Burseraceae F

PROGRAMA NACIONAL DE CIENCIAS BASICAS
INFORME TECNICO FINAL

PROYECTO

"Aislamiento de principios biolgicamente activos presente en especies
colombianas de la familia Burseraceae".

Cdigo 1203-05-10122.

Contrato N 449-2000.

Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Departamento de Qumica

Jorge Robles Camargo

Grupo de Investigacin Fitoqumica
GIFUJ

TABLA DE CONTENIDO

1. TITULO3

2. CONTRATO3

3. ENTIDAD, INVESTIGADOR PRINCIPAL Y GRUPO DE
INVESTIGACIN...3

4. RESUMEN DE LOS RESULTADOS DE
CONOCIMIENTO...4

5. SINOPSIS DE
RESULTADOS...6

6. CUADRO DE RESULTADOS DE
CONOCIMIENTO...8

7. CUADRO DE OTROS
RESULTADOS.12

8. DESCRIPCION DEL IMPACTO POTENCIAL DE LOS
RESULTADOS.14

9. BREVE DESCRIPCIN DE CADA ANEXO...14

10. RESULTADOS DE CONOCIMIENTOS ADICIONALES.15

11. AGRADECIMIENTOS17

PROGRAMA NACIONAL DE CIENCIAS BASICAS

INFORME TECNICO FINAL

1. TITULO: "Aislamiento de principios biolgicamente activos presente en
especies colombianas de la familia Burseraceae". Cdigo 1203-05-10122.

2. Contrato N 449-2000.

3. Entidad: Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
Departamento de Qumica.
Investigador Principal Jorge Robles Camargo.
Grupo de Investigacin Grupo de Investigacin Fitoqumica, GIFUJ.

4. Resumen de los resultados de conocimiento:

Los resultados de la investigacin se presentan en dos partes, en primera instancia los
correspondientes a los ensayos de actividad antimicrobiana y en segunda instancia los de los
estudios fitoqumicos.

Presentan actividad fungisttica los extractos etanlicos de hojas y corteza de Busera
simaruba (caratero) frente a los hongos fitopatgenos Fusarium oxysporum y Botrytis
cynerea, el extracto etanlico de hojas de Bursera graveolens (tachuelo) presenta accin
fungisttica frente a F. oxysporum. De igual manera las fracciones Eter de petrleo,
Diclorometano y Acetato de etilo de hojas y corteza de B. simaruba y B. graveolens
presentan actividad fungisttica frente al hongo F. oxysporum.

Adicionalmente, se determin la Dosis Mnima Inhibitoria de cada uno de los extractos que
presentaron actividad, encontrndose que para el extracto etanlico la DL50 se encuentra en
el rango de concentraciones entre 100 mg/mL 332 mg/mL y para las diferentes fracciones
en un rango de concentraciones entre 50 mg/mL 166 mg/mL.

El extracto etanlico de hojas de B. simaruba (E.EtOH.H.Bs) presenta el mayor porcentaje
de inhibicin de crecimiento frente a los hongos; siendo del 45.8% frente a F. oxysporum,
del 45.5% frente a B. cynerea y del 11.2% frente a T. viride cuando se aplicaron a una
concentracin de 200 mg/mL, como se aprecia en el anexo No. 1.

Continuando con la evaluacin de la actividad antimicrobiana presente en las partes areas
de B. simaruba y B. graveolens se hizo el ensayo frente a microorganismos, tales como E.
coli, S. aureus, B. subtilis, T. mentagrophytes, M. canis y F. oxysporum.

Para este segundo grupo de ensayos antimicrobianos, la materia prima vegetal provino de los
Municipios de Agua de Dios y Tocaima, en el Departamento de Cundinamarca. Para la
extraccin los solventes utilizados fueron etanol, ter de petrleo, diclorometano y acetato de
etilo.

De acuerdo a la complejidad de la mezcla de compuestos presentes se establecieron diferentes
concentraciones; para el extracto total (Etanol) se trabajo 200, 225 y 250 mg/mL; y para las fracciones (ter de
petrleo, diclorometano y acetato de etilo), 50, 75, 100, 125 y 150 mg/mL.

Para la seleccin de las cepas, se tuvo en cuenta su relacin con los distintos cuadros clnicos
que causan. Realizando la evaluacin por la tcnica de Perforacin en Gel.

Los extractos totales de hojas obtenidos de B. simaruba y B. graveolens presentaron
actividad inhibitoria de crecimiento frente a S. aureus y B. subtilis cuando se aplicaron a
concentraciones de 250 mg/mL.

Se realizaron todos los ensayos con cada fraccin aplicadas a cada microorganismo y se
obtuvo que la fraccin acetato de etilo de hojas y corteza de B. graveolens present mayor
actividad frente a S. aureus obtenindose un halo de inhibicin promedio de 19,8 mm y 23,0
mm respectivamente en la concentracin de 150 mg/mL. Mientras que para B. simaruba se
obtuvo una mejor actividad en el extracto total, tanto de hojas como de corteza en las
concentraciones de 250 mg/mL. A su vez B. subtilis present un halo de inhibicin de 18.5
mm en el extracto etanlico de hojas de la especie de B. graveolens, en la concentracin
de 250 mg/mL. Presentando este microorganismo un halo de inhibicin de 18.3 mm frente a
la fraccin de acetato de etilo de corteza, a la mayor concentracin. Mientras en B.
simaruba la mayor inhibicin se presento en el extracto etanolico, tanto de hojas como de
corteza, a una concentracin de 250 mg/mL.

La evaluacin antifngica de los extractos etanlicos en las concentraciones de 16.6 mg/mL
y 33.3 mg/mL, de las partes areas de B. graveolens y B. simaruba mostraron actividad
inhibitoria de crecimiento frente a los tres hongos estudiados. M. canis present inhibicin a
las fracciones de B. simaruba, tanto para hojas como para corteza. F. oxysporum fue el
microorganismo que presento mayor resistencia frente a las fracciones de B. graveolens y
B. simaruba. En cuanto a T. mentagrophytes no present inhibicin frente a la especie B.
graveolens; mientras, que frente a B. simaruba mostr inhibicin con las fracciones de
acetato de etilo (Ver anexo No. 2).

De estos ensayos podemos concluir que los extractos etanlicos y las fracciones de las
partes areas de B. simaruba y B. graveolens presentaron actividad frente a S. aureus y B.
subtilis, T. mentagrophytes, M. canis y F. oxysporum. Sin embargo, no se present
ninguna actividad contra la bacteria Gram (-) Escherichia coli.

La fraccin ms activa de B. graveolens fue acetato de etilo contra B. subtilis y S. aureus;
mientras que el extracto etanlico de B. simaruba mostr la mayor actividad frente a B.
subtilis y S. aureus.
La CMI para B. subtilis y S. aureus es diferente dependiendo del tipo de extracto y la
especie vegetal que se trabaje. Para las fracciones de las dos plantas, la CMI ptima es de
50 mg/mL.

De los resultados de la evaluacin antifngica, se observ que el ms activo es el extracto
etanlico de corteza de B. graveolens a una concentracin de 33.3 mg/mL frente a T.
mentagrophytes y dando un porcentaje de inhibicin del crecimiento del 89.4 %. De otro
lado, tanto extractos como fracciones de B. simaruba presentaron un porcentaje de
inhibicin de crecimiento superior al 30 % contra M. canis, pero hay que resaltar la poca
concentracin (3,33 mg/mL) de la fraccin de corteza en acetato de etilo (ver anexo No. 2).

Con relacin a la investigacin fitoqumica de la especie B. simaruba se hicieron las
comparaciones cromatogrficas uni- y bidimensionales de las fracciones en ter de petrleo
y diclorometano tanto de hoja como de corteza, obtenindose resultados muy parecidos en la
composicin qumica y desafortunadamente muy pobres en metabolitos.

El anlisis qumico realizado a los extractos en ter de petrleo de las hojas y de la corteza
de B. simaruba permiti aislar e identificar una mezcla de triterpenos pentacclicos, -
amirina, -amirina y un triterpeno tetracclico el -sitosterol.

Los triterpenos pentacclicos -amirina y -amirina fueron aislados en suficiente cantidad
nicamente de las fracciones de corteza; mientras, que el triterpeno tetraciclico -sitosterol
fue aislado en buena cantidad nicamente de las fracciones obtenidas de las hojas. A pesar
de que todos fueron detectados en todas las fracciones (Anexo No. 6).

De estos compuestos aislados se realizaron ensayos antimicrobianos de igual manera que
se haban hecho con los extractos y fracciones y no dieron resultados positivos.

Con relacin al estudio fitoqumico de la especie Bursera graveolens se estudi la fraccin
ter de petrleo de hojas y la fraccin de diclorometano de corteza que presentaron algunas

diferencias, pero en su mayora semejanzas en cuanto al contenido de metabolitos al ser
comparadas cromatogrficamente.

De las cromatografas en columnas desarrolladas a estas fracciones se aislaron y purificaron
7 slidos de los cuales se encuentran en estudio cuatro de ellos y tres han sido estudiados
por sus caractersticas espectroscpicas e identificados como cido 3-oxotirucala-8,24-dien-
21-oico (cido elemnico), cido 3-hidroxitirucala-8,24-dien-21-oico (cido elemlico) y
cido 3-hidroxitirucala-7,24-dien-21-oico. (Anexo No. 7)

Las fracciones muestran actividad antimicrobiana y se ha detectado en la banda de los tres
cidos, sin embargo al separar los compuestos la actividad se pierde, lo que indica que hay
la posibilidad que exista un sinergismo entre los tres compuestos para presentar la actividad
antimicrobiana mostrada por estas fracciones y extractos.

5. Sinopsis (Abstract) de resultados
De esta investigacin se proponer algunas de las especies estudiadas como promisoria en el
tratamiento de enfermedades infecciosas comunes.

Presentan actividad fungisttica los extractos etanlicos de hojas y corteza de Busera
simaruba y el de corteza de Bursera graveolens frente a Fusarium oxysporum y Botrytis
cynerea. Todas las fracciones de hojas y corteza de ambas especies tienen accin
fungisttica frente a F. oxysporum.

Al calcular la Dosis Mnima Inhibitoria de cada uno de los extractos, se determin que se
encuentra entre 100 mg/mL 332 mg/mL y para las fracciones entre 50 mg/mL 166 mg/mL.

El extracto etanlico de hojas de B. simaruba presenta inhibicin del 45.8% frente a F.
oxysporum, del 45.5% frente a B. cynerea y del 11.2% frente a T. viride a 200 mg/mL
Anexo No. 1.

Los extractos totales de hojas de B. simaruba y B. graveolens presentan actividad
inhibitoria de crecimiento frente a S. aureus y B. subtilis a 250 mg/mL. La fraccin acetato
de etilo de hojas y corteza de B. graveolens inhibe a S. aureus a 150 mg/mL. Mientras que
el extracto total tanto de hojas como de corteza de B. simaruba mostr actividad a 250
mg/mL. A su vez B. subtilis fue inhibido por el extracto etanlico de hojas y por la fraccin
de acetato de etilo de corteza de B. graveolens a 250 mg/mL. Igual efecto mostraron los
extractos etanlicos, tanto de hojas como de corteza de B. simaruba.

Los extractos etanlicos en las concentraciones de 16.6 mg/mL y 33.3 mg/mL de B.
graveolens y B. simaruba mostraron inhibicin de frente a los hongos estudiados. M. canis
present inhibicin a las fracciones de hojas y cortezas de B. simaruba. En cuanto a T.
mentagrophytes frente a B. simaruba mostr inhibicin con las fracciones de acetato de
etilo (Ver anexo No. 2).

Podemos decir que los extractos etanlicos y las fracciones de hojas y cortezas de B.
simaruba y B. graveolens tienen actividad frente a S. aureus y B. subtilis, T.
mentagrophytes, M. canis y F. oxysporum. Pero, no se mostr actividad frente a la
bacteria Gram (-) Escherichia coli.

Para las diferentes fracciones de las dos plantas investigadas, la CMI ptima es de 50
mg/mL.

El extracto etanlico de corteza de B. graveolens a 33.3 mg/mL inhibe el crecimiento de T.
mentagrophytes con un 89.4 %. De otro lado, tanto extractos como fracciones de B.
simaruba presentan inhibicin de crecimiento superior al 30 % contra M. canis, resaltando
que la fraccin en acetato de etilo de corteza estaba a 3,33 mg/mL (ver anexo No. 2).

De la fraccin en ter de petrleo de la corteza de B. simaruba se aislaron e identificaron -
amirina y -amirina; mientras, de la misma fraccin de hojas se aisl e identific el -
sitosterol (Anexo No. 6).

De las fracciones en ter de petrleo de hojas y corteza de B. graveolens se aislaron y
purificaron tres slidos identificados como cido 3-oxotirucala-8,24-dien-21-oico, cido 3-
hidroxitirucala-8,24-dien-21-oico y cido 3-hidroxitirucala-7,24-dien-21-oico. (Anexo No. 7)

II. Cuadros de resultados

CUADRO NO. 1 (Resultados de conocimiento)

OBJETIVOS
1

(del proyecto
aprobado)
RESULTADO
ESPERADO
2

(segn proyecto
aprobado)
RESULTADO
OBTENIDO
3

INDICADOR
VERIFICABLE
DEL
RESULTADO
4

No. DE
ANEXO
SOPORTE
5

OBSERVACIONES
6

1. Aislar los
componentes qumicos
o la mnima mezclas de
compuestos,
responsables de la
actividad desinfectante,
antimicrobiana y/o
antifngica de las
especies vegetales
escogidas para la
investigacin y que se
conocen como
"caratero" y "tachuelo".

Los obtenidos en
respuesta al logro de
los objetivos.
Se obtuvo los extractos
etanlicos tanto de
hojas y corteza de B.
graveolens como de B.
simaruba por el mtodo
de maceracin y reflujo;
y, posteriormente se
realizaron los
fraccionamientos
slido/lquido y
lquido/lquido con ter
de petrleo,
diclorometano y acetato
de etilo.
De esta manera se
obtuvo los extractos
etanlicos de hojas y
corteza y las fracciones
en ter de petrleo,
diclorometano y acetato
de etilo y se hicieron
los ensayos
antimicrobianos frente
a los diferentes
microorganismos.
Actividad
antimicrobiana
presente en
partes areas
de las
especies B.
simaruba y B.
graveolens
(Burseraceas),
frente a
microorganism
os como:
Agrobacterium
tumefaciens,
Erwinia
carotovora,
Fusarium
oxysporum,
Trichoderma
viride y
Botrytis
cinerea.

Anexo No. 1

1
Se debe indicar el objetivo planteado de acuerdo con la ficha aprobada del proyecto.
2
Se debe especificar el resultado esperado comprometido, correspondiente al objetivo planteado
3
Elaborar una breve resea del resultado obtenido
4
Especificar el indicador de producto con el cual se puede verificar el logro de los resultados (artculo o libro publicado, manuscrito de artculo o libro sometido para
publicacin, nombre de patente presentada u homologada, norma establecida, software registrado, prototipo desarrollado, etc.).
5
Relacionar el nmero del anexo que soporta o contiene el indicador del producto obtenido (copia de la publicacin, patente, registro, norma, etc. o de la fuente de
certificacin o verificacin respectiva).
6
Incluir aquella informacin adicional que el investigador considere importante o necesario que Colciencias conozca, con relacin al cumplimiento de los compromisos
adquiridos contractualmente con el proyecto

Evaluacin de
la actividad
antimicrobiana
de los
extractos de
partes areas
de las
especies B.
simaruba y B.
graveolens
contra algunos
microorganism
os patgenos
Anexo No.2
De las fracciones en
ter de petrleo y
diclorometano de
hojas y corteza de B.
simaruba se aislaron
e identificaron -
amirina, -amirina y -
sitosterol
Contribucin
al estudio
fitoqumico
de Bursera
simaruba (L)
Sarg.
Anexo No. 6
2. Comprobar la
actividad de cada
componente o de las
mezclas a travs de
ensayos
antimicrobianos y
antifngicos.
Los obtenidos en
los objetivos.
- Las fracciones Eter de
petrleo, Diclorometano
y Acetato de etilo tienen
actividad frente a F.
oxysporum. Para los
extracto etanlicos la
DL50 est entre 100
mg/mL 332 mg/mL y
para las fracciones
entre 50 mg/mL 166
mg/mL.

Actividad
antimicrobiana
presente en
las partes
areas de las
especies
Bursera
simaruba y
Bursera
graveolens
(Burseraceas),
frente a
fitopatgenos
como:
Fusarium
oxysporum y
Botrytis
cinerea.(articulo
en evaluacin)

Anexo No.1
Anexo No.8
Para la especie
vegetal B. simaruba, la
mnima mezcla posible
que tienen accin
antimicrobiana han
sido las fracciones
porque los
compuestos aislados
que fueron ensayados
no presentaron
actividad. Mientras
que en la especie B.
graveolens se ha visto
que la mezcla de los
cidos aislados
presentan accin
antimicrobiana la cual
se ha perdido al
ensayarlos
individualmente.

Los extractos etanlicos
de hojas de B. simaruba y
B. graveolens inhiben el
crecimiento frente de S.
aureus y B. subtilis a 250
mg/mL.
La fraccin acetato de etilo
de hojas y corteza de B.
graveolens tiene actividad
frente a S. aureus dando
halos promedios de
19,85mm a 150 mg/mL. A
su vez B. subtilis
presenta un halo de
inhibicin de 18.47 mm
frente al extracto etanlico
de hojas de B.
graveolens, a 250mg/mL
y de 18.3 mm frente a la
fraccin de acetato de etilo
de corteza, a la mayor
concentracin.

Actividad
antimicrobiana
presente en
las partes
areas de las
especies
Bursera
simaruba y
Bursera
graveolens
(Burseraceas),
frente a
fitopatgenos
como:
Fusarium
oxysporum y
Botrytis
cinerea.(articulo
en evaluacin)
Evaluacin de
la actividad
antimicrobiana
de los
extractos de
partes areas
de las
especies B.
simaruba y
B.graveolens
contra algunos
microorganism
os patgenos.
(Borrador de
artculo para
presentar)
Anexo No. 2
Anexo No. 9

3. Determinar la
estructura qumica de
los componentes
aislados de las partes
areas a travs de
mtodos
espectroscpicos.
Los obtenidos en
los objetivos.
De la fraccin ter de
petrleo de hojas de B.
simaruba se aislaron e
identificaron -amirina y
-amirina. Mientras, de la
fraccin ter de petrleo
de corteza se aisl e
identific -sitosterol.

Contribucin al
estudio
fitoqumico de
Bursera
simaruba

Anexos Nos.
6 y 12.

Los compuestos
aislados del estudio
fitoquimico de B.
simaruba fueron los
mayoritarios que
pudieron ser
aislados.

De las fracciones en ter
de petrleo de hojas y
diclorometano de corteza
de B. graveolens se
aislaron e identificaron
cido elemnico, cido
elemlico y cido 3-
hidroxitirucala-7,24-dien-
21-oico

Contribucin al
estudio
fitoqumico de
Bursera
graveolens.
Anexos Nos.
10 y 11.
Del estudio fitoqumico
de B. graveolens hay 4
compuestos que se
encuentran en estudios
de sus caractersticas
espectroscpicas
1.

NOTA:
Si como resultado de la ejecucin del proyecto se hubieren logrado resultados de conocimiento adicionales a los planteados y
comprometidos en la propuesta original, el investigador puede relacionarlos y documentarlos en este informe en una seccin aparte,
demostrando su relacin directa con el proyecto.

CUADRO No. 2 (Otros resultados obtenidos)

OTROS RESULTADOS
(comprometidos
contractualmente)
COMPROMISO
ADQUIRIDO
LOGROS ANEXO SOPORTE
Formacin de recurso
humano (trabajo de grado o
maestro o tesis de
doctorado)
5 estudiantes
en 3 trabajo de
grado
(pregrado)
Actividad antimicrobiana presente en partes
areas de las especies B. simaruba y B.
graveolens (Burseraceas), frente a
microorganismos como: Agrobacterium
tumefaciens, Erwinia carotovora, Fusarium
oxysporum, Trichoderma viride y Botrytis
cinerea.

Evaluacin de la actividad antimicrobiana de
los extractos de partes areas de las
especies B. simaruba y B. graveolens contra
algunos microorganismos patgenos.

Contribucin al estudio fitoqumico de
Bursera simaruba (L) Sarg.
Anexos Nos. 1, 2, 6, 12,13 y 14
Capacitacin
(entrenamientos en
investigacin)
1 Entrenamiento Catalina Pieros Osorio. Se le entren
en el manejo de aparatos para la
elaboracin de extractos totales y los
fraccionamientos en lquido/lquido y
slido/lquido.
Anexo No. 15
Cursos organizados por el
grupo, relacionados con el
proyecto
#, tipo Nombre del curso, Programa y No. De
participantes.
Certificacin de realizacin o
de asistencia.
Publicaciones divulgativas
(especificar)
1 Actualidades Biolgicas. No. 79, julio -
agosto de 2003.
Anexos Nos. 8 y 16

Participacin en eventos
cientficos
2, Expositor Congreso Nacional de Ciencias
Biolgicas, Medelln, Hotel, Nutibara,
Septiembre 2000.
Congreso Nacional de Ciencias
Biolgicas Cartagena, Octubre 2001.
Anexo No. 17
Organizacin de eventos
cientficos
#, tipo Descripcin Copia del programa y listado de
participantes.
Otros (especificar) #, tipo Descripcin Soporte correspondiente.

8. Descripcin del impacto actual o potencial de los resultados

En el aspecto acadmico, se ha fortalecido la capacidad cientfica del pas con la formacin
directa de 5 estudiantes de pregrado que estudiaron las plantas en investigacin en las reas
de Microbiologa Industrial y Biologa.

De otra parte tambin se han formado indirectamente 4 estudiantes de pregrado, 3 de
Microbiologa Industrial y uno de Biologa, los cuales han realizados estudios diferentes a los
propuestos con las plantas o estudios similares con otras plantas de la familia Burseraceae.

Las publicaciones que se hagan de esta investigacin fortalecern el conocimiento de la flora
colombiana y por ende se ver beneficiada la comunidad cientfica con esta informacin.
Esta informacin traducida a trminos populares se espera haga eco en las comunidades
rurales y que estas comunidades usen los datos como base de su utilizacin emprica, para
as justificar su uso en la medicina tradicional.

Se propone que con la informacin obtenida de esta investigacin se pueda llegar a los
pocos campesinos que hoy estn talando los rboles para que hagan reforestacin con las
especies endmicas de la regin que le traen un beneficio al ser mantenido el ecosistema y a
la vez le sirve de materia prima de las medicina en potencial.

Los resultados obtenidos permiten demostrar que la tala indiscriminada de el caratero (B.
simaruba) en la zona de coleccin alrededores de Tocaima, est cohibiendo a la poblacin
de una planta promisoria en el tratado de ciertas enfermedades infecciosas. Por el contrario
estos pobladores deben mantener este rbol como cerca viva para darle adems del uso
como potencial medicamento.

El no talar el caratero, adems de mantener una fuente natural de una medicina en potencia,
tambin permite que el ecosistema se mantenga ya que esta es una especie endmica de la
zona, pero est siendo talada por los campesinos de la regin.

Con relacin a tatamaco (B. graveolens) se debe seguir utilizando y divulgar la informacin
obtenida de la investigacin entre los pobladores, par indicarles la importancia cientfica de
estos resultados que corroboran el uso medicinal que la gente popular le da a esta planta.
Podra buscarse como alternativa, cultivarla para obtener la mezcla de compuestos del tipo
cido que est presente en ellas como materia prima en la elaboracin de medicamentos.
Por otro lado se pueden realizar extractos para ensayar mas directamente en el tratamiento
de enfermedades producidas por los microorganismos que fueron tratados.

9. Anexos: Con el presente formato de informe se anexan los soportes necesarios que
permiten corroborar lo expresado en dicho informe.

a) Anexo 1: Resumen y resultados de la tesis Actividad antimicrobiana presente en partes
areas de las especies Bursera simaruba y Bursera graveolens (Burseraceas), frente a

microorganismos como: Agrobacterium tumefaciens, Erwinia carotovora, Fusarium
oxysporum, Trichoderma viride y Botrytis cinerea.
b) Anexo 2: Resumen y resultados de la tesis Evaluacin de la actividad antimicrobiana de
los extractos de partes areas de las especies Bursera simaruba y Bursera graveolens
contra algunos microorganismos patgenos
c) Anexo 3: Resumen y resultados de la tesis Determinacin de la actividad antimicrobiana
de los extractos obtenidos a partir de hojas y corteza de Protium calanense
(Burseraceae) frente a microorganismos patgenos transmitidos por diferentes vias
d) Anexo 4: Resumen y resultados de la tesis D De et te er rm mi in na ac ci i n n d de e l la a A Ac ct ti iv vi id da ad d A An nt ti im mi ic cr ro ob bi ia an na a
d de e l la as s P Pa ar rt te es s A A r re ea as s d de e B Bu ur rs se er ra a t to om me en nt to os sa a T Tr r. . & & P Pl l. . c co on nt tr ra a A Al lg gu un no os s F Fi it to op pa at t g ge en no os s y y
P Pa at t g ge en no os s d de el l H Ho om mb br re e
e) Anexo 5: Resumen y resultados de la tesis Determinacin de la actividad antiinflamatoria
de los extractos totales y fracciones aisladas de Bursera simaruba (Burseraceae)
f) Anexo 6: Resumen y resultados de la tesis Contribucin al estudio fitoquimico de
Bursera simaruba (L.) Sarg.
g) Anexo 7: Resultados de estudio fitoqumico de Bursera graveolens.
h) Anexo 8: Articulo Actividad antifngica de partes areas de las especies Bursera
simaruba y Bursera graveolens (Burseraceae), frente a fitopatgenos como Fusarium
oxysporum y Botrytis cinerea (en revisin)
i) Anexo 9: Artculo Evaluacin de la actividad antimicrobiana de los extractos de partes
areas de las especies Bursera simaruba y Bursera graveolens contra algunos
microorganismos patgenos
j) Anexo 10: Estudio de Bursera graveolens
k) Anexo 11: Proyecto de tesis estudiante de maestra.
l) Anexo 12: Articulo Contribucin al estudio fitoqumico de Bursera simaruba
m) Anexo 13: Certificados de aprobacin de tesis de Microbiologa Industrial.
n) Anexo 14: Certificado de aprobacin de tesis de Biologa.
o) Anexo 15: Resumen entrenamiento de Catalina Pieros Osorio
p) Anexo 16 : Carta de evaluacin del articulo.
q) Anexo 17: Copias de resumen de ponencias en congreso.

10. Resultados de conocimientos adicionales.

Estudios adicionales de ensayos antimicrobianos tambin fueron realizados con la especie
Protium calanense, tambin de la familia Burseraceae, que fue colectada en el
departamento de Santander por la estudiante de Microbiologa Industrial Diana Yamile
Roncancio Benavides para realizar su trabajo de grado.
En esta parte de la investigacin se hace la evaluacin de la actividad antimicrobiana de los
extractos obtenidos a partir de hojas y corteza de Protium calanense frente a
microorganismos causantes de Enfermedades de Transmisin Alimentaria (ETAs). Esta
evaluacin se hizo enfrentando los extractos vegetales (etanlico) y fracciones (ter de
petrleo, diclorometano y acetato de etilo) contra Aspergillus niger mediante el mtodo de
difusin en agar y Candida albicans y Escherichia coli a partir del mtodo de bioautografa.

Se puede concluir de esta investigacin paralela al proyecto que los extractos etanlicos de
Protium aff. calanense de hojas y corteza presentaron la mayor actividad antifngica contra

Aspergillus niger, con una inhibicin de 95% y 97.5%, respectivamente, en comparacin
con todas las fracciones, cuando se aplica a una concentracin de 10mg/mL.

Los extractos etanlicos de Protium aff. calanense de hojas y corteza presentaron la mayor
actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, con una inhibicin de 90%, en
comparacin con todas las fracciones, cuando se aplica a una concentracin de 10mg/mL.

Las fracciones de ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo de corteza presentaron
mayor inhibicin (90%) frente a Escherichia coli, respecto a las fracciones de ter de
petrleo, diclorometano y acetato de etilo de hojas, las cuales no presentaron halos de
inhibicin significativos (30%).

Los extractos etanlicos y sus fracciones ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo,
no presentan actividad antifngica significativa frente a Candida albicans.

Las fracciones de ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo tanto de hojas como de
corteza, no poseen valores significativos de inhibicin frente a Aspergillus niger.

Finalmente se puede decir que los extractos etanlicos obtuvieron el mayor porcentaje de
inhibicin, junto con las fracciones de corteza, es decir, que los extractos y sus fracciones
de Protium aff. calanense pueden actuar como antibacterianos y antifngicos, inhibiendo el
crecimiento de los microorganismos estudiados (ver anexo No. 3)

Tambin se investig accin antimicrobiana con los extractos y fracciones de hojas y corteza
de Bursera tomentosa contra bacterias y hongos, utilizando como metodologa la difusin
en el medio (agar) y la perforacin en gel. Los microorganismos contra los cuales se
probaron los extractos y fracciones de B. tomentosa fueron Staplylococcus aureus,
Bacillus cereus, Pseudomona aeruginosa, Fusarium oxysporum var. clavel, Botrytis
cinerea y Trichophyton menthagrophytes.

D De e e es st ta a i in nv ve es st ti ig ga ac ci i n n p pr re el li im mi in na ar r s se e p pu ue ed de e c co on nc cl lu ui ir r q qu ue e l lo os s e ex xt tr ra ac ct to os s y y l la as s f fr ra ac cc ci io on ne es s d de e B B. .
t to om me en nt to os sa a T Tr r. . & & P Pl l. . m mo os st tr ra ar ro on n a ac ct ti iv vi id da ad d i in nh hi ib bi it to or ri ia a s so ob br re e l la as s b ba ac ct te er ri ia as s G Gr ra am m p po os si it ti iv va as s. .

L La a f fr ra ac cc ci i n n d di ic cl lo or ro om me et ta an no o d de e h ho oj ja as s m mo os st tr r l la a m me ej jo or r a ac ct ti iv vi id da ad d c co on nt tr ra a B B. . c ce er re eu us s e en nt tr re e t to od do os s
l lo os s e ex xt tr ra ac ct to os s y y f fr ra ac cc ci io on ne es s e en ns sa ay ya ad do os s. . D De e i ig gu ua al l f fo or rm ma a l la a a an nt te er ri io or r f fr ra ac cc ci i n n y y e el l e ex xt tr ra ac ct to o
e et ta an n l li ic co o d de e h ho oj ja as s p pr re es se en nt ta ar ro on n u un na a b bu ue en na a a ac ct ti iv vi id da ad d c co on nt tr ra a S S. . a au ur re eu us s c co on n r re es sp pe ec ct to o a a l la as s
d de em m s s f fr ra ac cc ci io on ne es s, , c co om mo o s se e p pu ue ed de e v ve er r e en n e el l a an ne ex xo o N No o. . 4 4. .

L La a m me en no or r C CM MI I c co on nt tr ra a B B. . c ce er re eu us s f fu ue e p pr re es se en nt ta ad da a p po or r l la a f fr ra ac cc ci i n n d de e d di ic cl lo or ro om me et ta an no o d de e h ho oj ja as s
c co on n u un n v va al lo or r d de e 1 1, ,5 5 m mg g/ /m mL L M Mi ie en nt tr ra as s, , q qu ue e n ni in ng gu un no o d de e l lo os s e ex xt tr ra ac ct to os s y y f fr ra ac cc ci io on ne es s d de e B B. .
t to om me en nt to os sa a T Tr r & & P Pl l. . p pr re es se en nt ta ar ro on n a ac ct ti iv vi id da ad d i in nh hi ib bi it to or ri ia a c co on nt tr ra a l lo os s h ho on ng go os s t tr ra at ta ad do os s. . ( (v ve er r a an ne ex xo o
N No o. . 4 4) )

Otra de las investigaciones que se hicieron en forma paralela ha sido la Determinacin de la
actividad antiinflamatoria de los extractos y fracciones obtenidos de Bursera simaruba
(Burseraceae).

En este trabajo, se determin el efecto antiinflamatorio de los extractos
etanlicos de hojas y corteza y de las fracciones de ter de petrleo y
diclorometano de hojas, obtenidas de B. simaruba (Burseraceae), la cual, ha
sido utilizada en la medicina popular en el tratamiento contra el reumatismo,
como cataplasma antiinflamatorio y contra la mordedura de serpientes entre
otras.

Los extractos y fracciones se evaluaron por el mtodo Edema Plantar, en ratas
hembras con un peso promedio entre 140-170g. Las dosis probadas fueron de
100mg/Kg de peso y 300mg/Kg de peso para los extractos etanlicos y de
300mg/Kg de peso para las fracciones.

Todas las sustancias exhibieron una actividad antiinflamatoria. El mayor efecto para los
extractos totales de hojas a dosis de 100mg/Kg de peso y de hojas y corteza a 300mg/Kg de
peso se present a la tercera hora de medicin, siendo estos efectos de un nivel comparable
al mostrado por el patrn indometacina a la dosis de 5mg/Kg de peso. Por otra parte las
fracciones de hojas a 300mg/Kg de peso presentan un mayor porcentaje de inhibicin a la
primera hora medida, lo cual indica un rpido pero poco duradero efecto (Anexo No. 5).

11. Agradecimientos
Finalmente deseo expresar mis mximos agradecimientos a COLCIENCIAS por el apoyo
financiero que brind a este proyecto durante estos 24 meses largos para la elaboracin
del mismo. Realmente son muchas dificultades las que se sobreponen a medida que se
va realizando el proyecto y si el apoyo de COLCIENCIAS y de la Universidad Javeriana
no fuera comprometedor, No se realizaran estas investigaciones pioneras en los nuevos
investigadores como es mi caso.

Jorge Robles Camargo Ph.D.
Investigador principal
Facultad de Ciencias
Universidad Javeriana

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA PRESENTE EN PARTES AEREAS
DE LAS ESPECIES Bursera si maoruba Y Bursera graveol ens
(BURSERACEAS), FRENTE A MICROORGANISMOS COMO:
Agrobacteri um tumefaci ens, Erwi ni a carotovora, Fusari um
oxysporum, Tri choderma vi ri de y Botryti s ci nerea.

MARTHA CECILIA RUIZ GIRALDO
CLARA MARCELA SUSUNAGA SUSUNAGA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD J AVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Santaf de Bogot, D.C.
2000
2
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA PRESENTE EN PARTES AEREAS
DE LAS ESPECIES Bursera si maoruba Y Bursera graveol ens
(BURSERACEAS), FRENTE A MICROORGANNISMOS COMO:
Agrobacteri um tumefaci ens, Erwi ni a carotovora, Fusari um
oxysporum, Tri choderma vi ri de y Botryti s ci nerea.

MARTHA CECILIA RUIZ GIRALDO
CLARA MARCELA SUSUNAGA SUSUNAGA

Tesis presentada como requisito parcial para optar al titulo de
Microbiologa Industrial

PONTIFICIA UNIVERSIDAD J AVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
Santaf de Bogot, D.C.
2000
3

______________________________________
Dr. CARLOS CORREDOR P. Ph. D
Decano acadmico
Facultad de Ciencias Universidad J averiana

____________________________________
Dra. AURA ROSA MANACERO G. M.Sc
Directora carrera Microbiologa Industrial

4

_____________________________________
Dr. J ORGE ROBLES CAMARGO Ph.D
Director

____________________________________
Dr. MARTIN ALONSO BAYONA R. M.Sc
Codirector

5

______________________________________
Dra. Mary Santaella
J urado

____________________________________
Dr. J ulio A. Pedrozo P. M.Sc
J urado

6

LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD J AVERIANA NO SE HACE
RESPONSABLE DE LOS CONCEPTOS EMITIDOS POR SUS
ESTUDIANTES EN SUS TESIS.

7

A DIOS,
A MIS PADRES,
A MIS HERMANOS
Y A DIEGO
QUE ME BRINDARON
SU APOYO

8

A MIS PADRES Y
A MIS HERMANOS
POR SU APOYO Y
CARIO.

9

AGRADECIMENTOS
A la Pontificia Universidad J averiana por el prstamo del material y
locaciones para el progreso y buen trmino de este trabajo.
Al Dr. J orge Robles por su apoyo incondicional, dedicacin y
constancia para la elaboracin de este proyecto.
Al Dr. Martn Bayona por su contina colaboracin.
Al Dr. Rubn Dario Torrenegra por su paciencia y su ayuda
desinteresada.
A nuestras familias por su colaboracin y aliento constante para el
cumplimiento de los objetivos y metas en nuestras vidas.
A todas las personas que de una u otra manera colaboraron para la
elaboracin y buen desarrollo de esta investigacin.

10

RESUMEN

Esta investigacin brinda un mtodo alternativo para el control y
manejo de diversos microorganismos (Agrobacterium tumefaciens,
Ervinia carotovora, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea y
Trichoderma viride) mediante la comprobacin de la actividad
biolgica presente en las partes areas (hojas y corteza) de las
especies B. simaruba y B. graveilens
Inicialmente, se colectaron plantas de nuestra flora de las cuales no
se conoca ningn reporte bibliogrfico en Colombia; con el fin de
estudiar la actividad antimicrobiana de las especies ya mencionadas.
Se obtuvo los extractos etanlicos y las diferentes fracciones (Eter de
petroleo, Diclorometano y Acetato de etilo), de las parte areas del
material vegetal en estudio.
Presentaron una actividad fungisttica los extractos etanlicos de
hojas y corteza de Bursera simaruba frente a los hongos fitopatgenos
Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea, el extracto etanlico de hojas
de Bursera graveolens fue activo (fungisttico) frente a Fusarium
oxysporum.
Las fracciones Eter de petrleo, Diclorometano y Acetato de etilo de
hojas y corteza de B. simaruba y B. graveilens presentaron actividad
fungisttica frente al hongo Fusarium oxysporum.
Se determin la Dosis Mnima Inhibitoria de cada uno de los extractos
que presentaron actividad, encontrndose que para el extracto
etanlico la DL 50 se encuentra en el rango de concentraciones entre
11
100mg/ ml 332mg/ ml y para las diferentes fracciones en un rango
de concentraciones entre 50mg/ ml 166mg/ ml.
Ninguno de los extractos estudiados present actividad frente a las
bacterias fitopatgenas Erwinia carotovora y Agrobacterium
tumefaciens.

12

INTRODUCCION
La qumica de las Burseraceas se ha estudiado ms ampliamente en
los ltimos 20 aos; son de destacar las propiedades farmacolgicas
de esta familia, encontrndose por ejemplo actividades anti-
inflamatorias y anti-virales de algunas resinas (Duwiejua, 1993;
Poehland, 1987 respectivamente.), Para tratamiento contra
nemtodos (Sharma, 1991), hepatoprotectores, adems del inters en
estudios sobre leucemia y carcinomas (J ing, 1993).

Las Burseraceas son tiles por las resinas que segregan y por la
madera. Son conocidas las gomoresinas incienso y mirra, producidas
por especies africano-arbicas de los gneros Boswellia y
Commiphora respectivamente. El exudado de la corteza de las
especies del gnero Protium, Paraprotium, Dacryodes y Tetragastris
constituyen en Sur Amrica el elemi del Brasil. Esta oleoresina es
segregada en mayor o menor abundancia por todas las especies, en
Colombia se conoce con los nombres de anime, incienso o
caraa. Tienen uso aunque limitado, en ritos religiosos, ahumerios,
13
perfumera, medicina popular y como resinas industriales.
(Cuatrecasas, J ., 1957).
Los gneros pertenecientes a esta familia son utilizados en algunas
culturas indgenas como desinfectantes de heridas, cicatrizantes
fuertes, en tratamientos para el asma, diarrea, clculos renales,
extraccin de cuerpos extraos de la piel, mordedura de serpiente,
tuberculosis, hemorroides y hernias (Bernal y Correa, J ., 1990).

Por medio de esta investigacin se pretende evaluar la actividad
antimicrobiana y antifngica presente en partes areas de las
especies Bursera simaoruba y Bursera graveolens, determinando la
concentracin mnima inhibitoria de las sustancias que tengan la
propiedad de inhibir el crecimiento de los microorganismos.

14

2. OBJ ETIVOS

2.1 OBJ ETIVO GENERAL

v Comprobar la actividad antimicrobiana presente en las partes
areas de las especies Bursera simaruba y Bursera graveolens,
mediante estudios biodirigidos.

2.2 OBJ ETIVOS ESPECIFICOS

v Obtener los extractos etanlicos de las partes areas de las plantas
seleccionadas.
v Realizar ensayos antifngicos de cada uno de los extractos,
utilizando el mtodo de crecimiento radial de los hongos en el
medio.
v Realizar ensayos antibacterianos de cada uno de los extractos
utilizando el mtodo de dilucin en el medio de cultivo con
perforacin en el agar.
15
v Purificar los extractos etanlicos totales de mayor accin
antimicrobiana a travs de fraccionamientos consecutivos con
solventes de diferentes polaridades.
v Obtener la Concentracin Mnima Inhibitoria a partir de los
extractos vegetales que presenten actividad antimicrobiana.

16

3. REVISION BIBLIOGRAFICA

3.1. BURSERACEAS
3.1.1 GENERALIDADES DE LA FAMILIA BURSERACEAS
En la familia Burseraceae se reconocen hoy da 18 gneros, con ms
de 600 especies distribuidas por los pases de Amrica tropical,
Malasia y el Noroeste de Africa. Ocho gneros estn representados en
el continente americano, seis de los cuales son endmicos (Bursera,
Crepidospermum, Hemicrepidospermum, Paraprotium, Tetragastris y
Trattinickia); los otros dos (Dacryodes y Protium) se extienden tambin
al viejo mundo. Los gneros ms prolficos en especies son: Bursera
(100 sp), Protium (90 sp), Commiphora (139 sp, predominan en Africa)
y Canarium (109 sp. predominan en Asia). (Cuatrecasas, J ., 1957;
Swart, J .J ., 1942).

Engler (1931) reconoci solamente 16 gneros, los cuales ubic en
tres tribus basandose en la estructura de los frutos. Dos gneros mas,
(Hemicrepidospermum y Paraprotium), fueron adicionados mas tarde e
17
incluidos en la tribu Protieae (Swart, J .J , 1942; Cuatrecasas, J .,
1957).
Todos los gneros conocidos en el continente Americano se
encuentran en Colombia en donde se conocen con los nombres de
almacigo, anime, bija, carao o caraa, incienso, tatamaco,
tachuelo y caratero.

TABLA No. 1 CLASIFICACIN DE LA FAMILIA BURSERACEAE.
(Cuatrecasas, J ., 1957; Swart, J .J , 1942)

TRIBUS
BOSWILLIEAE CANARI EAE PROTI AE
GENEROS Aucoumea Pierre Canarium L. Crepidospermun
Hook. F.

Boswellia Roxb. Canareillum
Engl.
Garuga Roxb
Bursera J acq. Ex L Dacryodes
Vahl.
(= Pachylobus
Don).
Hemicrepidosper
mun Swart.
Commiphora J acq. Santiria
Blume.
Paraprotium
Cuatrec.
Triommma Hook.
F.
Santiriopsis
Engl.
Protium Burm. F.
Scutinanthe
Thw.
Tetragastris
Gaertn.
Trattinickia willd.

18

3.1.2. CLASIFICACION TAXONOMICA
La clasificacin taxonmica de la familia Burseraceae es la siguiente:
(Cuatrecasas, 1957).

REINO Vegetal
DIVISION Angiospermae
CLASE Magnoliopsida
SUBCLASE Rosidae
ORDEN Sapindales
FAMILIA Burseraceae

Dentro de la familia se ubican tres tribus: Protieae, Canarieae y
Bursereae, dentro de las cuales, hasta la revisin actual, hay 18
gneros:
Aucoumea Canareillum Garuga
Boswellia Commiphora Haplolobus
Bursera Crepidospermun Hemicrepidospermun
19
Canarium Dacryodes Protium
Santiria Scutinanthe Trattinickia
Santidiopsis Tetragastris Triommma

La familia Burseraceae fue descrita por primera vez por Kunth en
1824 y fue modificada parcialmente en 1931 por Engler (Cuatrecasas,
1957). Adems reporta para Colombia la siguiente clasificacin: Tribu
Protieae: gneros Protium, Paraprotium, Crepidospermun,
Hemicrepidospermun, Tetragastris y Trattinnickia. Tribu Bursereae:
gnero Bursera. Tribu Canarieae: gnero Dacryodes.

En 1957 Cuatrecasa report que en el mundo haba 18 gneros y
cerca de 600 especies. Actualmente (segn Plant Book, 1991) se
tienen nueve gneros y la clasificacin se ha modificado segn los
siguientes criterios: Tribu Protieae: Drupa con dos a cinco partes
libres o adheridas. Consta de los gneros Protium y Tetragastris. Tribu
Bursereae: Drupa con el endocarpo totalmente fusionado y exocarpo
dehiscente. Gneros Boswellia, Bursera y Commphora. Tribu
Canarieae: Drupa con el endocarpo totalmente fusionado: a ella
pertenece Canarium, Dacryodes, Haplolobus y Santiria. ( Plant Book,
1991).
20
Sin embargo hay reportes de los gneros Crepidospermum y
Hemicrepidospermum, fueron unidos bajo el nombre del primero y
ubicados en la Tribu Protieae (Daly, 1987) y la trasferencia del gnero
Trattinnickia de la Tribu Canarieae, el reporte del gnero asitico
Garuga y la inclusin del gnero Paraprotium dentro de Protium (Daly,
1989).

3.1.3. DESCRIPCION BOTANICA
Las caractersticas morfolgicas de las plantas ubicadas en la familia
Burseraceas son:
Arboles o arbustos con sustancias resinosas en casi todos los
rganos; constantemente canales resinferos y balsamferos en la
corteza. Hojas alternas, pinnado compuestas, trifoliadas o
raramente unifoliadas generalmente sin estipulas, inflorescencias
paniculada axilares terminales o subterminales. Flores pequeas
actinomorfas, hermafroditas o con mas frecuencia unisexules; caliz
ms o menos cupuliforme, de 3-5 spalos completamente connatos o
casi libres, con perfloracin con torta o valvar. Estambres
obdiplostmonos raramente isotmonos con filamentos insertos en la
base externa o en el borde del disco; nteras ovoideas, elpticas u
oblongas, con dehiscencia longitudinal e introrsa. Disco anular
21
cupuliforme o pateliforme, intrastaminal. Carperlos 5-2 soldados.
Ovario globoso, elipsoidal o trigno, 2-5 locular placentacin axil;
cada loculo con dos ovulos pndulos, eptropos. Estilo corto o casi
nulo estrigma capitado 5-3 lobado. (Cuatrecasas, J , . 1957).
3.1.4. DISTRIBUCION GEOGRAFICA DE LA FAMILIA
BURSERACEAE
Esta familia est ampliamente distribuda en todas las regiones
tropicales y subtropicales del planeta, con mayor abundancia en las
reas ridas del Noreste de Africa, Arbia, Amrica tropical, Asia,
Australia y Madagascar.
Los ses gneros de la familia Burseraceae en Colombia, se diferencian
en cuanto al nmero de especies para cada uno y su distribucin. Los
gneros ms abundantes en especies de mayor a menor son: Protium
(51), Dacryodes (12), Bursera (7), Trattinnickia (4), Crepidospermum (3)
y Tetragastris(3). (Martinez, 1996).
Por otra parte, de los ses gneros que se encuentran en nuestro pas
podemos destacar los siguientes aspectos:
22
Bursera: es el nico encontrado en el Csar destacndose su
presencia en la Guajira ( 20 reportes); adems se presenta en el
Choc, a lo largo del valle de Magdalena; y junto con Crepidospermum
en el Archipilago de San Andrs y Providencia. (Martinez, 1996).
Crepi dospermum: se presenta en todas la regiones naturales,
especialmente en la Orinoqua y Amazona. (Martinez, 1996).
Dacryodes: se encuentra presente en las regiones del Choc y la
Amazona en su parte oriental, aunque tambin est en Santander Y
Guajira. (Martinez, 1996).
Proti um: adems de ser la ms abundante es la que presenta la ms
amplia distribucin, y cubre el mayor nmero de formas de vida.
(Martinez, 1996).
Tetragastri s: se localiza en el Choc, Boyac y Santander;
Magdalena y Caquet. ( Martinez, 1996).
Tratti nni cki a: se localiza al sur del pas, Cundinamarca, Valle y
Antioqua. (Martinez,1996).
Estas distribuciones son un acercamiento a la forma como la familia
se presenta de manera muy general; pues dentro de cada
23
departamento se pueden presentar caractersticas ecolgicas muy
diferentes entre s. Por otra parte se debe considerar que aun existen
regiones de nuestro pas que no estn lo suficientemente estudiadas,
y respecto a ellas no es posible asegurar la ausencia o presencia de
Burseraceas.
3.1.5 QUIMICA DE LAS BURSERACEAE
Las Burseraceae producen un gran rango de compuestos. La mayora
de las especies exudan una oleo-gomo-resina al ser daada la corteza.
Esta se compone de terpenoides (comn en muestras de zonas
ridas). Los componentes voltiles son a menudo diterpenos y
triterpenos. Otro tipo de metabolitos secundarios tambin presentes
son compuestos fenlicos tales como flavonoides, cumarinas y varios
lignanos. (Khalid S., 1983).

3.1.5.1 MONOTERPENOS
Los aceites esenciales de las Burseraceae se componen
principalmente de monoterpenoides y sesquiterpenoides. La variedad
de monoterpenos acclicos detectados o aislados cubre virtualmente
24
todos los grupos asociados con sta clase. Mirceno, Citronellol,
Linalool y Geraniol, o sus acetatos que se presentan ampliamente y
son los ms comunes. (Khalid S., 1983).
Monoterpenos monocclicos son usualmente la clase dominante en la
familia, con Limoneno, -felandreno y p-cimeno particularmente muy
distribudos. Derivados monocclicos tambin estn presentes como
aldehidos, cetonas y con menor frecuencia los cidos (Khalid S.,
1983).
Monoterpenos bicclicos incluyen los del tipo tujano, pinano y
canfano. (Khalid S., 1983).
3.1.5.2 SESQUITERPENOS
Los sesquiterpenos constituyen la fraccin de ebullicin de los aceites
esenciales. Ms de 30 diferentes sesquiterpenos estn registrados con
una amplia variacin de estructuras. Los sesquiterpenos son
comunes en los gneros Canarium y gnero Commiphora, mientras
solamente el cadineno ha sido aislado de Boswellia carterii. El
elemano (e.j. elemol), el cual proviene del precursor germacra-1(10), 4-
dieno. (Provan et al, 1987) aisl sesquiterpenos con esqueleto de
25
germacrano y elemano de Commiphora y C. holtziana. (Khalid S.,
1983)
Tambin se han reportaron algunos sesquiterpenos no aislados
previamente de las Burseraceae, tales como -cubebeno y -
bourboneno (Provan, et al. 1987).
Maradufu (1982) report algunos furanosesquiterpenos aislados de
Commiphora myrrha, los cuales presentan principalmente esqueleto
bsico furanogermacrano.
3.1.5.3 TRITERPENOS
En las resinas de las Burseraceas se encuentran triterpenos
tetracclicos y pentacclicos. Los cuales pueden ser clasificados en 4
series:
Tetracclicos: Euphano, Tirucalano
Pentacclicos: Lupano, Ursano y Oleanano.
Las estructuras del tipo tetracclico Euphano / Tirucalno se
caracteriza por presentar una oxidacin en la cadena lateral del C-17,
ejemplos de los ms comnmente encontrados son: el cido elemlico
y el cido isomasticadienmico; los cuales han sido aislados de
26
Canarium schweinfurthii y Dacryodes eludis respectivamente. ( Khalid
S., 1983).
Los triterpenos de la serie del Lupano presentan 3 niveles de
oxidacin; iniciando como alcohol, pasando por cetona y terminando
en cidos. Por ejemplo: el Lupeol que se encuentra ampliamente
distribuido en las especies de Bursera. Seguido por la Lupeonona
hallada en Commiphora y terminando con el 3,4-secotriterpeno, Acido
canrico hallado en especies de Canarium. Similares eventos ocurren
entre los anillos de los limonoides de Meliceas y Rutceas. ( Khalid
S., 1983).
Los triterpenos de la serie del Ursano muestran un alto grado de
oxidacin que se relaciona con el anillo A, visto ya en las Burseraceas.
Culminando esto con la 1,2,3-trihidroxilacin hallada en el cido
commico, una de las manifestaciones que se han notado en los
guassinoides de la Simaroubaceas. La capacidad de hidroxilacin del
C-1 y C-2 slo se ha visto en una especie, Commiphora
pyracanthoides.
Los de la serie del Oleanano muestran patrones de oxidacin
similares a los del Ursano en el anillo A, con la excepcin que no se
27
encuentra la oxidacin en el C-1. Tambin hay compuestos con
oxidacin en el anillo A y C, ejemplo: olean-12-en-3,11-diona de
Cannarium zeylanicum. Adems, algunas de las modificaciones que
presenta ste grupo es la presencia de la oxidacin en el anillo A y D
como el Manilodiol aislado de Manila elemi (Khalid, S., 1983).
Entre los limonoides reportados en las Burseraceae est la cedrelona
de Balsamodendron (Commiphora) pubescens (Khalid, S., 1983).
Aparte de los fitosteroles un nmero de compuestos esteroidales han
sido aislados de la resina de la droga cruda guggul (Commiphora
mukul). Entre los compuestos aislados de guggul estn guggulsterol I
y III, y guggulsterona I y II (Ramesh, C., et al, 1996).
3.1.5.4 FENOLES
Los flavonoides son a menudo importantes en sistemtica vegetal,
pero muy pocos han sido reportados en las Burseraceae. El
kaemferol, la quercetina y sus respectivos glicsidos se han
encontrado en Protium y Commiphora, pero el ms interesante ha sido
la presencia del biflavonoide Amentoflavona en hojas de Garuga
pinnata (Khalid, S., 1983).
28
Tambin muy pocas cumarinas han sido reportadas, el
cumarinolignoide Propacina de Protium opacum y la 5-metilcumarina
Siderina de Balsamoidendron pubescens (Khalid, J ., 1983).
3.1.5.5 VARIOS
Los componentes de la oleo-goma-resina (incienso) de algunas
especies de Commiphora se caracterizan por una alta variedad de
polisacridos que contienen principalmente galactosa, xilosa, fucosa,
arabinosa, ramnosa, cidos galacturnico y glucurnico, y sus
derivados metilados (>60% fraccin de goma) (Newall, C., et al 1996;
Bruneton, J ., 1995; Evans, W. C., 1996).
Los frutos se las Burseraceas son ricos en cidos esterico y linoleco.
Una mezcla de fenoles alifticos de cadena larga representan una
nueva clase de lpidos que han sido aislados de Commiphora mukul
(Patil, V.D., et al, 1973).
Alrededor de 15 aminocidos, ninguno de gran inters, han sido
aislados de Commiphora mukul. Los alcaloides son muy raros en la
familia (Khalid S., 1983).

29
3.1.6 FARMACOLOGIA DE LAS BURSERACEAE
Las Burseraceas son tiles por las resinas que segregan y por la
madera. Son famosas las gomorresinas incienso y mirra, producidas
por especies Afriacano-arbigas de Boswellia y Commiphora
respectivamente, y la oleorresina elemi de Manila, que mana de las
cortezas de especies Filipinas de Canarium. (Duwiejua, M., 1993).
En el noroeste africano, los extractos totales de la goma de Boswellia
carterii son usados como inhibidores del edema tanto mximo como
total en la inflamacin inducida por Carragenina en la pata de ratn,
analizado en un perodo de 6 horas (Duwiejua, M., 1993).
El extracto en etanol de la resina de Boswellia serrata, se usa en el
tratamiento de enfermedades inflamatorias en la India, mostrando
inhibicin en la produccin de Leucotrieno B4 y 5-HETE. De esta
planta se aisl el cido boswelio como principio activo que inhibe la
sntesis de Leucotrieno a travs de la va 5-lipoxigenasa (Ammon, H.
P. Et al., 1993) (Bruneton, J ., 1995).
La actividad desinflamatoria del extracto acuoso de la resina de
Commiphora incisa que se colect en el Este africano, se le atribuye a
los derivados del tipo triterpeno mansumbinona y cido 3,4-seco-
30
mansumbinoico (triterpeno degradado) que al probarse
separadamente dieron una alta actividad comparada a la de los
antinflamatorios comerciales Indometacina y Prednisolona
(Duwiejua, M., 1993).
Los componentes mayoritarios de Commiphora rostrata, 2-decanona,
2-undecanona y una serie anloga de estructuras mostraron una alta
actividad repelente contra la plaga del maz Sitophillus zeamais
comparable con el insecticida comercial N,N-dietil-toluamida, lo que
comprueba la sospecha de que los constituyentes de la resina juegan
un papel hormonal en el ecosistema donde crecen estas plantas
(Lwande, W., et al.,1992).
En Asia tambin son muy usadas las oleo-resinas que emanan de las
especies de las Burseracesas, en la medicina tradicional. El extracto
en etanol de frutos y races de Canarium album se usa en China para
el tratamiento por envenenamieto, diarrea y dermatitis; adems, ha
demostrado una fuerte actividad hepatoprotectora. Dos nuevos
triterpenos aislados de C. aslbum e identificados como urs-12-en-3,
16-diol y olean-12-en-3, 16-diol mostraron la alta actividad
hepatoprotectora en cultivo de hepatocitos de ratas intoxicados con
D-galactosamina (Tamai, M., et al., 1989).
31
El biflavonoide agatisflavona aislado de Canarium manii de la India,
aplicado oralmente en dosis de 50 a 100 mg, presenta actividad
hepatoprotectora contra hepatocitos de ratones y ratas
experimentalmente intoxicadas con tetracloruro de carbono (Anand,
K. K., et al., 1992).
El extracto acuoso de la resina de Commiphora mukul ha mostrado
una significante actividad antinflamatoria y una fuerte accin en la
disminucin de colesterol en sangre. De la resina de sta planta se ha
aislado e identificado guggulsterol I y III los cuales se les ha
comprobado actividad antinflamatoria. Adems, se han aislado
guggulsterona I (E-guggulsterona) y II (Z-guggulsterona), los cuales
son los principios activos en la disminucin grasas en la sangre, se ha
verificado que actan a nivel de la glndula tiroides (Newall, et al.,
1996; Rames, C., et al., 1996).
El exudado de la corteza de las especies de Dacryodes, Paraprotium,
Protium, y Tetragastris forman glomrulos resinosos blancos que
constituyen en Amrica del Sur el llamado elemi del Brasil. Esta
oleorresina que segregan con mayor o menor abundancia todas las
especies, se conocen en Colombia con los nombres de anime,
incieso o caraa. Tienen uso, aunque limitado, en ritos religiosos,
32
ahumericos, perfumera, medicina popular y como resinas
industriales (Cuatrecasas, J ., 1957).
En Colombia la resina de B. graveolens se usa en forma de emplastos
en hernias y tronchaduras de pies. Tambin se ha reportado para
extraer cuerpos extraos de la piel. Las hojas se usan contra el asma,
diarrea, pleuresa, clculos en rion, mordeduras de serpientes y
tuberculosis. Tanto las hojas y la corteza extrada en ron es usada
para combatir hemorroides y, aplicado localmente para lavar heridas
(Bernal y Correa, 1990). Adems, se usa para aliviar dolores
reumticos, Otero y Cadena evaluaron la actividad analgsica y
Txica a travs de pruebas farmacolgicas especficas y se encontr
que la resina de B. graveolens tiene un efecto analgsico comparable
al del cido acetilsaliclico pero sin efectos secundarios (Otero y
Cadena 1987).
En el Salvador la resina de la B. graveolens conocida como copalo
copalillo , se calienta y se coloca en el miembro afectado para curar
tronchaduras y sanar heridas, tambin se usa como carminativo,
para sanar llagas y luxaciones de miembros inferiores. Los extractos
acuosos y etanlicos de hojas y corteza poseen actividad inhibitoria
33
contra Staphylococcus aureus y adems mostraron toxicidad para lo
peces (De Mena Guerrero, M. G., 1994).
El extracto en etanol de la planta mexicana Bursera morolensis
mostr actividad citotxica al probarla contra P-388 linfocitos
leucmico (PS) y el carcinoma humano de la piel (KB). La accin
contra estas dos lneas celulares se debe a los compuestos
identificados como Deoxipodotolotoxina y un nuevo lignano, el 5-
desmetoxideoxipodofilotoxina tambin llamado morolensina (J olad, S.
D., et al ., 1977).
La B. simaruba se utiliza en Panam como cicatrizante de heridas
infectadas, antidiarrico, nacidos o granos. En Cuba se utiliza como
tnico estomacal en resfriados y diarreas. En Venezuela se la
considera antirreumtico. En las Bahamas se emplea para aliviar el
calor de la piel (salpullido) y para purificar la sangre. En el Darin se
utiliza contra enfermedades venreas y la obesidad. Los indgenas del
Choc usan la corteza en coccin como depilatorio. La resina se aplica
en las heridas en el ombligo del beb recin nacido. Su savia se utiliza
para curar cualquier herida infectada (Bernal y Correa, 1990). En el
Salvador la corteza de B. simaruba conocida como jiote, se utiliza
contra diarreas y como carminativo. Las hojas se maceran y se
34
utilizan en masas contra la cefalea y la resina para sanar heridas y
llagas. El extracto etanlico de hojas tiene actividad inhibitoria contra
Escherichia coli y Staphylococcus aureus (De Mena Guerrero, M. G.,
1994).
El Protium heptaphylum tiene un fruto comstible, del cual se produce
una bebida refrescante, adems contiene aceite que se usa en la
curacin de la sifilis, lceras, granos, hinchazones y el dolor de
cabeza. La madera se emplea en la industria por ser olorosa y durable
en lugares secos (Bernal y Correa, 1990).
La resina de Dacryodes peruviana (Uguna), es utilizada para darle un
agradable sabor en el ritual de la coca, en medicina para el
tratamiento de resfriado, tos y varicela. El uso de sta planta estara
justificado por la presencia de compuestos tales como Timol,
Carvacrol, p-mentol y -terpineol los cuales son conocidos por su
actividad antisptica, desinfectante, antioxidante, antifngico y
antihelmntico (Robles J ., 1998).
La resina de Xemena (Protium sp.) es quemada para limpiar de
insectos las casas (malocas) de lo indgenas de las comunidades
Muinane y Uitoto de la Amazona colombiana. El mayor componente
35
de sta planta es el conocido acariciada Benzoato de bencilo, que
junto con Metileugenol y Limoneno tienen actividad repelente de
insectos (Robles, J ., 1998).
3.1.7 POTENCIAL DEL USO DE LAS BURSERACEAS EN
COLOMBIA
Usos dados a las burseraceas a nivel internacional:
La qumica de las burseraceas se ha estudiado ms ampliamente en
los ltimos aos; son de destacar las propiedads farmacolgicas de
esta familia, encontrndose por ejemplo actividades antiflamantorias
y antivirales de algunas resinas (Duwiejua, 1993; Poehland, 1987
respectivamente), para tratamiento contra nemtodos (Sharma,1991),
propiedades antifngicas y antimicrobianas (Desta, 1993; Lima, 1992
y Rahalison, 1993; Claeson, 1992, respectivamente), efectos
hepatoprotectores (Anand,1992), adems del inters en estudios sobre
leucemia y carcinomas (J olad,1977 ; J ing, 1993).
Adicionalmente se ha detectado que los gneros Bursera y Protium
contienen sustancias antitumorales y estimulantes del Sistema
Nervioso Central (McDoniel, 1972; Gyllenhall, 1986; Quereshi, 1993).
36
La familia Burseraceae adems, se encuentra dentro de los reportes
de frutos comestibles (Benk, 1988; Fougue, 1974; Moreuil, 1971), y
algunas especies como Dacryodes edulis Cuart, se cultivan a fin de
cosechar sus frutos por sus caractersticas nutricionales,
principalmente en Africa (Newall, C.A.,1996; Obasi, 1993; Okafor,
1990).
A nivel de la bioqumica de las Burseraceas, en Colombia es poco lo
que se ha trabajado. Estos antecedentes a nivel mundial justifican
mayores esfuerzos por conocer sus componentes activos.
3.1.7.1 ASPECTOS ETNOBOTNICOS
En cuanto a la etnobotnica, es decir, al empleo de las burseraceas
por las comunidades, se conoce que en nuestro continente por
ejemplo, el exudado de la corteza de las especies de Protium,
Dacryodes y Tetragastris forman glomrulos resinosos blancos que
constituyen en Amrica el llamado elemi del Brasil; con usos en
ritos religiosos, sahumerios, perfumera, medicina popular y como
resinas industriales (Cuatrecasa, 1957).
En el libro de Especies Vegetales Promisorias de los pases del
convenio Andrs Bello, aparece que Bursera graveolens, es utilizada
37
medicinalmente en forma de emplastos, resina, y coccin de hojas y
corteza; para hacer incienso, como cercas vivas y como madera.
Adems que Protim heptaphylum March tienen frutos comestibles, es
maderable, y posee semillas aceitosas, adems del uso medicinal de la
corteza.
3.1.7.2 ESPECIES IMPORTANTES POR SU POTENCIAL DE USO
Las siguientes especies son importantes porque combinan una amplia
distribucin en el pas con varios reportes de uso. En la medida que
se ample el conocimiento de esta familia y se conozcan sus
propiedades a fondo, seguramente el nmero de especies promisorias
aumentar.
v Bursera tomentosa: usada como medicina, alimento, madera para
construccin, y sombro.
v Bursera simaruba: Usada como medicina y como alimentacin de
cerdos.
v Protium apiculatum: le sirve a los indgenas Muinane como
alimento; a los Uitotos como madera para construccin y su resina
38
para elaborar incienso (con fines mgico religiosos). En Antiquia
se usa su madera para construccin .
v Protium aracouchini: usado por los indgenas de jarapeto en
Antiquia. Maderable y medicinal.
v Tetragastris panamensis: utilizado por los Huitotos para
construccin, elaboracin de resina, alimentacin y medicina; en
Antioqua se considera buena su madera para carreteria y pisos
industriales.(Martinez, 1996).
3.2 CONTROL CON EXTRACTOS VEGETALES
3.2.1 GENERALIDADES
Se conservan papiros egipcios que se remontan al ao 1700 a.c. en
los que se enumeran muchas plantas comunes, como el ajo y el
enebro, que se han venido utilizando con fines medicinales desde
hace unos 4000 aos.
Algunos pretenden que fue Chin-Nong, emperador de China, quien
habra sido el primero en preconizar esta forma de medicamentos
(Ody, 1996; Barreto, 1997).
39
En 1676, Moyse Charas, en su Pharmacopee Royale Galenique et
Chymique, reproduce las tcnicas del Thesaurus sobre tratamiento
de plantas frescas y de plantas secas (Ody, 1996; Barreto, 1997).
En efecto, el trabajo de la Garaye, Chaymie hydraulique pour extraire
les sels essenties des vegtaux, es la primera obra que se halla al
margen de los errores de la poca y posee ideas del trabajo del
oxgeno durante la evaporacin de soluciones. En el siglo XIX,
Faurcroy, Vauquelin y Deyeux admitieron la existencia de un
principio activo de los vegetales. En 1814, Figuier y Barmentier,
propusieron la evaporacin al bao de Mara (Ody, 1996; Barreto,
1997).
El estudio de los extractos de las plantas como posibles agentes de
control se encuentra poco desarrollado, ya que su conocimiento se ha
reducido a observar su funcionamiento y en algunos casos a
determinar las sustancias que los componen. Estos pueden ser de
alto peso molecular, tales como lecitinas, polisacridos y sustancias
proticas. As mismo, una diversidad de compuestos aleloqumicos de
bajo peso molecular, entre estos se tienen: saponinas, taninos,
ligninas, terpenoides, alcaloides, aminocidos no proteicos y
compuestos cianognicos (Dickinson & Lucas, 1987; Vergara, 1995),
40
pero no se ha determinado cul es su accin especfica dentro del
control de la enfermedad (Duarte & Hernandez, 1996). Algunos de
estos compuestos inhiben el crecimiento y desarrollo de especies de
insectos, otros pueden alterar actividades proteolticas o amilolticas
(Dickinson & Lucas, 1987; Vergara, 1995).
Debido a la elevada y diversa produccin de estas sustancias por las
plantas, Meja (1989) plantea que es importante investigarlas como
fuente de bioinsecticidas que disminuyan la peligrosidad de los
insecticidas de sntesis orgnica y as se pueda minimizar la
contaminacin ambiental. Este planteamiento es respaldado por
Vergara (1995), quien comenta cmo los problemas generados por los
insecticidas, pueden solucionarse mediante el empleo de productos
obtenidos de las plantas y los cuales pueden actuar de forma
diferente.
Los extractos vegetales se han definido como un concentrado obtenido
por tratamiento de productos vegetales con solventes apropiados,
tales como agua, etanol o ter, de elementos solubles, constitudo por
una mezcla de principios activos y sustancias inertes que producen
de la totalidad o de partes de una planta fresca o seca (Ingold, 1984;
Duke, 1987; Pieros et al, 1988; Montaa, 1990).
41
Se piensa que los extractos preparados con plantas secas son ms
efectivos que los de plantas frescas, concepto un poco errado, sobre
todo en aquellas plantas que contienen hetersitos, saponsidos y
compuestos tnicos, los cuales sufren sensibles modificaciones
durante la desecacin. Su color caracterstico es ms o menos oscuro,
algunos caf-amarillento; su olor y sabor dependen de la materia
prima que les ha dado su origen. (Ingold, 1984; Duke, 1987; Pieros
et al, 1988; Montaa, 1990).
Para las plantas secas los agentes de disolucin pueden ser agua,
alcohol o ter, empleados separadamente, en mezclas apropiadas o
sucesivamente. El alcohol se usa para impedir la disolucin de
sustancias ppticas y para facilitar la disolucin de sustancias como
los alcaloides y esencias. El ter, se emplea bien solo o combinado con
el alcohol, en algunos casos determinados. Cuando se utilizan plantas
frescas, el vehculo de extraccin debe contener agua para facilitar el
procedimiento (Ingold, 1984; Duke, 1987; Pieros et al, 1988;
Montaa, 1990).
La preparacin de un extracto conlleva dos manipulaciones
importantes: obtencin y concentracin del extracto.
42
3.2.2 ANTECEDENTES DE LOS EXTRACTOS NATURALES
Muchas especies vegetales han sido explotadas como fuentes de
insecticidas o fungicidas, pero actualmente los productos naturales
juegan un papel mnimo en el mundo agrcola. Sin embargo, los
productos vegetales presentan un enorme potencial y han contribuido
a la investigacin agroqumica moderna. A comienzos de este siglo, se
descubrieron los extractos con actividad antimicrobiana para la
proteccin de cultivos y se desarrollaron a partir de 1940, apoyando el
progreso de la agricultura moderna (McChesney, 1994, Duarte &
Hernandez, 1996).
Aceites escenciales fueron extrados de: Majorana syriaca, Satureja
thymbra, Micromeria fruticosa y Salvia triloba, y la actividad
antifngica de sus fracciones voltiles fueron examinadas sobre
patgenos del suelo (Fusarium oxysporum y Macrophomina
phaseolina) y sobre patgenos foliares (Botrytis cinerea y Exserohium
turcicum). El efecto ms significativo fue ejercido por el aceite esencial
de M. Syriaca, el cual inhibi el crecimiento de B. cinerea en un 44% y
el de otros hongos examinados, en un 100% (Shimoni et al, 1993).
43
Con el fin de identificar sus propiedades antifngicas en Italia fueron
analizados un grupo de hongos filamentosos de los gneros Fusarium,
Cladosporium, Alternaria, Penicillium, Mucor, Rhizopus, Thichoderma y
Helmintosporium y los enfrentaron con extractos de canela (Ciinnamon
Zeylanicum), ajedrea (Satureja hortensis), romero (Rosmarinus
officinalis) y limonaria (Cymbopogon citratus). Los extractos de canela
y limonaria, a diferentes concentaciones mostraron inhibicin en el
crecimiento de Fusari um sp. y Alternaria sp. (Mangiarotti et al, 1990).
Tambin se han probado aceites esenciales de Satureja montana L.,
Rosmarinus officinalis L., Thymus vulgarius L. y Calamintha nepeta (I)
Savi. Fueron analizados qumicamente y sus actividades
antimicrobiales y fungicidas evaluadas con base en una
concentracin mnima inhibitoria (CMI) y una concentracin mnima
bactericida (CMB). Los 4 aceites mostraron un efecto biotxico, siendo
ms efectivos los de Calamintha nepeta y Thymus vulgaris (Duarte &
Hernandez, 1996).
Fernndez y Snchez (1996) probaron los aceites esenciales de
limonaria (Cymbopogon citratus), romero (Rosmarinus officinalis L. ), y
tomillo (Thymus sp.) sobre cinco aislamientos de Fusarium oxysporum,
Fusarium sp, Fusarium danthi, pero la actividad fungitxica de los
44
aceites esenciales examinados fue relativamente baja (Duarte &
Hernandez, 1996).
Al Abed et al, (1993) investig el efecto antifngico de los extractos en
agua de 49 especies de plantas silvestres de amplia distribucin en
J ordania, sobre cinco de los hongos fitopatgenos ms destructivos:
Fusarium oxysporum, Helminthosporium sativum, Alternaria solani,
Cladosporium herbarum y Botrytis cinerea. Los extractos de ciertas
especies inhibieron el crecimiento, otros estimularon el crecimiento y
otros no tuvieron efecto aparente. Los extractos frescos de yemas de
Inula viscosa inhibieron severamente el crecimiento de Fusarium
oxysporum, en tanto que los extractos de Anagallos arvensis
redujeron el crecimiento de Helminthosporium sativum.
3.2.3 ALGUNOS COMPONENTES DE LOS EXTRACTOS
VEGETALES
3.2.3.1 ACETILENOS Y POLIACETILENOS
Los acetilenos son caractersticos de algunas familias. Los
poliacetilenos se encuentran en toda la planta y especialmente, en la
raz. Su actividad antimicrobiana y antifngica se observ en
extractos crudos y, posteriormente, se encontr que los efectos
45
fungistticos se incrementaban con la polarizacin del triple enlace y
con la solubilidad en lpidos (Matta & Poveda, 1995).
Despus se determin la estructura del principal fungitxico presente
en la haba, el cual se llam Wyerona que es el cetoster acetilnico;
tambin se encontr el alcohol acetilnico. Estos fueron sintetizados y
ensayados microbiologicamente frente a cinco hongos, incluyendo
Botrytis cinerea, comparando su actividad de inhibir la germinacin
de las esporas de estos. La Wyerona natural fue ms activa contra
Botrytis cinerea, el ms patgeno para el haba (Matta & Poveda,
1995).

