CAPTULO 2.3.13.

ENFERMEDAD DE MAREK

RESUMEN
La enfermedad de Marek (EM) es una enfermedad linfomatosa y neuroptica de las aves domsticas causada por alphaherpesvirus. El diagnstico se realiza por los sntomas clnicos y por las lesiones mediante la observacin directa y microscpica. Los pollos pueden estar infectados de modo persistente con el virus de la EM (MDV) sin desarrollar la enfermedad clnica. La infeccin por el MDV se detecta mediante su aislamiento y la demostracin de antgenos vricos o de anticuerpos. La EM se evita mediante la vacunacin con vacunas mono o polivalentes de virus vivos de varios tipos. La vacuna se inyecta in ovo o a la salida del huevo. En los pollos, la EM ocurre a las 34 semanas de edad o ms tarde, y es ms corriente entre las 12 y las 30 semanas de edad. Los sntomas clnicos observados son la parlisis de las patas y de las alas, con afeccin o engrosamiento de los nervios perifricos, aunque a veces no se observa la implicacin nerviosa, sobre todo en las aves adultas. En funcin de la cepa del MDV, puede ocurrir linfomatosis, especialmente en el ovario, el hgado, el bazo, los riones, los pulmones, el corazn, el proventrculo y la piel. A diferencia de las poblaciones celulares uniformes que se observan en los tumores causados por la leucosis linfoide, la infiltracin nerviosa y los linfomas causados por el MDV contienen clulas linfoides de varios tipos. Los tumores inducidos por el retrovirus aviar y virus reticuloendotelial (REV) son parecidos a los producidos por el MDV. La diferenciacin entre EM y la leucosis linfoide es importante. Las lesiones causadas por el virus de la reticuloendoteliosis tambin pueden confundirse con las de la EM. Identificacin del agente: En condiciones de campo, muchos pollos se infectan con el MDV en las primeras semanas de vida y luego son portadores de la infeccin a lo largo de toda la vida, a menudo sin presentar una enfermedad clara. La infeccin se suele detectar inoculando leucocitos en cultivos en monocapa de clulas de rin de pollo o de fibroblastos de embrin de pato, donde se desarrollan las tpicas placas vricas en cuestin de das. Se conocen dos serotipos de MDV 1 y 2 y un tercer serotipo est representado por el herpesvirus de los pavos (HVT), que est relacionado. El serotipo 1 agrupa a las cepas virulentas y el serotipo 2 a las cepas avirulentas naturales. El antgeno vrico de la EM se puede detectar en el extremo de las plumas de las aves infectadas utilizando una prueba radial de precipitina. Pruebas serolgicas: Los anticuerpos contra el MDV aparecen a las 12 semanas de la infeccin y se suelen reconocer por la prueba de la inmunodifusin en medio slido, la prueba de la inmunofluorescencia indirecta y, a veces, por otras pruebas serolgicas como el enzimoinmunoensayo. Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: La EM se evita vacunando in ovo o a pollitos de 1 da. Se utilizan vacunas con virus vivos. El usado con ms frecuencia es el HVT, en forma acelular (liofilizado) o en forma asociada con clulas (hmeda). Las variantes atenuadas de las cepas del serotipo 1 del MDV constituyen el tipo de vacuna ms frecuentemente usado; tambin las cepas del serotipo 2, particularmente en las vacunas bivalentes, junto con el HTV (de serotipo 3). Las vacunas con serotipos 1 y 2 solo se presentan en la forma asociada con clulas. Tambin se utilizan vacunas bivalentes con los serotipos 1 y 3 o trivalentes con los serotipos 1,2 y 3. Las vacunas bivalentes y trivalentes se han introducido para combatir las cepas muy virulentas del MDV que no estn bien controladas por las vacunas monovalentes usuales. La vacunacin reduce mucho la enfermedad clnica, pero no la infeccin persistente por MDV. Los virus de la vacuna tambin permanecen en las aves durante toda la vida y continan propagndose, lo que determina la ubicuidad del MDV.

