econmicamente factible. De all que ha significado un avance importante la posibilidad de inmovilizar las enzimas sobre soportes inertes, reteniendo as gran parte de su actividad cataltica original. Como las reacciones enzimticas se desarrollan en medio acuoso, la matriz del soporte debe ser insoluble en agua, pero tan hidrfila que garantice un buen contacto con el medio de la reaccin. Su aplicacin se basa en sus interesantes propiedades: a) Son trmicamente ms estables que las enzimas nativas y ms resistentes a la autolisis; b) Al final de una reaccin catalizada enzimticamente, la enzima enlazada puede separarse por simple centrifugacin o filtracin, sin necesidad de agregar un reactivo de inactivacin o precipitacin; c) Una vez recuperada, la enzima enlazada puede volver a usarse las veces que se desea, sin prdida sustancial de actividad despus de un simple lavado con soluciones tampones acuosas y permitiendo realizar as procesos enzimticos continuos. Por lo tanto, se usan tambin para aislar y purificar enzimas, al separarlas de inhibidores especficos. 5.1. Los mtodos para la inmovilizacin de enzimas comprenden las siguientes tcnicas (l, 20) a) Por adsorcin de la protena enzimtica por la superficie de una matriz de soporte como silicagel, carbn, aluminio, vidrio poroso o poliaminas. La unin es relativamente dbil, pudiendo destruirse por cambios en el pH, la temperatura o la concentracin inica; pero puede estabilizarse si la enzima ya adsorbida se somete a un entramado con glutaraldehdo (vase bajo d) como lo es un soporte de resina a base de fenol y formaldehdo luego entramada con aldehdo glutrico (72). b) Por enlace inico en que la molcula de la enzima, cargada electrostticamente es de carcter polianinico o policatinico. Tambin aqu la unin es relativamente dbil, pues la carga de la protena enzimtica es pequea en relacin a su masa; sin embargo, puede intensificarse al asociarla a una adsorcin. c) Por enlace covalente entre la enzima y el soporte insoluble a travs de los diferentes grupos funcionales, capaces de reaccionar, de las enzimas, como NH2, COOH, -SH, y -OH. Portadores pueden ser sustancias inorgnicas, como silicagel, caoln, apatita, vidrio poroso, aluminio, hierro; orgnicas, como celulosa, almidn, dextrano, colgeno, agar y, especialmente, polmeros como de la carboximetilcelulosa, succinil-amino-hexil-celulosa, anhdrido maleico entramado, poliamidas, poliuretanos y poliacrilaminas. Lic. M. Alejandra Zinni 22
Este enlace es bastante estable y puede realizarse a veces en forma directa con el soporte, despus de una eventual modificacin de grupos funcionales, capaces de reaccionar con la enzima, o bien se intercala todava entre la enzima y el portador una molcula intermedia ("spacer") para que la enzima mantenga mayor movilidad y con ello una mayor actividad cataltica. As, en el caso de la carboximetil-celulosa transformada en su azida para su preactivacin, forma unin covalente por un enlace amida entre el soporte y el grupo epsilon de la lisina contenida en el polipptido de la enzima o el grupo amino libre de un aminocido terminal. En el caso del anhdrido maleico entramado, la unin covalente de la enzima se produce por aminolisis del grupo anhdrido sin preactivacin. d) Por entramado transversal (cross-linking), una forma especial de enlace covalente en que las molculas enzimticas se enlazan entre si mediante reactivos bi- o polifuncionales, como el dialdehdo glutrico, di-isotiocianato o cido disulfnico. Su inconveniente es el difcil contacto del substrato con la molcula enzimtica, situada en el interior del polmero macromolecular resultante. Tambin suele asociarse una adsorcin con un enlace covalente y un entramado. e) Por recubrimiento en que las enzimas mismas no se inmovilizan, sino que se limita su espacio de reaccin, recubrindolas con una membrana polmera, natural o sinttica, que sea semipermeable; es decir, permeable para el substrato y el producto de la reaccin, pero impermeable para las molculas enzimticas. El recubrimiento puede suceder por una envoltura con una matriz, por ejemplo, de , una separacin por ultrafiltro o por una inclusin de la enzima en microcpsulas, permeables al substrato, de bajo peso molecular (73). Factores como dimetro de poro del soporte de adsorcin y carga del soporte y del substrato son parmetros que influyen, segn el procedimiento elegido, en la cintica de las enzimas inmovilizadas. 5.2. La enzima as inmovilizada presenta las ventajas de un catalizador slido y es separada fcilmente de la mezcla de reaccin. En algunos casos, especialmente cuando la matriz de soporte es de carcter inico, las propiedades de la enzima inmovilizada pueden ser diferentes de aquellas que presenta la forma soluble. No cabe duda que estas tcnicas de inmovilizacin de enzimas, iniciadas a comienzos de la dcada del 60, conducirn a exitosos procesos industriales en el campo de la catlisis industrial por enzimas. Una de las posibilidades ms prometedoras en esta rea es la de crear sistemas multienzimticos inmovilizados al unir ms de un tipo de enzima en la matriz, como glucoamilasa y glucosa-isomerasa para transformar almidn en fructosa. Es interesante hacer notar, al respecto, que en la naturaleza las endoenzimas, es decir aquellas que operan dentro de las clulas, estn habitualmente inmovilizadas por fijacin sobre membranas o sobre partculas slidas en suspensin (20). La lactasa fngica para desdoblar la lactosa de leche y suero y la glucosa isomerasa para la obtencin de fructosa, son buenos ejemplos del empleo actual de enzimas inmovilizadas en tecnologa de alimentos. Lic. M. Alejandra Zinni 23
V. ENZIMAS EN TECNOLOGA DE ALIMENTOS Como es sabido, todo alimento constituye un complejo sistema biolgico, cuyas clulas se encuentran en equilibrio por accin de las enzimas que encierran. En este contexto, los tejidos provenientes de un organismo animal o vegetal, que despus de su muerte por matanza, cosecha o preparacin llegan a convertirse en alimentos, contienen todo el conjunto de enzimas que necesitan para su metabolismo, tanto anablico como catablico y que persisten despus de la destruccin de los tejidos. 1. LOCALIZACIN DE ALGUNAS ENZIMAS EN LOS ALIMENTOS. Es importante conocer la distribucin que tienen algunas enzimas en los alimentos. Ellas pueden encontrarse repartidas en diversa forma, como sucede, p. ej., en la fosfatasa de la leche adsorbida por sus glbulos grasos o bien, disueltas en el alimento como es el caso de las lipasas en grasas y aceites. Por otra parte, las encontramos adsorbidas en las partculas slidas como es el caso de las enzimas pectolticas y las fenolasas, que se encuentran adsorbidas en la pulpa; cuando se procede a filtrar, el grado de actividad enzimtica disminuye notablemente. En el trigo, las amilasas estn ubicadas en el germen, no encontrndoselas ni en la capa de aleurona ni en el salvado. Por otra parte, la actividad proteoltica del higo se encuentra en el ltex que est slo en la porcin conocida como receptculo del higo y no en el rea de las semillas (22). Las catepsinas estn localizadas en el lisosoma de las clulas. 2. INHIBICIN DE ENZIMAS DE LOS ALIMENTOS. Las enzimas pueden inactivarse por el calor, aditivos o componentes naturales de los alimentos. 2.1. Inactivacin por calor. La precoccin, escaldado o blanching es el mtodo ms conocido y empleado por la industria alimentara para la inactivacin de las enzimas, de modo que las reacciones enzimticas que inducen los cambios indeseables, no ocurren durante las siguientes etapas de los procesos. Este mtodo consiste en exponer durante un tiempo breve, la materia prima cruda a altas temperaturas por corto tiempo - 3 a 10 minutos - como mximo en el caso de las frutas y se realiza aplicando vapor o por ebullicin. La aplicacin de vapor tiene la ventaja sobre el agua de que reduce la prdida de las sustancias solubles en ella como las vitaminas y sales hidrosolubles. 2.2. Inhibicin por aditivos. Algunos estn prohibidos precisamente por su accin sobre enzimas importantes: -Acido frmico: por su poder complejante que inhibe enzimas que contienen Fe3+. -Acidos monocloro- y monobromoactico: por su accin tiolopriva en el sentido de bloquear los grupos sulfhidrlicos de las enzimas. -Acido brico: inactiva descarboxilasas, fuera de acumularse en la grasa del organismo. Lic. M. Alejandra Zinni 24
-Base de amonio cuaternario: que activan la citocromo-oxidasa y enzimas digestivas. -Acido nordihidro-guayartico: (NDHA-antioxidante), inhibe las catalanas, peroxidasas, alcohol-dehidrogenasa, fuera de tener una accin alergizante. 2.3. Inhibicin de enzimas por componentes de alimentos: -Factor antitrptico, que se encuentra en el poroto de soya, clara de huevo (ovomucoide) y zumo de papa cruda. -Solanina o solanidina (aglucn) de la papa, que inhibe la colino-esterasa; lo que tiene relacin con el control de la conduccin de los impulsos nerviosos (23). 3. ENZIMAS DE ALIMENTOS QUE DESTRUYEN NUTRIENTES. -Lipoxidasa, destruye los carotenos y la vitamina A de frutas y hortalizas, al actuar sobre los dobles enlaces de compuestos insaturados. -Tiaminasa, destruye la tiamina y se la encuentra en mariscos (ostras) y algunos peces crudos. 4. REGENERACIN ENZIMTICA. En la tecnologa alimentara moderna se deben tener presentes los cambios que pueden ocurrir en los procesos tecnolgicos. As, cuando las enzimas se han inactivado, algunas pueden regenerarse, como es el caso de la peroxidasa, de la fosfatasa y otras. El mtodo de High-temperature-Short-time (HTST) como lo dice su nombre, es la aplicacin de calor (a alta temperatura), pero por corto tiempo; antes se usaban 115C por tiempo prolongado, hoy se usan 125C por corto tiempo. Con ello puede suceder que la enzima no se inactive en su totalidad, no sufre el despliegue total de su estructura proteica helicoidal y as recupera parcialmente su estructura nativa despus de las 24 horas de elaborado el producto. Con esto regenera su actividad, en parte, lo suficiente como para que durante el almacenaje resulten efectos dainos en los alimentos conservados, produciendo mal olor y sabor. Pero la regeneracin de la actividad no est limitada a la desnaturalizacin por calor de la enzima-protena. Algunas, como la alfa-amilasa obtenida del Bacillus subtilis, pueden denaturarse por adicin de la urea a la solucin de enzima. Alrededor del 80% de su actividad original se regenera colocando la solucin en tampn de pH 8,5. Si se elimina el resto de urea por dilisis, se regenera slo el 40% de la actividad. La regeneracin ha sido explicada por algunos autores (24, 25, 26, 27) como la capacidad de la enzima de recuperar su estructura terciaria, por recombinacin de las uniones H. 5. ACCIN TIL O DETERIORO EJERCIDOS POR LAS ENZIMAS EN LOS ALIMENTOS. 5.1. Las enzimas pueden ejercer, segn las circunstancias del caso, una accin deseada o no deseada, desde el punto de vista de la tecnologa de alimentos. Segn Reed (3, 28), la diferencia entre un efecto beneficioso o desfavorable sobre los Lic. M. Alejandra Zinni 25