3.2.3.2 CUMARINAS
Algunas cumarinas incluyendo la umbeliferona, escopoletina y
furanocumarinas juegan un papel fungicida importante en las
plantas. Algunos autores estudiaron los efectos inhibitorios de la
umbeliferona y sus derivados alquil y acil sobre el crecimiento de
bacterias, hongos y levaduras (Duarte & Hernandez, 1996)
3.2.3.3 OTRAS MOLCULAS CON ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
46
Algunas sesquiterpenlactonas poseen propiedades antimicrobianas.
Los germacranlicos, mikanlido y dehidromikanlido de Mikana
monagasensis inhiben el crecimiento de bacterias y de Candida
albicans. La helenalina mostr actividad contra hongos patgenos
como: Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton acriminatum y
Epidermophyton sp. la partenina, principal lactona de Parthenium
hysterophorus, inhibi la germinacin esporangial y la movilidad de
esporas de Sclerospora graminicola pero no tuvo actividad contra el
desarrollo de conidios de Aspergillus flavus (Pedrozo & Torrenegra,
1983; Matta & Poveda, 1995).

3.2.4 USO DE LOS EXTRACTOS VEGETALES
El control con plantas se ha utilizado hace mucho tiempo y su
funcionamiento se basa en repeler o atraer insectos, gusanos, y
agentes vectores de enfermedades. Las plantas empleadas con estos
fines son hierbas aromticas, malezas que por los metabolitos
secundarios y/ o principios activos que poseen, favorecen o
desfavorecen condiciones de desarrollo de otras plantas o cultivos y
47
previenen enfermedades. Los tipos de control que se usan con mayor
frecuencia se hacen con plantas acompaantes, plantas repelentes o
con cultivos trampa, los que se hallan combinados para obtener un
beneficio mutuo (Mejia, 1989).
Ante la necesidad e importancia de reducir el uso de qumicos y
productos agrcolas, que influyen en la calidad de las plantas, se ha
dado cada vez ms importancia a los extractos naturales como
controladores, con el fin de dar nuevas alternativas dentro del MIP,
teniendo en cuenta los sistemas de defensa de las plantas, con la
ventaja de ser biodegradables y contribuyendo, adems, a preservar el
medio ambiente y la biodiversidad. (Mejia, 1996).

3.3 MICROORGANISMOS FITOPATOGENOS:
Las enfermedades infecciosas de las plantas son muy importantes
porque traen como consecuencia prdidas econmicas, desnutricin y
hambre.
48
Ya que no se han demostrado anticuerpos en las plantas, su
resistencia a la infeccin difiere de la de los animales. Los mtodos
ms comnmente usados para combatir esas infecciones son:
difusin de ejemplares resistentes, prcticas de cultivo adecuadas;
desinfeccin qumica, inspeccin y cuarentena.(Pelczar, 1982).
Debido a los mltiples factores implicados, no es posible estimar el
costo verdadero de las enfermedades de las plantas pues no se puede
valorar el hambre, la desnutricin, las prdidas de las granjas,
ranchos, casas, y todos los efectos adversos que repercuten en la
economa nacional por fallas en las cosechas debidas a tales
enfermedades.(Pelczar, 1982).
Adems de las prdidas econmicas, deficiencias en la dieta, el
hambre que resulta por disminuir el monto de las cosechas, algunos
organismos patgenos de las plantas producen intoxicacin
alimentaria al hombre y a los animales. Un ejemplo de esto es el
ergotismo, producido por el hongo Claviceps purpurea, que se
desarrolla en los granos de cereales y en algunos pastos
reemplazando el meollo de las semillas por masas compactas
llamadas esclerticas que son los cuerpos del hongo endurecido en
reposo. Estos contienen alcaloides que actan sobre el sistema
49
nervioso humano y de los animales, produciendo gangrena,
convulsiones y muerte. Otro tipo de organismo patgeno para las
plantas, que tambin produce intoxicacin en algunos animales es
Fusarium sp. que origina la roa del centeno y la cebada. Este y otros
hongos crecen en las semillas almacenadas produciendo sustancias
que son muy txicas para los cerdos y otros animales. (Pelczar, 1982).
Las infecciones de las plantas, como las de los humanos y los
animales, son producidas por algas, bacterias, virus, hongos,
nemtodos, y algunas plantas superiores parsitas. La mayora de
los organismos patgenos de las plantas son parsitos, pero algunos
como los virus y el hongo del tizn (roya), son parsitos obligados;
muchas bacterias y hongos son patgenos oportunistas o saprfitos
facultativos. (Pelczar, 1982).
La mayora de las enfermedades de las plantas son producidas por
hongos; poco menos de 200 por bacterias, y muchas menos por algas.
Se han descrito ms de 300 virus de los vegetales. Afortunadamente,
aunque hay miles de organismos patgenos en la naturaleza, una
planta en particular puede tener quizs 40 patgenos pero
generalmente slo es atacada por uno o dos de esos agentes al mismo
tiempo. De hecho, la resistencia a los organismos patgenos es, en
50
general, ms la regla que la excepcin. Aunque los mecanismos
bsicos del parasitismo y patogenicidad en las plantas son
esencialmente similares a los animales, hay algunas diferencias
bastante obvias:
v Como la mayora de las plantas son inmviles, el organismo
patgeno debe buscarse fuera de stas.
v Los organismos patgenos que atacan las plantas dependen de
factores ambientales como el viento, agua, insectos y otro animales
para su diseminacin.
v Las plantas no producen anticuerpos y por lo tanto no se hacen
inmunes a las infecciones como los animales.
Las bacterias producen gran variedad de enfermedades en las plantas
caracterizadas por reacciones del husped como agallas,
marchitamiento, podredumbre, chancros, deformidad de los frutos,
manchas en las hojas, cambios de color, enanismo y retardo en la
maduracin de los frutos.(Pelczar, 1982)

51
3.3.1 GNERO Agrobacteri um:
Mide aproximadamente 0.6 1.0 X 1.5 3.0 micras, bacilo flagelado,
Gram negativo que se establece en las plantas formando
tumoraciones. No formador de esporas, oxignico, mvil, posee de 1 a
6 flagelos pertricos; temperatura ptima de 25 a 28 C, tiene como
aceptor final de electrones el oxgeno, algunas cepas son
anoxignicas en presencia de nitrato; catalasa, oxidasa y urea
positiva, colonias usualmente convexas, circulares, pequeas y no
pigmentadas o ligeramente beige. (Brock, T. 1998).
Las dos especies ms estudiadas son: A. tumefaciens que causa la
agalla de corona y adems es la nica bacteria conocida relacionada
al desarrollo de cualquier forma de cncer. Por esto ha servido como
modelo experimental a los investigadores del cncer en los mamferos,
y A. rhizogenes que causan la raz pilosa. (Pelczar. M, 1982).
La Agrobacteria es un habitante del suelo. La cepas oncognicas se
presentan principalmente en suelos previamente contaminados con
material vegetal enfermo. Algunas cepas no oncognicas de
Agrobacterium se han aislado de especmenes humanos. (Garces. E,
1996).
52

3.3.2 GNERO Erwi ni a:
FIGURA No.1 Caractersticas microscpicas del Gnero Erwi ni a.
(BAYONA, M., 1996)
Erwinia causa diversas enfermedades como cncer, agallas, manchas
en las hojas, tizones, marchitamiento y pudriciones que pueden ser
blandas o no. Este gnero consta de once especies con un pathovar,
que causa tizones y marchitamiento, y de cuatro especies y tres
pathovars que producen pudriciones blandas, todas ellas con diversas
propiedades patognicas y fenotpicas. (Garces. E, 1996).
53
Mide aproximadamente 0.5 1.0 X 1 3 micras, Gram negativa,
mvil, posee flagelos pertricos, anoxignica facultativa,
qumiorganotrfica; temperatura ptima de 27 a 30 C. (Brock, T.
1998). Ver figura No. 1.
Invade los tejidos de las plantas vivas produciendo necrosis seca,
agallas, marchitamiento y reblandecimiento de las races. Como
muchas enfermedades graves de las plantas las producen los hongos,
se ha concedido mucha atencin a stos porque han causado muchas
epidemias que se han diseminado rpidamente dejando destruidas las
cosechas y en consecuencia una gran prdida econmica. (Pelczar,
1982).
3.3.3 GNERO Fusari um:
54
FIGURA No. 2 Caracterstica microscpicas del Gnero Fusari um.
(BAYONA, M., 1996)

Las lesiones producidas a las plantas por los hongos se localizan en
ciertas partes o tejidos, o la infeccin se generaliza, daando toda la
planta. Las infecciones por hongos producen enfermedades que
matan al vegetal; producen hipoplasia o impiden el desarrollo parcial
o total de ste. El crecimiento excesivo hiperplasia, en toda la planta o
en algunas partes, es el resultado de ciertas infecciones por hongos.
(Pelczar. M, 1982).
Estos mohos, Deuteromycetes, se hallan muy difundidos en la
naturaleza y frecuentemente contaminan los medios de cultivo
bacteriolgicos, ya que sus esporas se diseminan con las corrientes
areas. Tambin abundan en el suelo, la materia vegetal y alimentos
en descomposicin. Muchas de estas especies se han relacionado con
las enfermedades de las plantas y una, la F. moniliforme, produce
giberelina, un estimulante del crecimiento de las plantas. El gnero
Fusarium se caracteriza por conidias multicelulares, fusiformes y
falcifomes que nacen de los conidiforos que se agrupan como los
rayos de una rueda (arreglo verticilado) en hifas cortas ramificadas.
(Brock,T, 1998). Ver figura No. 2.
55

3.3.4 GNERO Tri choderma:
FIGURA No. 3 Cractersticas microscpicas del Gnero
Tri choderma.
(LAS AUTORAS)
Una de las especies de Deuteromycetes ms comn es T. viride, hongo
del suelo activo en los procesos de amonificacin y descomposicin de
celulosa. Los cultivos en placa toman color verde brillante debido a
los conglomerados de conidias que se forman en las puntas de las
hifas. Crecen rpidamente y son frecuentes contaminantes de los
cultivos en laboratorio. T. viride produce un antibitico eficaz contra
otras especies de hongos. (Brock. T, 1998). Ver figura No. 3
56
3.3.5 GNERO Botryti s

FIGURA No. 4 Caractersticas microscpicas del Gnero Botryti s.
(BAYONA, M., 1996).

Germina en condiciones favorables de temperatura y humedad
relativa siendo un factor limitante en la produccin, almacenamiento
y mercadeo de rosas, crisantemos, claveles, estatice, lechugas, uvas,
fresas y tomate. La podredumbre causada por Botrytis cinerea se
denomina moho gris la cual afecta flores, tallos y races. (Redmon,
1987; Pie & De Leeuw, 1991, Bayona 1996). Ver figura No. 4.
57

Las colonias de Botrytis cinerea son de crecimiento moderado, blancas
o grises. Dependiendo del medio de cultivo donde se encuentren y la
expresin de sus caractersticas genticas se presentan diferentes
morfologas macroscpicas que se pueden clasificar en uno de cuatro
tipos: De tipo micelial es una colonia de crecimiento rpido,
abundante, algodonosa y de color pardo en escasa produccin de
conidias y esclerocios. De tipo esclerocial, es una colonia de
crecimiento lento, micelio escaso de color blanco inicialmente y luego
a medida que va envejeciendo el micelio va tomando color gris a pardo
con abundantes esclerocios de color negro, distribuidos
irregularmente en el medio. De tipo esporulante, produce en forma
abundante conidios y poca formacin de esclerocios. Por ltimo, la de
tipo esporulante-esclerocial o intermedio, se caracteriza por la
produccin de esporas y la formacin de esclerocios en la etapas
diferentes del desarrollo de la colonia; la esporulacin se da entre 5 y
15 das y la produccin de esclerocios se presenta despus de los 16
das, con disminucin apreciable de la esporulacin. (J arvis, 1977;
Bary & Barnett 1984).
58
Botrytis posee un estado latente que es el esclerocio, el cual
permanece en el suelo mientras mejoran las condiciones medio
ambientales , para su crecimiento y desarrollo. Su estructura se
describe de la siguiente manera: los extremos de las hifas son
ramificados . Al comienzo de su formacin son hialinas y con el
tiempo se tornan pardas o negras debido a la descomposicin de los
pigmentos melnicos en el anillo externo. Su germinacin se establece
por la produccin de conidiforos a temperatura de 3 a 27 C,
formando una sucesin de conidioforos durante 2 meses (J arvis,
1981b; Bayona, 1996; Menge, 1997).
Los esclerocios, en condiciones de alta humedad, aumentan en
tamao rpidamente extendindose formando una lana superficial,
que se manifiesta en pocas con condiciones favorables del medio
ambiente para el crecimiento del hongo como humedad relativa alta,
bajas temperaturas, alta luminosidad, entre otros.(Sarrazola & Rocca
de Sarrazola, 1975).
3.3.5.2 PATOGENIA
Al colonizar la planta, el patgeno B. cinerea empieza a extraer los
alimentos, puede actuar de dos maneras: 1) produciendo toxinas que
59
matan las clulas antes del avance de las hifas, de tal forma que
estas necesitan solamente degradar los alimentos insolubles en las
clulas muertas para obtener los propios. 2) produccin de enzimas
digestivas que son excretadas desde las hifas convirtiendo los
alimentos insolubles en solubles. (Coley el al, 1981; Pie & De Leeuw,
19991; Bayona, 1996).
La infeccin se realiza de una forma rpida, a una temperatura
ptima de 20 C y su periodo de germinacin est comprendido entre
tres a cinco horas. (Coley el al, 1981; Pie & De leeuw, 1991).
Subsecuentemente se presenta una necrosis que da como resultado la
muerte por podredumbre del tallo y la raz (Pie & De Leeuw, 1991;
Vargas, 1994).
Los mecanismos de penetracin son variados: como la infeccin
mecnica, por degradacin quitina celulosa peptina. Ultimamente se
ha demostrado la degradacin de la pared celular vegetal en los
puntos de infeccin. Tambin es capaz de aprovechar las heridas
causadas por vientos fuertes y heladas. Los tejidos senescentes que
permanecen en las plantas sanas, facilitan su invasin y
60
contaminacin en las plantas vecinas (Pie & De Leeuw, 1991;
J ames,1991).

3.4 MANEJ O INTEGRADO DE PLAGAS (MIP)
Es la utilizacin armnica del mayor nmero posible de tcnica
apropiadas para reducir y mantener las poblaciones de plagas por
debajo de los niveles del dao econmico a la agricultura o a sus
productos (Cancelado, 1995).
En la investigacin de plagas, el desarrollo del MIP ha tenido la
ventaja de reducir el uso de plaguicidas, en algunos casos hasta en
un 50% (Quezada, 1989). En los programas MIP es de vital
importancia el tratar de combinar el mayor nmero de mtodos de
control. Dentro de este concepto de integracin con la ecologa
nutricional de las plagas, destacando como las plantas contienen
sustancias qumicas que afectan la biologa y el comportamiento de
los insectos (Vergara, 1995).
61
Dentro del MIP se encuentra el control biolgico, el control qumico, el
control cultural, el control etolgico y el control con extractos
vegetales (J imenez et al, 1993).

3.4.1.CONTROL BIOLGICO
3.4.1.1 GENERALIDADES
El control biolgico es la reduccin de la cantidad de inculo de un
patgeno o de su actividad productora de la enfermedad, logrado por,
o atravs de, uno o ms organismos diferentes al hombre, sin que se
de la eliminacin total del patgeno porque de esta manera se crea un
desequilibrio ecolgico (Bustamante, 1995).
La idea de que el control biolgico tena un efecto en los tejidos
areos, surgi desde 1910, ms tarde se demostr a travs de
estudios, que existen microorganismos no patgenos viables en la
superficie de los hojas. Ecolgicamente, el control biolgico, es
definido como la accin de un parsito o predador para mantener la
densidad de poblacin del organismo indeseable, a un nivel ms bajo
62
que el que existiera en su ausencia (Lopez & Rijo, 1994; Akeen, 1994;
De Bach, 1979; Pedigo, 1996).
Con relacin a los pases del rea tropical, Colombia ocupa una
posicin de privilegio en cuanto al avance y aplicacin del biocontrol
al lado del Per, Brasil y Mxico (Dominguez, 1989).
En Colombia el control biolgico de fitopatgenos ha sido muy poco
desarrollado frente al control de plagas y malezas. Sin embargo, hay
algunos trabajos realizados en cultivos como la caa de azcar,
cacao, caf, banano, guanbana, flores, etc., para el manejo de
plagas. Diferentes factores han impulsado al desarrollo del control
biolgico en este campo; el ms importante es la percepcin que se
tiene del impacto negativo en el medio ambiente que ocasionan las
plaguicidas y la calidad de los productos agrcolas para el consumo
humano y animal (Duarte & Hernandez, 1996; Greathead & Waage,
1997).
El control biolgico es una alternativa econmicamente, ya que
asegura un excelente mercado. Sin embargo, no todos los sistemas
han sido efectivos (J imenez, et al ,1993).
63
Aunque el biocontrol puede funcionar independientemente, ste
presenta sus limitaciones tanto intrnsecas como extrnsecas. Como
intrnsecas, se pueden sealar que los enemigos naturales importados
no logran adaptarse a las condiciones climticas de la nueva regin a
pesar de sus intentos de colonizacin, o no sincronizan bien sus
ciclos biolgicos con los de sus hospederos. Como extrnsecas, la
rigurosidad del clima en el rea nueva de colonizacin, las
condiciones perturbadoras de las prcticas agrcolas culturales y a la
presencia de residuos de plaguicidas (Arbelaez, 1995).
De igual forma, el control biolgico es ms efectivo si se combina con
otras medidas, como el tratamiento de suelos antes de la siembra, la
aplicacin de fungicidas, la produccin de material de propagacin
libre de patgenos, el uso de ciertas prcticas culturales, las medidas
de higiene y el manejo de ciertas condiciones ambientales, entre otras
(Baker & Scher, 1987).
3.4.1.2 MECANISMOS DEL CONTROL BIOLGICO
Dentro de los mecanismos de control biolgico tenemos el
Antagonismo Externo al hospedero. Este mecanismo incluye la
Antibiosis, en la cual un metablito producido por un organismo
64
(antibitico), directamente inhibe o destruye otro organismo de
diferente especie (Salazar, 1993).
La Proteccin Cruzada se da cuando un agente de control biolgico
es inoculado en una planta hospedante, la cual reconoce la presencia
de un microorganismo extrao e inicia la repuesta de resistencia, que
puede ser qumica y/ o morfo-fisiolgia. Una introduccin subsecuente
de un patgeno virulento encuentra que el hospedante ya est
prevenidoy su resistencia aumenta (Baker & Cock, 1985).
La Competencia que es la demanda activa en exceso de un
abastecimiento inmediato de material o condiciones de parte de uno o
ms organismos. En el suelo, los microorganismos compiten casi
exclusivamente por substrato, sin embargo, la competencia tambin
puede estar involucrada en ocupar los sitios de infeccin potenciales
por los agentes de biocontrol (Baker & Cock, 1985).
El Hiperparasitismo-Explotacin, es el crecimiento del
microorganismo benfico sobre el patgeno (Bustamante, 1995;
Salazar, 1993).
65
Se ha llegado a creer que el control biolgico slo consiste en
multiplicar masivamente y liberar parsitos y predadores, lo cual est
muy alejado de la realidad (Arbelaez, 1993).
Si fuera as no se podra conocer, o comprender las interacciones a
que est sometido el agente benfico cuando es colocado en campo
(J ames, 1991; Lopez & Rijo, 1994).
Los productos biolgicos poseen mayores beneficios, como el de la
especificidad, al contrario de ciertas sustancias qumicas que acaban
tambin con los organismos benficos con los que entran en contacto.
Para el desarrollo de las medidas de biocontrol se empieza por
investigar la biologa de la especie objetivo, sus enemigos naturales y
su ciclo de vida, con el fin de suministrar as los enemigos naturales
ms potentes (Vargas, 1994).
3.4.1.3 VENTAJ AS Y DESVENTAJ AS DEL CONTROL BIOLGICO
Las ventajas del control biolgico son la economa y la proteccin
ambiental la cual se traduce en la calidad de la vida humana.
El control qumico, debe ser aplicado repetidamente por un tiempo
indefinido, lo cual es costoso. Adems, la aplicacin repetida de
66
productos qumicos tiende a aumentar la polucin y el dao del medio
ambiente, puede inducir resistencia en poblaci ones de especies de
plagas lo cual obliga a que se investigue en el desarrollo de nuevos y
ms potentes productos. Debe tambin tenerse en cuenta que
muchos productos qumicos son derivados de valiosos recursos
naturales, como el petrleo y el carbn y requieren de grandes
consumos de energa para su produccin. En esto el control biolgico
posee una gran ventaja, ya que despus de establecido utiliza en su
mecanismo la energa biolgica presente en el medio ambiente sin un
consumo virtual de la misma (J imenez et al, 1993).
Sin embargo, el control biolgico posee tambin algunas desventajas
que pueden tenerse en cuenta, la certeza del control alcanzado es
variable en diferentes circunstancias. Tambin , las investigaciones
para el desarrollo de mtodos de control biolgico pueden ser muy
largas, y despus de aplicados, los mtodos pueden necesitar varios
aos de ajustes para alcanzar una total efectividad (J imenez et al,
1993).
Por estas razones, no se debe sobrestimar el control biolgico como
mtodo de control ni considerar que es el mtodo de control perfecto.
Se debe considerar ms bien como una herramienta primordial dentro
67
del MIP, a pesar de que en muchas ocasiones pueda emplearse como
mtodo nico, con relativo xito, para el control de una plaga
determinada (J imenez et al, 1993).

3.4.2 CONTROL QUIMICO
Este se define como el control de plagas y enfermedades por medio del
uso de productos sintetizados mediante una tcnica especfica, en
forma industrial.
Es uno de los controles ms empleados, especialmente en cultivos
bajo invernadero. Su uso ha contribuido sustancialmente en la
produccin de alimentos de calidad. A pesar de los esfuerzos
realizados para controlar mtodos no qumicos para el control de
plagas, los plaguicidas siguen siendo uno de los mtodos principales
para combatirlos (J imenez et al, 1993; Pedigo, 1996).
3.4.2.1 LOS AGROQUMICOS EN COLOMBIA
Los agroqumicos se comienzan a utilizar en Colombia en la dcada de
los 30 cuando la caja de Crdito Agrario realiz las primeras
68
importaciones de fertilizantes, insecticidas y fungicidas. En 1963 se
inici la formulacin de plaguicidas en el pas, proceso que consiste
en importar el ingrediente activo y agregarle los reactivos necesarios
para que quede el producto terminado (J imenez at al, 1993).
La superficie cultivada del pas se estima en 5 millones de hectreas,
encontrndose especies altamente demandantes de insecticidas como
es el caso del algodn, arroz, flores de exportacin, hortalizas, maz,
sorgo y caf (J imenez at al, 1993).
3.4.3 CONTROL CULTURAL
Muchos patgenos tienen parte de su ciclo de vida en el suelo, en
residuos de cosecha, hierba como hospedero o en insectos como
vectores. Pueden ser transportados por aire, agua, insectos,
desperdicios de animales y por implementos de agricultura. Por tanto
es conveniente reducir el inculo presente a travs de medidas de
sanidad apropiadas (Stakman & Harrar, 1975).
Las medidas sanitarias son factibles cuando el ciclo biolgico de un
organismo permite la aplicacin de un procedimiento eficaz. Estas
incluyen: desinfeccin de los implementos agrcolas, desinfeccin de
la herramienta usada en la poda, destruccin por quemas o enterrado
69
de los residuos de plantas fuentes de inculo (Walker & Aguirre,
1965).

3.4.3.1 TRATAMIENTO DEL SUELO
Fsico: los cultivos pueden ser sustituidos por otros ms resistentes o
pueden tomarse medidas para reducir la cantidad de patgenos. Se
pueden desarrollar patrones de rotacin para este propsito. Tambin
se ha utilizado la aplicacin directa de calor al suelo, lo cual parece
ser un mtodo de desinfeccin parcial. Los invernaderos, cuartos de
semilla y huertas pueden ser tratados con vapor o agua caliente,
reduciendo la incidencia de damping-off y otras enfermedades de los
semilleros (Stakman & Harrar, 1975).
3.4.4 CONTROL ETOLOGICO
Es la utilizacin de sustancias que de una u otra manera alteran el
comportamiento de los fitopatgenos. Dentro de ellas, se encuentran
las feromonas, los repelentes, los inhibidores de la alimentacin y
todas aquellas sustancias que tengan efectos similares. (Pedigo, 1996;
Lovaton & Mora, 1995).
70

4. METODOS

4.1 METODOS DE EXTRACCION DEL MATERIAL VEGETAL
Deben obedecer a la informacin de la naturaleza qumica de las
sustancias, presentes en la planta y al propsito de la investigacin
en el caso de la bsqueda de sustancias para la comprobacin de la
actividad biolgica, la extraccin del material vegetal frecuentemente
se realiza con solventes orgnicos de bajo punto de ebullicin (alcohol,
acetato de etilo) y de baja reactividad. El alcohol es generalmente ms
eficaz para recuperar la mayora de los metabolitos secundarios. Los
extractos son evaporados bajo presin reducida o liofilizados. (Tood,
S., 1988).
Los mtodos de extraccin se basan en las diferentes solubilidades de
los diversos compuestos encontrados en el material vegetal, as, para
sustancias de baja polaridad (lpidos) se utilizan como solventes el
71
ter de petrleo y cloroformo; para sustancias de mediana y alta
polaridad el acetato de etilo, el etanol y la acetona. (Torrenegra, R.,
1983).

4.2 METODOS DE SEPARACION
El mtodo de separacin ms utilizado en los estudios fitoqumicos es
la cromatografa que consiste en la separacin de los componentes de
una mezcla con base a la diferencia en retencin de tales sustancias
en dos fases, la mvil y la estacionara, dependiendo sta de la
adsorcin, reparto e intercambio inico. La adsorcin de una
sustancia es la fijacin de sta en la superficie de un slido. El
reparto es la distribucin de la sustancia entre dos fases lquidas
inmiscibles. El intercambio inico es el desplazamiento de un ion
desde una matriz, por otro que puede ser retenido ms fuertemente
La fase estacionara es aquella que permanece inmvil durante la
cromatografa; puede ser un slido o un lquido retenido sobre un
soporte slido. Los ms utilizados son la slica (SiO2), la almina
(Al2O3), xido de magnesio (MgO), carbn vegetal, carbonato de
calcio, florisil (Slica gel y magnesio). Etc. (Torrenegra, R., 1983).
Las cromatografas ms utilizadas hoy en da son la cromatografa en
papel (CP), utilizada para sustancias solubles en agua como
72
carbohidratos, amonocidos, fenoles, etc; La cromatografa en capa
delgada (CCD), un opcin para componentes lipdicos como
estreroides, quinonas simples etc y ofrece la ventaja de poder raspar
el compuesto que se requiere, disolverlo en el compuesto adecuado
para que se libere en la slica y volverlo a correrlo o analizarlo
separadamente, para esto es necesario hacer placas preparativas para
mejor separacin (Tood,S., 1988).
Las tcnicas anteriores permiten la obtencin de sustancias a
pequea escala en caso contrario la cromatografa en columna (CC).
Adems se emplea la cromatografa lquida de gases, para compuestos
voltiles como sequiterpenos, hidrocarburos y compuestos sulfricos
y la extraccin lquido lquido para compuestos carotenoides. La
combinacin de estas tcnicas permiten una mejor separacin de los
compuestos vegetales (Harborne, J . B. , 1973).
Otra tcnica, aunque menos utilizada, para separacin en fitoquimica
es la electrofloresis, ya que las sustancias a separar deben poseer una
carga para que corran en un campo elctrico (Torrenegra, R., 1988).

4.3 METODOS DE EVALUACION ANTIMICROBIANA
Estas tcnicas fueron desarrolladas al observar que los
microorganismos eran capaces de inducir resistencia al
73
antimicrobiano que sea utilizado contra l durante un perodo largo
de tiempo esta resistencia puede deberse a diversos mecanismos:
v Produccin de una sustancia que destruye el antibitico.
v Adaptacin del metabolismo bacteriano para inhibir el antibitico.
v La pared celular del microorganismo se vuelve impermeable al
antibitico.
v Un fago comunica la resistencia por transduccin.
v Desaparicin de cepas sensibles y supervivencia de cepas
resistentes por un fenmeno de seleccin natural.
v Produccin de cepas mutantes. (Pumarola, A., 1989).
Existen varias tcnicas para evaluar los antimicrobianos: Mtodo de
dilucin, mtodo de difusin en gel y mtodo de bioautografa.

4.3.1 METODO DE DILUCION
Tambin llamado turbidimtrico, consiste en hacer diluciones
seriadas del antibiotico en mcg/ ml en caldo de cultivo y un tubo como
control de crecimiento del microorganismo; los tubos se inoculan con
una suspensin calibrada del microorganismo y se inocula a
temperatura y tiempo determinados, finalizando el perodo de
incubacin, los tubos se examinan visualmente la existencia o no de
turbidez. (Dey, P. M., 1991).
74

4.3.2. METODO DE DIFUSION EN GEL
Se basa fundamentalmente en incorporar al medio de cultivo el
antibitico y el microorganismo en concentracin conocida para que
luego de solidificado el medio se adicione el extracto y se observar la
inhibicin de crecimiento o halos de inhibicin segn la tcnica
utilizada. Esta tcnica tambin abarca la llamada de discos de papel,
en la cual el antibitico a ensayar viene incorporado a discos de papel
absorvente en concentracin conocida, los cuales se colocan sobre la
superficie de una caja de agar sembrado masivamente con el
microorganismo en estudio, luego de incubar a la temperatura y
tiempo adecuados se observan halos de inhibicin de crecimiento.
Las ventajas de los mtodos de difusin son:
v Utilizan una pequea cantidad de la muestra a evaluar.
v Ofrecen la posibilidad de ensayar varias sustancias contra un
mismo microorganismo. (Dey, P. M., 1991, Meyers, E., 1964).
Con stas tcnicas y realizando diluciones de los diferentes
antimicrobianos a probar se puede determinar la Concentracin
Mnima Inhibitoria (CMI), que se define como la menor concentracin
de antibitico en g/ ml capaz de inhibir el desarrollo in vitro del
microorganismo. (Koneman, E., 1992).
75

4.3.3 METODO DE BIOAUTOGRAFIA
Es una tcnica que involucra un mtodo de separacin (CP, CCD) y
uno biolgico (difusin en gel), en el cual se pueden evaluar tanto
hongos como bacterias. Esta tcnica es ms utilizada para
compuestos lipoflicos en CCD y para compuestos polares en CP y se
debe realizar en una cabina de flujo laminar. (Kline, R., 1975).
El ensayo para bacterias inicia con la separacin (CP y CCD) de los
componentes de la mezcla en un solvente conveniente, el cual debe
ser secado completamente a temperatura ambiente, ya que al calor
prodra provocar la descomposicin de los componentes presentes en
la slica o en el papel. Posteriormente se siembra la placa con una
suspensin conocida de la bacteria y se observa el crecimiento
bacteriano a las 18 horas. Esta observacin es difcil a simple vista,
por lo tanto, se puede agregar un colorante de sensibilidad redox.
Este puede ser determinado para cada bacteria empiricamente.
(Meyers, E., 1964).
El mtodo para hongo es similar al de bacterias, pero no se debe
ensayar con hongos patgenos para humanos. La CCD se dejan secar,
luego se siembra la placa con una suspensin conocida de esporas, la
cual debe contener un detergente como Tween 80 (0,2%) para evitar la
76
agregacin de las mismas y obtener un inculo homogneo. Se incuba
en atmsfera hmeda y se observa un descenso o falta de
crecimiento. (Meyers, E., 1964).
Es importante tanto para bacterias como para hongos, realizar
pruebas donde se evale el solvente de corrido y el de disolucin de
los extractos, ya que muchos estabilizadores e impurezas de stos,
puede inhibir su crecimiento. (Meyers, E., 1964).
Dentro de sus ventajas se encuentra que es una tcnica rpida, fcil y
econmica. A dems requiere de pequeas cantidades de muestra y
puede ser aplicada a fracciones obtenidas por CC. (Kline, R., 1975).
Sus desventajas son el no saber la densidad del inculo que cae en la
CCD, el medio acuoso provoca que el componente se adsorba y se
libere sin saber que cantidad de ste es tomada por el
microorganismo, algunas sustancias se descomponen en su
separacin en slica gel. (Kline, R., 1975).

77

5. PARTE EXPERIMENTAL

El presente trabajo fue desarrollado en los laboratorios de fitoqumica
de la Pontificia Universidad J averiana; la parte experimental fue
desarrollada siguiendo los objetivos propuestos, analizando la
actividad antimicrobiana de los extractos de Bursera simaruba y
Bursera graveolens.
5.1. MATERIALES
5.1.1 MATERIAL VEGETAL
78

FIGURA No. 5 B. si maruba. Fotografa tomada en el lugar de la recoleccin.
Tocaima Cundinamarca. (ROBLES, J ., 1998).
Las especies estudiadas pertenecen a la familia Burseraceae las
cuales son usadas en medicina popular y presentan antecedentes de
poseer metablitos secundarios con algn tipo de bioactividad. Las
especies analizadas en el presente estudio (Bursera simaruba, Bursera
graveolens) fueron colectadas en el municipio de Tocaima,
departamento de Cundinamarca y en el municipio de Valle de San
J uan, departamento de Tolima, respectivamente. Ver figura No. 5.
Las caractersticas metereolgicas de estos municipios se presentan
en el ANEXO No.1
Un ejemplar de cada una de las especies estudiadas se registr en el
Herbario Nacional Colombiano. Ver figura No. 6
79

FIGURA No. 6 Montaje coleccionado en el Herbario Nacional Colombiano de
B. graveol ens (LAS AUTORAS).

5.1.2 MICROORGANISMOS ENSAYADOS
v Agrobacteriun tumefaciens y Erwinia carotovora fueron donados por
el cepario del Centro de Investigacin y Fsica de la Universidad
Nacional de Colombia.
v Fusarium oxysporum, Trichoderma viride y Botrytis cinerea fueron
donadas por el cepario del laboratorio de Microbiologa de la
Pontificia Universidad J averiana.

5.1.3 MATERIALES DE LABORATORIO
51.3.1 EQUIPOS
v Rotavapor Bouchi
v Incubadora
v Autoclave
v Mecheros Bunsen
v Cmaras cromatogrficas
v Nevera de icopor
v Molino

80
5.1.3.2 MATERIAL DE VIDRIO
v Cajas de petr
v Tubos de ensayo
v Erlenmeyer
v Beaker
v Vidrio reloj
v Pipetas
v Sacabocados

5.1.3.3 REACTIVOS
v Medios de cultivo : Agar Mueller Hinton, Agar Papa Dextrosa
(PDA), Caldo Nutritivo. VER ANEXO No. 2
v Solventes de extraccin: Eter de petroleo, Acetato de Etilo y Etanol
95%.
v Antibiticos: Amoxicilina y Griseofulvina

5.2 METODOS
5.2.1 MANEJ O MUESTRA VEGETAL
El material vegetal colectado fue colocado para su transporte en
bolsas plsticas selladas. Para la realizacin del trabajo se emplearon
las partes areas de las plantas (hojas y corteza), dicho material se
81
sec durante ocho das a temperatura ambiente (18C);
posteriormente se pulveriz en un molino y se almacen en
recipientes color ambar, siguiendo la metodologa explicada por
Robles, J ., 1998.

5.2.2 OBTENCION DEL EXTRACTO
5.2.2.1 EXTRACTO ETANOLICO
El material vegetal hojas y corteza (Ver Tabla No.2) se extrajo
inicialmente con etanol al 95%, por medio de la tcnica de maceracin
en fro durante ocho das, filtrando cada 48 horas, obtenindo el
extracto y recuperando el material vegetal. El extracto se concentr en
el rotavapor a presin reducida (175 psi) y temperatura constante
(45C). (Torrenegra,R.,1983). Ver esquema No.1

5.2.2.2 FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO ETANOLICO TOTAL
La mitad del extracto etanlico obtenido corresponde a 5.3g, 5.35g,
4.9g, 5.15g de hojas y corteza de B. simaruba y de B. graveolens
respectivamente a cada uno de estos extractos se le adicion Eter de
petrleo el cual se agit vigorosamente con el fin extraer la fraccin en
Eter de petrleo; est solucin fue concentrada en el Rotavapor
Bouchi.
82
La parte insoluble se trat posteriormente con
Diclorometano y Acetato de etilo. Obtenindose las Fracciones en
Diclorometano y Acetato de etilo. Ver esquema No.1.

83
Fraccionamiento
L/ L con Eter de
petroleo

MATERIAL
VEGETAL
Fraccin
insoluble
Fraccin Eter
de Petrleo
(F1)
Fraccin
Diclorometano
Fraccin
insoluble
Fraccin
Acetato de
etilo
Etanol 95% 8
das
Fraccionamiento
L/ L con CH2Cl2
Fraccionamiento
L/ L con AcOEt
ESQUEMA No.1. Metdo de obtencin de los
extractos y facciones.

EXTRACTO
ETANOLICO

84

5.2.3 CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA
La cromatografa en capa delgada (CCD) fue realizada en
cromatofolios plsticos TLC de slica gel GoF254 con cada una de las
fracciones.(Tood, S., 1988).
Se utilizaron los siguientes solventes:

FRACCION SOLVENTES PROPORCION
Ext. Etanlico cloroformo-etanol 9:05
Fr. Eter de petrleo Eter de petrleo- 8:2
Acetato de etilo-
Fr. Diclorometano Diclorometano 7:3
Etanol
Fr. Acetato Diclorometano 7:3
metanol

5.2.4 CARACTERIZACION DE LAS CEPAS
5.2.4.1 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACTERIAS
Las cepas de Agrobacterium tumefaciens y Erwinia carotovora fueron
sembradas en Caldo Nutritivo (BHI) para restablecer su metabolismo
85
y comprobar que se encontrase en la fase exponencial de su
crecimiento. Despus de incubar durante 24 horas a 35C; se
realizaron coloraciones de Gram para confirmar la pureza del cultivo.
Las cepas axnicas se sembraron en agar Mueller Hinton por el
mtodo de aislamiento por estras; despus de 24 horas de incubacin
se tomaron colonias aisladas para realizar las pruebas de
identificacin bioqumica, mtodo de diagnstico BBL (Crystal.
Beckton Dicknoson).

5.2.4.2 AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE LOS HONGOS
Las cepas de los hongos Fusariun oxysporum, Trichoderma viride y
Botrytis cinerea, se sembraron en PDA ( agar papa dextrosa) y se
incubaron a una temperatura de 25C durante seis das; una vez
crecidas se realizaron coloraciones con azul de lactofenol y se hicieron
observaciones microscpicas para establecer la pureza y
caractersticas morfolgicas que permitan identificarlos mediante la
comparacin con la clave taxonmica de Alexopoulos. (Alexopoulos, C.
J ., 1984)
A si mismo se realiz la curva de crecimiento radial inoculando con
cada uno de los hongos una caja de petri con medio de cultivo PDA y
86
midiendo el dimetro de la colonia cada dos das; para observar el
ciclo de desarrollo del hongo y confirmar su pureza. Ver grficos No.1,
2 y 3.
5.2.5 EVALUACION ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS
Se evalu por duplicado la actividad antimicrobiana de cada uno de
los extractos y fracciones frente a: Agrobaterium tumefaciens, Erwinia
carotovora, Fusarium oxysporum, Trichoderma viride y Botrytis cinerea;
utilizando. Como control negativo Dimetil Sulfxido (DMSO) 50l y
como control positivo amoxicilina 50l de una solucin cuya
concentacin fue de 20g/ 120ml de DMSO. (Las autoras).

5.2.5.1 BIOAUTOGRAFIA
Segn la concentracin del tubo No. 0.5 del patrn de Mc Farland, se
realiz una siembra masiva en cada una de las cajas de petri que
contenan 20ml de agar Mueller Hinton.
Paralelamente los extractos y fracciones fueron corridos en CCD;
estas se secaron a temperatura ambiente.
Estas cromatoplacas se colocaron en contacto directo con la siembra
realizada en las cajas de petri durante un perodo de 16 horas a 4C
para evitar el crecimiento de los microorganismos durante est
87
perodo de tiempo. Luego se retiraron las cromatoplacas y se
incubaron las cajas a 35C durante 18 horas.
Se observaron los halos de inhibicin para establecer la posible
actividad antimicrobiana. (Kline, R., 1975).

5.2.5.2. TECNICA DE DIFUSION EN GEL. PERFORACION EN GEL.
Se seleccionaron de cuatro a cinco colonias de un cultivo de 24 horas
para ser sembrados en caldo nutritivo y ajustar su concentracin con
el tubo No. 0.5 de la escala turbidimtrica de Mc Farlnd (10
13
UFC).
Se realizaron cinco perforaciones de 5mm de dimetro con un
sacabocado estril en cajas de petri que contenan 40ml de agar
Mueller Hinton. En cada perforacin se colocaron 10l de medio de
cultivo para evitar la dispersin del extracto.
Del tubo seleccionado se realiz una siembra masiva con hisopo en
las cajas de petri a ser utilizadas; en cada caja se analiz la actividad
de tres fracciones diferentes con sus respectivos controles positivo y
negativo. (Dey, P.M., 1991; Meyers, E., 1964).
En cada perforacin se colocaron 50l de las siguientes
concentraciones:

88
FRACCION CONCENTRACION
EXT. ETANOLICO 1g/ 5ml DMSO
FRACCIONES 0.3g/ 1.5ml DMSO

En las cajas de petri se incubaron a 35C durante 18 horas y se
compararon los halos de inhibicin de las fracciones con los controles
de cada una de las cajas.
Se utiliz ste mtodo porque permite observar halos mayores ya que
la sustancia se difunde en todo el medio. (Dey, P.M., 1991; Meyers,
E., 1964).

5.2.5.3 METODO DE CRECIMIENTO RADIAL
Los extractos para cada prueba fueron incorporados (extracto
etanlico total 1ml y fracciones 0.5ml) a 120ml de medio de cultivo
agar papa dextrosa (PDA) de la siguiente manera:
FRACCION CONCENTRACION
EXT. ETANOLICO 1g/ 5ml DMSO
FRACCIONES 0.3g/ 1.5ml DMSO

Se utilizaron como control positivo griseofulvina a una concentracin
de 50mg/ 1ml DMSO y como control negativo DMSO.
89
Posteriormente se sirvieron las cajas de petri con 20ml de agar PDA
ms extracto, donde fue colocado un inculo de 5mm de dimetro de
cada uno de los hongos procurando que ste quedara en el centro de
la caja, con el fin de observar el crecimiento radial.
Se incub a 20C realizando la lectura al sexto da, midiendo el
dimetro de cada colonia, considerndose el extracto activo si el
crecimiento es menor al 80% con relacin al control negativo.

5.2.5.4 DOSIS MEDIA INHIBITORIA
Teniendo en cuenta la actividad biolgica de los extractos frente a los
hongos se tomaron diferentes concentraciones:
Ext. ETANOLICO 332mg/ ml
266mg/ ml
200mg/ ml
100mg/ ml

FRACCIONES 166mg/ ml
133mg/ ml
100mg/ ml
50mg/ ml

90
Estas concentraciones fueron adicionadas al medio de cultivo (PDA) y
colocadas en las cajas de petri. Posteriormente se tom un inculo de
5mm de dimetro ubicado en el centro de la caja de petri. Se observ
el crecimiento radial midiendo el dimetro de cada hongo
comparndolo con el control negativo (DMSO).

91

6. RESULTADOS

6.1 MATERIAL VEGETAL EXTRAIDO

Las diferentes partes del material vegetal se pesaron para conocer la
cantidad a extraer, como se muestra a continuacin en la Tabla
No. 2.
TABLA No. 2 PESO DEL MATERIAL VEGETAL EXTRAIDO

PLANTA ORGANO PESO EN
GRAMOS
PESO EN GRAMOS DEL
EXTRACTO ETANOLICO
B. graveolens Hojas 62 9,8
Corteza 84 10,3
B. simaruba Hojas 65 11,6
Corteza 90 10.7

6.2 CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LOS
MICROORGANISMOS

De las bacterias estudiadas, E. carotovora; present un crecimiento
rpido y masivo en agar Mueller Hinton observandose colonias de
92
color beige, secas de borde irregular. Microscopicamente es un bacilo
Gram negativo corto. Ver figura No. 1 y Figura No. 7.

FIGURA No. 7 Caractersticas macroscpicas de Erwi ni a carotovora.
(LAS AUTORAS).

A. tumefaciens se caracteriz por un crecimiento moderado,
presentando colonias amarillas claras, de borde regular, circulares,
cremosas y olor caracterstico. Sus caractersticas microscopicas
fueron compatibles con bacilos Gram negativos largos.
Ver figura No. 8.

93

FIGURA No. 8 Caractersticas macroscpicas de Agrobacteri um tumefaci ens.
(LAS AUTORAS).

Los hongos presentaron un crecimiento caracterstico. Colonias
algodonosas, micelio abundante y colores tpicos de su especie. Ver
figura No 9.

94

FIGURA No. 9 Caractersticas macroscpicas de los hongos T. vi ri de, B.
ci nerea y F. oxysporum. (LAS AUTORAS).

6.3 CROMATOGRAFIA EN CAPA DELGADA
Utilizando la cromatografa en capa delgada (CCD) y realizando
cromatogramas se analizaron las similitudes y diferencias de las dos
especies en estudio. Observndose los compuestos de diferentes
polaridades.
Despus de revelar la placa con luz U.V. en onda larga se observa que
las dos especies presentan un grupo de sustancias que revelan con
azul celeste, de alta, mediana y baja polaridad, encontrndose
diferencias en las concentraciones de algunas de ellas.

95
6.4 ESTUDIO BIOLOGICO
La evaluacin de la actividad biolgica de los extractos se inici con el
ensayo frente a Erwi ni a carotovora y Agrobacteri um tumefaci ens,
el cual no mostr ningn tipo de inhibicin con respecto a los
diferentes extractos estudiados.
En los ensayos biolgicos de los extractos frente a los hongos
Fusari um oxysporum, Tri choderma vi ri de y Botryti s ci nerea, se
tomaron como positivos los extractos que provocaron un porcentaje
de crecimiento menor al 80% con respecto al control positivo (DMSO).

En tabla No. 3. podemos observar la actividad fungistatica de los
extractos etanlicos frente a los hongos F. oxysporum, B. cinerea y T.
Viride, donde se puede concluir que el extracto Etanlico de hojas de
B. simaruba (Extrcto No. 1) present el mayor porcentaje de inhibicin
frente a los hongos 45.8%, 45.5% y 11.2% respectivamente.

96
TABLA No. 3 ACTIVIDAD FUNGISTATICA DE LOS EXTRACTOS
ETANOLICOS FRENTE A Fusari um oxysporum (F. o), Botryti s
ci nerea (B. c) Y Tri choderma vi ri de (T.v).

CRECIMIENTO
(cm)
% DE
CRECIMIENTO
% DE
INHIBICION

EXTRACTO
F. o B. c T. v F. o B. c T. v F. o B. c T. v
Control negativo
(DMSO)
6 5.5 9 100 100 100 0 0 0
Control positivo
(Griseofulvina)
4.5 3.5 5.5 75 63.7 50 25 36.3 50
Extracto No. 1 3.3 3 8 54.2 54.5 88.8 45.8 45.4 11.2
Extracto No. 2 3.3 4.8 9 62.5 77.3 100 37.5 22.4 0
Extracto No.3 4.3 5.7 9 70.8 104 100 29.1 -4 0
Extracto No. 4 5 5.7 9 83.3 104 100 16.7 -4 0

* La concentraci n uti l i zada para l os extractos fue de
200mg/ml .

Las fracciones en Eter de petrleo de los cuatro extractos estudiados
presentaron un porcentaje de inhibicin alto frente a el hongo
Fusarium oxysporum resaltando el porcentaje de inhibicin de los
97
extractos No.1 y No. 4 con un valor del 40.6%; por otro lado estas
mismas fracciones no presentaron un porcentaje de inhibicin
representativo frente a B. cinerea. Ver tabla No. 4

TABLA No. 4 ACTIVIDAD FUNGISTATICA DE LA FRACCION ETER
DE PETROLEO FRENTE A Fusarium oxysporum (F. o), Botrytis
cinerea (B. c).

CRECIMIENTO
(cm)
% DE
CRECIMIENTO
% DE
INHIBICION
FRACCION
ETER DE
PETROLEO F. o B. c F. o B. c F. o B. c
Control negativo
(DMSO)
8 5 100 100 0 0
Control positivo
(Griseofulvina)
3 2 37.5 40 62.5 60
Extracto No. 1 4.8 5 59.3 100 40.6 0
Extracto No. 2 5.3 5.3 65.6 105 34.4 -5
Extracto No.3 5.5 4.8 68.7 95 31.2 5
Extracto No. 4 4.8 4 59.3 80 40.6 20
*La concentraci n uti l i zada para l a fracci n fue de 100mg/ml .

A continuacin se observa que las fraccciones en Diclorometano
presentan el mayor porcentaje de inhibicin frente al hongo F
.oxysporum en el extractos No. 2 (37.5%) y una menor inhibicin en
98
el extracto No. 4 (28.2%). Con respectos a los ensayos biolgicos
efectuados frente a B. cinerea, se observa que ningn extracto
presento un porcentaje de inhibicin significativo. Ver tabla No. 5

TABLA No. 5 ACTIVIDAD FUNGISTATICA DE LA FRACCION
DICLOROMETANO FRENTE A Fusari um oxysporum (F.o) Y
Botryti s ci nerea (B.c).

CRECIMIENTO
(cm)
% DE
CRECIMIENTO
% DE
INHIBICION
FRACCION
DICLOROMETA
NO F. o B. c F. o B. c F. o B. c
Control negativo
(DMSO)
8 5 100 100 0 0
Control positivo
(Griseofulvina)
3 2 37.5 40 62.5 60
Extracto No. 1 5.3 4 65.6 80 34.3 20
Extracto No. 2 5 4.3 62.5 85 37.5 15
Extracto No.3 5.3 4.5 65.6 90 34.3 10
Extracto No. 4 5.8 5.3 72 105 28 -5

En la evaluacin de la fraccin en Acetato de etilo frente a lo hongo
Fusarium oxysporum se presento un porcentaje mayor de inhibicin
de 38% en el extracto No. 2 que corresponde a la especie B.simaruba
99
(corteza), de acuerdo con estos resultados los extractos presentaron
actividad fungisttica contra ste microorganismo, mientras que ante
Botrytis cinerea no mostraron una actividad fungistatica relevante.
Ver tabla No.6

TABLA No. 6 ACTIVIDAD FUNGISTATICA DE LA FRACCION
ACETATO DE ETILO FRENTE A Fusari um oxysporum (F.o) Y
Botryti s ci nerea (B.c).

CRECIMIENTO
(cm)
% DE
CRECIMIENTO
% DE
INHIBICION
FRACCION
ACETATO DE
ETILO F. o B. c F. o B. c F. o B. c
Control negativo
(DMSO)
8 5 100 100 0 0
Control positivo
(Griseofulvina)
3 2 37.5 40 62.5 60
Extracto No. 1 5.7 4.2 72 85 28 15
Extracto No. 2 5 4.7 62 95 38 5
Extracto No.3 5.7 5.5 72 110 28 -10
Extracto No. 4 5.2 5 65.6 100 34.4 0

100
6.5 DOSIS MEDIA INHIBITORIA DL50
En el grfico No. 1 se puede estimar que la DL50 para el extracto
Etanlico de hojas de B. simaruba frente a F. oxysporum es de
180mg/ ml, mientras que para el extracto Etanlico de corteza de la
misma planta fue de 220mg/ ml; el extracto Etanlico de hojas de B.
graveolens presenta una Dosis Media Inhibitoria de 175mg/ ml. En
cuanto al extracto Etanlico de corteza de la misma planta se puede
observar en el grfico que la Dosis Media Inhibitoria no se encuentra
dentro del rango de las concentraciones estudiadas. Ver grfico No.1.
GRAFICO No.1 DOSIS MEDIA INHIBITORIA DEL EXTRACTO ETANOLICO
FRENTE A F. oxysporum
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 50 100 150 200 250 300 350
CONCENTRACION (mg/ ml)
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJ AS B. simaruba CORTEZA B.simaruba HOJ AS B. graveolens CORTEZA B. graveolens
101
En el siguiente grfico se puede concluir que la Dosis Media
Inhibitoria para los extractos Etanlicos de hojas y corteza de B.
graveolens frente a B. cinerea no se encuentran dentro del rango de
concentraciones analizadas, en tanto que el extracto Etanlico de las
partes areas (hojas y corteza) de B.simaruba presentaron una Dosis
Media Inhibitoria en un rango de concentraciones aproximadas de
285mg/ ml y 170mg/ ml respectivamente. Ver grfico No. 2.

FRENTE A B.cinerea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJAS B.simaruba CORTEZA B.simaruba HOJAS B. graveolens CORTEZA B. graveolens
102
La Dosis Media Inhibitoria de la fraccin en Diclorometano frente a F.
oxysporum de las partes areas (hojas y corteza) de las especies B.
simarunba y B. graveolens fueron aproximadamente las siguientes:
110mg/ ml, 120mg/ ml, 139mg/ ml y 89mg/ ml. Ver grfico No. 3.

GRAFICO No.3 DOSIS MEDIA INHIBITORIA DE LA FRACCION
DICLOROMETANO FRENTE A F. oxysporum
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJAS B. simaruba CORTEZA B.simaruba HOJAS B. graveolens CORTEZA B. graveolens
103
En la fraccin en Acetato de etilo frente a F. oxysporum se estima que
la DL50 se encuenta entre 62mg/ ml y 142mg/ ml. Ver grfico No. 4.

GRAFICO No.4 DOSIS MEDIA INHIBITORIA DE LA FRACCION ACETATO
DE ETILO FRENTE A F. oxysporum
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
CONCENTRACION (mg/ml)
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJAS B.simaruba CORTEZA B. simaruba HOJAS b. graveolens CORTEZA B. graveolens
104
La DL50 aproximada para la fraccin en Eter de petrleo frente a F.
oxysporom de las especies B. simaruba y B.graveolens (hojas y
corteza) se encuentra dentro del rango de concentraciones de
55mg/ ml (corteza de B. simaruba) y 140mg/ ml ( hojas B.graveolens).
Ver grfico No. 5.

GRAFICO No.5 DOSIS MEDIA INHIBITORIA DE LA FRACCIONETER DE
PETROLEO FRENTE A F. oxysporum
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
CONCENTRACION(mg/ml)
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJAS B.simaruba CORTEZAB. simaruba HOJAS B. graveolens CORTEZA B. graveolens
105

FIGURA No. 10 Actividad Fungisttica del Extracto Etanlico de
B. graveol ens de Corteza frente a F. oxysporum.
(LAS AUTORAS)

106

FIGURA No.11 Actividad Fungisttica del Extracto Etanlico de
Corteza de B. si mauba frente a B. ci nerea.
(LAS AUTORAS)

107

FIGURA No.12 Arriba y FIGURA No. 13 Abajo Comparacin de la actividad
Fungisttica del Extracto Etanlico de Corteza y Hojas de B. si maruba frente
a F.oxysporun, T.vi tri de y B. Ci nerea. (LAS AUTORAS)

108

FIGURA No.14 Arriba y FIGURA No.15 Abajo. Comparacin de la Actividad
Fungisttica del Extracto Etanlico de Corteza y Hojas de B. graveol ens
Frente a F. oxysporum, T. vi ri de y B. ci nerea. (LAS AUTORAS).

109

7. DISCUSIN DE RESULTADOS

Teniendo en cuenta la experiencia de trabajos previos se eligieron
como solventes de extraccin Etanol al 95%, Eter de petroleo,
Diclorometano y Acetato de etilo y para la evaluacin de la actividad
antibacteriana y antifungica el mtodo de perforacin (difucin en gel)
y crecimiento radial que permiten evaluar muestras no estriles, como
es el caso de los extractos vegetales, utilizando pequeas cantidades
de los mismos y adicionalmente brinda la posibilidad de enfrentar
simultneamente un microorganismo a varias concentraciones de un
mismo extracto. (Robles, J ,. 1998)

Debido a que los extractos vegetales estn constituidos por sustancias
de diversas caractersticas no es posible realizar una comparacin de
su potencia con respecto al patrn, en este sentido slo puede
determinarse para cada microorganismo el grado de activi dad del
extracto con relacin a un patrn de referencia.

De acuerdo a los resultados obtenidos. Ver tabla No. 3. Los extractos
que mostraron mayor porcentaje de inhibicin (actividad fungisttica)
110
fueron los extractos etanlicos de hojas de B. simaruba frente a los
hongos B. cinerea y F. oxysporum con porcentajes de inhibicin 45,4%
y 45,8% respectivamente.

De los resultados anteriores se puede deducir que el extracto
etanlico total es una extraccin completa donde se encuentran todos
los compuestos que las hojas o corteza de estas especies poseen, se
cree que por esta razn present actividad fungisttica frente a los
hongos F. oxysporum y B. cinerea, disminuyendo su crecimiento. Esto
posiblemente se debe a que las Burseraceas se componen
principalmente de una mezcla de terpenoides, polisacridos y otro
tipo de metabolitos secundarios como son los compuestos fenlicos.
(Khalid, S., 1983). Los cuales probablemente presentan accin sobre
la pared celular de las estructuras fngicas.

En cuanto a las fracciones todas (Eter de petrleo, Diclorometano y
Acetato de etilo) mostraron una mayor actividad fungisttica frente al
hongo F. oxysporum. Mientras que el porcentaje de inhibicin frente a
B. cinerea de estas mismas fracciones no fue significativo. Ver Tabla
No. 4, Tabla No. 5 y Tabla No. 6. Estos resultados se pueden
atribuir posiblemente a que los componentes que se encuentran en
111
cada una de las fracciones son muy similares; lo que se evidencia en
cada una de los mapas cromatogrficos realizados.

Los extractos Etanlicos totales de las especies en estudio no
presentaron ningn tipo de inhibicin frente a T. viride. Segn reporta
la literatura estas plantas poseen una alta variedad de polisacridos
que contienen principalmente galactosa, xilosa, arabinosa, ramnosa.
Estos azucares pueden ser fuente de alimento para el hongo. (Newall,
et al. 1996). Dando como consecuencia la no inhibicin de ste
microorganismo.

Lo mencionado anteriormente es una respuesta positiva ya que T.
viride es considerado benfico para el suelo interviniendo
activamente en los procesos de amonificacin y degradacin de
celulosa y adems produce antibiticos eficaces contra otros hongos.
(Pelczar, 1982).

Por otro lado todos los extractos y fracciones no mostraron actividad
antimicrobiana contra las bacterias (Erwinia carotovora y
Agrobacterium tumefaciens) siendo ensayados a diferentes
concentraciones. Este grupo bacteriano (bacterias Gram negativas),
112
poseen resistencia intrnseca frente a varios antibiticos de uso
clnico que son efectivos contra Gram positivos y esta resistencia no
especfica es reconocida como un limitante para el tratamiento de
infecciones producidas por este tipo de microorganismo. (J awetz, E.,
1984).

Las paredes celulares de las bacterias Gram negativas contienen tres
componentes que yacen exteriores en la envoltura de peptidoglucano:
lipoprotena, membrana exterior y lipopolisacaridos. La pared celular
es en general permeable sin selectividad especfica; sin embargo una
capa de la pared de las clulas Gram negativas, la membrana externa,
bloquea el paso de molculas relativamente grandes. Por esta razn se
considera que los diferentes extractos no presentan actividad frente a
E. carotovora y A. tumefaciens ya que los componentes de esta familia
son molculas grandes de alto peso molecular. (J awetz, E., 1984).

113

CONCLUSIONES

v Los extractos Etanlicos de Bursera simaruba de hojas y corteza
presentaron la mayor actividad fungisttica en relacin con todos
los extractos frente a los hongos fitopatgenos Fusarium
oxysporum y Botrytis cinerea.

v Los extractos Etanlicos de Bursera graveolens de hojas
presentaron una buena actividad fungisttica en relacin con
todos los extractos frente a Fusarium oxysporum mientras que
frente a Botrytis cinerea los porcentajes de inhibicin no fueron
significativos.

v Los extractos Etanlicos de las dos plantas estudiadas (Bursera
simaruba y Bursera graveolens) no presentaron ningn tipo de
actividad frente al hongo Trichoderma viride siedo un resultado
positivo ya que este hongo es venfico para el suelo.

114
v Las fracciones en Eter de petroleo, Diclorometano y Acetato de etilo
de las partes area (hojas y corteza) de las especies Bursera
simaruba y Bursera graveolens presentaron una buena actividad
fungisttica frente a Fusarium oxysporum.

v Los diferentes extractos de las especies Bursera simaruba y
Bursera graveolens no presentan actividad frente a las bacteria
fitopatgenas Erwinia carotovora y Agrobacterium tumefaciens.

115

RECOMENDACIONES

Con base en los resultados obtenidos en esta investigacin se
propone:
v Realizar estudios encaminados al aislamiento e identificacin de
la(s) sustancia(s) responsable de la actividad antimicrobiana
mostrada por los extractos de Bursera simaruba y Bursera
graveolens.

v Continuar la realizacin de otros bioensayos preliminares que
contribuyan a complementar la informacin sobre la actividad
antimicrobiana de Bursera simaruba y Bursera graveolens sobre
las que no existe en el momento mayor informacin.

v Implementar el uso de estos extractos como Control Integrado de
Plagas en cultivos con el fin de reducir las aplicaciones de
fungicidas y ayudar a mantener el equilibrio ecolgico para lograr
una mejor produccin y calidad.
116

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v SARRAZOLA, A. & ROCCA DE SARRAZOLA, M. 1975. Fitopatologa
Curso Moderno. Tomo I. Fitopatologa general Control Primera
Edicin. Editorial Hemisferio Sur, Buenos Aire, Argentina. 170 pp.

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v SWART, J . J ., 1942. Flora of Suriname Vol. 3, Part 2, Edited by the
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130
v TAMAI, M., et al. 1989. Planta Mdica. 55, 44-47 pp.

v TOOD, S., DAVIDSOHHN. 1988. Diagnostico y Tratamientos
Clnicos por el Laboratorio. Editorial Salvat S.A. Barcelona 8.
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v TORRENEGRA, Rubn D. 1983. Introduccin al Anlisis Moderno.
Pontificia Universidad J averiana. Santaf de Bogot.

v WALKER, J ., AGUIRRE, A., 1965. Patologa Vegetal. Primera
Edicin, Editorial Omega. S.A. Barcelona, Espaa. 1009 pp.

131
ANEXO No.1 CARACTERISTICAS METEREOLOGICAS DE LOS
MUNICIPIOS

TOCAIMA VALLE DE SAN J UAN
ALTURA SOBRE EL 500m. 400m.
EL NIVEL DEL MAR
TEMP. PROMEDIO 24C 27C
HUMEDAD RELATIVA 54% 66.3%

132
ANEXO No.2 COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

AGAR MUELLER HINTON:

Composicin (g/ L)
Infusin de carne 2,0
Hidrolisado de casena 17,5
Almidn 1,5
Agar-agar 13,0

AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

COMPOSICION (g/ L)
Infusin de patata 4,0
D(+)-glucosa 20,0
Agar-agar 15,0

CALDO CEREBRO CORAZON (BHI)

COMPOSICIN (g/ L)
Sustrato alimenticio 27,5
(Extacto de cerebro,corazn
y peptona)
D(+)-glucosa 2,0
Cloruro Sdico 5,0
Hidrgenofosfato disdico 2,5

9
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
EXTRACTOS DE PARTES AEREAS DE LAS ESPECIES Bursera
simaruba Y Bursera graveolens CONTRA ALGUNOS
MICROORGANISMOS PATOGENOS

LIBIA MERCEDES ORTIZ PEARANDA
MARTHA ELIZABETH SIERRA MESA

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el titulo de

MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
Bogot.
MAYO 2003

10

NOTA DE ADVERTENCIA

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique
nada contrario al dogma y a la moral catlica y porque
las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas
el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

Articulo 23 de la Resolucin No. 13 de
Julio de 1946

11

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS
EXTRACTOS DE PARTES AEREAS DE LAS ESPECIES Bursera
simaruba Y Bursera graveolens CONTRA ALGUNOS
MICROORGANISMOS PATOGENOS


APROBADO

Dr. JORGE ROBLES C. Ph. D ALVARO GRANADOS.
Director Codirector

Dr. JULIO PEDROZO. Ph. D. Dra. LUISA GUTIERREZ
Jurado Jurado

12

Dra. ANGELA UMAA
Decana Acadmica
Facultad de Ciencias - Universidad Javeriana

Dra. MARIA MERCEDES MARTINEZ
Directora Carrera Microbiologa Industrial
Facultad Ciencias Universidad Javeriana

13

ESTE TRABAJO ESTA DEDICADO PRINCIPALMENTE A DIOS, SIENDO
L LA FUENTE DE SABIDURA Y FORTALEZA; A MI FAMILIA POR SU
AMOR, COLABORACIN Y COMPRENSIN Y A TODAS LAS
PERSONAS QUE ME BRINDARON SIEMPRE SU APOYO
INCONDICIONAL

Libia Mercedes Ortiz Pearanda

14

DEDICO ESTE TRABAJO A DIOS, A MI FAMILIA POR SU APOYO Y
COMPAIA Y A TODAS AQUELLAS PERSONAS QUE SIEMPRE
ESTUVIERON PENDIENTES, BRINDNDOME SU APOYO Y NIMO EN
LOS MOMENTOS DIFCILES.

Martha Elizabeth Sierra Mesa

15

16

AGRADECIMIENTOS

Al Doctor Jorge Robles Camargo, por su apoyo y aliento constante para el
desarrollo y buen termino del trabajo.

Al Grupo de Investigacin Fitoqumica de la Universidad Javeriana (GIFUJ),
por los materiales, instalaciones e informacin prestada.

A nuestras familias, por su colaboracin y apoyo incondicional, Gracias.

A Libia por su tolerancia y paciencia en los momentos difciles y porque
siempre prim la amistad.

17

TABLA DE CONTENIDO

Pg.

LISTA DE ABREVIATURAS..........................................................................IV
INDICE DE FIGURAS......................................................................................V
INDICE DE TABLAS.....................................................................................VII
RESUMEN

1. INTRODUCCIN..........................................................................................9

2. OBJETIVOS...............................................................................................11

2.1 Objetivo general.....................................................................................11

2.2 Objetivos especficos.............................................................................11

3. ANTECEDENTES BIBLIOGRFICOS......................................................12

3.1 Antecedentes..........................................................................................12

3.2 Actualidad.............................................. .................................................16

3.3 Familia Burseraceae...............................................................................17

3.3.1 Composicin qumica.........................................................................17

3.3.1.1 Sesquiterpenos.................................................................................17

3.3.1.2 Monoterpenos...................................................................................18

3.3.1.3 Triterpenos........................................................................................19

18
3.3.1.4 Fenoles..............................................................................................20

3.3.2 Bursera simaruba................................................................................20

3.3.2.1 Descripcin taxonmica..................................................................20

3.3.2.2 Nombres vulgares............................................................................22

3.3.2.3 Compone ntes ...................................................................................22

3.3.2.4 Usos e importancia econmica.......................................................22

3.3.2.5 Distribucin geogrfica...................................................................23

3.3.2.6 Ecologa.............................................................................................23

3.3.3 Bursera graveolens.............................................................................26

3.3.3.1 Descripcin taxonmica..................................................................26

3.3.3.2 Nombres vulgares............................................................................28

3.3.3.3 Componentes...................................................................................28

3.3.3.4 Usos e importancia econmica.......................................................28

3.3.3.5 Distribucin geogrfica...................................................................28

4. BACTERIAS PATGENAS.......................................................................29

4.1 Bacillus subtilis......................................................................................29

4.2 Escherichia coli...................................................................................29

4.3 Staphylococcus aureus..............................................................31

5. HONGOS PATGENOS....................................................................34

5.1 Fusarium oxysporum......................................................................34

5.2 Microsporum canis.............................................................................35

5.3 Trichophyton mentagrophytes..............................................................35

19
6. FORMULACIN DEL PROBLEMA...........................................................37

7. MATERIALES............................................................................................38

7.1 Materiales de laboratorio.......................................................................38

7.2 Reactivos................................................................................................38

8. MTODOS.................................................................................................39

8.1 Extraccin...............................................................................................39

8.2 Tcnicas turbidimtricas.......................................................................39

8.3 Mtodos de evaluacin antimicrobiana...............................................40

8.4 Mtodos de dilucin en caldo...............................................................41

8.5 Mtodos de dilucin en agar.................................................................42

8.6 Bioautografa..........................................................................................42

8.7 Concentracin mnima inhibitoria........................................................43

8.8 Mtodo de crecimiento radial................................................................44

9. METODOLOGA........................................................................................45

9.1 Recoleccin del material vegetal..........................................................45

9.2 Cepas bacterianas utilizadas en el estudio.........................................46

9.3 Procedimientos fitoqumicos................................................................46

9.4 Aislamiento e identificacin de bacterias............................................46

9.5 Aislamiento e identificacin de hongos...............................................47

9.6 Bioautografa..........................................................................................47

9.7 Perforacin en gel..................................................................................48

9.8 Mtodo de crecimiento radial...............................................................48

20
9.9 Concentracin mnima inhibitoria........................................................49

10.RESULTADOS..........................................................................................51

10.1 Material vegetal.....................................................................................51

10.2 Revisin de cepas................................................................................52

10.2.1 Escherichia coli.................................................................................52

10.2.2 Bacillus subtilis..............................................................................52

10.2.3 Staphylococcus aureus....................................................................52

10.2.4 Fusarium oxysporum52

10.2.5 Trichophyton mentagrophytes......53

10.2.6 Microsporum canis...53

10.9 Evaluacin de la actividad biolgica53

10.10 Concentracin mnima inhibitoria de bacterias.............................58

10.11 Concentracin mnima inhibitoria de hongos.................................58

11. DISCUSIN DE RESULTADOS..............................................................67

12. CONCLUSIONES.....................................................................................78

13. RECOMENDACIONES............................................................................80

14. BIBLIOGRAFA........................................................................................81

ANEXOS

21

LISTA DE ABREVIATURAS

BHI Infusin cerebro corazn
B. graveolens Bursera graveolens
B. simaruba Bursera simaruba
B. subtilis Bacillus subtilis
CMI Concentracin mnima inhibitoria
DMSO Dimetil sulfxido
E. coli Escherichia coli
F. oxysporum Fusarium oxysporum
M. canis Microsporum canis
PDA Agar Papa Dextrosa
T. mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

22

LISTA DE FIGURAS

Pg.