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A. INTRODUCCIN
La enfermedad de Marek (EM) (22, 25, 33) es una enfermedad de las aves domsticas (pollos) causada por un herpesvirus. Los pjaros se infectan mediante la inhalacin del polvo contaminado procedente de las jaulas, y siguiendo un ciclo complejo, el virus se propaga a partir del folculo de las plumas de los pjaros infectados (4). La EM aparece a las 34 semanas de vida o ms tarde, y es ms comn entre las 12 y las 30. La EM se relaciona con diferentes sndromes patolgicos, de los que los sndromes linfoproliferativos son los ms frecuentes y los de ms importancia prctica. En la forma clsica de la enfermedad, caracterizada principalmente por las implicaciones nerviosas, la mortalidad no suele superar el 1015% y puede durar desde unas cuantas semanas a muchos meses. En la forma aguda, en la que normalmente hay formacin de linfomas en las vsceras, es corriente una incidencia del 1030% en las aves y pueden aparecer brotes con una incidencia de hasta el 70%. La mortalidad puede aumentar rpidamente en unas cuantas semanas y luego cesar, o puede continuar de modo estable o con una lenta disminucin durante varios meses. En la actualidad, la forma aguda de la enfermedad, con linfomas viscerales extendidos, es la ms comn. En su forma clsica, el sntoma clnico ms corriente de la EM es la parlisis parcial o completa de las patas y de las alas. En la forma aguda, las aves muestran a menudo una grave depresin y algunas pueden morir sin mostrar los sntomas clnicos de la de enfermedad. La enfermedad neoplsica que implica la patologa del cerebro con edema vasognico y ocasiona una parlisis pasajera, est cada vez ms identificada con la EM inducida por las cepas ms virulentas. En la forma clsica, resulta caracterstico el engrosamiento de uno o ms nervios perifricos. Los ms afectados normalmente y los que mejor se observan en la necropsia son los plexos braquiales y citicos, el plexo celaco, el vago abdominal y el nervio intercostal. Los nervios afectados suelen tener un grosor doble o triple del normal, con prdida de la estriacin cruzada normal y de su aspecto brillante, y pueden aparecer grises o amarillentos, y a veces edematosos. A veces se presentan linfomas en la forma clsica de la EM, con frecuencia como pequeos tumores grisceos y blandos en el ovario y, a veces, tambin en los pulmones, los riones, el corazn, el hgado y otros tejidos. El ojo gris, que est causado por una iridociclitis que incapacita al ave para acomodar el iris en respuesta a la luz y origina una pupila distorsionada, es ms comn en las aves viejas (16 18 semanas), y puede ser el nico sntoma que se presente. En la forma aguda, el hallazgo habitual es una extensin linfomatosa difusa en el hgado, las gnadas, el bazo, los riones, los pulmones, el proventrculo y el corazn. A veces tambin aparecen linfomas en la piel rodeando los folculos de las plumas y en los msculos esquelticos. Las aves afectadas suelen tener afectados los nervios perifricos, como en la forma clsica. En las aves jvenes el aumento del tamao del hgado suele ser moderado, pero en las adultas puede estar muy aumentado y con apariencia idntica a la que se presenta en la leucosis linfoide, de la que se debe distinguir. A menudo no hay lesiones nerviosas en las aves adultas con EM. Tanto en la forma clsica de la EM como en la aguda, la enfermedad comienza con la proliferacin de las clulas linfoides, que es progresiva en algunos casos y regresiva en otros. Los nervios perifricos pueden estar afectados por cambios proliferativos, inflamatorios o de infiltracin menor, que se denominan respectivamente lesiones de tipo A, B, y C. Las de tipo A comprenden infiltracin de linfoblastos proliferativos, de linfocitos pequeos y medianos, y de macrfagos, y parecen ser de naturaleza neoplsica. Las lesiones de tipo B se caracterizan por un edema interneurtico, una infiltracin de linfocitos mayoritariamente pequeos y clulas plasmticas, y por la proliferacin de clulas de Schwann, y parecen ser inflamatorias. Las de tipo C comprenden una leve dispersin de linfocitos principalmente pequeos, y a menudo aparecen en aves que no muestran lesiones gruesas o sntomas clnicos. Se consideran lesiones inflamatorias regresivas. La desmielinizacin que ocurre con frecuencia en los nervios con lesiones de tipo A o B es la responsable de la parlisis clnica. Los linfomas en las viscerales y en otros tejidos son citolgicamente similares a las proliferaciones linfoides en los nervios de las lesiones de tipo A. Normalmente, las clulas linfoides son de tipos mixtos, con una frecuencia mayor de linfocitos pequeos y medios, aunque, a veces, predominan los linfocitos grandes y los linfoblastos, particularmente en las aves adultas con EM crnica. Las poblaciones heterogneas de linfocitos en los linfomas de la EM, como se observa en los cortes teidos con hematoxilina-eosina o en los frotis de linfomas teidos con MayGrnwaldGiemsa, es una caracterstica importante para diferenciar esta enfermedad de la de la leucosis linfoide, donde las infiltraciones linfomatosas comprenden linfoblastos uniformes. Otra diferencia importante es que, en la leucosis linfoide, ocurren linfomas grandes en la bolsa de Fabricio, y que los tumores tienen un origen y un modelo de proliferacin intrafolicular. Aunque en la EM la bolsa est en ocasiones implicada en la proliferacin linfoide, el tumor se localiza de modo difuso entre los folculos y es menos patente. Las lesiones nerviosas perifricas no son caractersticas de la leucosis linfoide, como lo son en la EM. La mayor dificultad consiste en distinguir entre la leucosis linfoide y las formas de la EM que se ven a veces en las aves adultas, en las que el tumor es linfoblstico con una marcada inflamacin del hgado y la ausencia de lesiones nerviosas. Si se realizan exmenes post mrtem en varios pjaros afectados, generalmente se puede hacer un diagnstico basado en las lesiones manifiestas y en la histopatologa. Sin embargo, se han descrito otras tcnicas especficas. Se ha utilizado la expresin de un marcador bioqumico Meg para diferenciar entre los tumores de EM, las infecciones latentes de MDV y los tumores inducidos por retrovirus (3). El procedimiento puede requerir reactivos especficos y un equipo, y puede que no sea posible llevar a cabo estas pruebas en laboratorios que no tengan dichos servicios. Otras tcnicas,