alimentos que pueden resultar de estas acciones enzimticas puede ser, a veces, sutil, dependiendo de la intensidad de la reaccin enzimtica; as sucede en el pardeamiento y reblandecimiento de frutas, como tambin en la disminucin de su fibra por celulasas durante su maduracin. 5.2. Efectos beneficiosos de la accin enzimtica. Entre stos pueden mencionarse las complejas reacciones enzimticas que determinan la rigidez cadavrica y la posterior maduracin de la carne y productos derivados con las respectivas modificaciones de las caractersticas de su tejido muscular (57). Por otra parte, la preparacin de la malta o cebada germinada, primer paso de la elaboracin de la cerveza, se basa en la accin de las amilasas y proteasas propias del cereal en germinacin. La elaboracin de la masa del pan por accin de las enzimas del cereal y de la levadura y la maduracin de la crema, de los quesos y de las frutas, son otros tantos ejemplos de procesos que serian imposibles sin la valiosa intervencin de enzimas. A la qumica de los estimulantes de tipo cafenico se le ha llamado tambin la qumica enzimtica, ya que en una u otra forma son enzimas las que intervienen en la elaboracin del t negro (polifenoloxidasas y otras), la separacin previa de las semillas de caf de sus frutos (enzimas pectinolticas) y la compleja fermentacin previa de las semillas de cacao para desarrollar su sabor y aroma agradables (41). Por otra parte, tambin en la tecnologa de la preparacin de diferentes especias, como la pimienta negra, la mostaza, el rbano y la vainilla, el desarrollo de sus caractersticas de sabor y aroma se debe a tiles reacciones enzimticas (33); al igual que el aroma de muchas frutas se debe a enzimas que lo generan a partir de sus precursores (vase industria de derivados de frutas y hortalizas). 5.3. Efectos no deseados o deterioros producidos en alimentos por accin enzimtica. Entre estos efectos deben mencionarse los fenmenos de pardeamiento de los alimentos, los cuales se manifiestan por la aparicin de manchas oscuras en el tejido animal o vegetal y pueden tener dos causas bien diferentes, distinguindose entr el pardeamiento qumico o no enzimtico y el enzimtico. 5.4. Pardeamiento qumico o no enzimtico. Alimentos ricos en protenas' y azcares experimentan la llamada "Reaccin de Maillard" (32), quien encontr, ya en 1912, que aminocidos simples reaccionan en caliente con ciertos azcares para formar compuestos oscuros semejantes a la melanina. Se ha definido esta reaccin como "la reaccin de los grupos aminocidos, pptidos o protenas con los grupos hidroxil-glucosidicos de los azcares". La reaccin es favorecida por la humedad, la temperatura, algunos metales, como hierro y cobre, y el pH. Entre las diversas reacciones intermedias tenemos la formacin de glicosilamina que es incolora, luego una isomerizacin conocida como reordenamiento de Amadori y posteriormente la llamada degradacin de Strecker, con prdida de una Lic. M. Alejandra Zinni 26
molcula de dixido de carbono y formacin de hidroximetil-furfural. Este fenmeno es deseable en algunos productos, como cerveza, corteza del pan, caf, pero en otros alimentos no es conveniente, ya que involucra aparte del cambio de color, cambios en el sabor, olor y en la disminucin del valor nutritivo, ya que estn comprometidos algunos aminocidos esenciales como la lisina (32). Este pardeamiento se puede evitar mediante bajas temperaturas, bajo pH, descomponiendo la mitad de glucosa que puede estar presente, y el mtodo ms usado, que es bloquear el grupo -CO mediante el sulfito de sodio (29). 5.5. Pardeamiento enzimtico (36, 37). Aunque el resultado final de este fenmeno de pardeamiento conduce tambin a polmeros obscuros del tipo de la melanina, semejantes a los que se forman en el pardeamiento no enzimtico, el mecanismo de la formacin es bien diferente. El cambio de color en frutas, verduras y tubrculos se observa cuando ellos sufren dao mecnico o fisiolgico: cuando se mondan, cortan o golpean. Se debe a la presencia en los tejidos vegetales de enzimas del tipo polifenoloxidasas, cuya protena contiene cobre, que cataliza la oxidacin de compuestos fenlicos a quinonas. Estas prosiguen su oxidacin por el oxgeno del aire sobre el tejido en corte reciente, para formar pigmentos oscuros, melanoides, por polimerizacin. Los sustratos responsables son de tipo orto-fenlico y entre ellos se mencionan: cido clorognico-tirosina-catecol-cido cafeico-cido glico-hidroquinonas, antocianos-flavonoides. Las enzimas responsables son: la tirosinasa, la catecolasa, lacassa, la ascrbicooxidasa y las polifenol-oxidasas. Los compuestos de la reaccin no son txicos, pero la preocupacin de los tecnlogos es el aspecto, color y presentacin de frutas y verduras, que indudablemente tienen gran importancia comercial y culinaria. Para que se produzca este pardeamiento es necesario, por lo tanto, la presencia de los tres componentes: enzima, substrato ms el oxgeno. Como nada se puede hacer o muy poco con el substrato oxidable, los mtodos hoy en uso tienden a inhibir la enzima o a eliminar el oxgeno y algunas veces se combinan ambos mtodos. a) Inactivacin de la enzima mediante calor. Tiene la ventaja de que no se aplica aditivo alguno, pero presenta el inconveniente de que la aplicacin de calor en frutas frescas produce cambios en la textura, dando sabor y aspecto a cocido. Para evitar estos inconvenientes se regula el tiempo de calentamiento, acortndolo justo al mnimo capaz de inactivar la enzima por un escaldado inmediato. Se puede controlar la inhibicin enzimtica por la prueba del catecol. La inhibicin es lenta a 75, pero se hace rpida a 85C. b) Inactivacin de la enzima mediante inhibidores qumicos: Anhdrido sulfuroso: Es uno de los ms efectivos y econmicos inhibidores qumicos hoy usados en la industria alimentara, aunque su olor y sabor desagradables pueden comunicarse al alimento cuando se emplea en grandes cantidades. Su uso no es aconsejable en alimentos ricos en tiamina y vitamina C, Lic. M. Alejandra Zinni 27
pues las destruye. En el caso de la tiamina, el SO2 es capaz de romper el anillo tiazlico de la vitamina, separando el anillo de pirimidina, con lo que pierde su carcter vitamnico. La polifenoloxidasa es muy sensible al SO2, pero la reaccin debe realizarse antes que se formen las quinonas por oxidacin del substrato, pues stas oxidan al SO2, por lo que pierde entonces su propiedad de inhibir la enzima. Acidos: Bajo un pH 2,5 cesa la actividad enzimtica, que es ptima entre 5 y 7. Aunque luego se vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera, impidindose as el pardeamiento. Entre los cidos ms usados est el mlico, que se agrega al prensar la fruta: caso de la manzana, de la cual es uno de sus componentes naturales (30); tambin se usa, pero en menor proporcin, el cido ctrico. Acido ascrbico: Este cido es el ms recomendado para evitar o minimizar el pardeamiento enzimtico, por su carcter vitamnico inofensivo. El cido ascrbico por s mismo no es un inhibidor de la enzima: acta sobre el substrato, de modo que puede adicionarse despus de haberse formado las quinonas; Tiene la propiedad de oxidarse a cido dehi-hidroascrbico, reduciendo la quinona a fenol (35). Esto lo hace el cido ascrbico hasta que se haya transformado totalmente en dehidroascrbico que ya no puede reducir las quinonas, de manera que stas continan, entonces, su oxidacin hasta la formacin de melanoides. El cido dehidroascrbico an puede ser perjudicial al formar, en la esterilizacin posterior, melanoides con los aminocidos presentes; por eso la adicin de cido ascrbico no es eficaz en cerezas, ciruelas y frutillas. Sin embargo, si se agrega a otras frutas exceso de cido ascrbico para inactivas totalmente la enzima, se logra prevenir el pardeamiento en forma efectiva y permanente. Productos especialmente propensos a empardecer por oxidacin qumica, cmo manzanas, peras, duraznos, damascos, ciruelas y pltanos entre las frutas, y papas, esprragos, zanahorias entre las hortalizas, deben mantenerse, inmediatamente despus de cortadas o peladas, en agua adicionada de 0,1-0,2 % de cido ascrbico y de 0,2% de cido ctrico. Adems, para evitar alteraciones de color por oxidacin qumica en las conservas enlatadas, es conveniente agregar por cada litro de liquido de relleno 0,5-1 g de cido ascrbico (y 0,25-0,50 g de cido ctrico, segn lo admita el producto en cuanto al sabor). Para mantener el color de conservas de championes y otros hongos es conveniente una adicin de 0,15-0,20 g por litro y para el choucroute se agrega a la salmuera 1-2 g/kg de cido ascrbico, poco antes del envase. Otros inhibidores qumicos: Entre las sales propuestas para controlar el pardeamiento la ms usada es NaCl, cuya accin impide la actividad de la polifenol-oxidasa frente al cido clorognico. Una sumersin en solucin acuosa diluida de NaCl (0,3%) se usa mucho cuando se quiere evitar por corto tiempo el obscurecimiento de frutas peladas, como rodajas de manzanas, antes de ser sometidas al procesamiento; Su contenido en cido ascrbico s mantiene, entonces, constante durante varias horas. Lic. M. Alejandra Zinni 28