FIGURA No. 1. B. simaruba. Fotografa de la corteza. Tomada en el lugar
de la recoleccin. Tocaima. Cundinamarca..................................................21

FIGURA No. 2. B. simaruba. Fotografa de las hojas, tomada en el lugar de
la recoleccin. Tocaima. Cundinamarca......................................................21

FIGURA No. 3. B. graveolens. Fotografa de las hojas y flores, tomada en
el lugar de la recoleccin, Agua de Dios. Cundinamarca...............................27

FIGURA No. 4. B. graveolens. Fotografa de la corteza, tomada en el lugar
de la recoleccin, Agua de Dios, Cundinamarca............................................27

FIGURA No. 5. B. simaruba. Coleccin en el Herbario Nacional
Colombiano....................................................................................................45

FIGURA No. 6. Mtodo de obtencin de los extractos y fracciones.............50

FIGURA No. 7. Control positivo (Gentamicina) y Control negativo
(DMSO)..........................................................................................................69

FIGURA No. 8. Bioensayos realizados a B. subtilis y S. aureus................69

FIGURA No. 9. Control positivo con griseofulvina y Control negativo con
DMSO.............................................................................................................75

FIGURA No. 10. T. mentagrophytes frente a B. graveolens, hojas y
corteza. Extracto etanlico 33.3mg/mL..........................................................75

FIGURA No. 11. M. canis frente a B. simaruba, hojas y corteza. Extracto
etanlico 33.3mg/mL .....................................................................................76

FIGURA No. 12. M. canis frente a B. graveolens, hojas; fraccin ter de
petrleo 3.33mg/mL. Y M. canis frente a B. simaruba, corteza; fraccin
diclorometano 2.6mg/mL............................................................................. ..76

23
FIGURA No. 13. F. oxysporum frente a B. graveolens, corteza. Fraccin
acetato de etilo 2.6mg/mL..............................................................................77

24
LISTA DE TABLAS

TABLA No. 1. Peso en gramos del material..................................................51

TABLA No. 2. Peso de los extractos y fracciones obtenidos, en gramos.....51

TABLA No. 3. Actividad de B. simaruba contra B. subtilis, Extracto
etanlico.........................................................................................................54

TABLA No. 4. Actividad de B. simaruba contra B. subtilis, fraccin ter de
Petrleo..........................................................................................................54

TABLA No. 5. Actividad de B. simaruba contra B. subtilis, fraccin
Diclorometano................................................................................................54

TABLA No. 6. Actividad de B. simaruba contra B. subtilis, fraccin Acetato
de Etilo............................................................................................................55

TABLA No. 7. Actividad de B. graveolens contra B. subtilis, extracto
etanlico.........................................................................................................55

TABLA No. 8. Actividad de B. graveolens contra B. subtilis, Fraccin ter
de petrleo......................................................................................................55

TABLA No. 9. Actividad de B. graveolens contra B. subtilis, fraccin
Diclorometano................................................................................................55

TABLA No. 10. Actividad de B. graveolens contra B. subtilis, fraccin
Acetato de Etilo..............................................................................................56

TABLA No. 11. Actividad de B. simaruba contra S. aureus, extracto
etanlico.........................................................................................................56

TABLA No. 12. Actividad de B. simaruba contra S. aureus, fraccin ter
de petrleo......................................................................................................56

TABLA No. 13. Actividad de B. simaruba contra S. aureus, fraccin
Diclorometano................................................................................................56

TABLA No. 14. Actividad de B. simaruba contra S. aureus, fraccin
Acetato de Etilo..............................................................................................57

25
TABLA No. 15. Actividad de B. graveolens contra S. aureus, extracto
etanlico.........................................................................................................57

TABLA No. 16. Actividad de B. graveolens contra S. aureus, fraccin ter
de petrleo.....................................................................................................57

TABLA No. 17. Actividad de B. graveolens contra S. aureus , fraccin
Diclorometano................................................................................................57

TABLA No. 18. Actividad de B. graveolens contra S. aureus, fraccin
Acetato de Etilo..............................................................................................58

TABLA No. 19. Actividad del extracto etanlico de B. graveolens y B.
simaruba frente a T. mentagrophytes.........................................................59

simaruba frente a M. canis...........................................................................59

simaruba frente a F. oxysporum..................................................................60

TABLA No. 22. Actividad de B. simaruba frente a T. mentagrophytes....61

TABLA No. 23. Actividad de B. graveolens frente a T.
mentagrophytes............................................................................................62

TABLA No. 24. Actividad de B. simaruba frente a M. canis.......................63

TABLA No. 25. Actividad de B. graveolens frente a M. canis....................64

TABLA No. 26. Actividad de B. simaruba frente a F. oxysporum..............65

TABLA No. 27. Actividad de B. graveolens frente a F. oxysporum...........66

26
RESUMEN

La aplicacin teraputica de las plantas medicinales es un rea que ha
presentado una gran expansin, adquiriendo una importancia cada vez
mayor. Debido a esto se estn investigando las especies Bursera simaruba
y Bursera graveolens de la familia Burseraceae.
Este trabajo tiene por objeto evaluar la actividad antimicrobiana presente en
las partes areas de B. simaruba y B. graveolens frente a
microorganismos, tales como E. coli, S. aureus, B. subtilis, T.
mentagrophytes, M. canis y F. oxysporum.
La materia prima vegetal provino de los Municipios de Agua de Dios y
Tocaima, en el Departamento de Cundinamarca. Los mtodos de extraccin
se basaron en la solubilidad de los compuestos, por lo cual los solventes
utilizados fueron etanol, ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo.
De acuerdo a la complejidad de la mezcla de compuestos presentes se
establecieron diferentes concentraciones; para el extracto total (Etanol) se
trabaj 200, 225 y 250mg/mL; y para las fracciones (ter de petrleo,
diclorometano y acetato de etilo), 50, 75, 100, 125 y 150mg/mL.
Para la seleccin de las cepas, se tuvo en cuenta su relacin con los
distintos cuadros clnicos que causan. Realizando la evaluacin por la
tcnica de Perforacin en Gel.
Los extractos totales de hojas obtenidos de B. simaruba y B. graveolens
presentaron actividad inhibitoria de crecimiento frente a S. aureus y B.
subtilis cuando se aplicaron a concentraciones de 250mg/mL.
Se realizaron todos los ensayos con cada fraccin aplicadas a cada
microorganismo y se obtuvo que la fraccin acetato de etilo de hojas y
corteza de B. graveolens present mayor actividad frente a S. aureus
obtenindose un halo de inhibicin promedio de 19,85mm y 23,01mm
respectivamente en la concentracin de 150mg/mL. Mientras que para B.

27
simaruba se obtuvo una mejor actividad en el extracto total, tanto de hojas
como de corteza en las concentraciones de 250mg/mL. A su vez B. subtilis
present un halo de inhibicin de 18.47mm en el extracto etanlico de hojas
de la especie de B. graveolens, en la concentracin de 250mg/mL.
Presentando este microorganismo un halo de inhibicin de 18.3mm frente a
la fraccin de acetato de etilo de corteza, a la mayor concentracin. Mientras
en B. simaruba la mayor inhibicin se present en el extracto etanlico,
tanto de hojas como de corteza, a una concentracin de 250mg/mL.
La evaluacin antifngica de los extractos etanlicos en las concentraciones
de 16.6mg/mL y 33.3mg/mL, de las partes areas de B. graveolens y B.
simaruba fueron activos frente a los tres hongos estudiados. M. canis
present inhibicin a las fracciones de B. simaruba, tanto para hojas como
para corteza. F. oxysporum fue el microorganismo que present mayor
resistencia frente a las fracciones de B. graveolens y B. simaruba. En
cuanto a T. mentagrophytes no present inhibicin frente a la especie B.
graveolens. Mientras, que frente a B. simaruba fue inhibido por las
fracciones de acetato de etilo.

28
SUMMARY

The therapeutic application of the medicinal plants is an area that has
presented a great expansion, acquiring an importance every bigger time. For
this reason species Bursera simaruba and Bursera graveolens of de
Burseraceae family are been investigated.

This work has for object to evaluate the antimicrobial activity present in aerial
parts of B. simaruba and B. graveolens against microorganisms, such as E.
coli, S. aureus, B. subtilis, T. mentagrophytes, M. canis and F.
oxysporum.
The plant material was collected from Agua de Dios and Tocaima city
town, in the department of Cundinamarca. The extraction methods were
based on the solubility of the compound, reason why the used solvents were
ethanol, petroleum ether, dichloromethane and ethyl acetate.
According to the complexity of the mixture of present compounds different
concentration settled down; for the total extract (ethanol) we tested 200, 225,
and 250mg/mL; and for the fraction (petroleum ether, dichloromethane and
ethyl acetate), were 50, 75, 100, 125 and 150 mg/mL.
For the selection of trains we took their relationship with the different clinical
symptoms that they cause. Carrying out the evaluation for the holes in gel
technique.
The obtained total extracts of leaves of B. simaruba and B. graveolens
presented grown inhibitory action against S. aureus and B. subtilis when
they were applied to concentrations of 250mg/mL.

They were carried out all assay with each fraction applied to each
microorganism and the ethyl acetate fraction of leaves and bark of B.
graveolens showed bigger activity against S. aureus by a halo of inhibition

29
average of 19,85mm and 23,01mm respectively in the concentration of
150mg/mL While B. simaruba showed a bigger activity in the total extract,
so us leaves as bark in the concentrations of 250 mg/mL. While B. subtilis
showed an inhibition of halo of 18,47mm in the etanolic extract of leaves of
the B. graveolens species in the concentration of 250mg/mL, while B.
graveolens showed an inhibition halo of 18,3mm against fraction of ethyl
acetate of bark to the same concentration. While in B. simaruba the biggest
inhibition showed in the etanolic extract, so us of the leaves as bark, to a
concentration of 250mg/mL .

The antifungal evaluation of the etanolics extracts in the concentrations of
16,6mg/mL and 33,3mg/ml, of the aerial parts of B. graveolens and B.
simaruba was active against the three studied fungi. M. canis showed
inhibition to the fraction of B. simaruba, so us for the leaves as the bark. F.
oxysporum was the microorganism that showed bigger resistance against
the fraction of B. graveolens and B. simaruba. The T. mentagrophytes it
didnt present inhibition against the B. graveolens species. While against to
B. simaruba was inhibited by the ethyl acetate fractions

30
1. INTRODUCCIN

La fitoterapia vive actualmente su segunda poca de prestaciones
humanitarias a gran escala, de una forma moderna, racional y cientfica,
observndose en las plantas que un principio activo, definido y clasificado se
comporta de modo distinto o no previsto, extrao a los resultados cientficos
experimentales. La razn de estos resultados imprevistos se debe a la
accin sinrgica de los componentes de una planta, y no slo al principio
activo de inters. (Crdenas 1990)
En la familia Burseraceae se destacan sus propiedades farmacolgicas,
encontrndose por ejemplo actividades antiinflamatorias y antivirales de
algunas resinas (Duwiejua 1993).
Adems del inters en estudios sobre leucemia y carcinomas, los gneros
pertenecientes a esta familia son utilizados en algunas culturas indgenas
como desinfectantes de heridas, cicatrizantes fuertes, en tratamientos para el
asma, diarrea, clculos renales, entre otros. (Bernal y Correa 1990)
Desde tiempos muy remotos las plantas han cumplido un papel importante
en el rea de la teraputica gracias a las mltiples propiedades que ellas
poseen. Por esta razn en las ultimas dcadas ha ido tomando cada da
mayor importancia su estudio y el desarrollo de tcnicas analticas que
permitan la determinacin e identificacin de las sustancias o principios
activos contenidos en un vegetal. El poder constatar la presencia de estos
principios activos es un resultado de gran ayuda para la creacin de nuevas
tcnicas de control biolgico.
Colombia es poseedora de una gran variedad de plantas cuyas propiedades
no han sido descubiertas por completo, como aporte a este tipo de
investigacin se han escogido las plantas de la familia Burseraceae en sus
especies B. simaruba y B. graveolens, reconocidas por sus propiedades
teraputicas y cuyas partes areas han sido probadas preliminarmente y han
mostrado actividad antimicrobiana contra algunos microorganismos.

31
Esta posibilidad es el foco de estudio de esta investigacin, concretamente
evaluamos los diferentes extractos obtenidos de la planta contra bacterias y
hongos patgenos del humano y fitopatgenos; y as determinamos la
actividad antimicrobiana de los extractos contra cada uno de los
microorganismos. Adems, determinamos la concentracin mnima inhibitoria
del extracto.

32
2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antimicrobiana presente en las partes areas de
Bursera simaruba y Bursera graveolens frente a los microorganismos
seleccionados, mediante tcnicas biolgicas y qumicas.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS
Obtener los extractos de las plantas seleccionadas.
Fraccionar los extractos obtenidos que presenten una mayor accin
contra los microorganismos.
Realizar ensayos antimicrobianos contra Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Fusarium oxysporum,
Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes.
Establecer la concentracin mnima inhibitoria a partir de los extractos
y fracciones vegetales.
Sealar cual extracto y fraccin de las partes reas (hojas y corteza),
presenta actividad antifngica y cual presenta mayor actividad
antibacteriana.

33
3. ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS

3.1. Antecedentes
La cuarta parte, si no mas, de los frmacos empleados hoy en los pases
industrializados proceden o se han modelado a partir de productos vegetales.
Es una tendencia creciente con un inesperado doble punto de partida: la
farmacopea tradicional (los remedios de la abuela) y los sistemas de
sanacin de los pueblos indgenas. Hasta comienzo del siglo pasado haba
una notable coherencia sobre los frmacos empleados. Una rebotica del
siglo XVIII no difera mucho de otra del siglo XIII, si exceptuamos los
frmacos procedentes del Nuevo Mundo, como el blsamo del Per,
Guayaco, Zarzaparrilla o el Tabaco. (Arvigo 1993)
Cierto es que la medicina acadmica se fue apartando, sobre todo desde la
poca de la revolucin cientfica, de las prcticas de los curanderos tan
arraigadas en el pueblo llano. Pero no era una separacin tajante. En 1775,
William Withering, mdico ingls, le oy contar a un curandero que las hojas
de Digitalis purpurea eran muy eficaces para el tratamiento de la
hidropesa, trastorno producido por el bombeo deficiente del corazn. Al
tratar a sus pacientes de hidropesa con las hojas Withering descubri en
ellas un poderoso efecto cardiotnico. Desde entonces se han aislado a
partir de D. pupurea treinta glicsidos cardacos, entre ellos la digitoxina, la
digoxina y la digitoxigenina. Hoy sabemos que la digitalis inhibe una enzima
que moviliza el transporte de los iones sodio y potasio a travs de las
membranas celulares, la ATPasa de Na+/K+. ( Balick 1993)
Para llegar a la situacin actual hubo que seguir un camino de ida y vuelta.
En la explicacin de la evolucin de la teraputica, antroplogos e
historiadores de la medicina trazaron un esquema rgido, lineal y ascendente,
que colocaba en el vrtice, el quehacer mdico de los pases desarrollados.
Pero ese enfoque ha empezado a cambiar. Hoy se admite la coexistencia

34
histrica de distintas pautas o modelos culturales, cada uno de ellos con una
peculiar visin acerca de la enfermedad en su conjunto y, por lo tanto, con un
manejo diverso de los recursos curativos.
Dentro de esa tendencia, las medicinas tradicionales fueron reconocidas,
en los aos setenta por la Organizacin Mundial de la Salud, lo que confiri
un poderoso impulso a la investigacin en particular, de plantas medicinales.
De manera complementaria, los avances en zoofarmacognosia han puesto
de manifiesto que ciertos primates, los chimpancs por ejemplo, emplean de
forma selectiva plantas medicinales cuando se sienten enfermos, mostrando
as que la seleccin y uso de los vegetales medicinales con la consecuente
transmisin del conocimiento a los dems miembros de una especie no es
caracterstica exclusiva de los humanos. (Ramrez 1988)
Esta vuelta a los herbarios de rebotica no significa ningn retroceso. Para
entenderlo conviene darle cierta perspectiva histrica y espacial a la
situacin en que nos encontramos. Lo primero que salta a la vista es que las
estrategias seguidas por la investigacin y los laboratorios farmacuticos de
occidente difieren de las seguidas en oriente. A largo de los ltimos 20 aos
los frmacos de origen natural que han salido al mercado, en proporcin
abrumadora, resultado de las investigaciones realizados en China, Corea o
Japn. La contribucin occidental en nuevos medicamentos de origen
vegetal es, para el mismo periodo, menor. A que obedece esta diferencia?.
( Ramrez 1988)
La estrategia seguida por occidente para la produccin de medicamentos ha
venido determinada por dos factores principales: las dos guerras mundiales y
el establecimiento de los sistemas de seguridad social. Respecto al primero,
los gobiernos hubieron de hacer frente a la necesidad de grandes cantidades
de alimentos para atender a los combatientes y a la poblacin civil vctima de
los bombardeos en las ciudades densamente pobladas. Adems la
implantacin de sistemas de seguridad social motiv la demanda de

35
frmacos para proveer a los mdicos (miles de profesionales liberales
convertidos en asalariados de las instituciones gubernamentales de salud)
con los medicamentos requeridos por la asistencia mas o menos gratuita
para los ciudadanos. (Ammon 1991)
Ambos factores obligaron a los laboratorios farmacuticos a abordar nuevas
estrategias de produccin, lo que signific un replanteamiento del papel que
las plantas medicinales venan desempeando en su elaboracin.
La industrializacin de los medicamentos de origen vegetal haba comenzado
ya en los ltimos decenios del siglo pasado como un fruto ms del desarrollo
de la qumica alemana y francesa, sobre todo. En esa poca surgieron los
primeros laboratorios farmacuticos, que producan medicamentos en forma
de jarabes, extractos, tinturas, pomadas y emplastos. Para los habitantes de
las ciudades en pleno desarrollo y expansin, resultaba poco prctico el uso
tradicional de infusiones y tisanas medicinales elaboradas con las plantas
que crecan espontneamente. Esta incipiente industria farmacutica
productora de extractos de valeriana, quina, digital, hipecacuana, amapola,
cornezuelo del centeno, entre otros medicamentos galnicos, reconoca la
importancia histrica de los recursos naturales, se apoyaba en la
farmacognosia (conjunto de conocimientos de botnica taxonmica,
anatoma microscpica vegetal, qumica orgnica y fisiologa), y se
sustentaba en los procesos extractivos practicados mediante el uso de
disolventes orgnicos de distinta polaridad. Esta industria pr ocuraba, hasta
donde la tcnica finisecular lo permita, generar el mayor volumen de
productos a partir de una materia prima importada o fcil de obtener.
(Zamora 1992)
La ciencia de comienzos de siglo supona que, una vez conocido el principio
activo de una planta medicinal, esta dejaba de tener importancia comercial.
Se crey que las plantas medicinales contenan, por lo general, un solo
principio activo y que los dems metabolitos secundarios eran innecesarios

36
para el efecto curativo. La qumica progresaba y el sistema mtrico decimal
abandonaba el territorio de los gramos para presumir precisin en miligramos
y soar con los microgramos. As, el extracto, la tintura y la infusin de
rebotica fueron pasando a la historia de la farmacia como productos
inseguros, difciles de cuantificar y sobre todo, porque los medicamentos
galnicos eran mezclas de demasiados componentes y su accin resultaba
difcil de evaluar. Se pens que, con el tiempo, todos estos productos podan
sustituirse con las cpsulas, tabletas e inyectables elaborados con el
compuesto puro, con el elemento biolgicamente activo identificado en las
plantas. (Ramrez 1988)
Esta visin del proceso de investigacin determin, a su vez, los pasos
metodolgicos a seguir. Primero habra que seleccionar un vegetal idneo;
para ello, el camino ms racional era utilizar la quimotaxonoma que ayuda a
detectar en qu parte del planeta puede existir la flora ideal para encontrar el
producto previsto. Un segundo paso consistira en realizar una anlisis
fitoqumico de los compuestos presentes en el vegetal, extrayendo y aislando
las molculas de inters; de preferencia, las pertenecientes a grupos
qumicos de demostrada accin biodinmica, como son, por ejemplo, los
alcaloides. A continuacin, habr a que disear un modelo de
experimentacin farmacolgica animal en el cual ensayar los compuestos
puros extrados del vegetal; de detectarse alguna accin biolgica til, se
procedera a sintetizar el compuesto para su estudio farmacolgico,
toxicolgico y farmacutico. Por ltimo se iniciaran los estudios clnicos, con
sus respectivas fases que garantizaran la eficacia y seguridad del compuesto
descubierto. (Kubo 1991)
La biotecnologa ha entrado ya en el dominio de las plantas medicinales. Y
as se han ensayado los transplantes de clulas vegetales en organismos
animales con el fin de lograr que aquellas ejerzan su accin curativa en
stos. Los trasplantes entre reinos han mostrado que las clulas vegetales

37
podran funcionar como biobombas, segregando compuestos activos en el
torrente sanguneo o en los rganos diana de un animal. Clulas de plantas
medicinales, preparadas in vitro e injertadas luego en un animal de
laboratorio, permanecen metablicamente viables durante meses en el
cuerpo de un animal. (Ramrez 1988)
El mercado de los fitofrmacos ha llegado para quedarse por largo tiempo.
Es un regreso a las plantas medicinales? Para algunos pueblos si, para
otros no. Para la ciencia mdica, definitivamente no. El abordaje de la
investigacin de plantas medicinales se modific en la medida en que el
progreso de la tcnica permiti otros accesos para construir nuevos
paradigmas.

3.2. Actualidad
La aplicacin teraputica de las plantas medicinales es un rea que ha
presentado una gran expansin, adquiriendo una importancia cada vez
mayor. Es por esto, que se hace necesario profundizar en el conocimiento
por medio de los estudios en diferentes niveles que garanticen productos
fitoteraputicos de una gran calidad, eficacia y seguri dad. (Pieros 1992)
El efecto medicinal de una planta est contenido en los principios activos los
cuales son un complejo de compuestos qumicos que actan en sinergismo
manifestando una accin teraputica especifica.
La fitoterapia vive actualmente su segunda poca de prestaciones
humanitarias a gran escala, de una forma moderna, racional y cientfica,
observndose en las plantas que un principio activo, definido y clasificado se
comporta de modo distinto o no previsto, extrao a los resultados cientficos
experimentales. (Crdenas 1990)

38
3.3. Familia Burseraceae
Son rboles o arbustos con canales resinferos y balsamferos en la corteza;
hojas alternas, generalmente sin estipulas, pinnadas, trifoliadas o simples;
flores pequeas perfectas o polgamo-dioicas en pancula axilares,
terminales o subterminales, cliz con tres a cinco spalos imbricados o
valvares, ptalos tres a cinco, libres o raras veces connados, imbricados o
valvados en el capullo, un disco anular cupuliforme libre o soldado al cliz,
estambres iguales o desiguales, insertos en la margen o en la base del disco,
anteras con dos tecas; ovario spero con dos a cinco carpelos trgonos,
ovoide o globoso, estigma simple o con dos a cinco lbulos, placentacin
axial, usualmente con dos lbulos en cada lculo (excepcionalmente uno),
fruto en drupa, dehiscente, en dos a cinco valvas o indehiscente, pericarpo
carnoso, mesocarpo a menudo carnoso y mucilaginoso, con dos a cinco
nuececillas (pirenos), que contienen sendas semillas con testa membrancea
y endospermo nulo. (Garca 1992)

3.3.1. Composicin qumica
Las Burseraceae producen un gran rango de compuestos. La mayora de las
especies exudan una oleo-gomo-resina al ser daada la corteza. Esta se
compone de terpenoides. Los componentes voltiles usualmente
monoterpenos y sesquiterpenos, mientras las fracciones no voltiles son
diterpenos y triterpenos. Otro tipo de metabolitos secundarios tambin
presentes son compuestos fenlicos tales como flavonoides, cumarinas, y
varios lignanos. ( Khalid 1983)
Es de gran importancia conocer las caractersticas generales de los grupos
qumicos presentes en esta familia de plantas. A continuacin se realiza una
revisin global de cada uno de ellos:

39
3.3.1.1. Sesquiterpenos
Son un amplio grupo de sustancias presentes en diferentes organismos, y
estos son compuestos de la larga clase de terpenoides. Mas de 100
estructuras de terpenoides son conocidas y varios miles de compuestos de la
clase han sido aislados e identificados. Un gran nmero de sus estructuras
han sido determinadas en los ltimos 20 aos como resultado del desarrollo
de nuevas tcnicas cromatogrficas y espectroscpicas. Los
sesquiterpenoides son formados por condensacin de isopentil pirofosfato
con 3,3-dimetilalilpirofosfato para dar geranil pirofosfato. Adems, la adicin
de una molcula de isopentil pirofosfato forma 2E,6E-farnesil pirofosfato, el
cual tiene 15 tomos de carbono caractersticos de los sesquiterpenoides.
(Dey P 1991)
Desafortunadamente, la qumica de los productos naturales se ha interesado
ms en elucidar la estructura de nuevos compuestos que en entender la
funcin y actividad de estas sustancias.

3.3.1.2. Monoterpenos
Este tipo de compuestos qumicos se encuentra en plantas principalmente,
en los aceites esenciales. La volatilidad y el marcado olor de los aceites
esenciales, constituyen los elementos de la comunicacin qumica: su papel
es la polinizacin y la dispersin de las disporas. Los aceites esenciales se
muestran eficaces para disminuir o suprimir espasmos gastrointestinales;
frecuentemente intensifican la secrecin gstrica, por lo que se han calificado
como digestivos y estomquicos, lo que puede explicar el frecuente uso
tanto popular como mdico.
En los aceites esenciales se encontrarn, nicamente los terpenos ms
voltiles, es decir aquellos cuyo peso molecular no sea demasiado elevado:
Monoterpenos y Sesquiterpenos. Los de la serie monoterpnica son
hidrocarburos acclicos, monocclicos, bicclicos o policclicos. Estos

40
compuestos van acompaados de sus derivados oxigenados: alcoholes,
aldehdos, cetonas, steres, teres, etc. (Dey 1991 )

3.3.1.3. Triterpenos
Son compuestos de 30 carbonos, procedentes de la ciclacin del escualeno;
poseen una estructura siempre policclica, normalmente tetra o pentacclica.
Casi siempre hidroxilados en 3, presentan, al contrario de los dems
terpenos, una unidad bastante fuerte, siendo excepcionales las
modificaciones profundas del esqueleto bsico. No existe una diferencia
fundamental entre los triterpenos y los esteroles, considerndose estos
ltimos Triterpenos tetracclicos que han perdido, como mnimo tres metilos,
sin dejar de ser estructuras fuertes. Su inters teraputico de numerosas
drogas como saponsidos, utilizadas para extraer sustancias activas (escina,
glicirricina) o para obtener preparados galnicos, utilizados con frecuencia; y
con posible inters antitumoral de los cuasinoides. ( Dey 1991 )

3.3.1.4. Fenoles
Los fenoles son compuestos aromticos formados por un anillo bencnico
que tiene unido, por lo menos un grupo hidroxilo. Por regla general, los
compuestos poseen varios grupos presentes; en ocasiones el OH se
encuentra modificado. Existe gran cantidad de fenoles presentes en plantas
y otros organismos. (Pernet 1992)

3.3.2. Bursera simaruba
3.3.2.1. Descripcin taxonmica
Son rboles de 5 a 20 m de altura; corteza rojo-cobrizo, brillante;
ramificaciones glabras hasta raramente amarillo-lanosas. Hojas imparipinada,
21 35 cm de longitud y 12 - 23.5cm de ancho; pecolos pulverulentos en la
base y esparcidamente pubescentes arriba, o glabros, o raramente amarillo

41
lanosos, 7 11.5 cm de longitud; foliolos de 5 7 (-9), largo acuminados,
base inequilatera, foliolos laterales ampliamente ovados hasta ovado-
oblongos, foliolos terminales obovados, membranceos hasta coriceos,
mrgenes enteras, conspicuamente lanosos cuando jvenes, al menos con
las nervaduras pubescentes, laminas 4.5 14.5 cm de longitud y 2.5 8.0 cm
de ancho; pecolos pubescentes a glabros, 5 31 mm de longitud; raquis no
alado. Inflorescencias por lo general glabras, rojizas, estaminadas 17 28
cm de longitud; ms largas que las hojas jvenes; carpeladas 4 10.5 cm de
longitud, tan largas como las hojas jvenes. Flores 3 o 5 meras, con
pedicelos glabros 2 4 mm de longitud en las flores y 5 16 mm de longitud
en los frutos; estaminadas 5 meras, cliz poco profundo 5 lobado, lbulos
menos de 1 mm de longitud, ptalos 5, ovado elpticos, aguda y
apicalmente curvada, 2 2.5 mm de longitud y 1 mm de ancho, estambre 10,
tan largos como los ptalos, filamentos 1.5 mm de longitud, disco 5 lobado;
carpelodas 3 meros, lbulos del cliz 3, ptalos 3, ovados, agudos y
curvados apicalmente, 2 mm de longitud y aproximadamente 1 mm de ancho,
los estambres 6 , aproximadamente la mitad de la longitud de los ptalos,
ovario 3 loculado, ovoide aprox. 2mm de alto, estigma 3- lobado. Frutos
subglobulados, puntiagudos en ambos extremos, ligeramente 3 angulados,
verdes hasta rosado brillante, maduros caf - rojizos y caf cuando secos,
18 a 13 mm de longitud y 7 9 mm de dimetro. ( Bernal 1990)

42

FIGURA No.1 B. simaruba. Fotografa de la corteza, tomada en el lugar de
la recoleccin. Tocaima (Las autoras)

FIGURA No.2 B. simaruba. Fotografa de las hojas, tomada en el lugar de
recoleccin, Tocaima (Las autoras)

43
3.3.2.2. Nombres vulgares. Indio desnudo (Cundinamarca); Palo mulato
(Bolvar); Indio encuero y Almacigo (Magdalena y La Guajira); Caratero
(Cundinamarca); Faca-naca o Aria (Guajira). (Garca, 1992)

3.3.2.3. Componentes
Segn un estudio preliminar realizado por el Bilogo Edgar Palacios, los
compuestos aislados de B. simaruba fueron identificados como -amirina y
-amirina los cuales se encuentran en la corteza y -sitosterol que se
encuentra en las hojas, estos son compuestos de media polaridad.

3.3.2.4. Usos e importancia econmica
B. simaruba se considera en la medicina popular panamea cicatrizante de
heridas infectadas, nacidos o granos y antidiarreico. Su savia se usa para
curar cualquier herida infectada; para diarreas la corteza se machaca y se
deja en agua toda la noche, y el preparado se toma como agua de pasto
durante todo el da. Se acostumbra a combinarla con corteza de nance, de
culantro, cogoyo de guayabo, maraon o pia para obtener mejores
resultados. (Bernal 1990)
En la Indias Orientales la goma fragante de este rbol se usa para incienso
de iglesias. En la provincia del Darien el t de las hojas se usa para tratar
enfermedades venreas y la obesidad. Los indgenas chocoes aplican una
decoccin de la corteza al cuerpo tres veces al da por su accin depilatoria.
La resina se usa para tratar heridas y es aplicada al ombligo del nio recin
nacido. En Cuba se usa como tnico estomacal en resfriados y diarreas,
tambin se emplea como diurtico y antiespasmdico. La resina es
diafortica. La corteza se utiliza en las fiebres intermitentes y persistentes.
En Venezuela se le considera antirreumtico. Las hojas detienen
hemorragias gstricas y las semillas sirven para la mordedura de serpientes.
La decoccin de la corteza se usa para el cncer del estomago. En Costa

44
Rica la gomarresina de esta planta llamada clemeque es usada para la
acumulacin de lceras y enfermedades venreas. Los indgenas lo
emplean contra la diarrea y como insecticida. La infusin de los renuevos, se
ha empleado como abortivo. (Garca 1992)
La resina que se obtiene del tronco es usada luego de pasarla por agua
caliente, no solo para la extraccin de espinas sino tambin contra
mordeduras de culebra. Las hojas en forma de cataplasma y colocndolas
en la parte afectada se usan en casos de gangrena para evitar o prevenir
que se extienda. Los tallos en decoccin se utilizan en el Tolima con el fin de
adelgazar es decir para guardar la lnea. Tambin se dice que es un buen
remedio para el hgado y la tiroides. En Exumas y Long Island (Bahamas)
emplean en medicina popular a Bursera simaruba para aliviar el calor en la
piel (salpullido) y para refrescar la sangre, hirviendo las hojas y preparando
con ellas un t. (Garca 1992)

3.3.2.5. Distribucin Geogrfica
Se distribuye a travs de la regin del Caribe, ocurre desde la costa norte de
Mxico a travs de Amrica Central y sur de Florida, las Indias Occidentales,
hasta Panam, Colombia y Venezuela. De acuerdo con Arguello (1984) es
una especie nativa de las reas comprendidas desde la Florida central hasta
las Bahamas y las Antillas y desde el sur de Mxico hasta las regiones
septentrionales de Amrica del Sur.
En Colombia, ha sido registrada para los departamentos de:
Cundinamarca: de Girardot a Tocaima, altura 350 m.
Guajira: Cuatro lenguas al este de Carraipa , en la cordillera
Magdalena: Tucurinca, altura 100 a 200m.
3.3.2.6. Ecologa
Arguello(1984) indica que los ejemplares de Bursera simaruba, que han
alcanzado su completa madurez soportan ligeras heladas en invierno.

45
Abundan en lugares donde la precipitacin anual media es de 500 a 1400
mm, generalmente en altitudes por debajo de los 1000 m.s.n.m. soporta tipos
de suelos extremos, fluctuando entre habitats frtiles de bosques hmedos y
suelos calizos secos poco frtiles, aunque crece mejor en las tierras bajas
ricas. Tiene un alto grado de tolerancia a la sal. En Panam florece desde
mediados de marzo a mediados de junio. A travs de istmo varan en
trminos de tamao forma y pubescencia de los foliolos. Sin embargo la
combinacin de corteza delgada con textura de papel, de color rojo que se
desprende y la completa prdida de hojas durante la estacin seca, hacen
que este rbol sea inmediatamente reconocido en el campo. Los frutos
estn presentes desde noviembre a enero y ocasionalmente durante todo el
ao. Esta especie es ocasional en bosques jvenes, secos o hmedos, pero
particularmente en las reas ms secas. (Bernal 1990)
A continuacin se cita un recuento Wayuu, tomado del proyecto de
investigacin Etnologa Wayuu: Pautas de asentamiento y aprovechamiento
del ecosistema en la Serrana de la Makuira, Alta Guajira, Colombia. (En
ejecucin)
Hubo un hombre que pasando cerca de un cerro, vi el rbol del indio
desnudo y decidi cortar una rama para llevrsela a su casa y sembrarla. As
fue, la cort y se la llev a su casa, la sembr y todos los das se dedicaba a
echarle agua, la matita iba creciendo, lleg pues un da en que el seor vi
que la mata ya haba crecido, ya era un rbol grande y el seor decidi cavar
la tierra cerca de ese rbol, para colocar otro palo, y as poda colgar su
chinchorro y descansar.
As fue, entonces l dorma todo los das afuera. Sucede pues, que por all
cerca pasa todas las noches un diablo, ya que era su camino. Una noche, el
diablo pas, me huele a comida, tengo que encontrar esa comida.... El
diablo intentaba acercarse a la casa pero l no poda, algo le impeda pasar,
senta un miedo...

46
Una noche hizo todo lo posible y lleg a la casa y encontr al hombre
durmiendo profundamente y dijo riendo en voz alta: ya encontr lo que yo
quera, esta es mi comida, lo adivine desde un principio. Entonces de
pronto escuch una voz dicindole: tu no puedes llevar fcilmente a mi amo,
yo lo proteger de ti. Miro por todas partes y vio un rbol desnudo y le dijo:
Tu que haces aqu? Tu eres el que me ha estado dando miedo.
hagamos un trato, tu me das el alma de tu amo y te prometo nunca mas
pasar por aqu. El rbol le contesto: no puedo hacer esto con mi amo el
me cri desde pequeo, me echaba agua, me vio crecer, serv para su
enramada y no le puedo fallar, porque s que l me quiere. El diablo sigui
insistiendo, pero despus se fu cuando se cans de estar hablando; y as
segua todos los das, vena a molestar al rbol pidiendo el alma de su amo.
El rbol ya estaba cansado hasta que un da le dijo: si en verdad quieres
ganarte el alma de mi amo, hagamos un trato, sube en mis troncos hasta
lograr llegar a mi cima, en lo mas alto, tienes que llegar hasta all antes de
amanezca, si logras llegar antes de que amanezca el alma de mi amo ser
tuya, si no logras llegar lo dejas en paz, a l y a m y nunca mas vuelvas por
aqu. As fue, desde ese momento y esa misma noche el diablo comenz a
tratar de subir pero siempre se resbalaba, ya que el tronco del rbol era muy
suave y resbaloso. El diablo haca todo lo posible pero no poda, vio que
amaneci y todava no haba llegado a la cima, entonces le dijo al rbol:
esta bien, has ganado, qudate con el alma de tu amo, nunca volver a
pasar por aqu y nunca los molestar. Diciendo esto se fue. El rbol se
puso muy contento de salvar la vida de su amo, y desde ese momento el
diablo no pas por all.
Hay dos versiones sobre la planta: la primera consiste en que Kutena era un
hombre hermoso y de piel tersa que por su vanidad fue castigado
convirtindolo en un rbol. La segunda versin consiste en que un hombre

47
se convirti en rbol para que sirviera a las seoritas Wayuu en sus baos
para mantenerse bonitas.
Es una planta que mide ms o menos de 20 a 30 metros de altura, de hojas
ovaladas, tallo liso con partes de color verde intenso y partes marrones,
silvestre, propia de la Serrana de la Makuira y que se encuentra en la falda
de los cerros. Este rbol cura los enfermos. La corteza se hierve con panela
o sin sta para hacer una toma con la cual se combate la tos. El tallo sirve
para operar hernias. Tambin se utiliza para el desarrollo y el
rejuvenecimiento. El fruto recupera los glbulos rojos. (Etnologa Wayuu)

3.3. Bursera graveolens
3.3.3.1. Descripcin taxonmica
Ramificaciones densamente frondosas en los extremos; pecolos de 1 1.5
dm de longitud, angostamente alados arriba de la parte media; foliolos 2 3
pares, sesiles, oblongos, cerrados y angostos hasta agudos u obtusos en el
extremo enteros hacia la base aguda, foliolos laterales 3 6 cm de longitud, 2
3 cm de ancho, tpicamente glabros, nervio medio prominente en el envs,
nervaduras laterales y venas reticuladas inconspicuas; ramas florecidas
aprox. Tan largas como las hojas o alrededor de 1dm de longitud,
paniculadas con bracteas agudas lineal - lanceoladas; pedicelos 5 8mm de
longitud, mucho mas largos que las flores; cliz glabro y puberulento, lbulos
ovados de 1mm de longitud, ptalos oblongos de 4mm de longitud, un cuarto
mas amplio; ovario contrado en un estilo muy corto, drupas ovoides agudas
en ambos extremos, 6 9mm de longitud, 4mm de espesor. (Garca 1992)

48

FIGURA No.3 B. graveolens. Fotografa de las hojas y flores, tomada en el
lugar de recoleccin, Agua de Dios. (Las autoras)

FIGURA No.4 B. graveolens. Fotografa tomada en el lugar de recoleccin,
Agua de Dios. (Las autoras)

49
3.3.3.2. Nombres vulgares. Carao (Atlntico, Magdalena); Bija
(Magdalena); Tatamaco (Huila); Tamagaco(Soat); Zasafra
(Cundinamarca). (Bernal 1990)

3.3.3.3 Componentes
Mediante el estudio fitoqumico de la corteza de Bursera graveolens, se
encontr que contiene aceites esenciales, cido olmico (C
35
H
45
O
4
), resina
que posee los grupos C=O, CH
2
, CH
3
(simtrico y asimtrico), cadena
rectilnea. Adems los cidos resnicos 1, de color amarillo y con punto de
fusin 131C y cido resnico 2, de color amarillo y punto de fusin 152C; y
el reseno tambin de color amarillo, con punto de fusin 63C. A partir de la
especie Bursera graveolens se aislaron extractos con un aroma muy similar
al de la ginebra. (Garca 1992)

3.3.3.4. Usos e importancia econmica
La resina producida por Bursera graveolens es usada en medicina popular
en forma de emplastos en las hernias y tronchaduras de los pies. Es
sealada tambin para extraer cuerpos extraos epidrmicos. En el estado
de Yucatn (Mxico) emplean de Bursera graveolens las hojas en
cocimiento por va oral contra el asma, diarrea, pleuresa, clculos en el
rin, mordedura de serpientes y tuberculosis. Las hojas y la corteza en ron
para combatir las hemorroides; aplicada localmente para lavar heridas,
expulsin de fetos muertos y para facilitar el parto. (Bernal 1990)

3.3.3.5. Distribucin geogrfica
Desde Yucatn por Centro Amrica hasta Colombia y Per
Cundinamarca: Nario.
Magdalena: Santa Marta. Valle: Cali

50
4. BACTERIAS PATOGENAS

4.1. Bacillus subtilis:
Bacilo Gram positivo, posee esporas centrales ovaladas o cilndricas, es
aerobio facultativo, capaz de hidrolizar casena y almidn; tiene esporangios
no inflados, y esporas de pared delgada, es mesfilo. Produce subtilisina
agente que inhibe o mata a especies estrechamente relacionadas o incluso
cepas diferentes de la misma especie. El antibitico se libera cuando el
cultivo alcanza la fase estacionaria de su crecimiento, tras la cual inicia la
esporulacin. Puede aislarse fcilmente del suelo o de partculas de polvo
en suspensin y es uno de los organismos mas corrientes cuando se
siembra por estra muestras de suelo en placas que contengan diferentes
medios nutritivos. Los formadores de esporas pueden aislarse
selectivamente a partir de suelo, de los alimentos o de otros materiales,
dejando las muestras a 80C durante 100 minutos; este tratamiento destruye
completamente las clulas vegetativas, mientras que muchas de las esporas
presentes se mantienen viables. (Brock 1998)

4.2. Escherichia coli:
Es un bacilo de 1 3 m por 0.5m, que se presenta slo, en pares, en
cortas cadenas o formando grupos. En general es mvil (por flagelos
peritricos), aunque existen variantes inmviles no flageladas. No forma
esporas y por lo general es no cpsulado y Gram negativo. En cultivos
jvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente; en los viejos se
presentan formas de una dimensin mayor. (Carmona 1997)
E. coli crece bien en medios comunes de laboratorio. En caldo simple crece
en abundancia, formando una turbiedad uniforme, y un anillo, pero no en
pelcula, con fuerte olor fecaloide. En agar forma colonias circulares de 3 a 5
mm convexas, de borde continuo o un tanto ondulado, brillantes y de

51
coloracin blanca un poco amarillenta. Con produccin de cido y gas,
fermenta la lactosa y un gran nmero de carbohidratos; algunas cepas son
lactosa negativas. Es indol positiva, rojo de metilo positiva, Voges-Proskauer
(VP) negativa y no utiliza el citrato. Produce H
2
S en determinados medios.
Acidifica y coagula la leche. Pueden necesitarse pruebas adicionales en
casos de E. coli aislada de colitis hemorrgicas, las cuales son tpicamente
negativas a sorbitol. (Brock 1998)
Este bacilo es aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura ptima de
crecimiento es de 37C, pero posee propiedades de desarrollo en una gama
bastante amplia de temperaturas; el pH favorable es de 7 alguna cepas
producen hemolisina. El bacilo coli es relativamente resistente: permanece
vivo durante algn tiempo fuera del organismo, en especial en condiciones
de humedad y en aguas contaminadas. Es destrudo por el calor a 60C
durante 1 hora. Los antispticos comunes lo destruyen con relativa facilidad.
Tiene una estructura antignica bastante heterognea y, al igual que otros
gneros pertenecientes a esta familia se divide en grupos con base en un
antgeno somtico (O) termoestable, de naturaleza lipopolisacrida, presente
en la pared celular, y en tipos, por el antgeno protico flagelar (H). Este
ultimo es bastante complejo por lo comn se subdivide en B, L y A.
(Carmona 1997)
La variada combinacin de los componentes hace suponer que existen un
alto nmero de serotipos. A la fecha se han descrito unos 170 antgenos O,
90 antgenos K y 50 antgenos H. Como otras enterobacterias, puede formar
antgenos de fimbrias. Los llamados K88 y K99 son antgenos de este tipo;
se han clasificado como protenicos y constituyen factores importante de
colonizacin en cepas productoras de diarrea en cerdos y terneros. Aunque
forma parte de la flora intestinal normal del ser humano, es capaz de ejercer
accin patgena en el intestino o fuera de l. En el primer caso, E. coli est
asociado con al menos cuatro tipos de enfermedades en el humano; incluye

52
cepas enteropatgenas (EPEC), enterotxigenicas (ETEC), enteroinvasiva
(EIEC) y enterohemorrgica (EHEC), las cuales ocasionan enteritis agudas
benignas en nios y adultos y, a veces, diarreas tipo disenteriforme. En el
segundo caso originan meningitis (en recin nacidos ), infecciones urinarias.
As mismo puede causar peritonitis, septicemia y abscesos en distintas
partes del organismo. ( Jawetz 1995)

4.3. Staphylococcus aureus
Son clulas esfricas u ovoides inmviles, dispuestas en grumos semejantes
a racimos cuando est en medio slido, y en parejas, pequeos grupos o
cadenas cortas cuando se encuentran en medio lquido. No esporgenas ni
flageladas. (Brock 1998)
Los estafilococos son los microorganismos mas fciles de cultivar In Vitro en
caldo nutritivo, despus de 24 horas a 37C se observa una densa turbiedad,
con depsito moderado de carcter mucoso adherente, que se desintegra y
desaparece al agitarlo, con lo cual aumenta la turbiedad. En agar nutritivo
despus de 24 a 48 horas produce colonias redondas, circulares, de borde
continuo, consistencia cremosa y fcilmente emulsionables de color negro.
(Jawetz 1995)
La capacidad de S. aureus para fermentar los azcares como maltosa,
manitol, trehalosa es positiva. La produccin de una nucleasa termoestable
es un buen indicador de la presencia S. aureus, al igual que la conversin de
nitratos a nitritos. Los estafilococos son aerobios y anaerobios facultativos
(metabolismo respiratorio y fermentativo). Crecen a una temperatura ptima
de 37C y se desarrollan mejor en un pH ligeramente alcalino de 7.6 la
adicin de glucosa favorece el crecimiento. Elaboran diversas enzimas:
proteasas, lipasas, fosfatasas, gelatinasas, catalasas y coagulasas. La
produccin de esta ultima es exclusiva de S. aureus; produce tambin una
hemolisina filtrable y forma pigmentos dorados. Los estafilococos figuran

53
entre los organismos no esporulados mas resistentes al calor y a la
deshidratacin. Toleran los desinfectantes ordinarios mejor que las formas
vegetativas de muchas especies. En cultivo puro resisten una concentracin
de fenol al 1% durante 15 minutos, pero solo los mata una concentracin al
2%. Soportan el calor hmedo a 60C durante 30 minutos. Muchas cepas
de S. aureus toleran concentraciones altas de cloruro de sodio (7,5 a 10%),
y son fcilmente inhibidos por colorantes como el violeta de genciana.
(Jawetz 1995)
Son poco inmungenos, pero estimulan una respuesta especifica de
anticuerpos cuando se unen al peptidoglucano. En su mayor parte, las
cepas de S. aureus estn recubiertas por una protena A, unida por enlaces
covalentes a la capa de peptidoglucano. Tiene afinidad por el receptor Fc
de las inmunoglobulinas IgG
1
, IgG
2
e IgG
4,
y al unirse a esta fraccin
interfiere con la fagocitosis y la opsonizacin, adems de presentar tambin
actividad anticomplementaria. Se le considera por tanto, como un factor de
virulencia. Ms internamente est la membrana citoplasmtica formada por
un complejo de protenas, lpidos en menor proporcin y carbohidratos. En
algunas cepas se ha observado la presencia de una cpsula de
polisacridos, cuya funcin es proteger a la bacteria de la fagocitosis e inhibir
la opsonizacin. Experimentalmente, la accin patgena se pone a prueba
en el conejo, por ser el ms sensible de los animales de laboratorio: si se
inocula por va intravenosa, producir septicemia mortal, y por va
subcutnea dar lugar a la formacin de un absceso. Las infecciones
causadas en el ser humano por este gnero se deben sobre todo a la
especie S. aureus, con una gravedad que depende del sitio de la invasin y
de la respuesta del husped. Estas infecciones tienden a ser ms severas
en nios, adultos de edad avanzada e individuos inmunocomprometidos.
(Carmona 1997)

54
Puede producir una variedad de infecciones, incluyendo: meningitis,
endocarditis, osteomielitis, forunculosis, abscesos localizados, celulitis,
imptigo, sndrome de piel quemada, sndrome de choque txico, infecciones
postoperatorias, neumona, etc. Staphylococcus aureus tambin puede
dar origen a enfermedades dermatolgicas, como exfoliacin generalizada
(sndrome de Ritter), necrlisis epidrmica txica en individuos mayores,
imptigo buloso localizado, y erupcin escarlatiniforme generalizada. Todas
estas enfermedades configuran el llamado sndrome estafiloccico de piel
escaldada (SEPE). (Carmona 1997)

55
5. HONGOS PATOGENOS
5.1. Fusarium oxysporum:
Se trata de un hongo de distribucin universal. Se asla como saprofito del
suelo y de numerosas plantas (cereales, soja, algodn, pltanos, cebolla,
patatas, manzanas, etc.). Como fitopatgeno causa grandes prdidas
econmicas. En el hombre puede causar queratitis, infecciones cutneas y
diseminadas. Tiene una gran variedad morfolgica y sufre frecuentes
mutaciones en cultivo, apareciendo progresivamente ms micelio y
desapareciendo las esporodoquias y la coloracin. En PDA presenta un
crecimiento rpido: 50 mm en una semana. Al principio la colonia es lisa y
algodonosa. Con el tiempo toma un aspecto como el fieltro, de color blanco
o salmn plido, tindose de prpura en su zona central. El reverso es
prpura o azul oscuro. Produce un pigmento prpura-violeta que difunde al
medio. La esporodoquia, presente en algunas cepas, da una coloracin
crema anaranjada al cultivo. Algunas cepas tienen un caracterstico olor a
lilas. (Booth 1997)
Las microconidias son ovoides o en forma de rin, con un tamao de 5-12 x
2,3-3,5m y, ocasionalmente, con uno o dos tabiques. Nacen de
monofilides laterales, cortas y anchas, afiladas hacia la punta, con
collaretes poco definidos, solitarias o ramificadas. Las microconidias pueden
formar masas (simulan cabezas) pero nunca cadenas. Las macroconidias
tienen de uno a cinco septos. Su tamao es de 23-54 x 3-4,5m. Tienen
forma de media luna, ligeramente curvadas, con pared fina y delicada. Su
clula apical es afilada y la clula basal con forma de pie pero pueden tener
ambos extremos afilados. En la mayora de los cultivos las clamidosporas
son abundantes. Son grandes, hialinas, de pared lisa o rugosa y pueden
observarse aisladas o en parejas, intercalares o terminales. (Nelson 1994).
Algunos aislamientos presentan masas de esclerotia de color claro, azul o
violeta. El estado sexual no se ha descrito. In vitro presenta Concentracin

56
Mnima Inhibitoria (CMI) elevadas a los azoles y a la 5-fluorocitosina. Un 50
% de las cepas tienen CMI bajas a la anfotericina. F. oxysporum produce
marchitamientos vasculares principalmente en flores y hortalizas anuales,
plantas herbceas perennes de ornato, plantas de cultivo, malezas y en la
mimosa (rbol de seda). (Agrios 1998)

5.2. Microsporum canis:
Es el agente mas comn de tia microscpica. La infeccin proviene
generalmente de animales domsticos (gatos, perros y caballos). La
propagacin es posteriormente interhumana. En el medio Sabouraud la
colonia est formada por un micelio areo lanoso o algodonoso, de rpido
crecimiento, blanco al principio pero que al poco tiempo se vuelve
amarillento. Este pigmento amarillo se difunde a travs del medio y el
reverso de la colonia es pardo-rojizo. Se caracteriza por sus alargadas
macroconidias, fusiformes (75 micrones de promedio), de base truncada y
con extremos afilados forma navicular. Poseen una gruesa membrana
verrugosa. Las macroconidias aparecen al 5 6 da de su cultivo. Las
microconidias son piriformes. Tambin se observan hifas en raqueta,
pectinadas, cuerpos nodulares y clamidiosporos. (Willard 1990)
Causa cuadros de tinea capitis en los nios, y tinea corporis en nios y
adultos. La infeccin al cabello es del tipo ectotrix floreciendo bajo luz
ultravioleta, este dermatofito crece muy bien en PDA glucosado a
temperatura ambiente dando lugar a colonias que se desarrollan ms o
menos rpido. Las colonias son francamente algodonosas de color carmelito
al centro, por el reverso la colonia presenta un color amarillo anaranjado,
particularmente cuando la colonia es joven. (Guzmn 1989)

57
5.3. Trichophyton mentagrophytes:
Es un agente productor de tias y de dermatomicosis de la piel y de las uas.
Esta especie es la causante del conocido pie de atleta, y con frecuencia
origina la tinea barbae. La infeccin se contrae de fuentes humanas y
animales. Las colonias se desarrollan rpidamente y sus caracteres
macroscpicos estn, en lneas generales, dentro de dos grandes grupos
principales: colonias granulosas o algodonosas. Se ha observado que T.
mentagrophytes que da colonias de aspecto granuloso provoca tanto en la
piel glabra como en el crneo lesiones agudas, inflamatorias y supurativas, y
que los contagios son provocados, generalmente, por animales. Por el
contrario las colonias de tipo algodonoso producen lesiones ms
persistentes, crnicas, y el contagio se hace de persona a persona. (Zapater
1981)
Experimentalmente se sabe que las formas algodonosas son escasamente
virulentas para el cobayo. Sin embargo, pudo lograrse, por pasaje seriado,
un aumento de la virulencia de cepas algodonosas acompaada del cambio
morfolgico con la obtencin de la variedad granulosa. De esta manera se
demostr la unidad de la especie. Presenta microconidias esfricas de 2 a 5
micrones de dimetro, dispuestas en racimos. Las macroconidias son
claviformes, sostenidas por un corto pedculo, tabicadas, de un tamao que
varia entre 15 a 50 micrones. ( Willard 1990)
Este dermatofito ha sido aislado con cierta frecuencia. Causa cuadros
bastante inflamatorios de tinea pedis, manum, corporis y unguium. Tambin
tinea capitis, barbae y cruris. Se aisla frecuentemente en casos de tinea de
animales domsticos y salvajes. Su hallazgo en la lesin se hace a partir del
material infectado. En el cabello produce un tipo de invasin ectotrix. En las
preparaciones pueden verse fragmentos de hifa; se cultiva sobre PDA en el
cual da lugar a una colonia plana de color blanco y apariencia granular en su
superficie.

58
Microscpicamente en las preparaciones en fresco a partir de cultivos se
aprecian hifas delgadas con gran cantidad de microconidias agrupadas a
manera de racimos. Los cuerpo espirales y en raqueta se observan tambin
y guan la identificacin (Guzmn 1989 )

59
6. FORMULACIN DEL PROBLEMA

Tendrn actividad antimicrobiana los extractos de las partes areas de
Bursera simaruba y Bursera graveolens contra microorganismos como
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Fusarium
oxysporum, Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes ?

60
7. MATERIALES

7.1. MATERIALES DE LABORATORIO
Molino, Rotavapor Buchi, Incubadora, Autoclave, Mecheros Bunsen, Horno,
Cmaras cromatogrficas, Micropipetas, Sacabocados; Botellas Ambar,
Frascos de Mayonesa grandes, Cajas de Petri, Tubos de ensayo,
Erlenmeyer, Beaker.

7.2. REACTIVOS
Agar Mueller Hinton (Merck), Agar PDA (Difco), Caldo y Agar Nutritivo;
Solventes: Etanol 95%, ter de Petrleo, Diclorometano, Acetato de Etilo,
Dimetilsulfoxido (DMSO). Antibiticos: Amoxicilina y Griseofulvina.

61
8. METODOS

8.1. Extraccin
Los mtodos de extraccin se basan en las diferentes solubilidades de los
diversos compuestos encontrados en el material vegetal, as, para sustancias
de baja polaridad (lpidos) se utilizan solventes como ter de petrleo y
Diclorometano; para sustancias de mediana y alta polaridad el acetato de
etilo, el etanol y la acetona. ( Torrenegra 1983)
Las extracciones pueden hacerse por extraccin continua por reflujo
(utilizada en este trabajo) en la cual un matraz de fondo redondo que
contiene en su interior el material vegetal y el solvente, se calienta a
ebullicin, se evapora y se licua en el condensador o refrigerante; luego baja
por una varilla porosa a la fase acuosa aumentando la superficie de contacto
lo que ocasiona que la extraccin sea mayor; y por maceracin en fro una
de las tcnicas utilizadas en esta investigacin, el material se mezcla con el
solvente triturado constantemente en fro. (Deanna 1991).

8.2. Tcnicas turbidimtricas
Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo
y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetra mide la cantidad de
luz transmitida por la suspensin. Por este procedimiento se puede estimar
el nmero de bacterias en el cultivo, ya que dentro de un rango, la luz
absorbida o difractada por una suspensin bacteriana es directamente
proporcional a la concentracin de clulas en el culti vo. (Pelczar 1982).
Normalmente la multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin
de la luz transmitida ( transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida
(absorbancia), ya que esta ultima es directamente proporcional al nmero de
bacterias presentes en la suspensin. Si medimos la absorbancia de un
cultivo a distintos intervalos de tiempo, la curva que relaciona estos

62
parmetros representa la multiplicacin de la bacteria en sus distintas fases.
(Pelczar 1982). La primera es la fase de latencia en la que la bacteria se
adapta al medio de cultivo y el nmero de clulas no aumenta. Tras este
perodo las bacterias comienzan una fase de crecimiento exponencial en la
que la reproduccin celular alcanza una actividad mxima y el tiempo de
duplicacin es constante; esta fase se mantiene hasta que aparece algn
factor limitante y por eso la velocidad de multiplicacin disminuye y la
poblacin comienza un periodo de equilibrio que se denomina fase
estacionaria. Por ltimo, si se mantiene el cultivo por mas tiempo en esta
situacin, puede comenzar un proceso de muerte, en el que el nmero de
clulas disminuye : fase de muerte.

8.3. Mtodos de evaluacin antimicrobiana
Estas tcnicas fueron desarrolladas al observar que los microorganismos
eran capaces de inducir resistencia al antimicrobiano que se ha utilizado
contra l, durante un periodo largo de tiempo, esta resistencia puede deberse
a:
a. Produccin de una sustancia que disminuye el antibitico.
b. Adaptacin del metabolismo bacteriano para inhibir el antibitico
c. La pared celular del microorganismo se vuelve impermeable al
antibitico
d. Un fago comunica la resistencia por transduccin.
e. Desaparicin de cepas sensibles y supervivencia de cepas resistentes
por un fenmeno de seleccin natural.
f. Produccin de cepas mutantes. ( Pumarola 1989)
Muchas bacterias y hongos presentan resistencia a diferentes
antimicrobianos y algunos virus han desarrollado resistencia a los agentes
antivirales nuevos. Los patrones de resistencias cambian constantemente.

63
No importa cuan rpidamente se producen los nuevos agentes teraputicos,
los microorganismos parecen estar dispuestos a pasarlos.
El trmino antimicrobiano ha sido definido como una sustancia que es activa
frente a los microorganismos los cuales pueden ser producidos por stos
mismos o sintticamente en el laboratorio. Dentro de esta categora se
encuentran los antivirales y los antimicticos. (Jawetz 1995)
Para las pruebas de sensibilidad es necesario emplear un inculo estndar
de bacterias. El nmero de bacterias en un medio lquido puede
determinarse midiendo la densidad ptica de un cultivo en caldo de la
bacteria y comparndolo con el nmero de colonias que se observa en el
subcultivo en un medio de agar, haciendo crecer al microorganismo hasta su
fase estacionaria ( cuando su nmero es aproximadamente 1x 10
9

bacterias/mL ) o por comparacin visual de la turbidez del medio lquido con
un estndar que representa una suspensin de un nmero conocido de
bacterias. (Pumarola 1989)
La evaluacin de esta sensibilidad nos va a ayudar en la seleccin del
compuesto mas adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana.
Las pruebas mas utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria
frente a un agente antimicrobiano estn basados en el enfrentamiento in
vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente. (tratamiento de
las muestras clnicas)
Los mtodos empleados para estas pruebas son:

8.4. Mtodo de Dilucin en Caldo
En este mtodo se colocan concentraciones decrecientes del agente
antimicrobiano, generalmente diluciones al medio (1:2), en tubos con el caldo
de cultivo que sostendr el desarrollo del microorganismo. El agente
antimicrobiano se prepara en soluciones concentradas en un diluyente y
luego se diluyen en caldo para obtener las concentraciones apropiadas. Un

64
tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento,
y un tubo inoculado pero sin antimicrobiano. Luego de la incubacin
(usualmente 24 horas) se observa la turbidez de los tubos que indicar el
desarrollo bacteriano. (Jawetz 1995)

8.5. Mtodo de difusin en agar
En este mtodo se incorporan distintas concentraciones de agentes
antimicrobianos en placas con agar, una placa para cada dilucin. Los
microorganismos en estudio se diluyen hasta obtener una suspensin con
una turbidez algo superior a la del estndar 0.5 de Mac Farland y se coloca
una alcuota de cada suspensin en una cavidad del dispositivo para
inoculacin. Este dispositivo tiene prolongaciones metlicas calibradas para
recoger una pequea cantidad de la suspensin bacteriana y depositarla en
la superficie del agar. Luego de la incubacin durante 18-24 horas, los
microorganismos se desarrollarn en aquellas placas que no contengan
suficiente cantidad de antimicrobiano para inhibirlas. (Jawetz 1995)

8.6. Bioautografa
Es una tcnica que involucra un mtodo de separacin (CP, CCD) y una
biolgica (Difusin en gel) en el cual se pueden evaluar tanto hongos
(saprofitos) como bacterias. Esta tcnica es ms utilizada para compuestos
lipoflicos en CCD y para compuestos polares en CP y se debe realizar en
una cabina microbiolgica. (Kline 1975)
El ensayo para bacterias se inicia con la separacin (CP, CCD) de los
componentes de la mezcla en un solvente conveniente el cual debe ser
secado completamente a temperatura ambiente, ya que el calor puede
provocar la descomposicin de los componentes presentes en la slica o en
el papel. Posteriormente se asperja la placa una suspensin conocida de la
bacteria y se observa el crecimiento bacteriano a las 24 horas. Esta
observacin es difcil a simple vista, por lo tanto, se puede agregar un

65
colorante de sensibilidad redox. El mtodo para hongos es similar al de
bacterias, pero no se debe ensayar con hongos patgenos para humanos.
(Meyers 1964)
Es importante tanto para bacterias y hongos realizar pruebas en donde se
evale el solvente de corrido y el de disolucin de lo extractos, ya que
muchos estabilizadores e impurezas de estos, pueden inhibir el crecimiento.
(Meyers 1964 y Kline 1975)

8.7. Concentracin mnima inhibitoria
La sensibilidad de una bacteria a un antibitico determinado viene dada por
la concentracin mnima inhibitoria (CMI), que se define como la menor
concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa
bacteriana dada. As, si se logra alcanzar en el organismo la CMI con dosis
teraputicas, podremos afirmar que la cepa es sensible al antibitico. En
caso contrario, tendremos que decir que la cepa es resistente. Una cepa es
moderadamente sensible cuando la CMI de ese antibitico se alcanza en el
organismo con una dosis mas elevada que la dosis teraputica habitual sin
llegar a ser txica. A veces la CMI se suele encontrar en los lmites entre
sensible y resistente, lo que se llama puntos de corte o concentraciones
crticas; en este caso se clasifica la cepa como intermedia y se aconseja
repetir la prueba. (Carmona 1997)
La CMI mide la capacidad del agente antimicrobiano para inhibir la
multiplicacin del microorganismo. En consecuencia, los microorganismos
presentes en el inculo pueden ser solo inhibidos por el agente
antimicrobiano; estos reiniciarn su crecimiento si se elimina la accin de
este ltimo. En este caso se dice que el antimicrobiano es bacteriosttico o
inhibidor. (Jawetz 1995)

66
El mtodo de dilucin en caldo fue originariamente realizado en tubo de 13 x
100 con un volmen de caldo con un mililitro de antimicrobiano
(macromtodo). La determinacin de la CMI mediante el mtodo de dilucin
en caldo, al ir disminuyendo la concentracin de antibitico se observara que
no hay desarrollo de microorganismos por la ausencia de turbidez, hasta
llegar a un tubo a partir del cual comienza a haber un aumento de turbidez y,
por tanto, desarrollo bacteriano. Definimos la CMI con la mnima
concentracin de antibitico que inhibe el desarrollo de una bacteria
(Carmona 1997)

8.8. Mtodo de crecimiento radial
La evaluacin de la actividad de los extractos, contra hongos puede hacerse
por inhibicin del crecimiento radial, midiendo el halo de crecimiento del
hongo respecto al control negativo (% de crecimiento) restndolo de 100
para hallar el % de inhibicin de crecimiento. Por la tcnica de inhibicin del
crecimiento radial se toman como positivas aquellas sustancias que
provoquen un porcentaje de inhibicin del 20%. (Brock 1998)

67
9. METODOLOGA
9.1. Recoleccin de material:
La recoleccin del material vegetal de B. simaruba se realiz en el municipio
de Tocaima; y B. graveolens en el municipio de Agua de Dios,
pertenecientes al Departamento de Cundinamarca; con una altitud promedio
de 2300m.s.n.m y presencia de clima clido-hmedo; temperatura promedio
de 25C y humedad relativa de 54%. Un ejemplar de cada una de las
especies estudiadas de registro se encuentran en el Herbario Nacional
Colombiano, identificados con los nmeros: B.simaruba 472877 y B.
graveolens 443597

FIGURA No. 5. B. simaruba. Coleccin en el Herbario Nacional Colombiano.
(Las autoras)

El material recolectado fue sometido a un proceso de secado a temperatura
ambiente (18C) durante ocho das, posteriormente se pulveriz en un molino
y se almacen en recipientes color mbar.

68
9.2. Cepas microbianas utilizadas en el estudio:
Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus; fueron
donados por el Cepario de bacterias del Departamento de Microbiologa de
la Pontificia Universidad Javeriana.
Fusarium oxysporum, Microsporum canis y Trichophyton
mentagrophytes, fueron donados por el Cepario de Hongos del
Departamento de Microbiologa de la Pontificia Universidad Javeriana.

9.3. Procedimientos fitoqumicos:
El material vegetal, hojas y corteza se extrajo inicialmente con etanol al 95%,
por medio de la tcnica de Reflujo durante 48 horas. Filtrando cada 2 horas
hasta obtener el extracto etanlico. Luego se concentr el extracto en el
Rotavapor a presin reducida (175psi) y temperatura constante (45C) como
lo indica Torrenegra 1983. Posteriormente se realiz el Fraccionamiento
Lquido/Lquido en ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo para
obtener las diferentes fracciones. Las respectivas fracciones obtenidas se
concentraron en el Rotavapor Buchi. En donde se manejaron presiones de
vaco indicadas para estos solventes. Ver figura No. 6 Mtodos de obtencin
de extractos y fracciones.

9.4. Aislamiento e identificacin de bacterias
Se realiz la siembra de las cepas B. subtilis, E. coli y S. aureus en caldo
nutritivo, incubndose durante 24 horas a 35C. Se realizaron coloraciones
de Gram, confirmando la pureza del cultivo. Luego se sembraron las cepas
en agares selectivos como Luria Bertoni, EMB y Agar Manitol Salado,
respectivamente, por aislamiento; incubndose durante 24 horas. Se
tomaron las colonias aisladas para realizar las pruebas bioqumicas
respectivas.

69
Posteriormente se realiz la curva de crecimiento de cada bacteria, con el fin
de observar la viabilidad y velocidad de reproduccin celular en un tiempo
determinado. se realiz por agitacin durante 18 horas a 100 r.p.m en caldo
BHI, por la tcnica de espectrofotometra, absorbancia vs. tiempo. Ver anexo
No. 1

9.5. Aislamiento e identificacin de hongos patgenos
Se sembraron las cepas de F. oxysporum, M. canis y T. mentagrophytes
en agar PDA. Con un tiempo de incubacin de 6 a 12 das a una temperatura
de 30C. Se realizaron coloraciones con azul de lactofenol para su
observacin microscpica.
Se realiz la curva de crecimiento radial de los hongos, tomando 5 mm de
inoculo, colocndolo en el centro de la caja de petri; midiendo diariamente el
dimetro.

9.6. Bioautografa
Se realiz la siembra masiva en cada una de las cajas de petri con 20 ml del
respectivo medio para cada microorganismo segn la concentracin del tubo
No. 0.5 del patrn de Mc Farland. Luego se corrieron los extractos y
fracciones en Cr omatografa de Capa Delgada por duplicado para cada
extracto positivo para bacterias y se secaron a temperatura ambiente.
Los extractos etreos se disolvieron y se corrieron en diclorometano. Los
extractos etanlicos se disolvieron en etanol y unas gotas de diclorometano,
para bajar un poco la polaridad, corrindose en una mezcla de
diclorometano- acetato de etilo (1:1). Una de las CCD se revelo con vainillina
y la otra se utiliz para la bioautografia. Estas cromatoplacas se pusieron en
contacto directo con la siembra realizada en las cajas de petri durante 16
horas a 4C y se retiraron cumplido el tiempo e incubndose a 35C por 18
horas. Se observaron los halos de inhibicin para establecer la posible

70
actividad antimicrobiana. Esta tcnica se hizo de acuerdo a la variacin
guiada por el Dr. Jorge Robles.

9.7. Perforacin en gel
Fueron seleccionadas de 4 a 5 colonias de cada una de las cepas
bacterianas de cultivo de 24 horas estas se sembraron en caldo nutritivo para
ajustar su concentracin con el Tubo No. 0.5 de Mc Farland (1.5 x 10
6
UFC).
Se realizaron 5 perforaciones de 5mm de dimetro en cajas de petri que
contenan 20ml de medio Mueller Hinton. Posteriormente en cada
perforacin se colocaron 10l de medio Mueller Hinton para evitar la
dispersin del extracto. Luego se realiz la siembra masiva del tubo
seleccionado en las cajas correspondientes de petri e incubando a 35C por
18 horas.
Finalmente se analiz la actividad antimicrobiana en cada caja de las tres
fracciones diferentes con sus respectivos controles positivo y negativo;
comparando los halos de inhibicin de las fracciones con los controles de
cada una de las cajas. El nmero de rplicas realizadas fue de 10 de
acuerdo a la estadstica de prueba del tamao de la muestra. Ver anexo
No.2

9.8. Mtodo de crecimiento radial
A partir de la solucin stock (1g/mL), se incorpor cada uno de los extractos
en el medio PDA, as: Extracto Etanlico se aplicaron volumenes de 1mL y
2mL obtenindose una concentracin de 16,6mg/mL y 3.33mg/mL; para
fracciones se aplic 30, 40 y 50L, para obtener una concentracin final
2mg/mL, 2.66mg/mL y 3.33mg/mL respectivamente. Se utiliz como control
positivo griseofulvina 50mg/1mL (Grisovin)y como control negativo DMSO.
Sirvindose las cajas de petri con 15mL de agar PDA (agar papa dextrosa)
comercial marca Difco, ms el extracto; donde se coloca un inculo de 2 -

71
5mm de dimetro de cada hongo. Luego se incub a 30C durante seis das
realizando la medicin del dimetro de la colonia cada da.
La medicin de la colonia en cada caja de petri se realiz en dos direcciones
tomndose un promedio de estos valores permitiendo calcular el porcentaje
de inhibicin y de crecimiento.
% Inhibicin : 100 - % de crecimiento

% crecimiento : dimetro radial de la muestra x 100
dimetro radial del control negativo

9.9. Concentracin mnima inhibitoria
De acuerdo a la actividad biolgica de los extractos frente a cada
microorganismo, a partir de la solucin stock preparada se tom un volumen
de 750L, 800L, 850L, 900L, 950L para obtener las diferentes
concentraciones del extracto etanlico ( 150,160,170, 180 y 190mg/ml) y
100L, 150L, 200L para obtener las diferentes concentraciones de las
fracciones(20, 30 y 40mg/mL) respectivamente. Estas concentraciones se
evaluaron mediante la tcnica de dilucin en tubo. Se incub y se observ.
Luego de 24 horas de incubacin a 35C se tomo 1ml de cada tubo de la
prueba el cual se sembr en profundidad y se le agreg Agar BHI (Merck) a
una temperatura de 45C ; se llev a incubar a 35C y se observ cuales
cajas presentaron crecimiento bacteriano.

La CMI fngica se realiz para la fraccin acetato de etilo de la corteza de B.
simaruba frente a M. canis, utilizando concentraciones de 1mg/mL,
1,5mg/mL y 1.7mg/mL.

72

FIGURA No. 6. Mtodo de obtencin de los extractos y fracciones
Recoleccin e Identificacin de las plantas
Separacin hojas y corteza
Obtencin de los extractos
ter de Petrleo Diclorometano Acetato de Etilo
Fraccin de Hojas Fraccin de corteza
Crecimiento Radial Perforacin en Gel
CMI
Tcnica de Reflujo
Extracto Etanlico
Fraccionamiento Lquido/ Lquido

73
10. RESULTADOS

10.1. Material vegetal
El material vegetal secado y molido, dio los siguientes cantidades en peso en
gramos.

TABLA 1. Peso en gramos del material
PLANTA PARTE PESO EN GRAMOS
B. graveolens Hojas 330
Corteza 445
B. simaruba Hojas 220
Corteza 300

TABLA 2. Peso de los extractos y fracciones obtenidos en gramos
PLANTA PARTE EXTRACTO/FRACCIN PESO (g)
B. graveolens Hojas Etanol 18,45
ter de Petrleo 8,32
Diclorometano 3,65
Acetato de Etilo 3,2
Corteza Etanol 27,5
ter de Petrleo 20,2
Diclorometano 6,63
B. simaruba Hojas Etanol 14,6
ter de Petrleo 9,6
Diclorometano 6,54
Corteza Etanol 17,8
ter de Petrleo 11,5
Diclorometano 8,87

74
10.2. Revisin de cepas

10.2.1. Escherichia coli
Este microorganismo present las siguientes caractersticas:
microscpicamente observamos Bacilos rectos Gram negativos y
macroscpicamente colonias planas, poco convexas hmedas con superficie
brillante, bordes enteros.
Segn las pruebas bioqumicas reaccion: Oxidasa negativa, Citrato
negativo, Indol positivo, Rojo de Metilo positivo, Voges Proskauer negativo,
TSI negativo, Urea negativo, LIA positivo, Motilidad positivo, Gelatina
negativo y Nitratos negativo.

10.2.2. Bacillus subtilis
Al observar este microorganismo al microscopio se ven bacilos largos Gram
positivos. Macroscpicamente se observan colonias grandes extendidas,
blanco grisceas, con bordes irregulares. Catalasa positivo, Glucosa
positivo, manitol positivo y sacarosa positivo.