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tales como la deteccin por inmunofluorescencia de los antgenos de clulas T activadas presentes en la superficie de clulas tumorales de EM (antgeno superficial asociado a los tumores de EM, o MATSA), o de antgenos de clulas B o IgM en las clulas tumorales de la leucosis linfoide, pueden servir como diagnstico presuntivo, pero dichas tcnicas no son especficas de las clulas tumorales de la EM. Las lesiones nerviosas y las proliferaciones linfomatosas inducidas por algunas cepas del virus de la reticuloendoteliosis son similares a las que se presentan en la EM, tanto a nivel global como microscpico. Aunque el virus de la reticuloendoteliosis no es comn entre las aves de corral, debera tenerse en cuanta como una posible causa de tumores linfoides; su reconocimiento depende de las pruebas virolgicas y serolgicas en las aves. El virus de la reticuloendoteliosis tambin puede causar una enfermedad neoplsica en los pavos, los patos, las codornices y otras especies. Tambin los retrovirus pueden originar una enfermedad proliferativa linfoide en los pavos. Aunque los pollos pueden ser seropositivos para el virus de la reticuloendoteliosis, la enfermedad neoplsica es rara. Las principales caractersticas para un diagnstico diferencial entre EM, leucosis linfoide y reticuloendoteliosis, se muestran en el cuadro 1. La neuropata perifrica es un sndrome que puede confundirse fcilmente con las lesiones neurolgicas causadas por el virus de la EM (MDV). Esto no es muy comn, pero su incidencia puede ir en aumento en algunas poblaciones europeas (3). No existen riesgos sanitarios conocidos para la salud humana cuando se trabaja con el virus de la MD (MDV) o con el herpesvirus relacionado de pavos (HVT). Cuadro 1. Caractersticas tiles para diferenciar la enfermedad de Marek, la leucosis linfoide y la reticuloendoteliosis
Carcter
Edad

Enfermedad de Marek
Cualquiera. Normalmente 6 o ms semanas Frecuentemente parlisis Con frecuencia ms de 5% en aves no vacunadas. Rara en aves vacunadas

Leucosis linfoide
No menos de 16 semanas

Reticuloendoteliosis*
No menos de 16 semanas

Signos Incidencia

No especfica Raramente por encima de 5%

No especfica Rara

Lesiones macroscpicas Implicacin neural Bolsa de Fabricio Tumores en la piel, msculo y proventrculo, ojo gris Lesiones microscpicas Implicacin neuronal Tumores del hgado Bazo Bolsa de Fabricio S A menudo perivasculares Difusos Tumores interfoliculares y/o atrofia de los folculos S S No Focales o difusos A menudo focales Tumor intrafolicular No es frecuente Focales Focales o difusos Tumor intrafolicular Frecuente Aumento difuso o atrofia Puede estar presente Ausente Tumores nodulares Normalmente ausente No frecuente Tumores nodulares Ausente

Sistema nervioso central Proliferacin linfoide en la piel y folculos de las plumas Citologa de los tumores

No No

No No

Clulas linfoides pleomrficas, incluyendo los linfoblastos, linfocitos pequeos, medios y grandes y las clulas reticulares. Raramente solo linfoblastos Clula T

Linfoblastos

Linfoblastos

Categora de clula linfoide neoplsica

Clula B

Clula B

* El virus de la reticuloendoteliosis puede causar varios sndromes diferentes. El sndrome del linfoma bursal es el ms probable en el campo y el que se describe aqu.