Se aplica el bloqueo de los hidrxilos fenlicos por adicin de complejantes con el cobre de la enzima, como el cido ctrico (0,2%) y boratos (0,2% + 0,01% SO2). Tambin la cistena y otros dadores de SH se unen a los fenoles, dando complejos incoloros, previa reduccin de las quinonas. El uso de jugos de pia o de limn para evitar el pardeamiento en preparaciones caseras, se basa en el contenido de compuestos sulfhidrlicos del primero y en cidos ctrico y ascrbico del segundo. c) Eliminacin del oxgeno: La exclusin o limitacin de la influencia del oxgeno del aire al trabajar y envasar rpidamente el material y en caso necesario con ayuda del vaco o en atmsfera inerte representan medidas satisfactorias para mantener ciertas frutas al estado lo ms natural posible, especialmente en lo que se refiere a textura y sabor. Para frutas destinadas a la congelacin, se usa tambin azcar y jarabe para cubrir la superficie, retardando as la entrada del oxigeno atmosfrico. 5.6. Fuera de estos fenmenos de pardeamiento enzimtico existen tambin otras reacciones enzimticas que pueden conducir a un deterioro en los alimentos. Durante el procesamiento de productos tanto animales (matanza) como- vegetales (frutas, hortalizas, molienda de cereales), la destruccin de los tejidos por accin generalmente mecnica, puede liberar enzimas de sus estructuras tisulares. Las consiguientes transformaciones metablicas no controladas pueden conducir entonces, a veces, a reacciones enzimticas que van en desmedro de la calidad del alimento. Es as que la ya mencionada lipoxidasa puede dar origen a productos de oxidacin de sabor rancio o amargo en derivados de cereales y destruir los carotenos (55). Tambin una excesiva proteolisis enzimtica puede conducir a un deterioro del tejido, como sucede en la putrefaccin de productos crneos y marinos. Por otra parte, el reblandecimiento exagerado o la prdida de consistencia de frutas y hortalizas que han sobrepasado su estado de madurez tienen su origen en una pectinolisis no controlada por pectinasas. En el fruto fresco e intacto estas enzimas se encuentran separadas de su substrato, las pectinas; Pero al producirse la ruptura celular en el fruto alterado se genera entonces su reaccin de deterioro (28). VI. ASPECTOS SANITARIOS Y LEGALES DEL USO DE ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA 1. Las enzimas se consumen en gran cantidad a travs de todos los alimentos frescos como frutas, ensaladas frescas, leche, mantequilla, queso, carne, pescado y huevo. Tales enzimas no slo proceden del reino animal, sino, adems, son de origen microbiano, ya que estn en los productos obtenidos por fermentacin, curado, etc. Estas enzimas son constituyentes naturales de los alimentos, en donde se las encuentra, o bien, se han adicionado a los alimentos, en donde no existen o estn en cantidades insuficientes. En este sentido las enzimas se vuelven "ingredientes intencionales de los alimentos o aditivos" (3). 1.1. Mientras la pureza de las enzimas para fines analticos slo es necesaria llevarla al grado que permita descartar actividades extraas que puedan interferir en la Lic. M. Alejandra Zinni 29
exactitud del resultado analtico y no a una pureza absoluta, las enzimas destinadas a la elaboracin de alimentos deben cumplir, segn el Comit FAO/OMS, con las exigencias de inocuidad y pureza de los Aditivos Alimentarios, como por ej., Con respecto a la ausencia de microorganismos patgenos, de metales txicos y de restos de reactivos o agentes clarificantes o precipitantes. 1.2. Los polvos secos concentrados de enzima pueden ocasionalmente producir alergias por inhalacin, aunque esto es tambin vlido para otros productos en polvo. Las enzimas comerciales no se consumen en su forma activa, pero hay excepciones como la parcial supervivencia de proteasas bacterianas en alimentos horneados o la parcial actividad de la papana de la cerveza. Pero sabemos que la mayora de las enzimas se inactivan durante los procesos tecnolgicos; las cantidades de enzimas presentes en los alimentos (generalmente en forma inactiva) son pequeas. 1.3. Se sabe con certeza que las enzimas usadas en tecnologa alimentara no son dainas de por s. Sin embargo, se ha estudiado la posibilidad de la formacin de toxinas durante el desarrollo de microorganismos usados en la produccin de ellas. Pero la industria puede ponerse a salvo al tomar todas las medidas de seguridad contra la contaminacin con agentes patgenos, por los procesos microbiolgicos. 1.4. La elaboracin de preparados enzimticos exige tratamientos delicados que no perjudiquen su actividad. Como no pueden aplicarse temperaturas altas durante su preparacin no es posible pensar en una esterilizacin trmica (3). Por este motivo seria posible la presencia de microorganismos extraos, capaces de multiplicarse a travs de ellos mismos o de sus formas de resistencia (esporas) y/o de sus metabolitos no deseados (antibiticos, toxinas). Estas contaminaciones podran tener, segn Frank, los siguientes orgenes (44, 45): - el propio productor de la enzima o la flora contaminante que aporta: - substratos nutritivos usados, como la melaza, residuos oleaginosos, afrecho; - material usado para la adsorcin o la dilucin; como celulosa, almidn, harina, afrecho; - infecciones no controladas durante el cultivo masivo de microorganismos. 2. Para evitar posibles peligros, las Comisiones para la "Investigacin en Nutricin" y para el "Examen de sustancias extraas en los alimentos" de la Corporacin Alemana para la Investigacin (DFG) (47) han recomendado al legislador algunas medidas como: 2.1. El cultivo masivo de microorganismos en la planta industrial debe realizarse de tal manera que no se produzca, por razones ecolgicas, una propagacin indeseable de los microorganismos en la fbrica y en sus alrededores. 2.2. Por este motivo el personal respectivo debe recibir la instruccin necesaria para el manejo de microorganismos. 2.3. Las fabricantes de enzimas y de metabolitos microbianos (por ej., para la elaboracin de jugos de frutas y productos de panadera) deben vigilar cuidadosamente el aire desprendido y las soluciones nutritivas. 2.4. En la preparacin de cultivos para iniciadores (starter) debe evitarse la intromisin, como impurezas, de microorganismos extraos. Lic. M. Alejandra Zinni 30
2.5. Los cultivos, enzimas y metabolitos deben estar, exentos de antibiticos que tengan actuacin teraputica. 2.6. Las enzimas de microorganismos deben provenir de grmenes no patgenos para el hombre y los animales. Debe prestarse especial atencin a la ausencia de microorganismos causantes de intoxicaciones alimentaras como E. coli, Salmonella, Arizona y Staphylococcus aureus. Deben incluirse ensayos de toxicidad crnica, a largo plazo, y sobre todo la investigacin de una posible accin carcinognica, teratognica y mutagnica. 2.7. Para ajustar los preparados enzimticos a una actividad constante o definida de acuerdo con su aplicacin, y tambin para facilitar su estabilidad, se recurre a aditivos permitidos. Para este objeto pueden aplicarse disolventes como agua potable, glicerina, propilenglicol; coadyuvantes Para comprimidos como cido esterico y sus sales de calcio y magnesio, slice coloidal y silicato de calcio (hasta 10 g/kg) , glutatin, cistena y los preservadores y antioxidantes autorizados para alimentos. Por otra parte, los preparados enzimticos no deben contener habitualmente ms de 3 mg/kg de arsnico; 10 mg/kg de plomo; 25 mg/kg de zinc y 50 mg/kg en conjunto de cobre y zinc. En este sentido, la limitacin de aflatoxina a 5-10 ppb, respectivamente, a 30 ppb (48) y de actividades antibiticas residuales hasta, por ej., 0,03 U. I. de equivalentes de penicilina/g de enzima (44) parecen constituir medidas adecuadas en proteccin de la pureza de esta clase de aditivos que constituyen las enzimas. Afortunadamente, segn las investigaciones realizadas por Frank y colab. (46) , no se han encontrado entre estos residuos, antibiticos aplicados en gran escala en medicina humana y veterinaria, ni grmenes patgenos como Estafilococos, Salmonellas y Pseudomonas. 2.8. Para la introduccin de nuevas variedades de cultivos de microorganismos destinados a alimentos debe ser de responsabilidad del fabricante una declaracin de su carcter inofensivo en forma similar al examen para la admisin de un nuevo medicamento. De estas investigaciones y exigencias se deduce la importancia de que se apliquen en la Industria de Alimentos preparados enzimticos suficientemente garantizados en su pureza. 3. Segn la Ley sobre el trfico de Alimentos, Tabacos, Cosmticos y Productos Similares de la Repblica Federal de Alemania, de 1974, las enzimas, en general, por su calidad de protenas digestibles, no se consideran como Aditivos, sino como equivalentes a integrantes de alimentos. En Chile rige una situacin similar, pues el nuevo Reglamento Sanitario de los Alimentos (71 b) no incluye las enzimas usadas en los alimentos en la lista de los aditivos autorizados, mientras que el Reglamento anterior (71 a) inclua las proteasas: pancreatina, tripsina, pepsina, cuajo, papana, bromelina y ficina como mejoradores de la fermentacin y ablandadores para carne. En algunos casos, el uso de enzimas de otras fuentes es sancionado por reglamentos especiales dentro de la categora de Aditivos Alimentarios. As sucede Lic. M. Alejandra Zinni 31
con el uso de carbohidrasas derivadas del Rhizopus oryzae, para producir jarabe de almidn y dextrosa; de catalasas bacterianas de M. lysodeikticus, para eliminar agua oxigenada, y de la pareja glucosa-oxidasa y catalasa para la eliminacin de glucosa en huevos lquidos (3). VII. APLICACIN DE PREPARADOS ENZIMTICOS EN LAS DIFERENTES INDUSTRIAS ALIMENTARIAS 1. Para comprender los principios y las ventajas de la suplementacin de enzimas, es necesario observar estrechamente los factores envueltos: el substrato, los tipos y acciones de las enzimas y las propiedades que dar este agregado enzimtico a los productos finales (3, 52). Debido a que la estructura espacial de la protena participante de las enzimas (por ej., Helicoidal o globular) es muy sensible frente a las condiciones ambientales (temperatura, aire y agentes qumicos), las enzimas son bastante lbiles, debiendo conservarse secas, en envases cerrados y a baja temperatura, si se almacenan por mucho tiempo. Sus soluciones deben ser recientes y se preparan en tampones apropiados con adicin de adecuados reactivos de proteccin. 2. ENZIMAS QUE SE APLICAN EN LA INDUSTRIA MOLINERA Y PANADERA 2.1. ALFA y BETA-AMILASA. El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales. Origen de alfa-amilasa: Fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B. stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del pncreas. Origen de beta-amilasa: cereales, soya y camote. La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda ms en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por el contrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal. Acciones: Como es sabido, el almidn est formado por la fraccin amilosa de cadena recta de molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos alfa-1,4; en tanto que la fraccin amilopectina, adems de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosdicos 1,6. La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa. Por su accin, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0C por 15 min. El pH ptimo de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70C conserva un 70% de su Lic. M. Alejandra Zinni 32