10.2.3. Staphylococcus aureus
Las colonias de S. aureus presentaron un color amarillo, redondas,
cremosas y brillantes con borde regular. Al observarlas al microscopio se
aprecian cocos Gram positivos agrupados en racimos. Al realizar la prueba
de la coagulasa su reaccin fue positiva y al crecer sobre agar sangre
present hemlisis.

10.2.4. Fusarium oxysporum
F. oxysporum present macroconidias multicelulares grandes, puntiagudas
en forma de bote o banana, las hifas son hialinas y septadas. Las colonias
tuvieron un crecimiento rpido, inicialmente blancas, cubiertas por un micelio

75
areo algodonoso, bien desarrollado. Al madurar produjeron un pigmento
color lavanda a rojo prpura en la superficie del micelio y en el reverso del
agar.

10.2.5. Trichophyton mentagrophytes
Las colonias se desarrollaron rpidamente, en forma granular algodonosa.
Blanco pardoso con reverso de pardo a rojo.
Microscpicamente presenta microconidias esfricas dispuestas en racimos;
las macroconidias son claviformes sostenidas por una corta hifa tabicada.

10.2.6. Microsporum canis
Presenta macroconidias numerosas en forma navicular con puntas finas
multiseptadas, de pared gruesa. Tambin se pudieron ver microconidias a
maneras de pequeos ndulos alargados, prendidos a lo largo de la hifa. Al
ser observadas macroscpicamente present una colonia algodonosa de
color caf en el centro y con reverso amarillo anaranjado.

10.3. Evaluacin de la actividad biolgica
En la evaluacin antimicrobiana por medio de la bioautografia no se observ
ningn halo de inhibicin por parte de los extractos y fracciones aplicadas en
cada placa cromatogrfica.
Al realizar el enfrentamiento de las cepas de E. coli, S. aureus y B. subtilis
detectamos que tanto el extracto total como las fracciones no presentaron
actividad contra E. coli, por lo tanto, este microorganismo no fue tenido en
cuenta para realizar los anlisis estadsticos.
A continuacin se presentan las tablas de la actividad de los extractos Y
fracciones(concentraciones) frente a las bacterias :

76
El criterio para que la medida del halo sea 5mm se debe a que se tom como
patrn para la estadstica, el control negativo donde no hubo halo de
inhibicin; ademas este es el tamao de la perforacin realizada con el
sacabocados.

A = Actividad (Halo mayor de 5mm)
R = Resistente (Halo igual a 5mm)

TABLA No. 3 Actividad de B. simaruba contra B. subtilis
B. simaruba Extracto Etanol
-Concentracin (mg/mL)
Hojas Corteza
200 A A
225 A A
250 A A

B. simaruba Fraccin ter de petrleo-
Concentracin (mg/mL)
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

B. simaruba Fraccin Diclorometano-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

77
B. simaruba Fraccin Acetato de Etilo-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

TABLA No. 7 Actividad de B. graveolens contra B. subtilis
B. graveolens Extracto de Etanol
-Concentracin (mg/mL)
Hojas Corteza
200 A A
225 A A
250 A A

B. graveolens Fraccin ter de petrleo-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

B. graveolens Fraccin Diclorometano-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

78

TABLA No. 10 Actividad de B.graveolens contra B. subtilis
B. graveolens Fraccin Acetato de Etilo-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

TABLA No. 11 Actividad de B. simaruba contra S. aureus
B. simaruba Extracto Etanlico-
Hojas Corteza
200 A A
225 A A
250 A A

B. simaruba Fraccin ter de petrleo-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

TABLA No.13 Actividad de B. simaruba contra S. aureus
B. simaruba Fraccin Diclorometano-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

79

B. simaruba Fraccin Acetato de Etilo-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

TABLA No. 15 Actividad de B. graveolens contra S. aureus
B. graveolens Extracto Etanlico-
Hojas Corteza
200 A A
225 A A
250 A A

B. graveolens Fraccin ter de petrleo-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

B. graveolens Fraccin Diclorometano-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

80
TABLA No. 18 Actividad de B.graveolens contra S. aureus
B. graveolens Fraccin Acetato de Etilo-
Hojas Corteza
50 A A
75 A A
100 A A
125 A A
150 A A

10.4. Concentracin Mnima Inhibitoria de bacterias

TABLA No. 19 Concentracin mnima inhibitoria del extracto etanlico
B. graveolens B. simaruba
Bacteria
Hojas Corteza Hojas Corteza
S. aureus 160mg/mL 190mg/mL 170mg/mL 180mg/mL
B. subtilis 170mg/mL 180mg/mL 180mg/mL 160mg/mL

La CMI de las fracciones en ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo
frente a B. subtilis y S. aureus de las partes areas ( hojas y corteza ) de
las especies de B. graveolens y B. simaruba fueron de 50mg/mL.

10.5. Concentracin Mnima Inhibitoria de hongos
La CMI para la fraccin de acetato de etilo de la corteza de B. simaruba
contra M. canis fu de 1.7mg/mL con un porcentaje de inhibicin de 67.86%.

En los ensayos antifngicos de los extractos y fracciones de B. graveolens y
B. simaruba frente a los hongos T. mentagrophytes, M. canis y F.
oxysporum, se obtuvieron los resultados que acontinuacin se muestran en
las tablas, donde se especifica la concentracin utilizada, el porcentaje de
crecimiento %C y el porcentaje de inhibicin %I.

81
TABLA No. 20 Actividad del extracto etanlico de B. graveolens y B.
simaruba frente a T. mentagrophytes
Trichophyton mentagrophytes
PLANTA PARTE EXTRACTO
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
B. graveolens Hojas Etanol 16,66 5 27,5 39,33 45,29 54,71
33,33 5 7 11 12,57 87,43
Corteza Etanol 16,66 5 14,5 21,25 24,28 75,72
33,33 5 9,25 9,25 10,57 89,43
B. simaruba Hojas Etanol 16,66 5 28,16 36,66 41,89 58,11
33,33 5 10 11,25 12,85 87,15
Corteza Etanol 16,66 5 29,5 35 40 60
33,33 5 16,6 20 22,85 77,15
Control negativo 87.5mm de crecimiento

simaruba frente a M. canis
Microsporum canis
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
33,33 5 7 14 15,79 84,21
Corteza Etanol 16,66 5 28,5 34 38,35 61,65
33,33 5 16 26,75 30,17 69,83
B. simaruba Hojas Etanol 16,66 5 25 38 42,86 57,14
33,33 5 12 18,66 21,04 78,96
Corteza Etanol 16,66 5 26,45 28,6 32,26 67,74
33,33 5 11 21,5 24,25 75,75
Control negativo 88,65mm de crecimiento.

82
simaruba frente a F. oxysporum
Fusarium oxysporum
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA
mm
DIA 6
mm % C % I
33,33 5 11,5 15 19,35 80,65
Corteza Etanol 16,66 5 28 38,5 49,67 50,33
33,33 5 9,5 9,59 12,37 87,63
33,33 5 22,5 23,75 30,64 69,36
Corteza Etanol 16,66 5 15,25 47,5 61,29 38,71
33,33 5 31 33 42,58 57,42
Control negativo 77,5mm de crecimiento

83
TABLA No. 23 Actividad de B. simaruba frente a T. mentagrophytes

PLANTA PARTE FRACCIN
CONC
mg/mL
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
Hojas ter de petrleo 2 23,55 38,75 90 102,85 -2,85
2.6 15,5 33,33 90 102,85 -2,85
3.33 10,33 32 90 102,85 -2,85
Diclorometano 2 10 29,37 90 102,85 -2,85
2.6 9,13 35 90 102,85 -2,85
3.33 9 30,5 74 84,57 15,43
Acetato de etilo 2 15,5 22,5 50,25 57,42 42,58
2.6 13,75 20,75 48,75 55,71 44,29
3.33 12 18,45 41,25 47,14 55,86
Corteza ter de petrleo 2 10,6 30,75 90 102,85 -2,85
2.6 10,6 29 78,3 89,48 10,52
3.33 8,86 21,33 82,5 94,28 5,72
Diclorometano 2 12 28,25 81,3 92,91 7,09
2.6 10,3 26,5 70 80 20
3.33 10,1 27,62 65,33 74,66 25,34
Acetato de etilo 2 7,6 26 48,25 55,14 44,86
2.6 7,33 17,83 45 51,42 48,58
B. simaruba
3.33 73 15,83 33 37,71 62,29
CONTROL POSITIVO (Griseofulvina)
16,3 26 28,5 32.57 67.43
CONTROL NEGATIVO (DMSO)
21,5 62 87,5 0 100

84
TABLA No. 24 Actividad de B. graveolens frente a T. mentagrophytes

CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
Hojas ter de petrleo 2 29,58 64,33 77,5 88,57 11,43
2.6 21 62,3 74,3 84,91 15,09
3.33 17,32 60 72,25 82,57 17,43
Diclorometano 2 20,58 59 84,5 96,57 3,43
2.6 19,32 56 73,65 84,17 15,83
3.33 18 54,5 70 80 20
Acetato de etilo 2 25,66 60 77 88 12
2.6 19,66 57,5 73,25 83,71 16,29
3.33 16,66 56,25 70 80 20
Corteza ter de petrleo 2 19,32 57,5 81,25 92,88 7,12
2.6 18,62 57 76,75 87,71 12,29
3.33 18,66 52,85 74 84,57 15,43
Diclorometano 2 22 56 75 85,71 14,29
2.6 18,52 53 72,25 82,57 17,43
3.33 16,65 53 69,5 79,42 20,58
Acetato de etilo 2 22,8 55,5 67,5 77,14 22,86
2.6 18,82 54 65,5 77,14 22,86
B. graveolens
3.33 18,05 52 74 84,57 15,43

CONTROL POSITIVO (Griseofulvina)
16,3 26 28,5 32.57

67.43
CONTROL NEGATIVO (DMSO)
21,5 62 87,5 0 100

85
TABLA No. 25 Actividad de B. simaruba frente a M. canis

Microsporum canis
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
Hojas ter de petrleo 2 29,22 48,33 55 56,4 43,6
2.6 25,74 41,48 53 59,78 40,22
3.33 27,75 35,7 50 56,4 43,6
Diclorometano 2 31,25 36,65 58,33 65,79 34,21
2.6 30,75 32,79 55,75 64,01 35,99
3.33 28,45 29,61 55 56,4 43,6
Acetato de etilo 2 30,5 41,3 53,2 60,01 39,99
2.6 26,41 34,98 45,32 51,12 48,88
3.33 15,8 20,78 40,21 45,35 54,65
Corteza ter de petrleo 2 34,5 45,65 60 67,68 32,32
2.6 29,15 42,56 48,25 54,42 45,58
3.33 25,33 34,23 46,66 52,63 47,37
Diclorometano 2 15,25 47 61,5 69,37 30,63
2.6 12,75 37,75 59,75 69,39 32,61
3.33 10,5 37 58,85 66,38 33,62
Acetato de etilo 2 19,5 23,5 32,5 36,66 63,34
2.6 16,75 20,13 28,33 31,95 68,04
B. simaruba
3.33 9,25 15,22 22,5 25,38 74,62
CONTROL POSITIVO (Griseofulvina) 15 15 22,5 25.38
74.64

CONTROL NEGATIVO (DMSO) 26,13 40 88,65 0 100

86
TABLA No. 26 Actividad de B. graveolens frente a M. canis

Microsporum canis
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
Hojas ter de petrleo 2 27 50,75 87,5 98,07 1,3
2.6 26 50,5 78,75 88,83 11,17
3.33 16,5 45 60,75 68,52 31,48
Diclorometano 2 36 54,25 63,75 71,91 28,09
2.6 24 46,75 65 73,32 26,68
3.33 11,5 43,75 55,25 62,32 37,68
Acetato de etilo 2 31 50,75 69,25 78.11 21.88
2.6 20 44,16 64,75 73,04 26,96
3.33 17,5 40,3 58,75 66,27 33,73
2.6 21,75 50 71 80,09 19,91
3.33 20,63 48 66,65 75,18 24,82
Diclorometano 2 12,75 48,75 66,25 74,73 25,27
2.6 12 47,25 65 73,32 26,68
3.33 11,75 45 60,25 67,96 32,04
Acetato de etilo 2 22,25 49,75 80 90,24 9,76
2.6 13,5 47,25 76,65 86,46 13,54
B. graveolens
3.33 13,25 45 73,75 81.19 16.81

CONTROL POSITIVO (Griseofulvina) 15 15 22,5 25.38
74.64


87
TABLA No. 27 Actividad de B. simaruba frente a F. oxysporum

CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
Hojas ter de petrleo 2 45,25 48,75 82,5 106,45 0
2.6 35,75 45,75 82 105,8 0
3.33 26,5 40,99 72,5 93,54 6,46
Diclorometano 2 40 73,75 77,5 100 0
2.6 34,75 57 72,5 93,54 6,46
3.33 27 52,5 65 83,87 16,13
Acetato de etilo 2 25,63 45,2 67,9 87,61 12,39
2.6 23,1 40,1 65,23 84,16 15,84
3.33 20,85 35,65 60,33 77,84 22,16
2.6 29,25 45 66,25 85,48 14,52
3.33 12,5 44,25 41,25 53,22 46,78
Diclorometano 2 33,5 49,25 85 109,67 -9,67
2.6 30,75 48 68,75 88,7 11,3
3.33 22,32 42 61,25 79,03 20,97
Acetato de etilo 2 39,65 53,6 77,5 100 0
2.6 30,2 50,2 77,5 100 0
B. simaruba
3.33 28,85 46,75 71,44 92,19 7,81
CONTROL POSITIVO (Griseofulvina) 15 15 27,5 35.48 64.52

88
TABLA No. 28 Actividad de B. graveolens frente a F. oxysporum

CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
Hojas ter de petrleo 2 39,25 55 80 103,22 -3,22
2.6 28,25 50,5 78,75 101,61 -1,61
3.33 25 47,75 76,25 98,38 1,62
Diclorometano 2 33 62,5 86,25 111,29 -11,29
2.6 20 55,6 82,6 106,45 -6,45
3.33 16 52,75 72,5 93,54 6,46
Acetato de etilo 2 32 62,75 78,75 101,61 -1,61
2.6 26,25 54,5 77,5 100 0
3.33 24,22 57 76 98,06 1,94
Corteza ter de petrleo 2 37,85 56 86,25 111,29 -11,29
2.6 36,5 48,25 81,75 105,48 -5,48
3.33 31,51 45,33 78,75 101,61 -1,61
Diclorometano 2 41,25 61,25 90 116,12 -16,12
2.6 37,75 53,87 80 103,22 -3,22
3.33 28,75 55 75 96,77 3,23
Acetato de etilo 2 36,75 75 90 116,12 -16,12
2.6 35 73,25 78,75 101,61 -1,61
B. graveolens
3.33 45 70 72,5 93,54 6,46

CONTROL POSITIVO (Griseofulvina) 15 15 27,5 35.48 64.52

89


La familia Burseraceae muestra un gran inters desde el punto de vista
qumico y biolgico debido a la posible actividad antimicrobiana que
presentan algunos metabolitos propios de esta familia.

Entre las tcnicas de evaluacin antimicrobiana se encuentra la tcnica de
Kirby - Bauer la cual esta estandarizada para Tetraciclina con halos de
resistencia (menor o igual a 14mm) y sensibilidad (mayores o iguales a
14mm), segn informacin presentada en el trabajo de Arvalo y Enciso
(1996). Para tcnicas como la difusin o perforacin en gel no se encuentran
datos estandarizados como en la anterior. Es por ello que en este estudio se
tomaron como patrones estadsticos los niveles de significancia de la Prueba
t para demostrar la existencia de actividad, teniendo en cuenta el control
negativo (DMSO halo de 5mm), como referencia para desarrollar las
hiptesis nula (Ho) y alternativa (Ha): Ver Figura No. 7

Ho: el promedio de halo es igual a 5mm
Ha: el promedio de halo es mayor a 5mm
Ver Anexo 3.

La bacteria Gram negativa E. coli no present sensibilidad frente a los
extractos, quizs debido a la complejidad de su pared celular; ya que esta
contiene una membrana permeable a solutos de bajo peso molecular y los
extractos evaluados contienen en su mayora compuestos de alto peso
molecular, por eso es posible que no fueran captados por la clula
bacteriana, como se reporta en la literatura. La no- observacin de efecto
antimicrobiano de los extractos frente a E. coli, no los excluye de la

90
posibilidad de presentarlo frente a otros agentes bacterianos aqu no
incluidos.
El estudio estadstico realizado mediante la tcnica Anlisis de varianza de 2
factores con varias muestras por grupo nos permiti realizar una
comparacin entre los resultados de las concentraciones de corteza y hojas
de las dos especies B. simaruba y B. graveolens, frente a las bacterias;
obteniendo as, las diferencias o similitudes entre los tamaos de halo de las
concentraciones para corteza y hojas de las fracciones y extractos. Ver
anexo 4.

Se pudo determinar que no hay diferencia significativa entre el dimetro de
halo de las muestras de los extractos etanlicos y las fracciones de corteza y
hojas de las plantas B. graveolens y B . simaruba frente a S. aureus y B.
subtilis. Es decir, que las dos plantas presentaron actividad antimicrobiana
frente a los dos microorganismos. Ver figura 8.
Al encontrar diferencias significativas entre las diferentes concentraciones
tanto de hojas, como de corteza de cada planta, se emple la estadstica de
varianza de un solo factor, la cual muestra las diferencias entre las
concentraciones de corteza u hojas de un mismo extracto o fraccin.
Luego, de que la anterior prueba nos arroj la existencia de diferencias o no,
en los tamaos de halo; se realiz la prueba t para dos muestras suponiendo
varianzas desiguales, donde se correlacion cada concentracin y nos
permiti obtener las diferencias o similitudes de cada una. Ver anexo 4
Al comparar las concentraciones utilizadas 200mg/mL, 225mg/mL y
250mg/mL, para la evaluacin del extracto etanlico de hojas de B.
graveolens frente a S. aureus, se observ que no hay diferencia;
obtenindose un promedio de halo de 18.05mm. Mientras que en el extracto
etanlico de corteza se encontraron variaciones en el tamao del halo en
cada una de las concentraciones.

91

FIGURA No. 7. Izquierda: Control positivo (Gentamicina) y
Derecha: Control negativo (DMSO). (Las autoras)

FIGURA No. 8. Izquierda: Actividad de B. subtilis frente a B. simaruba,
hojas, extracto etanlico, a: 200mg/mL, b: 225mg/mL, c: 250mg/mL y d:
DMSO Derecha: Actividad de S. aureus frente a B. graveolens, extracto
etanlico corteza, a: 225mg/mL, b: 250mg/mL, c: 200mg/mL y d:
Gentamicina. (Las autoras)

92
En la evaluacin del extracto etanlico de hojas de B. graveolens frente a B.
subtilis se observ que al comparar las concentraciones de 200mg/mL y
225mg/mL el tamao de halo es similar, 12.55mm y 13.45mm
respectivamente. Notndose diferencia en la comparacin de los datos de
las concentraciones de 200mg/mL vs. 250mg/mL, y entre, 225mg/mL vs.
250mg/mL.. Presentndose el mismo resultado en el extracto etanlico de
corteza de B. graveolens frente a B. subtilis.

B. graveolens frente a B. subtilis en la fraccin etrea de hojas y corteza
presenta diferencias entre los tamaos de halo de cada una de las
concentraciones, obtenindose la mayor actividad en la concentracin de
150mg/mL. Con un promedio de halo de 11.91mm para hojas y 16.4mm
para corteza. Frente a S. aureus, solo mostr una diferencia entre las
concentraciones de 100mg/mL vs. 125mg/mL tanto para corteza como para
hojas.

En la fraccin de diclorometano de B. graveolens frente a S. aureus se
encuentra una amplia diferencia en los dimetros de halo de las
concentraciones de hojas de 50mg/mL y 150mg/mL. En los datos de
corteza se pudo determinar que no hay diferencia entre las comparaciones
de 50mg/mL vs. 75mg/mL, y en los de, 100mg/mL vs. 125mg/mL. Frente a
B. subtilis la comparacin entre las concentraciones de hojas de 50mg/mL
vs. 75mg/mL y entre 125mg/mL vs. 150mg/mL no present diferencia en los
tamaos de halo. Mientras que al evaluar corteza se present similitud entre
los halos de las concentraciones de 125mg/mL vs. 150mg/mL.

En la evaluacin de la fraccin de acetato de etilo de hojas de B. graveolens
frente a S. aureus, los tamaos de halo fueron directamente proporcionales
a la concentracin, con diferencias notorias entre cada una. A diferencia de

93
los halos de las concentraciones de corteza en donde los tamaos de halo
eran muy similares. B. subtilis present similitud entre las comparaciones
de halo de las concentraciones de hojas de 50mg/mL vs. 75mg/mL y entre
100mg/mL vs. 125mg/mL.. Y en la comparacin de concentraciones de
corteza se observ que el tamao de halo fue muy cercano en todas las
concentraciones, existiendo un aumento proporcional a la concentracin.

En cuanto al estudio estadstico, mediante las tcnicas ant eriormente
descritas, realizado a B. simaruba se tiene que: en la fraccin etrea de
hojas frente a B. subtilis no se observ diferencia en el tamao de halo al
correlacionar las concentraciones 75mg/mL vs. 100mg/mL. En cuanto a
corteza se puede decir que, entre las concentraciones de 100mg/mL,
125mg/mL y 150mg/mL los tamaos de halo no variaron entre si. Mientras
que S. aureus mostr diferencia entre las concentraciones de 75mg/mL vs.
100mg/mL y 100 mg/mL vs. 125mg/mL para hojas, evidencindose el mismo
resultado para corteza.

Para la fraccin de diclorometano, frente a S. aureus esta mostr similitud en
los tamaos de halo de las concentraciones de hojas de 50mg/mL vs.
75mg/mL. Mientras que en corteza se present una semejanza entre las
concentraciones de 100mg/mL vs. 125mg/mL. Por su parte B. subtilis difiri
en la comparacin de las concentraciones de hojas entre 75mg/mL a
125mg/mL. Y en corteza solo present semejanza la comparacin de tamao
de halo de las concentraciones 125mg/mL vs. 150mg/mL.

En la evaluacin de la fraccin acetato de etilo, B. subtilis mostr diferencias
significativas en el tamao de halo entre todas las concentraciones
correlacionadas menos en 75mg/mL vs. 100mg/mL, para hojas. A diferencia
de corteza la cual present una notoria semejanza entre todas las

94
concentraciones comparadas. En lo que respecta a S. aureus, se observ
una semejanza en la comparacin de las concentraciones entre 100mg/mL
vs. 125mg/mL y 100mg/mL vs. 150mg/mL, para hojas. Y en corteza se
obtuvo una diferencia entre los tamaos de halo de todas las
concentraciones.

Finalmente, la fraccin acetato de etilo de hojas y corteza de B. graveolens
present mayor actividad frente a S. aureus obtenindose un halo de
inhibicin promedio de 19,85mm y 23,01mm respectivamente en la
concentracin de 150mg/mL. Mientras que para B. simaruba se obtuvo una
mejor actividad en el extracto total, tanto de hojas como de corteza en las
concentraciones de 250mg/mL. A su vez B. subtilis present un halo de
inhibicin de 18,47mm en el extracto etanlico de hojas de la especie de B.
graveolens, en la concentracin de 250mg/mL. Presentando este
microorganismo un halo de inhibicin de 18,3mm frente a la fraccin de
acetato de etilo de corteza, a la mayor concentracin. Mientras en B.
simaruba la mayor inhibicin se present en el extracto etanlico, tanto de
hojas como de corteza, a una concentracin de 250mg/mL.

De los resultados de porcentaje de inhibicin obtenidos para cada hongo se
toman como activos todos aquellos mayores o iguales a 30% debido a que
en la literatura se reportan como activos los mayores al 20% y con el fin de
disminuir el porcentaje de error se da un rango ms amplio. Ver tablas No.
20-28.

De acuerdo con los resultados obtenidos en la evaluacin antifngica de los
extractos y fracciones; y al realizar estudios microscpicos comparativos
entre los controles, Ver figura No. 10 y extractos se presume que el

95
mecanismo por el cual las sustancias evaluadas inhiben el crecimiento radial
del hongo es por alteracin de la germinacin de las esporas. (Ayala 1998)

La evaluacin antifngica de los extractos etanlicos en las concentraciones
de 16.6mg/mL y 33.3mg/mL, de las partes areas de B. graveolens y B.
simaruba fueron activos frente a los tres hongos estudiados. Ver figuras No.
11 y 12. Debido a que el extracto etanlico es una extraccin completa
donde se encuentran todos los compuestos que estas especies poseen tanto
en sus hojas como en su corteza; se cree por esta razn el crecimiento se ve
disminuido.

Con respecto a las fracciones de B. graveolens contra T. mentagrophytes
no presentaron inhibicin, Ver Tabla No. 24. Mientras, que las fracciones de
acetato de etilo de B. simaruba tanto de hojas como de corteza dieron
actividad inhibitoria superando el 30%. Ver tabla No. 23

M. canis present inhibicin a las fracciones de B. simaruba, tanto para
hojas como para corteza, Ver Tabla No.25. En cuanto a las fracciones de
hojas de B. graveolens en ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo
este microorganismo fue inhibido a una concentracin de 3.33mg/mL
obtenindose un porcentaje de inhibicin de 31.48%, 37.68% y 33.73%
respectivamente; en la corteza la fraccin de diclorometano a la misma
concentracin present el 32.04% de inhibicin. Ver Tabla No. 26 y Figura
No. 12

Como muestra la tabla No. 27 y 28 F. oxysporum fue el microorganismo
que present mayor resistencia frente a las fracciones de B. graveolens y B.
simaruba, Ver figura No. 13, resaltando que slo se observ inhibicin

96
frent e a la fraccin de ter de petrleo de corteza a una concentracin de
3.33mg/mL, con un porcentaje de inhibicin de 46.78%.

La CMI para hongos se trabaj nicamente en la fraccin acetato de etilo de
la corteza de B. simaruba contra M. canis; ya que esta present el mayor
porcentaje de inhibicin de los extractos y fracciones estudiadas.

Debido a los resultados obtenidos por parte de M. canis frente a B.
simaruba, se puede estimar como una alternativa futura en el tratamiento de
las enfermedades causadas por este dermatofito; adems, es de resaltar, la
pequea concentracin que se requiere para su actividad.

97

FIGURA No. 9. Izquierda: Control positivo con Griseofulvina y
Derecha: Control negativo con DMSO, para hongos. (Las autoras)

FIGURA No. 10. Izquierda: T. mentagrophytes frente a B. graveolens,
Hojas, extracto etanlico 33.3mg/mL y Derecha: T. mentagrophytes frente
a B. graveolens, Corteza, extracto etanlico 33.3mg/mL.
(Las autoras)

98

FIGURA No. 11 Izquierda: M. canis frente a B. simaruba, hojas, extracto
etanlico 33.3mg/mL. Derecha: M. canis frente a B. simaruba, corteza,
extracto etanlico 33.3mg/mL
(Las autoras)

FIGURA No. 12. Izquierda: M. canis frente a B. graveolens, hojas; fraccin
ter de petrleo 3.3mg/mL. Derecha: M. canis frente a B. simaruba,
corteza; fraccin Diclorometano 2.6mg/mL
(Las autoras)

99

FIGURA No. 13 Fusarium oxysporum frente a B. graveolens, corteza.
Fraccin acetato de etilo 2.6mg/mL. (Las autoras)

100
12. CONCLUSIONES

Los extractos etanlicos y las fracciones de las partes reas de B simaruba
y B. graveolens presentaron actividad frente a S. aureus y B. subtilis, T.
mentagrophytes, M. canis y F. oxysporum

No se present ninguna actividad frente a la bacteria Escherichia coli por
parte de los extractos y fracciones de las partes areas de B. simaruba y B.
graveolens.

La fraccin mas activa de la especie B. graveolens fue acetato de etilo para
B. subtilis y S. aureus. Y en B. simaruba la mayor actividad se present en
el extracto etanlico, frente a B. subtilis y S. aureus.

Se puede estimar que de acuerdo a los resultados obtenidos, la actividad
antibacteriana presente en las fracciones y extractos de las especies
vegetales estudiadas es directamente proporcional a la concentracin
aplicada; a mayor concentracin mayor actividad.

La CMI para B. subtilis y S. aureus es diferente dependiendo del tipo de
extracto y la especie vegetal que se trabaje. Para las fracciones de las dos
plantas la CMI ptima es de 50mg/mL.

En la evaluacin antifngica de los extractos etanlicos se observ que el
ms activo fue el extracto etanlico de corteza de B. graveolens en una
concentracin de 33.33mg/mL frente a T. mentagrophytes con un
porcentaje de inhibicin del 89.43%.

101
F. oxysporum fue el hongo que present menor porcentaje de inhibicin
frente a las fracciones de las partes de areas de las plantas.

La especie B. simaruba en sus partes areas present actividad antifngica
frente a M. canis, ya que todas las fracciones presentaron un porcentaje de
inhibicin mayor al 30%. Resaltando la fraccin acetato de etilo de la corteza
de esta planta a un concentracin de 3.33mg/mL.

102
13. RECOMENDACIONES

Para prximos estudios se recomienda utilizar concentraciones mas altas
para las fracciones ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo, para
as observar un mayor porcentaje de inhibicin, frente a las bacterias en
estudio.

Para estudios posteriores sera conveniente realizar la identificacin de las
sustancias responsables de la actividad frente a los diferentes
microorganismos.

103
14. BIBLIOGRAFA

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DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE
LOS EXTRACTOS OBTENIDOS A PARTIR DE HOJAS Y CORTEZA
DE Protium calanense (Burseraceae) FRENTE A MICROORGANISMOS
PATGENOS TRANSMITIDOS POR DIFERENTES VAS

DIANA YAMYLE RONCANCIO BENAVIDES

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT, AGOSTO DE 2001
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE
LOS EXTRACTOS OBTENIDOS A PARTIR DE HOJAS Y CORTEZA
DE Protium calanense (Burseraceae) FRENTE A MICROORGANISMOS
PATGENOS TRANSMITIDOS POR DIFERENTES VAS

DIANA YAMYLE RONCANCIO BENAVIDES

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar el ttulo de
MICROBIOLOGO INDUSTRIAL

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
BOGOT, AGOSTO DE 2001

__________________________________________
Dr. JORGE E. ROBLES CAMARGO Ph.D.
Director
Facultad de Ciencias Pontificia Universidad Javeriana

__________________________________________
Dr. MARTN ALONSO BAYONA R.
Jurado

__________________________________________
Dr. JULIO ARMANDO PEDROZO P.
Jurado

__________________________________________
Dr. CARLOS CORREDOR P. Ph. D.
Decano Acadmico

__________________________________________
Dra. AURA ROSA MANASCERO G. M. Sc.
Directora de Carrera

LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA NO SE HACE
RESPONSABLE DE LOS CONCEPTOS EMITIDOS POR SUS
ESTUDIANTES EN SUS TESIS.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a todas las personas, instituciones y fuentes de informacin que
permitieron la realizacin de este estudio:
A mi director de tesis J orge Robles Camargo Ph.D., por su respaldo e inters
en todo el curso de la investigacin.
A Nivea Cristina Garzn por su valiosa colaboracin con su Trabajo de
Grado, presentado a la Universidad Nacional de Colombia.
Al profesor Edgar Linares y al Herbario Nacional de Colombia por la
determinacin de Protium aff. calanense, especie arbrea, base de nuestro
estudio.
Al Ing. Forestal J airo Pedraza lvarez por su incondicional apoyo en cuanto
a las salidas de campo y toma de muestras arbreas.
A Rubn Torrenegra por su alegra constante y experiencia en los
procedimientos a seguir durante la investigacin.
A la Pontificia Universidad J averiana por el prstamo del material utilizado,
equipos y laboratorios.
A mis padres, y a mis hermanas por su apoyo incondicional, comprensin y
cario para lograr otra meta en mi vida.
TABLA DE CONTENIDO

Pgina
INDICE DE ANEXOS
INDICE DE FIGURAS
INDICE DE MAPAS
INDICE DE TABLAS
1. INTRODUCCIN.1
2. OBJ ETIVOS.5
2.1 Objetivo General..5
2.2 Objetivos Especficos...5
3. J USTIFICACIN...6
4. MARCO TERICO7
4.1 Familia Burseraceae.7
4.1.1 Antecedentes de las Burserceaes.7
4.1.2 Caractersticas de la Familia Burseracea.11
4.1.3 Clasificacin Taxonmica actual de la Familia
Burseracea..13
4.1.4 Ubicacin de Protium aff. calanenseCuat. (Burseraceae).13
4.1.4.1 La Familia Burseracea en el mundo.16
Pgina

4.1.4.2 La Familia Burseracea en Amrica17
4.1.5 Usos e importancia de las Burserceas en general19
4.1.5.1 Usos e importancia de Protium calanense................21
4.2 Microorganismos patgenos transmitidos por diferentes
vas....24
4.2.1 Gastroenteritis por Escherichia coli24
4.2.2 Aspergilosis por Aspergillus niger.26
4.2.3 Candidiasis por Candida albicans.29
4.3 Tcnicas utilizadas en el diseo experimental.31
4.3.1 Cromatografa en capa delgada (CCD)..31
4.3.2 Mtodo de Bioautografa.34
4.3.3 Mtodo de Crecimiento radial35
5. MATERIALES Y MTODOS37
5.1 Recoleccin y preparacin del material vegetal...38
5.2 Obtencin de los extractos vegetales.39
5.3 Obtencin de las fracciones40
5.4 Evaluacin de la actividad antimicrobiana...42

Pgina

6. RESULTADOS..45
6.1 Extracto del material vegetal..45
6.2 Microorganismos de ensayo46
6.2.1 Escherichia coli46
6.2.2 Aspergillus niger47
6.2.3 Candida albicans48
6.3 Cromatografa en capa delgada (CCD) .49
6.4 Evaluacin antimicrobiana..50
7. DISCUSIN DE RESULTADOS.58
8. CONCLUSIONES..62
9. RECOMENDACIONES64
10. BIBLIOGRAFA.65

INDICE DE ANEXOS

Pgina
ANEXO 1
Microorganismos patgenos transmitidos por diferentes vas.73

ANEXO 2
Recoleccin y preparacin del material vegetal..74

ANEXO 3
Identificacin Taxonmica de Protium aff. calenense75

ANEXO 4
Actividad Antimicrobiana de los Extractos Etanlicos de Corteza de Protium
calanensefrente a Escherichia coli y Candida albicans.................76

INDICE DE FIGURAS

Pgina
FIGURA 1
Caractersticas microscpicas de Escherichia coli.24
FIGURA 2
Caractersticas microscpicas de Aspergillus niger26
FIGURA 3
Caractersticas microscpicas de Candida albicans29
FIGURA 4
Identificacin Taxonmica de Protium calanense38
FIGURA 5
Caractersticas macroscpicas de Escherichia coli46
FIGURA 6
Caractersticas macroscpicas de Aspergillus niger47
FIGURA 7
Caractersticas macroscpicas de Candida albicans48
Contina

Pgina
FIGURA 8
Control Positivo (Metronidazol), Control Negativo (0.3 mL DMSO) y
Control de Crecimiento (PDA) de Aspergillus niger44
FIGURA 9
Actividad Antifngica de los Extractos Totales Etanlicos frente a A. niger.52
FIGURA 10
Actividad Antifngica de las Fracciones de ter de Petrleo frente a
A. niger..54
FIGURA 11
Actividad Antifngica de las Fracciones de Diclorometano frente a
A. niger..55
FIGURA 12
Actividad Antifngica de las Fracciones de Acetato de Etilo frente a
A. niger..57

INDICE DE MAPAS

Pgina
MAPA 1
Distribucin geogrfica mundial de la Familia Burseracea..17

MAPA 2
Distribucin geogrfica de la Familia Burseracea en Amrica.18

INDICE DE TABLAS

Pgina
TABLA 1
Principales modificaciones a las tribus de Engler y clasificacin actual
de la Familia Burseracea...10
TABLA 2
Solventes y proporciones utilizadas en la Cromatografa de Capa
Delgada (CCD)..35
TABLA 3
Algunas propiedades fisicoqumicas de los solventes utilizados41
TABLA 4
Peso del Material Vegetal..45
TABLA 5
Actividad Antimicrobi ana de los extractos y sus fracciones frente a
Escherichia coli y Candida albicans50

Contina
Pgina
TABLA 6
Actividad Antifngica de los Extractos Totales Etanlicos frente a
Aspergillus niger52
TABLA 7
Actividad Antifngica de las Fracciones de Eter de Petrleo frente a
Aspergillus niger53
TABLA 8
Actividad Antifngica de las Fracciones de Diclorometano frente a
Aspergillus niger55
TABLA 9
Actividad Antifngica de las Fracciones de Acetato de Etilo frente a
Aspergillus niger56

1. INTRODUCCIN

El presente estudio hizo un aporte al conocimiento de Protium aff. calanense
(Burseraceae), con el propsito de evaluar la actividad antimicrobiana de sus
extractos y fracciones, frente a diversos microorganismos patgenos
transmitidos por diferentes vas.

El desarrollo del documento se encuentra dividido en cuatro partes, a saber: la
primera parte presenta una visin general de la Familia Burseracea y en
principal instancia de la especie Protium calanense.
La segunda parte, se refiere a algunos microorganismos patgenos
transmitidos por diferentes vas, seleccionados para el estudio.
La tercera parte de este estudio, comprende la metodologa utilizada para
lograr los objetivos y posteriormente se encuentran los resultados del trabajo
realizado en el Laboratorio de Fitoqumica de la Pontificia Universidad
J averiana.
Finalmente, la cuarta parte es la discusin de los anteriores resultados,
derivndose de sta una propuesta sobre la especie arbrea Protium calanense
en Colombia y su aprovechamiento, contribuyendo al esfuerzo por conocer y
valorar nuestros recursos naturales.
Nuestro pas, Colombia, posee grandes riquezas, entre ellas, se encuentra la
biodiversidad vegetal (Aguilar, 1992), la cual ha estado presente desde la
colonizacin y el desarrollo de las comunidades indgenas hasta nuestros das.
A pesar de los beneficios medicinales que aportan stas plantas, han
permanecido de alguna manera olvidadas, siendo el componente principal de
los ecosistemas de nuestros bosques nacionales. Por sta razn, es importante
investigar nuevas posibilidades de uso, manejo y aprovechamiento de los
rboles, ya que surgen como alternativas adecuadas y sostenibles para ser
incluidos en las reas de produccin, contribuyendo en el aspecto social,
econmico y por ende, ambiental del pas. (lvarez, 1999).

En la actualidad se intensifica el inters por la medicina natural, es decir,
comprobar que muchas de las medicinas de los indgenas son eficaces en el
tratamiento de enfermedades humanas, por ello, la correcta utilizacin de
stos rboles mejora la calidad de vida de la poblacin. A partir del Proyecto
de Investigacin: Aislamiento de principios activos antimicrobianos
presentes en especies de la Familia Burseraceae endmicas en la Amazona
Colombiana, basado en la evaluacin antimicrobiana de sustancias
obtenidas a partir de plantas superiores, en este caso de Protium calanense,
frente a diversos microorganismos patgenos transmitidos por diferentes vas,
con el fin de adquirir antibiticos naturales que acten eficazmente contra los
microorganismos resistentes a los efectos bacteriostticos y/ o bactericidas de
los frmacos. Es as, como se evalu la actividad antimicrobiana de los
extractos obtenidos a partir de hojas y corteza de Protium calanense.

No es posible dudar que las propiedades curativas de la inmensa mayora de
productos del Reino Vegetal, ofrecido por la Madre Naturaleza, son algo
sumamente til y beneficioso en todas las enfermedades. Es indudable , as
mismo, que la ciencia mdica llamada ortodoxa, y especialmente la
farmacopea moderna, han dado un gran paso adelante, de manera particular
desde el descubrimiento de la penicilina por el doctor Alexander Fleming, y la
consiguiente serie de antibiticos en el campo de la prevencin, curacin o
alivio de toda clase de enfermedades, sobre todo de carcter microbiano.
(Chessi, 1997).
Sin embargo, la creencia popular en el poder curativo de las hierbas y las
plantas se encuentra afortunadamente, arraigada en la humanidad en general.
Resulta innegable que los vegetales que crecen en terrenos tanto bajos como
en regiones montaosas, en forma de hierbas, plantas, arbustos y rboles
(Protium calanense), poseen unas propiedades medicinales, que tienen gran
importancia dentro de los tratamientos teraputicos actuales, no solamente en
los aspectos naturistas sino tambin en los de la farmacopea oficial.
Los vegetales, hierbas, plantas, arbustos o rboles, pueden usarse bien vivos o
bien muertos, puesto que en el primer caso, una planta viva purifica y
perfuma el ambiente circundante, lo cual ayuda a mejorar la calidad del aire,
y por consiguiente, a tonificar las inflamaciones de las vas y mucosas
respiratorias. Por otra parte, las propiedades de los vegetales muertos, es
decir, arrancados de la tierra, o cortados los tubrculos, races, hojas del resto
del conjunto del vegetal, son las realmente curativas, las que ms profunda y
eficazmente participan en el bienestar del humano y a la curacin de su
dolencia, ya sea externa, como un eczema o una herida, interna, como un
catarro o una indigestin.

Por lo tanto, la planta arrancada del suelo, o alguna de sus partes cortadas,
como lo es el caso de la presente investigacin, puede usarse en forma de
zumo, polvo, infusin, coccin, con alcohol muy diluido (Extracto total
etanlico y sus fracciones) o de menor polaridad, as mismo, es necesario
conocer qu parte del vegetal hay que emplear para la curacin o el alivio de
cierta enfermedad, aqu se evidencia si los extractos de las hojas o de la
corteza de nuestro rbol presenta actividad antimicrobiana.

2. OBJ ETIVOS

2.1 Objetivo general

Evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos a partir de
hojas y corteza de Protium calanense frente a microorganismos patgenos
transmitidos por diferentes vas.

2.2 Objetivos Especficos

Obtener los extractos y sus fracciones a partir de hojas y corteza de
Protium calanense.
Determinar mediante el mtodo de crecimiento radial la actividad
antimicrobiana de los extractos y sus fracciones de Protium calanense
frente a Aspergillus niger.
Determinar mediante el mtodo de bioautografa la actividad
antimicrobiana de los extractos y sus fracciones de Protium calanense
frente a Candida albicans y Escherichia coli.

3. JUSTIFICACIN

Actualmente en nuestro pas se elaboran antibiticos con efecto bactericida,
con muchas dificultades en el campo de la produccin, ya sea por altos costos
o por baja rentabilidad. Para ello, este proyecto de grado se basa en explotar
el potencial econmico de nuestra flora, ya que es un recurso natural que
contribuye al desarrollo integral del pas. Es as, con la utilizacin de los
extractos de hojas y corteza de Protium calanense, se pretende demostrar la
capacidad inhibitoria que ejercen stas sustancias obtenidas de sta planta
superior contra Escherichia coli, Candida albicans y Aspergillus niger,
microorganismos patgenos transmitidos por diferentes vas.

El proyecto se enfoc principalmente en la evaluacin antimicrobiana que
poseen o no los extractos vegetales, ya que como Microbilogo Industrial, se
forma parte del desarrollo cientfico de la sociedad, estudiar
microbiolgicamente las propiedades teraputicas de sta planta colombiana,
resulta imprescindible descubrir nuevas sustancias con actividad antibitica
frente a microorganismos resistentes y con alta capacidad infectiva,
aumentando la calidad de vida del hombre.

4. MARCO TERICO

4.1 FAMILIA BURSERACEAE

4.1.1 Antecedentes de las Burserceaes

La Etnobotnica es la ciencia que se encarga de estudiar la relacin de las
plantas y el hombre, en cuanto a los usos dados por el hombre a las plantas en
toda su gama de espectros. (Dimat, 2000).

Durante siglos e incluso milenios, el hombre se sirvi de los vegetales de su
entorno, para alimentarse e incluso curarse. En los primeros estados vitales
de desarrollo de la conducta humana, el hombre prehistrico desarroll un
saber especial sobre cules plantas poda y cules no utilizar en su propio
beneficio. A lo largo de la historia, esta principiante cultura tradicional se ha
ido transmitiendo de generacin en generacin, y con Protium, de continente a
continente. (J imnez, 1965).

En estos das de desenfreno tecnolgico, el saber popular ocupa menor
importancia, y la tradicin, acabar por perderse. Recuperar aquellos ritos,
usos tradicionales que nuestros antepasados daban a las plantas, nos
proporciona una incertidumbre al aceptar que todos aquellos conocimientos
se encuentran a nuestra disposicin. Las nuevas ramas del saber cientfico, la
visin futurista y otras costumbres de las nuevas generaciones, hacen que la
cultura tradicional y la sabidura sobre los beneficios de las plantas,
desaparezcan con el tiempo.
Dentro de unos aos, cuando miles de enfermedades nos aquejen y no posean
curacin alguna, intentaremos recuperar la tradicin perdida y encontrar en
las plantas la salvacin de nuestras dolencias. An estamos a tiempo para
evitar esta prdida de informacin mdica, etnolgica, farmacutica,
ecolgica y social. (Patio, 1977).

Las primeras referencias histricas del uso de las plantas como curativos data
de los egipcios, quienes alrededor del ao 1700 antes de Cristo se sirvieron del
ajo, camo y del enebro. En la antigua Grecia, Hipcrates (468 377 a.C.)
desarroll frmulas y remedios naturales a partir de datos que obtuvo en
Asira (Asia antigua) e India, incorporando plantas como el jengibre o la
albahaca. El mismo ide el primer herbario conocido, estableciendo una
divisin de los alimentos y las hierbas en funcin de sus cualidades. De los
griegos, las virtudes de las plantas llegaron a los romanos alrededor del ao
100 a.C. luego, en el ao 60 despus de Cristo, el botnico naturista Pedanius
Dioscrides profundiz en el conocimiento teraputico de los vegetales y sus
principios activos. Su Tratado de Plantas Medicinales es base fundamental
aun hoy en da, de cualquier tipo de investigacin etnobotnica y medicinal.
(Lpez, 2000).

En la Corte del Emperador Marco Aurelio, en Asia Menor, su mdico
Claudio Galeno desarroll mucho mas las ciencias fitoteraputicas y elabor
numerosas frmulas y teoras a partir de los conocimientos de Hipcrates.
Las obras de Galeno se convirtieron en el indicio de la Medicina Natural en
toda Roma, llegando hasta la Edad Media. En esta ultima poca , la Iglesia
participo a travs del cultivo de plantas medicinales y en el intercambio de
conocimientos entre los pases europeos. En siglos mas recientes como el
XVII y XVIII , aparecen ya en los remedios naturales otras plantas de origen
americano o de las Indias orientales como la yuca o la nuez moscada.
(Lpez, 2000).

A partir de 1932 y hasta nuestros das, contina la revisin de la sistemtica al
interior de las Burserceas. Ver Tabla 1.

TABLA 1
Modificaciones actuales (1932-1997) Clasificacin actual
Protieae: exclusin de Trattinnickia. Gneros: Protium, Tetragastris,
Crepidospermum y Garuga.
Boswellieae: cambio de nombre por
Burseraceae.
Gneros: Boswellia, Triomma,
Aucoumea, Bursera y Commiphora.
Canarieae: inclusin de Trattinnickia.
Cambio de Pachylobus don por
Dacryodes vahl.
Gneros: Canarium, Dacryodes,
Scutinanthe, Santiria, Haplolobus y
Trattinnickia.

TABLA 1. Principales modificaciones a las tribus de Engler y clasificacin actual de la
Familia Burseracea. (Martnez, 1998).

Los cambios y descubrimientos ms importantes son:
o El cambio de nombre de la tribu Boswellieaepor Burseraceae, debido a la
mayor antigedad de esta ltima por H. J . Lam en 1932 (Harley,
1996).
o Reaparicin de Dacryodes vahl, en reemplazo de Pachylobus don, que
pasa a ser sinnimo, realizado por H. J . Lam en 1932 (Cuatrecasas,
1957).
o En Colombia, J os Cuatrecasas crea el gnero Paraprotium y presenta
claves para las especies en nuestro pas. Adems aporta informacin
en cuanto a su distribucin, nombres vulgares y la importancia de esta
familia en algunas de sus formas vegetales.
o En 1996, D. C. Daly junto con M. Harley presentan 16 tipos de polen
de la tribu Protieae, evidenciando que este grupo es muy diverso
tambin en su polen.
o En 1997, Takhtajan publica la disposicin de las familias Burseraceae,
Anacardiaceaey Podoaceaeen el Orden Burserales.

4.1.2 Caractersticas de la Familia Burseracea

Las Burserceas se distinguen por ser la familia del incienso y la mirra, son
rboles y arbustos que pueden alcanzar los 40 metros de altura. Protium
calanensealcanza los 13 metros de altura. Tienen un caracterstico olor a
incienso o trementina producido por canales resinferos que se ubican
especialmente en la corteza y ramas. Poseen hojas compuestas alternas
imparipinnadas en su mayora, con o sin estpulas; flores pequeas en
inflorescencias paniculadas o racimosas, spalos de 3 a 5, ptalos ausentes y
fruto en drupa, pequeos y globosos, con semillas de poco o ningn
endospermo.
La Familia de las Burserceaes son una serie de rboles, a veces corpulentos,
con seis gneros y doce especies que integran la selva hmeda tropical. Se
caracteriza por el olor que despiden todas sus partes, poseen la corteza muerta
desprendible en placas o corteza lisa, gris o rojiza, con olor agradable y
exudado resinoso con olor a mango o a miel.

Protium calanense pertenece a la Familia Burseraceae, son rboles con
sustancias resinosas en casi todos los rganos, posee conductos resinferos y
balsamferos en la corteza y en la mdula; hojas alternas, generalmente sin
estpulas, con flores de color amarillo plido, pequeas y muy olorosas, posee
spalos verdes, anteras amarillo verdosas, de dos a siete fololos, frutos rojos,
pequeos y resinosos. (Cuatrecasas, 1957).

El gnero Protium posee 90 especies conocidas, en su mayora colombianas,
debido a que slo siete son asiticas o africanas, las dems son constituyentes
importantes de la flora amaznica y de las partes clidas de Amrica
(Barrancabermeja) desde Colombia hasta el norte de Argentina (CAB
CYTED, 1995).

4.1.3 Clasificacin Taxonmica actual de la Familia Burseraceae

Segn el Estudio preliminar de la Familia Bursearacea en Colombia de
Martnez, 1998, se expone la siguiente clasificacin taxonmica:

v REINO Vegetal
v DIVISIN Angiospermae
v CLASE Magnoliopsida
v SUBCLASE Rosidae
v ORDEN Burserales
v FAMILIA Burseraceae
v GRUPO Proteae
v GNERO Protium
v ESPECIE P. calanense

4.1.4 Ubicacin de Protium calanenseCuatr.

Protium calanensese encuentra ubicado en la selva hmeda tropical, la cual
comprende las zonas de clima clido, con bosques que no experimentan
durante todo el ao una sequa estacional pronunciada. Al amanecer, la selva
guarda neblina entre los follajes, las nubes se forman favorecidas por la
transpiracin de la vegetacin, se elevan y llueve de nuevo sobre los rboles
en repetidos ciclos que reutilizan su propia agua. Igualmente el suelo se nutre
de la lluvia de hojas secas, ramas y desechos de los rboles que son
transformados por millones de organismos. Si se talan los bosques para
dedicar el terreno a la agricultura o la ganadera, las lluvias se van. Muy
pronto el suelo desaparece dando lugar al desierto. Es por ello que la
importancia de la selva reside en que se mantenga en pie, con su fauna y sus
especies vegetales llenas de promesas para la nutricin y la medicina.

Protium calanense es una de las especies dominantes de las formaciones
vegetales de la sabana permanentemente inundada y pantanosa, pertenece al
bosque subhigrfilo o de galera, los cuales son bosques que presentan
irregularidad en las lluvias a travs del ao, se localizan a lo largo de las
riberas de los ros, pueden ser inundados durante una parte del ao y esto
ocasiona que exista menor heterogeneidad florstica. En estos bosques
pantanosos se presentan pocas secas marcadas y que pierden las hojas en
algn momento del ao.

Protium calanense, denominado comnmente anime, se encuentra en el Valle
del Magdalena, cerca del Municipio de Barrancabermeja, a 75 m.s.n.m., rbol
de diez a 20 metros a lo largo de las quebradas.

Protium es un gnero de aproximadamente 100 especies (Harley, 1996), lo que
indica una amplia distribucin, presentndose en el Paleo trpico entre 7 9
especies (Asia y Madagascar), cuya morfologa floral se considera arcaica. La
mayora son grandes rboles de selvas hmedas primarias, en tierra firme. El
principal centro de diversidad es la Amazona, y son centros de endemismo
secundarios la regin Guyana venezolana, el sur de Centroamrica y las
selvas costeras del Atlntico de Brasil. En Colombia se han reportado 63
especies de Protium en todo el pas (Martnez, 1998), cubriendo el mayor
nmero de formas de vida vegetal. En las guyanas, algunas especies son
dispersadas por animales como monos, tucanes y tortugas, quienes consumen
los frutos. Es el gnero ms abundante y el de distribucin ms amplia,
recorre el pas a excepcin de Guajira, Csar, Sucre y Magdalena. Las zonas
de mayor concentracin de especies son la Amazona y la regin del Choc
biogeogrfico entre Valle, Choc y Antioquia. (Martnez, 1998).

4.1.4.1 La Familia Burseracea en el mundo

Esta familia se compone de rboles y arbustos provistos de conductos
resinferos (sin sustancias alergnicas o venenosas). Las hojas son alternas,
imparipinnadas, algunas veces trifolioladas o unifolioladas, la mayora sin
estpulas. Las inflorescencias son paniculadas, usualmente axilares, algunas
veces pseudoterminales y raramente terminales. Tiene flores pequeas y
actinomorfas, hermafroditas o unisexuales, con 3 5 spalos usualmente
connados o casi libres, estambres obdiplostmonos, con filamentos insertos en
la base externa. Fruto, una drupa con pericarpo carnoso, globoso y resinfero,
y 2 5 pirenos con una semilla cada uno. Semillas sin endospermo, con
radcula apical y cotiledones lobados. (Swart, 1942; Cuatrecasas, 1957).

Esta familia se encuentra en todas las regiones tropicales especialmente en
Malasia, Amrica del Sur y Africa (Heywood, 1985). En Africa predomina
en la regin centro este y en la Isla Madagascar, all los gneros
predominantes son Boswellia, Canarium, Commiphora; Dacryodes, Santiria y
algunas especies de Protium; que crecen tanto en los matorrales ridos y
espinosos, como en las grandes sabanas y los cinturones aluviales a lo largo de
los manglares. En Asia se encuentra principalmente en la regin de
Indochina, Filipinas, Nueva Guinea y el sur de la Pennsula rabe; con los
gneros Boswellia, Canarium y Garuga. Ver Mapa 1.

Mapa 1. Distribucin geogrfica mundial de la Familia Burseracea.

4.1.4.2 La Familia Burseracea en Amrica

En Amrica se encuentran ocho gneros, de los cuales cinco son
exclusivamente americanos (Bursera, Crepidospermum, Tetragastris y
Trattinnickia) y tres se extienden al viejo mundo (Commiphora, Dacryodes y
Protium). La distribucin geogrfica de estos gneros comprende desde el sur

de Estados Unidos (estados de Florida, Texas, Arizona y Nuevo Mxico)
cruzando toda Centroamrica y las Antillas, hasta el Noreste de Sudamrica,
desde Colombia hasta Bolivia y el norte de Paraguay. (Heywood, 1985). Ver
Mapa 2.

Mapa 2. Distribucin geogrfica de la Familia Burseracea en Amrica.

4.1.5 Usos e importancia de las Burserceas en general

Las Burserceas son especies de madera ordinaria a semifina, de algunas de
ellas se ha elaborado triples y parquet y se han aserrado para labores
domsticas e industriales, pero se usa frecuentemente el anime
medicinalmente para reventar o quitar orzuelos y otras inflamaciones, adems
colocando una bolita en el ombligo y friccionando sobre l se alivia; algunos
insectos (abejas) utilizan este exudado para elaborar sus colmenas con otros
exudados, y tambin se usan como brea para canoas. De esta familia
procedente de frica, los reyes magos llevaron incienso y mirra a J ess de
Nazareth. (Mahecha, 1997).

El uso de la resina de las Burserceas existe desde antes de la conquista
espaola, siendo usada a manera de incienso para ceremonias religiosas de
varias culturas indgenas como los Mayas y Aztecas. En Yucatn haba
bosquecillos de copal (Protium copal), especie que se da silvestre en las tierras
bajas; con una resina superior a los dems inciensos indgenas que se
distribua con las poblaciones de las tierras altas (Thompson, 1978). Los
indgenas caribes empleaban la resina del copal para calafatear sus canoas y
as protegerlas de los insectos (Standley, 1946).
En Paraguay, la decoccin de la corteza de Protium heptaphyllum es utilizada
como depurativa y astringente. El exudado mezclado con sebo de vaca, se
utiliza para las afecciones catarrales en forma de cataplasma. Una infusin de
las hojas es utilizada como anticatarral. En Brasil y Colombia, la decoccin
de la goma se usa contra tumores. (CAB CYTED, 1995).

El uso medicinal que se atribuye a gran nmero de Burserceas, se ha
comprobado mediante el anlisis de algunas muestras de resina. En general,
se han encontrado en especies amaznicas colombianas, compuestos del tipo
monoterpeno y sesquiterpeno, que son conocidos agentes desinfectantes y
repelentes de insectos; triterpenos pentacclicos del esqueleto del lupano y
ursano que tienen actividad antiinflamatoria, y triterpenos tetracclicos de tipo
tirucallano, muy usados en la quimiotaxonoma de las burserceas.
(Martnez, 1998).

La madera se ha empleado para la elaboracin de vigas y columnas en casas
campesinas, como poste para el tendido de redes elctricas o de telefona,
troncos partidos empleados en la construccin de cercas, corrales y
alambrados, tambin se ha empleado en el tendido de caminos para facilitar el
paso de animales cuando el suelo es inestable y resbaloso; la mdula junto
con la corteza constituyen la composicin de medicinas naturales elaboradas
por los indgenas, gracias a la sustancias resinosa que desprenden; adems es
una planta adecuada para el manejo de zonas con alto grado de erosin,
debido a sus races que le aseguran un fuerte anclaje al suelo (zancos), lo que
permite estabilizar el suelo, aportando gran cantidad de materia orgnica que
continuamente va enriqueciendo el suelo; tambin es uno de los principales
constituyentes de la biodiversidad, puesto que alberga numerosas especies que
aprovechan su sombra y nutrientes, de igual manera cumple un papel
importante en la regulacin del agua; por otro lado, durante la poca de
floracin es abundante la cantidad de nctar liberado, reflejado en su
agradable aroma a miel, el cual es utilizado por las abejas. (Prez, 1996).

4.1.5.1 Usos e importancia de Protium calanense(Burseraceae)

Las utilidades que le proporciona el rbol de anime al humano son
mltiples, como la madera de su tronco, la mdula de su tronco, manejo de
zonas erosionadas, proteccin de zonas productoras de agua, reforestacin y
asocio con cultivos agrcolas, el nctar de sus flores y de la mdula en
medicina popular.

En cuanto a la medicina popular, poco se conoce acerca de la composicin
qumica del rbol, sin embargo se tienen registros acerca del uso de algunas
partes del anime para el tratamiento de enfermedades; las hojas y tallos
tiernos se emplean en cocimiento o infusin en algunas regiones de Colombia
como medicamento contra las hemorragias post parto; adems, el humo,
producto de la combustin de la mdula se emplea por algunas personas
como una alternativa para la sinusitis, y el cocimiento de las hojas en baos
externos para el tratamiento del coto. (Gonzlez, 1984).

Segn la Base de Datos de Fitoqumica y Etnobotnica, Protium es
considerado en Panam como el rbol de mayor valor, debido a que la goma
que libera el rbol es usada de dos formas, fra, donde es aplicada
directamente en las heridas para prevenir infecciones; y tambin es aplicada
externamente para dolores de cabeza.

En las regiones selvticas se recogen las resinas de estos rboles que se hallan
en abundancia, estas resinas son usadas para curar llagas, Protium produce en
su fruto una resina lquida, amarilla, aceitosa, que llaman aceite de sasafrs,
empleado para la curacin de la sfilis, lceras, granos, hinchazones y tambin
se utiliza para el dolor de cabeza. (Prez, 1996).
La resina que libera esta especie es una sustancia segregada de las clulas en
reservorios internos y no regresan al metabolismo del vegetal, esta resina tiene
propiedades fisicoqumicas, es insoluble en el agua, soluble en el alcohol, en el
ter, no es cristalina y es muy olorosa. Por destilacin, se puede obtener de
ella derivados industriales como la trementina. (Arbelez, 1990).

Adems, si el olor de la cocina o de la casa resulta desagradable, se puede
aromatizar el ambiente con la coccin de las hojas de Protium, el cual se
convierte en incienso. (Garca, 1992).

4.2 MICROORGANISMOS PATGENOS TRASMITIDOS POR
DIFERENTES VAS

Ver Anexo 1. Microorganismos patgenos transmitidos por diferentes
vas. Pg. 73.

4.2.1 Gastroenteritis por Escherichia coli

FIGURA 1. Caractersticas microscpicas de Escherichia coli

Escherichia coli es una causa de enfermedades transmitidas por alimentos. La
infeccin produce sntomas como diarrea sanguinolenta, y de vez en cuando
daos en el rin. La enfermedad ha sido asociada por comer carne picada
contaminada. La infeccin tambin puede ocurrir despus de beber leche
cruda y despus de nadar o de beber agua contaminada del alcantarillado. Los
consumidores pueden prevenir la infeccin de E. coli consumiendo carne
picada perfectamente cocinada, evitando tomar leche ordeada sin
pasteurizar y lavando las manos con frecuencia. El microorganismo se
mantiene vivo en los intestinos del ganado, por esta razn se deben tener
medidas preventivas saludables en las granjas ganaderas y durante el
procesamiento de la carne. Vive tambin en los intestinos de humanos
saludables y en los animales, esta tensin produce una toxina poderosa y
puede causar la enfermedad severa. (Mttar, 1998). E. coli se reconoci
primero en 1982 como una causa de enfermedad durante una erupcin de
diarrea sangrienta severa; la erupcin se atribuy a las hamburguesas
contaminadas. Luego, la mayora de las infecciones se asignan a la carne
picada mal cocinada. Este microorganismo puede contaminar la carne
durante la matanza del animal, y puede mezclarse con otros microorganismos
en la carne cuando es molida. Las bacterias estn presentes en las ubres de la
vaca o en el equipo de ordeo de la leche cruda. (CDC, 2000).

La infeccin de E. coli a menudo causa diarrea sangrienta severa y calambres
abdominales, a veces la infeccin no presenta ningn sntoma. La
enfermedad se resuelve entre 5 a 10 das. En algunas personas,
particularmente, en los nios menores de 5 aos de edad y los ancianos, la
infeccin tambin puede causar una complicacin llamada Sndrome
Urmico Hemoltico, en la cual las clulas de la sangre (glbulos rojos) son
destruidas, causando daos en los riones, sangrado profuso y anemia
temporal. (CDC, 2000).

4.2.2 Aspergilosis por Aspergillus niger

FIGURA 2. Caractersticas microscpicas de Aspergillus niger. (Salfelder, 1979).

Las especies del gnero Aspergillus son ubicuas en la naturaleza. La
aspergilosis ocurre en todo el mundo. Principalmente afectan la piel,
mucosas, odo externo y pulmones. La enfermedad fngica ocurre
especialmente en pacientes debilitados como los que padecen tumores
malignos, estn en tratamiento con esteroides, reciben drogas citostticas o
estn siendo irradiados. En el hombre se observa, adems de otras formas de
esta micosis, el aspergiloma, que es una forma caracterstica de la aspergilosi s
pulmonar. Como tumor pulmonar, el aspergiloma es relativamente frecuente
y puede producir daos serios de la salud de las personas afectadas.
(Guzmn, 1977).

Las clulas de Aspergillus se presentan como hifas septadas o tabicadas,
relativamente anchas que se ramifican en forma dicotmica y que forman un
micelio. As como las hifas de otros gneros patgenos, las clulas del
Aspergillus pueden invadir y penetrar estructuras tisulares, como paredes de
vasos sanguneos y de los bronquios. En el extremo distal de una hifa
(conidifora) puede formarse una separacin de la misma (vescula).
Alrededor de la vescula nace una corona de esterigmas (primarios o
secundarios). En la punta de los esterigmas se originan cadenas de conidios
que pueden desprenderse de modo que pueden encontrarse en forma libre en
el tejido. Al encontrar exclusivamente conidios, que tienen un aspecto
levaduriforme y son Gram positivos. Los aspergilomas persisten porque las
masas fngicas impiden la enervacin de las cavidades pulmonares y por
consiguiente su cicatrizacin y curacin. No se conoce todava un
medicamento especfico para tratar la aspergilosis. (Salfelder, 1979).
Presenta rasgos clnicos como la infeccin pulmonar y enfermedad
diseminada, normalmente con fiebre, tos, y dolor de pecho. Sinusitis con
fiebre, dolor localizado. Segn el Centro para el Control y Prevencin de
Enfermedades (CDC) y su Divisin de Enfermedades bacterianas y micticas,
los casos o la proporcin de fatalidad puede ser igual al 100%. El paciente
depende de recobrar su estado inmune y la terapia antifngica eficaz. Su
modo de transmisin ocurre por la inhalacin de conidias fngicas
aerotransportadas, el hongo puede colonizar el tracto respiratorio, la
enfermedad del pulmn es crnica. La infeccin exgena puede ser asociada
a la exposicin del polvo. (CDC, 2000).

En cuanto a su incidencia en los alimentos, es llamado el moho negro,
causante de la podredumbre negra en melocotones, ctricos e higos. Produce
alteracin en jamones y tocinos, tambin en aceites de palma y de maz.
Aunque posee una amplia importancia industrial, en la produccin de
enzimas como amiloglucosidasa utilizada en la elaboracin de jarabe de
almidn, pectinasas presentes en el procesamiento de vinos y en la
preparacin de jugos de frutas, antocianasa empleada en la decoloracin de
uvas, hemicelulasa utilizada en panadera, gomas, entre otras. (Bayona, M.,
1997).
4.2.3 Candidiasis por Candida albicans

FIGURA 3. Caractersticas microscpicas de Candida albicans. (Salfelder, 1979).

Es una de las infecciones fngicas que ocurre comnmente en todo el mundo.
Existen numerosas especies del gnero Candida. La especie patgena ms
frecuente en el hombre es la Candida albicans. Estos hongos viven como
saprofitos sobre la piel y las mucosas del tracto respiratorio, digestivo y genital
femenino, de preferencia en pacientes diabticos y durante el embarazo. Es
frecuente ver las invasiones superficiales (piel y mucosas) producidas por este
hongo. La forma generalizada se produce por va hemtica y se manifiesta
por lesiones o abscesos en casi todos los rganos y tejidos. Se observa
exclusivamente en pacientes con enfermedades debilitantes, adictos a las
drogas, personas que reciben terapias con varios medicamentos, trasfusiones
de sangre y enfermos con defectos inmunolgicos. (Salfelder, 1979).
Microscpicamente se puede observar que en el tejido se forma un micelio
con hifas delgadas y seudohifas, adems de clulas micticas levaduriformes
pequeas. Estas clulas pueden mostrar gemacin. Las hifas y seudohifas
penetran en el tejido como lo hacen las races de una planta.

Presenta rasgos clnicos como dolor del esfago y dificultad al comer,
infeccin del torrente sanguneo y enfermedad diseminada normalmente con
fiebre, raramente: pulmona, osteomielitis y artritis. (CDC, 2000).
Segn el CDC y la Divisin de Enfermedades Bacterianas y Micticas posee
una incidencia de 8 casos/ 100.000 en la poblacin general, en los pacientes
VIH positivos se presenta como una infeccin oportunista. (CDC, 2000).

Se relaciona con los alimentos ya que es una levadura presente en la
fermentacin de stos, atacando alimentos ricos en grasa, a pesar de ello otras
especies de Candida tienen importancia industrial produciendo cidos
orgnicos, etanol a partir de nutrientes especiales, enzimas como la lipasa
utilizada en la produccin de jabn, lpidos en sustratos ricos en glucosa y
vitaminas como la riboflavina, entre otras. (Bayona, M., 1997).

4.3 TECNICAS UTILIZADAS EN EL DISEO EXPERIMENTAL

La evaluacin de la actividad antimicrobiana de los extractos vegetales y sus
fracciones de Protium aff. calanense COL 447165, se verific con
microorganismos patgenos transmitidos por diferentes vas, tales como:
Escherichia coli 708 CIMIC, Aspergillus niger 765 CIMIC y Candida albicans 117
CIMIC, con el fin de detectar sobre cules microorganismos es efectiva la
actividad antimicrobiana. El CIMIC es el Centro de Investigaciones
Microbiolgicas de la Universidad de los Andes, entidad donde fueron
conseguidas las cepas de cada uno de los microorganismos certificadas.

4.3.1 Cromatografa en capa delgada (CCD)

Se efectu una Cromatografa en Capa Delgada (CCD), para verificar cules
fracciones poseen mayor actividad biolgica. La CCD tiene ventajas como:

Versatilidad, por el gran nmero de adsorbentes diferentes, en nuestro
caso, la silicagel, el cual tiene un indicador de fluorescencia
Velocidad en el desarrollo de separacin de los componentes
Sensibilidad, ya que separa cantidades menores a los microgramos
(g).
Se utiliza un equipo simple y de bajo costo
Es fcil su comprensin y ejecucin
Utilizacin de una pequea cantidad de solvente y muestra a ser
analizada
Posibilidad de analizar varias muestras en una sola placa
cromatogrfica
Posibilidad de revelar las placas con reactivos cromognicos, lo cual
hace posible detectar sustancias que no absorben en la regin UV
visible. (CAB CYTED, 2000).

sta tcnica cromatogrfica comprende una fase mvil que es el solvente o la
mezcla de solventes y una fase estacionaria que es la silicagel. La
cromatografa que se llev a cabo es de tipo lquido slido (CLS). Sobre las
placas plsticas de silicagel se coloca la muestra de los extractos de cada
fraccin con capilares para ser colocadas en la cmara cromatogrfica con el
solvente o la mezcla de solventes. Luego, se dejan secar las placas de
silicagel y se colocan bajo luz ultravioleta para observar cul fraccin presenta
fluorescencia. Posteriormente se comprueba la deteccin de compuestos
antimicrobianos humedeciendo la placa con un revelador qumico, en nuestro
caso con vainillina, el cual contiene cido sulfrico concentrado, por ltimo
se evidencia la efectividad de las fracciones colocando las placas en un horno
durante cinco minutos.

Por otro lado, la actividad antimicrobiana de plantas, tejidos o extractos de
plantas, el cual es el objetivo de nuestro proyecto, fue detectada observando la
respuesta de crecimiento de los microorganismos en estudio, los cuales fueron
puestos en contacto con el extracto de la planta.
Para detectar esta actividad se debe tener en cuenta las siguientes condiciones:

El extracto de la planta debe ponerse en contacto con la pared celular
del microorganismo seleccionado para la prueba.
El microorganismo debe crecer cuando el agente microbiano para la
prueba no est presente, es decir, el extracto total y sus fracciones, debe
crecer en el Control Negativo, por el contrario, se utiliz un Control
Positivo especfico para cada microorganismo.
Debe existir un medio de cultivo para observar la cantidad de
crecimiento del microorganismo durante el perodo de tiempo elegido
para la prueba, es decir, un Control de Crecimiento.
4.3.2 Mtodo de Bioautografa

Para este mtodo se emple una cantidad conocida del extracto, el cual se
tom de una solucin con una concentracin de 10 mg/ 1 ml de DMSO. Los
extractos y sus fracciones fueron aplicados con capilares en una placa de
slicagel y corridas en una fase mvil apropiada para cada una de las
fracciones. Ver Tabla 2.
Luego se colocaron las placas a secar a temperatura ambiente. Esta tcnica se
realiza por duplicado para conocer el lugar o la zona en la que se encuentran
los componentes activos. (Cole, 1994).
Previamente se realiz una siembra masiva en cajas de petri de 20 ml de Agar
Nutritivo para Escherichia coli y Agar Saboraud para Candida albicans,
empleando la concentracin del Tubo No. 1 del patrn de Mac Farland.
Las cromatoplacas son colocadas sobre el agar en contacto directo con la
siembra durante 16 horas a 4 C (nevera) para evitar el crecimiento de los
microorganismos y permitir a los extractos y sus fracciones difundirse en el
agar. Finalizado este tiempo se descartaron las cromatoplacas y las cajas se
llevaron durante 18 horas a 36 C (incubadora), terminado este tiempo se
observaron las cajas de petri para determinar la posible actividad
antimicrobiana, por medio de halos de inhibicin en el crecimiento del
microorganismo. Luego, se comparan stos resultados con las cromatoplacas
de control reveladas con vainillina.

TABLA 2
FRACCIONES SOLVENTES PROPORCIN
ter de Petrleo
Hojas/ Corteza
ter de Petrleo+Acetato de Etilo 8 : 2
Diclorometano
Hojas/ Corteza
Diclorometano + Etanol 9 : 1
Acetato de Etilo
Hojas/ Corteza
Diclorometano + Metanol 9.5 : 0.5
Extracto Total Etanlico
Hojas/ Corteza
Diclorometano + Metanol 8 : 2

TABLA 2. Solventes y proporciones utilizadas en la Cromatografa de Capa Delgada.