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B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente

La infeccin de una poblacin por el MDV puede detectarse aislando el virus de los tejidos de los pollos infectados. Debe tenerse en cuenta la naturaleza omnipresente del MDV y el diagnstico de la EM debe basarse en una combinacin del aislamiento del MDV o de la deteccin del genoma por la PCR y la manifestacin clnica de la enfermedad. Las fuentes ms utilizadas son las capas de clulas leucocitarias de las muestras de sangre con heparina o las suspensiones de clulas de linfoma o de bazo. Se sugiere que, cuando estas muestras se toman en el campo, se transporten al laboratorio en condiciones de refrigeracin. Como el MDV est muy asociado a las clulas, es importante que estas suspensiones contengan clulas viables. Las suspensiones se inoculan en cultivos celulares en monocapa de clulas de rin de pollo o en fibroblastos de embrin de pato (los fibroblastos de embrin de pollo son menos sensibles para el aislamiento primario del virus). Los virus de los serotipos 2 y 3 (vase la seccin C.1.a) son ms fciles de aislar en fibroblastos de embrin de pollo que en clulas de rin de pollo. Normalmente se inocula 0,2 ml de una suspensin que contenga 106107 clulas vivas en monocapas duplicadas crecidas en placas de plstico para cultivo celular (de 60 mm de dimetro). Los cultivos de control inoculados y los no inoculados se incuban a 38.5C en una estufa con humedad que contenga una atmsfera con el 5% de CO2. Alternativamente, se pueden utilizar recipientes de cultivo cerrados. El medio se reemplaza cada dos das. Las reas con efecto citoptico, denominadas placas, aparecen a los 35 das y se pueden contar a los 710 das. A efectos de diagnstico, otra fuente menos comn del MDV son los extremos de las plumas, de las que se puede extraer el MDV libre de clulas. Los extremos de 5 mm de largo, o trozos de piel cortados que contengan los extremos de las plumas, se suspenden en un tampn SPGA/EDTA (sacarosa, fosfato, glutamato y albmina/cido etilndiamino tetraactico) para la extraccin y titulacin del MDV libre de clulas (9). El tampn se hace as: 0,2180 M de sacarosa (7.462 g), 0,0038 M de fosfato monopotsico (0,052 g), 0,0072 M de fosfato dipotsico (0,125 g); 0,0049 M de L-glutamato monosdico (0,083 g); 1% de albmina bovina en polvo (1 g); 0,2% de EDTA (0,2 g); y agua destilada (100 ml). El tampn se esteriliza por filtracin y debe tener un pH de aproximadamente 6,5 Esta solucin se somete a sonicacin y se filtra con filtros de membrana de 0,45 m para la inoculacin en una monocapa de clulas de rin de pollo desecada durante 24 horas. Despus de una absorcin de 45 minutos, se aade medio y el cultivo se incuba como antes durante 710 das. Utilizando estos mtodos, se pueden aislar los serotipos 1 y 2 de MDV, junto con el HVT (serotipo 3), si est presente a consecuencia de una vacunacin. Con experiencia, se pueden diferenciar de modo muy ajustado las placas causadas por los diferentes serotipos del virus teniendo en cuenta el tiempo de aparicin, la velocidad de desarrollo y la morfologa de las placas. Las placas de HTV aparecen antes y son mayores que las del serotipo 1, mientras que las placas del serotipo 2 aparecen ms tarde y son ms pequeas que las del serotipo 1. Las placas causadas por el MDV y el HVT pueden identificarse como tales utilizando anticuerpos fluorescente especficos obtenidos en pollos. Tambin se pueden utilizar anticuerpos monoclonales para diferenciar los serotipos (17).

Reaccin en cadena de la polimerasa

Se han secuenciado los genomas de los tres serotipos (2, 18). Se han elaborado pruebas de reaccin en cadena de la polimerasa para el diagnstico de la EM y se ha descrito una RT-PCR en tiempo real (1, 5, 16) Adems se ha descrito la diferenciacin de algunas cepas oncognicas y no oncognicas de MDV de serotipo 1, y de cepas vacunales de los serotipos 2 y 3 (6, 7, 15, 27, 34). Tambin se puede utilizar la PCR para cuantificar la concentracin de virus en los tejidos (3, 4, 24) o para la deteccin diferencial de MDV y HVT en la sangre o en el extremo de las plumas (5, 13).