actividad. Acta sobre almidones crudos y gelatinizados. La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarognica, pues acta sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina acta en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su accin a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de una exoamilasa, ya que acta sobre el terminal de la molcula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar (38). La beta-amilasa no necesita de activador para actuar, pero es menos estable al calor, inactivndose a 70C por 15 min. El pH ptimo de la beta-amilasa es de 4,5. Aplicaciones: El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhdrido carbnico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles que estn presentes en la masa, y cuya formacin depende, a su vez, de la accin sincronizada de la alfa- y la beta-amilasa; en mejor forma que por adicin de extracto de malta usado tambin para este objeto. Mientras los cereales germinados contienen ambas enzimas, muchas harinas de trigo son deficientes en alfa-amilasa, siendo entonces conveniente su adicin. La alfa-amilasa de origen fngico (como es la que se obtiene por crecimiento del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que permiten una agitacin y una aereacin intensas), aunque puede ser menos potente que la de bacterias o de cereales, se puede obtener con baja actividad de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa, conservndose as la maltosa, esencial para la fermentacin. La presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentacin de la masa, tiene las siguientes ventajas: - mayor contenido de azcares fermentescibles en la masa; - aceleracin de la fermentacin; - desprendimiento gaseoso, mayor y uniformemente mantenido; - aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad ms fina y de costra ms uniforme y ms coloreada. La alfa-amilasa de origen bacteriano es ms estable al calor que la de hongos y de cereales, de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. Por este motivo, su adicin debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproduccin de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa (38, 40). Por otra parte, una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservacin, al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradacin de su almidn, causante del envejecimiento. Al sustituir la adicin, de la amilasa por extracto, jarabe o harina malteados, debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteoltica, cuyas desventajas se han sealado anteriormente. 2.2. PROTEASAS. Origen: Fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (Bacillus, Streptococcus) y vegetal (Canica papaya L: Papana). Lic. M. Alejandra Zinni 33
Accin. Desdoblamiento hidroltico de protenas y pptidos hasta aminocidos. Aplicaciones: Como la adicin de amilana y/o proteasa depende de la harina y otros ingredientes de la masa, la conveniencia de agregar proteasa queda generalmente restringida a harinas de trigo duro, ricas en gluten (como las de Canad y Rusia), mientras que en harinas pobres o medianamente ricas en gluten puede originar un reblandecimiento exagerado de la masa. En los casos en que la adicin de proteasa es conveniente, se produce una mayor extensibilidad y elasticidad de la masa, acortndose el tiempo de amasijo y facilitando el amasijo mecnico (maquinofilia). El pan resultante adquiere mayor volumen por una mejor retencin de gas, mejorando su textura y simetra, como tambin sus condiciones de conservacin y aun de aroma (40); esto ltimo, sobre todo si se asocia a una adicin de amilasa. Como la protelisis en la masa puede ser inhibida por la sal, conviene agregar sta slo durante el amasijo. En algunos productos de panadera, como barquillos y galletas secas duras, las masas deben elaborarse con una menor adicin de agua; por otra parte, deben ser blandas y plsticas y poco elsticas para que se puedan moldear fcilmente. Por este motivo se prefiere el uso de una harina "floja", es decir, pobre en protenas totales (no ms de 11 %) y en gluten hmedo (mx. 22%), pues con contenidos ms elevados se necesita ms lquido para preparar la masa. Esto tiene el inconveniente de la formacin de una miga de, poros ms gruesos y un excesivo levantamiento del producto, formndose a menudo una superficie spera, irregular o con ampollas, grietas o fisuras en las galletas. Si no se dispone de una harina apropiada para estos fines, puede regularse, la plasticidad de la masa frenando su desarrollo. Esto se puede conseguir en forma adecuada por medio de una enzima proteoltica como la papana, que desdobla parte del gluten y permite obtener una masa blanda, suave y extensible, y con menor tiempo de horneo. La cantidad por usar depende del contenido de gluten de la harina que se usa; pero, en general, un 0,5%; o, relacionando con 100 kilos de harina, 50-100 ml de Auxillase (un concentrado liquido de Merck) son suficientes. Como toda enzima, la papana se destruye con la temperatura del horno de panificacin, por lo cual su accin debe tener lugar durante el tiempo de reposo de la masa, de unos 15-20 minutos despus de su adicin. La dosificacin depende, en todo caso, de la humedad, tratamiento mecnico en el amasijo, pH, composicin y tiempo de reposo de la masa. Para asegurar una distribucin homognea es conveniente agregar la enzima al agua del amasijo. Su actividad comprende un margen de pH de 3 hasta 9 y alcanza un ptimo entre 40 y 70C. 3. ENZIMAS QUE SE APLICAN EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS AZUCARADOS. 3.1. INVERTASA O SACARASA. Origen y accin: La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar Lic. M. Alejandra Zinni 34
invertido) puede ser realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que acta sobre el extremo fructosa de la molcula de sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de hongos (Aspergillus oryzae). Rango de pH: 4-6. Aplicaciones: El uso frecuente de la invertasa en alimentos azucarados se basa en la transformacin lenta y parcial de la sacarosa en azcar invertido que tiene mayor poder edulcorante, mayor carcter humectante, mayor solubilidad y, por lo tanto, menor tendencia a cristalizar y endurecer. De esta manera, acta como un agente de reblandecimiento en alimentos azucarados con tendencia a cristalizar la sacarosa y evaporar agua, lo que afecta su aspecto y consistencia. Adems, la fructosa resultante tiene cierto carcter humectante y da sensacin de frescura al producto. Productos de confitera, como bombones con relleno, productos de jaleas, fondants, mazapanes y pasteles adquieren entonces una consistencia suave, cremosa y blanda, an despus de un almacenamiento prolongado. La actividad enzimtica de la invertasa depende del pH, siendo su ptimo de 4,5 a 5,0, y de la temperatura que puede variar de 25 a 55C; no debe agregarse a productos con ms de 65C ni a aquellos con ms de 20% de alcohol (bombones con relleno), pues la enzima es inactivada. Como la invertasa produce una hidrlisis, exige la presencia de agua (por lo menos 5% del peso del azcar). De un preparado lquido de invertasa se agregan normalmente 100-125 ml para 100 kg de masa; dicha cantidad puede aumentarse si no se puede llevar al pH ptimo mediante la adicin de cido ctrico, por razones de sabor. A veces se agrega la invertasa al producto previamente mezclado con sorbitol, que tambin posee un gran poder higrosttico o estabilizador de la humedad, en el sentido de retenerla frente a variaciones en la humedad ambiente. Mientras que el sorbitol reblandece de inmediato y su accin contina durante el almacenamiento, la invertasa acta de preferencia en el transcurso del almacenamiento. Otra aplicacin importante de la invertasa est en la elaboracin de azcar invertido a partir de sacarosa por va enzimtica, la cual aventaja a la hidrlisis cida, por ser ms fcil de controlar. Adems, el jarabe resulta de mayor concentracin, presenta mejores caracteres de color y sabor y no contiene indicios de productos secundarios como el furfural. Una vez elaborado el jarabe por inversin enzimtica, se calienta a 80C para inactivar la enzima, teniendo aplicacin en diferentes productos azucarados y licores. Por otra parte, desechos de frutas ricas en sacarosa pueden ser hidrolizados por invertasa en glucosa y fructosa y stas fermentadas por levaduras para producir etanol y/o protenas unicelulares (74, 11). Es interesante que la accin cariognica del azcar invertido es bastante inferior ala causada por la sacarosa. La propiedad de no producir caries es an mucho ms manifiesta en el xilitol, alcohol pentavalente, de poder edulcorante, semejante al de la sacarosa. Lic. M. Alejandra Zinni 35