4.3.3 Mtodo de Crecimiento Radial

Segn Cole, M., 1994, al utilizar sta tcnica, los componentes del extracto se
difunden en el agar (PDA), si las sustancias activas se encuentran presentes, el
crecimiento radial del hongo se ver afectado. Los componentes identificados
posiblemente como antifngicos incluyen a los monoterpenos y derivados del
benceno, triterpenos de tipo esteroidal, sesquiterpenos, flavonoides, entre
otros.

Esta tcnica es una evaluacin cualitativa de los extractos y sus fracciones, se
asume si poseen o no actividad antifngica cuando las sustancias activas son
solubles en el agar y por lo tanto se difunden hacia el crecimiento del hongo.
La metodologa empleada fue la siguiente: (Cole, 1994) se utiliz un volumen
fijo de agar (20ml), al igual la concentracin de los extractos y sus fracciones
fue de 10mg/ 1ml, agregando 0.5 ml y 0.3 ml de cada una de las muestras a
evaluar; se coloc un inculo de 0.2 mm de dimetro del hongo en estudio en
el centro de la caja de petri, con el fin de medir correctamente el crecimiento
radial; se trasladaron las cajas a temperatura de incubacin durante cinco (5)
das permitiendo el mayor crecimiento del hongo Aspergillus niger, midiendo el
dimetro de ste, considerando el extracto con actividad antifngica si el
crecimiento es menor al 50% con relacin al control de crecimiento.

Es importante resaltar que sta tcnica fue realizada por triplicado para cada
una de los extractos y sus fracciones. Este mtodo de difusin en agar es el
ms adecuado para evaluar extractos de plantas no estriles porque los
microorganismos aerbicos no se desarrollan bajo el agar solidificado.

5. MATERIALES Y MTODOS

Se utiliz tanto material qumico y como biolgico; dentro del material
qumico se encuentran los reactivos (solventes de extraccin), medios de
cultivo, vidriera y equipos del Laboratorio de Fitoqumica (evaporador
rotatorio, cmaras cromatogrficas, molino), y equipos del Laboratorio de
Microbiologa (incubadora, nevera, autoclave, mecheros); y a su vez el
material biolgico se divide en dos, en las cepas microbianas: Escherichia coli
708 CIMIC, Aspergillus niger 765 CIMIC y Candida albicans 117 CIMIC; y en
material vegetal de hojas secas y corteza seca de Protium calanense.

El presente trabajo es un estudio de tipo descriptivo, donde se evalu la
actividad antimicrobiana que poseen o no los extractos vegetales de Protium
aff. calanense. Para ello se escogieron tres microorganismos patgenos
transmitidos por diferentes vas, cada uno de ellos representa un gnero de
microbios, entre ellos: Escherichia coli, Aspergillus niger y Cndida albicans, con
el fin de detectar sobre cules microorganismos es efectiva la actividad
antimicrobiana.
Ver Anexo 2. Recoleccin y preparacin del material vegetal. Pg. 74.
5.1 Recoleccin y preparacin del material vegetal

FIGURA 4. Identificacin Taxonmica de Protium calanense

El material vegetal fue recolectado en el bosque de clima tropical hmedo de
la regin del Magdalena Medio, exactamente en el Centro Experimental
Santa Luca de la Universi dad de la Paz, Vereda Zarzal, Municipio de
Barrancabermeja, Kilmetro 14, Autopista Barrancabermeja Bucaramanga,
75 metros sobre el nivel del mar. Su determinacin taxonmica fue realizada
por Edgar Linares en el Herbario Nacional de Colombia, dependencia del
Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia,
donde se encuentra radicado con el nombre de Protium aff. calanenseCuatr. y
bajo el nmero COL 447165. Ver Figura 4. Ver Anexo 3. Pg. 75.
Una vez recolectado el material vegetal, el cual comprende hojas y corteza
separadamente, se prescindi secar a temperatura ambiente durante 15 das
aproximadamente, para liberarlo de agua y evitar la disolucin de los
solventes miscibles en ella (Pedrozo, 1999). Es importante resaltar que las
plantas colectadas deben estar libres de enfermedades. Posteriormente el
material seco se macer en un molino para obtener un tamao de partculas
uniforme y pequeo que facilit el proceso de extraccin (debido a que el
molino deshace los tejidos celulares del material vegetal seco, permitiendo la
entrada del solvente fcilmente). Las hojas y la corteza se estudiaron por
separado, como indica la tcnica de Seleccin del material vegetal para un
anlisis fitoqumico, segn Pedrozo, J ., 1999).

5.2 Obtencin de los extractos vegetales

Para la obtencin del extracto total etanlico, fue agregado al material vegetal
seco y molido etanol destilado, conservado en frascos de vidrio tapados y en
la oscuridad, durante 48 horas como se describe para la tcnica de
Maceracin en fro. (Pedrozo, 1999). Durante este tiempo el disolvente se
infiltra en los tejidos de los rganos vegetales, liberando sustancias naturales
como resinas, ceras, blsamos y gomas. El etanol se utiliza porque es un
solvente fro y es uno de los solventes con mayor polaridad, extrayendo
mayor cantidad de sustancias, lo que es de gran importancia para la actividad
biolgica de un vegetal. Luego de stas 48 horas el extracto total etanlico se
filtr y se destil en un evaporador rotatorio a 40 C a 175 mbar de presin
para obtener el extracto del etanol hasta mnimo volumen, se procedi luego a
secar los extractos totales etanlicos de hojas y de corteza por aparte, el
extracto de hojas se realiz en un vaso de precipitado colocado en una estufa
al vaco a 30 C de temperatura y a 15 kPa de presin de vaco, mientras que
el extracto de corteza se efecto en un evaporador rotatorio a 50 C y a 185
mbar de presin de vaco.

5.3 Obtencin de las fracciones

El fraccionamiento del extracto total etanlico, se inici con ter de Petrleo,
Diclorometano, y Acetato de Etilo, dejando un residuo en Etanol. El
mtodo de fraccionamiento del Extracto total etanlico se efectu mediante
una extraccin discontinua lquido slido (Pedrozo, 1999), es decir, se inici
agregando aproximadamente 50 mililitros (mL) de ter de petrleo a 40
gramos (g) de extracto total etanlico seco, tanto de hojas como de corteza.
Para aumentar la eficacia de la extraccin etrea se repiti el procedimiento
diez veces. Finalizada la obtencin de la Fraccin ter de petrleo de hojas y
de corteza por separado, se dej secar el solvente del extracto total etanlico y
se repiti el mismo proceso con Diclorometano, al obtener la Fraccin
Diclorometano de hojas y de corteza por separado, se repiti nuevamente el
proceso con Acetato de etilo, logrando por ltimo la Fraccin Acetato de etilo
de hojas y corteza por separado. Tanto la destilacin de los solventes como la
concentracin de los extractos fueron realizadas en un evaporador rotatorio.
Ver Tabla 3.

TABLA 3.
SOLVENTE Punto de ebullicin a
presin normal ( C)
VACO ( mbar)
ter de Petrleo 40 > 335
Diclorometano 30 ( T mn) 746 (Presin normal)
Acetato de Etilo 40 240
Etanol 40 175

Tabla 3. Algunas propiedades fisicoqumicas de los solventes utilizados. (Pedrozo, 1999).

5.4 Evaluacin de la actividad antimicrobiana

Para los ensayos antibacterianos (Escherichia coli 708 CIMIC) se utiliz el
Mtodo de Bioautografa (Cole, 1994), en el cual se determin la actividad
antimicrobiana por las zonas de inhibicin en el Agar Nutritivo. Para el
Control Positivo se emple una solucin de 0.5 g de Amoxicilina en 1 ml de
Dimetilsulfxido (DMSO), diluida en el agar, y el Control Negativo con
DMSO nicamente.

Para los ensayos antifngicos (Candida albicans 117 CIMIC) se aplic el
Mtodo de Bioautografa, en el cual se determin la actividad antimicrobiana
por las zonas de inhibicin del crecimiento en la caja de petri con Agar
Saboraud. Para el Control Positivo se emple una solucin de 0.5 g de
Nistatina en 1 ml de Dimetilsulfxido (DMSO), diluda en el agar, y el
Control Negativo con DMSO nicamente.

Para los ensayos antifngicos (Aspergillus niger 765 CIMIC) se emple el
Mtodo de Crecimiento Radial en PDA (Cole, 1994), en el cual se determin
la actividad antimicrobiana a partir del porcentaje de inhibicin del
crecimiento del hongo frente a los extractos y sus fracciones. Se emplearon
cajas de petri de 6 ml con un crecimiento homogneo del hongo en estudio,
luego se prepar una solucin del extracto de 1.44 g/ 1 ml DMSO, obteniendo
una concentracin final de 10mg / 1 ml. Para el Control Positivo se manej
una solucin de 0.5 g de Metronidazol en 1 ml de Dimetilsulfxido, diluida
en el medio de cultivo PDA, y para el Control Negativo se agreg 0.3 ml de
DMSO. Sin embargo, los extractos y sus fracciones no se disolvieron
completamente en el DMSO , por lo cual, se adicionaron de 23 gotas de
Tween 80 para obtener una solucin ms lquida, ya que slo con DMSO la
solucin permanece en forma de goma resina. Ver Figura 8.

Tanto para los ensayos antibacterianos como para los ensayos antifngicos se
manejaron Controles de Crecimiento para comparar la inhibicin producida
por los extractos y sus fracciones del material vegetal en estudio; adems, se
desarrollaron Controles de Ambiente para evitar confusiones con los
microorganismos en estudio.

FIGURA 8

C. de Crecimiento (PDA) C. Negativo (0.3 DMSO) C. Positivo (Metronidazol)

FIGURA 8. Control Positivo (0.5 ml Metronidazol), Control Negativo (0.3 ml DMSO) y Control de Crecimiento (PDA) de
Aspergillus niger.

6. RESULTADOS

6.1 Extracto del Material Vegetal

Tanto las hojas como la corteza de Protium aff. calanensese pesaron antes y
despus de la extraccin para conocer el peso en gramos de la cantidad
extrada. Ver Tabla 4.

TABLA 4
PLANTA PESO (g) PESO EXTRACTO
TOTAL ETANLICO (g)
Hojas secas 363 112
Corteza seca 1990 153

TABLA 4. Peso del Material Vegetal.

6.2 Microorganismos de ensayo
6.2.1 Escherichia coli

FIGURA 5. Caractersticas macroscpicas de Escherichia coli

Present un crecimiento rpido y masivo en Agar Nutritivo, se observaron
colonias pequeas, color beige, opacas, convexas y de borde regular. En la
Figura 5 se observa la siembra masiva como Control de Crecimiento de
Escherichia coli, adems esta bacteria fermenta la lactosa, facultad propia de
este bacilo Gram negativo anaerobio facultativo. (Brock, 1998).

6.2.2 Aspergillus niger

FIGURA 6. Caractersticas macroscpicas de Aspergillus niger

Present un crecimiento comn de sal y pimienta causado por la proliferacin
profusa de esporos negros. Sin embargo, el reverso de la colonia es color
verde limn en el centro y mbar alrededor. (Koneman, 1992). Colonias
cubiertas los primeros das (2 3) por un micelio areo blanco y plumoso, al
cabo de los das (5 8) la colonia madura se cubre de esporos negros.

6.2.3 Candida albicans

FIGURA 7. Caractersticas macroscpicas de Candida albicans

Present colonias grandes, color crema en Agar Saboraud, de aspecto
mucoide, de consistencia blanda y cremosa, al madurar se vuelve ms lisa y
de un color ms oscuro, adems de poseer su olor caracterstico. (Comptons
Interactive Encyclopedia, 1996).

6.3 Cromatografa en Capa Delgada (CCD)

Siguiendo la metodologa utilizada para CCD, se utilizaron los solventes y
las proporciones adecuadas para correr las cromatoplacas, se establecieron
similitudes y diferencias de los extractos y sus fracciones, observando los
compuestos a varias polaridades que posiblemente tienen actividad
antimicrobiana. (Kline, 1975). Al observar las cromatoplacas de control
con Luz U.V. de onda larga, se observa que las Fracciones de Corteza de
todos los solventes emiten fluorescencia en las manchas que posiblemente
poseen los compuestos antimicrobianos. Cabe mencionar que la Fraccin
Etanlica de Corteza emite fluorescencia de dos compuestos diferentes, una
color azul violeta y la otra color verde limn. Mientras que las Fracciones
de Hojas de todos los solventes no emiten ninguna fluorescencia ni con Luz
U.V. de onda larga ni con onda corta.

6.4 Evaluacin Antimicrobiana

La evaluacin de la actividad antimicrobiana de los extractos y sus fracciones
frente a Escherichia coli y Candida albicans, presentan halos de inhibicin,
medidos en centmetros (cm), hallando el porcentaje de inhibicin para cada
microorganismo, a partir del crecimiento total del Control Negativo. Ver
Tabla 5. Ver Anexo 4. Pg. 76.

TABLA 5
FRACCIN
E. coli
Dimetro
(cms)
C. albicans
Dimetro
(cms)
E. coli
%
Inhibicin
C. albicans
%
Inhibicin
ter de Petrleo Hojas 3.5 3.5 35 35
ter de Petrleo Corteza 9 2.7 90 27
Diclorometano Hojas 2 2 20 20
Diclorometano Corteza 9 3.5 90 35
Acetato de Etilo Hojas 3.5 2.7 35 27
Acetato de Etilo Corteza 9 2.5 90 25
Ext.Total EtOH Hojas 9 3 90 30
Ext.Total EtOH Corteza 9 3 90 30
Controles Positivos*

0 0 100 100
Controles Negativos
(0.5 mL DMSO)
10 10 0 0
* Control Positivo para E. coli: Amoxicilina (0.5) y para C. albicans: Nistatina (0.5).
TABLA 5. Actividad Antimicrobiana de los extractos y sus fracciones frente a E. coli y
C. albicans
La evaluacin de la actividad antimicrobiana de los extractos y sus fracciones
frente a Aspergillus niger, se determinaron como activos los extractos que
arrojaron un porcentaje de crecimiento menor al 50% respecto al crecimiento
de la cepa control, el cual se asume como el l00%.

Adems, se realiz una comparacin entre los solventes solubles en agua, es
decir menos polares y que podran ser empleados en las pruebas biolgicas
como Controles Negativos, escogindose el DMSO en cantidades menores a
0.3 ml / 20ml de agar.

En la Tabla 6 se puede observar la mayor actividad antifngica de los
Extractos Totales Etanlicos tanto de hojas como de corteza de Protium aff.
calanensefrente a Aspergillus niger, donde se obtienen resultados satisfactorios,
dando como porcentaje de inhibicin 95% y 97.5% respectivamente. Ver
Figura 9.

TABLA 6
EXTRACTO
CRECIMIENTO
(cm)
%
CRECIMIENTO
%
INHIBICIN
Control Crecimiento 4 100 0
Control Negativo 2.9 72.5 27.5
Control Positivo 0 0 100
Total Etanlico Hojas 0.2 5 95
Total Etanlico Corteza 0.1 2.5 97.5
La concentracin del extracto fue de 10mg / 1ml.

TABLA 6. Actividad Antifngica de los Extractos Totales Etanlicos frente a A. niger

FIGURA 9

Extracto Total Etanlico Extracto Total Etanlico
Hojas Protium calanense Corteza Protium calanense

FIGURA 9. Actividad Antifngica de los Extractos Totales Etanlicos frente
a A. niger

La Fraccin de ter de Petrleo de Hojas obtuvo un menor porcentaje de
inhibicin respecto a la Fraccin de ter de Petrleo de Corteza, frente a
Aspergillus niger, por lo cual, el porcentaje adquirido (15% y 20%
respectivamente) no es significativo para el estudio realizado. Ver Tabla 7y
Figura 10.

TABLA 7

FRACCIN TER
DE PETRLEO
CRECIMIENTO
(cm)
%
CRECIMIENTO
%
INHIBICIN
Fraccin Hojas 3.4 85 15
Fraccin Corteza 3.2 80 20
La concentracin de la fraccin fue de 10 mg / 1 ml.

TABLA 7. Actividad Antifngica de las Fracciones de ter de Petrleo frente a A. niger

FIGURA 10

Fraccin ter de Petrleo Fraccin ter de Petrleo

FIGURA 10. Actividad Antifngica de las Fracciones de ter de Petrleo
frente a A. niger

Similarmente se indica que los porcentajes de inhibicin de las Fracciones de
Diclorometano tanto de hojas como de corteza actan de igual manera que
las anteriores, es decir, los porcentajes obtenidos no poseen mayor relevancia
frente a A. niger (17.5% y 22.5% respectivamente). Ver Tabla 8 y Figura 11.

TABLA 8
FRACCIN
DICLOROMETANO
CRECIMIENTO
(cm)
%
CRECIMIENTO
%
INHIBICIN
Fraccin Hojas 3.3 82.5 17.5
Fraccin Corteza 3.1 77.5 22.5

TABLA 8. Actividad Antifngica de las Fracciones de Diclorometano frente a A. niger

FIGURA 11

Fraccin Diclorometano Fraccin Diclorometano

FIGURA 11. Actividad Antifngica de las Fracciones de Diclorometano
frente a A. niger

Respecto a la evaluacin de las Fracciones de Acetato de Etilo de hojas y de
corteza, frente a A. niger se alcanzaron porcentajes de inhibicin poco
demostrativos para cumplir con los objetivos del estudio, a saber, 12.5% y
20% respectivamente. Ver Tabla 9 y Figura 12.

TABLA 9

FRACCIN
ACETATO DE ETILO
CRECIMIENTO
(cm)
%
CRECIMIENTO
%
INHIBICIN
Fraccin Hojas 3.5 87.5 12.5
Fraccin Corteza 3.2 80 20

TABLA 9. Actividad Antifngica de las Fracciones de Acetato de Etilo frente a A. niger

FIGURA 12

Fraccin Acetato de Etilo Fraccin Acetato de Etilo

FIGURA 12. Actividad Antifngica de las Fracciones de Acetato de Etilo
frente a A. niger


De acuerdo a los datos alcanzados en la Tabla 5, se deduce que los Extractos
Totales Etanlicos tanto de hojas como de corteza presentaron la mayor
actividad antimicrobiana contra Escherichia coli, debido a que los halos de
inhibicin indican un 90% de inhibicin del crecimiento.
Esto se podra atribuir principalmente a que en stos extractos se encuentran
compuestos presentes en hojas y corteza de Protium calanense (Burseraceae),
como triterpenos de tipo esteroidal, sesquiterpenos, monoterpenos y derivados
del benceno, que posiblemente tienen actividad antimicrobiana.

Respecto a los Extractos de Corteza de las Fracciones de ter de Petrleo,
Diclorometano y Acetato de Etilo, se observ un porcentaje de inhibicin del
orden del 90% frente a Escherichia coli, esto se confirm con los controles de
las cromatoplacas, observadas con luz ultravioleta de onda larga, donde las
fracciones de corteza emiten fluorescencia en su separacin.

Mientras que los Extractos de Hojas de las Fracciones de ter de Petrleo,
Diclorometano y Acetato de Etilo, arrojaron halos de inhibicin del orden del
30%, frente a Escherichia coli, esta bacteria (Gram Negativa) posee una capa
delgada de peptidoglicano y una membrana exterior como parte de la pared
celular; la capa de peptidoglicano est compuesta por polisacridos formando
enlaces entre stos y aminocidos, por lo cual, no permite la entrada de las
sustancias presentes en las fracciones. Adems E. coli posiblemente fermenta
los azcares presentes en las hojas y corteza de la especie arbrea en estudio,
as como lo realiza en los medios de cultivo selectivos. As mismo esta
bacteria con el tiempo puede desarrollar esporas resistentes bajo condiciones
desfavorables que se forman en el interior de las clulas y estn envueltas en
una gruesa capa que posiblemente contiene cido dipicolnico, el cual es
soluble en etanol. (Dictionary of organic compounds, 1965).

De otra parte, los extractos y sus fracciones no demostraron actividad
antifngica frente a Candida albicans, segn las cifras arrojadas de la Tabla 5,
debido a que los halos de inhibicin no superan el 35%.
Estos resultados posiblemente se deben a que sta levadura en condiciones
adversas (como exponerla a las sustancias presentes en la cromatoplaca),
forma esporas sexuales, es decir, comienza un ensanchamiento dentro de las
hifas, las cuales se rodean de una pared gruesa, creando resistencia a las
sustancias empricamente antibiticas. Igualmente, se asume que Candida
albicans asimila posiblemente los azcares como la glucosa, maltosa, sacarosa,
galactosa, xilosa y trehalosa, factiblemente presentes en los compuestos
qumicos de las Burserceas. (Koneman, 1992).

Por otro lado, los resultados logrados en la Tabla 6, demuestra que los
Extractos Totales Etanlicos tanto de Hojas como de Corteza poseen mayor
actividad fungisttica frente a Aspergillus niger, con porcentajes de inhibicin
de 95% y 97.5%, respectivamente, cuando se aplica a concentraciones de
10mg/ 1ml..
De los datos obtenidos se deriva la teora que el extracto total etanlico hace
parte de una extraccin directa y completa de las hojas y corteza de Protium
calanense, donde se hallan todos el conjunto de compuestos terpenoides,
anteriormente mencionados, principalmente los monoterpenos y los derivados
del benceno, como el fenol, el cual posee fuertes propiedades antispticas y en
general es un germicida activo, debido a su gran toxicidad. (Routh,
J .I.,1990).

En cuanto a las cantidades obtenidas en la Tabla 7, Tabla 8y Tabla 9, del
porcentaje de inhibicin de las Fracciones de ter de Petrleo, Diclorometano
y Acetato de Etilo, respectivamente, no se hall significativo frente a
Aspergillus niger, ya que el porcentaje de crecimiento es mayor al 50%.
Estos datos indican que los componentes presentes en cada una de las
fracciones tanto de hojas como de corteza fueron separados en la obtencin
de stas. Conjuntamente, estas plantas poseen en su composicin diversos
polisacridos como galactosa, xilosa, arabinosa, fructosa, ramnosa, cidos
glucurnicos y galacturnicos, los cuales pueden ser la base de alimentacin
del hongo, causando un crecimiento mayor. (Newall, 1996).

A parte de esto, la pared celular de este hongo que rodea a cada clula est
compuesta por Quitina, la cual consta de subunidades de glucosamina, un
azcar nitrogenada, celulosa y otros polisacridos, como la glucosa, la cual
puede terminarse y por lo tanto el hongo comienza a metabolizar los
polisacridos presentes en las fracciones de hojas y corteza, aumentando su
crecimiento; al mismo tiempo, la quitina es ms resistente a la degradacin
por antibiticos, por ser una pared gruesa y refringente, tiene la ventaja de ser
impermeable para el hongo pero esto no favorece nuestro estudio. (Pelczar,
1992).

8. CONCLUSIONES

Los Extractos Etanlicos de Protium aff. calanense de hojas y corteza
presentaron la mayor actividad antifngica contra Aspergillus niger, con una
inhibicin de 95% y 97.5%, respectivamente, en comparacin con todas las
fracciones, cuando se aplica a una concentracin de 10mg/ 1mL.

Los Extractos Etanlicos de Protium aff. calanense de hojas y corteza
presentaron la mayor actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, con una
inhibicin de 90%, en comparacin con todas las fracciones, cuando se aplica
a una concentracin de 10mg/ 1mL.

Las Fracciones de ter de petrleo, Diclorometano y Acetato de Etilo de
Corteza presentaron mayor inhibicin (90%) frente a Escherichia coli, respecto
a las Fracciones de ter de petrleo, Diclorometano y Acetato de Etilo de
Hojas, las cuales no presentaron halos de inhibicin significativos (30%).

Los Extractos Etanlicos y sus Fracciones ter de petrleo, Diclorometano y
Acetato de Etilo, no presentan actividad antifngica significativa frente a
Candida albicans.

Las Fracciones de ter de petrleo, Diclorometano y Acetato de etilo tanto de
Hojas como de Corteza, no poseen valores significativos de inhibicin frente a
Aspergillus niger.

Finalmente se lograron los objetivos propuestos, ya que los extractos
etanlicos obtuvieron el mayor porcentaje de inhibicin, junto con las
fracciones de corteza, es decir, que los extractos y sus fracciones de Protium
aff. calanensepueden actuar como antibacterianos y antifngicos, inhibiendo el
crecimiento de los microorganismos estudiados.

9. RECOMENDACIONES

Incrementar el control de microorganismos en la industria alimenticia, ya que
algunos microbios como los estudiados deterioran los alimentos, desde su
produccin, almacenaje, distribucin, hasta llegar al consumidor que es el
ms afectado.

Continuar con las investigaciones qumicas y biolgicas de las plantas
medicinales como Protium calanense (Burseraceae), para aumentar los datos
obtenidos del presente proyecto, del cual no se conoca ningn reporte
bibliogrfico y de esta forma mejorar la calidad de vida de la humanidad,
recurriendo a el potencial medicinal de nuestra flora.

Aprovechar nuestras plantas no slo como base de la materia prima de
determinados productos, o incluso industrias, sino que se aproveche la
investigacin desinteresada, aumentando el patrimonio de nuestros
conocimientos y aplicaciones vegetales.

10. BIBLIOGRAFA

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RESUMEN

Esta investigacin aporta a la ciencia fitoqumica, la evaluacin de la
actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos a partir de hojas y corteza
de Protium calanensefrente a microorganismos causantes de Enfermedades de
Transmisin Alimentaria (ETAs).
Se inici con la recoleccin y preparacin del material vegetal, obteniendo as
los extractos vegetales (Extracto Total Etanlico) y sus fracciones (ter de
petrleo, Diclorometano y Acetato de Etilo). Posteriormente se procedi a
determinar si los extractos y sus fracciones poseen o no actividad
antimicrobiana contra Aspergillus niger mediante el mtodo de difusin en
agar, y Candida albicans y Escherichia coli a partir del mtodo de bioautografa.
Los extractos totales etanlicos tanto de hojas como de corteza presentaron la
mayor actividad antifngica frente a Aspergillus niger, con un porcentaje de
inhibicin de 95% y 97.5%, respectivamente. Al igual, stos extractos
exhibieron la mayor actividad antibacteriana frente a Escherichia coli, con un
porcentaje de inhibicin del 90%.
Las fracciones de corteza de ter de petrleo, Diclorometano y Acetato de
etilo demostraron actividad frente a Escherichia coli, con un porcentaje de
inhibicin del 90%. Mientras que las fracciones de hojas de todas las
fracciones no manifestaron halos de inhibicin significativos (30%). As
mismo, las fracciones de ter de petrleo, Diclorometano y Acetato de Etilo
de hojas y de corteza no revelaron inhibicin representativa frente a
Aspergillus niger, debido a que su crecimiento super el 50%.
Finalmente, los extractos y sus fracciones no demostraron actividad
antifngica frente a Candida albicans, respecto a que los halos de inhibicin no
superan el 35%.

ANEXO 4


DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LAS PARTES
AREAS (HOJAS Y CORTEZA) DE Bursera tomentosa Tr. & Pl. CONTRA
ALGUNOS FITOPATGENOS Y PATGENOS DEL HOMBRE.

NATALIA ANDREA BECERRA COBOS
IVAN ALEXANDER SEGURA FRANCO

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar el ttulo de

MICROBILOGO INDUSTRIAL
Bogot D. C., Mayo 2003

RESUMEN

La planta Bursera tomentosa Tr. & Pl. se colect en cercanas del municipio de
Agua de Dios, Cundinamarca. Posteriormente se obtuvo un extracto etanlico de
corteza y hojas a travs de un sistema de reflujo, los cuales subsecuentemente se
fraccionaron con tres solventes de diferente polaridad ter de petrleo,
Diclorometano y Acetato de Etilo, consiguiendo distintas mezclas de compuestos.

Por su importancia a nivel clnico y mantener una alta incidencia en enfermedades
nosocomiales en Colombia, se tomaron las bacterias Pseudomonas aeruginosa y
Staphylococcus aureus. Bacillus cereus, por su parte, al ser causante de
intoxicaciones alimentaras fue utilizado en este estudio. Estos microorganismos
fueron enfrentados con los extractos y las fracciones obtenidas empleando la
tcnica difusin en agar con pozos. Las bacterias Grampositivas mostraron
inhibicin de crecimiento con todos los extractos, realizando consecutivamente la
Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) con la misma tcnica, en diferentes
concentraciones. Para S. aureus se obtuvo una CMI de 25mg/mL en la fraccin ter
de petrleo de corteza y extracto total de hojas, mientras para B. cereus en la
fraccin diclorometano y extracto etanlico de hojas present una CMI de 1.5 y
2mg/mL, respectivamente.

Empleando la misma tcnica de las bacterias, se evaluaron los hongos
fitopatgenos Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea, dada la importancia que
revisten en el mbito agroindustrial. Trichophytum mentagrophytes, un dermatofito
comn en micosis del hombre; el cual fue valorado de igual manera. Sin embargo,
se present un crecimiento normal de estos frente a las sustancias extradas de las
hojas y de la corteza.

RESULTADOS

OTENCIN DE FRACCIONES

DeI moferioI recoIecfodo de , tomentosu se consiguieron Ios siguienfes
confidodes de frocciones y de exfrocfo fofoI:

Purte de
Iu pIuntu
Cuntidud
recoIectudu
Cuntidud
etructo
totuI
Cuntidud
fruccionudu
Fruccin
Cuntidud
obtenidu
Efer de
pefroIeo
4.oZg
DicIoromefon
o
b.Zbg Hojos 790.30 g 44.oIg 30.Ibg
Acefofo de
EfiIo
Z.4Zg
Efer de
pefroIeo
0.o8g
DicIoromefon
o
o.Zbg Corfe;o I.334,90g Z3.bIg I4.bZg
Acefofo de
EfiIo
0.4bg

Tabla 5. Cantidades obtenidas de B. tomentosa. Autores

EI rendimienfo obfenido de Io confidod froccionodo de hojos se puede
observor en Io Figuro ZI, siendo disfinfo oI rendimienfo de Io corfe;o
mosfrodo en Io Figuro ZZ.

RENDIMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL DE
HOJAS FRACCIONADO
8%
9%
4%
49%
30%
ter de petrleo
Diclorometano
Acetato de Etilo
Can. Fraccionada
Marco y fraccin acuosa

Figura 21. Grfica del rendimiento del material vegetal de hojas. Autores
RENDIMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL DE
CORTEZA FRACCIONADO
2%
22%
2%
49%
25%
ter de petrleo
Diclorometano
Acetato de Etilo
Can. Fraccionada
Marco y fraccin acuosa

Figura 22. Grfica del rendimiento del material vegetal de corteza. Autores

,Z, IDENTIFICACIN DE MICROORSANISMOS

Poro confirmor que Ios cepos oforgodos por Ios fuenfes, poseon Ios
corocfersficos mefoboIicos y morfoIogicos, se procedio o Io reoIi;ocion de
Io idenfificocion bioqumico recomendodo por Moc Foddin (I980) poro codo
microorgonismo. Anexo 3

Posferiormenfe se reoIi;o uno curvo de crecimienfo de codo
microorgonismo, inocuIondo ImL deI fubo b de Mc ForIond en I00mL de coIdo
8HI (Merck), eI cuoI obfuvo uno obsorboncio finoI de 0.oZ, 0.70 y 0.b8 con
StuphyIococcus uureus, uciIIus cereus y Pseudomonus ueruginosu,
respecfivomenfe, esfos fubos fueron odemos sembrodos en profundidod en
ogor Mufrifivo (Merck), poro esfobIecer eI nmero de unidodes formodoros
de coIonios que presenfobo codo fubo. Despues de incubor o 3b.8"C por un
periodo de 48 horos, se reoIi;o eI recuenfo poro StuphyIococcus uureus eI
cuoI orrojo un resuIfodo de I4xI0
8
UFC/mL, poro uciIIus cereus fue de
bxI0
8
UFC/mL y poro Pseudomonus ueruginosu de I0xI0
8
UFC/mL, Io curvo
defermino Ios horos de Ios respecfivos foses de crecimienfo que duroron un
fofoI de b7 horos, desde Io fose de odopfocion hosfo Io fose de muerfe.
(Figuro. Z3)
CURVA DE CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS
EVALUADAS EN EL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA DE Bursera tomentosa Tr. & Pl.
0,00
0,30
0,60
0,90
1,20
1,50
1,80
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
TIEMPO (horas)
Staphylococcus aureus Bacillus cereus Pseudomonas aureginosa

Figura 23. Curva de crecimiento de las bacterias Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y
Bacillus cereus. Autores

,3, ENSAYOS DE DIFUSIN EN ASAR CON POZOS

Los ensoyos reoIi;odos oI enfrenfor Ios bocferios con Ios diferenfes
exfrocfos o Ios Z4 horos de incubocion permifieron deferminor Io ocfividod
inhibiforio en eI crecimienfo de Ios microorgonismos o Ios disfinfos
concenfrociones de Ios exfrocfos y deI confroI posifivo (genfomicino). Se
midio enfonces Ios hoIos de codo po;o en mm. (CoIe, I999, Leivo. I999)

EI confroI posifivo poro codo ensoyo con Ios diferenfes frocciones de esfo
pruebo reocciono sofisfocforiomenfe, es decir, fuvo un hoIo de inhibicion
sensibIe frenfe o codo microorgonismo como Io indicobo Jorgensen, y coI.,
(I999), soIo que se incremenfo Io concenfrocion o I00g/mL poro que eI hoIo
orrojodo por esfe, fuviero eI diomefro requerido, eI cuoI debero ser moyor
o iguoI o Ibmm, yo que o uno concenfrocion menor se presenfobo un hoIo
incipienfe poro ser fomodo como confroI.

Los frocciones exfrodos de Ios hojos que dieron ocfividod inhibiforio confro
uciIIus cereus fueron dicIoromefono y ocefofo de efiIo, os mismo eI
exfrocfo efonoIico mosfro inhibicion en confro de esfe bociIo, obfeniendo
hoIos de inhibicion enfre 8 y I3mm, siendo significofivos frenfe oI confroI
posifivo que monfuvo hoIos promedios de I9mm. (Figuro Z4) Por ofro Iodo, Io
froccion mos opoIor, efer de pefroIeo, no indico uno ocfividod inhibiforio
simiIor o Ios frocciones mos poIores, puesfo que oI medir Ios hoIos de
inhibicion eI diomefro fue menor, con respecfo o dicIoromefono, ocefofo de
efiIo y exfrocfo efonoIico. (Figuro Zb)

Figura 24. Actividad inhibitoria de extracto total y las fracciones de ter de petrleo, diclorometano y
acetato de etilo de hojas contra Bacillus cereus. Autores
AI confrorio de Ios frocciones exfrodos o porfir deI exfrocfo fofoI de
hojos, Io de efer de pefroIeo de corfe;o presenfo uno ocfividod simiIor o Io
froccion dicIoromefono de hojos confro uciIIus cereus, o pesor de que Ios
concenfrociones evoIuodos fueron de 7b y Ib0mg/mL, en confro posicion o
Ios demos que fueron o porfir de 400mg/mL, odemos Ios hoIos presenfodos
osciIobon enfre I0 y I3mm, Iogrondo ser comporobIes con eI confroI posifivo
(genfomicino). (Figuro Zo.) Lo froccion dicIoromefono y eI exfrocfo efonoIico
de corfe;o muesfron un menor diomefro de Io ;ono de inhibicion deI
crecimienfo, pero significofivomenfe confronfobIes con oqueIIos que
indicoron poco ocfividod frenfe o Io genfomicino, como es eI coso de Io
froccion ocefofo de efiIo. (Figuro Zb)

0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
P
r
o
m
e
d
i
o
s

H
a
l
o
s

d
e

I
n
h
i
b
i
c
i
n

(
m
m
)
ter de petrleo Diclorometano Acetato de etilo Extracto etanlico
Fracciones
COMPARACIN ENTRE EL CONTROL POSITIVO Y
LOS EXTRACTOS DE HOJAS Y CORTEZA DE
Bursera tomentosa CONTRA Bacillus cereus
Hojas Control-Hojas . Corteza Control-Corteza

Figura 25. Grfica de comparacin entre el control positivo (gentamicina) y los extractos de hojas y
corteza de Bursera tomentosa Tr. & Pl. frente a Bacillus cereus. Autores

Poro StuphyIococcus uureus Ios resuIfodos orrojodos fuvieron concordoncio
con Ios presenfodos con uciIIus cereus pues Io froccion efer de pefroIeo
de corfe;o mosfro ocfividod en confro de esfe coco simiIor o Io deI bociIo.
Sin emborgo, Io froccion ocefofo de efiIo y exfrocfo efonoIico de corfe;o no
exhibieron un diomefro de hoIo de inhibicion, comporobIe con Io froccion
efereo y con eI confroI posifivo. (Figuro Z7) Por ofro Iodo, Io froccion
dicIoromefono, indico un promedio de diomefros de hoIos simiIores o Ios
mosfrodos por uciIIus cereus, que fueron significofivos con respecfo o Io
froccion efereo y o Ios producidos por Io genfomicino.

Figura 26. Actividad inhibitoria de extracto total y las fracciones de ter de petrleo, diclorometano y
acetato de etilo de corteza contra Bacillus cereus. Autores

Con respecfo o Ios frocciones de hojos, Io ocfividod inhibiforio de
StuphyIococcus uureus se mosfro en dicIoromefono, Io cuoI presenfo un
diomefro de hoIos mucho moyor o Ios presenfodos por Ios ofros frocciones
(efer de pefroIeo, ocefofo de efiIo y eI exfrocfo efonoIico) y comporobIes
con Ios mosfrodos por eI confroI posifivo. Sin emborgo, eI exfrocfo fofoI y Io
froccion ocefofo de efiIo fuvieron promedios de ;onos de inhibicion
equivoIenfes o Io froccion dicIoromefono y Io genfomicino, pero Io ocfividod
que presenfo con uciIIus cereus fue moyor. (Figuro Z7)

Tonfo Ios exfrocfos fofoIes de hojos y corfe;o como Ios frocciones efer de
pefroIeo, dicIoromefono y ocefofo de efiIo, no mosfroron ;onos de inhibicion
deI crecimienfo confro Pseudomonus ueruginosu, mienfros eI confroI
posifivo (genfomicino) mosfrobo Io ocfividod inhibiforio esperodo. (Anexo
4)
0
3
6
9
12
15
18
21
P
r
o
m
e
d
i
o

H
a
l
o
s

d
e

i
n
h
i
b
i
c
i
n

(
m
m
)
Eter de petrleo Diclorometano Acetato de etilo Extracto etanlico
Fracciones
COMPARACIN ENTRE EL CONTROL POSITIVO Y LOS
EXTRACTOS DE HOJAS Y CORTEZA DE Bursera
tomentosa CONTRA Staphylococcus aureus

Figura 27. Grfica de comparacin entre el control positivo (gentamicina) y los extractos de hojas y
corteza de Bursera tomentosa Tr. & Pl. frente a Staphylococcus aureus. Autores
,4, CONCENTRACIN MNIMA INHIITORIA {CMI}

Los concenfrociones evoIuodos poro Io CMI poro Ios bocferios 0romposifivos
StuphyIococcus uureus orrojoron eI siguienfe resuIfodo

Concentracin Mnima Inhibitoria de Staphylococcus aureus
Hojas ( Dimetros en mm)
Concentracin
mg/mL
Extracto etanlico Diclorometano Acetato de etilo
75 10 11 0 0 0 0
50 10 10 0 0 0 0
25 9 8 0 0 0 0
12 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0

Corteza ( Dimetros en mm)
Concentracin
mg/mL
Extracto etanlico ter de petrleo Diclorometano
75 0 0 8 8 10 12
50 0 0 8 8 0 0
25 0 0 8 8 0 0
12 0 0 0 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0
3 0 0 0 0 0 0

Tabla 6. Halos de inhibicin para la CMI de Staphylococcus aureus. Autores

A. B.

Figura 28. A. Inhibicin del Extracto Etanlico de hojas y B. de la fraccin ter de petrleo de corteza
contra Staphylococcus aureus. Autores

Poro StuphyIococcus uureus Ios frocciones que fuvieron uno concenfrocion
menor de Zbmg/mL fueron exfrocfo efonoIico de hojos (Figuro Z8A) y efer
de pefroIeo de corfe;o, (Figuro Z88) mienfros dicIoromefono de hojos fuvo
uno concenfrocion mnimo de 7bmg/mL.

Los ofros frocciones probodos poro StuphyIococcus uureus obfuvieron
concenfrociones mnimos de I00mg/mL como Io fueron ocefofo de efiIo de
hojos y exfrocfo efonoIico de corfe;o que en Ios biensoyos de CMI, no
exhibieron hoIos grondes con respecfo o efer de pefroIeo de corfe;o y
dicIoromefono de hojos.

Concentracin Mnima Inhibitoria de Bacillus cereus
Hojas ( Dimetros en mm) Concentracin
mg/mL
Extracto etanlico Diclorometano Acetato de etilo
75 10 12 10 12 10 10
50 10 10 10 12 10 10
25 10 10 10 10 10 9
12 8 9 10 10 8 8
6 8 9 10 10 8 8
3 8 8 8 8 8 8
2 8 8 8 8 0 0
1,5 0 0 8 0 0 0
1 0 0 0 0 0 0

Corteza ( Dimetros en mm)
Concentracin
mg/mL
Extracto etanlico ter de petrleo Diclorometano
75 8 8 10 10 10 10
50 8 8 8 10 10 8
25 8 8 8 9 8 8
12 8 0 8 8 8 8
6 0 0 8 8 8 8
3 0 0 8 8 8 8
2 0 0 0 0 0 0

Tabla 7. Halos de inhibicin de la CMI de Bacillus cereus. Autores

A. B.

Figura 29. Inhibicin de la fraccin diclorometano de hojas contra Bacillus cereus, A. Concentraciones
de 3, 6, 12, 25, 50 y 75mg/mL. B. Concentraciones de 0.5, 1, 1.5, 2 y 3mg/mL. Autores

Por ofro Iodo, Ios exfrocfos que fuvieron uno moyor ocfividod confro
uciIIus cereus (TobIo 7) en uno mnimo concenfrocion fueron: Io froccion
dicIoromefono (Figuro Z9) y eI exfrocfo fofoI de hojos (Figuro 30), pues
orrojoron resuIfodos de Z y I.bmg/mL, respecfivomenfe.

A. B.

Figura 30. Inhibicin del extracto etanlico de hojas contra Bacillus cereus, A. Concentraciones de 3, 6,
12, 25, 50 y 75mg/mL. B. Concentraciones de 0.5, 1, 1.5, 2 y 3mg/mL. Autores

Acefofo de efiIo de hojos (Anexo 4), dicIoromefono (Anexo 4) y efer de
pefroIeo en corfe;o (Figuro 3I) fuvieron uno concenfrocion mnimo
oproximodo de 3mg/mL, mienfros que poro eI exfrocfo efonoIico de corfe;o
(Anexo 4) Io concenfrocion menor osciIo enfre IZ o Zbmg/mL.

Figura 31. Inhibicin de la fraccin ter de petrleo de corteza contra Bacillus cereus, con
concentraciones de 3, 6, 12, 25, 50 y 75mg/mL. Autores

,, DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIFNSICA

EI resuIfodo obfenido enfrenfondo hongos y frocciones no fue sofisfocforio,
yo que no se enconfro ocfividod oIguno. Se siguio o coboIidod eI
procedimienfo de CoIe (I999), duronfe Ib dos, fomondo codo cinco dos eI
crecimienfo que se feno de codo hongo, proporcionondoIe Ios focfores
exfrnsecos opropiodos. Como es eI coso de otrytis cinereu (Figuro 3Z) que
poro su crecimienfo debio fener odemos de Ios componenfes bosicos,
oscuridod obsoIufo duronfe cinco dos, poro eI coso de Trichophytum
mentugrophytes se debio incubor o uno femperofuro enfre Z8"C y 30"C.
Fusurium oysporum no necesifo de focfores especioIes soIo de
femperofuro ombienfe sin que Io Iu; deI soI coyero direcfomenfe sobre eI.

Figura 32. Actividad del Extracto Etanlico de hojas contra Botrytis cinerea. Autores

Poro Trichophytum mentugrophytes ninguno froccion mosfro ocfividod, un
ejempIo es Io siguienfe figuro, o pesor de esfor en Ios condiciones que
indicobo Ionemon, (I999)

Figura 33. Actividad de la fraccin diclorometano de corteza contra Trichophytum mentagrophytes.
Autores

Asimismo, poro Fusurium oysporum no se presenfo ocfividod confro ningn
exfrocfo o froccion de corfe;o u hojos. (Figuro 34)

Figura 34. Actividad del Extracto Etanlico de corteza contra Fusarium oxysporum. Autores

CONTRIBUCION AL ESTUDIO FITOQUIMICO
DE Bursera simaruba (L) Sarg.

EDGAR ALFONSO PALACOS ORTEGA

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al titulo de

BIOLOGO

CARRERA DE BIOLOGIA
Bogot, D.C.
Febrero 27 de 2002

NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la Resolucin No. 13 de Julio de 1946: La Universidad no se hace
responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus tesis de grado.

CONTRIBUCION AL ESTUDIO FITOQUIMICO
DE Bursera simaruba (L) Sarg.

EDGAR ALFONSO PALACOS ORTEGA

APROBADO

______________________________________________
Director: Jorge Robles Camargo, Ph.D.

______________________________________________
Jurado: Martha Ramrez, M.Sc

______________________________________________
Jurado: Omar Fuentes, Ph.D.

______________________________________________
Decano Acadmico Facultad de Ciencias: Angela Umaa, MPhil.

______________________________________________
Director Carrera Biologa: Luz Mercedes Santamaria, M.Sc.

Agradecimientos

Quiero agradecerle al Doctor Jorge Robles por haberme abierto las puertas del laboratorio
de Fitoqumica y darme la oportunidad de trabajar con tan magnificas personas.
A Alvaro Granados por su valiosa colaboracin tanto en la parte acadmica como en la
personal.

A Martha Ramrez por sus colaboracin y sus valiosos consejos que me hicieron crecer
mucho como persona

Al profesor Ruben Torrenegra por su orientacin en la parte cientfica

A doa Rosalba, Patricia, Jorge, Jaime por hacerme sentir en familia....

TABLA DE CONTENIDO

Pag.
1. INTRODUCCION. 9

2. MARCO TEORICO. 10
2.1. Generalidades botnicas de la familia Burseraceae. 10
2.2. Generalidades morfolgicas de las Burseraceas 11
2.3. Consideraciones botnicas y morfolgicas del genero Bursera jacq.ex linn. 15
2.4. Caractersticas morfolgicas de la especie Bursera Simaruba (L.) Sarg. 16
2.5. Clasificacin taxonmica. de la especie B. simaruba 16

3. Qumica de la familia Burseraceae. 17
3.1 Monoterpenos 17
3.2 Sesquiterpenos 18
3.3 Diterpenos 20
3.4 Triterpenos 20
3.5 Esteroides 23
3.6 Fenoles 24
3.7 Varios 24

4 FARMACOLOGA DE LA FAMILIA BURSERACEAE. 25

5. FORMULACIN DEL PROBLEMA. 26

6. JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN. 26

7. OBJETIVOS. 27
7.1. Objetivo General. 27
7.2. Objetivos Especficos. 27

8. METODOLOGA 27

8.1 Mtodos aplicados al estudio qumico. 27
8.1.1 Mtodo de extraccin y maceracin 27
8.1.2 Mtodos cromatogrficos 28
8.1.3 Mtodos espectroscpicos 29
8.1.4. Constantes fisicoqumicas 30

9. PARTE EXPERIMENTAL 30
9.1 Recoleccin material vegetal 30
9.2 Obtencin de los extractos 31
9.3 Obtencin de fracciones 32
9.3.1 Tratamiento de las fracciones en Eter de Petrleo 36
9.3.1.1.Fraccin ter de petrleo hojas 36
9.3.1.2. Fraccin ter de petrleo corteza 39
9.3.2. Obtencin de espectros 40

10. RESULTADOS 41
10.1. Compuesto Bs1H. 41
10.2 Compuesto Bs3C. 42
10.3 Compuesto Bs2H. 45
10.4 Compuesto Bs4C. 49

11. ANALISIS DE RESULTADOS 50

12. CONCLUSIONES 53

13. RECOMENDACIONES 53

14. REFERENCIAS 54

15. ANEXOS
15.1 Anexo 1.(Determinacin taxonmica) 59
15.2 Anexo 2 (Espectro RMN
13
C del compuesto Bs2H) 60
1
H del compuesto Bs2H) 61
15.4 Anexo 4 (Espectro IR del compuesto Bs2H) 62
13
C del compuesto Bs3C) 63
1
H del compuesto Bs3C) 64
15.7 Anexo 7 (Espectro IR del compuesto Bs3C) 65
15.8 Anexo 8 (Revisin qumica de la familia Burseraceae) 66

RESUMEN

El anlisis qumico realizado a los extractos de ter de petrleo de las hojas y de la corteza
de la especie Bursera simaruba permiti aislar e identificar una mezcla de triterpenos
pentacclicos, a y -amirinas y un triterpeno tetracclico, el -sitosterol

1.INTRODUCCIN.

La qumica de las Burseraceas se ha estudiado ampliamente en los ltimos 20 aos. Se han
aislado metabolitos secundarios tales como Geraniol de la corteza de Bursera delpechiana
(Bernal & Correa 1990), Limoneno de la oleoresina de Canarium Luzonicum, (Bruneton
1995), etc. Estos metabolitos han servido de soporte para explicar las propiedades
farmacolgicas que estas plantas poseen, por ejemplo, actividades anti-inflamatorias y
antivirales de algunas resinas (Duwiejua 1993), propiedades antifungicas y antimicrobianas
(Claeson et al 1991), efectos heapatoprotectores (Anand 1992), adems del interes en
estudios sobre leucemia y carcinomas (Jolad 1977). Adicionalmente se ha detectado que los
gneros Bursera y Protium contiene sustancias atitumorales y estimulantes del sistema
nervioso central (Mcdoniel 1972).

A pesar que las Burseraceas se encuentran ampliamente distribuidas en nuestro pas (6
gneros de los 10 reportados en el mundo y en especial el gnero Bursera que es exclusivo
de Amrica (Daly 1993).), no se han realizado estudios qumico en esta familia de plantas.

Debido al gran potencial farmacolgico que posee la familia Burseraceae, el laboratorio de
fitoqumica del departamento de Qumica de la Pontificia Universidad Javeriana con la
financiacin de Colciencias se ha propuesto a travs del presente trabajo separar, purificar e
identificar los metabolitos secundarios mayoritarios tanto de hojas como de la corteza de la
especie Bursera simaruba (L.) Sarg mediante tcnicas cromatogrficas y espectroscpicas.

Este trabajo es de gran importancia ya que puede ser la base para la elaboracin de
proyectos que permitan el desarrollo de productos farmacuticos biosintetizados en
laboratorio que ayuden a la prevencin y curacin de enfermedades, al control de plagas
y/o mejorar el rendimiento de los cultivos.

2. MARCO TEORICO.

2.1. Generalidades botnicas de la familia Burseraceae.

Las Burseraceas se distinguen por ser la familia del incienso y la mirra; son rboles y
arbustos que pueden alcanzar los 40 metros de altura (fig 1). Tienen un caracterstico olor a
incienso o trementina producido por canales resinferos que se ubican especialmente en
la corteza y ramas. Poseen hojas compuestas alternas imparipinadas en su mayora, con o
sin estpulas; flores pequeas con inflorescencias paniculadas o racimosas y fruto en drupa
con semillas de poco o ningn endospermo (Swart 1942, Cuatrecasas 1957).

Figura 1.Bursera simaruba
(http://www.viridis.net/cactus/mexico/img)

La familia Burseraceae fue descrita por primera vez por Kunth en 1824 y fue modificada
parcialmente en 1931 por Engler (Cuatrecasas 1957). En 1957 Cuatrecasas reporto 18
gneros y cerca de 600 especies en el mundo. Sin embargo, existen reportes de los gneros
Crepidospermum y Hemicrepidospermum, que fueron unidos bajo el nombre del primero y
ubicados en la tribu Protieae (Daly 1987); la transferencia del gnero Trattinnickia a la
tribu Canarieae, el reporte del gnero asitico Garuga, y la inclusin del gnero
Paraprotium dentro del Protium (Daly 1992). Actualmente se reportan 10 gneros, y la
clasificacin se ha modificado segn los siguientes criterios: Tribu Protieae: Drupa con 2-
5 partes libres o adheridas. Consta de los gneros Protium, Crepidospermum, Tetragastris y
Garuga. Tribu Bursereae: Drupa con endocarpo totalmente fusionado y exocarpo
dehiscente. Consta de los gneros Commiphora, Bursera y Boswellia. Tribu Canarieae:
Drupa con endocarpo completamente fusionado; a ella pertenecen los gneros Canarium,
Dacryodes y Trattinnickia (Daly 1989
a
).

En Colombia se encuentran seis gneros , distribuidos de diferentes formas segn los
diversos hbitat que ofrece nuestro pas. Los seis gneros en Colombia son: Bursera,
Crepidospermum, Dacryodes, Protium, Tetragastris, Trattinnickia.

2.2. Generalidades morfolgicas de las Burseraceas

La corteza exterior se desprende en tiras en algunas especies, particularmente del genero
Bursera; donde el color cobrizo y satinado de su tronco hace que sea llamado Indio
Desnudo y Palo mulato, haciendo alusin a la piel de los indgenas ( figura 2.).

Interiormente, la corteza de las Burserceas es rica en resina, una de las partes ms tiles de
la planta. Esta resina vara en su composicin y forma de fluir a travs de la corteza, como
lo evidencia el genero Dacryodes y cumple adems un interesante papel ecolgico con
otras especies (Daly 1993).

Figura 2. Corteza de Bursera simaruba
(http://www.acguanacaste.ac.cr/.../bursera_simaruba/cascara.jpg)

Las hojas de las Burseraceas son alternas, compuestas, e imparipinadas con foliolos
opuestos. No tienen estpulas, a excepcin de los gnero asiticos Canarium L y Garuga
Roxb; algunas especies son unifoliadas y pueden presentar pulvnulos en sus peciolos y/o
peciolos. El gnero Bursera Jacq. Ex L presenta a menudo raquis alado de manera ms o
menos notable (Daly 1993). La forma de los foliolos es de ovada a lanceolada, y de 3 a 50
cm de largo, que en la mayora de las especies son acuminados; el margen es generalmente
aserrado en los gneros Crepidospermum Hook y Bursera Jacq. Ex L y entero en los dems
gneros. Las hojas pueden ser permanentes o decduas durante estaciones secas; y varan en
consistencia de membranosa a coricea.(Daly 1993)(figura 3).

Figura 3. Hojas del gnero Dacryodes

Las flores son un importante carcter sistemtico. Se encuentran dispuestas en
inflorescencias paniculadas, cimosas o en racimos axilares y algunas veces terminales o
subterminales. Las flores son pequeas, de color verde a crema, actinomorfas, 3-5 meras,
hermafroditas pero funcionalmente unisexuales. Spalos unidos al menos en la base,
imbricados o valvados; ptalos usualmente libres o unidos en tubo, imbricado o valvados.
Estambres en igual o doble numero que los ptalos , generalmente obdiplostmonos;
filamentos libres o adnados al disco con anteras introsas, dorsifijas a basifijas y dehiscencia
longitudinal. Polen tricolporado. Disco nectarfero intrastaminal, ovario spero, 2-5-
carpelar, sincrpico, 2-5-locular con 2 ovulos antropos, eptropos y pndulos y de
placentacin axilar; estilo corto o ausente y estigma 2-5-lobado (Daly 1993)(figura 4)

Figura 5. Frutos del gnero Dacryodes

2.3. Consideraciones botnicas y morfolgicas del genero Bursera jacq.ex linn.

Sinnimos: Busseria Cramer, Dammara Gaertn, Elaphrim Jacq, Icia Aubl, Marionia Comm.
Ex. Kunth.

Este genero exclusivo de Amrica tiene cerca de 100 especies; se caracteriza entre otros por no tener
pulvnulos; la forma del arilo carnoso y brillantemente coloreado que envuelve el pireno parcial o totalmente
es tambin un carcter taxonmico, al igual que su corteza. La mayora de las especies son deciduas y
florecen sin hojas, en algunas especies unifoliadas. La mayora de las especies son endmicas de Mxico,
donde dominan en bosques deciduos en densidad y diversidad. La hibridizacin es frecuente y se han
detectado especies de origen hbrido. Crecen en hbitats semihmedos, semiridos y ridos. En Colombia se
han reconocido 5 especies distribuidas al norte del pas especialmente(Daly 1993).

2.4. Caractersticas morfolgicas de la especie Bursera simaruba (L.) Sarg.

Corteza exterior parecida a papel, descortezada; raquis de la hoja sin alas; foliolos enteros,
lanceolados a ovados; flores glabras; frutos trivalvados, ovoides a elipsados 10-13 mm de
largo; hojas (1) 2-6-yugada,los peciolulos laterales (2) 3-8 mm. de largo, foliolos
lanceolados a ovados, pice acuminado; pedicelos del fruto rectos; pireno cartilaginoso
(Daly 1993).

2.5. Clasificacin taxonmica. de la especie B. simaruba

REINO: Vegetal
DIVISIN: Angiospermae
CLASE: Magnoliopsida
SUBCLASE: Rosidae
ORDEN: Sapindales ( Cronquist 1988 )
Burserales (Takhtajan 1997 )
FAMILIA: Burseraceae
TRIBU: Bursereae
GENERO: Bursera Jacq. Ex L
ESPECIE : Bursera simaruba ( L ) Sarg

Luego de haber obtenido las fracciones de ter de petrleo, Diclorometano y acetato de
etilo tanto de corteza como de hojas, se sometieron a cromatografias en capa delgada (fig7
A,B,C). y corridas en ter de petrleo-Acetato de etilo 8:2, ter de petrleo-Acetato de etilo
7:3 y Acetato de etilo-metanol 1:1 respectivamente. Figura 7 A. fraccin Diclorometano
hojas (H) y corteza (C), B. fraccin ter de petrleo hojas (H) y corteza, C. fraccin
Acetato de etilo (H) y corteza (C)

Con la comparacin de las cromatografias de las diferentes fracciones se puede observar
que en la fraccin de Acetato de etilo no se observa separacin. a pesar de utilizar una
mezcla de solventes de una polaridad media-alta, esto quiere decir, que los compuestos que
se encuentran en esta fraccin son demasiado polares y es necesario cambiar tanto su fase
mvil como la estacionaria.
Posteriormente, se realizaron cromatografias bidimensionales a las fracciones de ter de
petrleo y Diclorometano (figura 8 A,B,C y D).

Debido a que la fraccin de acetato de etilo posee compuestos muy polares se decidi
iniciar el estudio fitoqumico de la especie B. simaruba con las fracciones de ter de
petrleo y Diclorometano.

3. QUMICA DE LA FAMILIA BURSERACEAE.

Las plantas de esta familia producen una gran variedad de compuestos. La mayora de las
especies exudan una resina oleo-gomsa, al ser daada la corteza, la cual esta compuesta de
terpenoides o mezcla de terpenoides y polisacridos. Los componentes voltiles son
C
H
A
C H
C
usualmente monoterpenos y sesquitepenos, mientras las fracciones no voltiles son a
menudo diterpenos y triterpenos. Otro tipo de metabolitos secundarios tambin presentes
son compuestos fenlicos tales como flavonoides, cumarinas y varios lignanos (Robles
1998).

3.1 Monoterpenos

Los aceites esenciales estn constituidos principalmente de monoterpenoides y
sesquiterpenoides. La variedad de monoterpenos acclicos detectados o asilados cubre
virtualmente todos los grupos asociados con esta clase. El Mirceno, el Citronellol, el
Linalol y Geraniol, o sus acetatos, se presentan abundantemente y son los mas comunes.
(Khalid 1983)

Los monoterpenos monocclicos son usualmente la clase dominante en la familia,
particularmente, el limoneno, el a-felandreno y el p-cimeno. Los derivados monocclicos
tambin estn presentes como aldehidos, cetonas y con menor frecuencia como cidos
(Khalid 1983).

CH2OH
OH
CH2OH
Mirceno Citronelol Linalol Geraniol
Limoneno felandreno p-cimeno

Los monoterpenos bicclicos incluyen los del tipo tujano, pinano y canfano (Khalid 1983).

3.2 Sesquiterpenos

Los sesquiterpenos constituyen la fraccin voltil de los aceites esenciales. Mas de 30
diferentes sesquiterpenos estn registrados con una amplia variacin de estructuras. Los
sesquiterpenos son comunes en los gneros Canarium y Commiphora, mientras que
solamente el cadineno ha sido aislado de Boswellia carteri. El gnero Canarium es un buen
productor y reserva de sesquiterpenos del grupo del elemano (elemol), el cual proviene del
precursor germacra-1(10),4-dieno. (Provan et al. 1987) aisl sesquiterpenos con esqueleto
de germacrano y de elemano de las especies Commiphora myrrha y C. holtziana.

Cadineno Elemol Germacrano

Ellos tambin reportaron algunos sesquiterpenos no aislados previamente de la familia
Burseraceae, tales como el cubebeno y el bourboneno (Provan et al. 1987).

1
14
4
10
15
7
12
11
13
OH
H
H
H
-cubebeno -bourboneno
Pinano Canfano
Tujano

Maradufu (1982) report algunos furanosesquiterpenos aislados de la especie Commiphora
myrrha, los cuales presentan principalmente el esqueleto bsico furanogermacrano, el 2-
acetil-8-12-epoxigermacra-1(10),4,7,11-tetraeno y el 2-metil-8-12-epoxigermacra-
1(10),4,7,11-tetraeno.

3.3 Diterpenos

Los gneros Boswellia y Commiphora son la fuente de la mayora de los diterpenos
reportados para la familia. Ellos forman parte de las gomarresina y son monocclicos y
macrocclicos como el a-canforeno de Commiphora mukul y Cembreno de Boswellia
frereana (Khalid 1983).

-canforeno cembreno
o
RO
2-aceti-8-12-epoxigermacra-1(10),4,7,11-tetraeno: R=Acetato
2-metil-8-12-epoxigermacra-1(10),4,7,11-tetraeno: R=Me

3.4 Triterpenos

En las resinas de las Burseraceae se encuentran triterpenos tetracclicos y pentacclicos. Los
cuales pueden ser clasificados en 4 series:

Tetracclicos : Eufano / Tirucalano
Pentacclicos: Lupano, Ursano y Oleanano

Las estructuras del tipo tetracclico Eufano / Tirucalano se caracteriza por presentar una
oxidacin en la cadena lateral del C-17, de ejemplos de los ms comnmente encontrados
son el cido elemlico y el cido isomasticadienmico. los cuales han sido aislados de
Canarium schweinfurthii y Dacryodes eludis respectivamente (Khalid 1983).

Los triterpenos de la serie del Lupano presentan 3 niveles de oxidacin; iniciando como
alcohol, pasando por cetona y terminando en cidos. Similares eventos ocurren entre los
anillos de los limonoides de Meliceas y Rutceas.
H
HO O
COOH
-cido elemlico cido isomasticadienmico

Los triterpenos de la serie del Ursano muestran un alto grado de oxidacin que se relaciona
con el anillo A, visto ya en las Burseraceas. Culminando esto con la 1,2,3-trihodroxilacin
hallada en el cido commico.

OH
H
HOOC
Lupanol cido cannarico
H
H
HO HO
HO
HO
H
COOH
-amirina cido commico

Los de la serie Oleanano muestran patrones de oxidacin similares a los del Ursano en el
anillo A, con la excepcin que no se encuentra la oxidacin en el C-1(Khalid 1983).

Entre los limonoides reportados en las Burseraceae est la cedrelona de Balsamodendron
(Commiphora) pubescens (Khalid 1983).

3.5 Esteroides

Aparte de los fitosteroles un nmero de compuestos esteroidales han sido aislados de la
resina de la droga cruda guggul (Commiphora mukul). Entre los compuestos aislados de
HO
H
-amirina cido -boswelico
H
HO
COOH
o
o
O O
OH
Cedrelona
guggul estn guggulsterol I y II, y guggulsteronal I y II (Khalid 1983). Estos compuestos
han reportado tener significativa actividad antiinflamatoria (Ramesh et al. 1996).

3.6 Fenoles

Los flavonoides son a menudo importantes en sistemtica vegetal, pero muy pocos han sido
reportados en las Burseraceae. El kaemferol, la quercetina y sus respectivos glicsidos se
han encontrado en Protium y Commiphora, pero el ms interesante ha sido la presencia de
el biflavonoide Amentoflavona en hojas de Garuga pinnata (Khalid 1983).
Tambin muy pocas cumarinas han sido reportadas, el cumarinolignoide Propacina de
Protium opacum y la 5-metilcumarina Siderina de Balsamodendron pubescens (Khalid
1983).

3.7 Varios

Los componentes de la oleo-goma-resina (incienso) de algunas especies de Commiphora se
caracterizan por una alta variedad de polisacridos que contienen principalmente galactosa,
xilosa, fucosa, arabinosa, ramnosa, cidos galacturnico y glucornico y sus derivados
metilados (>60% fraccin de goma) (Newall et al. 1996, Bruneton 1995, Evans 1996).

O
OH
R
OH
O
C
O
R1
R2
Guggulsterol I (R=OH) Guggulsterona I (R1= Me, R2=H)
Guggulsterol II (R=H) Guggulsterona II (R1=H, R2=Me)
Los frutos de las Burseraceae son ricos en cidos esterico y linoleico. Una mezcla de
teroles alifticos de cadena larga representan una nueva clase de lpidos que han sido
aislados de Commiphora mukul (Patil et al. 1973).

Alrededor de 15 aminocidos, ninguno de gran inters, han sido aislados de Commiphora
mukul. Los alcaloides son muy raros en la familia (Khalid 1983).

4. FARMACOLOGA DE LA FAMILIA BURSERACEAE.

La Bursera simaruba se utiliza en Panam como cicatrizante de heridas infectadas,
antidiarrico, nacidos o granos. En Cuba lo utilizan como tnico estomacal, en resfriados y
diarreas. En Venezuela se le considera antirreumtico. En las Bahamas se emplea para
aliviar el calor en la piel (salpullido) y para purificar la sangre. En el Darin se utiliza
contra enfermedades venreas y la obesidad. Los indgenas del Choc usan la corteza en
decoccin como depilatorio. La resina se aplica en heridas en el ombligo del bebe recin
nacido. Su savia se utiliza para curar cualquier herida infectada (Bernal & Correa 1990). En
el salvador la corteza de B. simaruba conocida como Jiote se utiliza como carminativo y
contra la diarrea. Las hojas se maceran y se utilizan en masas contra la cefalea y la resina
para sanar heridas y llagas. El extracto etanlico de hojas tiene actividad inhibitoria contra
Scherichia coli y Staphylococcus aureus (De Mena Guerrero 1994).

En Colombia la resina de Bursera graveolens se usa en forma de emplastos en hernias y
tronchaduras de los pies. Tambin se ha reportado para extraer cuerpos extraos de la piel.
Las hojas se usan contra el asma, diarrea, pleuresa, clculos en el rin, mordeduras de
serpientes y tuberculosis. Tanto las hojas y la corteza extrada en rones usada para combatir
hemorroides y aplicado localmente para lavar heridas (Bernal & Correa 1990). Adems, se
usa para aliviar dolores reumticos, Otero & Cadena (1987), evaluaron la actividad
analgsica y txica a travs de pruebas farmacolgicas especficas y se encontr que la
resina de B. graveolens tiene un efecto analgsico comparable al del cido acetilsaliclico
pero sin efectos secundarios.

En el salvador la resina de la B. graveolens conocida como copal o copalillo, se
calienta y se coloca en el miembro afectado para curar tronchaduras y sanar heridas,
tambin se usa como carminativo, para sanar llagas y luxaciones de miembros inferiores.
Los extractos acuosos y etanlicos de hojas y corteza poseen actividad inhibitorias contra
Staphylococcus aureus y adems mostraron toxicidad para los peces (De Mena Guerrero
1994).

El extracto en etanol de la planta mexicana Bursera morolensis mostr actividad citotxica
al probarla contra P- 388 linfocitos leucmico ( PS )y el carcinoma humano de la piel ( KB
). La accin contra estas dos lneas celulares se debe a los compuestos identificados como
Deosipodofilotoxina y un nuevo lignano, el 5- desmetoxideoxipodofilotoxina tambin
llamada morolensina (Jolad et al. 1977 ).

5. FORMULACIN DEL PROBLEMA.

En Colombia no se conocen reportes de estudios qumicos realizados a plantas
pertenecientes a la familia Burseraceae, en especial la especie Bursera simaruba.

6. JUSTIFICACIN DE LA INVESTIGACIN.

En Colombia esta familia est ampliamente distribuida y debido a su gran potencial
farmacolgico sera muy importante realizar un estudio qumico de la especie Bursera
simaruba ya que esta especie es exclusiva de Amrica y no existen reportes de estudios
qumicos acerca de ella.

7. OBJETIVOS.

7.1. Objetivo General.

Aislar los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en las hojas y en la corteza de la
especie Bursera simaruba.

7.2. Objetivos Especficos.

Separar y purificar, mediante tcnicas cromatogrficas, los metabolitos secundarios
mayoritarios presentes en hojas y corteza de Bursera simaruba.

Identificar mediante tcnicas espectroscpicas (Resonancia Magntica Nuclear
13
C,
1
H y
espectroscopa Infrarroja) los metabolitos secundarios mayoritarios aislados de hojas y
corteza de Bursera simaruba.

8. METODOLOGA

8.1 Mtodos aplicados al estudio qumico.

8.1.1 Extraccin por Maceracin
La cual es la trituracin mecnica del material vegetal y el contacto de este con el solvente
fro; el disolvente penetra rpidamente los rganos vegetales y disuelve junto con las ceras,
algunos colorantes y la mayora de los metabolitos secundarios. Se deja que el solvente
acte con el macerado una semana, en un frasco hermtico de color mbar o forrado para
evitar que entre luz.(Wijesekera 1984)

8.1.2 Mtodos cromatogrficos
Se denomina cromatografa a un procedimiento, en el cual una solucin de sustancias a
separar se desplaza en una direccin predeterminada por una disposicin de aparatos, por
medio de una materia slida, insoluble, inorgnica u orgnica, mas o menos finamente
repartida, siendo retenido los componentes en medida individualmente distinta. (Randerath
1965). Tambin podemos considerar como cromatografa a la distribucin de los
componentes de una muestra entre dos fases: una mvil (gas o lquido) y una fija o
estacionaria (lquido o slido)(Gros, et al 1985)

Cromatografa en capa delgada y capa delegada bidimensional(CCD y CCDB): Entre
las ventajas que presenta la cromatografa en capa delgada sobresalen su versatilidad, su
velocidad en el desarrollo y su sensibilidad. la versatilidad deriva del gran nmero de
adsorbentes diferentes disponibles en el comercio: slica gel ( el mas empleado, xido de
aluminio (almina), celita (tierra de diatomeas), hidrxido de calcio, fosfato de magnesio
,celulosa, etc. y mezcla de dos o mas de ellos.(Pedrozo, J. Conversaciones personales) Para
las cromatografas en capa delgada se utiliz slica gel 60 G Merk y como revelador
vainillina disuelta en cido sulfrico(Randerath 1965). Si los componentes de una mezcla
no son completamente separados en el desarrollo de una direccin, es posible resolverlo por
la tcnica de dos dimensiones. Primero se toman las placa de slica gel 10x10 y se le trazan
rayas perpendiculares a 1.5cm a dos de los lados obtenindose el siguiente esquema.

La placa se lleva a la cmara con el solvente 1,dejandose correr hasta la distancia L1, de
deja secar la placa, se gira 90 y se lleva nuevamente a la cmara con el solvente 2
dejndose correr hasta la distancia L2. Posteriormente se deja secar, se revela y se observa
la coloracin de las diferentes manchas(Randerath 1965).
Cromatografa en columna (CC): Esta tcnica se lleva a cabo convencionalmente
introduciendo la fase estacionaria dentro de un cilindro largo de vidrio, provisto de una
L1
L2
A
llave de paso en su parte inferior, obtenindose as una columna de material retenedor. El
cilindro puede ser cambiado por una bureta o por algn otro recipiente similar. En la CC
clsica las dimensiones de la columna son escogidas de acuerdo a la cantidad de muestra a
separar y, al tipo de adsorbente a utilizar. Por lo general, se acepta que entre mas delgada y
larga sea una columna es mucho mas eficiente ya que el camino recorrido por la muestra es
mas largo y por consiguiente, la distribucin y separacin de cada uno de sus componentes
ser ms ntida.(Pedrozo, J. Conversaciones personales)Para las cromatografas en columna
se utilizaron soportes de vidrio empacados en slica gel 60 G Merk, tamao de grano 0.063-
0200 mm.) (Randerath 1965)

8.1.3Mtodos espectroscpicos.

Espectroscopia infrarroja (IR): Los espectros infrarrojos se basan en las transiciones
vibracionales y rotacionales de los enlaces que permite indicar la presencia o ausencia de
interacciones C-O, C-N, C-S y C-halgenos; los grupos funcionales y funciones presentes (
Alcohol, carbonilo, carboxilo, amina, nitro, etc ); los sistemas insaturados ( doble y triple
enlace, anillos aromticos) y algunos detalles estereoqumicos.(Domnguez 1988)

Resonancia Magntica Nuclear (RMN
1
H y
13
C): Un espectro RMN brinda
especialmente la siguiente informacin: 1). La posicin de la lnea (su desplazamiento
qumico) que indica las caractersticas del entorno que rodea al ncleo en cuestin , 2). Las
estructura fina (dada por el acoplamiento espn-espn) que provee informacin sobre la
relacin espacial y el nmero de ncleos vecinos con espn distinto de cero y 3). El rea de
la seal que es proporcional al nmero de ncleos que contribuyen a dicha lnea. (Gros et
al 1985)
las ventajas principales de estos mtodos son su naturaleza no destructiva y el hecho de que
en muchos casos la informacin obtenida permite la asignacin inequvoca de la estructura
de un compuesto, ya que, a diferencia de otros mtodos cada lnea obtenida puede ser
asignada en general a un ncleo (o grupo de ncleos) de una molcula.