2.

Pruebas serolgicas

La presencia de anticuerpos contra el MDV en pollos no vacunados de unas dos semanas de edad constituye una indicacin de infeccin. Antes de esa edad, tales anticuerpos pueden representar una transmisin materna de anticuerpos a travs del vitelo y no constituyen una prueba de infeccin activa. Normalmente los virus, los antgenos y los antisueros estn disponibles en los laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de Marek (vase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres, pero an no se han fabricado reactivos estandarizados internacionalmente.

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a)

Inmunodifusin en medio slido

No hay ninguna prueba prescrita para la comercializacin, pero, para detectar anticuerpos, normalmente se emplea la prueba de la inmunodifusin en gel de agar (IGDA). La prueba se hace en portas de vidrio que contengan agar al 1% en solucin salina tamponada con fosfato que contenga un 8% de cloruro sdico. Se llenan los pocillos adyacentes con antgeno o suero y se incuban a 37C durante 24 horas en una incubadora con humedad para que tenga lugar la difusin; los sueros positivos muestran reacciones de identidad con muestras conocidas de suero positivo y antgeno. El antgeno usado en esta prueba consiste en clulas rotas de cultivos celulares infectados por el MDV o un extracto de extremos de plumas, o piel de animales infectados por MDV que contenga zonas plumosas. El antgeno del cultivo celular se prepara propagando el MDV en clulas de rin de pollo o en fibroblastos de embrin de pollo. Cuando el efecto citoptico muestra confluencia, las clulas se separan del recipiente del cultivo y se suspenden en el medio de cultivo o en la solucin salina tamponada con fosfato sin caldo de triptosa fosfato (la presencia de caldo de triptosa fosfato puede producir lneas inespecficas de precipitacin) a una concentracin aproximada de 1 107 clulas/ml. Luego esta suspensin se congela y descongela tres veces y se usa como antgeno. i) ii) iii) Procedimiento de la prueba Se prepara una solucin de Bactoagar de Difco al 1% en cloruro sdico al 8%, poniendo la mezcla al bao mara. Se puede utilizar bien un portaobjetos o una placa de Petri, y el agar se vierte hasta obtener un grosor de 23 mm. Se excavan los agujeros sobre al agar utilizando un molde con un pocillo central y 6 pocillos espaciados de forma equidistante alrededor del pocillo central. El dimetro de los pocillos debe ser de aproximadamente 3 mm, y los pocillos deben estar separados aproximadamente 4 mm. Los moldes con cter se pueden adquirir en el mercado. El antgeno se coloca en el pocillo central y el antisuero estndar se coloca de forma alterna en los pocillos exteriores. Las muestras de suero para la prueba se colocan en los tres pocillos restantes. De este modo se crear una lnea continua de identidad entre una muestra desconocida cuando sea positiva y el suero de control positivo conocido. Se incuba el porta 24 horas a 37C en un recipiente con humedad y se leen los resultados sobre una lmpara en una habitacin a oscuras.

iv)

v)

Se puede utilizar una variacin de la prueba IGDA para detectar el antgeno del MDV en extremos de plumas como una indicacin de infeccin por el MDV. Se preparan portas de vidrio con agarosa al 0,7% (por ejemplo, A37) en cloruro sdico al 8%, que contengan el antisuero contra el MDV. Se toman los extremos de pequeas plumas de los pjaros a examinar y se insertan verticalmente en el agar, mantenindose los portas como se ha indicado anteriormente. El desarrollo de zonas radiales de precipitacin alrededor de los extremos de las plumas denota la presencia de antgeno NDV en la pluma y, por lo tanto, la infeccin del ave.

b)

Otras pruebas
Otras pruebas para detectar anticuerpos contra el MDV son las pruebas de inmunofluorescencia directa e indirecta. Estas demuestran la capacidad de un determinado antisuero para marcar las placas de MDV en los cultivos celulares (28, 29). Estas pruebas son especficas para cada grupo y ms sensibles que la prueba IGDA. Tambin se puede emplear una prueba de neutralizacin para ver la capacidad que tiene un suero para neutralizar la propiedad del MDV de formar placas (5). Sin embargo, esta prueba es ms adecuada para fines de investigacin que para llevar a cabo un el diagnstico rutinario. Hay disponibles diversos enzimoinmunoensayos (ELISA) para detectar anticuerpos contra MDV (10, 25, 35). En la preparacin de antgeno para la prueba ELISA, se recubren los pocillos de una placa de microtitulacin de 96 pocillos con clulas infectadas por el MDV.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