3.2. GLUCOAMILASA O AMILOGLUCOSIDASA. Origen: Fngico (Aspergillus niger, Rhizopus, Endomyces). Accin: Hidroliza los enlaces 1,4 y 1,6 del almidn (tanto amilosa como amilopectina) desde los extremos no reductores de las cadenas con separacin de unidades sucesivas de glucosa. pH ptimo: 4-6. Aplicacin: Se usa para la elaboracin enzimtica de jarabe de glucosa y de glucosa a partir de almidn (40). En el campo analtico tiene aplicacin en la determinacin cuantitativa del almidn y alfa-oligo y poliglucsidos en alimentos. 3.3. GLUCOSA-ISOMERASA. Origen: Bacteriano (Streptomyces, Aerobacter, Lactobacillus). Accin: Cataliza la isomerizacin de glucosa en fructosa. Aplicacin: Como se trata de una reaccin reversible, la transformacin no es cuantitativa, resultando a partir de la glucosa, un azcar invertido, isomerosa, es decir, mezcla de fructosa y glucosa. Desdoblando primero el almidn mediante glucoamilasa -eventualmente inmovilizada-, se puede transformar la glucosa resultante mediante la glucosaisomerasa para lograr jarabes de alto poder edulcorante a partir de almidn de maz o de papa (16). 3.4. CELULASAS. Origen: Fngico (Trichoderma reesei y T. viride, Aspergillus flavus). Accin: Se trata de un complejo de por lo menos 3 enzimas, que en conjunto son capaces de desdoblar la celulosa hasta glucosa. pH ptimo: 2-7. Aplicacin: Se prev su uso para la elaboracin futura de glucosa y productos azucarados a partir de residuos celulsicos de bajo costo y abundante disponibilidad, como lo son muchos desperdicios de ciudades y desechos industriales. Debido a la presencia de sustancias acompaantes en estos residuos con accin inhibidora sobre la hidrlisis de la celulosa, como las ligninas, puede ser necesario un pretratamiento de la celulosa (15, 16). 4. ENZIMAS QUE SE APLICAN EN LA INDUSTRIA DE LA CARNE Y DERIVADOS. 4.1. PAPANA. Se obtiene por purificacin del zumo lechoso (ltex) coagulado, proveniente de ligeras incisiones longitudinales que se practican en la superficie de los frutos bien desarrollados, pero an no maduros de la papaya (Carica papaya). 4.2. BROMELINA. Se obtiene por precipitacin con acetona del jugo resultante de la presin de los tallos recin brotados de la Bromelicea, la pia (Ananas comosus, sativa). Lic. M. Alejandra Zinni 36
4.3. FICINA. Se obtiene del ltex coagulado proveniente de cortes o incisiones practicados en los brotes de los tallos de la higuera (Ficus sp.). Se puede purificar la ficina por precipitacin con acetona o etanol, redisolucin en agua, nueva precipitacin con acetona y desecacin al vaco; con un rendimiento de unos 11-12 g de polvo a partir de 100 m1 de ltex (22). 4.4. PROTEASAS MICROBIANAS. Se obtienen por cultivos de cepas seleccionadas de hongos (Aspergillus oryzae) o bacterias (Bacillus subtilis). Accin: Todas estas proteasas hidrolizan gran nmero de protenas diferentes a travs de polipptidos hasta aminocidos; tambin desdoblan amidas y steres de aminocidos. pH ptimo: 4-8 (vegetal); 2-10 (fngico); 6-2 (bacteriano). Aplicacin: Durante el proceso de maduracin de la carne que sigue al de rigidez cadavrica, las transformaciones autolticas, causadas por sus enzimas proteolticas (catepsinas) suministran a la carne una textura blanda, jugosa, masticable, de sabor agradable y apta para la coccin y digestin (41). Como esta maduracin natural suele ser prolongada (12 das), se puede acelerar artificialmente mediante la adicin de proteasas extraas para as aumentar la ternura de la carne (meat tenderizer). Al atacar por protelisis las fibras musculares y /o los componentes del tejido conectivo (colgeno, elastina, actomiosina) se logra un relajamiento de los enlaces peptdicos de las protenas y con ello el ablandamiento de la carne. Siendo la papana la enzima ms usada para estos fines, existen tambin preparados a base de mezclas de proteasas de origen tanto vegetal como tambin fngico y bacteriano que seran an ms eficaces. Estos ablandadores de la carne se pueden aplicar por pulverizacin, en la superficie, con preparados enzimticos secos, como, p. ej., una mezcla de 88%, de sal de comer (como sustancia portadora); 4,5%, de almidn (para hacerla ms espolvoreable); 4,5% de papana al 1:350, 2% de citrato de sodio cristalizado y 1% de glutamato de sodio, extracto de carne y condimentos. Tambin suelen agregarse polifosfato, glutatin o cistena y cido ascrbico como estabilizadores. La aplicacin puede efectuarse tambin por inmersin o por dispersin (spray) con soluciones acuosas o hidroalcohlicas de 2 a 5% de la enzima. Despus de 30 minutos y hasta un mximo de 3 horas a la temperatura ordinaria debe procederse a la preparacin culinaria de la carne, como la coccin y el asado rpido (bisteques, escalopas) para evitar que la superficie se vuelva pegajosa. En el caso de carne destinada a ser congelada, se sumergen los trozos en solucin de papana, adicionada eventualmente de cido lctico y sal de comer, y despus de 20 a 30 minutos se congela. Las proteasas, como la papana, pueden aplicarse tambin premortem por inyeccin en la vena yugular hasta 30 minutos antes de la matanza, con el objeto de aprovechar la distribucin homognea de la enzima por efecto de la circulacin sangunea, aunque suelen producirse hemorragias o edemas en rganos internos Lic. M. Alejandra Zinni 37
del animal vivo. Esto puede evitarse por tratamiento previo de la papana o ficina con lcali (pH 11-12), lo que las inactiva en forma reversible. A veces se han observado tambin reacciones defensivas en el organismo del animal vivo que inactivan la enzima inyectada. Este inconveniente no se presentar al hacer la inyeccin postmortem, despus de la matanza, en la arteria del animal desangrado, pero an caliente (10). Tambin se ha propuesto inyectar premortem compuestos azufrados copio metionina, cistena, glutatin o sales inorgnicas azufradas, que seran capaces de aumentar la actividad de las proteasas naturales del tejido muscular de la carne, las cuales desdoblaran entonces las fibras musculares con efecto de tenderizacin de la carne (72). En la carne liofilizada la aplicacin de estas proteasas tiene el efecto de facilitar la rehidratacin, al aumentar, por la protelisis, la capacidad de fijacin de agua. 4.5. Tambin en los pescados tiene lugar, despus de la pesca, una cierta maduracin natural que influye en su sabor y textura. Como en la protelisis de esta maduracin intervienen, fuera de las enzimas del tejido muscular (catepsinas), tambin otras de origen gastrointestinal, stas no podrn actuar si el pescado es eviscerado antes del salado, p. ej., en la preparacin de preservas. En estos casos una adicin de proteasas fngicas al liquido del curado de los trozos fileteados puede ser til, como tambin en la elaboracin de condensados solubles de pescado. Si ya se desea una hidrlisis ms intensa, como sucede en la preparacin de hidrolizados proteicos, de valor condimenticio a base de pescado, cereales, soya o protenas lcteas,-el uso de proteasas vegetales, animales (pepsina) o microbianas presenta ventajas sobre el sistema clsico de hidrlisis en medio cido bajo presin, pues no produce la destruccin de ciertos aminocidos como el triptfano, ni su racemizacin (10). 5. APLICACIN DE ENZIMAS EN LA INDUSTRIA LECHERA. Es en la quesera donde la aplicacin de enzimas asume el mayor inters en esta industria. 5.1. RENINA, QUIMOSINA O FERMENTO LAB. Origen: Por maceracin de trozos de estmagos de terneros (alimentados slo con leche) en agua salada se obtiene el llamado cuajo, cuyo principio activo es la enzima y que se expende en forma de un extracto liquido o polvo seco, con sal. Si los terneros reciben fuera de leche tambin otro forraje, se va formando pepsina, la cual constituye en el animal adulto la proteasa ms activa del estmago. Accin: Determina la coagulacin de la leche en presencia de sales de calcio, para la formacin de la "cuajada" en la elaboracin de quesos. La renina acta sobre la fraccin kappa-casena de la leche con liberacin de varios pptidos. Al realizar su accin proteoltica, se destruye el efecto de coloide protector de la micela de casena, causando su floculacin. Acidez, tiempo y temperatura en este Lic. M. Alejandra Zinni 38
proceso influyen significativamente en las caractersticas posteriores del queso resultante. pH ptimo: 6-7. Se ha preparado tambin renina a partir de estmagos de aves por su inmersin en solucin de sal, a pH 4 (72). 5.2. ENZIMAS COAGULANTES DE ORIGEN MICROBIANO. Debido a la mayor demanda mundial de carne como alimento, no resulta actualmente muy econmico matar terneros an no destetados para obtener el cuajo. Fuera de la pepsina, a veces en mezcla con la renina, se estn aplicando en quesera, cada vez en mayor escala, enzimas coagulantes de origen microbiano. De aplicacin ya industrial son las de la Endothia parastica, Mucor pusillus L. y Mucor miehei, cuya enzima es la renilasa; stas se caracterizan por tener poca actividad de proteasa. Esto es importante para evitar la formacin de pptidos de sabor amargo durante la maduracin posterior del queso (16, 41). 5.3. ENZIMAS AUXILIARES DE LA MADURACIN DE QUESOS. Para abreviar el proceso de maduracin y mejorar la calidad de los quesos se recurre a la aplicacin adicional de lipasas de origen vacuno, ovino, caprino o fngico y de proteasa de Streptomyces, por ej., en quesos Gouda. En la elaboracin de algunos tipos de quesos la adicin de lipasa se hace a la leche de partida ya pasteurizada, junto al cuajo, pues la pasteurizacin la inactiva (es inhibida a 57C por 30 minutos); por otra parte, la lipasa participa tambin en el aroma de queso, crema y mantequilla. Un ejemplo de la accin de un microorganismo en la maduracin de quesos es la adicin de un cultivo de Penicillium camemberti como fuente de una proteasa extracelular, la cual, al hidrolizar lentamente las protenas del queso Camembert, produce la textura suave y mantecosa que lo caracteriza. En cambio, el Penicillium roqueforti es responsable de la formacin de vetas de color verde-azulado y de metilcetona, caractersticas de los quesos Roquefort, Gorgonzola y Stilton. Proteasas de Streptomyces se usan para acortar la maduracin del queso Gouda, y de Aspergillus flavus para mejorar los caracteres sensoriales del queso Cheddar (10). Para mejorar la textura y aroma del queso Cheddar se suele agregar tambin un cultivo de Streptococcus diacetilactis, pero debe agregarse slo en pequea cantidad a la cuajada, para evitar un hinchamiento del queso por desprendimiento de CO2 (72). 5.4. LACTASA. Origen: Levaduras (Saccharomyces lactis, S. fragilis, Torula cremoris) y Fngico (Aspergillus niger, Streptomyces coelicor, ms termorresistente). Accin: Cataliza la hidrlisis de la lactosa en glucosa y galactosa, desde los extremos de los restos de galactosa; siendo los dos monosacridos resultantes ms dulces y ms fcilmente asimilables. pH ptimo: 4-7. Aplicaciones: Como la lactosa es de menor solubilidad que los otros azcares, tiene Lic. M. Alejandra Zinni 39