8.1.4. Constantes fisicoqumicas.
En la identificacin de las sustancias aisladas se recurri a constantes fisicoqumicas, como:
punto de fusin, solubilidad en diferentes solventes y relacin de frente.

Punto de fusin. Determinados en un fusimetro MELT-TEMP, laboratory devices. Mass
02139.

Relacin de frente (Rf): Es la relacin que existe entre la distancia recorrida por la
sustancia desde el origen hasta su desplazamiento y la distancia recorrida por el solvente
desde el origen hasta el frente del solvente (Randerath 1965).
Para el trabajo el Rf se determin en los cromatogramas de sustancias puras, en diferentes
solventes.


9.1 Recoleccin del material vegetal.
El material vegetal fue recolectado en los alrededores de Tocaima (Cundinamarca). Los
especmenes fueron determinados en el Herbario Nacional de Colombia bajo el nmero de
coleccin (COL) 472877 (anexo 1).

9.2 Obtencin de los Extractos.

Despus de haber limpiado y picado el material vegetal se peso obtenindose 1651g de
corteza y 539g de hojas. Luego se procede a hacer la extraccin.

La extraccin se hizo por medio de alcohol etlico en fro previa su destilacin en rotavapor
para aumentar la pureza, ya que es el solvente mas apto para la extraccin de material
vegetal fresco (Wijesekera 1984)

El primer paso de la maceracin consiste en pesar el material vegetal, en este caso, se
obtuvieron 1651g corteza y 539g de hojas luego se procede a la maceracin. Para cada
muestra se utilizaron 5L de solvente. Este es el mtodo mas recomendable para extraer
sustancias termolbiles ( Wijesekera 1984)

Posteriormente se procedi a filtrar cada macerado por medio de filtros de papel N 41
Whatman, para luego eliminar el disolvente de la solucin alcohlica por medio de
concentracin a presin reducida en rotavapor, a 175 mba/hpa. Seguido este procedimiento
se obtuvieron extractos concentrados llamados concretos o absolutos libres de alcohol.
Los extractos se dejaron secar por completo y finalmente fueron pesados en una balanza
analtica Sartorius, Basic BA 160p. En total se obtuvieron 58.1g de extracto absoluto de
corteza y 32.6g de extracto absoluto de hojas, para un rendimiento del 6.04% en hojas y
3.51% en corteza.

9.3 Obtencin de Fracciones

Los extractos etanlicos obtenidos se diluyeron con una solucin hidroalcohlica al 60%
v/v en EtOH. Esta solucin fue sometida a fraccionamientos L/L con ter de petrleo,
CH2Cl2 y AcOEt, respectivamente, hasta agotamiento(ver figura 6)

Figura 6. Diagrama general de obtencin de extractos y fracciones de corteza y hoja
en Bursera simaruba (L.) Sarg.

Luego de haber obtenido las fracciones de ter de petrleo

Extracto
Etanlico
Extracto
Etanlico
Extracto
Etanlico
Extracto
Etanlico
Fraccin
Eter de Petrleo
Fraccin
Diclorometano
Fraccin
Acetato de
Etilo

Fraccionamiento L/L
Eter Petrleo
Fraccionamiento L/L
Diclorometano
Fraccionamiento L/L
Acetato de Etilo
9.3.2 Obtencin de espectros.

La elucidacin estructural de los metabolitos aislados a partir de hojas y corteza de Bursera
simaruba se basa en el anlisis de los datos espectroscpicos .

Las estructuras fueron identificadas por comparacin de los datos espectroscpicos
obtenidos con los reportados en la literatura. El orden en que son presentados no obedece
necesariamente al seguido en su obtencin.

Para la obtencin de los espectros infrarrojos se utilizo un equipo Shimadzu, modelo 8300
Series FTIR, utilizando pastillas de Bromuro de Potasio (KBr).

Los espectros RMN
1
H y
13
C se realizaron disueltos en cloroformo deuterado, en un
espectmetro de Resonancia Magntica Nuclear marca JEOL FX 90 Q de 90 MHz
multinuclear (Pontificia Universidad Javeriana).

Los compuestos aislados y purificados se codificaron con las iniciales del gnero Bursera
(B) y la especie simaruba (s), el nmero que representa el orden de elucidacin del
compuesto ( 1,2,3 ) y si se aslo de corteza (C) o de la hoja (H).

En las fracciones 57-69 obtenidas de la CC del extracto de ter de petrleo (hojas),
precipit un slido amorfo, el cual se lav con metanol fro para su limpieza. El
slido
lavado fue monitoreado por CCD (fig 10(A)). A este slido se le denomin Bs1H.
De igual forma en las fracciones 70-84 precipito un slido amorfo que tambin fue
lavado
con metanol fro y monitoreado por CCD como se muestra en la figura 10(B). a este slido
se le denomino Bs2H el cual fue sometido a estudios espectroscpicos.
Las otras fracciones de la CC del extracto ter de petrleo (hojas) se encuentran an en
estudio.
Figura 10. Fracciones 57-69 (A) y 70-84 (B) de hojas corridas en Petrol-AcEt 9:1
A B

9.3.1.2 Fraccin Eter de Petrleo (corteza)
Se pesaron 4g de fraccin ter de petrleo (corteza) y se sometieron a una CC empacada en
100g de slica gel 60G. la CC se eluy con mezclas de ter de petrleo -CH
2
Cl
2
relacin 9:1
de polaridad creciente, con CH
2
Cl
2
y con AcOEt hasta terminar con EtOH. Se colectaron
180 fracciones de 125ml aproximadamente, que se monitorearon por CCD.
En la fraccin 78-83, precipit un slido amorfo el cual se lav sucesivamente con metanol
fro, se monitoreo por medio de CCD y se determin que estaba puro. Este slido se
compar cromatograficamente con las fracciones 84-89 mostrando ser el mismo compuesto
(fig 11 A y B) por ello se procedi a unirlos. A este slido se le denomin Bs3C y fue
sometido a estudios espectroscpicos.
Figura 11. Fracciones 78-83 (A) y 84-89 (B) de corteza corridas en ter de petrleo -
AcOEt 9:1
A B
10.RESULTADOS

10.1 Compuesto Bs1H.

Slido amorfo, con punto de fusin 134-136C; Rf 0.57 en CCD, empleando ter de
petrleo:AcOEt 9:1 como fase mvil. Soluble en ter de petrleo, CH2Cl2, CHCl3 e
insoluble en Metanol (MeOH). El slido an se encuentra en estudio ya que lcantidad hasta
ahora aislada ha sido insuficiente par efectuar las pruebas espectroscpicas.

10.2. Compuesto Bs3C.

Slido blanco de forma irregular con punto de fusin 176-178C; Rf de 0.57 en CCD
empleando una mezcla ter de petrleo:AcOEt 9:1 como fase mvil. Mostr una mancha de
color violeta al revelado con vainillina/ H
2
SO
4
. El compuesto es soluble en ter de petrleo,
CH
2
Cl
2
y CHCl
3
e insoluble en MeOH.

La muestra disuelta en cloroformo deuterado (CDCl
3
) fue sometida a estudios de
espectroscopa de RMN, obtenindose los espectros RMN
1
H como se observa en la figura
13 cuyos datos se muestran en la tabla 1; y el espectro de RMN
13
C de la figura 14 cuyos
datos se muestran en la tabla 2 del compuesto. De otro lado el espectro IR realizado en
pastilla de KBr, se muestra en la figura 15.

Tabla 1. Datos espectroscpicos de RMN
1
H del compuesto Bs3C y sus respectivas
asignaciones (CDCl
3
90 MH
z
) comparado con bibliografa (Perea 1994)

Desplazamiento
qumico d (ppm)
obtenidos
Desplazamiento
qumico d (ppm)
segn Perea 1994
Seal Asignacin de grupos a los
hidrgenos
5.15 5.20 t H-C=
3.2 3.24 t H-C-OH
1.28-1.68 m CH, CH
2

1.10 Mltiples seales CH
3
1.05 s CH
3

1.02 s CH
3

0.98 s CH
3

0.82 s CH
3

0.76 s CH
3

0.71 s CH
3

Tabla 2 Datos espectroscpicos de RMNC
13
del compuesto Bs3C (CDCl
3
90
MH
z
).comparado con bibliografa (Conolly 1991)
Carbono Desplazamiento qumico
d (ppm) a-amirina segn
Conolly 1991
Desplazamiento qumico d
(ppm) a-amirina obtenido
Desplazamiento qumico
d (ppm) amirina segn
Conolly 1991
Desplazamiento
qumico d (ppm)
amirina obtenido
1 38.5 38.5
2 27.2 27.0
3 78.8 79.3 78.9 79.3
4 38.7 38.7
5 55.2 55.1
6 18.3 18.3
7 32.9 32.6
8 40.0 39.7
9 47.7 47.6
10 36.9 37.0
11 17.4 33.4
12 124.3 124.6 121.7 121.9
13 139.3 139.8 145.0 145.4
14 42.0 41.7
15 28.7 28.3
16 26.6 26.2
17 33.7 32.5
18 58.9 59.3 47.2 47.5
19 39.6 39.9 46.8 41.8
20 39.6 39.8 31.1 31.3
21 31.2 31.5 34.8 33.2
22 41.5 37.2
23 28.1 28.1
24 15.6 15.5
25 15.6 15.5
26 16.8 16.8
27 23.3 26.0
28 28.1 27.3
29 23.3 17.7 33.2 33.5
30 21.3 21.6 23.6 23.5

Figura 13.Espectro de RMN
1
H del compuesto Bs3C (CDCl
3
90 MH
z
)
Figura 14.Espectro de RMN
13
C del compuesto Bs3C (CDCl
3
90 MH
z
)
C-13
C-13
C-12
C-12
C-3
C-18
C-30
C-18
C-30
H-C= H-C-OH
CH3
CH3
CH3

Nota: en Donde E= estiramiento, F= flexin, C= confirmacin.
Figura 15. Espectro IR en pastilla de KBr del compuesto Bs3C.
10.3 Compuesto Bs2H.
Slido blanco de forma irregular con punto de fusin 138-140C; Rf de 0.35 empleando
una mezcla ter de petrleo:AcOEt 9:1 como fase mvil. Mostr una mancha de color caf
rojizo al revelado con vainillina/ H
2
SO
4
positivo para prueba Lieberman Burchad. El
compuesto es soluble en ter de petrleo, CH
2
Cl
2
y CHCl
3
3
espectroscopia de RMN, obtenindose los espectros RMNC
13
cuyos datos se muestran en la
tabla 3, y en la figura 16, y el espectro RMNH
1
figura 17. De otro lado el espectro IR que
se realiz en pastilla de KBr se muestra en la figura 18 y sus datos correspondientes en la
tabla 4
E. OH
E. CH(CH CH ) 2 3
E. C=C
F. CH(CH ) 2
F. Ch3
C. OH
Tabla 3. Datos espectroscpicos de RMN
13
C

del compuesto Bs2H (CDCl
3
90 MH
z
)
comparado con bibliografa (Khan 1997)
Nmero del
carbono
Desplazamiento qumico para
- sitosterol (Khan 1997)
Desplazamiento
qumico para Bs2H
Asignacin
1 38.55 37.6 CH
2
2 27.2 27.0 CH
2

3 77.8 72.0 CH
4 41.2 42.7 CH
2

5 142.0 141.3 C
6 122.7 121.8 CH
7 33.05 32.2 CH
2

8 33.7 32.4 CH
9 51.7 50.7 CH
10 37.4 36.9 C
11 22.7 21.4 CH
2

12 39.26 40.2 CH
2

13 41.1 40.2 C
14 57.2 57.7 CH
15 25.3 24.5 CH
2

16 30.2 29.8 CH
2

17 54.69 56.7 CH
18 12.24 12.1* d CH
3
19 19.4 19.3 CH
3

20 34.9 34.5 CH
21 19.1 19.0 CH
3

22 35.1 36.4 CH
2

23 29.3 28.3 CH
2
24 49.5 46.4 CH
25 25.9 24.5 CH

26 19.8 19.5 CH
3

27 20.1 19.9 CH
3

28 23.7 23.6 CH
2
29 12.3 12.1* d CH
3

Nota: seales con * y d, pueden ser intercambiables.

Figura 16. Espectro de RMN
13
C del compuesto Bs2H (CDCl
3
90 MH
z
)
Figura 17. Espectro de RMN
1
H del compuesto Bs2H (CDCl
3
90 MH
z
)
C-5
C-6
C-3
C-4
C-9
C-14
C-17
C-18
H-C=
H-C-OH
CH3
CH3
CH3
CH3

Figura 18.Espectro IR en pastilla de KBr del compuesto Bs2H
Tabla 4. Datos IR del compuesto Bs2H.
BANDA( cm
-1 )
ASIGNACIN
3336.5 Estiramiento OH
2937.4 Estiramiento C-H ( CH
2,
CH
3
)
1660 Estiramiento C=C
1465.8 Flexin C-H
1380.9 Flexin CH
3
1053.1 Confirmacin O H
E. OH
E. CH(CH ,CH ) 2 3
E. C=C
F. C-H
F. CH3
C. OH

10.4 Compuesto Bs4C.
La fraccin de ter de petrleo (corteza) al ser eluida con CH2Cl2 se pudo observar un
compuesto que revela al ultravioleta dando una coloracin fluorescente ( azul ) como se
observa en la figura 19. Debido a que no se pudo purificar por medio de CC, se realizo una
cromatografa preparativa con el fin de obtener la sustancia Este compuesto an se
encuentra en estudio debido a la poca cantidad que se ha obtenido por medio de
cromatografa preparativa.
Figura 19. Revelado con luz ultravioleta del compuesto Bs4C en columna
cromatogrfica.
11. ANLISIS DE RESULTADOS

Compuesto Bs3C

Muestra en su espectro RMNH
1
siete seales para -CH
3
( 0.1ppm, 0.76ppm, 0.82ppm,
0.98ppm, 1.02ppm, 1.05ppm, 1.10ppm), una seal 3.2ppm que corresponde a un H
carbinlico y una seal a 5.15ppm que corresponde a un H de un carbono vinlico lo que
indica la presencia de un doble enlace. Los datos anteriores se corroboran con los datos del
espectro IR donde se observan seales a 3313.5cm
-1
correspondientes al estiramiento del
OH, tambin existe una seal a 1660cm
-1
que corresponde a un estiramiento C=C, que
corrobora la seal del espectro RMN
1
H donde aparece un H de un carbono vinlico. Por
ltimo, el espectro RMN
13
C muestra 30 seales dentro de las cuales se resaltan (en ppm.):
139.8, 145.4, 124.6, 121.7, 79.3,59.3, 47.5, 39.9, 41.8, 39.8, 31.3, 31.5, 33.2, 17.7, 33.5,
21.6, 23.5, Los espectros RMN
1
H y
13
C fueron comparados con la literatura (Connolly
1991, Vanderland et al 1991)y estas seales nos indican la presencia de una mezcla de dos
compuestos, a la vez tambin nos corroboran lo expresado en las dems pruebas, es decir
que el compuesto Bs3C posee un doble enlace y que presenta un grupo OH.

De toda la informacin anterior se podra inferir que el compuesto Bs3C es una mezcla de
a-amirina y -amirina (triterpeno pentaciclico con funcin OH en C-3). Esto lo confirman
las seales del espectro RMN
13
C, ya que a-amirina segn la literatura presenta un
desplazamiento de 124.3 ppm caracterstico del C-12 y 139.3 ppm, caracterstico del C-13
que indican la presencia del doble enlace y la -amirina presenta desplazamientos de 121.7
ppm asignado al C-12 y 145 ppm asignado al C-13 tambin indicando el doble enlace y un
desplazamiento 78.9 caracterstico del C-3 que indica la presencia de la funcin OH para
ambas sustancias Lo cual coincide con los resultados obtenidos. Por lo tanto se proponen
las siguientes estructuras:

a -amirina
HO
H
HO
H
H
-amirina
Compuesto Bs2H

Muestra en su espectro RMN
1
H siete seales para -CH
3
( 0,68ppm, 0.88-0.90ppm, 0.91pm,
102ppm), una seal 3.5ppm que corresponde a un H carbinlico y una seal a 5.35ppm que
corresponde a un H de un carbono vinlico lo que indica la presencia de un doble enlace,
adems, la mayora de seales se encuentran concentradas entre d 0.5 2.5 ppm. Esta
caracterstica es tpica de Terpenos ( Shoorely & Rogers 1958).

El espectro IR(fig 18 ) presenta bandas de absorcin a 3336.3 caracterstica de una tensin
OH y en 1660 caracterstica de un C=C lo que estara corroborando lo presentado en el
espectro RMN
1
H.

El espectro RMN
13
C muestra 27 seales entre las cuales se destacan 141.3 ppm, 121.8 ppm,
que corresponden a carbonos olefnicos, y 72 ppm que corresponde a la funcin alcohol del
C-3, confirmando la insaturacin y la funcin alcohol que se observa en los espectros IR y
RMN
1
H.

Toda la informacin anterior sumado a las pruebas fisicoqumicas nos hace presumir que el
compuesto en mencin es de tipo esteroidal. Debido a esto se efectuaron

comparaciones con la literatura (Khan 1997)(Tabla 4) encontrndose mucha similitud entre
las seales de los espectros de RMN
13
C obtenidos con sitosterol. Vale la pena aclarar, que
el solvente que se utiliz para disolver la muestra de Bs3C es el mismo que se utiliz para
obtener los espectros reportados en la literatura (CDCl
3
). Por lo tanto los datos reportados
se pueden comparar con los datos obtenidos, ya que estos presentaran los mismo
desplazamientos que los reportados en la literatura.

Con el conocimiento de que el compuesto es un terpeno esteroidal, adems de las
coincidencias de los espectros de RMN
13
C, RMN
1
H, e IR, se propone la siguiente
estructura.

- SITOSTEROL

12. CONCLUSIONES

Los compuesto aislados de la especie Bursera simaruba fueron identificados por medio de
comparacin como a-amirina y -amirina y -sitosterol.

Los compuestos a-amirina y -amirina se encuentran nicamente en corteza mientras que
- sitosterol se encuentra nicamente en las hojas.

a-amirina, -amirina y - sitosterol son compuestos de media polaridad.

HO
H H
H
13. RECOMENDACIONES

Debido a que hasta la fecha no se haban hecho reportes sobre el estudio fitoqumico de las
hojas y la corteza de las especie Bursera simaruba, se recomienda continuar el trabajo de
aislamiento purificacin y determinacin de estructuras qumicas ya que esta especie podra
tener gran potencial farmacolgico como lo poseen otras especies de la misma familia que
han sido estudiadas.

14. REFERENCIAS.

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A B C

1

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE LOS

EXTRACTOS TOTALES Y FRACCIONES AISLADOS DE

Bursera simaruba (Burseraceae).

GINNA LILIAM CAMACHO MEDINA

Director
Jorge Robles, Ph.D

Coodirector
Martha Ramirez, MSc



FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS

CARRERA DE BIOLOGA


2002

2

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA DE LOS

EXTRACTOS TOTALES Y FRACCIONES AISLADAS DE

Bursera simaruba (Burseraceae).

GINNA LILIAM CAMACHO MEDINA

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el titulo de
BIOLOGA.


FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS

CARRERA DE BIOLOGA


Abril de 2002

3
RESUMEN

En el presente trabajo, se determin el efecto antiinflamatorio de los extractos
etanlicos de hojas y corteza y de las fracciones de hojas de Diclorometano y ter de
Petrleo, obtenidos de Bursera simaruba, perteneciente a la familia Burseraceae, que
ha sido utilizada en la medicina popular en el tratamiento contra el reumatismo, como
cataplasma antiinflamatorio, contra la mordedura de serpientes entre otras.
Las sustancias se evaluaron por el mtodo Edema Plantar, en ratas hembras con un
peso entre 140-170g. Las dosis probadas fueron de 100mg/Kg y 300mg/Kg para los
extractos etanlicos y de 300mg/Kg para las fracciones.
Todas las sustancias exhibieron una actividad antiinflamatoria. El mayor efecto para
los extractos totales a dosis de 300mg/Kg y para el extracto de hojas a 100mg/Kg
se present a la tercera hora de medicin y la mayor actividad del extracto de corteza
a dosis de 100mg/Kg se encontr a la tercera hora y se mantuvo hasta la quinta,
siendo estos comportamientos de un nivel comparable al presentado por el patrn
indometacina a la dosis de 5mg/Kg.
Por otra parte la actividad de las dos fracciones estudiadas (Diclorometano y ter de
petrleo) se encontr a la primera hora de medicin, es decir que poseen un efecto
antiinflamatorio bastante rpido.

4
1. INTRODUCCIN
La familia Burseraceae ha sido muy estudiada durante los ltimos 20 aos, ya que se
han destacado sus propiedades famacolgicas dentro de las cuales se encuentran
actividades antiinflamatorias (Duwiejua, 1993; Singh et al., 1996), antivirales
(Roming, et al., 1992), hepatoprotectoras (Annad, et al., 1992), para el tratamiento
contra insectos (Becerra, 1994), adems de estudios sobre las lneas celulares
cancergenas (Al-Harbi et al., 1994).
Bursera simaruba, es una planta con varios usos en la medicina tradicional como la
extraccin de espinas, el suero para la mordedura de culebras, para prevenir la
extensin de la gangrena (Garcia-Barriga, 1992), como cicatrizante de heridas
infectadas, antidiarrico, contra nacidos o granos, para la curacin de lceras y
enfermedades venreas entre otros (Bernal & Correa, 1990). Adems de su
importancia en la medicina tradicional, se usa tambin en la parte ornamental y
maderable.
El conocimiento de las propiedades teraputicas de las plantas es de gran importancia
para los profesionales de las ciencias, debido a que la poblacin la usa con propsitos
medicinales y en algunos casos se utilizan de manera indiscriminada, generando no
slo perdidas exageradas en el material vegetal, sino adems un alto riesgo para la
salud de los individuos; por esta razn es importante conocer e investigar sobre las
plantas medicinales y sus propiedades farmacolgicas, principios activos, mtodos de
preparacin y extraccin, dosis de administracin, contraindicaciones y dems
caractersticas que permiten de alguna manera colaborar con la prevencin de sus

5
usos incontrolados y de las circunstancias que pueden ser perjudiciales para la salud
(Ritch et al., 1996).
Por las razones expuestas anteriormente, con este trabajo se pretende contribuir de
alguna manera con el estudio de actividades farmacolgicas, como lo es la
determinacin de la actividad antiinflamatoria de los extractos etanlicos aislados de
hojas y corteza de Bursera simaruba, y de las fracciones de Diclorometano y Eter de
Petrleo de las hojas de la misma planta de la familia Burseraceae, pretendiendo con
ello generar resultados de gran importancia, que proporcionen una base para futuras
investigaciones de la misma especie de la cual la informacin registrada hasta el
momento es escasa.

6
2. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1 FAMILIA BURSERACEAE
2.1.1 GENERALIDADES
La familia Burseraceae fue descrita por primera vez por Kunth en 1824 y fue
modificada parcialmente por Engler en 1931, dicha familia presenta la siguiente
clasificacin taxonmica (Cuatrecasas, 1957):
Reino Vegetal
Divisin Angiospermae
Clase Magnoliopsida
Orden Sapindales
Familia Burseraceae
En la actualidad, son reconocidos 18 gneros con ms de 600 especies, distribuidas
por los pases de Amrica tropical, Malasia y el Noroeste de Africa. De los 18
gneros, ocho se encuentran en el continente americano y seis de ellos son endmicos
(Bursera, Crepidospemum, Hemicrepidospermum, Paraprotium, Tetragastris y
Trattinickia), los otros dos (Dacryodes y Protium se encuentran tambin en el viejo
mundo (Cuatrecasas, 1957).

2.1.2 DESCRIPCIN DE LA FAMILIA BURSERACEAE
Est constituida por una gran variedad de rboles o arbustos de 5-20m de altura con
canales resinferos y balsamferos en la corteza (Gentry, 1993). Hojas
imparipinnadas, alternas generalmente sin estpulas. Flores pequeas perfectas o

7
polgamo-diicas en panculas axilares, terminales o subterminales, por lo general
glabras rojizas, cliz con tres a cinco spalos imbricados o valvares, ptalos tres a
cinco, libres o raramente connados, imbricados o valvados en el capullo, un disco
anular cupuliforme libre o soldado al cliz, estambres iguales o desiguales, insertos
en la margen o en la base del disco, anteras con dos tecas (Garcia-Barriga, 1992).
Ovario spero con dos a cinco carpelos trgonos, ovoide o globoso, estigma simple o
con dos a cinco lbulos, placentacin axial, usualmente con dos lbulos en cada
lculo (Garcia-Barriga, 1992). Fruto en drupa, dehiscente, en dos a cinco valvas o
indehicente, pericarpo carnoso, mesocarpo a menudo carnoso o musilaginoso,
subglobulares, puntiagudos en ambos extremos, ligeramente angulados, verdes hasta
rosado brillante (Bernal & Correa, 1990).
Las familias que mas se confunden con Burseraceae son Anacardiaceae que difiere
en el nmero de vulos y en su orientacin y la Sapindaceae que difiere en su olor
vegetativo y sus flores pubescentes (Gentry, 1993).

2.1.3 DISTRIBUCIN GEOGRFICA DE LA FAMILIA
Esta familia se encuentra ampliamente distribuida en todas las regiones tropicales y
subtropicales del planeta, con mayor abundancia en las reas ridas del Noreste de
Africa, Arabia, Amrica tropical, Asia, Australia y Madagascar (Ruiz & Susunaga,
2000).
Los seis gneros de la familia Burseraceae en Colombia, se diferencian en cuanto al
nmero de especies de cada uno y su distribucin. Los gneros que presentan mayor
riqueza de especies en orden descendente son: Protium (51 spp), es la que presenta la

8
distribucin ms amplia y cubre el mayor nmero de formas de vida. Bursera (7 spp),
encontrado en el Csar, Choco, Valle del Magdalena y en el Archipilago de San
Andrs y Providencia. Trattinnickia (4 spp), se localiza al sur del pas,
Cundinamarca, Valle y Antioquia. Crepidospermum (3 spp), se presenta en todas las
regiones naturales, especialmente en la Orinoqua y Amazona y Tetragastris (3 spp),
se reporta en los departamentos de Choc, Boyac, Santander, Magdalena y Caquet
(Bernal & Correa, 1990).
Esta amplia distribucin de la familia en nuestro pas muestra la importancia que
presenta y la gran cantidad de investigaciones que se pueden generar en torno a su
diversidad.

2.1.4 QUMICA DE LAS BURSERACEAE
La mayora de las especies presentan una oleo-goma-resina al presentarse algn dao
en su corteza. Dicha sustancia est compuesta por terpenoides. Los componentes
voltiles son a menudo diterpenos y triterpenos. Tambin se presentan otro tipo de
metabolitos secundarios que son los compuestos fenlicos tales como flavonoides,
cumarinas y varios lignanos (Khalid, 1983).

2.1.4.1 Monoterpenos
Los aceites esenciales de las Burseraceae estn compuestos principalmente por
monoterpenoides y sesquiterpenoides (Khalid, 1983).

9
La variedad de monoterpenos acclicos detectados o aislados cubre todos los grupos
asociados con sta clase. Los ms comunes son Mirceno, Citronellol, Linalool y
Geraniol o sus acetatos (Khalid, 1983).
Los monoterpenos monocclicos son usualmente la clase dominante de la familia,
con Limoneno, a-felandreno, y p-cimeno particularmente bien distribuidos. Adems
se encuentran derivados monocclicos como aldehidos, cetonas y en menos frecuencia
los cidos (Khalid, 1983).
Monoterpenos bicclicos incluyen los de tipo tujano, pinano y canfano (Khalid,
1983).

2.1.4.2 Sesquiterpenos
Se encuentran registrados ms de 30 con una amplia variacin de estructuras. Los
sesquiterpenos son comunes en los gneros Canarium y Comiphora (Khalid, 1983).
Tambin se han reportado algunos sesquiterpenos no aislados previamente de las
Burseraceae, tales como a-cubebeno y -bourboneno (Provan et al., 1985; Provan et
al., 1987 citado de Ruiz & Susunaga, 2000).

2.1.4.3 Triterpenos
En las resinas de las Burseraceae se encuentran triterpenos tetracclicos y
pentacclicos, los cuales pueden ser aislados en cuatro series:
Tetracclicos: Euphano, Tirucalano, los cuales presentan una oxidacin en la cadena
lateral del C-17, entre ellos se encuentran comnmente los cidos elemlico y
isomasticadienmico (Khalid, 1983); los cuales han sido aislados de Canarium

10
scheweinfurhii y Dacryoides eludis (Robles, 2000). Los compuestos de este tipo
tienen la capacidad de sufrir modificacin en la cadena lateral, la ciclacin de ellos a
llevado a la obtencin de Sapelina A y B, los cuales han sido aislados de Bursera
klugii. (Robles, 2000)
Pentacclicos: Lupano, Ursano y Oleano.

Figura No 1: Triterpenos pentacclicos
Los triterpenos de la serie lupano presentan tres niveles de oxidacin, iniciando como
alcohol, pasando por cetona y terminando en cidos (Khalid, 1983).
Por su parte los de la serie Ursano (ver figura No 1) muestran un alto grado de
oxidacin que se relaciona con el anillo A, presentando un mximo de oxidacin
como el de la 1,2,3-trihidroxilacin hallada en el cido commico, una de las
manifestaciones que se han notado en los quassinoides de las Simarubceas.
Tambin se han encontrado oxidaciones que envuelven el C-11 del anillo C, por
ejemplo la presencia de Acetato en 11-hidroxi-a-amirina y 11-oxo- a-amirina,

11
obtenidos de Canarium strictum y otras oxidaciones como el Metil-ester del cido
Boswelico aislado de Boswelia serrata (Khalid, 1983; Robles, 2000).
Los triterpenos de la serie Oleano muestran patrones de oxidacin similares a los de
Ursano en el anillo A, con la excepcin que no se encuentra la oxidacin en el C-1,
tambin se encuentran compuestos con oxidacin en el anillo A y C (Khalid, 1983).

2.1.4.4 Fenoles
Los flavonoides son importantes en sistemtica vegetal pero han sido muy poco
reportados en la familia Burseraceae. El kaemferol, la quercetina y sus respectivos
glicsidos se han encontrado en los gneros Protium y Commiphora, pero el ms
interesante ha sido la presencia del biflavonoide Amentoflavona en hojas de Garuya
pinnata (Khalid, 1983).
Al igual que los flavonoides, las cumarinas han sido poco reportadas, solo se
encuentran el cumarinolignoide Propacina de la especie Protium opacum y la 5-
metilcumarina Siderina de Balsamodendron pubescens (Khalid, 1983).

2.2 BURSERA SIMARUBA
2.2.1 SINNIMOS
Bursera simaruba, es conocida con los nombres de: Pistacia simaruba (Linneo),
Bursera gumminifera (Linneo), Elaphrium simaruba (Linneo). Rose y Terebinthus
simaruba (Linneo) W.F. Wight in Rose. (Bernal & Correa, 1990; Garcia-Barriga,
1975)

12
2.2.2 NOMBRES COMUNES
En Colombia: Almacigo, Ara, Caratejo, Faca-naca, Indio desnudo, Indio en cuero,
Palo mulato, Resbala mico, Resbala mono.
En Panam: Almacigo, Carate, Cholo pelao, Indio desnudo, Indio en cuero.
En Venezuela: Almacigo, Caraa, Cucheme, Indio desnudo, Jobo liso, Mara, Mararo,
Palo de incienso, Pellejo de indio, Picagua (Bernal & Correa, 1990).

2.2.3 DESCRIPCIN DE LA ESPECIE
rbol resinoso aromtico de corteza amarilla pardusca o rojiza, papircea y caediza,
de unos 25m. de alto; ramillas glabras y engrosadas; hojas caducas, pinnadas, de
raquis no alado con cinco a siete folios glabros o escasamente pilosos, ntegros,
coriceos o subcoriceos, ovados u oval-oblongos, acuminados y de base redondeada
con nerviacin prominente en el envs y retculo promnulo en ambas superficies
hasta de 5-12cm. de longitud; panculas subterminales, glabras, de 4-8cm;

13
Flores pentmeras, glabras, verdosas o amarillentas, aromticas, con tres estigmas;
fruto drupceo, subovoide 6-12mm por 7-8mm de dimetro, dehiscente, trivalval,
rojizo en la madurez, nculas duras de 8-9mm por 6mm. (Garcia-Barriga, 1992;
Gentry, 1993).

2.2.4 DISTRIBUCIN GEOGRFICA
Bursera simaruba se distribuye a travs de la regin del Caribe, ocurre desde la costa
norte de Mxico a travs de Amrica Central y sur de Florida, las Indias occidentales,
hasta Panam, Colombia y Venezuela (Lecciones hipertextuales de botnica, va
internet).
En Colombia, ha sido registrada para los departamentos de Cundinamarca (de
Girardot a Tocaima), Guajira (Cuatro leguas al este de Carraipa) y Magdalena
(Tucurinca), en alturas de 100 a 350 m.s.n.m (Bernal & Correa, 1990).

2.2.5 USOS
En la medicina popular panamea se usa como cicatrizante de heridas infectadas,
antidiarrico y para los granos (Bernal & Correa, 1990).
En las Indias Orientales la goma fragante de este rbol se usa para incienso de
iglesias (Garcia-Barriga, 1992; Duke, 1987; Bernal & Correa, 1990;).
En la provincia del Darin el t de las hojas de esta especie se usa para tratar
enfermedades venreas y la obesidad. Los indgenas chocoanos aplican una
decoccin de la corteza al cuerpo tres veces al da por su accin depilatoria. La resina
se usa para tratar heridas y es aplicada al ombligo del recin nacido (Duke, 1987).

14
En Cuba se usa como tnico estomacal, en resfriados y diarreas. Tambin se emplea
como diurtico y antiespasmdico. La resina es diafortica. La corteza se utiliza en
las fiebres intermitentes y persistentes. En Venezuela se le considera antirreumtico.
Las hojas detienen hemorragias gstricas y las semillas sirven para la mordedura de
serpiente. La decoccin de la corteza se usa para el cncer de estmago (Giraldo,
1997).
En Costa Rica la gomarresina de esta planta, es usada para la curacin de lceras y de
enfermedades venreas. Los indgenas la emplean contra la diarrea y como
insecticida. La infusin de los renuevos, se ha empleado como abortivo (Giraldo,
1997).
De acuerdo con Garcia-Barriga (1992) la resina que se obtiene del tronco es usada
para la extraccin de espinas y contra la mordedura de serpientes. Las hojas usadas en
forma de cataplasma se emplean en casos de gangrena para evitar o prevenir que se
extienda. Los tallos en decoccin se utilizan en el departamento del Tolima
(Colombia) con el fin de adelgazar. Tambin se afirma que es un buen remedio para
el hgado y la tiroides.
En Exumas y Long Island (Bahamas), la emplean para aliviar el "color de la piel"
(salpullido) y para refrescar la sangre, preparando un t con las hojas. Para sanar la
presin arterial baja se hierve la corteza con azcar (Garcia-Barriga, 1992).
Esta planta, empleada al principio como sudorfico utilizando la infusin de sus hojas,
hoy esta muy en boga su tronco para adelgazar. Con este propsito se fabrican unas
artesas en las cuales se deposita el agua que se ha de beber o tambin colocan
tronquitos en las vasijas del agua. En el departamento del Magdalena (Colombia), lo

15
emplean para curar las enfermedades del rin. Su madera, de mala calidad para
construcciones, arde fcilmente pero no da mucho calor (Duke, 1987; Bernal &
Correa, 1990).
En la medicina popular de Venezuela, emplean las hojas de B.simaruba como
antirreumtico y en forma de cataplasmas, aplicadas localmente contra la gangrena.
La infusin de la madera como sudorfico, el cocimiento de la corteza para costringir
poros y fortificar el cuerpo; el tallo en decoccin para adelgazar, para el hgado y
tiroides.
De la misma manera se indica que esta especie a menudo se planta como estaca viva
en las cercas y que en Mxico emplean su madera para fsforos o para enchapes de
centro.(Lecciones hipertextuales de botnica va Internet).

2.2.6 HISTORIA NATURAL
Las flores atraen agentes polinizadores como abejas sin aguijn, moscas, hormigas,
escarabajos etc. Despus de ser fecundadas las flores, los frutos alcanzan un tamao
mayor de 9 mm de dimetro en menos de una semana y dura 8 meses antes de que se
maduren y dispersen. Los frutos maduran a mediados de la estacin seca.
Los frutos de Bursera simaruba son comidos por monos carablanca (Cebus
capucinus) , los cuales extraen y consumen nicamente las semillas secas; mastican y
desechan las flores. As como el mono araa (Ateles geoffroyi) y algunas ardillas
como la (Sciurus variegatoides) que tambin se alimentan de este fruto.
Tambin existen algunas especies que utilizan el Indio Desnudo como hospedero tal
es el caso de la avispa (Synosca surinama) quin utiliza la corteza para fabricar sus

16
panales y el coleptero (Brentus anchorago), un gorgojo que pone sus huevecillos en
un hueco en la madera en descomposicin del Indio Desnudo (Lecciones
hipertextuales de botnica. Va Internet).

2.3 FARMACOLOGA DE LAS BURSERACEAS
Las diferentes especies de la familia Burseraceae han sido objeto de diversos estudios
farmacolgicos, en los que se incluyen estudios antiinflamatorios, antifngicos,
hepatoprotectores, analgsicos entre otros.

2.3.1 ESTUDIOS ANTIINFLAMATORIOS
En plantas de varias familias, entre ellas la familia Burseraceae se encuentran los
iridoides que constituyen un gran grupo de monoterpenos. Se consideran estos como
agentes antiinflamatorios, ya que fueron probados doce de ellos con dos modelos: 1.
Edema inducido por carragenina en pata de ratn y 2. Eritema en oreja de ratn, los
resultados mostraron la relacin entre la estructura y la actividad antiinflamatoria
sobre la base de diferentes patrones de substitucin, entre ellos hidroxilacin,
insaturacin y ciclacin (Recio, et al., 1993).
Las Burseraceas son tiles por las resinas que segregan y por la madera. Son famosas
las gomorresinas de incienso y mirra, producidas por especies africano-arbigas de
Boswellia y Commiphora y la oleorresina de Manila, que mana de las cortezas de
especies de Filipinas de Canarium (Duweiejua, 1993; Robles, 2000).
En el estudio realizado por Siani y colaboradores (1999) se encuentra que los aceites
de varias especies del gnero Protium (P.grandifolium; P. lewellyni; P. hebetatum)

17
presentan actividad antiinflamatoria, ya que inhiben la acumulacin de neutrfilos en
la cavidad pleural del ratn.
El extracto en etanol de la resina de Boswellia serrata, se usa en el tratamiento de
enfermedades inflamatorias en la India, mostrando inhibicin en la produccin de
Leucotrieno 4 5-HETE. De esta planta se aisl el cido boswelico como principio
activo que inhibe la sntesis de Leucotrieno a travs de la va 5-lipooxigenasa
(Ammon et al.,1993).
En el noroeste africano, los extractos totales de la goma de Boswellia carteri son
usados como inhibidores del edema tanto mximo como total en la inflamacin
inducida por carragenina en la pata de ratn analizado en un periodo de 6 horas
(Duweiejua, 1993).
De igual manera se encontr actividad antiinflamatoria en el extracto acuoso de la
resina de Comiphora incisa, la cual es atribuida a los derivados de tipo triterpeno
mansumbinona y cido 3,4-seco-mansumbinico (triterpeno degradado) que al
probarse separadamente dieron una alta actividad comparada con la de los
antiinflamatorios comerciales Indometacina y Prednisolona (Duweiejua, 1993)
El extracto acuoso de la resina de Commiphora mukul ha mostrado una significante
actividad antiinflamatoria y una fuerte accin en la disminucin de colesterol en la
sangre. De la resina de esta planta se han aislado e identificado guggulsterol I y III a
los cuales se les ha comprobado su actividad antiinflamatoria. Adems se han aislado
guggulsterona I (E-guggulsterona) y II (Z-guggulsterona), los cuales son los
principios activos en la disminucin de grasas en la sangre, se ha verificado que
actan a nivel de la glndula tiroides (Newall, et al., 1996)

18
Por otra parte se ha demostrado la actividad antiinflamatoria de los acidos
Boswellicos en edemas inducidos por carragenina en ratas y ratones, ya que se genera
una permeabilidad vascular y se inhibe la migracin de leucocitos en el edema
generado (Singh, 1996).
Fourie & Snyckers (1989) descubrieron un nuevo triterpeno pentacclico (2a,3,23-
trihidroxiolean-12 eno) aislado de las races de Commiphora merkeri, el cul posee
no solo una actividad antiinflamatoria, sino tambin analgsica. Dicho triterpeno fue
medido oralmente, despus de la induccin del edema por carragenina en ratas.

2.3.2 ESTUDIOS CON BURSERA SIMARUBA
Se ha comprobado la actividad inhibitoria del extracto etanlico de hojas, contra
Escherichia coli y Staphylococus aureus (De Mena Guerrero, 1994).
Por su lado Ruiz & Susunaga (2000) establecieron la actividad antimicrobiana
presente en las partes areas de B. simaruba y B graveolens, frente a
microorganismos como Agrobacterium tumefaciens, Erwinia carotovora, Fusarium
oxysporum, Trichoderma viride y Botrytis cinerea.
Se encontr que el CHCl
3
extrado de las resina de B. simaruba tuvo actividad
biolgica al probarse en agua de camarones. Despus de varias purificaciones
cromatogrficas se obtiene un metabolito biolgicamente activo identificado como 1-
ariltetranaptil lignano lactona (Peraza & Pea, 1992).

19
2.3.3 ESTUDIOS GENERALES
En Asia son muy usadas en medicina tradicional, las oleo-resinas que emanan de las
especies de Burseraceae. El extracto etanlico de frutos y races de Canarium
album, se usa en China para el tratamiento por envenenamiento, diarrea y dermatitis;
adems se ha demostrado su actividad hepatoprotectora (Tamai, et al.,1989).
Por otra parte dos nuevos triterpenos aislados de C. aslbum e identificados como urs-
12en-3a, 16-diol mostraron una alta actividad hepatoprotectora en cultivo de
hepatocitos de ratas intoxicadas con D-galactosamina (Tamai, et al.,1989).
Los componentes mayoritarios de Commiphora rostrata, 2-decanona, 2-undecanona
y una serie anloga de estructuras mostraron una alta actividad repelente contra la
plaga del maz Sitophillus zeamais comparable con el insecticida comercial N,N-
dietil-toluamida, lo que comprueba que los constituyentes de la resina juegan un
papel hormonal en el ecosistema donde crecen estas plantas (Lwande, et al.,1992)
El biflavonoide agatisflavona aislado de Canarium manii de la India aplicado
oralmente en dosis de 50 a 100 mg, presenta actividad hepatoprotectora contra
hepatocitos de ratones y ratas experimentalmente intoxicadas con tetracloruro de
carbono (Annad, et al.,1992)
El exudado de la corteza de las especies de los gneros Dacryodes, Paraprotium,
Protium y Tetragastris forman glomrulos resinosos blancos que constituyen el
llamado en Amrica del Sur "elemi del Brasil". Esta oleorresina que segregan con
mayor o menor abundancia todas las especies, se conocen en Colombia con los
nombres de "anime", "incienso" o "caraa". Tienen uso aunque limitado en ritos

20
religiosos, ahumerios, perfumera, medicina popular y como resinas industriales
(Cuatrecasas, 1957)
Otero y Cadena 1987, (citado de Ruiz & Susunaga, 2000) evaluaron la actividad
analgsica y txica de la resina de Bursera graveolens y encontraron que tiene un
efecto analgsico comparable con el del cido acetilsaliclico, pero no genera efectos
secundarios.
Adems los extractos etanlicos y acuosos de hojas y corteza de esta misma planta
poseen una actividad inhibitoria contra Sthaphilococcus aureus y mostraron toxicidad
para los peces (De Mena Guerrero, 1994)
McDoniel & Cole (1972) determinaron dos nuevos lignanos (-)-trans-2-(3",4",5"-
trimethoxy-benzyl)-3-(3,4-methylenedioxybenzyl)butyrolactona y (-)-trans-2 -
(3",4" - dimethoxybenzyl) - 3 - (3,4- methylenedioxybenzyl)butyrolactona,
procedentes del extracto de cloroformo de la planta Bursera schlechtendalii
demostrando su actividad antitumoral.
El extracto en etanol de la planta mexicana Bursera morolensis, mostr actividad
citotxica al probarla contra el P-388 linfocitos leucmicos (PS) y el carcinoma
humano de la piel (KB). La accin contra estas dos lneas celulares se debe a los
compuestos identificados como Deoxipodofilotoxina y un nuevo lignano, el 5-
desmetoxideoxipodofilotoxina tambin llamado morolensina (Jolad, et al.,1977)
La resina de Dacryoides peruviana, es utilizada para dar un agradable sabor en el
ritual de la coca, en medicina para el tratamiento de resfriado, tos y varicela. El uso
de esta planta estara justificado por la presencia de compuestos tales como timol,
carvacrol, ?-mentol y a-terpineol los cuales son conocidos por su actividad

21
antisptica, desinfectante, antioxidante, antifngica y antihelmntica (Robles, 1998.
Citado de Ruiz & Susunaga, 2000)
Se encontr que cuatro constituyentes de Bursera permollis (deoxipodophyllotoxin;
-peltatin metil eter; picro- -peltatin metil eter; y dehidro- -peltatin metil eter)
muestran citotoxicidad para un panel de once lneas celulares cancergenas, sin
embargo su potencia depende de la estereoqumica del anillo de lactona y de la
flexibilidad del anillo B (Wickramaratne, et al., 1994).
La resina de Xemena (Protium sp.) es quemada para fumigar las casas de los
indgenas (malocas) de las comunidades de Muinane y Uitoto de la Amazona
colombiana. El mayor componente de sta planta es el conocido acariciada Benzoato
de bencilo, que junto con Metileugenol y Limoneno tienen actividad repelente de
insectos (Robles, 1998, Citado de Ruiz & Susunaga, 2000).
Los compuestos triterpnicos tetracclicos cido 3a-hidroxitirulaca-8,24-dien-21-oico
y cido 3a-hidroxitirulaca-7,24-dien-21-oico aislados de Dacryodes peruviana y
Protium heptaphyllum mostraron una fuerte actividad citotxica a concentraciones de
10
-3
a 10
-4
M, contra lneas celulares B
11
de Drosophila melanogaster (Robles, 2000)

2.4 ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
2.4.1 MECANISMO DE LA INFLAMACIN
La inflamacin como reaccin local (especialmente de tejido conectivo y vascular),
incluye una serie de fenmenos que pueden ser desencadenados por diversos
estmulos (agentes infecciosos, isquemia, interacciones antgeno-anticuerpo y
lesiones trmicas o fsicas de otra ndole); entre los signos clnicos que se producen

22
en estado de inflamacin estn el rubor, calor, tumor, dolor y alteracin funcional
(Winter, et al., 1962).
La fisiopatologa de la inflamacin presenta varios fenmenos segn Winter, et
al.,1962

1. Iniciacin de la inflamacin:
En esta fase hay un aumento del metabolismo celular local en la zona inflamada, lo
que origina procesos de gluclisis, neoglucognesis y protelisis, con formacin de
metaboltos como el cido lctico, que ocasiona una acidosis local y elevacin de la
presin osmtica; a causa de la acidificacin , se aumenta la permeabilidad capilar
con paso de las protenas a los tejidos, apareciendo el primer sntoma que es el
enrojecimiento debido a la vasodilatacin, que es producida por el reflejo axnico
desencadenado a su vez por la acidosis y sustancias de tipo histamnico.
La misma vasodilatacin lleva a un aumento de temperatura o calor, ocasionado por
el aumento del metabolismo local.

2. Periodo del estado de la Inflamacin
En este periodo la acidificacin y el aumento de la presin osmtica se acentan,
causando una alteracin de la funcin celular, aqu se producen lesiones celulares.
Tambin se median los procesos de aumento de la permeabilidad capilar producida
por un polipptido (lucotaxina) aislado del exudado inflamatorio, leucocitosis
provocada por leucocitina (alfa-globulina), necrosis tisular causada por la necrosina
(globulina), fiebre provocada por pirexina (polipptido), tumor ocasionado por

23
edema, que se debe al aumento de la presin capilar, de la permeabilidad capilar y de
la presin osmtica y onctica (presencia de protenas) en el lquido intersticial, dolor
inflamatorio debido al aumento de la presin osmtica, de la concentracin de iones
hidrgeno, al ion potasio liberado por la destruccin celular (Litter, 1973) y a la
estimulacin local de las fibras de dolor y mayor sensibilidad a l por la excitabilidad
de las neuronas centrales de la mdula espinal (Hardman et al., 1996); finalmente la
citologa del exudado inflamatorio que es determinada por el pH, cuando es menor de
6.5 se destruyen los leucocitos y se produce pus (Litter, 1973).

3. Inflamacin e Inmunidad
La inflamacin es un proceso de proteccin que impide la expansin de agentes
patgenos, por bloqueo de las vas linfticas por trombosis causada por necrosina y
formacin de una red de fibrina en el foco inflamatorio.

4. Inflamacin crnica
En procesos inflamatorios prolongados las alteraciones enunciadas anteriormente son
poco acentuadas; no hay dolor local, hay poco edema, pues la modificacin en la
presin osmtica es baja, adems de haber poca acidocis local (pH 6.6 mnimo).

5. Curacin
Desaparece la causa de la inflamacin, existiendo regeneracin total o cicatrizacin
epitelial y del tejido conectivo fibroso (Litter, 1973)

24
2.4.2 CLASES DE INFLAMACIN
2.4.2.1 Aguda
Presenta una modificacin en el calibre de los vasos que da lugar al aumento en el
flujo de la sangre, alteraciones en la estructura de la microvasculatura y la migracin
de leucocitos hasta el foco de la lesin (Ramzi, et al., 1995).

2.4.2.2 Crnica
Lleva inmediatamente al dao permanente de los tejidos por la falta de una oportuna
resolucin del proceso inflamatorio debido a la persistencia del antgeno o agente
agresor dentro de los tejidos o por deficiencia de algunos de los mecanismos
homeostticos encargados de controlar el proceso (Ramzi, et al., 1995)

2.4.3 RESPUESTAS DEL PROCESO INFLAMATORIO
2.4.3.1 Local
Participan los sistemas de coagulacin y de las kininas, metabolismo del cido
araquidnico, con lo cual se genera vasodilatacin local, permeabilidad de lquidos,
formacin del edema, aumento de temperatura local y aflujo de las clulas de la
sangre hacia el tejido afectado (Ramzi et al., 1995).
2.4.3.2 Sistemtica
Se caracteriza por fiebre, leucocitosis, cambios en las concentraciones de metales
pesados en incremento de una serie de protenas de la fase aguda de la inflamacin
(Ramzi et al., 1995).

25
2.4.4 CLULAS QUE PARTICIPAN EN LA INFLAMACIN
2.4.4.1 Neutrfilos (PMN)
De la clula pluripotencial de la mdula se originan melioblastos, por mitosis y
maduracin se da lugar al promielocito, mielocito y finalmente polimorfonucleares;
existen tres clases: los PMN, Eosinfilos y basfilos.
Los primeros tienen un ncleo polisegmentado y en su citoplasma se encuentra una
serie de granulaciones o lisosomas, ricas en sustancias con actividad enzimtica.
Poseen un sistema locomotor de microtbulos y microfibrillas muy desarrollado que
les permite movilizarse por todos los tejidos y cumplir funcin de fagocitosis
(Ramirez, 2000).
Los PMN permanecen en circulacin de seis a ocho horas. La circulacin a los tejidos
es un proceso activo regulado por una serie de sistemas moleculares (leucotrieno B4 y
el factor C5a derivado del complemento acelera este paso). La vida media de los
tejidos es de cuatro das.
Durante el proceso de maduracin los PMN adquieren la capacidad de adherirse ,
deformarse, moverse, fagocitar, matar microorganismos y secretar mediadores de la
inflamacin. Los PMN tienen dos tipos de movimientos: uno de patrullaje (sin
direccin cierta) en busca de los agentes patgenos o sustancias extraas que pueden
haber invadido el tejido. Y otro unidireccional inducido por sustancias
quimiotcticas de diferentes orgenes (se difunden en forma radial) (Ramirez, 2000).

26
2.4.4.2 Basfilos y mastocitos (Bas, Mas)

Los basfilos se encuentran en la sangre circulante (duran das) y los mastocitos en
los tejidos (duran semanas). Durante el proceso de inflamacin los Mas en su
degranulacin, liberan mediadores primarios (heparina, histamina, y otros
mediadores) e inicia la sntesis de los mediadores secundarios (prostaglandinas,
leucotrienos, factores quimiotcticos, interleuquinas etc). Su degranulacin atrae
otras clulas como Eosinfilos, linfocitos y PMN, los cuales a su vez producen ms
citoquininas (Ramirez, 2000)
Por otra parte los Mas y Bas coadyudan en la defensa contra infecciones parasitarias
y participan en la cicatrizacin y reparacin de los tejidos (Ramirez, 2000).

2.4.4.3 Macrfagos (M)

De la clula pluripotencial de la mdula se origina el monoblasto, que da lugar a la
formacin del monocito; ste entra en circulacin y al pasar de los vasos sanguneos a
los tejidos se transforma en macrfago. De seis a ocho horas despus de que los
PMN se hayan hecho presentes en el sitio de la inflamacin se inicia la infiltracin
por clulas M. Estas adems de su importante funcin fagocitaria, liberan una
cantidad de sustancias que van a incrementar la produccin de PMN en la mdula
sea y secreta factores del complemento y prostaglandinas (Ramirez, 2000)

27

2.4.4.4 Linfocitos (Ls)
Son clulas responsables de la respuesta inmune. Participan activamente en la
inflamacin por medio de las molculas que ellos producen como anticuerpos y
linfoquinas (Ramirez, 2000)

2.4.4.5 Eosinfilos (Eos)
Su concentracin aumenta enormemente bajo determinadas circunstancias con
procesos alrgicos y parasitosis. Responden a agentes quimiotcticos y tienen cierta
capacidad fagoctica, aunque preferentemente estas clulas liberan al exterior el
contenido de sus grnulos en respuesta a parsitos que no pueden fagocitarse
(Ramirez, 2000)

2.4.4.6 Plaquetas
Son esenciales en el proceso de coagulacin y en la reparacin posterior del tejido
daado(Ramirez, 2000)

2.4.4.7 Mediadores
Son molculas que intervienen en el proceso de inflamacin y que son producidas
directa o indirectamente por las clulas antes mencionadas o que se derivan de otros
factores. Se dividen en dos clases: primarios que pueden ser de origen celular y
secundarios cuya produccin empieza una vez que el proceso de inflamacin se ha
iniciado (Ramirez, 2000).

28

2.4.5 MECANISMO ANTIINFLAMATORIO
Los antiinflamatorios no esteroides (AIDES) son comnmente usados para el
tratamiento de la inflamacin, el dolor y la fiebre. Estos compuestos actan por va de
la inhibicin de la enzima ciclooxigenasa (COX), la cual cataliza la conversin del
cido araquidnico (AA) a prostaglandinas (PGs) y tromboxanos (TXs). As mismo
la indometacina anula la movilidad de los polimorfonucleares y desacopla la
fosforilacin oxidativa a concentraciones suprateraputicas y deprime la biosntesis
de los mucopolisacridos (Goodman, et al., 1996; Llanos, 2001; Campana et al.,
2000; Brittanica.com; Indomethacin, va internet).
Recientemente se han identificado dos isoenzimas COX-1 y COX-2 o PGHS-1 y
PGHS-2. Se puede considerar que la primera se encarga de la manutencin de las
funciones fisiolgicas como el metabolismo renal de agua y sodio, secrecin de cido
gstrico y la hemstasis y puede provocar lceras gstricas por disminucin de las
PGs citoprotectoras; mientras que la inhibicin de la segunda presente en tejidos
como el cerebro y la prstata, promueve la accin antipirtica, analgsica y
aniinflamatoria (Patarroyo, 1999) y es inducida por procesos nitrognicos o
inflamatorios mediados por numerosas citoquinas (IL-1, alfa y beta), factores de
crecimiento, hormonas o factores tumorales, por lo cual su inhibicin ocasionara una
disminucin de las PGs producida en situaciones de inflamacin, sin embargo an no
es posible excluir el papel de COX-1 en la inflamacin segn los conocimientos
obtenidos hasta el momento (Llanos, 2001) (Ver figura No 3).

29
Existen reportes como los mencionados anteriormente que indican la capacidad de los
triterpenos, para inhibir las enzimas xido ntrico sintasa y ciclooxigenasa (COX-2)
en lneas celulares, sugiriendo el efecto significativo que estos pueden cumplir en
enfermedades crnicas que conllevan procesos inflamatorios (Suh et al., 1998). De la
misma manera existen estudios como los antes mencionados que evidencian la
capacidad de la apigenina y otras hidroxiflavonas para inhibir las ciclooxigenasas a
concentraciones de 100 Mm (Kelm et al., 2000; Brittanica.com) para inhibir los
mediadores de la inflamacin como lo son las citoquinas (IL-1) (Gerritsen et al.,
1995) y para inhibir los efectos del cido araquidnico sobre la agregacin
plaquetaria (Lin et al., 1996).
Macrfagos/ Citoquinas

COX-1 Inducible cido Araquidnico COX-2 Constitutiva

PGs citoprotectoras PGs proinflamatorias

Plaquetas, PGI2, Endotelio PGE2, rin
TXA2 Mucuosa gstrica Mucosa gstrica, etc.
Inflamacin

Funciones Fisiolgicas
AINES NO SELECTIVOS AINES SELECTIVOS
Y NO SELECTIVOS
Fig No 3: Ciclooxigenasas COX1 / COX2.

30
2.4.6 MEDICIN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
Los mtodos empleados para el estudio de los agentes antiinflamatorios se han
realizado in vivo e in vitro. En la actualidad existen diferentes tcnicas que nos
permiten evaluar las propiedades antiinflamatorias de las sustancias, dichos mtodos
se clasifican en :
v Modelos de inflamacin aguda
v Modelos de inflamacin crnica y subcrnica
v Tcnicas especficas
En los modelos de inflamacin aguda, crnica y subcrnica se evalan compuestos
que puedan inhibir de una manera especfica los signos de una reaccin inflamatoria
aguda o subaguda que ha sido artificialmente inducida en animales de laboratorio
(Winter et al, 1962).
Una de las tcnicas utilizadas para la inflamacin aguda es el edema plantar, esta
tcnica fue descrita por primera vez en 1962 por Winter y colaboradores y
posteriormente fue modificada por Sugishita y colaboradores en 1981. Consiste en la
administracin subcutnea de una pseudosolucin de carragenina, que es un
mucopolisacrido extrado del alga marina Chondrus crispus, en la aponeurosis
plantar de la rata o ratn; la reaccin que se produce es la inflamacin causada por
histamina, serotonina, bradiquinina y prostaglandinas, entre otras. La sustancia a
ensayar puede administrarse por va oral o intraperitoneal. El grado de edema es
medido por comparacin del volumen de agua desplazado por la pata del animal antes
y despus de la administracin del agente flogstico (Winter et al., 1962; Sugishita et
al., 1981)

31

Figura No 4: Edema plantar inducido en la pata derecha de la rata.

Otras tcnicas utilizadas son: edema auricular, artritis inducida por adyuvante y
carragenina, mtodo de la bolsa de aire en ratas (tcnica Edwars, tcnica de Sedwick)
(Barrera, 1999).

2.4.7 ANTIINFLAMATORIOS NO ESTEROIDES (AINES)
Los frmacos antiinflamatorios, analgsicos y antipirticos de esta categora incluyen
muy diversos compuestos que casi nunca tienen relacin qumica alguna, pero que
comparten algunas actividades teraputicas y efectos colaterales. El compuesto
prototpico sera la aspirina o cido acetl saliclico.

32
Se piensa que el aspecto ms importante del mecanismo de accin de estos
compuestos es la inhibicin de la ciclooxigenasa, enzima encargada de la biosntesis
de prostaglandinas y otros autacoides similares.
Las prostaglandinas se liberan siempre que hay dao celular o que aparecen exudados
inflamatorios.

2.4.8 INDOMETACINA O PATRN DE MEDICIN
La indometacina fue producto de los esfuerzos de laboratorios en busca de frmacos
con propiedades antiinflamatorias, se usa ampliamente y es eficaz pero su toxicidad,
suele limitar su empleo.
La formula estructural de la indometacina, es un derivado indlico metilado (figura
No 5):

Figura No 5: Estructura de la Indometacina.

La indometacina posee notables propiedades antiinflamatorias, analgsicas y
antipirticas que son semejantes a las de los saliciatos. Este es un frmaco ms

33
potente que la aspirina y posee propiedades analgsicas diferentes de sus efectos
antiinflamatorios.
Constituye un potente inhibidor de la ciclooxigenasa que forma prostaglandinas, y
tambin anula la movilidad de los polimorfonucleares. A semejanza de otros
antiinflamatorios no esteroides, desacopla la fosforilacin oxidativa a
concentraciones suprateraputicas y deprime la biosntesis de los mucopolisacridos.

2.4.8.1 Farmacocintica y Metabolismo
Despus de ingerida la indometacina, se absorbe en forma rpida y casi completa por
las vas gastrointestinales. La concentracin mxima en plasma se alcanza al trmino
de dos a tres horas.
Este frmaco se liga 90% a las protenas plasmticas y tambin lo hace en forma
extensa a los tejidos. Es convertida primordialmente en metabolitos inactivos y estos
se eliminan por orina, bilis y heces.
Se sabe que 10 a 20% del frmaco se excreta sin modificaciones en orina y ello se
debe en parte a la secrecin tubular.

2.4.8.2 Aplicaciones Teraputicas
Ante la gran incidencia y gravedad de los efectos colaterales que conlleva la
administracin de indometacina por largo tiempo, no se le usa a menudo como
analgsico o antipirtico (Goodman,et al., 2001).

34
En seres humanos el frmaco reduce el dolor, disminuye la hinchazn y la
hipersensibilidad articulares; incrementa la potencia de prensin manual y reduce la
duracin de rigidez matinal (Rojas, 1999)
Como ya se dijo, los efectos colaterales de este medicamento, reducen su utilidad
teraputica, pero una forma de aprovechar la eficacia de este frmaco, reduciendo al
mnimo los efectos adversos e indeseables, es consumir una dosis grande a la hora de
acostarse y dejar para la teraputica diurna la combinacin con otros antiiflamatorios
no esteroides mejor tolerados (Godmam et al., 2001).

2.5 EXTRACTOS VEGETALES
Los extractos vegetales se han definido como un concentrado obtenido por
tratamiento de productos vegetales con solventes apropiados, tales como agua, etanol
o ter, de elementos solubles, constituidos por una mezcla de principios activos y
sustancias inertes que se producen de la totalidad o de las partes de una planta fresca
o seca (Duke, 1987; Pieros et al., 1988).
Se piensa que los extractos preparados con plantas secas son ms efectivos que los de
plantas frescas, sin embargo este concepto puede llegar a ser un poco errneo, sobre
todo en las plantas que contienen hetersidos, saponsidos y compuestos tnicos, los
cuales sufren sensibles modificaciones durante la desecacin. Su color caracterstico
es ms o menos oscuro, su olor y sabor dependen de la materia prima que les ha dado
su origen (Duke, 1987; Pieros et al., 1988).
Para las plantas secas, los agentes de disolucin pueden ser agua, alcohol o ter,
empleados separadamente en mezclas apropiadas o sucesivamente. El alcohol se usa

35
para impedir la disolucin de sustancias ppticas y para facilitar la disolucin de
sustancias como los alcaloides y esencias. Cuando se utilizan plantas frescas, el
vehculo debe contener agua para facilitar el procedimiento (Duke, 1987; Pieros et
al., 1988).
El estudio de los extractos de las plantas como posibles agentes de control se
encuentra poco desarrollado, ya que su conocimiento se ha reducido a observar su
funcionamiento y en algunos casos a determinar las sustancias que los componen
(Dickison & Lucas, 1987).
La preparacin de un Extracto conlleva dos manipulaciones importantes: obtencin
del extracto y concentracin del mismo (Duke, 1987; Pieros et al., 1988).

36

3. PROBLEMA DE INVESTIGACIN y JUSTIFICACIN

Determinar la actividad antiinflamatoria procedente de los extractos con diferente
polaridad, derivados de las hojas y corteza de Bursera simaruba

Por medio del presente trabajo se pretende contribuir con el estudio de actividades
farmacolgicas, esperando con ello generar resultados de gran importancia , que
proporcionen una base para futuras investigaciones sobre la misma especie de la cual
la informacin registrada hasta el momento es escasa.

37

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL
v Determinar la existencia de una actividad antiinflamatoria por parte de los
extractos etanlicos o totales procedentes de hojas y corteza de Bursera simaruba
y de las fracciones de Diclorometano y ter de petrleo del extracto etanlico de
hojas de la misma planta.

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

v Obtener los extractos etanlicos provenientes de hojas y corteza de Bursera
simaruba.
v Fraccionar el extracto etanlico de hojas, con los solventes Diclorometano y ter
de petrleo.
v Inducir la inflamacin en ratas por medio de un agente externo como la
carragenina utilizando el mtodo del "edema plantar".
v Aplicar los extractos y las fracciones en las ratas inducidas con carragenina.
v Observar el efecto que las sustancias presentan frente a las inflamaciones
previamente inducidas con carragenina en los modelos vivos.

38


El presente trabajo es de tipo analtico y se realizo en los laboratorios de fitoqumica
de la Pontificia Universidad Javeriana, todo este fue realizado con base en lo
aprendido durante los aos anteriores de formacin acadmica en la carrera de
biologa y manteniendo siempre las enseanzas ticas y morales inculcadas por los
docentes de la universidad.
5.1 HIPOTESIS
Ho: Todos los tratamientos son iguales
H1: No todos los tratamientos son iguales.

5.2 MATERIALES
5.2.1 MATERIAL VEGETAL
La especie objeto de estudio fue Bursera simaruba, perteneciente a la familia
Burseraceae, colectada en el municipio de Tocaima, departamento de Cundinamarca
a una altura de 500 m.s.n.m con una temperatura media anual de 24C. y una
humedad relativa de 54%.
El proceso de determinacin biolgica fue realizado por el Doctor Edgar Linares, y
Maria Cristina Martinez, de la Universidad Nacional de Colombia (Bogot) y

39
permiti tener un ejemplar registrado en el Herbario Nacional Colombiano bajo el
nmero de coleccin 472877 (Ver anexo 1).
Las partes de la planta utilizadas para el estudio fueron las hojas y corteza, las cuales
se dejaron secar a temperatura ambiente (18C.) durante 10 das y se molieron por
separado en un molino de cuchillas.

5.2.2MATERIAL EXPERIMENTAL VIVO
Para el estudio se utilizaron ratas hembras Wistar con un peso entre 140-170 gramos;
dichas ratas fueron criadas en el bioterio de la Pontificia Universidad Javeriana para
garantizar la cepa pura.

5.3 MTODOS
5.3.1 OBTENCIN DEL EXTRACTO ETANLICO DE HOJAS (E.E. hojas)
Las hojas secas y molidas (109.4g) se sometieron a maceracin en fro con etanol al
95%, concentrando y cambiando el solvente cada dos das. La concentracin del
extracto se realiz en el rotavapor Buchi con una presin de 175 psi y una
temperatura constante de 45C. Se obtuvo un total de 13.32 g de extracto (Ver figura
No 6).

5.3.2 OBTENCIN DEL EXTRACTO ETANLICO DE CORTEZA
(E.E. corteza)
La corteza seca y molida (373.4g) se someti a maceracin en fro con etanol al 95%,
hasta extraccin total. El proceso de maceracin se efectu con agitacin espordica

40
y cambio de solvente cada 48 horas, el extracto fue filtrado y concentrado en el
rotavapor Buchi con una presin de 175 psi y una temperatura de 45C. Se obtuvo un
total de 23.08 g de extracto (Ver figura No 6).

MATERIAL VEGETAL

HOJAS CORTEZA

Secado y molido Secado y molido

Maceracin en fro Maceracin en fro

Cambio de solvente Cambio de solvente
(cada 2 das) (cada 2 das)

[Rotavapor psi 175] [Rotavapor psi 175]

45C 45C

Extracto etanlico de hojas Extracto etanlico corteza
(13.32g) (23.08g)

Figura No 6: Obtencin de los extractos etanlicos de hojas y corteza de B.
simaruba.

41
5.3.3 FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO ETANLICO de HOJAS
A cinco gramos del extracto etanlico de hojas obtenido de Bursera simaruba, se le
adicion Eter de Petrleo el cual se agit vigorosamente con el fin de extraer la
fraccin en Eter de petrleo (F. EdP); dicha solucin fue concentrada en el
Rotavapor. De la misma manera se extrajo la fraccin de diclorometano (F. CH
2
Cl
2
).
(Ver figura No 7)

Extracto etanlico de hojas

5g + Diclorometano 5g + ter de petrleo

[Rotavapor] [Rotavapor]

Fraccin Diclorometano Fraccin ter de petrleo
Hojas Hojas

Figura 7: Obtencin de las fracciones del extracto etanlico de hojas.

5.3.4 TCNICA CROMATOGRFICA
El mtodo ms utilizado en los estudios fitoqumicos es la cromatografa que consiste
en la separacin de los componentes de una mezcla con base en la diferencia de
retencin de tales sustancias en dos fases: la mvil y la estacionaria, estas dependen
de la adsorcin, reparto e intercambio inico. La adsorcin de una sustancia es la
fijacin de sta en la superficie de slido. El reparto es la distribucin de la sustancia

42
entre dos fases lquidas inmiscibles. El intercambio inico es el desplazamiento de
un ion desde una matriz, por otro que puede ser retenido ms fuertemente.
La fase estacionara es aquella que permanece inmvil durante la cromatografa;
puede ser un slido o un lquido retenido sobre un soporte slido. Los ms utilizados
son la slica (SiO
2
), la almina (Al
2
O
3
), xido de magnesio (MgO), carbn vegetal,
carbonato de calcio, florisil (Silica gel y magnesio) etc. (Torrenegra, R., 1983)
Las cromatografas ms utilizadas hoy en da son la cromatrografa en papel (CP),
utilizada para sustancias solubles en agua como carbohidratos, aminocidos, fenoles,
etc; La cromatografa en capa delgada (CCD), una opcin para componentes
lipdicos como esteroides, quinonas simples etc, y ofrece la ventaja de poder raspar el
compuesto que se requiere, disolverlo en el compuesto adecuado, para que se libere
en la slica y volver a correrlo o analizarlo separadamente, para esto es necesario
hacer placas preparativas para mejor separacin (Tood, S., 1988).
Las tcnicas anteriores permiten la obtencin de sustancias a pequea escala, en caso
contrario la cromatografa en columna (CC) es empleada.
Adems se emplea la cromatografa lquida de gases, para compuestos voltiles como
sesquiterpenos, hidrocarburos y compuestos sulfricos, y la extraccin lquido-
lquido para compuestos carotenoides. La combinacin de estas tcnicas permiten
una mejor separacin de los compuestos vegetales (Hostettann, 1991).
Otra tcnica de separacin, aunque utilizada con menor frecuencia es la
electroforesis, ya que las sustancias a separar deben poseer una carga para que corran
en un campo elctrico (Torrenegra, R., 1983).

43
5.3.5 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
La actividad antiinflamatoria se evalu utilizando la metodologa del edema plantar
en ratas, empleando como agente flogstico carragenina al 1% en solucin salina
(Sugishita et al., 1981; Salama et al., 1999), dicho agente fue administrado
subcutanemente en la pata derecha de cada rata; para el ensayo se utilizaron ratas de
raza Wistar, hembras con un peso entre 140 y 170g (ver figura 8).

Figura No 8: Ratas Wistar con peso entre 140 - 170 g utilizadas en el estudio.

Como sistema de medida se utiliz un pletismmetro Ugo Basile 7150, que est
especialmente diseado para obtener medidas de volumen de las patas de la rata, para
comparar la pata tratada, con la pata control (no tratada). La medida de volumen se
obtiene al introducir la pata de la rata, marcada con anterioridad hasta el tobillo en un

44
recipiente con agua y por un transductor se genera la informacin del volumen de
agua desplazado.
El diseo experimental utilizado fue de bloques completamente aleatorizados, en el
cual se establecieron tres bloques pertenecientes a los deltas de las tres horas medidas
(D1-D0, D3-D0, y D5-D0) y en los cuales se aplicaron ocho tratamientos
correspondientes a los diferentes extractos utilizados (E.E.hojas (100mg/Kg y
300mg/Kg), E.E.corteza (100mg/Kg y 300mg/Kg), Fracciones de EdeP y CH
2
Cl
2
de
hojas (300mg/Kg), el control etanl-agua (20:80) y la Indometacina tomada como
patrn 5mg/Kg) dichas sustancias fueron administradas por va oral en suspensin
con el vehculo etanol-agua.
Como patrn se tuvo la indometacina, y fue aplicada en dosis de 5mg/Kg en
solucin salina. Todas las sustancias evaluadas fueron administradas por va oral
empleando sonda orogstrica.
Se realizaron entonces dos anlisis de varianza uno para extractos y otro para
fracciones. En el de extractos se tuvieron 6 cajas (1 por dosis a probar (4), 1 de
patrn y 1 de control). Mientras que en el experimento con fracciones se tuvieron 4
cajas (1 para cada fraccin (2) y una de control y otra de patrn. Todas las cajas
contenan 3 ratas para garantizar la obtencin confiable de datos.