El control de la EM se consigue principalmente mediante el uso generalizado de vacunas vivas atenuadas (21). Los productos biolgicos comercializados para controlar la EM son virus vivos MVD o HVT respectivamente asociados a clulas o libres de clulas (liofilizados) (vase ms adelante). Aunque se han desarrollado vacunas recombinantes por ingeniera gentica (23), no se comercializan en la actualidad. Las vacunas contra la enfermedad de Marek se inyectan in ovo el da 17 o 18 de la embriognesis (26) o por va subcutnea despus del nacimiento. Los requisitos para producir vacunas se sealan a continuacin y en el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias, pero, para ms informacin, se deben consultar otras fuentes sobre los procedimientos (11. 12 19, 20, 22, 30). Los protocolos se encuentran en la Monografa 589 de la British Pharmacopoeia, y en el Volumen 9, parte 113 del US Code of Federal Regulations (31). Las directrices de este

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Manual de animales terrestres son de carcter general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.

1.
a)

Control del inculo

Caractersticas del inculo
Los virus del grupo MDV se clasifican en tres serotipos 1, 2 y 3 por su relacin antignica. Serotipo 1: Este incluye a todas las cepas patgenas del virus, desde las cepas que son muy muy virulentas plus (vvMDV+) (por ejemplo, la 648A), hasta las muy virulentas (Md/5, Md/11, Ala-8, RB-1B), las virulentas (HPRS-16, JM GA), las de virulencia media (HPRS-B14, Conn A), y finalmente las dbilmente virulentas (CU-2, CVI-988). Estas cepas se pueden atenuar por pases en cultivos celulares, perdiendo las propiedades patognicas pero con retencin de la inmunogenicidad, originando cepas que se han usado como vacunas. Entre las usadas comercialmente se encuentran las cepas atenuadas HPRS-16 y CVI-988 (Rispens). Las variantes atenuadas de las cepas muy virulentas se han usado como vacunas experimentales para proteger contra la forma aguda de EM causada por las cepas muy virulentas, y el uso de la cepa Md11/75/CR2/23 (32) est autorizado en los Estados Unidos de Amrica. Las vacunas contra el serotipo 1 se preparan en forma asociada a las clulas (mojadas) y deben mantenerse en nitrgeno lquido. Serotipo 2: Este incluye cepas naturales avirulentas de MDV (como por ejemplo, SB-1, HPRS-24, 301B/1, HN-1) y se ha visto que algunas de estas confieren proteccin contra las cepas virulentas. Las cepas SB-1 y 301B/1 se utilizan comercialmente, en particular con HVT, en forma de vacunas bivalentes para la proteccin contra las cepas muy virulentas. Las vacunas de serotipo 2 solo existen en forma asociada a clulas. Serotipo 3: ste contiene las cepas de HVT naturales avirulentas (como la FC126, PB1), que se utilizan mucho como vacuna monovalente, y tambin en combinacin con cepas de los serotipos 1 y 2 como vacunas bivalentes o trivalentes contra las cepas muy virulentas de MDV. Se puede preparar HVT en forma libre de clulas como una vacuna liofilizada o bien en forma asociada a clulas (mojada).

b)

Mtodo de cultivo
Los substratos usados para la produccin comercial de vacunas son fundamentalmente fibroblastos primarios de embrin de pollo (CEF) derivados de aves libres de patgenos especficos (SPF) o fibroblastos de embrin de pato. Los CEF de aves SPF son preferibles a las clulas de pato porque existe un mayor conocimiento sobre los patgenos transmitidos por el embrin de pollo y sobre los mtodos para su deteccin.

c)