tendencia a cristalizar en concentrados de leche y de suero lcteo. Esta cristalizacin va acompaada de una desestabilizacin del complejo de caseinato de calcio, lo que conduce fcilmente en el almacenamiento fro de leches condensadas, helados de leche y de crema y concentrados de suero lcteo a floculaciones, con formacin de sedimentos granulosos o arenosos. Esto se puede evitar -obteniendo productos suaves al paladar- si se hidroliza por lo menos el 20% y hasta el 50% de la lactosa presente mediante la adicin de lactasa. En condensados lcteos que se elaboran con adicin de sacarosa conviene agregar sta slo despus de su tratamiento con lactara, pues la presencia de sacarosa retarda considerablemente la velocidad de hidrlisis por la lactasa. Otra aplicacin tecnolgica de la lactasa es en la elaboracin de leches delactosadas, destinadas a la alimentacin infantil y de adultos que presentan una intolerancia ala lactosa por dficit de su lactasa intestinal. 6. APLICACIN DE ENZIMAS EN LA INDUSTRIA DE DERIVADOS DE FRUTAS Y HORTALIZAS. 6.1. PECTINO-ESTERASA (P.E.) O PECTINO-METIL-ESTERASA. Origen: Es producida por hongos (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum), levaduras, bacterias y algunos vegetales, como tomates, cebollas y frutas ctricas. Accin: Produce la hidrlisis de la pectina, formando cido pctico o poligalacturnico y metanol, al actuar de preferencia sobre los enlaces metlicos, vecinos de grupos carboxlicos libres (15). Como estas enzimas son las causantes de la prdida de las caractersticas de turbidez de algunos jugos y nctares, deben inactivarse por el calor. As sucede con el jugo de tomate, rico en esta enzima, la cual debe inactivarse antes de exprimir el jugo, por calentamiento del tomate a 80C por 45 seg. para as conservar el cuerpo o textura del concentrado. Como estabilizadores de turbidez de jugos o nctares de frutos ctricos suele agregarse a la vez pectinasa y una proteasa vegetal (papana, bromelina), la cual contribuye a aumentar el desdoblamiento del pectato de calcio. Aplicaciones: En cambio, una adicin de preparados a base de pertino-esteraras, muchas veces en mezcla con celulasas y pectinasa (0.05-0.5 g/l) llamados "enzimas filtrantes o clarificantes", al degradar las sustancias pcticas, permite realizar filtraciones rpidas para obtener jugos claros. Sin obstruir los poros del filtro y evitando a la vez cambios de los jugos por fenmenos de oxidacin en las filtraciones lentas. Este proceso de clarificacin se realiza generalmente en diversas fases: a) reduccin de la viscosidad, pero sin cambio de opalescencia; b) floculacin o decantacin y disminucin de la opalescencia, y c) eliminacin de la pectina y obtencin rpida de un filtrado claro. Tambin se aplica una adicin de esta enzima con el objeto de lograr un mayor rendimiento en jugo a partir de algunas frutas que no se pueden prensar con facilidad, quedando retenida una cantidad apreciable de jugo. As sucede en las uvas para obtener el mosto, lo que trae, adems, como ventaja, que los vinos resultantes adquieren mejor aroma, al haberse degradado las sustancias pcticas; Lic. M. Alejandra Zinni 40
tambin aumenta la extraccin del colorante de la uva. En cambio, la antocianasa de diversos hongos puede disminuir la excesiva intensidad de coloracin natural de productos como vinos, mermeladas y jaleas de algunas frutas. 6.2. PECTINASA, POLIGALACTURONIDASA (PG) O PECTINODEPOLIMERASA Origen: Fngico (Aspergillus, Penicillium chrysogenum) y bacteriano (Bacillus). Accin: Desdoblamiento hidroltico de los enlaces glucosdicos de las cadenas de pectina o del cido pctico a oligournidos o a cido galacturnico monmero (con reduccin rpida de la viscosidad). pH ptimo: 3-6 (fngica) y 5-8 (bacteriana). Aplicacin: Se usa en el procesamiento de frutas y hortalizas para preparar jugos y nctares, formando tambin parte de las ya mencionadas "enzimas clarificantes", junto a la pectino-esterasa. Tambin se emplea para la maceracin de tejidos vegetales con el objeto de obtener aromas (16). Por otra parte, en la fermentacin hmeda de las semillas de caf la adicin ex profeso de preparados de pectinasa proveniente de levadura, permite reducir a aproximadamente la dcima parte el tiempo de fermentacin previa del caf para lograr la separacin final de las partculas de pericarpio an adheridas a las semillas (41). 6.3. ENZIMAS DEL AROMA O FLAVORASAS. Origen: Se trata de un gran grupo de enzimas individuales o en mezcla que participan en el aroma y sabor (flavor) de alimentos vegetales. La cromatografa gaseosa en combinacin con la espectrometra de masa y la resonancia magntica nuclear han permitido dilucidar los complejos procesos de la formacin de las sustancias aromticas, en su mayora voltiles, de muchas frutas y hortalizas. Se trata de los productos intermedios o finales de procesos metablicos de biosntesis a partir de precursores, frecuentemente no voltiles y sin olor y sabor. Accin: En muchos procesos de conservacin de frutas y hortalizas, estas enzimas, responsables de aroma y sabor, se destruyen y hay prdida de estos caracteres naturales del producto. Pero como los procesos trmicos no destruyen generalmente los precursores, cabe la posibilidad de una regeneracin y an a veces intensificacin de los aromas propios del alimento por adicin posterior de un concentrado enzimtico obtenido del vegetal fresco, antes del consumo del producto. Se acelera la formacin de aroma si se produce el contacto ntimo de los componentes del tejido con las enzimas, como ser, al desmenuzar o moler el material. Es as que, p. ej., en el ajo y la cebolla, el precursor, la aliina, forma por accin de la enzima: aliinasa, la aliicina, de fuerte sabor picante; sta se pierde en la desecacin, pero al agregar un extracto enzimtico de material fresco al precursor se regenera el aroma primitivo (33). Extractos enzimticos obtenidos a partir de mostaza y repollo han sido utilizados para mejorar el aroma de berros y otras verduras, mientras que la aplicacin de Lic. M. Alejandra Zinni 41
preparados enzimticos extraos al producto, como celulasa, glucosidasa o alcohol-dehidrogenasa (p. ej., para frambuesas y frejoles), se encuentra an en estudio. 6.4. Tambin es posible la aplicacin de enzimas para la correccin del sabor de ciertas frutas y derivados. El caso ms conocido es la eliminacin del desagradable sabor amargo de algunos frutos ctricos, especialmente si se procesan con sus semillas, como pomelos, naranjas y limones. Dicho sabor se debe al flavanonadiglucsido, la narangina, en la cual el enlace entre los dos glcidos constituyentes, la L-ramnosa y la D-glucosa, es tan esencial para el sabor que es desdoblable por la enzima, naranginasa, de origen vegetal o microbiano (Aspergillus o Coniothyrium diplodiella) . Esta va enzimtica a pH 3,5-5 y unos 60C es mucho ms efectiva que la eliminacin de la narangina por una hidrlisis cida o una adsorcin por carbn activo (10, 41, 42). 6.5. GLUCOSA-OXIDASA. Como se describe en Enzimas de accin mltiple (vase Pg. 60), los daos que puede causar en derivados de frutas y de hortalizas la presencia de oxgeno se pueden evitar por la adicin de esta enzima; acompaada, eso s, de catalasa para impedir la destruccin de aromas y de pigmentos antocinicos por el perxido libre que forma la glucosa-oxidasa. Lgicamente, la adicin debe hacerse una vez enfriado el producto despus de su procesamiento trmico (pasteurizacin o esterilizacin). Existen tambin preparados enzimticos, recubiertos de una envoltura resistente al calor y la acidez, que actan slo despus del enfriamiento rpido. En nctares y jugos pulposos es importante que los preparados enzimticos que se apliquen estn exentos de celulasas y pectinasas (que desdoblan las cadenas glucosdicas del cido poligalacturnico en la pectina) para evitar el desdoblamiento de los coloides protectores que estabilizan la turbidez. 7. APLICACIN DE ENZIMAS EN LA INDUSTRIA CERVECERA. Aunque la ms antigua reglamentacin alemana de alimentos, dictada en 1516 por el Archiduque Guillermo IV de Baviera sobre "la pureza de la cerveza", an vigente en Alemania, no permite ms que el uso de malta, hobln, levadura y agua para su elaboracin, las enzimas no son consideradas como aditivos segn la actual legislacin alemana. 7.1. La preparacin de la malta o cebada germinada (la cual constituye junto con el hobln o lpulo, la levadura y el agua, las materias primas para la elaboracin de esta bebida) tiene por objeto lograr por la germinacin la transformacin de los componentes proteicos y amilceos insolubles de la cebada en otros tantos solubles, de desdoblamiento, los cuales pasarn posteriormente al caldo de fermentacin. Mientras que esto sucede en la malta verde por la actividad ejercida por las proteasas y amilasas propias del cereal durante la germinacin de la malta y la posterior incorporacin de agua, resulta conveniente una suplementacin enzimtica con alfa-amilasa, glucoamilasa y proteasas de origen vegetal o microbiano (vase aplicacin de enzimas en molinera y panadera), en caso que la Lic. M. Alejandra Zinni 42