45
5.3.6 MEDICIN DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
Para medir la actividad antiinflamatoria se realizaron los siguientes pasos:
v Transcurrida una hora despus de la administracin de la sustancia objeto de
estudio por va oral, se procedi a marcar la pata derecha hasta la zona a medir y
posteriormente a sumergirla en el pletismmetro hasta la zona sealada con
anterioridad y la medida de volumen obtenida en ese momento correspondi al
Do.
v Posteriormente se procedi a inyectar 0.05 ml de suspensin de carragenina al 1%
en solucin salina (agente flogstico) en la zona metatarsiana de la pata derecha de
la rata.
v Una hora despus de la administracin del agente flogstico se procedi a medir
el nuevo volumen de la pata, y esto mismo se realiz a la tercera y quinta hora,
obteniendo los valores D1, D3 y D5 respectivos para cada hora.
v Se consider como el 100% de la inflamacin, la producida por los animales
control a quienes se les aplic solo etanol-agua.
v D1-Do indica el delta del desplazamiento de agua obtenido una hora despus de la
administracin del agente flogstico.
v D3-Do corresponde al delta del desplazamiento obtenido tres horas despus de la
v D5-Do es el delta del desplazamiento obtenido cinco horas despus de la
v Posteriormente se determin el porcentaje de inhibicin de la inflamacin
utilizando la siguiente formula (Salama et al., 1999)

46
% Inhibicin = 100-( ( A/B) * 100)
En donde:
A: delta del desplazamiento obtenido con los animales tratados con las sustancias en
estudio o el patrn a la primera, tercera o quinta hora.
B: delta del desplazamiento obtenido con los animales tratados con el vehculo
respectivo a la hora, tres horas o cinco horas.

5.4 ANLISIS CROMATOGRFICO
Se realiz una cromatografa en capa delgada, usando como fase estacionaria silica
gel activada, y como fase mvil diclorometano-metanol (9.5:0.5). Despus de
secarla, se procedi a revelarla con vainillina al 1% en agente cromognico, seguido
por calentamiento suave hasta la aparicin de coloracin.

47
6. RESULTADOS

Para medir la actividad antiinflamatoria de los extractos objeto de estudio, fue
necesario asegurar que el vehculo (etanol-agua) no demostr actividad sobre las
ratas, as lo confirman los resultados presentados en las tablas 1 y 2 , en donde se
evidencia una relacin etanol-agua/agua mayor a uno, trayendo como consecuencia
una media de porcentaje de inhibicin de la inflamacin menor a cero al aplicar la
frmula correspondiente y evidenciando el 100% de la inflamacin. En las grficas
No 1 y 2 se observa el incremento de la inflamacin a medida que transcurre el
tiempo en el etanol-agua utilizado para el estudio con los extractos etanlicos y el
utilizado para las fracciones de hojas, destacando la mxima inflamacin a la quinta
hora, lo que coincide con los estudios que indican un mayor efecto de la carragenina
entre la tercera y la quinta hora de haber aplicado el agente flogstico (Winter et.al.,
1962).
Tabla No 1: Actividad antiinflamatoria del vehculo etanol-agua usado para
comparar con los extractos etanlicos. Desplazamiento y Delta de
Desplazamiento.
Sustancia # Ind Do D1 D3 D5 D1-D0 D3-D0 D5-D0
1 1.02 1.17 1.54 1.64 0.15 0.52 0.62
2 1.11 1.26 1.65 1.77 0.15 0.54 0.66
3 1.10 1.22 1.62 1.75 0.12 0.52 0.65

Etanol-
Agua 20:80
Va oral
X 0.14 0.52 0.64

48
Tabla No 2: Actividad antiinflamatoria del vehculo etanol-agua usado para
comparar con las fracciones de hojas. Desplazamiento y Delta de
Desplazamiento.

Sustancia #Ind Do D1 D3 D5 D1-D0 D3-D0 D5-D0
1 0.94 1.24 1.33 1.38 0.30 0.39 0.44
2 0.88 1.13 1.26 1.45 0.25 0.38 0.57
3 0.94 1.23 1.35 1.40 0.29 0.41 0.46
Etanol-
Agua
20:80
Va oral
X 0.28 0.38 0.49

Grfica No 1: Evolucin del edema observado con el etanol-agua usado para
extractos etanlicos (Desplazamiento de la inflamacin (ml))

0
1
3
5
E ta n o l -A g u a 0
0.5
1
1.5
2
D
e
s
p
l
a
z
a
m
i
e
n
t
o

(
m
l
)
Tiempo (Horas)
Evolucin del edema (extractos)
Etanol-Agua

49

Grfica No 2: Evolucin del edema observado con el etanol-agua usado para
fracciones (Desplazamiento de la inflamacin (ml))

As mismo, se evalu la actividad antiinflamatoria de la Indometacina utilizada como
patrn a dosis de 5mg/Kg, suministrada por va oral, cuando esta tiene como
vehculo solucin salina. En las dos cajas utilizadas se obtuvo un comportamiento
similar, ya que la media de porcentaje de inhibicin fue ms alta a la primera y
tercera hora para la caja 1 (31.0% y 74.3% respectivamente) y para la caja 2 (51.1% y
53.8% respectivamente) , decreciendo en ambas a la quinta hora de haber
suministrado la carragenina, con una media de porcentaje de inhibicin de 50.4%
para la caja 1 y 45.5% para la caja 2 (ver tablas No3 No6 y graficas No 3 y No 4).

0
1
3
5
Etanol-Agua
0
0.5
1
1.5
2
D
e
s
p
l
a
z
a
m
i
e
n
t
o

(
m
l
)
Tiempo (Horas)
Evolucin del edema (fracciones)
Etanol-Agua

50

Tabla No 3: Actividad antiinflamatoria de la Indometacina usada para extractos
etanolicos. Desplazamiento y Delta del desplazamiento.

1 1.03 1.15 1.18 1.28 0.12 0.15 0.25
2 1.03 1.13 1.18 1.37 0.10 0.15 0.34
3 1.02 1.09 1.12 1.38 0.07 0.10 0.36

Indometacina
5 mg/Kg
X 0.09 0.13 0.31

Tabla No 4: Actividad antiinflamatoria de la Indometacina usada para las
fracciones de hojas. Desplazamiento y Delta del desplazamiento.

1 1.15 1.27 1.36 1.48 0.12 0.21 0.33
2 1.01 1.19 1.20 1.30 0.18 0.19 0.29
3 1.01 1.12 1.23 1.27 0.11 0.14 0.18

Indometacina
5 mg/Kg
X 0.11 0.18 0.26

51

Tabla No 5: Porcentaje de Inhibicin de la Inflamacin de la Indometacina
usada para extractos.

SUSTANCIA # Ind % INH 1 Hora % INH 3 Hora % INH 5 Hora
1 14..3 71.1 60.9
2 28.6 71.1 46.8
3 50.0 80.7 43.7

Indometacina
5 mg/Kg
X 31.0 74.3 50.4

Tabla No 6: Porcentaje de Inhibicin de la Inflamacin de la Indometacina
usada para fracciones de hojas.

SUSTANCIA # Ind % INH 1 Hora % INH 3 Hora % INH 5 Hora
1 57.1 46.1 32.6
2 35.7 51.2 40.8
3 60.7 64.1 63.2

Indometacina
5mg/Kg
X 51.1 53.8 45.5

52

Grfica No 3: Actividad antiinflamatoria de la Indometacina usada para extractos
etanlicos (Porcentaje de Inhibicin vs tiempo horas)

Grfica No 4: Actividad antiinflamatoria de la Indometacina usada para fracciones
(Porcentaje de Inhibicin vs tiempo horas)

0
20
40
60
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH Indometacina (Extractos)
% INH
0
20
40
60
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH Indometacina (Fracciones)
% INH

53
Con respecto de la actividad antiinflamatoria de los extractos etanlicos de hojas y
corteza se observ una relacin directa entre dosis-efecto en donde se manifest un
decrecimiento en el clculo del porcentaje de inhibicin en la dosis de 300 mg/Kg
con respecto a la dosis de 100 mg/Kg, ya que en la dosis de 100 mg/Kg del extracto
de hojas se presenta un claro crecimiento en el porcentaje de inhibicin pasando de
59.4% a la primera hora a un 76.2% en la tercera hora y en la quinta hora decrece
hasta 51.5% (ver tablas No 7 y 8)

Tabla No 7: Actividad antiinflamatoria de la dosis 100mg/Kg del extracto
etanlico de hojas. Desplazamiento y Delta del desplazamiento
Sustancia Caja Do D1 D3 D5 D1-D0 D3-D0 D5-D0
1.09 1.12 1.21 1.44 0.03 0.12 0.35
1.09 1.15 1.24 1.42 0.06 0.15 0.33
Ext. EtOH
de hojas
100mg/Kg

3
1.10 1.18 1.20 1.35 0.08 0.10 0.25

etanlico de hojas. Porcentaje de inhibicin de la inflamacin.
Sustancia Caja % INH 1hora %INH 3hora %INH 5hora
78.5 76.9 45.3
57.1 71.1 48.4

3
42.8 80.7 60.9

Ext. EtOH de
hojas
100mg/Kg
X 59.4 76.2 51.5

54
Por su parte el extracto E.E de corteza a la dosis de 100 mg/Kg presenta un
porcentaje de inhibicin bajo a la primera hora (28.5%) que aumento a la tercera hora
hasta un 42.9% y a la quinta hora se vuelve a incrementar levemente hasta un 43.7%
(ver tablas No 9 y 10)

etanlico de corteza. Desplazamiento y Delta del desplazamiento

1.03 1.14 1.35 1.48 0.11 0.32 0.45
1.10 1.25 1.39 1.50 0.15 0.29 0.40
Ext. EtOH
de corteza
100mg/Kg

4
0.97 1.03 1.25 1.20 0.06 0.28 0.23

etanlico de corteza. Porcentaje de inhibicin de la inflamacin.

Sustancia # Ind % INH 1Hora %INH 3 Hora %INH 5Hora
21.4 38.4 29.6
7.1 44.2 37.5

4
57.1 46.1 64.0
Ext. EtOH de
corteza
100mg/Kg
X 28.5 42.9 43.7

55

Grfica No 5: Actividad antiinflamatoria de los extractos etanlicos de hojas y
corteza a 100mg/Kg (Porcentaje de inhibicin vs Tiempo en horas)

Con dosis de 300mg/Kg los mismos extractos presentan una relacin efecto - tiempo,
al igual que el E.E de hojas (100mg/Kg) en donde se evidencia un incremento de la
media de porcentaje de inhibicin hasta la tercera hora, que luego empieza a declinar
a la quinta hora de haber suministrado la carragenina. Hallndose valores de
inhibicion para el extracto total de hojas de 33.2% a la primera hora que aumenta
hasta 51.2% en la tercera y decrece hasta 36.9% en la quinta hora (ver tablas No 11 y
12)

0
20
40
60
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH Extractos etanlicos 100mg/Kg
E.E. Hojas
E.E. Corteza

56
etanlico de hojas. Desplazamiento y Delta del desplazamiento.

1.10 1.15 1.22 1.43 0.05 0.15 0.33
1.07 1.19 1.36 1.53 0.12 0.29 0.46
Ext. EtOH
hojas
300mg/Kg

5
1.09 1.20 1.41 1.51 0.11 0.32 0.42

etanlico de hojas. Porcentaje de inhibicin de la inflamacin.

Sustancia Caja % INH 1Hora %INH 3 Hora %INH 5Hora
64.2 71.1 48.4
14.2 44.2 28.1

5
21.4 38.4 34.3
Ext. EtOH
de hojas
300mg/Kg
X 33.2 51.2 36.9

El extracto total de corteza a la misma dosis presenta un porcentaje de inhibicin de
30.9% a la primera hora, se incrementa hasta 37.1% en la tercera y declina levemente
hasta 35.4% en la quinta hora (ver tablas No 13 y 14)

57
etanlico de corteza. Desplazamiento y Delta del desplazamiento

1.17 1.30 1.55 1.61 0.13 0.38 0.4
1.09 1.25 1.41 1.55 0.16 0.32 0.46
Ext. EtOH
de corteza
300mg/Kg

6
1.15 1.26 1.43 1.53 0.11 0.28 0.38

etanlico de corteza. Porcentaje de inhibicin de la inflamacin.

71.4 26.9 37.5
0 38.4 28.1

6
21.4 46.1 40.6
Ext. EtOH de
corteza
300mg/Kg

X 30.9 37.1 35.4

Los comportamientos de los extractos etanlicos de hojas y corteza a la dosis de 300
mg/Kg, pueden observarse con mayor detalle en la grfica No 6.

58

Grfica No 6: Actividad antiinflamatoria de los extractos etanlicos de hojas y
corteza a 300 mg/Kg (Porcentaje de inhibicin vs Dosis mg/Kg)

En las fracciones de hojas objeto de estudio (CH
2
Cl
2
) y EdeP) se encontr un
comportamiento diferente de la una a la otra, pues en la primera se observa una media
de porcentaje de inhibicin de 44.0% a la primera hora, decrece hasta 32.4% en la
tercera hora y baja hasta 21.7% en la quinta hora, es decir que se presenta el mximo
efecto a la primera hora, mientras que en la fraccin de ter de petrleo se observa el
porcentaje de inhibicin ms alto a la primera hora (76.1%) pero este decrece a la
tercera hora (40.1%) y a la quinta hora vuelve a incrementarse hasta un 54.3% (ver
tablas No 15-18 y Grfica No 7).

0
20
40
60
80
%
I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
%INH Extractos etanlicos 300mg/Kg
E.E. Hojas
E.E. Corteza

59
Tabla No 15: Actividad antiinflamatoria de la fraccin de diclorometano
300mg/Kg del extracto etanlico de hojas. Desplazamiento y Delta del
desplazamiento.

1.08 1.20 1.43 1.65 0.12 0.35 0.57
1.12 1.27 1.34 1.55 0.15 0.22 0.43
Fraccin
Dicloro Hojas
300mg/Kg

3
1.13 1.33 1.35 1.44 0.20 0.22 0.31

Tabla No 16: Actividad antiinflamatoria de la dosis 300mg/Kg de la fraccin de
diclorometano del extracto etanlico de hojas. Porcentaje de inhibicin de la
inflamacin.

Sustancia Caja %INH 1Hora %INH 3 Hora %INH 5Hora
57.1 10.2 16.3
46.4 43.5 12.2

3
28.5 43.5 36.7
Fraccin
Dicloro de
hojas
300mg/Kg
X 44.0 32.4 21.7

60
ter de petrleo del extracto etanlico de hojas. Desplazamiento y Delta del
desplazamiento.

1.10 1.14 1.27 1.33 0.04 0.17 0.23
1.09 1.14 1.32 1.30 0.05 0.23 0.21
Frac. EdP
de hojas
300mg/Kg

4
1.05 1.16 1.35 1.28 0.11 0.30 0.23

ter de petrleo del extracto etanlico de hojas. Porcentaje de inhibicin de la
inflamacin.

85.7 56.4 53.0
82.1 41.0 57.1

4
60.7 23.0 53.0
Frac. EdP
de hojas
300mg/Kg
X 76.1 40.1 54.3

61

Grfica No 7: Actividad antiinflamatoria de las fracciones de diclorometano y ter
de petrleo de hoja 300mg/Kg.
Finalmente en la grfica No 8 se observan los comportamientos de todos los extractos
y fracciones estudiadas.

Grfica No 8: Comparacin de la actividad antiinflamatoria de todos los extractos a
diferentes dosis y fracciones objeto de estudio.
0
20
40
60
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH Fracciones 300mg/Kg
F. Diclorometano
F. EdP
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH de Extractos y Fracciones estudiados
E.E.hoj as 100mgKg
E.E.corteza 100mg/Kg
E.E.hoj as 300mg/Kg
F.Diclorometano
F. EdP
a

62
La cromatografa realizada a los extractos y fracciones evaluados permiti observar
una serie de terpenos an no identificados, posiblemente del tipo glicosilados, ya que
presentaron un color caf rojizo (Ver figura No 9), caracterstico de este tipo de
compuestos, adems de encontrarse por lo general en extractos polares como los
estudiados (Robles, com. pers, 2002).

Figura No 9: Cromatografa de extractos y fracciones objeto de estudio, fase
estacionaria (silica gel ), fase mvil (diclorometano-metanol 9.5:0.5).

63
El diseo experimental utilizado fue de Bloques completos aleatorizados, teniendo
como datos los Deltas del desplazamiento tomados a la primera (D1-D0), tercera (D3-
D0) y quinta (D5-D0) hora, de los diferentes extractos y fracciones estudiadas,
haciendo pruebas de significancia estadstica con un error alfa del 5%. Para
verificacin se utilizo la prueba de Duncan. Fueron realizados dos anlisis de
varianza uno para extractos y otro para fracciones ya que los experimentos no fueron
realizados el mismo da.
Los tratamientos aplicados para el primer anlisis son:
1. Indometacina 5mg/Kg
2. Extracto etanlico de hojas 100mg/Kg
3. Extracto etanlico de corteza 100mg/Kg
4. Extracto etanlico de hojas 300mg/Kg
5. Extracto etanlico de corteza 300mg/Kg

Tabla No 19: Anlisis de varianza para la primera hora de medicin y prueba
de Duncan para el experimento con extractos.
Fuente Grados de
libertad (df)
Suma de
cuadrados(SS)
Cuadrado
medio (MS)
F calculado
(F)
F. 05
Bloques 2 0.003 0.002 1.709 4.46
Tratamientos 4 0.009 0.002 2.436 3.84
Error 8 0.008 0.001
Total 14 0.020 0.001

64
Coeficiente de Variacin (CV) = 18.5%

Rango de probabilidad al nivel a 05 (Prueba de Duncan)
Tratamiento 5 0.133 A
Tratamiento 3 0.106 AB
Tratamiento 2 0.056 B

La tabla No 19 muestra las respuestas obtenidas con los diferentes extractos a la
primera hora, la cual nos indica que no hubo diferencias entre bloques (Delta de las
tres horas medidas), ya que el F calculado (1.709) fue menor que el F de las tablas
(4.46) y tampoco entre tratamientos a esta misma hora, pues el F calculado (2.43) fue
menor que el F de las tablas (3.84). A pesar de no existir diferencias entre los
tratamientos se realizo la prueba de Duncan para establecer entre cuales se encontraba
la mayor diferencia, en la tabla se muestra que cuando entre los tratamientos hay
alguna letra en comn significa que no hay diferencias ellos, pero cuando no existen
letras comunes entonces si hay diferencias, en la prueba e Duncan de la tabla 15, se
encuentra que la mayor diferencia esta entre el tratamiento 5 y el 2, aunque estas
diferencias no son significativas .
Finalmente se acepta la Ho en la cual se establece que todos los tratamientos son
iguales a la primera hora de medicin.

65
Tabla No 20: Anlisis de varianza y Prueba de Duncan para la tercera hora de
medicin en el experimento con extractos.
Fuente df SS MS F calculado F. 05
Bloques 2 0.001 0.001 0.251 4.46
Tratamientos 4 0.105 0.026 8.809 3.84
Error 8 0.024 0.003
Total 14 0.130 0.009
CV= 14.08%
Rango de probabilidad al nivel a05 (Prueba de Duncan)

En la tabla 20 se observan los resultados de los diferentes extractos a la tercera hora
de medicin y se establece que no hay diferencias entre bloques pero si entre
tratamientos ya que el F calculado (0.251) para el primer caso es menor que el F de
las tablas (4.46) y para el caso de los tratamientos el F calculado (8.809) es mayor
que el F de las tablas (4.46), entonces en la prueba de Duncan muestra que las
mayores diferencias se encuentran entre los tratamientos 5,3,4 con los tratamientos 1
y 2, sin embargo no hay diferencia entre estos grupos de tratamiento. Finalmente se

66
rechaza la Hiptesis nula, es decir que todos los tratamientos no son iguales. El
coeficiente de variacin para esta prueba es de 14.08% lo que garantiza confiabilidad
en los datos.

Tabla No 21: Anlisis de varianza y Prueba de Duncan para la quinta hora de
medicin para el estudio con extractos.
Fuente Df SS MS F calculado F. 05
Bloques 2 0.012 0.006 1.274 4.46
Tratamientos 4 0.027 0.007 1.400 3.84
Error 8 0.039 0.005
Total 14 0.079 0.006
CV= 16.36


Por su lado la tabla No 21 muestra los resultados entre los extractos a la quinta hora
de medicin y se observa, que no hay diferencias entre bloques y tampoco entre

67
tratamientos, pues en ambos caso el F calculado es menor que el F. de las tablas. Se
observa un coeficiente de variacin igualmente confiable de 16.36% La prueba de
Duncan confirma que no existe ninguna diferencia entre los tratamientos. Finalmente
se acepta la Ho, es decir que todos los tratamientos son iguales.

Por otra parte en el anlisis estadstico para fracciones se tuvieron los siguientes
tratamientos:
1. Etanol-Agua 20:80
2. Indometacina 5mg/Kg
3. Fraccin diclorometano 300mg/Kg
4. Fraccin ter de petrleo 300mg/Kg

Tabla No 22: Anlisis de varianza para la primera hora de medicin y prueba
de Duncan para el experimento con fracciones.
Fuente Grados de
libertad (df)
Suma de
cuadrados(SS)
Cuadrado
medio (MS)
F calculado
(F)
F. 05
Bloques 2 0.002 0.001 0.782 5.14
Tratamientos 3 0.071 0.024 17.2 4.76
Error 6 0.008 0.001
Total 11 0.081 0.007
Coeficiente de Variacin= 13.18%

68
probabilidad al nivel a 05 (Prueba de Duncan)
Tratamiento 2 0.136 BC
Tratamiento 4 0.066 C

La tabla No 22 muestra las respuestas obtenidas con las diferentes fracciones a la
primera hora, y nos indica que no hubo diferencias entre bloques, ya que el F
calculado (0.782) fue menor que el F de las tablas (5.14) pero si existen diferencias
entre los tratamientos a esta misma hora, pues el F calculado (17.2) fue mayor que el
F de las tablas (4.76). La prueba de Duncan establece que hay diferencias entre todos
los tratamientos menos en el 3 y el 2. Finalmente se rechaza la Ho, es decir que no
todos los tratamientos son iguales.

Tabla No 23: Anlisis de varianza y Prueba de Duncan para la tercera hora de
medicin en el experimento con fracciones.
Fuente df SS MS F calculado F. 05
Bloques 2 0.001 0.001 0.174 5.14
Tratamientos 3 0.074 0.025 6.870 4.76
Error 6 0.022 0.004
Total 11 0.097 0.009
CV= 12.40%

69


En la tabla No 23 se observan los resultados de las fracciones a la tercera hora de
medicin y se establece que no hay diferencias entre bloques pero si entre
tratamientos ya que el F calculado (0.174) para el primer caso es menor que el F de
las tablas (5.14) y para el caso de los tratamientos el F calculado (6.87) es mayor que
el F de las tablas (4.76), entonces la prueba de Duncan muestra que las mayores
diferencias se observan entre el tratamiento 1 con los dems tratamientos (2, 3, 4),
sin embargo entre ellos no existen diferencias significativas. Finalmente se rechaza la
Hiptesis nula. El coeficiente de variacin para esta prueba es de 12.40% lo que
garantiza confiabilidad en los datos.

70
Tabla No 24: Anlisis de varianza y Prueba de Duncan para la quinta hora de
medicin para el estudio con fracciones.
Fuente Df SS MS F calculado F. 05
Bloques 2 0.022 0.011 1.886 5.14
Tratamientos 3 0.150 0.050 8.731 4.76
Error 6 0.034 0.006
Total 11 0.206 0.019
CV= 11.37%


Por su lado la tabla No 24 muestra los resultados entre las fracciones a la quinta hora
de medicin y se observa, que no hay diferencias entre bloques pero si entre
tratamientos, pues en caso el F calculado (0.782) es menor que el F. de las tablas
(5.14), mientras que en el caso de los tratamientos el F calculado (8.73) es mayor que
el de las tablas (4.76). Se observa un coeficiente de variacin igualmente confiable
de 11.37% La prueba de Duncan confirma que existen diferencias entre los
tratamientos 1 y 3 con los tratamientos 2 y 4. Finalmente se rechaza la Ho, es decir
que todos los tratamientos no son iguales.

71

Teniendo en cuenta la experiencia de trabajos previos se eligieron como solventes de
extraccin Etanol al 95%, Eter de petrleo y Diclorometano, de las partes areas de
Bursera simaruba (hojas y corteza) para la evaluacin de la actividad
antiinflamatoria, y como modelos vivos fueron usadas ratas Wistar con un peso entre
140-170 g, este peso tambin permiti tener individuos con una misma edad
promedio entre 6 y 7 semanas (individuos juveniles). Gracias a la homogeneidad de
las condiciones se establecieron las concentraciones o dosis objeto de estudio, ya que
la dosis mxima probada en extractos etanlicos con gneros de la misma familia y
con individuos adultos ha sido de 500mg/Kg por va oral (Salama, 1999), por ello
esta se consider una dosis demasiado alta para aplicar por va oral en individuos
juveniles.
Partiendo entonces del principio de que "Todas las sustancias son txicas, no hay
alguna que no lo sea", y la dosis exacta es lo que establece la diferencia entre un
veneno y un frmaco curativo (Goodman et al, 2001), se estableci como dosis
mnima (100mg/Kg) y como dsis mxima (300mg/Kg).

La indometacina, utilizada como patrn, fue escogida por sus altas propiedades
farmacolgicas y su eficacia como agente antiinflamatorio (Goodmam et al, 2001),
adems de las ptimos resultados obtenidos en estudios anteriores (Salama, et al.
1999; Barrera, 1999).

72
Dicho compuesto demostr una mayor actividad a la tercera hora de la induccin de
la inflamacin, tiempo en el cual la carragenina empieza a mostrar su mayor efecto.
La actividad antiinflamatoria de la indometacina, se increment de la primera a la
tercera hora, luego de la induccin de la inflamacin, para luego descender levemente
a la quinta hora, segn lo demuestran los resultados de las tablas No 5 y 6, en el que
se muestran los porcentajes de inhibicin obtenidos a las tres horas de medicin, en
el experimento con extractos totales (31.0%, 74.3% y 50.4%) y en el realizado con
fracciones de hojas (51.1%, 53.8% y 45.5%).

Se puede observar que en el caso de la indometacina, su estructura qumica presenta
diferentes elementos electronegativos como son el nitrgeno, oxgeno y el cloro, que
le dan caractersticas polares, por su capacidad de formar puentes de hidrgeno por lo
que se retarda ms su absorcin y por ende el resultado de su efecto, siendo esta la
causa de su mxima actividad antiinflamatoria a las tres horas. Los grupos
funcionales como el grupo carboxilo en la posicin 3 que le confiere acidez y mayor
potencia antirreumtica, el grupo arilacilo en la posicin 1, el metoxilo en la posicin
5 y presencia del halgeno en la posicin para del grupo 1-benzoilo, son en gran
parte los responsables de la actividad antiinflamatoria (Fowlie, 2001).

Con los resultados obtenidos se puede establecer que algunas de los extractos y
fracciones objeto de estudio, presentan una actividad diferente a la de la
indometacina, segn se observa en la grfica No 8 que muestra un comportamiento
diferente en el caso del extracto etanlico de corteza a dosis de 100mg/Kg en el cual

73
la mayor actividad se presenta a la quinta hora, despus de sufrir un leve incremento
desde la tercera hora de medicin, as se observan porcentajes de inhibicin de 28.5%
a la primera hora, 42.4% a la tercera hora y 43.7 % a la quinta hora, como se puede
observar el incremento es bastante leve por lo cual se podra decir que el extracto se
mantiene estable a partir de la tercera hora.
Por su lado, la fraccin de diclorometano de hojas a dosis de 300mg/Kg y de Eter de
petrleo a la misma dosis, presentan la mayor actividad la primera hora y se presenta
un decremento del efecto con el paso del tiempo en el caso de la primera fraccin, es
decir que la actividad es ms baja en la ltima hora medida (44.0%, 32.4% y 21.7%);
mientras que en la fraccin de Eter de petrleo de hojas, (76.1%, 40.1% y 54.3%), los
resultados demuestran un efecto ms rpido, a la primera hora, que desciende a la
tercera pero se incrementa nuevamente a la quinta hora.
En el caso de las fracciones el hecho de obtenerse un mayor efecto a la primera hora
de medicin, nos permite decir que ambos frmacos presentan una buena actividad
antiinflamatoria a la primera hora, es decir que su efecto es bastante rpido, sin
embargo la mxima inflamacin se presenta a la quinta hora, es decir que las
fracciones no actuan debidamente al tiempo en que se presenta la mxima
inflamacin sino cuando esta se encuentra en su punto ms bajo. Posiblemente
esto sea debido a una mayor y ms rpida absorcin en el organismo siendo esto
quizs consecuencia de su naturaleza qumica triterpnica que les confiere
caractersticas apolares (Litter, 1973).

74
Sin embargo el resto de extractos evaluados, como el Etanlico de hojas 100mg/Kg
(59.4%, 76.2% y 51.5%); el Etanlico de hojas 300mg/Kg (33.2%, 51.2% y 36.9%) y
el Etanlico de corteza 300 mg/Kg (30.9%, 37.1% y 35.4%), si presentan una
actividad antiinflamatoria similar a la presentada por el patrn indometacina 5mg/Kg,
pues se evidencia un comportamiento creciente de la primera a la tercera hora,
teniendo su mximo efecto a la tercera hora de la administracin del agente inductor
de la inflamacin, para luego disminuir a la quinta hora como se puede observar en la
grfica 8, sin embargo en este caso no se cumple lo planteado a cerca de las dosis por
Goodmam y colaboradores (2001) que a medida que se incrementa gradualmente la
concentracin de un frmaco se suele generar una respuesta de mayor magnitud
conforme se las aumenta, sin embargo se debe tener en cuenta el lmite de toxicidad
de la sustancia en cuestin, en este caso la actividad antiinflamatoria ms alta se
present en el extracto etanlico de hojas a 100mg/Kg el cual tiene una actividad
mxima a la tercera hora con un 76.2% de inhibicin y le sigue el mismo extracto
pero a dosis de 300 mg/Kg en el cual a la tercera hora presenta una inhibicin de
51.2%, estos extractos cumplen con la dosis efectiva 50 (DE
50
).

El comportamiento de una nueva elevacin repentina del porcentaje de inhibicin a la
quinta hora despus de la induccin de la carragenina, que se presenta en la fraccin
de EdP a 300mg/kg, podra explicarse por el efecto de los antagonistas de la
histamina, ya que como es bien sabido la histamina tiene una importante funcin
durante los procesos inflamatorios, pues es un vasodilatador e interviene en la
formacin del edema.

75
La vasodilatacin incluye la participacin de los receptores H1 que se sitan en las
clulas endoteliales y H2 distribuidos en las clulas de msculo liso de los vasos. La
activacin de uno u otro tipo de receptores desencadena vasodilatacin mxima.
Los receptores H1 poseen la mayor afinidad por la histamina y median una respuesta
dilatadora de inicio relativamente rpida pero breve, mientras que los receptores H2
generan dilatacin que aparece con mayor lentitud y es ms sostenida.
Podra ser que la fraccin de ter de petrleo de hojas estudiada estimulara la
produccin de heparina o de algn antagonista de la histamina y se inhibiera su
accin a nivel de receptores H2 (Goodman et al, 2001), es decir que primara la
respuesta dilatadora mediada por los H1, entonces se tendra que a la primera hora
tenga una vasodilatacin bien establecida que permite no solo la permeabilidad de
clulas que intervienen en el proceso inflamatorio (Macrofagos, polimorfonucleares,
eosinfilos, etc) (Goodman et al, 2001; Rojas,1999) sino tambin el paso de los
diferentes componentes de la fraccin antiinflamatoria objeto de estudio, por esa
razn si ocurre una vasoconstriccin en la zona de inflamacin el porcentaje
inhibitorio de la sustancia se va a ver afectado y por ello se observa una disminucin
hasta la tercera hora, pero luego posiblemente por una reactivacin de la accin de la
histamina por disminucin del antagonista, se genere nuevamente vasodilatacin a
nivel de los dos tipos de receptores, y con ella se restablece el flujo de diferentes
clulas y molculas, incluidas las presentes en el frmaco en cuestin y se presente
una elevacin en el porcentaje de inhibicin, por una mejor absorcin del frmaco en
la zona afectada.

76
Sin embargo se piensa que la actividad antiinflamatoria presente en los extractos y
fracciones de Bursera simaruba se debe a la presencia de compuestos de tipo terpeno
observados en la cromatografa de capa delgada, ya que se evidencian colores cafs,
rojizos caractersticos de dichos compuestos (Robles. com.pers., 2002)
Adems en los estudios realizados a varios gneros de la misma familia, se han
encontrado nuevos compuestos de tipo terpenoide, a los cuales se les atribuye la
actividad antiinflamatoria, por ejemplo en las resinas de las especies Commiphora
incisa y Commiphora mukul fueron encontrados dos nuevos triterpenos
(mansumbinona y cido mansumbinonico) los cuales inhibieron de manera
significativa los edemas inducidos por carragenina en pata de ratn (Duwiejua, et al.,
1992). Por otro lado en el genero Diospiros, especficamente en la especies D.
leucomelas, fueron aislados tres triterpenos, identificados como betulin, cido
betulinico y cido urslico que muestran una fuerte actividad antiinflamatoria en los
edemas inducidos con carragenina y serotonina en ratas, esta inhibicin es causada
por la interaccin de dichas sustancias con los receptores glucocorticoides que
participan en el proceso inflamatorio (Recio, et al., 1994).
As mismo los cidos boswellicos aislados de la goma resina de Boswellia serrata,
pertenecientes a la familia de los triterpenos pentacclicos, fueron identificados con
principios activos antiinflamatorios, ya que inhiben la sntesis de leucotrienos, en la
va 5-lipooxigenasa, aunque no se presenta ninguna evidencia de que afecte la va 12-
lipooxigenasa o las actividades de la ciclooxigenasa (Ammon, et al., 1993) Por otro
lado la Curcumina, otro triterpeno aislado de Boswellia serrata presenta actividad
antiinflamatoria al inhibir la actividad de la va 5-lipooxigenasa en los neutrfilos

77
peritoneales de las ratas, as como la va 12-lipooxigenasa y ciclooxigenasa en
humanos (Ammon, et al., 1993).
Por su parte Singh y colaboradores (1996), encontraron que los cidos boswellicos,
son una nueva clase de antiinflamatorios no esteroides ya que adems de inhibir la
actividad de la va 5-lipooxigenasa, reducen el volumen de exudado inflamatorio e
inhiben la migracin de leucocitos en los edemas inducidos con carragenina.
En algunas especies del genero Protium (P.heptaphyllum, P. strumosum, P.
grandifolium, P. lewellyny y P. hebetatum) fueron hallados monoterpenos,
fenilpropanoides y algunos sesquiterpenos provenientes de las hojas de dichas
especies. Fue detectada una actividad antiinflamatoria en el modelo de inflamacin
inducido con Zymosan, ya que sus aceites inhiben la acumulacin de neutrfilos, la
acumulacin de eosinfilos en la cavidad pleural del ratn e inhiben la acumulacin
de clulas mononucleares (Siani, et al., 1999).
Es por la evidencia citada que se podra establecer aunque no con total seguridad que
son los terpenos presentes en los extractos evaluados los causantes de la actividad
antiinflamatoria evaluada en este estudio.
En cuanto al anlisis estadstico para extractos se puede decir que a ninguna de las
tres horas medidas se tiene diferencias entre los bloques y solo se encuentran
diferencias significativas entre los tratamientos a la tercera hora de medicin , por lo
cual solo en el anlisis de esta hora se rechaz la hiptesis nula, es decir que todos los
tratamientos no son iguales a la tercera hora despus de la induccin de la
carragenina. Los coeficientes de variacin observados en este anlisis se encuentran

78
entre 14.08% y 18.5% lo que indica que a pesar de no encontrarse en el rango de
confiabilidad estimado para estudios netamente analticos de 5% a 15%, garantiza
datos confiables para este estudio biolgico.
En cuanto al anlisis estadstico paara las fracciones se tiene que no hay diferencias
significativas entre bloques a ninguna de las tres horas medidas, pero en todas ellas
existen diferencias entre tratamientos. Por lo tanto se rechaza la Ho, es decir que no
todos los tratamientos son iguales.

79

6. CONCLUSIONES

La mxima inflamacin se presenta a la quinta hora despus de la induccin del
agente flogstico.

Los extractos etanlicos de hojas y corteza a las dosis de 100mg/Kg y 300mg/Kg
presentaron una actividad antiinflamatoria mxima a las tres horas, semejante a la
expresada por el patrn (indometacina) a dosis de 5mg/Kg.

Las dos fracciones de hojas estudiadas (Diclorometano y ter de petrleo) a dosis
de 300mg/Kg presentaron una actividad antiinflamatoria mxima a la primera
hora, es decir que su efecto fue el ms rpido.

El extracto etanlico que present una mejor actividad antiinflamatoria fue el de
hojas a 100mg/kg, seguido por el mismo a la dosis de 300mg/Kg.

En el anlisis estadstico para extractos no se encontraron diferencias
significativas entre los bloques a ninguna de las tres horas medidas, y solo se
encuentra diferencia entre los tratamientos a la tercera hora de medicin

.

80

En el anlisis estadstico de fracciones, no se encuentran diferencias
significativas entre bloques pero si se encontraron diferencias significativas entre
los tratamientos.

En todos los anlisis de varianza para las fracciones se rechaz la hiptesis nula,
es decir que todos los tratamientos aplicados no son iguales.

81

9. RECOMENDACIONES

Extender el estudio farmacolgico determinando la toxicidad y dosis letal de los
extractos etanlicos de hojas y corteza aislados de Bursera simaruba, aplicados
por va oral.

Continuar el proceso de investigacin, para observar los posibles mecanismos de
accin que ocurren dentro del organismo con la aplicacin de los extractos y
fracciones estudiados.

Probar diferentes mtodos de aplicacin de los extractos para determinar as la
aplicacin teraputica con mejor efecto antiinflamatorio.

Determinar los compuestos qumicos presentes en las diferentes extractos y
fracciones estudiadas para as conocer o confirmar el compuesto qumico que
determina la actividad antiinflamatoria.

82
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ANEXO 7
RESULTADOS DE LA INVESTIGACIN FINAL

A continuacin se muestran los resultados de las cromatografas comparativas
obtenidas de los compuestos aislados de B. graveolens con sus respectivas
fracciones.

7 6 5 4 3 2 1 B A

Cromatoplaca comparativa de las fracciones ter de petrleo de hojas (A) y
diclorometano de corteza (B) eludas en ter de petrleo-AcOEt (7:3), donde se
aprecian adems los compuestos aislados de ambas fracciones que
corresponden a siete slidos, de los cuales los nmeros 5, 6 y 7 han sido
identificados.

7 6 5 4 3 2 1 B A

Cromatoplaca comparativa de las fracciones ter de petrleo de hojas (A) y
diclorometano de corteza (B) eludas en diclorometano-MeOH (9.5:0.5), donde
se aprecian adems los compuestos aislados de ambas fracciones que
corresponden a siete slidos, de los cuales los nmeros 5, 6 y 7 han sido
identificados.

En las siguientes pginas se mostrarn los espectros de los compuestos 5, 6 y
7, que fueron analizados y que corresponden a derivados del tipo tirucalano
identificados como:
cido 3-oxotirucala-8,24-dien-21-oico (5), Acido 3-hidroxitirucala-8,24-dien-21-
oico(6) y Acido 3-hidroxitirucala-7,24-dien-21-oico(7).

Espectro del protn para el compuesto 5, (400 MHz, CDCl3) donde se aprecian
seales para 7 grupos metilos que es caracterstico de este tipo de
compuestos, la seal para la insaturacin del C24, la presencia de la funcin
cetona en el C3 se evidencia por la seal de ddd a H 2,53 para el protn axial
del C2, que se acopla con el metileno del C1( H 1,96/1,62).

El espectro de RMN
13
C del compuesto 5, (400 MHz, CDCl3), permite diferenciar
30 seales de las cuales los siete metilos se encuentran a campos altos entre
C 10 y 30. Tambin se pueden diferenciar 4 carbonos de metinos (CH)
estando el del C24 a 123.8 y el C3 del grupo ceto a C 218.1, adems el C21
que es cuaternario aparece a C 183.3.

El espectro del protn del compuesto 6, (400MHZ, C
6
D
6
/CD
3
OD), el patrn es
muy parecido al anterior pero muestra un protn carbinlico resonando a H
3.33 indicativo de un terpenoide del tipo 3-hidroxi.

El espectro de RMN
13
C del compuesto 6, (400MHZ, C6D6/CD3OD), en este el
carbonilo a C 218.1, fue reemplazado por un carbono carbinolico a C 76.1,
como caracterstica relevante.

Espectro del compuesto 7, (400MHZ, C6D6/CD3OD), muestra seales para dos
protones olefnicos a H 5.24 asignado para el H-24 y a H 5.31 asignado al H-
7.

Espectro de RMN
13
C del compuesto7, (400MHZ, C6D6/CD3OD), muestra 7
carbonos cuaternarios (uno menos que el compuesto 6) y siete carbonos
terciarios (dos mas que el compuesto 6). La seal del metino olefnico del C7
aparece a C 119.1 y un metino aliftico del C9 a C 49.3 lo que ayuda a
corroborar la existencia del doble enlace entre C7 y C8.

ANEXO 8
Robles y Torrenegra 2
ACTIVIDAD ANTIFUNGICA DE PARTES AEREAS DE Bursera simaruba y
Bursera graveolens (BURSERACEAE) FRENTE A FITOPATOGENOS COMO:
Fusarium oxysporum Y Botrytis cinerea.
Palabras Claves: Actividad Antimicrobiana, Bursera graveolens, B. simaruba, Burseraceae,
Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Concentracin Inhibitoria media, crecimiento
radial.

ANTIFUNGAL ACTIVITY FROM AERIAL PARTS OF Bursera simaruba and
Bursera graveolens SPECIES (BURSERACEAE) AGAINST PLANT PHATOGENIC
FUNGI LIKE Fusarium oxysporum AND Botrytis cinerea.
Keys Words: Antimicrobial, Bursera graveolens, B. simaruba, Burseraceae, Fusarium
oxysporum, Botrytis cinerea, Medium Inhibitory Concentration, radial grown.

Jorge Robles
1
, Rubn Torrenegra
1
y Martn Bayona
2
.
1
2
Departamento de Microbiologa. Pontificia Universidad
Javeriana. Bogot. Colombia. Carrera 7 No. 43-82. Edificio Carlos Ortz (52), Oficina 110.
Departamento de Qumica. Telfax: 3208320 ext 4034, 4131 4038.
e-mail: jrobles@javeriana.edu.co, rtorrene@javeriana.edu.co, mbayona@javeriana.edu.co
malonsobayona@hotmail.com
Correspondencia con: Dr. Jorge Robles Camargo al Departamento de Qumica.
Fax No. 3208320 Ext. 4034

RESUMEN
La presente investigacin brinda un mtodo alternativo para el control y manejo de
microorganismos fitopatgenos como Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea con el uso de
extractos vegetales de las partes areas de especies de Burceraceas. Extractos etanlicos y
sus diferentes fracciones (Eter de petrleo, Diclorometano y Acetato de etilo) fueron
probados en el estudio.
Presentaron actividad inhibitoria los extractos etanlicos de hojas y corteza de Bursera
simaruba frente a los fitopatgenos F. oxysporum y B. cinerea mientras que el extracto
etanlico de hojas de Bursera graveolens present efecto inhibitorio frente a F. oxysporum.
Las fracciones Eter de petrleo, Diclorometano y Acetato de etilo presentaron actividad
frente a F. oxysporum. Se determin la Concentracin Inhibitoria Media ( CI50) de cada
uno de los extractos que presentaron actividad, encontrndose que para los extracto
etanlicos la CI50 se encuentra en el rango de concentraciones entre 100mg/ml 332mg/ml
y para las diferentes fracciones en un rango de concentraciones entre 50mg/ml 166mg/ml.

ABSTRACT
The present investigations offer an alternative method to control and to manipulate plant
phatogenic fungi like Fusarium oxysporum and Botrytis cinerea using extract plants. The
ethanol extracts and their several fractions (petrol, dichloromethane and Ethyl acetate) from
aerial parts were tested on the study.
The ethanol extracts from barks and leaves of Bursera simaruba showed inhibitory activity
against F. oxysporum and B. cinerea while ethanol extract from leaves of Bursera
graveolens showed inhibitory activity against F. oxysporum. The petrol, dichloromethane
and ethyl acetate fractions showed inhibitory activity against F. oxysporum also. The
Medium Inhibitory Concentration was resolved for each extract which had activity,
founding that to ethanol extract the IC50 is placed between concentrations range from 100
mg/mL 332 mg/mL and to the several fractions it was placed between concentrations
range from 50 mg/mL 166 mg/mL.

INTRODUCCION
Las Burseraceae son tiles por las resinas que segregan y por su madera. Son conocidas las
gomorresinas incienso y mirra (Swart, 1942). Los especies pertenecientes a esta familia son
utilizados en algunas culturas indgenas en el tratamiento de enfermedades muy comunes y
en algunos ritos religiosos como es el limpiar las casas y malocas de energas negativas,
adicionalmente, algunos presentan frutos comestibles (Cuatrecasas, 1957).
La especie Bursera graveolens es conocida popularmente como tatamaco y ha sido
utilizada en el tratamiento de asma, diarrea, pleuresa, clculos renales, tuberculosis y
mordedura de serpiente, adems para sanar heridas y llagas. De otro lado, la especie
Bursera simaruba se conoce popularmente como caratero y se ha usado como cicatrizante
de heridas infectadas, antidiarreico, en el tratamiento de resfriados y para curar el ombligo
de nios recin nacidos (Bernal y Correa, 1990). La informacin etnobotnica de las
plantas en estudio nos han permitido plantearnos algunos interrogantes que nos conducen a
buscar la confirmacin cientfica de los usos populares que especies de la familia
Burseraceae tienen.
Por medio de esta investigacin se pretendi evaluar la actividad antimicrobiana y
antifngica presente en hojas y corteza de las especies B. simaruba y B. graveolens,
determinando la Concentracin Inhibitoria media (CI50) de los extractos o fracciones que
presentan la propiedad de inhibir el crecimiento de los microorganismos fitopatgenos
evaluados.
MATERIALES Y METODOS
MATERIAL VEGETAL
Las especies analizadas en el presente estudio fueron colectadas en el municipio de
Tocaima, departamento de Cundinamarca y el municipio de Valle de San Juan
departamento del Tolima; teniendo en cuenta su uso en medicina popular y el hecho de
pertenecer a familias que contienen metablitos secundarios con actividad biolgica. Para
la realizacin del trabajo se emplearon las partes areas de las plantas (hojas y corteza),
Dicho material se sec durante ocho das a temperatura ambiente posteriormente se
pulveriz en un molino y se almacen en recipientes adecuados (Domnguez, 1973).
MICROORGANISMOS ENSAYADOS
Los microorganismos (B. cinerea y F. oxysporum) fueron seleccionados teniendo en cuenta
su facilidad para el crecimiento y desarrollo en medios de cultivo sencillos y el ser
representativos de grupos microbianos de importancia agrcola. Dichos microorganismos
fueron obtenidos de la coleccin de cepas del Grupo de Investigacin en Biotransformacin
de la Universidad Javeriana (GIBUJ) y manejados segn Bayona (1996).
METODOS DE EXTRACCION
El material vegetal (hojas y corteza) se extrajo por maceracin con Etanol al 95%,
obtenindose los extractos etanlicos respectivos y luego se fraccionaron lquido - lquido
con Eter de petrleo, Diclorometano y Acetato de etilo en forma consecutiva como lo
describe Robles (1998).
METODOS DE VALORACION ANTIMICROBIANA
Para la evaluacin de la actividad antibacteriana se emple la tcnica de perforacin en
agar, la cual consiste en una modificacin de la tcnica de Kirby Bauer (Koneman, 1992).
La evaluacin antifngica se determin segn el mtodo de crecimiento radial, propuesto
por Hostettmann, (1991).
RESULTADOS
F. oxysporum, se caracteriz por presentar sobre agar PDA (Agar Papa Dextrosa) colonias
vellosas o algodonosas con un micelio extenso; en ocasiones produjo un pigmento difusible
en el reverso (colores rojos, rosa, prpura). Este crecimiento fue observado en el control
negativo (Dimetilsulfxido), indicando que este compuesto no induce ningn tipo de
cambio morfofisiolgico para el hongo; en contraste, el crecimiento con los diferentes
extractos las colonias observadas presentaron micelio escaso, de color ms intenso
indicando posiblemente que el hongo se encontraba en condiciones adversas para su
crecimiento (stress).
Las colonias de B. cinerea presentaron un crecimiento moderado, micelio escaso de color
grisceo, con abundante esporulacin y formacin de esclerocios (estructuras de
resistencia). El Dimetilsulfxido no alter el crecimiento del hongo.
Los extractos etanlicos de hojas y corteza de B. simaruba presentaron actividad
fungisttica frente a los hongos fitopatgenos F. oxysporum y B. cinerea, como se puede
ver en las tablas Nos. 1 y 2 respectivamente; mientras, el extracto etanlico de hojas de B.
graveolens fue activo nicamente frente a F. oxysporum, como se puede ver en la tabla No.
1.
Tablas No. 1 y Tabla No. 2.
Las fracciones en Eter de petrleo de hojas de B. simaruba y cortezas de B. graveolens
mostraron un 40.6 % de inhibicin del crecimiento contra F. oxysporum. La fraccin en
Diclorometano de corteza de B. simaruba mostr un 37.5% de inhibicin de crecimiento;
mientras la fraccin en Acetato de etilo un 38% de inhibicin contra F. oxysporum.
Se determin la Dosis Mnima Inhibitoria de cada uno de los extractos y fracciones que
presentaron actividad, encontrndose que la CI50 para los diferentes extractos etanlicos se
encuentra en el rango de concentraciones entre 100 mg/mL 332 mg/mL y la DL50 para
las distintas fracciones en un rango de concentraciones entre 50 mg/mL 166 mg/mL.
DISCUSION
En los ensayos biolgicos de los extractos y fracciones frente a los hongos F. oxysporum, y
B. cinerea, se tomaron como positivos los extractos que permitieron un porcentaje de
crecimiento menor al 80% con respecto al control negativo Dimetilsulfxido (DMSO).
Los extracto etanlico totales son una extraccin completa donde es posible encontrar todos
los compuestos que cada especie posee, se cree que por esta razn presentaron actividad
inhibitoria del crecimiento frente a los hongos F. oxysporum y B. cinerea. Tambin se cree
que esta accin se debe a que las Burseraceae se componen principalmente de una mezcla
de terpenoides y polisacridos y otro tipo de metabolitos secundarios como son los
compuestos fenlicos (Khalid, 1983) los cuales podran presentar accin sobre la pared
celular de las estructuras fngicas (Koneman 1992).
En cuanto a las distintas fracciones el nico microorganismo que present inhibicin en su
crecimiento fue F. oxysporum, posiblemente esto se debe a que los componentes
mayoritarios que se encuentran en fraccin etrea sean los compuestos fenlicos (Khalid,
1983) que son fuertes desinfectantes; mientras, en las fracciones de diclorometano y acetato
de etilo los compuestos mayoritarios son del tipo triterpeno pentacclico cuya estructura es
similar a la del control positivo Griseofulvina (Robles, 1998), esto se confirm en cada uno
de los mapas cromatogrficos realizados.
B. cinerea es un hongo que normalmente se inhibe al acidificar el medio de cultivo
(Koneman, 1992), pero en nuestro trabajo esto no ocurri.
CONCLUSIONES
Los extractos etanlicos de B. simaruba de hojas y corteza presentaron actividad
fungisttica frente a F. oxysporum y B. cinerea.
El extracto etanlico de B. graveolens de hojas present actividad fungisttica frente a F.
oxysporum.
Las fracciones Eter de petrleo, Diclorometano y Acetato de etilo son activos frente a F.
oxysporum.
Los extractos vegetales de las especies estudiadas pueden ser utilizados como mtodo
alternativo para el control de los fitopatgenos F. oxysporum y B. cinerea, disminuyendo
los riesgos ecolgicos y los costos de produccin de los cultivos.
AGRADECIMENTOS
Los autores desean agradecer a la Pontificia Universidad Javeriana por su apoyo logstico, a
COLCIENCIAS por el apoyo financiero del proyecto, al Herbario Nacional de Colombia
por la determinacin de las especies vegetales y finalmente Marta Ruz y Marcela Susunaga
por su participacin desinteresada en esta investigacin.
REFERENCIAS
Bayona M. 1996. Control Biolgico Qumico de Botrytis cinerea en Rosa (L) en la
Calera (Cundinamarca). Tesis de Postgrado. Facultad de Ciencias. Pontificia
Universidad Javeriana. Santaf de Bogot D.C.
Bernal H, Correa J. 1990. Especies Vegetales Promisorias de los Pases del Convenio
Andrs Bello, Tomo III Burseraceae, Editado por Secretaria Ejecutiva del Convenio
Andrs Bello (SECAB).
Cuatrecasas J. 1957. Prima Flora Colombiana: 1. Burseraceae. Webbia 12: 375441.
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Mxico.
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10.
Koneman AS. 1992. Diagnstico Microbiolgico. Editorial Mdica Panamericana.
Buenos Aires. 565- 620 pp.
Robles J. 1998. Phytochemical Investigation of some Traditional Medicinal Plants
Used by Indigenous Colombian Tribes. Ph.D. Thesis, Strathclyde University,
Department of Pharmaceuticals Science. School of Pharmacy. Glasgow. Scotland.
Swart J J. 1942. Flora of Suriname Vol. 3, Part 2, Edited by the Institute. Printed by J.
H. Bussy, 204-251 pp.

TABLA No. 1 ACTIVIDAD DEL EXTRACTO ETANOLICO FRENTE A Fusarium
oxysporum.

EXTRACTO CRECIMIENTO
(cm)
% CRECIMIENTO % INHIBICION
Control negativo
(DMSO)

6 100 0
Control positivo
(Griseofulvina)
4.5 75 25
Extracto No.1 3.25 54.16 45.8
Extracto No.2 3.25 62.5 37.5
Extracto No.3 4.25 70.8 29.1
Extracto No.4 5 83.3 16.6
*La concentracin utilizada para los extractos fue de 200mg/ml.
EXTRACTO No 1 Extracto etanlico de hojas de B. simaruba
EXTRACTO No.2 Extracto etanlico de corteza de B. simaruba
EXTRACTO No.3 Extracto etanlico de hojas de B. graveolens
EXTRACTO No.4 Extracto etanlico de corteza de B. graveolens

TABLA No. 2 ACTIVIDAD DEL EXTRACTO ETANOLICO FRENTE A Botrytis
cinerea

(cm)
% DE
CRECIMIENTO
% DE
INHIBICION
Control negativo
(DMSO)
5.5 100 0
Control positivo
(Griseofulvina)
3.5 63.6 36.3
Extracto No. 1 3 54.5 45.4
Extracto No. 2 4.75 77.3 22.4
Extracto No.3 5.75 104.5 -4.5
Extracto No. 4 5.75 104.5 -4.5
* La concentracin utilizada para los extractos fue de 200mg/ml.

EXTRACTO No 1 Extracto etanlico de hojas de B. simaruba
EXTRACTO No.2 Extracto etanlico de corteza de B. simaruba
EXTRACTO No.3 Extracto etanlico de hojas de B. graveolens
EXTRACTO No.4 Extracto etanlico de corteza de B. graveolens

ANEXO 9
EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS DE PARTES AEREAS
DE LAS ESPECIES Bursera simaruba Y Bursera graveolens CONTRA ALGUNOS MICROORGANISMOS
PATGENOS

Libia Mercedes Ortiz, Martha Elizabeth Sierra, Jorge Robles Camargo (Director).

RESUMEN
El efecto medicinal de una planta est contenido en los principios activos los cuales son un complejo de compuestos
qumicos que actan en sinergismo manifestando una accin teraputica especifica.
En este estudio se practicaron una serie de ensayos que ponen en evidencia propiedades antibacterianas y
antifungicas en las plantas de la familia Burseraceae.
Los extractos totales y las fracciones de B. simaruba y B. graveolens presentaron diferentes respuestas de inhibicin
de crecimiento frente a S. aureus, B. subtilis, T. mentagrophytes y M. canis. Obtenindose halos de inhibicin
proporcionales a la concentracin aplicada de cada sustancia.
Palabras claves: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Fusarium oxysporum, Microsporum canis, Trichophyton
mentagrophytes.
ABSTRAC
The effect medical of a plant is contained in the active principles which are a complex of chemical compounds that
act in synergism showing an specific therapeutic action.
In this studio were practiced some assays that evidence antibacterians antifungus properties in the family plants
Burseraceae.
The total extracts and the fractions presented different inhibition answers proportional to the concentration applied of
each substance.

Keywords: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Fusarium oxysporum, Microsporum canis, Trichophyton
mentagrophytes.

INTRODUCCION
La aplicacin teraputica de las plantas medicinales es un rea que ha presentado una gran expansin, adquiriendo
una importancia cada vez mayor. Es por eso, que se hace necesario profundizar en el conocimiento de las sustancias
o principios activos en un vegetal.
Este trabajo tiene por objeto evaluar la actividad antimicrobiana presente en las partes areas de Bursera simaruba y
Bursera graveolens frente a E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Microsporum canis, Trichophyton
mentagrophytes y Fusarium oxysporum.
Los mtodos de extraccin se basaron en la solubilidad de los compuestos presentes en el material vegetal; de
acuerdo a la complejidad de la mezcla de compuestos presentes se establecieron diferentes concentraciones.
Para la seleccin de las cepas, se tuvo en cuenta su relacin con los distintos cuadros clnicos que causan y que a su
vez permiten la observacin de los efectos posibles antimicrobianos por parte de los extractos vegetales escogidos.
La evaluacin de esta sensibilidad nos va a ayudar en la seleccin del compuesto mas adecuado para el tratamiento
de una infeccin bacteriana. Las pruebas mas utilizadas para evaluar la sensibilidad de una bacteria frente a un
agente antimicrobiano estn basados en el enfrentamiento in Vitro de la bacteria con distintas concentraciones del
agente. En este trabajo se realiz la evaluacin por la tcnica de Perforacin en Gel.

MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES
La recoleccin del material vegetal de B. simaruba se realiz en el municipio de Tocaima; y B. graveolens en el
municipio de Agua de Dios, pertenecientes al Departamento de Cundinamarca.
Las cepas bacterianas y fngicas fueron donadas por el Cepario de bacterias y por el Cepario de hongos del
Laboratorio de Microbiologa de la Pontificia Universidad Javeriana, respectivamente. Los solventes como: etanol
95%, ter de Petrleo, Diclorometano y Acetato de Etlo fueron suministrados por el Laboratorio de Fitoqumica de
Universidad Javeriana.
MTODOS
Extraccin
El material vegetal, hojas y corteza se extrajo inicialmente con etanol al 95%, por medio de la tcnica de Soxhlet
durante 48 horas hasta obtener el extracto etanolico. Luego se concentr el extracto en el Rotavapor a presin
reducida (175psi)y temperatura constante (45C) (Torrenegra, R., 1993). Posteriormente se realiz el
fraccionamiento Lquido/Lquido en ter de petrleo, diclorometano y acetato de etilo. Las respectivas fracciones
obtenidas se concentraron en el Rotavapor Buchi. En donde se manejaron presiones de vaci indicadas para estos
solventes.
Perforacin en gel
Fueron seleccionadas de 4 a 5 colonias de un cultivo de 24 horas estas se sembraron en caldo nutritivo para ajustar su
concentracin con el Tubo No. 5 de Mc Farland (10
13
UFC). Se realizaron 5 perforaciones de 5mm de dimetro en
cajas de petri que contenan 20ml de cada medio. En cada perforacin se colocaron 10l de medio de cultivo para
evitar la dispersin del extracto. Luego se realizo la siembra masiva del tubo seleccionado en las cajas de petri e
incubando a 35C por 18 horas.
Finalmente se analiz la actividad antimicrobiana en cada caja de las tres fracciones diferentes con sus respectivos
controles positivo y negativo; Comparando los halos de inhibicin de las fracciones con los controles de cada una de
las cajas.
Mtodo de crecimiento radial
A partir de la solucin stock 1g/ml, se incorporo cada uno de los extractos en el medio PDA, as: Ext. Etanolico se
aplic un volumen de 1ml obtenindose una concentracin de 66mg/ml y para fracciones se aplic 30, 40 y 50l para
obtener una concentracin final 2mg/ml, 2.66mg/ml y 3.33 respectivamente. Se utiliz como control positivo
griseofulvina 50mg/1ml DMSO (Grisovin)y como control negativo DMSO.
Sirvindose las cajas de petri con 15ml de agar PDA (agar papa dextrosa) comercial marca Difco, ms el extracto;
donde se coloca un inoculo de 2 -5mm de dimetro de cada hongo. Luego se incub a 30C durante seis das
realizando la medicin del dimetro de la colonia cada da.
La medicin de la colonia en cada caja de petri se realiz en dos direcciones tomndose un promedio de estos valores
permitiendo calcular el porcentaje de inhibicin y de crecimiento.
% Inhibicin : 100 - % de crecimiento
% crecimiento : dimetro radial de la muestra x 100
dimetro radial del control negativo
Concentracin mnima inhibitoria
De acuerdo a la actividad biolgica de los extractos frente a cada microorganismo se tomaron diferentes
concentraciones del extracto etanolico (100, 150, 180 mg/ml) y de las fracciones(30, 40, 50 mg/ml). Estas
concentraciones se evaluaron mediante la tcnica de perforacin en gel. Se incub y se observ.

RESULTADOS Y DISCUSION
Material vegetal
El material se peso luego de su recoleccin y secado, para obtener el peso total en gramos. Ver tabla No.1
Evaluacin de la actividad biolgica
Al realizar el enfrentamiento de las cepas de E. coli, S. aureus y B. subtilis detectamos que tanto el extracto total
como las fracciones no presentaron actividad contra E. coli, por lo tanto, este microorganismo no fue tenido en
cuenta para realizar los anlisis estadsticos. No present sensibilidad frente a los extractos, quizs debido a la
complejidad de su pared celular; ya que esta contiene una membrana permeable a solutos de bajo peso molecular y
los extractos evaluados contienen compuestos de alto peso molecular, por eso es posible que no fueran captados por
la clula bacteriana, como se reporta en la literatura. La no- observacin de efecto antimicrobiano en los extractos
frente a E. coli, no los excluye de la posibilidad de presentarlo frente a otros agentes bacterianos aqu no incluidos.
Finalmente, la fraccin acetato de etilo de hojas y corteza de B. graveolens present mayor actividad frente a S.
aureus obtenindose un halo de inhibicin promedio de 19,85mm y 23,01mm respectivamente, en la concentracin
de 150mg/mL. Mientras que para B. simaruba se obtuvo una mejor actividad en el extracto total, tanto de hojas
como de corteza en las concentraciones de 250mg/mL. A su vez B. subtilis present un halo de inhibicin de
18.47mm en el extracto etanolico de hojas de la especie de B. graveolens, en la concentracin de 250mg/mL.
Presentando este microorganismo un halo de inhibicin de 18.3mm frente a la fraccin de acetato de etilo de corteza,
a la mayor concentracin. Mientras en B. simaruba la mayor inhibicin se presento en el extracto etanolico, tanto de
hojas como de corteza, a una concentracin de 250mg/mL.
Concentracin Mnima Inhibitoria
Se pudo estimar que la CMI para el extracto etanolico de hojas para B. graveolens frente a S. aureus fue de
160mg/mL , mientras que para el extracto etanolico de corteza de la misma planta fue de 190mg/mL. El extracto
etanolico de B. simaruba presenta una CMI de 170mg/mL. En cuanto al extracto etanolico de corteza de la misma
planta fue de 180mg/mL.
Para B. subtilisla CMI que presento el extracto etanolico de hojas de B. simaruba fue de 180mg/mL, mientras que
para corteza fue de 160mg/mL. Diferente a B. graveolens en la cual la CMI presente en el extracto etanolico de hojas
de 170mg/mL y para corteza de 180 mg/mL. La CMI de las fracciones en ter de petrleo, diclorometano y acetato
de etilo frente a B. subtilisy S. aureus de las partes areas ( hojas y corteza ) de las especies de B. graveolens y B.
simaruba fueron de 50mg/mL.
En los ensayos biolgicos de los extractos y fracciones de B. graveolens y B. simaruba frente a los hongos T.
mentagrophytes, M. canisy F. Oxysporum, se obtuvieron resultados satisfactorios de inhibicin. A continuacin
se muestra en las tablas los resultados mas relevantes, donde se especifica la concentracin utilizada, el porcentaje de
crecimiento (%C )y el porcentaje de inhibicin (% I). De los resultados de porcentaje de inhibicin obtenidos para
cada hongo se toman como activos todos aquellos mayores o iguales a 30% debido a que en la literatura se reportan
como activos los mayores al 20% y con el fin de disminuir el porcentaje de error se da un rango ms amplio. Ver
tablas No. 2- 8.
Los extractos etanolicos y las fracciones de las partes reas de B simaruba y B. graveolens presentaron actividad
frente a S. aureus y B. subtilis, T. mentagrophytes, M. Canis y F. oxysporum. No se presento ninguna actividad
frente a la bacteria Escherichia coli por parte de los extractos y fracciones de las partes areas de B. simaruba y B.
graveolens. La fraccin mas activa de la especie B. graveolens fue acetato de etilo para B. subtilisy S. aureus. Y en
B. simaruba la mayor actividad se presento en el extracto etanolico.

Se puede estimar que de acuerdo a los resultados obtenidos, que la actividad antibacteriana presente en las fracciones
y extractos de las especies vegetales es directamente proporcional a la concentracin aplicada; a mayor
concentracin mayor actividad.

La CMI para las dos bacterias es diferente dependiendo el tipo de extracto y la especie vegetal que se trabaje. Para
las fracciones de las dos plantas la CMI optima es de 50mg/mL.
En la evaluacin antifungica de los extractos etanolicos se observ que el mas activo fue el extracto etanolico de
corteza de B. graveolens en una concentracin de 33.33mg/mL frente a T. mentagrophytes con un porcentaje de
inhibicin del 89.43%. F. oxysporumfue el hongo que presento menor porcentaje de inhibicin frente a las
fracciones de las partes de areas de las plantas. La especie B. simaruba en sus partes areas presento una optima
actividad antifungica frente a M. Canis, ya que todas las fracciones presentaron un porcentaje de inhibicin mayor al
30%. Resaltando la fraccin acetato de etilo de la corteza de esta planta a un concentracin de 3.33mg/mL.

AGRADECIMIENTOS
Las autoras agradecen al Laboratorio de Investigacin Fitoqumica de la Universidad Javeriana (GIJUF ), a
Colciencias por el soporte econmico brindado al proyecto. Al doctor Jorge Robles Camargo por su apoyo para
llevar a cabo la investigacin y al estadista Miguel Pinzn por su asesora en el anlisis de la misma.

LITERATURA CITADA
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ZAPATER, R. 1981. Micologa Medica Diagnostico y Tratamiento. Editorial Librera El Ateneo.
Argentina

Tabla 1. Peso en gramos del material
PLANTA PARTE
PESO EN
GRAMOS
B. graveolens Hojas 330
Corteza 445
B. simaruba Hojas 220
Corteza 300

Tabla No. 2 Actividad del extracto etanolico de B. graveolens y B. simaruba frente a T. mentagrophytes
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
Mm
DIA 6
mm % C % I
33,33 5 7 11 12,57 87,43
Corteza Etanol 16,66 5 14,5 21,25 24,28 75,72
33,33 5 9,25 9,25 10,57 89,43
33,33 5 10 11,25 12,85 87,15
Corteza Etanol 16,66 5 29,5 35 40 60
33,33 5 16,6 20 22,85 77,15
Control negativo: 87.5mm

Tabla No. 3 Actividad del extracto etanolico de B. graveolens y B. simaruba frente a M. canis
Microsporum canis
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
Mm
DIA 6
mm % C % I
33,33 5 7 14 15,79 84,21
Corteza Etanol 16,66 5 28,5 34 38,35 61,65
33,33 5 16 26,75 30,17 69,83
33,33 5 12 18,66 21,04 78,96
Corteza Etanol 16,66 5 26,45 28,6 32,26 67,74
33,33 5 11 21,5 24,25 75,75
Control negativo 88,65mm
Tabla No. 3 Actividad del extracto etanolico de B. graveolens y B. simaruba frente a F. oxysporum
Fusarium oxysporum
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA
mm
DIA 6
mm % C % I
33,33 5 11,5 15 19,35 80,65
Corteza Etanol 16,66 5 28 38,5 49,67 50,33
33,33 5 9,5 9,59 12,37 87,63
33,33 5 22,5 23,75 30,64 69,36
Corteza Etanol 16,66 5 15,25 47,5 61,29 38,71
33,33 5 31 33 42,58 57,42
control negativo 77,5mm

Tabla No. 4 Actividad de B. simaruba frente a M. Canis
Microsporum canis
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
Hojas ter de petrleo 2 29,22 48,33 55 56,4 43,6
2.6 25,74 41,48 53 59,78 40,22
3.33 27,75 35,7 50 56,4 43,6
Diclorometano 2 31,25 36,65 58,33 65,79 34,21
2.6 30,75 32,79 55,75 64,01 35,99
3.33 28,45 29,61 55 56,4 43,6
Acetato de etilo 2 30,5 41,3 53,2 60,01 39,99
2.6 26,41 34,98 45,32 51,12 48,88
3.33 15,8 20,78 40,21 45,35 54,65
Corteza ter de petrleo 2 34,5 45,65 60 67,68 32,32
2.6 29,15 42,56 48,25 54,42 45,58
3.33 25,33 34,23 46,66 52,63 47,37
Diclorometano 2 15,25 47 61,5 69,37 30,63
2.6 12,75 37,75 59,75 69,39 32,61
3.33 10,5 37 58,85 66,38 33,62
Acetato de etilo 2 19,5 23,5 32,5 36,66 63,34
2.6 16,75 20,13 28,33 31,95 68,04
B. simaruba
3.33 9,25 15,22 22,5 25,38 74,62
CONTROL POSITIVO 15 15 22,5
CONTROL NEGATIVO 26,13 40 88,65

Tabla No. 5 Actividad de B. graveolens frente a M. canis
Microsporum canis
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
Hojas ter de petrleo 3.33 16,5 45 60,75 68,52 31,48
Diclorometano 3.33 11,5 43,75 55,25 62,32 37,68
Acetato de etilo 3.33 17,5 40,3 58,75 66,27 33,73
Corteza Diclorometano 3.33 11,75 45 60,25 67,96 32,04

Tabla No. 6 Actividad de B. simaruba frente a F. oxysporum
CONC
(mg/mL)
DIA 2
mm
DIA 4
mm
DIA 6
mm % C % I
B. simaruba Corteza ter de petrleo 3.33 12,5 44,25 41,25 53,22 46,78

ANEXO 10
ACTVIDADES DESARROLLADAS DESDE AGOSTO 2002 HASTA JUNIO
2003

Actualmente la estudiante de Biologa Catalina Pieros Osorio est en la ltima
fase de los ensayos de la actividad antiinflamatoria de los extractos y
fracciones de hojas y corteza de Bursera graveolens con el propsito de indicar
si esta especie presenta actividad antiinflamatoria y luego determinar la dosis
mnima que tiene la fraccin activa.

Los estudiantes Microbiologa Industrial Natalia Becerra Cobos e Ivn Segura
culminaron satisfactoriamente su trabajo de investigacin en el cual se estaba
determinando la accin antimicrobiana en este caso de una de las especies
adicionales colectadas Bursera tomentosa, contra algunos microorganismos
fitopatgenos y patgenos del hombre como son: Fusarium oxysporum var.
clavel, Botrytis cinerea, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus y Trychophyton
mentagrophytes. Anexo No. 4

Las estudiantes Libia Mercedes Ortz Pearanda y Martha Elizabeth Sierra de
Microbiologa Industrial, culminaron con xito su trabajo de grado realizado
para determinar la actividad antimicrobiana de extractos y fracciones de las
especies en estudio y que fueron evaluados contra un grupo de
microorganismos diferentes a los realizados previamente por Martha Ruiz
Giraldo y Clara Marcela Susunaga y as completar la investigacin en todos los
microorganismos que se haban propuestos. Para la seleccin de las cepas, se
tuvo en cuenta su relacin con los distintos cuadros clnicos que causan. En
este caso fueron realizados los estudios contra las bacterias E. coli, B. subtilis,
S. aureus, el hongo fitopatgeno F. oxysporum y los hongos patgenos a
humanos T. mentagrophytes y Microsporum canis.