Validacin como vacuna

Hay mtodos disponibles para comprobar la ausencia de infeccin en las aves SPF (20, 30). Los pollitos procedentes de aves SPF deben estar libres de adenovirus aviares, incluyendo el virus 76 del sndrome de la puesta, el virus de la encefalomielitis aviar, los virus de la leucosis aviar (subgrupos A, B y J), el virus de la nefritis aviar, los reovirus y rotavirus aviares, el virus de la anemia del pollo, el poxvirus de la gallina, el virus de la bronquitis infecciosa, el virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, el virus de la laringotraqueitis infecciosa, el virus de la gripe de tipo A, el MDV, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, el virus de la enfermedad de Newcastle, el virus de la reticuloendoteliosis, Salmonella spp, y el virus de la rinotraqueitis del pavo. Las poblaciones de patos SPF deben carecer de adenovirus aviares, reovirus aviares, Chlamydia, virus de la enteritis del pato, virus tipo I y II de la hepatitis del pato, virus de la gripe tipo A, virus de la enfermedad de Newcastle, Pasteurella (ahora Riemerella) anatipestifer, virus de la reticuloendoteliosis, e infecciones por Salmonella. Tambin puede ser necesario determinar la ausencia de otras infecciones a medida que se vayan reconociendo. Para comprobar que el inculo primario del virus no es patgeno para los pollos, se inocula diez veces la dosis de campo en pollitos SPF de 1 da susceptibles a la EM, para asegurar que no causa lesiones generalizadas o microscpicas significativas debidas a la EM cuando tengan 120 das de edad. Debe advertirse que algunas cepas vacunales de MDV y HTV pueden producir lesiones nerviosas microscpicas leves y transitorias.

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No debe aparecer un aumento de la virulencia despus de seis pases seriados de la cepa vacunal en los pollitos SPF de 1 da susceptibles a la EM. Primero se inocula diez veces la dosis de campo y luego se llevan a cabo los pases inoculando sangre con heparina a intervalos de 57 das, y realizando pruebas de viremia para comprobar que el virus se transfiere en cada pase. Las aves que reciben el ltimo pase han de mantenerse durante 120 das y deben carecer de lesiones por la EM. No obstante, algunas cepas, como la de Rispens, pueden originar lesiones leves de EM. La cuestin clave es que la virulencia no debe variar. Esta es una prueba difcil porque la resistencia gentica de los pollitos influye fundamentalmente en la virulencia patente de los virus, y, por tanto, en el tipo de inculo. Despus de superar con xito las pruebas de inocuidad de laboratorio, se debe confirmar la inocuidad de la cepa en numerosos ensayos de campo. El virus de inculo debe estar libre de los agentes sealados para las poblaciones SPF y de otros contaminantes que se puedan adquirir en el laboratorio. Una cepa vacunal que derive de pavos debe carecer tambin del virus de la enfermedad linfoproliferativa y del virus de la enteritis hemorrgica. Se debe determinar la capacidad del virus del inculo primario y de los virus derivados despus de los pases utilizados para producir el virus vacunal (por lo general, no ms de cinco pases en cultivo de tejidos) para proteger contra la EM. Se han publicado pruebas de proteccin estandarizadas. Implican la vacunacin de los pollitos SPF de 1 da susceptibles a la EM y la reinoculacin de desafo 8 das despus con suficiente MDV como para causar al menos un 70% de incidencia de la EM en los pollitos no vacunados. Se utilizan dos tipos de prueba. En la prueba del ndice de proteccin, se vacuna con una sola dosis de campo (1.000 UFP) (unidades formadoras de placas) y se compara la aparicin de EM en las aves vacunadas y en las no vacunadas. Los ndices de proteccin deben ser superiores a 80, es decir, las aves vacunadas deben mostrar al menos un 80% de reduccin en la aparicin de la EM en comparacin con los controles no vacunados. Tambin se usa una prueba PD50 (dosis media de proteccin), que supone la inoculacin de cinco diluciones seriadas de vacuna, a un cuarto cada dilucin, elegidas para dar proteccin por encima y por debajo del 50%, y luego proceder a un inculo de desafo 8 das despus para determinar el valor PD50. Los ensayos se realizan utilizando una vacuna estndar de referencia como comparacin. La PD50 puede ser tan baja como 4 UFP, pero se pueden obtener valores superiores dependiendo de la cepa vacunal, de si est libre de clulas o est asociada a clulas, y de la presencia o ausencia de anticuerpos maternos en los pollitos de ensayo. Con los datos de la prueba PD50, se ha sugerido que la dosis mnima de vacuna en condiciones de campo debe ser superior a dos valores: 103 PFU, o, 100 PD50. Se deben hacer numerosos ensayos de campo en presencia del virus natural de desafo, utilizando diferentes razas de aves con un estado variable en cuanto a los anticuerpos maternos contra el MDV, para asegurar la eficacia y duracin de la inmunidad. La experiencia indica que una vez adquirida, la inmunidad por vacunacin dura toda la vida.

2.