malta se adicione desde un principio (por razones econmicas) de cierta proporcin de cereal (cebada, maz o trigo) no germinado. 7.2. Por otra parte, puede aplicarse junto con alfa-amilasa y proteasas, la Glucanasa, enzima proveniente del Bacillus subtilis, para descomponer glucano, sustancia gomosa de la cebada. 7.3. Otra aplicacin importante de proteasas vegetales o microbianas tiene lugar en la cerveza ya terminada, susceptible de experimentar enturbiamientos de origen no biolgico, que le pueden comunicar un aspecto desagradable. Los factores causantes de estos enturbiamientos son el oxgeno, la luz, el calor, trazas metlicas y, especialmente, la presencia de protenas de alto peso molecular, provenientes va sea de la cebada o de la levadura. Estas protenas coagulan por influencia del oxgeno y tambin de los taninos y carbohidratos existentes, especialmente despus del almacenamiento en fro de la cerveza ya terminada. Mediante la adicin de proteasas, como la papana, estas protenas se desdoblan en sus componentes hidrosolubles (pptidos hasta aminocidos), que ya no causan precipitaciones o enturbiamientos. Para este objeto s pueden mezclar directamente 2-4 ml de Auxillasa lquida (un concentrado normalizado de papana de Merck) por hectolitro de cerveza, despus de su filtracin, al trasegarla al estanque de presin y dejndola actuar algunos das, hasta una semana. Como la enzima mantiene su accin despus de la pasteurizacin (62C por 20 min.) y del llenado de las botellas, la cerveza se estabiliza as durante un largo tiempo, volvindose menos susceptible ala agitacin y al fro y sin ser afectados su sabor, pH y espuma (16, 41) . Para lograr este mismo efecto se suele recurrir tambin a preparados enzimticos a base de proteasas de origen fngico (Aspergillus), a veces unidos a un tratamiento sinrgico con tanino (72). 7.4. En cuanto a los enturbiamientos y floculaciones de origen biolgico, stos son causados por la presencia de levaduras y otros grmenes aerobios en la cerveza. En estos casos la adicin, antes de la pasteurizacin, de glucosa-oxidasa (vase sta) asociada a catalasa permite eliminar el oxgeno necesario para la actividad de estos microorganismos. De esta manera es posible mejorar el sabor y la estabilidad de la cerveza frente a este fenmeno y tambin frente a una posible contaminacin metlica de las cervezas enlatadas (50). Para estos fines suele usarse tambin la mezcla de 5 mg/1 de glucosa-oxidasa y 25 mg/1de metabisulfito de sodio 7.5. Tambin puede recurrirse a una adicin de glucoamilasa (vase sta) a la cerveza para mejorar su estabilidad y lograr a la vez un desdoblamiento mayor de las dextrinas (10). 8. ENZIMAS ALIMENTOS. DE APLICACIN MULTIPLE EN LA INDUSTRIA DE
8.1. GLUCOSA-OXIDASA. Origen: Fngico (Aspergillus niger, Penicillium vitale y notatum). Lic. M. Alejandra Zinni 43
Acciones: Oxidacin de glucosa por O2 a D-glucono-delta-lactona, la cual es hidrolizada por la lactonasa (presente en la mayora de los preparados enzimticos de glucosa-oxidasa) a cido glucnico y perxido de hidrgeno: C6H12O6 + O2 + H2O ____________________________ C6H12O2 + H2O2
Si a la vez est presente o se agrega catalasa, los productos finales son cido glucnico, agua y oxigeno. pH ptimo: 3-7. Aplicaciones: En jugos y otros derivados de frutas y verduras, vinos y cervezas, la glucosa-oxidasa (10-30 mg/1) en mezcla con catalasa permite eliminar el oxgeno, causante de cambios de color, prdidas de aroma y de vitamina C y de turbideces y floculaciones debidas a microorganismos aerobios. Por su adicin a conservas y bebidas enlatadas se puede reducir tambin la migracin de metales a su contenido, al disminuir fenmenos de corrosin, Si el producto no contiene suficiente glucosa es conveniente agregar un 0,1%. La mezcla de ambas enzimas puede usarse tambin para la proteccin superficial contra la oxidacin por impregnacin del material de empaque de quesos, carnes y alimentos deshidratados. Tambin se puede aplicar la glucosa-oxidara en mezcla con glucosa y con un tampn para neutralizar el cido glucnico que se va formando. Al colocar una bolsita impermeable al agua, pero permeable al oxigeno con esta mezcla, dentro del envase del producto, el oxgeno de la atmsfera del envase es rpidamente captado; protegiendo de este modo productos deshidratados con alto contenido de grasa y otros componentes sensibles a la oxidacin. Por otra parte, se usan tambin estas dos enzimas en la desecacin de clara y huevo entero (unos 120 mg/kg) para eliminar los indicios de glucosa, que contienen; lo que causa pardeamiento segn Maillard, con cambios de color, sabor y olor. A la vez aumenta la estabilidad y el poder espumante por batido de la clara. A menudo conviene agregar perxido de hidrgeno, necesario para el de la reaccin (a pH7 y 30C) (50). En el caso de que la clara de huevo est acompaada de un poco de yema, tan rica en grasa, puede suceder que sta impida la formacin de espuma, evitando el debido esponjamiento. En este caso la adicin de otra enzima, la lipasa (proveniente del ricino) desdobla la grasa, permitiendo as una mayor incorporacin de aire y formando ms espuma. 8.2. CATALASA O HIDRGENO-PERXIDO-OXIDO-REDUCTASA. Origen: Fngico (Aspergillus niger), bacteriano (Micrococcus sp.) y animal (hgado, eritrocitos de origen vacuno y porcino). Accin: Cataliza el desdoblamiento de perxido de hidrgeno en agua y oxigeno. pH ptimo: 4-9. Aplicaciones: Preparados enzimticos que contienen glucosa-oxidara junto con catalasa se emplean (fuera de los usos recin mencionados) como antioxidantes de Lic. M. Alejandra Zinni 44
productos lquidos y pastosos, como mantequilla, mayonesa y grasa animal, eventualmente con adicin de glucosa (0,5%). Aqu debe evitarse que el lpido tenga exceso de acidez, la cual puede inactivar la catalasa. Suelen aplicarse del preparado enzimtico 20-25 mg/kg. En la elaboracin de vinos la adicin de ambas enzimas (ms 0,1 % de glucosa) impide el crecimiento de microorganismos aerobios y la formacin de exceso de acidez voltil. Sin embargo, debe evitarse la inhibicin de la catalasa por el pH cido del vino (su inactivacin se produce a pH de 3-3,5), pues entonces quedara H2O2 sin descomponerse, causando cambios desagradables de color y/o sabor. CUADRO RESUMEN DE ALGUNAS APLICACIONES INDUSTRIALES DE ENZIMAS MICROBIANAS, SEGUN REED (3) Preparacin enzimtica a base de: Tipo de enzima Nivel mximo en ppm
Usos tpicos
Panificacin-Molinera, Cereales precocidos (para mejorarlos por modificacin de su almidn). Carbohidrasa Fermentacin de cerveza Bacillus subtilis Jarabe de chocolate (control de viscosidad) Cerveza (mantencin de transparencia). Proteasa Galletas (modificar la masa) Hidrolizados proteicos Pescado (curado de filetes y condensados solubles) Aspergillus Carbohidrasa Jarabes hidrolizados de almidn oryzae Sacarificacin de desechos de destilacin (produccin de alcohol)
500
100 100 10 40 500 1000 250
1000
Cerveza (eliminacin de almidn)
10 45
Jugos de fruta (clarificacin) Jarabe de chocolate (control de viscosidad) Carbohidrasa y Panificacin y galletera (modificacin Proteasa de masa) Proteasa Carbohidrasa Celulasa Ablandadora de carne Sacarificacin de restos de destilera (prod. de alcohol) Concentrado liquido de caf (control de viscosidad)
400 200
50 500
100
Huevo seco (eliminacin de glucosa) Aspergillus Glucosaniger oxidasa y Derivados de frutas y hortalizas, vinosy Catalasa cervezas (eliminacin de oxigeno) Pectinasa jugos de fruta y vinos (produccin y Pectinestearasa clarificacin) Lipasa Queso (produccin de aroma y sabor)
750 10
200 100
La catalasa sola tiene tambin aplicacin para eliminar exceso de agua oxigenada de alimentos (por ej., de leche) y para la produccin de oxigeno, a partir de agua oxigenada en la preparacin de baos de oxigeno (43). 8.3. LIPASAS: Origen: Animal (pancretica), vegetal (semillas de soya, ricino, algodn y cereales como trigo y maz) y fngico (Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Gandida). En la leche hay una lipasa naturalmente activa, adsorbida en los glbulos grasos y otra lipasa que se activa por tratamiento mecnico (agitacin, homogeneizacin). Accin: Cataliza la hidrlisis de triglicridos a diglicridos, monoglicridos y cidos grasos, ms glicerina, liberando de preferencia los cidos grasos de las posiciones 1 y 3 de los glicridos. Rangos de pH: 8-9 (animal), 4-5 (vegetal) y 2-9 (fngica). Aplicaciones: Se usa en el desdoblamiento de lpidos, en la produccin de aroma de quesos (vase Aplicacin de enzimas en la industria lechera), crema, Lic. M. Alejandra Zinni 46
mantequilla, margarina y productos de chocolatera. Tambin se usa en el desgrasado de protena. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
(1) W. HARTMEIER: Inmobilisierte Enzyme fr die Lebensmitteltechnologie. Lebensmitteltechnologische Kolloquien, Lippe in Lemgo (1977) . (2) Invitacin al Simposio Internacional sobre la utilizacin de enzimas en tecnologa alimentara. Ann. des falsif. et de lexpertise chimique 74, 801, 575 (1981). (3) G. REED: Enzymes in food processing. Academic Press, New York (1966). (4) a) J. B. S. BRAVERMAN: Introduction to the biochemistry of foods Elsevier (1963) b) Z. BERK: Braverman's Introduction to the biochemistry of foods. 2nd. edition. Elsevier (1976) . (5) S. BERNHARD: The Structure and Function of Enzymes. N. A. Benjamin Inc., New York (1968) . (6) A. L. LEHNINGER: Biochemistry, 2nd. Ed. Worth Publishers, Inc. New York (1975) . (7) L. STRYER: Bioqumica. Edit. Revert, S. A. Barcelona (1976). (8) D. E. METZLER: Biochemistry, Academic Press, New York (1977). (9) a) H. U. BERGMEYER: Methoden der enzymatischen Analyse. Verlag Chemie. Weinheim (1962). b) H. U. BERGISIEYER: Methods of enzymatic analysis. 2nd. edition. Academic Press Inc. New York (1974) . (10) H. RUTTLOFF et al.: Industrielle Enzyme. Dr. D. Steinkopff. Verlag. Darmstadt (1979). (11) H. SCHMIDT-HEBBEL: Avances en Ciencia y Tecnologa de alimentos. Alfabeta Impresores. Santiago (1981). (12) T. H. MAUGH: Bioregulators: Alteration of gene expression in Citrus fruit. Science 184, 655 (1974). (13) H. RUTTLOFF R J. HEMPEL: Zum Einsatz von Enzymen bei der Lebensmittelproduktion. Ernhrungsforschung. Akademie Verlag. Berlin 4, 25, 102 (1980) (14) AUTCHER, JENSSEN, ALTHOUSE: Fundamentos de Bioqumica Agrcola. Ed. Salvat (1954). (15) J. A. ASENJO: Ingeniera enzimtica, un nuevo enfoque en biotecnologa. Rey. Alimentos 3, 1, 37 (1978). (16) A. ILLANES, G. SCHAFFELD: Utilizacin de enzimas en la industria alimentara. Rey. Alimentos 6, 2, 35 (1981). (17) E. J. BECKHORN, M. D. LABBEE, L. A. UNDERKOFLER: Production and use of microbial enzimes for food processing. J. Agr. Food Chem. 13, 1 (1965) (18) H. SCHMIDT-HEBBEL: Aditivos y Contaminantes en alimentos. Editorial Universitaria (1979). (19) SOC. OF CHEMICAL INDUSTRY: Production and application of enzyme preparations in food manufacture. Monograph N 11. London (1961) . (20) S. A. BARKER, C. J. GRAY, A. W. LOMATH: The stabilization of enzymes for industrial use. Biochem. Soc. Trans. 7, 5 (1979). (21) E. MERCK: Enzimas enlazadas a polmeros. Darmstadt (1973) . (22) J. R. WHITAKER: The effect of variety and maturity on the proteolitic content of figs. Food Research 23, 4 (1958). (23) H. SCHMIDT-HEBBEL: Intoxicaciones por alimentos. Escuela Salesiana La Gratitud Nacional, Santiago (1969). (24) A. JOSLYN, J. B. S. BRAVERMAN: Advances in Food Research 5, 97 (1959).