Teniendo en cuenta la complejidad de las mezclas de compuestos presentes
en los diferentes extractos y fracciones se establecieron diferentes
concentraciones de aplicacin; as, para los extractos totales (etanlico) se
trabajaron concentraciones de 200, 225 y 250 mg/ mL; mientras que para las
diferentes fracciones (etrea, diclorometano y acetato de etilo), las
concentraciones fueron de 50, 75,100, 125 y 150 mg/mL . Anexo No. 2

La estudiante de Maestra Luz Marleny Correa Bernal ha ejecutado parte de la
investigacin fitoqumica de la especie B. graveolens la cual fue colectada en
Agua de Dios en la pasada salida de campo, realizada a inicios del presente
ao. Esta trabajo le permitir optar el ttulo de Magister en Biologa con nfasis
en Fitoquimica. En esta investigacin se han realizado las pruebas qumicas
preliminares para los extractos etanlicos y diferentes fracciones obtenidas.
Tambin se han hecho cromatografas uni- y bidimensionales con el propsito
de evidenciar la presencia de diferentes compuestos como se aprecia en las
siguiente cromatoplacas que estn eludas con Ep-AcOEt (7:3) y
Diclorometano- MeOH (9.5:0.5).

ter de petrleo AcOEt (7:3) Diclorometano MeOH (9.5:0.5)

7 6 5 4 3 2 1 B A 7 6 5 4 3 2 1 B A

Cromatoplacas comparativas de los compuestos aislado de fracciones en
ter de petrleo de hojas (A) y fraccin en diclorometano de corteza (B)
de B. graveolens.

Posterior a esto, se ha desarrollado cromatografa en columna tanto de la
fraccin etrea de hojas como de la fraccin en diclorometano de corteza de B.
graveolens. En el primer caso la C.C. fue eluda con ter de petrleo, mezclas
de solventes (ter de petrleo Acetato de etilo) de polaridad creciente y
finalmente con etanol y metanol. De esta columna se pudo obtener cuatro (4)
slidos en las fracciones obtenidas con polaridad media y tres (3) slidos ms
de las fracciones de mayor polaridad. Estos slidos se han limpiado
principalmente con metanol y fueron enviados al grupo de Qumica Orgnica de
la Universidad de Antioqua para la elaboracin de los espectros, por
consiguiente estos slidos se encuentran en estudio espectroscpicos, pero los
tres de mayor polaridad (5,6 y 7) han sido identificados por sus caractersticas
espectroscpicas, como veremos en los resultados. Anexo No. 7

La columna proveniente de la fraccin de diclorometano de corteza, que fue
eluda con mezclas de ter de petrleo Acetato de etilo de polaridad
creciente, con diclorometano y finalmente con etanol y metanol, ha permitido
detectar por comparacin los tres slidos polares obtenidos tambin de la
fraccin de ter de petrleo de hojas.

RESULTADOS DE ESTAS ACTIVIDADES

Los resultados de esta investigacin pueden dividirse en dos secciones
principalmente. Los que corresponden a la deteccin de la actividad
antimicrobiana y los relacionados con la separacin y aislamiento de
metabolitos secundarios presentes en estas muestras vegetales.

En primer lugar los estudios de la determinacin de la actividad antimicrobiana
han sido realizados contra un pull de microorganismos entre los cuales se
encuentran los que se propusieron para esta investigacin y otros adicionales,
que estn causando cuadros clnicos en enfermedades comunes en nuestro
pas.

Los extractos totales de hojas obtenidos de B. simaruba y B. graveolens
presentaron actividad inhibitoria de crecimiento, del tipo bacterioestatico, frente
a S. aureus y B. subtilis cuando se aplicaron a concentraciones de 250 mg/mL

Se realizaron todos los ensayos con cada fraccin aplicadas a cada
microorganismo y se obtuvo que la fraccin de acetato de etilo tanto de hojas
como de corteza de B. graveolens present mayor actividad inhibitoria frente a
S. aureus mostrando un halo promedio de 19,8 mm y 23,0 mm
respectivamente en la concentracin de 150 mg/mL. Mientras que para B.
simaruba se obtuvo una mejor actividad en el extracto total, tanto de hojas
como de corteza a la concentracin de 250 mg/mL A su vez, B. subtilis
present un halo de inhibicin de 18,5 mm en el extracto etanlico de hojas de
la especie B. graveolens, a la concentracin de 250 mg/mL, mientras que,
contra la fraccin de acetato de etilo de corteza el halo de inhibicin fue de 18,3
mm a 150 mg/mL. Anexo No. 2

La evaluacin antifngica de los extractos etanlicos de hojas y corteza tanto
de B. simaruba como B. graveolens a concentraciones de 16,6 y 33,3 mg/mL,
presentaron actividad frente a los tres hongos estudiados. M. canis present
inhibicin a las fracciones de B. simaruba, T. mentagrophytes fue inhibido por
la fraccin de acetato de etilo tanto de hojas y corteza de B. simaruba, mientras
F. oxysporum fue el microorganismo que mayor resistencia mostr a las
diferentes fracciones como se aprecia en los datos de resultados del anexo No.
2.

La CMI para B. subtilis y S. aureus es diferente dependiendo del tipo de
extracto y la especie vegetal que se trabaje. Para las fracciones de ambas
plantas la CMI ptima es de 50 mg/mL.
En la evaluacin antifngica de los extractos etanlicos se observ que el ms
activo fue el extracto etanlico de corteza de B. graveolens en una
concentracin de 33,3 mg/mL frente a T. mentagrophytes con un porcentaje de
inhibicin del 84,4%.

No se present actividad alguna frente a la bacteria E. coli por parte de los
extractos y fracciones de hojas y cortezas de B. simaruba y B. graveolens.

De la investigacin fitoqumica de B. graveolens se han podido aislar y purificar
cinco slidos de la fraccin ter de petrleo de hojas y dos de la fraccin de
diclorometano de corteza.

Los slidos identificados corresponden en la cromatoplaca previa a los nmero
5, 6 y 7. Despus del anlisis de los espectros de RMN tanto de carbono como
del protn y de la comparacin con otras caractersticas fsicas y
espectroscpicas con la literatura, muestran una estructura del tipo cido
triterpnico derivados del esqueleto del tirucalano (Triterpeno tetracclico) y se
han denominado de la siguiente manera. El compuesto 5 corresponde al cido
3-oxotirucala-8,24-dien-21-oico (cido -elemnico), el compuesto 6
corresponde al cido 3-hidroxitirucala-8,24-dien-21-oico (cido -elemlico) y
el compuesto 7 corresponde al cido 3-hidroxitirucala-7,24-dien-21-oico.
Anexo No7

Compuesto 5

Compuesto 6

Compuesto 7

H
O
HOOC
H
H
H
H
H
HOOC
H
H
H
HO
H
H
H
H
H
HOOC
H
H
HO
Contribucin al estudio fitoqumico de Bursera simaruba (L.) Sarg.

Edgar Alfonso Palacios, Jorge Robles Camargo Ph.D.

(Palabras Clave: cromatografa en columna, cromatografa capa delgada, Bursera,
Esteroide, triterpeno )

RESUMEN

El anlisis qumico realizado a los extractos de ter de petrleo de las hojas y de la corteza
de la especie Bursera simaruba permiti aislar e identificar una mezcla de triterpenos
pentacclicos, a y -amirinas y un triterpeno tetracclico, el -sitosterol

INTRODUCCIN

La qumica de las Burseraceas se ha estudiado ampliamente en los ltimos 20 aos. Se han
aislado metabolitos secundarios tales como Geraniol de la corteza de Bursera delpechiana
(Bernal & Correa 1990), Limoneno de la oleoresina de Canarium Luzonicum, (Bruneton
1995), etc. Estos metabolitos han servido de soporte para explicar las propiedades
farmacolgicas que estas plantas poseen, por ejemplo, actividades anti-inflamatorias y
antivirales de algunas resinas (Duwiejua 1993), propiedades antifungicas y antimicrobianas
(Claeson et al 1991), efectos heapatoprotectores (Anand 1992), adems del interes en
estudios sobre leucemia y carcinomas (Jolad 1977). Adicionalmente se ha detectado que los
gneros Bursera y Protium contiene sustancias atitumorales y estimulantes del sistema
nervioso central (Mcdoniel 1972).

A pesar que las Burseraceas se encuentran ampliamente distribuidas en nuestro pas (6
gneros de los 10 reportados en el mundo y en especial el gnero Bursera que es exclusivo
de Amrica (Daly 1993).), no se han realizado estudios qumico en esta familia de plantas.

Debido al gran potencial farmacolgico que posee la familia Burseraceae, el laboratorio de
fitoqumica del departamento de Qumica de la Pontificia Universidad Javeriana con la
financiacin de Colciencias se ha propuesto a travs del presente trabajo separar, purificar e
identificar los metabolitos secundarios mayoritarios tanto de hojas como de la corteza de la
especie Bursera simaruba (L.) Sarg mediante tcnicas cromatogrficas y espectroscpicas.

Este trabajo es de gran importancia ya que puede ser la base para la elaboracin de
proyectos que permitan el desarrollo de productos farmacuticos biosintetizados en
laboratorio que ayuden a la prevencin y curacin de enfermedades, al control de plagas
y/o mejorar el rendimiento de los cultivos.

RESULTADOS

Compuesto Bs1H.
Slido amorfo, con punto de fusin 134-136C; Rf 0.57 en CCD, empleando Petrol:AcOEt
9:1 como fase mvil. Soluble en Petrol, CH2Cl2, CHCl3 e insoluble en Metanol (MeOH).
Debido a que la muestra ha sido insuficiente (1mg) no se han podido efectuar las pruebas
espectroscpicas para poder determinar su estructura.

Compuesto Bs3C.
empleando una mezcla Petrol:AcOEt 9:1 como fase mvil. Mostr una mancha de color
violeta al revelado con vainillina/ H
2
SO
4
. El compuesto es soluble en Petrol, CH
2
Cl
2
y
CHCl
3

3
espectroscopa de RMN, obtenindose los espectros RMNH
1
, el espectro de RMNC
13
y el
espectro IR que se realiz en pastilla de KBr.

Compuesto Bs2H.
empleando una mezcla Petrol:AcOEt 9:1 como fase mvil. Mostr una mancha de color
caf rojizo al revelado con vainillina/ H
2
SO
4
positivo para prueba Lieberman Burchad. El
compuesto es soluble en Petrol, CH
2
Cl
2
y CHCl
3

3
espectroscopia de RMN, obtenindose los espectros RMNH
1
, el espectro de RMNC
13
y el
espectro IR que se realiz en pastilla de KBr.

Compuesto Bs4C.
El compuesto Bs4C se colect de las fracciones 125- 138 de la CC que se realiz a los
extractos etreos de corteza. Este compuesto revela al ultravioleta dando una coloracin
fluorescente ( azul )

DISCUSIN DE RESULTADOS

Compuesto Bs3C
1
3
( 0.1ppm, 0.76ppm, 0.82ppm,
0.98ppm, 1.02ppm, 1.05ppm, 1.10ppm), una seal 3.2ppm que corresponde a un H
carbinlico y una seal a 5.15ppm que corresponde a un H de un carbono vinlico lo que
indica la presencia de un doble enlace. Los datos anteriores se corroboran con los datos del
espectro IR donde se observan seales a 3313.5cm
-1
correspondientes al estiramiento del
OH, tambin existe una seal a 1660cm
-1
que corresponde a un estiramiento C=C, que
corrobora la seal del espectro RMNH
1
donde aparece un H de un carbono vinlico. Por
ltimo, el espectro RMNC
13
muestra 30 seales dentro de las cuales se resaltan (en ppm.):
139.8, 145.4, 124.6, 121.7, 79.3,59.3, 47.5, 39.9, 41.8, 39.8, 31.3, 31.5, 33.2, 17.7, 33.5,
21.6, 23.5, Los espectros RMNH
1
yC
13
fueron comparados con la literatura (Connolly 191,
Vanderland et al 1991)y estas seales nos indican la presencia de una mezcla de dos
compuestos, a la vez tambin nos corroboran lo expresado en las dems pruebas, es decir
que el compuesto Bs2H posee un doble enlace y que presenta un grupo OH.

De toda la informacin anterior se podra inferir que el compuesto Bs2H es una mezcla de
a-amirina y -amirina (triterpeno pentaciclico con funcin OH en C-3). Esto lo confirman
las seales del espectro RMNC
13
, ya que a-amirina segn la literatura presenta un
desplazamiento de 124.3 ppm caracterstico del C-12 y 139.3 ppm, caracterstico del C-13
que indican la presencia del doble enlace y la -amirina presenta desplazamientos de 121.7
ppm asignado al C-12 y 145 ppm asignado al C-13 tambin indicando el doble enlace y un
desplazamiento 78.9 caracterstico del C-3 que indica la presencia de la funcin OH para
ambas sustancias Lo cual coincide con los resultados obtenidos. Por lo tanto se proponen
las siguientes estructuras:

Compuesto Bs2H
1
3
( 0,68ppm, 0.88-0.90ppm, 0.91pm,
102ppm), una seal 3.5ppm que corresponde a un H carbinlico y una seal a 5.35ppm que
corresponde a un H de un carbono vinlico lo que indica la presencia de un doble enlace,
adems, la mayora de seales se encuentran concentradas entre d 0.5 2.5 ppm. Esta
caracterstica es tpica de Terpenos (Shoorely & Rogers 1958).

a -amirina
HO
H
HO
H
H
-amirina
El espectro IR presenta bandas de absorcin a 3336.3 caracterstica de una tensin OH y en
1660 caracterstica de un C=C. lo que estara corroborando lo presentado en el espectro
RMNH
1.

El espectro RMNC
13
muestra 27 seales entre las cuales se destacan 141.3 ppm, 121.8
ppm,que corresponden a carbonos olefnicos, y 72ppm que corresponde a la funcin
alcohol del C-3, confirmando la insaturacin y la funcin alcohol.

Toda la informacin anterior sumado a las pruebas fisicoqumicas nos hace presumir que el
compuesto en mencin es de tipo esteroidal. Debido a esto se efectuaron comparaciones
con la literatura (Khan 1997) y hubo mucha similitud en las seales de los espectros de
RMNC
13
obtenidos con los del sitosterol. Vale la pena aclarar, que el solvente que se
utiliz para disolver la muestra de Bs3C es el mismo que se utiliz para obtener los
espectros reportados en la literatura (CDCl
3
). Por lo tanto los datos reportados se pueden
comparar con los datos obtenidos, ya que estos presentaran los mismo desplazamientos
que los reportados en la literatura.

Con el conocimiento de que el compuesto es un terpeno esteroidal, adems de las
coincidencias de los espectros de RMNC
13
, RMNH
1
, e IR, se propone la siguiente
estructura.

- SITOSTEROL

HO
H H
H
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean expresan los agradecimientos a la Pontificia universidad Javeriana por
la infraestructura, a COLCIENCIAS por el apoyo econmico del proyecto, al Dr. Linares
en el Herbario Nacional de Colombia, Al Dr. Gray por los espectros de RMN.

REFERENCIAS.

Anand, K. Gupta, V. Rangari, V. Singh, B. AND Chandan, K.1992. Planta Medica. 58, pp.
493 495.

Bernal, H. & J Correa. 1990. Especies Vegetales Promisorias de los Pases del Convenio
Andrs Bello, Tomo III. Burseraceae, Editado por Secretaria Ejecutiva del Convenio
Andrs Bello. ( SECAB ).

Bruneton, J. 1995. Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants, Londeres, Lavoisier
TEC, pp. 467 469, 600 602

Claeson, P. Samuelsson,G. Anderson, R.1991.Terpenoids and related compounds Planta
Medica,57 pp. 352-356

Conolly, J. And Hill, A. 1991. Triterpenoids. In. Methods in Plant Biochemistry. edited, By
P.M. Dey and J.B. P. Harborne. Academic Press. Vol. 7,pp. 331-359

Daly, D. 1993.Notes on Bursera in South America, including a New species. Studies in
Neotropical Burseraceae VII Brittonia, 45(3), pp. 240-246

Duwiejua, M. .Zeitlin, P. Waterman J. Chapman,.J. Mhango, P and Provan.,G. 1993.
Planta Medica. 59, pp 12-16.

Jolad, S. Widhoph, R. and Cole., J 1977. Journal of Parmaceutical Sciences, vol. 66, no. 6,
pp. 892-893.

Khan, R. 1997. Sucroside from the Suckers of Mentha arvensis. Phytochemistry. Vol. 45.
No 6. Pp.1295-1296

Mcdoniel, P. And Cole, J.1972. Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 6, No 12, pp.
1992-1994

Shoorely ,J.and Rogers, M. 1958. Nuclear Magnetic Resonance Spectra of steroids. J. Am.
Chem. Soc. 80,5121

Vanderlad Das; S. Bolzani, V. Trevisan, .Young, M. 1991. Phytochemistry. Vol. 30, No. 6
pp.2089-2091

ANEXO
13
LA DIRECCION DE LA CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
HACE CONSTAR
Que JORGE E. ROBLES CAMARGO identificado con c.c. numero 8.719.385,
docente del Departamento de Quimica, ha dirigido los siguientes trabajos de
grado de estudiantes de la carrera de Microbiologia Industrial:
1. Determinacion de la actividad antimicrobiana de las partes aereas (hojas y corteza) de
Bursera tomentosa Tr.&PI. contra algunos fitopatogenos y patogenos del hombre; trabajo de
grado realizado por los estudiantes Natalia Becerra Cobos e Ivan Segura Franco, sustentado
y aprobado el 10 dejuniode 2003. .
2. Evaluacion de la actividad antimicrobiana de los extractos de partes aereas de las
especies de B.simaruba y B.graveolens contra algunos microorganismos pat6genos; trabajo
de grado realizado por las estudiantes Libia Mercedes Ortiz Penaranda y Martha Elizabeth
Sierra Mesa, sustentado y aprobado el 12 dejunio de2003.
3. Detem-iinaci6n de la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos a partir de hojas
y corteza de Protium calanense (Bursareceae) frente a microorganismos patogenos
transmitidos por diferentes vias; trabajo de grado realizado por Diana Yamile Roncancio
Benavides, sustentado y aprobado el 27 de junio de 2001.
4. Actividad antimicrobiana presente en partes aereas de las especies Bursera simaoruba y
Bursera graveolenas (Burseraceas), frente a microorganismos como: Agrobacterium
tumefaciens, Erwinia carotovora, Fusarium oxysporum, Trichoderma viride y Botrytis cinerea;
trabajo de grado realizado por las estudiantes Martha Cecilia Ruiz Giraldo y Clara Marcela
Susunaga Susunaga, sustentado y aprobado el 21 de septiembre de 2000.
Se expide a solicitud del interesado a los dieciocho (18) dias del mes de junio
de dos mil jtres (2003).
Cordialmente.

Carrera de Microbiologia Industrial
Cai-rcra 7 No. 43-82 Edit'lcio Cai-los Ortiy: Oficina 502 Bogota D.C. - Colombia
Conmutador 32083211 cxl. 4123-4073

ANEXO 14

ANEXO 16
Medelln, 4 de abril de 2003

Profesor
JORGE ROBLES R.

Cordial saludo:

Me complace informarle que hemos recibido su artculo Actividad antifngica de
partes areas de las especies Bursera simaruba y Bursera graveolens (Burseraceae),
frente a fitopatgenos como Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea, presentado por
usted junto con los profesores Rubn Torrenegra y Martn Bayona. El trabajo ser
enviado para evaluacin a personas expertas en el tema y ser tenido en cuenta para
nuestro prximo nmero (79, de julio-agosto de 2003). Tan pronto tengamos resultados
le informaremos al respecto.

Atentamente:

DANIEL ALDANA E
Editor
Revista Actualidades Biolgicas

ANEXO 17
Actividad antimicrobiana presente en partes aereas de las
especies Bursera simaruba y Bursera graveolens
(Burseraceas), frente a fitopatogenos como: Fusarium
oxysporumY Botrytis cinerea.
Ruiz M, Susunaga M, Robles J , Bayona M.
1

Institucin: Pontificia Universidad Javeriana -Facultad de Ciencias Bsicas -Grupo de
investigacin de Fitoquimica de la Universidad Javeriana. (GIFUJ).
Resumen
DOS especies vegetales de la familia Burseraceae (Bursera simaruba y Bursera
graveolens) colectadas en Tocaima (Cundinamarca) y Valle de San Juan (Tolima), se
estudiaron con el fin de determinar la actividad andmicrobiana de sus extractos frente a
microorganismos fitopat6genos (Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea).
El material vegetal colectado, separado (hojas y corteza) y molido se extrajo con etanol
al 95%.Par- te del extracto etan61ico se fracciono liquido-liquido con Eter de petr61eo,
Diclorometanp yAcetato de etilo para obtener las respectivas fracciones.
Tanto extractos etan61icos y fracciones fueron evaluados mediante estudios
biodirigidos contra los hongos fitopat6genos Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea,
utilizando el metodo de Crecimiento Radial.
Los extractos etan61icos de hojas y corteza de Bursera simaruba presentaron actividad
fungistatica frente a los hongos fitopatogenos Fusarium oxysporum y Botrytis cinerea;
mientras, el extracto etan61ico de hojas de Bursera graveolens fue active unicamente
frente &fusarium oxysporum.
Las fracciones Eter de petr61eo, Diclorometano y Acetato de etilo (hojas y corteza) de
Bursera simaruba y Bursera graveolens presentaron actividad fungistatica frente a
Fusarium oxysporum. Se determin6 la Dosis Minima Inhibitoria de cada uno de los
extractos y fracciones que presentaron actividad, encontrandose que la DL50 para el
extracto etan61ico se encuentra en el rango de concentraciones entre lOOmg/ml -
332mg/ml y la DL50 para las fracciones en un rango de concentraciones entre 50mg/ml
-166 mg/ml.

Octubre de 2000 - Medellfn, Colombia

Aislar los metabolitos secundarios responsables de las actividades
antimicrobianas que las especies de la familia Burseraceaepresentan, a
travs de estudios biodirigidos y fitoqumicos.
Jorge Robles Camargo Ph.D. (Director)
COLCIENCIAS Cod. 1203-05-10122
contrato No. 449-2000.
Aislamiento de principios
biologicamente activos presentes en
especies colombianas de la Familia
Burseraceae
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA PRESENTE EN
LAS PARTES AEREAS DE LAS ESPECIES
Bursera simaruba Y Bursera graveolens
(BURSERACEAS), FRENTE A
MICROORGANISMOS COMO: Botrytis cinerea
Y Fusarium oxysporum
XXXV CONGRESO NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS.
MEDELLIN, OCTUBRE 10 - 13 / 2000
GIFUJ
Proyecto COLCIENCIAS Cdigo No. 1203-05-10122
Contrato No. 449-2000
DIRIGIDO POR: JORGE E. ROBLES Ph. D.
CODIRIGIDO POR: MARTIN A. BAYONA
Departamento de Microbiologa
REALIZADO POR:
MARTHA RUIZ Y CLARA M. SUSUNAGA
Estudiantes Microbiologa Industrial
OBJETIVO
DETECTAR LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
PRESENTE EN LAS PARTES AEREAS DE LAS
ESPECIES Bursera simaruba Y Bursera
graveolens.
PROBAR EXTRACTOS Y FRACCIONES DE LAS
PARTES AEREAS DE LAS ESPECIES VEGETALES
ESTUDIADAS CONTRA FITOPATOGENOS COMO
F. oxysporum Y B. cinerea, MEDIANTE ESTUDIOS
BIODIRIGIDOS.
INTRODUCCION
LA QUMICA Y
FARMACOLOGA DE LAS
BURSERACEAS SE HA
ESTUDIADO MS
AMPLIAMENTE EN LOS
LTIMOS 20 AOS.
POR MEDIO DE ESTA
INVESTIGACIN SE
EVALU LA ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA
PRESENTE EN PARTES
AREAS DE LAS
ESPECIES B. simaruba Y B.
graveolens. Bursera simaruba
GENERALIDADES BOTANICAS
Arboles o arbustos entre 3 - 35 m de altura.
Conductos resinferos.
Hojas alternas, a menudo pinnada.
Inflorescencia axial, raramente panculas cymosas.
Flores pequeas, usualmente unisexual.
Frutos drupceos, con frecuencia de una semilla.
Corteza, hojas y frutos en todos los miembros de la
familia contienen resina olorosas.
EN LA FAMILIA
BURSERACEAE SE
RECONOCEN HOY
DIA 18 GENEROS,
CON MAS DE 600
ESPECIES
DISTRIBUIDAS POR
LOS PAISES DE
AMERICA
TROPICAL, MALASIA
Y NORESTE DE
AFRICA.
Africa
Amrica
Asia
DISTRIBUCION GEOGRAFICA
QUIMICA DE LAS BURSERACEAS
LAS BURSERACEAS
PRODUCEN
VARIEDAD DE
COMPUESTOS.
MONOTERPENOS
SESQUITERPENOS
TRITERPENOS
FENOLES
OTROS
FARMACOLOGIA DE LAS BURSERACEAS
Bursera graveolens(tatamaco): Hojas en
tratamiento de asma, diarrea, pleuresa,
clculos renales ,tuberculosis y mordedura de
serpiente. Sanar heridas y llagas.
Bursera simaruba(caratero): Cicatrizante de
heridas infectadas, antidiarreico, tratamiento
de resfriados, curar el ombligo de nios recin
nacidos.
GENERO Fusarium
SE CARACTERIZA
POR CONIDIAS
MULTICELULARES,
FUSIFORMES Y
FALCIFORMES QUE
NACEN DE LOS
CONIDIOFOROS
QUE SE AGRUPAN
EN HIFAS CORTAS
RAMIFICADAS.
GENERO Botrytis
CRECIMIETO
MODERADO,
COLONIAS
BLANCAS O GRISES.
PUEDEN SER DE
TIPO MICELIAL,
ESCLEROCIAL,
ESPORULANTE E
INTERMEDIO.
GENERO Trichoderma
EN CAJAS DE PETRI
PRESENTAN UN
COLOR VERDE
BRILLANTE DEBIDO
A LOS
CONGLOMERADOS
DE CONIDIAS.
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
VEGETAL:
Bursera simaruba y
Bursera graveolens
(Corteza y Hojas)
MICROORGANISMOS
ENSAYADOS:
Fusarium oxysporum
Trichoderma viride y
Botrytis cinerea
Agrobacterium
tumefaciens y Erwinia
carotovora
METODOLOGIA
OBTENCION DE EXTRACTOS
BIOAUTOGRAFIA
CRECIMIENTO RADIAL
OBTENCIN DE EXTRACTO Y FRACCIONES
Fraccionamiento
L/L con Eter de petrleo
Material
Vegetal
Fraccin
insoluble
Fraccin Eter
de Petrleo
Fraccin
Diclorometano
Fraccin
insoluble
Fraccin
Acetato de
etilo
Etanol 95% /8 das
Fraccionamiento L/L con CH2Cl2
Fraccionamiento
L/L con AcOEt
Extracto
Etanolico
ANTIMICROBIANOS
EVALUACION ANTIMICROBIANA DE
LOS EXTRACTOS
BIOAUTOGRAFIA
TECNICA DE PERFORACION EN GEL
METODO DE CRECIMIENTO RADIAL
DOSIS MEDIA INHIBITORIA
CRECIMIENTO RADIAL
MUESTRA MEDIO
(PDA)
INOCULO
MEDICIN DEL DIAMETRO DE LA COLONIA
INCUBACION
6 DIAS
Botrytis cinerea
Fusarium oxysporum
Trichoderma viride
CONCENTRACIONES UTILIZADAS
EVALUACION
ANTIMICROBIANA
EXTRACTO
ETANOLICO:
1g/5mL DMSO
FRACCIONES:
0,15g/1.5mL DMSO
DOSIS MEDIA
INHIBITORIA
EXTRACTO
ETANOLICO: 332,
266, 200 Y 100
mg/mL
FRACCIONES: 166,
133, 100 Y 50
mg/mL
Ext. EtOH HOJAS
B. simaruba
F. oxysporum T. viride B. cinerea
Ext. EtOH CORTEZA
B. simaruba
F. oxysporum T. viride B. cinerea
Ext. EtOH HOJAS
B. graveolens
F. oxysporum T. viride
B. cinerea
Ext. EtOH CORTEZA
B. graveolens
F. oxysporum
T. viride B. cinerea
ACTIVIDAD DE EXTRACTO ETANOLICO
FRENTE Botrytis cinerea
EXTRACTO CRECIMIENTO (cm) % DE
CRECIMIENTO
% DE INHIBICION
Control negativo
(DMSO)
5.5 100 0
Control positivo
(Griseofulvina)
3.5 63.6 36.3
Extracto No. 1 3 54.5 45.4
Extracto No. 2 4.75 77.3 22.4
Extracto No.3 5.75 104.5 -4.5
Extracto No. 4 5.75 104.5 -4.5
* La concentraci n uti li zada para l os extractos fue de 200mg/ml .
FRENTE Fusarium oxysporum
(cm)
Control negativo
(DMSO)
6 100 0
Control positivo
(Griseofulvina)
4.5 75 25
Extracto No.1 3.25 54.16 45.8
Extracto No.2 3.25 62.5 37.5
Extacto No.3 4.25 70.8 29.1
Extacto No.4 5 83.3 16.6
*La concentraci n uti l i zada para l os extractos fue de 200mg/ml .
FRENTE Trichoderma viride
(cm)
Control negativo
(DMSO)
9 100 0
Control positivo
(Griseofulvina)
5.5 50 50
Extracto No.1 8 88.8 11.2
Extracto No.2 9 100 0
Extacto No.3 9 100 0
Extacto No.4 9 100 0
*La concentraci n uti l i zada para l os extractos fue de 200mg/ml .
ACTIVIDAD DE FRACCION ETER DE PETRLEO
CRECIMIENTO
(cm)
% DE
CRECIMIENTO
% DE
INHIBICION
FRACCION
ETER DE
PETROLEO F. o B. c F. o B. c F. o B. c
Control negativo
(DMSO)
8 5 100 100 0 0
Control positivo
(Griseofulvina)
3 2 37.5 40 62.5 60
Extracto No. 1 4.8 5 59.3 100 40.6 0
Extracto No. 2 5.3 5.3 65.6 105 34.4 -5
Extracto No.3 5.5 4.8 68.7 95 31.2 5
Extracto No. 4 4.8 4 59.3 80 40.6 20
*La concentraci n uti l i zada para l a fracci n fue de 100mg/mL.
ACTIVIDAD DE FRACCION DICLOROMETANO
CRECIMIENTO
(cm)
% DE
CRECIMIENTO
% DE
INHIBICION
FRACCION
DICLOROMETA
NO F. o B. c F. o B. c F. o B. c
Control negativo
(DMSO)
8 5 100 100 0 0
Control positivo
(Griseofulvina)
3 2 37.5 40 62.5 60
Extracto No. 1 5.3 4 65.6 80 34.3 20
Extracto No. 2 5 4.3 62.5 85 37.5 15
Extracto No.3 5.3 4.5 65.6 90 34.3 10
Extracto No. 4 5.8 5.3 72 105 28 -5
*La concentraci n uti l izada para l a fracci n fue de 100mg/mL.
CRECIMIENTO
(cm)
% DE
CRECIMIENTO
% DE
INHIBICION
FRACCION
ACETATO DE
ETILO F. o B. c F. o B. c F. o B. c
Control negativo
(DMSO)
8 5 100 100 0 0
Control positivo
(Griseofulvina)
3 2 37.5 40 62.5 60
Extracto No. 1 5.7 4.2 72 85 28 15
Extracto No. 2 5 4.7 62 95 38 5
Extracto No.3 5.7 5.5 72 110 28 -10
Extracto No. 4 5.2 5 65.6 100 34.4 0
*La concentracin utilizada para la fraccin fue de 100mg/mL.
ACTIVIDAD DE FRACCION ACETATO DE ETILO
FRENTE A F. oxyspor um
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 50 100 150 200 250 300 350
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJ AS B. si maruba CORTEZA B.si maruba HOJ AS B. graveol ens CORTEZA B. graveol ens
FRENTE A B.ci ner ea
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 50 100 150 200 250 300 350
CONCENTRACION (mg/ ml )
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJAS B.simaruba CORTEZA B.simaruba HOJAS B. graveolens CORTEZA B. graveolens
GRAFICO No.3 DOSIS MEDIA INHIBITORIA DE LA FRACCION
DICLOROMETANO FRENTE A F. oxyspor um
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJAS B. simaruba CORTEZA B.simaruba HOJAS B. graveolens CORTEZA B. graveolens
GRAFICO No.4 DOSIS MEDIA INHIBITORIA DE LA FRACCION ACETATO DE
ETILO FRENTE A F. oxyspor um
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJAS B.simaruba CORTEZA B. simaruba HOJAS b. graveolens CORTEZA B. graveolens
GRAFICO No.5 DOSIS MEDIA INHIBITORIA DE LA FRACCION ETER DE
PETROLEO FRENTE A F. oxysporum
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
%

I
N
H
I
B
I
C
I
O
N
HOJAS B.simaruba CORTEZA B. simaruba HOJAS B. graveolens CORTEZA B. graveolens
CONCLUSIONES
LOS EXTRACTOS ETANOLICOS DE B. simaruba DE HOJAS Y
CORTEZA PRESENTARON LA MAYOR ACTIVIDAD
FUNGISTATICA FRENTE A LOS HONGOS FITOPATOGENOS F.
oxysporum y B. cinerea.
LOS EXTRACTOS ETANOLICOS DE B. graveolens DE HOJAS
PRESENTARON UNA BUENA ACTIVIDAD FUNGISTATICA
FRENTE A F. oxysporum MIENTRAS QUE FRENTE A B. cinerea
LOS PORCENTAJES DE INHIBICION NO FUERON
SIGNIFICATIVOS.
LOS EXTRACTOS ETANOLICOS DE LAS DOS PLANTAS
ESTUDIADAS (B. simaruba Y B. graveolens) NO PRESENTARON
NINGUN TIPO DE ACTIVIDAD FRENTE AL HONGO T. viride.
LAS FRACCIONES EN ETER DE PETROLEO, DICLOROMETANO Y
ACETATO DE ETILO DE LAS PARTES AEREAS DE LAS ESPECIES
B. simaruba Y B. graveolens PRESENTARON UNA BUENA
ACTIVIDAD FUNGISTATICA FRENTE A F. oxysporum.
TODOS LOS EXTRACTOS ENSAYADOS CONTRA T. viride,
PERMITIERON UN MAYOR CRECIMIENTO DE ESTE
MICROORGANISMO.
AGRADECIMIENTOS
A la PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
A COLCIENCIAS
A HERBARIO NACIONAL DE COLOMBIA
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA DE LOS EXTRACTOS
OBTENIDOS A PARTIR DE HOJAS Y CORTEZA
DE Protiumcalanense(Burseraceae) FRENTE A
VARIOS MICROORGANISMOS
Robles Jorge, Granados A., Roncancio D. y Daza P.
XXXVI CONGRESO NACIONAL DE CIENCIAS
BIOLOGICAS. CARTAGENA, OCTUBRE 10-13, 2001
Actividad Antifngicade las Fracciones
de Eter de petrleo frente a A. niger
20 80 3.2 Corteza
15 85 3.4 Hojas
100 0 0 C.Posit
27.5 72.5 2.9 C.Negat
0 100 4 C.Creci
%In %Cr (cm) Fraccin
Actividad Antifngicade las Fracciones
de Diclorometanofrente a A. niger
22.5 77.5 3.1 Corteza
17.5 82.5 3.3 Hojas
100 0 0 C.Posit
27.5 72.5 2.9 C.Negat
0 100 4 C.Creci
%Inh %Cre (Cm) Fraccin
Actividad antifngicade los extractos totales
EtOH frente a Aspergillus niger
97.5 2.5 0.1 Corteza
95 5 0.2 Hojas
100 0 0 C.Pos
27.5 72.5 2.9 C.Neg
0 100 4 C.creci
%In %Cr (cm) Extract
RESULTADOS DE LA BIOAUTOGRAFIA
Actividad antifngicade las Fracciones de
Acetato de etilo frente a A. niger
20 80 3.2 Corteza
12.5 87.5 3.5 Hojas
100 0 0 C.Positi
27.5 72.5 2.9 C.Negat
0 100 4 C.Creci
%In %Cr (cm) Fraccin
Muestrra
Concentracin
(mg/mL)
Dimetro de
Crecimiento
(mm)
Inhibicin
%
E.EtOH.C
F.AcOEt.C
Griseoful.(+)
Dimetils.(-)
F.CH
2
Cl
2
.H
10
15
20
20
15
10
5
30
21
26
22
12
21
18
15
CRECIMIENTO DE Trichoderrma harzianum FRENTE
A Protium calanense
30
13
27
60
30
40
50
25
100
100
0
Fraccin Diclorometano
de Hojas
Trichodermaharzianum
10 mg /mL 15 mg/mL 20 mg/mL
Trichodermaharzianum
Extracto Etanlico
de Corteza
10 mg/mL 15 mg/mL
20 mg/mL
Fraccin en AcOEt de Corteza
Muestrra
Concentracin
(mg/mL)
Dimetro de
Crecimiento
(mm)
Inhibicin
%
E. EtOH.C
F. AcOEt.C
Griseoful.(+)
Dimetils.(-)
F. CH
2
Cl
2.
H
10
15
20
20
15
10
5
30
12
24
19
10
21
13
10
CRECIMIENTO DE Fusarium oxysporum FRENTE
A Protium calanense
60
20
37
67
30
57
67
100 100
0
25
10 mg/mL 15 mg/mL 20 mg/mL
Fusarium oxysporum
Fraccin en AcOEt de corteza
Extracto Etanlico Corteza
25 mg/mL
10 mg/mL 15 mg/mL 20 mg/mL
Fusarium oxysporum
Fraccin en Diclorometano
Hojas
Muestrra
Concentracin
(mg/mL)
Halo de
Inhibicin
(mm)
E. EtOH.C
F. AcOEt.C
Amoxaci.(+)
F. CH
2
Cl
2.
H
10
15
20
20
15
10
8
12
14
16
18
8
10
12
INHIBICION DE Bacillus subtilis FRENTE
A CORTEZA DE Protium calanense
50 g
10
15
20
14
16
FRACCION DICLOROMETANO
FRACCION ACETATO DE ETILO
EXTRACTO ETANOLICO
FRACCIONES Y EXTRACTO
CONCLUSI ONES
Los extractos etanlicos de P. calanensede hojas y
corteza presentaron la mayor actividad antifngica
contra A. niger, con una inhibicin del 95% y
97.5%, respectivamente, cuando se aplica a
10mg\mL.
Los extractos y fracciones de P. calanense de
corteza presentaron actividad antibacteriana
frente a B. Subtilis.
CONCLUSI ONES
Las fracciones de diclorometano y acetato de etilo
de corteza presentaron mayor inhibicin frente a
B. subtilis, respecto a las fracciones de hojas.
Los extractos etanlicos y sus fracciones, no
presentan actividad antifngica significativa frente
a C. albicans.
Las fracciones de ter de petrleo, diclorometano y
acetato de etilo tanto de hojas como de corteza, no
poseen valores significativos de inhibicin frente a
A. niger.
Contribucin al estudio fitoqumico de
Bursera simaruba (L.) Sarg
Departamento de Biologa
Director: Jorge Robles Camargo Ph.D.
Edgar Alfonso Palacios Ortega
TRATAMIETO FRACCIONES
4g fraccin Petrol hojas y corteza
4g fraccin Petrol hojas y corteza
Cromatografa columna
Cromatografa columna
Mezcla Petrol
Mezcla Petrol
-
-
CH2Cl2, CH2Cl2, AcOEt
CH2Cl2, CH2Cl2, AcOEt
hasta EtOH
hasta EtOH
Coleta fracciones 125ml
Coleta fracciones 125ml
aprox
aprox
Concentra a volumen mnimo
Concentra a volumen mnimo
128 fracciones hojas
128 fracciones hojas
180 fracciones Corteza
180 fracciones Corteza
Fracciones 57-69 y 70-84 hojas
Fracciones 57-69 (A) y 70-84 (B) de hojas corridas
en Petrol-AcEt 9:1
A.....B A.....B
Fracciones 78-83 y 84-89 corteza
Fracciones 78-83 (A) y 84-89 (B) de corteza
corridas en Petrol-AcOEt 9:1
A....B A....B
Comparacin de las fracciones puras
de hojas y corteza
(A) Fracciones 57-69 hojas, (B) fracciones 70-84 hojas y
(C) Fracciones 78-89 corteza.
A...b...C A...b...C
RESULTADOS Y ANLISIS
Compuesto Bs2H
Compuesto Bs2H
! Punto de fusin 138-140C.
! Rf de 0.35 en CCD empleando una mezcl Petrol:AcOEt 9:1
como fase mvil.
! Positivo para prueba Lieberman Burchad.
! El compuesto es soluble en Petrol, CH
2
Cl
2
y CHCl
3
e insoluble
en MeOH.
Espectro de RMN
13
C del compuesto Bs2H
(CDCl
3
90 MH
z
)
C-5
C-6
C-3
C-4
C-9
C-14
C-17
C-18
Espectro de RMN
1
H del compuesto
Bs2H (CDCl
3
90 MH
z
)
H-C=
H-C-OH
CH3
CH3
CH3
CH3
Espectro IR en pastilla de KBr del
compuesto Bs2H
E. OH
E. CH(CH ,CH ) 2 3
E. C=C
F. C-H
F. CH3
C. OH
Compuesto Bs3C
HO
H H
H
- SITOSTEROL
ESTRUCTURA PROPUESTA
Compuesto Bs3C
Compuesto Bs3C
! Punto de fusin 176-178C
! Rf de 0.57 en CCD empleando una mezcl Petrol:AcOEt 9:1
como fase mvil.
! El compuesto es soluble en Petrol, CH
2
Cl
2
y CHCl
3
e insoluble
en MeOH.
Espectro de RMN
13
C del compuesto
Bs3C (CDCl
3
90 MH
z
)
C-13
C-13
C-12
C-12
C-3
C-18
C-30
C-18
C-30
Espectro de RMN
1
H del compuesto
Bs3C (CDCl
3
90 MH
z
)
H-C=
H-C-OH
CH3
CH3
CH3
3.2 3.2 5.15 5.15
Espectro IR en pastilla de KBr del
compuesto Bs3C
E. OH
E. CH(CH CH ) 2 3
E. C=C
F. CH(CH ) 2
F. Ch3
C. OH
ESTRUCTURA PROPUESTA
Compuesto Bs2H
-amirina
HO
H
HO
H
H
-amirina
CONCLUSIONES
Los compuesto aislados de la especie Bursera simaruba fueronidentificados
como -amirinay -amirina (estos compuestos se encontraron mezclados)
y -sitosterol.
Los compuestos -amirina y -amirina se encuentran en el tallo mientras
que - sitosterol se encuentra nicamente en las hojas.
-amirina, -amirina y - sitosterol son compuestos de media polaridad
puesto as lo demuestran sus caractersticas fisicoqumicas.
AGRADECIMIENTOS
A Jorge Robles Camargo Ph.D.
Dr. Rubn Torrenegra
COLCIENCIAS (Proyecto No. 1203-05-10122,
Contrato No. 449-2000)
Compaeros del GIFUJ
Herbario Nacional de Colombia
Auxiliares del Laboratorio
Determinacin de la Actividad
Antimicrobiana de las Partes Areas
de Bursera tomentosa Tr. & Pl. contra
Algunos Fitopatgenos y Patgenos
del Hombre
de
de
Bursera tomentosa
Bursera tomentosa
Tr. & Pl. contra
Tr. & Pl. contra
del Hombre
del Hombre
Natalia Andrea Becerra Cobos Natalia Andrea Becerra Cobos
Ivn Alexander Segura Franco Ivn Alexander Segura Franco
Director Jorge Robles Director Jorge Robles
Codirector Mariela Burbano Codirector Mariela Burbano
Aislamiento de Principios
Biolgicamente Activos Presentes
en Especies Colombianas de la
Familia Burseraceae.
Familia
Familia
Burseraceae.
Burseraceae.
COLCIENCIAS ( COLCIENCIAS (Cod Cod. 1203 . 1203- -05 05- -10122, Contrato No. 449 10122, Contrato No. 449- -2000) 2000)
Pontificia Universidad Javeriana Pontificia Universidad Javeriana
RESULTADOS
RESULTADOS
Resultados
Resultados
0,45g 0,45g
Acetato de Acetato de
etilo etilo
6,25g 6,25g
Diclorometano Diclorometano
0,68g 0,68g
ter de ter de
Petrleo Petrleo
14,52g 14,52g 23,51g 23,51g 1334,90g 1334,90g
Corteza Corteza
2,42g 2,42g
Acetato de Acetato de
etilo etilo
5,25g 5,25g
Diclorometano Diclorometano
4,62g 4,62g
ter de ter de
Petrleo Petrleo
30,15g 30,15g 44,61g 44,61g 790,30g 790,30g Hojas Hojas
Cantidad Cantidad
Obtenida Obtenida
Fraccin Fraccin
Cantidad Cantidad
fraccionada fraccionada
Cantidad Cantidad
extracto extracto
total total
Cantidad Cantidad
Recolectada Recolectada
Parte de la Parte de la
planta planta
"
"
Cantidades obtenidas
Cantidades obtenidas
Resultados
Resultados
Actividad del extracto etanlico de
Actividad del extracto etanlico de
corteza contra
corteza contra
Fusarium oxysporum
Fusarium oxysporum
A. Envs B. Revs
A. Envs B. Revs
400 400
300 300
200 200
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
Actividad de la fraccin CH
Actividad de la fraccin CH
2 2
Cl
Cl
2 2
de corteza
de corteza
contra
contra
Trichophytum mentagrophytes
Trichophytum mentagrophytes
;
;
A. Envs B. Revs
A. Envs B. Revs
400 400
300 300
200 200
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
Actividad del Extracto
Actividad del Extracto
Etan
Etan
lico
lico
de hojas
de hojas
contra
contra
Botrytis
Botrytis
cinerea
cinerea
A. Env
A. Env
s B.
s B.
Reves
Reves
400 400
300 300
200 200
100 100
A. A. B. B.
C ( C (- -) )
C (+) C (+)
Resultados
Resultados
Actividad Actividad inhibitoria del inhibitoria del
extracto total de hojas extracto total de hojas
contra contra Bacillus Bacillus cereus cereus. .
400 400
300 300
200 200
100 100
400 400
300 300
200 200
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
Actividad Actividad inhibitoria de la inhibitoria de la
fracci fracci n n ter de petr ter de petr leo de leo de
hojas contra hojas contra Bacillus Bacillus cereus cereus. .
A. A. B. B.
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
Resultados
Resultados
fracci fracci n n Diclorometano Diclorometano de de
400
300
200
100
C (+)
C (-)
400
200
100
C (+)
C (-)
fracci fracci n Acetato de etilo de n Acetato de etilo de
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
fraccion fraccion ter de petr ter de petr leo de leo de
corteza contra corteza contra Bacillus Bacillus cereus cereus. .
400 400
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
200 200
300 300
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
150 150
75 75
fraccion fraccion diclorometano diclorometano
de corteza contra de corteza contra
Bacillus Bacillus cereus cereus. .
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
Actividad Actividad inhibitoria del extracto inhibitoria del extracto
etan etan lico lico de corteza contra de corteza contra
400 400
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
200 200
300 300
50 50
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
Actividad Actividad inhibitoria de la fracci inhibitoria de la fracci n n
acetato de etilo de corteza contra acetato de etilo de corteza contra
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
Pseudomonas Pseudomonas aeruginosa aeruginosa
frente al extracto frente al extracto etan etan lico lico
de hojas de hojas
400 400
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
200 200
300 300
400 400
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
200 200
300 300
frente a la fracci frente a la fracci n n ter de ter de
petr petr leo de hojas leo de hojas
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
frente a la fracci frente a la fracci n n
Diclorometano Diclorometano de hojas de hojas
400 400
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
200 200
400 400
100 100
C (+) C (+)
C ( C (- -) )
200 200 300 300
frente a la fracci frente a la fracci n Acetato n Acetato
de Etilo de hojas de Etilo de hojas
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
#
#
Concentraci
Concentraci
n M
n M
nima Inhibitoria
nima Inhibitoria
Inhibici Inhibici n del Extracto n del Extracto
Etan Etan lico lico de hojas contra de hojas contra
Staphylococcus Staphylococcus aureus aureus. .
25 25
50 50
75 75
12 12
6 6
3 3
25 25
50 50
75 75
12 12
6 6
3 3
Inhibici Inhibici n de la fracci n de la fracci n n ter ter
de petr de petr leo de corteza contra leo de corteza contra
Staphylococcus Staphylococcus aureus aureus. .
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
#
#
Concentraci
Concentraci
n M
n M
nima Inhibitoria
nima Inhibitoria
Inhibici
Inhibici
n de la fracci
n de la fracci
n
n
ter
ter
de petr
de petr
leo de corteza
leo de corteza
contra
contra
Bacillus
Bacillus
cereus
cereus
Inhibici
Inhibici
n de la fracci
n de la fracci
n
n
diclorometano
diclorometano
de hojas
de hojas
contra
contra
Bacillus
Bacillus
cereus
cereus
25 25
50 50
75 75
12 12
6 6
3 3
25 25
50 50
75 75
12 12
6 6
3 3
A. A. B. B.
Resultados
Resultados
#
#
Concentraci
Concentraci
n M
n M
nima Inhibitoria
nima Inhibitoria
Inhibici Inhibici n del extracto n del extracto etan etan lico lico
de hojas contra de hojas contra Bacillus Bacillus cereus cereus
A. concentraciones 3 a 75 A. concentraciones 3 a 75
mg/mL mg/mL
25 25
50 50
75 75
12 12
6 6
3 3
3 3
2 2
1.5 1.5
1 1
0.5 0.5
A. A. B. B.
Inhibici Inhibici n del extracto n del extracto etan etan lico lico
de hojas contra de hojas contra Bacillus Bacillus cereus cereus
B. concentraciones 0.5 a 3 B. concentraciones 0.5 a 3
mg/mL mg/mL
Discusin de Resultados
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
ter de petrleo Diclorometano Acetato de etilo Extracto
etanlico
Fracci ones
COMPARACIN ENTRE EL CONTROL POSITIVO Y LOS
EXTRACTOS DE HOJAS Y CORTEZA DE Bursera tomentosa
CONTRA Bacillus cereus
P
r
o
m
e
d
i
o

h
a
l
o
s

d
e

i
n
h
i
b
i
c
i
n

(
m
m
)
8
8
3
3
CH
CH
2 2
Cl
Cl
2 2
8
8
3
3
ter de petrleo
ter de petrleo
8
8
25
25
Ext. EtOH
Ext. EtOH
CORTEZA
CORTEZA
8
8
3
3
AcOEt
AcOEt
8
8
1.5
1.5
CH
CH
2 2
Cl
Cl
2 2
8
8
2
2
Ext. EtOH
Ext. EtOH
HOJAS
HOJAS
Inhibicin Inhibicin
(mm) (mm)
CMI CMI
mg/ mL mg/ mL
Fraccin Fraccin
planta planta
CMI /
CMI /
Bacillus cereus
Bacillus cereus
0
3
6
9
12
15
18
21
Eter de petrleo Diclorometano Acetato de etilo Extracto
etanlico
Fracciones
COMPARACIN ENTRE EL CONTROL POSITIVO Y
LOS EXTRACTOS DE HOJAS Y CORTEZA DE
Bursera tomentosa CONTRA Staphylococcus aureus
P
r
o
m
e
d
i
o
s

h
a
l
o
s

d
e

i
n
h
i
b
i
c
i
n

(
m
m
)
8
8
75
75
CH
CH
2 2
Cl
Cl
2 2
8
8
25
25
ter de petrleo
ter de petrleo
8
8
100
100
Ext. EtOH
Ext. EtOH
CORTEZA
CORTEZA
8
8
100
100
AcOEt
AcOEt
8
8
100
100
CH
CH
2 2
Cl
Cl
2 2
8
8
25
25
Ext. EtOH
Ext. EtOH
HOJAS
HOJAS
Inhibicin Inhibicin
(mm) (mm)
CMI CMI
mg/ mL mg/ mL
Fraccin Fraccin
planta planta
CMI /
CMI /
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Conclusiones
Conclusiones
"
"
Al fraccionar el
Al fraccionar el
ExtOH
ExtOH
de hojas y corteza, se
de hojas y corteza, se
logr un mayor porcentaje de obtencin de la
logr un mayor porcentaje de obtencin de la
fraccin diclorometano con respecto a las
fraccin diclorometano con respecto a las
fracciones ter de petrleo y acetato de etilo.
fracciones ter de petrleo y acetato de etilo.
$
$
Los extractos y las fracciones de
Los extractos y las fracciones de
B.tomentosa
B.tomentosa
Tr. & Pl. no presentaron
Tr. & Pl. no presentaron
actividad antifngica.
actividad antifngica.
%
%
Los extractos y fracciones de
Los extractos y fracciones de
B.tomentosa
B.tomentosa
Tr
Tr
& Pl. mostraron actividad inhibitoria sobre las
& Pl. mostraron actividad inhibitoria sobre las
bacterias
bacterias
Gram
Gram
Positivas.
Positivas.
Conclusiones
Conclusiones
%
%
La mejor actividad mostrada de los extractos
La mejor actividad mostrada de los extractos
y fracciones de hojas contra
y fracciones de hojas contra
B.cereus
B.cereus
fue la
fue la
fraccin diclorometano.
fraccin diclorometano.
%
%
La fraccin diclorometano y el extracto
La fraccin diclorometano y el extracto
etanlico de hojas presentaron una actividad
etanlico de hojas presentaron una actividad
superior contra
superior contra
S.aureus
S.aureus
con respecto a las
con respecto a las
dems fracciones.
dems fracciones.
%
%
La CMI menor contra
La CMI menor contra
B.cereus
B.cereus
fue la fraccin
fue la fraccin
diclorometano de hojas con 1,5mg/mL
diclorometano de hojas con 1,5mg/mL
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
&
&
Colciencias
Colciencias
&
&
&
&
Directores
Directores
Antiinflamatoria
Antiinflamatoria
de los Extractos
de los Extractos
Etanlicos
Etanlicos
de Hojas y Corteza y
de Hojas y Corteza y
Algunas Fracciones de Hojas
Algunas Fracciones de Hojas
Extraidos
Extraidos
de
de
Bursera
Bursera
simaruba
simaruba
(
(
Burseraceae
Burseraceae
)
)
Actividad del Etanol-Agua.
0
1
3
5
E ta n o l -A g u a
0
0,5
1
1,5
2
D
e
s
p
l
a
z
a
m
i
e
n
t
o

(
m
l
)
Tiempo (Horas)
Evolucin del edema (extractos)
Etanol-Agua
0
1
3
5
Etanol -Agua
0
0,5
1
1,5
2
D
e
s
p
l
a
z
a
m
i
e
n
t
o

(
m
l
)
Tiempo (Horas)
Evolucin del edema (fracciones)
Etanol-Agua
Actividad Antiinflamatoria Indometacina
0
20
40
60
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH Indometacina (Extractos)
% INH
0
20
40
60
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH Indometacina (Fracciones)
% INH
Actividad Antiinflamatoria de los extractos
etanlicos a dosis de 100mg/Kg
0
20
40
60
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH Extractos etanlicos 100mg/Kg
E.E. Hojas
E.E. Corteza
Actividad Antiinflamatoria de Extractos
Etanlicos a 300 mg/Kg
0
20
40
60
80
%
I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
%INH Extractos etanlicos 300mg/Kg
E.E. Hojas
E.E. Corteza
Actividad Antiinflamatoria de las Fracciones
Diclorometano y EdP a 300mg/Kg
0
20
40
60
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH Fracciones 300mg/Kg
F. Diclorometano
F. EdP
Actividad Antiinflamatoria de todas los
extractos y fracciones estudiados
0
10
20
30
40
50
60
70
80
%

I
N
H
1 3 5
Tiempo (Horas)
% INH de Extractos y Fracciones estudiados
E.E.hojas 100mgKg
E.E.hojas 300mg/Kg
F.Diclorometano
F. EdP
a
Anlisis Estadstico para
Extractos
Tratamientos:
Indometacina 5mg/Kg
E.E.hojas 100mg/Kg
E.E.hojas 300mg/Kg
Etanol-Agua 20:80
Anlisis de varianza primera hora
Coeficiente de variacin=18.5%
Anlisis de varianza Tercera Hora
Anlisis de Varianza Quinta Hora
Coeficiente de variacin = 16.36
Anlisis Estadstico para
Fracciones
Tratamientos:
Etanol-Agua 20:80
Indometacina 5 mg/Kg
F. Diclorometano 300
mg/Kg
F. EdP 300mg/Kg
Anlisis de Varianza Primera Hora
Anlisis de Varianza Tercera Hora
Anlis de Varianza Quinta Hora
'Mxima inflamacin se presenta a la quinta
hora.
'Los extractos etanlicos de hojas y corteza a las
dosis de 100 y 300mg/kg presentaron una
actividad antiinflamatoria mxima a las tres
horas, semejante a la expresada por el patrn
(5mg/Kg).
'Las dos fracciones de hojas (CH
2
Cl
2
y EdP) a
dosis de 300mg/Kg presentaron una actividad
mxima a la primera hora, es decir su efecto
fue ms rpido.
'El extracto etnolico que presento la mejor
actividad antiinflamatoria fue el de hojas a
100mg/Kg, seguido por el mismo a 300mg/Kg.
'En el anlisis estadstico para extractos no se
encontraron diferencias significativas entre
bloques a ninguna de la 3 horas medidas, y solo
se encuentran diferencias significativas a la
tercera hora.
'Para fracciones no se encuentran diferencias
entre bloques pero si entre tratamientos.
'Se rechaza Ho en los anlisis de variaza para
fracciones. Todos los tratamientos aplicados no
son iguales.
'Dr. Jorge Robles Camargo
'Prof. Martha Ramirez
'Pontificia Universidad Javeriana
'COLCIENCIAS (Proyecto No. 1203-05-
10122, Contrato No. 449-2000)
'Padres y hermanos
'Auxiliares de laboratorio.
EVALUACION DE LA ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA DE LOS
EXTRACTOS DE PARTES AEREAS DE
LAS ESPECIES Bursera simaruba y
Bursera graveolens CONTRA
ALGUNOS MICROORGANISMOS
PATOGENOS
PERTENECIENTE AL PROYECTO AISLAMIENTO DE
PRINCIPIOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS
PRESENTES EN ESPECIES DE LA FAMILIA
BURSERACEAE.
FINANCIADO POR COLCIENCIAS
Y RADICADO EN LA UNIVERSIDAD
BAJO EL CODIGO # 120106E0101103
DIRIGIDO POR EL Dr. JORGE ROBLES CAMARGO
Ph. D
RESPONSABLE E INVESTIGADOR PRINCIPAL
Codirector : Alvaro Granados.
RESULTADOS Y DISCUSIN
(Ho: El promedio de halo es igual a 5mm
(Ha: El promedio de halo es mayor a 5mm
Cuadro de niveles de significancia de prueba t para
desarrollar la existencia de actividad (Formulacin del
Problema) B. subtilis
200 225 250
0,00000693 0,00002052 0,00000033
200 225 250
0,00000005 0,000000000 0,0000000001
200 225 250
8,64035E-08 0,000000735 0,00000001
200 225 250
0,00000590 0,00001500 0,0000000434
Etanol
Hojas
Corteza
B. graveolens
Etanol
Hojas
Corteza
B. simaruba
Continuacin
(E. coli no present sensibilidad frente a los
extractos.
Anlisis de varianza de 2 factores con varias
muestras por grupo
Extracto etanolico
hojas 200 225 250
12 10 25 RESUMEN 200 225 250
11 9 16 Hojas
8 10,5 20,4 Cuenta 10 10 10
9,5 12 16,8 Suma 125,5 134,5 184,7
12 10 14 Promedio 12,55 13,45 18,47
13 15 22 Varianza 7,9139 13,03 12,258
12 18 13,8
16 16 19 corteza
17 15 18,5 Cuenta 10 10 10
15 19 19,2 Suma 130 131,5 160
corteza 11 15 18 Promedio 13 13,15 16
10 14 17 Varianza 2,7222 0,998 1,5867
12 13 16,3
13,5 14 17,2 Total
14 12,5 15,4 Cuenta 20 20 20
14 12,5 15,2 Suma 255,5 266 344,7
12,5 11,9 16,7 Promedio 12,775 13,3 17,235
15 12 15,6 Varianza 5,0914 6,666 8,1634
15 12,9 14,7
13 13,7 13,9
Anlisis de varianza de dos factores con
muestras por grupo
B. graveolens contra B. subtilis
Continuacin
ANLISIS DE VARIANZA
Muestra 8,9707 1 8,9707 1,3979 0,2423 4,0195
Columnas 237,68 2 118,84 18,518 8E-07 3,1682
Interaccin 22,996 2 11,498 1,7917 0,1764 3,1682
346,54 54 6,4173
Total 616,18 59
Valor crtico
para F
Origen de
las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Dentro del
grupo
Promedio de
los
cuadrados F Probabilidad
Comparacin entre concentraciones de hojas
Extracto etanolico
hojas 200 225 250 Anlisis de varianza de un factor
12 10 25
11 9 16 RESUMEN
8 10,5 20,4 Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza
9,5 12 16,8 Columna 1 10 125,5 12,55 7,9138889
12 10 14 Columna 2 10 134,5 13,45 13,025
13 15 22 Columna 3 10 184,7 18,47 12,257889
12 18 13,8
16 16 19
17 15 18,5 ANLISIS DE VARIANZA
15 19 19,2
Entre grupos 203,52267 2 101,76133 9,1961937 0,0008998 3,3541312
298,771 27 11,065593
Total 502,29367 29
Dentro de
los grupos
Promedio
de los
cuadrados F
Probabilida
d
Valor
crtico para
F
Suma de
cuadrados
Origen de
las
variacione
Grados de
libertad
B. graveolens contra B. subtilis
Continuacin
B. graveolenscontra B. subtilis. Extracto etanolico, hojas
200 225 200 250
Media 12,55 13,45 Media 12,55 18,47
Varianza 7,91388889 13,025 Varianza 7,913888889 12,25789
Observaciones 10 10 Observaciones 10 10
Grados de libertad 17 Grados de libertad 17
Estadstico t -0,62196464 Estadstico t -4,16821027
P(T<=t) una cola 0,27110874 P(T<=t) una cola 0,000322182
P(T<=t) dos colas 0,54221747 P(T<=t) dos colas 0,000644363
225 250
Media 13,45 18,47
Varianza 13,025 12,25789
Observaciones 10 10
Grados de libertad 18
Estadstico t -3,15711476
P(T<=t) una cola 0,00272629
Diferencia hipottica de
las medias
0
Valor crtico de t (una
cola)
1,73406306
Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas
desiguales
desiguales
desiguales
Diferencia hipottica de
las medias
Diferencia hipottica
de las medias
0 0
cola)
1,73960643
cola)
1,739606432
Valor crtico de t (dos
colas)
Valor crtico de t (dos
colas)
2,10981852 2,109818524
Continuacin
(No hay diferencia significativa entre el
dimetro de halo de las muestras de los
extractos y fracciones de corteza y hojas
frente a S. aureus y B. subtilis
Izquierda: Actividad de B. subtilis frente a B. simaruba, hojas, extracto
etanlico, a: 200mg/mL, b: 225mg/mL, c: 250mg/mL y d: DMSO
Derecha: Actividad de S. aureus frente a B. graveolens, extracto etanlico
corteza, a: 225mg/mL, b: 250mg/mL, c: 200mg/mL y d: Gentamicina.
CMI bacteriana para el extracto etanolico
160mg/mL 180mg/mL 180mg/mL 170mg/mL B. subtilis
180mg/mL 170mg/mL 190mg/mL 160mg/mL S. aureus
Corteza Hojas Corteza Hojas
B. simaruba B. graveolens
Bacteria
Actividad del extracto etanlico
PLANTA PARTE FRACCION CONC DIA 2 DIA 4 DIA 6 % C % I
33,33 5 7 11 12,57 87,43
Corteza Etanol 16,66 5 14,5 21,25 24,28 75,72
33,33 5 9,25 9,25 10,57 89,43
33,33 5 10 11,25 12,85 87,15
Corteza Etanol 16,66 5 29,5 35 40 60
33,33 5 16,6 20 22,85 77,15
Control negativo 87.5 mm de crecimiento
Izquierda: T. mentagrophytesfrente a B. graveolens, Hojas,
extracto etanlico 33.3mg/mL.
Derecha: T. mentagrophytesfrente a B. graveolens, Corteza,
extracto etanlico 33.3mg/mL.
Continuacin
PLANTA PARTE FRACCIN CONC DIA 2 DIA 4 DIA 6 % C % I
33,33 5 7 14 15,79 84,21
Corteza Etanol 16,66 5 28,5 34 38,35 61,65
33,33 5 16 26,75 30,17 69,83
33,33 5 12 18,66 21,04 78,96
Corteza Etanol 16,66 5 26,45 28,6 32,26 67,74
33,33 5 11 21,5 24,25 75,75
Control negativo 88,65
Microsporum canis
Izquierda: M. canisfrente a B. simaruba, hojas, extracto
etanlico 33.3mg/mL.
Derecha: M. canisfrente a B. simaruba, corteza, extracto
etanlico 33.3mg/mL
Continuacin
33,33 5 11,5 15 19,35 80,65
Corteza Etanol 16,66 5 28 38,5 49,67 50,33
33,33 5 9,5 9,59 12,37 87,63
33,33 5 22,5 23,75 30,64 69,36
Corteza Etanol 16,66 5 15,25 47,5 61,29 38,71
33,33 5 31 33 42,58 57,42
control negativo 77,5
Fusarium oxysporum
Actividad de B. simarubafrente a
T. mentagrophytes
Hojas Eter de petroleo 30 23,6 38,75 90 102,85 -2,85
40 15,5 33,33 90 102,85 -2,85
50 10,3 32 90 102,85 -2,85
Diclorometano 30 10 29,37 90 102,85 -2,85
40 9,13 35 90 102,85 -2,85
50 9 30,5 74 84,57 15,43
Acetato de etilo 30 15,5 22,5 50,25 57,42 42,58
40 13,8 20,75 48,75 55,71 44,29
50 12 18,45 41,25 47,14 55,86
Corteza Eter de petroleo 30 10,6 30,75 90 102,85 -2,85
40 10,6 29 78,3 89,48 10,52
50 8,86 21,33 82,5 94,28 5,72
Diclorometano 30 12 28,25 81,3 92,91 7,09
40 10,3 26,5 70 80 20
50 10,1 27,62 65,33 74,66 25,34
Acetato de etilo 30 7,6 26 48,25 55,14 44,86
40 7,33 17,83 45 51,42 48,58
50 73 15,83 33 37,71 62,29
CONTROL POSITIVO 16,3 26 28,5
B. simaruba
Actividad de B. graveolensfrente a
T. mentagrophytes
Hojas Eter de petroleo 30 29,6 64,3 77,5 88,6 11,4
40 21 62,3 74,3 84,9 15,1
50 17,3 60 72,3 82,6 17,4
Diclorometano 30 20,6 59 84,5 96,6 3,43
40 19,3 56 73,7 84,2 15,8
50 18 54,5 70 80 20
Acetato de etilo 30 25,7 60 77 88 12
40 19,7 57,5 73,3 83,7 16,3
50 16,7 56,3 70 80 20
Corteza Eter de petroleo 30 19,3 57,5 81,3 92,9 7,12
40 18,6 57 76,8 87,7 12,3
50 18,7 52,9 74 84,6 15,4
Diclorometano 30 22 56 75 85,7 14,3
40 18,5 53 72,3 82,6 17,4
50 16,7 53 69,5 79,4 20,6
Acetato de etilo 30 22,8 55,5 67,5 77,1 22,9
40 18,8 54 65,5 77,1 22,9
50 18,1 52 74 84,6 15,4
B. graveolens
M. canis
Hojas Eter de petroleo 30 29,22 48,33 55 56,4 43,6
40 25,74 41,48 53 59,78 40,22
50 27,75 35,7 50 56,4 43,6
Diclorometano 30 31,25 36,65 58,33 65,79 34,21
40 30,75 32,79 55,75 64,01 35,99
50 28,45 29,61 55 56,4 43,6
Acetato de etilo 30 30,5 41,3 53,2 60,01 39,99
40 26,41 34,98 45,32 51,12 48,88
50 15,8 20,78 40,21 45,35 54,65
Corteza Eter de petroleo 30 34,5 45,65 60 67,68 32,32
40 29,15 42,56 48,25 54,42 45,58
50 25,33 34,23 46,66 52,63 47,37
Diclorometano 30 15,25 47 61,5 69,37 30,63
40 12,75 37,75 59,75 69,39 32,61
50 10,5 37 58,85 66,38 33,62
Acetato de etilo 30 19,5 23,5 32,5 36,66 63,34
40 16,75 20,13 28,33 31,95 68,04
50 9,25 15,22 22,5 25,38 74,62
Microsporum canis
B. simaruba
Izquierda: M. canisfrente a B. simaruba, hojas; fraccin
ter de petrleo 3.3mg/mL.
Derecha: M. canisfrente a B. simaruba, corteza; fraccin
Diclorometano 2.6mg/mL
M. canis
Hojas Eter de petroleo 30 27 50,8 87,5 98,1 1,3
40 26 50,5 78,8 88,8 11,2
50 16,5 45 60,8 68,5 31,5
Diclorometano 30 36 54,3 63,8 71,9 28,1
40 24 46,8 65 73,3 26,7
50 11,5 43,8 55,3 62,3 37,7
Acetato de etilo 30 31 50,8 69,3 69,3 21,9
40 20 44,2 64,8 73 27
50 17,5 40,3 58,8 66,3 33,7
40 21,8 50 71 80,1 19,9
50 20,6 48 66,7 75,2 24,8
Diclorometano 30 12,8 48,8 66,3 74,7 25,3
40 12 47,3 65 73,3 26,7
50 11,8 45 60,3 68 32
Acetato de etilo 30 22,3 49,8 80 90,2 9,76
40 13,5 47,3 76,7 86,5 13,5
50 13,3 45 73,8
Microsporum canis
B. graveolens
F. oxysporum
Hojas Eter de petroleo 30 45,25 48,8 82,5 106 0
40 35,75 45,8 82 106 0
50 26,5 41 72,5 93,5 6,46
Diclorometano 30 40 73,8 77,5 100 0
40 34,75 57 72,5 93,5 6,46
50 27 52,5 65 83,9 16,1
Acetato de etilo 30 25,63 45,2 67,9 87,6 12,4
40 23,1 40,1 65,23 84,2 15,8
50 20,85 35,7 60,33 77,8 22,2
40 29,25 45 66,25 85,5 14,5
50 12,5 44,3 41,25 53,2 46,8
Diclorometano 30 33,5 49,3 85 110 -9,7
40 30,75 48 68,75 88,7 11,3
50 22,32 42 61,25 79 21
Acetato de etilo 30 39,65 53,6 77,5 100 0
40 30,2 50,2 77,5 100 0
50 28,85 46,8 71,44 92,2 7,81
Fusarium oxysporum
B. simaruba
F. oxysporum
Hojas Eter de petroleo 30 39,3 55 80 103,2 -3,22
40 28,3 50,5 78,8 101,6 -1,61
50 25 47,8 76,3 98,38 1,62
Diclorometano 30 33 62,5 86,3 111,3 -11,3
40 20 55,6 82,6 106,5 -6,45
50 16 52,8 72,5 93,54 6,46
Acetato de etilo 30 32 62,8 78,8 101,6 -1,61
40 26,3 54,5 77,5 100 0
50 24,2 57 76 98,06 1,94
Corteza Eter de petroleo 30 37,9 56 86,3 111,3 -11,3
40 36,5 48,3 81,8 105,5 -5,48
50 31,5 45,3 78,8 101,6 -1,61
Diclorometano 30 41,3 61,3 90 116,1 -16,1
40 37,8 53,9 80 103,2 -3,22
50 28,8 55 75 96,77 3,23
Acetato de etilo 30 36,8 75 90 116,1 -16,1
40 35 73,3 78,8 101,6 -1,61
50 45 70 72,5 93,54 6,46
B. graveolens
Fusariumoxysporumfrente a B. graveolens, corteza.
Fraccin acetato de etlo 2.6mg/mL.
CONCLUSIONES
( Los extractos etanlicos y las fracciones de las
partes areas de B. simaruba y B. graveolens
presentaron actividad frente a S. aureus, B. subtilis,
T. mentagrophytes, M. canis y F. oxysporum.
( No se present actividad frente a la bacteria E. coli.
( La fraccin ms activa de la especie B. graveolens
fue acetato de etilo para B. subtilis y S. aureus. Y
en B. simaruba la mayor actividad se present en el
extracto etanlico frente a B. subtilis y S. aureus.
Continuacin
( La actividad antibacteriana presente en las
fracciones y extractos de las especies vegetales es
directamente proporcional a la concentracin
aplicada.
( La CMI para B. subtilis y S. aureus es diferente
dependiendo del tipo de extracto y la especie vegetal
que se trabaje. Para las fracciones de las dos
plantas la CMI optima es de 50mg/mL.
( F. oxysporum fue el hongo que present menor
porcentaje de inhibicin frente a las fracciones de las
partes areas de las plantas.
Continuacin
( En la evaluacin antifngica de los extractos
etanlicos se observ que el ms activo fue corteza
de B. graveolens una concentracin de 33.33mg/mL
frente a T. mentagrophytes con un porcentaje de
inhibicin del 89.43%.
( B. simaruba en sus partes areas present actividad
antifngica frente a M. canis, ya que todas las
fracciones presentaron un porcentaje mayor al 30%.
AGRADECIMIENTOS
(A Colciencias por el apoyo financiero.
(Al Dr. Jorge Robles por su colaboracin y
gua constante para el desarrollo y buen
termino del trabajo.
(Al profesor Alvaro Granados por su
colaboracin.

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