47
(25) R. B. GUYER, J. W. HOLMQUIST: Regeneration in High-Temperature-Short-Time Canned Food journ. Food Techn. Australia 7, 199 (1955). (26) S. SCHWIMMER: Regeneration of heat-inactivated peroxidase. Journ. Biol. Chem. 154, 487 (1944). (27) R. B. GUYER, J. W. HOLMQUIST: Food Technology 547 (1954). (28) A. ILLANES, G. SCHAFFELD: Actividad enzimtica en relacin al deterioro y preservacin de alimentos. Revista Alimentos 6, 2, 48 (1981). (29) H. W. SCHULTZ, A. F. ANGLEMEIR: Symposium Food Proteins and their reactions. AVI. Publ. (1964). (30) H. W. SCHULTZ, A. F. ANGLEMEIR: Symposium Food Enzymes AVI Publ. (1960). (31) A. DELINCEE, J. BECKER, B. RADOLA: Heat-inactivated peroxidase isoenzymes in green beans. Congress of Food Science and Technology 1, 270 (1970). (32) G. P. ELLIS: The Maillard Reaction. Advances Carbohydrate Chemistry 14 (1959) . (33) H. SCHMIDT-HEBBEL: Las Especias. Su Qumica y Tecnologa. Editorial Universitaria, Santiago (1980). (34) M. A. JOSLYN, J. D. PONTING: Enzyme catalized oxidate browning fruit products. Advances in Food Research 3, 1 (1950) . (35) J. D. PONTING, M. A. JOSLYN: Ascorbic acid oxidation and browning in apple tissue extract. Arch. Bioch. 19, 47 (1948). (36) M. SCHEEL, C. VERGARA, I. PENNACCHIOTTI, H. SCHMIDT-HEBBEL: Determinacin de los principales substratos del pardeamiento enzimtico y estudio de la polifenoloxidasa en manzanas chilenas. Agroqumica y Tecnologa de Alimentos, Valencia, Espaa (1969). (37) L. GUZMN, I. PENNACCHIOTTI, H. SCHMIDT-HEBBEL: Estudio del pardeamiento enzimtico de peras cultivadas en Chile. Anal. Facultad de Qum. y Farm. Universidad de Chile (1969). (38) E. J. PYLER: Enzymes in baking. Theory and practice. Bakers Digest 43, 1-2, 36-52 (1969). (39) A. OSTROVOSKI ET AL.: Fundamentos de la Tecnologa de los Productos Alimenticios. Traducido del ruso por B. Zapatero. Editorial MIR, Mosc. (40) ROHM AND HAAS Co.: Enzyme topics 5 (1965). (41) H. SCHMIDT-HEBBEL: Avances en Ciencia y Tecnologa de Alimentos. Alfabeta Impresores, Santiago (1981) (42) R. BURKHARDT: Beobachtungen beim Entbittern yon Grapefruit. Mitt. G.D.Ch. Lebensm. Gerichtl. Chem. 12, 354 (1971). (43) G.D.Ch. FACHGRUPPE LEBENS. U. GERICHTL. CHEM.: Standard fr Enzympreparate zur Be- u. Verarbeitung yon Lebensmitteln. Franfurt/M. (1975). (44) H. K. FRANK: Deutsche Lebensmittel-Rundschau 68, 8, 252 (1972). (45) H. K. FRANK: Umschau 1, 19 (1974) . (46) G. LOTT, K. H. FRANK: Deutsche Lebensmittel-Rundschau 69, 2, 73 (1973). (47) INFORMATIONSBLATT fr deut. Wissenschaftler im Ausl. 8, 12 (1974). (48) WHO FOOD Additives Series N 2 Genera (1972). (49) M. E. PINTO y A. HOUBRAKEN: Mtodos de anlisis qumico de leche y productos lcteos. Centro Reg. Capacitacin en Lechera de FAO. Santiago (1976). (50) J. VOIGT: Anwendungsmglichkeiten der Glukoseoxidase Mitt. Ges. Deut. Chemiker, Fachgr. Lebensm. u. Gerichtl. Chem. 15, 242 (1961). (51) J. SCHORMLLER: Enzymatische Analytik in Lebensmittelchemie u. Technologie 19, 2, 18 (1965).
48
(52) El mercado de las enzimas industriales. Revista Alimentos 6, 3, 32 (1981). (53) E. MERCK: Biochemica - Merck. Darmstadt (1979). (54) F. C. ASENJO: The chemistry of papaine. Bol. Oficial Asoc. Qum. Puerto Rico (1951). (55) S. BERGSTROM: On the oxidation of linoleic acid with lipoxidase. Arch. Chem. Mineral. Geol. 21 A, 15 (1946) (56) Z. J. KERTESZ: The pectic substances (1951). (57) H. SCHMIDT-HEBBEL: Control de calidad de carnes. Rey. Contacto Latinoamericano. E. Merck. 3, 11 (1980). (58) BOEHRINGER MANNHEIM, BIOCHEMICA: Methoden der enzimatischen Lebensmittel-analytik 75/76 & 77/78. 59) R. M. ROTH, R. FOSTER, J. VINAGRE, I. PENNACCHIOTTI: Estudio enzimtico y tecnolgico de arvejas destinadas a la congelacin. Tesis tt. Qum. Farm. Universidad de Chile, (1975). (60) 1. ESPINOSA, J. VINAGRE, I. PENNACCHIOTTI: Estudio enzimtico y tecnolgico de algunos vegetales, destinados a la congelacin. Tesis tt. Qum. Farm. Universidad de Chile (1974). (61) M. P. MASURE, H. CAMBELL: Rapid estimation of peroxidase in vegetable extracts as index of blanching for frozen vegetables. The fruit products. Journ. American Food Manufacture 23, 8 (1944). (62) H. MORRIS: Application of peroxidase test paper in food processing. Food Techn. 12, 6 (1958). (63) A. IBIETA, I. CORDERO, V. PARRAGUIRRE, I. PENNACCHIOTTI, H. SCHMIDTHEBBEL: Estudio de envases plsticos para industrializacin de palta chilena. Rev. Agroqumica y Tecnol. de Alimentos, Valencia (Espaa) , 12, 3, 444 (1972). (64) R. M. SANDSTEDT, E. KNEEN, NI. BLISH: J. Cereal Chemistry 16, 712 (1939). (65) WORTHINGTON BIOCHEMICAL CORPORATION: Worthington Enzyme Manual. New jersey (1972). (66) BALLS & HOOVER: Journ. Biolog. Chem. 121, 137 (1937). (67) A. TEMPERLI, H. SCHRER, U. KNSCH: Un mtodo enzimtico para determinacin de glucosa en bebidas. Flssiges Obst. 7, 257 (1976). (69) I. PENNACCHIOTTI M.: Apuntes de clases, Prof. Montgomery. Corvallis, Oregon State University (1966). (70) E. R. STADTMAN, G. D. T. NOVELLI & F. DIPMAN: Journ. Biol. Chem. 365, 191 (1951). (71a) SERVICIO NACIONAL DE SALUD: Reglamento Sanitario de los Alimentos. Santiago, Chile (1961) y sus modificaciones (1976). (71b) MINISTERIO DE SALUD PBLICA: Reglamento Sanitario de los Alimentos. Decreto N 60, del 5 de abril de 1982 y publicado en el Diario Oficial del 5 de junio de 1982. (72) D. PINTAURO: Food processing enzimes. Recent developments. Noyes Data Corporation. New jersey (1979). (73) A. VALENZUELA: La inmovilizacin de enzimas y sus aplicaciones bioanalticas. Revista Alimentos (en prensa). (74) G. PINCHEIRA V.: Desarrollo de la biotecnologa de enzimas. Rev. Creces 3, 1-2 (1982). (75) J. L. VETTER, M. P. STEINBERG y A. I. NELSON: Quantitative determination of peroxidase in sweet corn. Agricultural and Food Chemistry 6, 1 (1958). (76) THE UNITED STATES PHARMACOPEIA, U.S.P. XVIII (1970) , Pg. 1026. (77) G. PETTERMANN, F.: Maduracin artificial de las frutas por el gas etileno. Tesis, Ct. Bromat, Fac. Qum. y Farm. Santiago (1939).
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