Mtodo de fabricacin

Las clulas usadas como substrato se siembran en recipientes de fondo liso para una incubacin estacionaria o en recipientes cilndricos para una incubacin rotatoria. Los medios ms utilizados son el medio mnimo de Eagle, o el medio 199, tamponado con bicarbonato sdico y suplementado con un 5% de suero de ternero. La incubacin se hace a 3839C durante 48 horas. Para las vacunas asociadas con clulas, los cultivos se infectan con stock del virus de siembra HVT o MDV para la produccin, en forma asociada a clulas, que por lo general tiene dos pases adicionales ms que el stock primario de virus. Los cultivos se incuban 48 horas y luego se recogen las clulas tratando la monocapa celular lavada con una solucin de EDTA/tripsina para favorecer que las clulas se despeguen. Los recipientes se devuelven a la incubadora (a 38,5C) para permitir la liberacin completa. Las clulas se someten a una centrifugacin a baja velocidad y despus se resuspenden en una mezcla de congelacin formada por medio de crecimiento con 7,515% de dimetil sulfxido (DMSO), y se mantienen a 4C o se distribuyen de inmediato en los recipientes para la vacuna final, que suelen ser ampollas de vidrio, que se cierran a la llama y se congelan en nitrgeno lquido. Las vacunas liofilizadas, sin clulas, se pueden preparar a partir de cepas de HTV, pero no de cepas de MDV. Para la produccin de esta forma de vacuna, los cultivos infectados por HTV se incuban 72 horas, las clulas infectadas se separan del recipiente como se indic anteriormente, o se raspan de las paredes del recipiente. Las clulas se suspenden en un volumen pequeo de medio de crecimiento, se centrifugan, y se resuspenden en una solucin tamponada con un estabilizador que contenga sacarosa al 8%, pero que est libre de protena para impedir la formacin de espuma. La suspensin se sonica para liberar el virus y los restos celulares se eliminan: luego, se diluye la suspensin con un estabilizador completo como SPGA- aadido en los recipientes finales, y se liofiliza.

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Las diluciones para las vacunas asociadas a las clulas o para las libres de clulas se basan en la experiencia previa, como el nmero de dosis necesario por recipiente, ya que el contenido en virus del material recogido no se puede ensayar antes del llenado de los recipientes. La carga de virus del producto final se puede consignar luego en la etiqueta.

3.

Control interno

Para obtener resultados ptimos en la preparacin de la vacuna asociada a las clulas, es esencial una velocidad de congelacin lenta (15C por minuto) y una descongelacin rpida. El ttulo de infectividad de las clulas infectadas y, por tanto, el nmero de dosis por ampolla, se determina despus del llenado de las ampollas. De modo similar, el contenido en virus de la suspensin final de las vacunas liofilizadas y, por tanto, el nmero de dosis por recipiente se determinan tras el llenado.

4.
a)

Control de lotes
Identidad
Utilizando la tcnica de la inmunoflorescencia (IF) con suero monoespecfico, se debe comprobar que el producto es de la misma especificidad que el virus del inculo. Esto se realiza mejor utilizando anticuerpos monoclonales. Inocuidad y esterilidad Se requiere realizar muchas pruebas sobre los materiales utilizados para producir la vacuna y sobre el producto final. Las clulas de substrato deben proceder de una poblacin de aves SPF que estn libres de agentes transmitidos verticalmente. Las substancias de origen animal usadas en la preparacin de las vacunas, como el suero, la tripsina y la seroalbmina bovina, deben carecer de agentes indeseables. Los lotes de vacuna final producida deben probarse para la ausencia de bacterias contaminantes, hongos, micoplasmas, y de los virus indicados para poblaciones SPF; tambin deben realizarse pruebas de pureza a los diluyentes. Varias instituciones oficiales recomiendan pruebas adecuadas para la deteccin de agentes indeseables en todas las etapas de la produccin de vacunas (20, 22, 30) y tambin aparecen en el captulo 1.1.8. Se debe inocular diez veces la dosis vacunal, o una cantidad de diluyente equivalente a dos veces la dosis vacunal, en pollitos SPF de 1 da. No deberan producirse reacciones adversas durante un perodo de observacin de 21 das.

b)

Potencia
La dosis estndar de cada tipo de vacuna es 1.000 UFP por pollito o por huevo. Los ensayos sobre el contenido vrico se realizan en lotes de vacuna para confirmar que se alcanzar la dosis correcta de vacuna por cada ave.

c)

Duracin de la inmunidad
Para la duracin de la inmunidad solo se realiza una prueba con el virus de inculo. En apariencia, tal inmunidad es duradera para toda la vida.

d)

Estabilidad
Las pruebas de estabilidad se hacen con seis lotes representativos de la vacuna para demostrar que se mantiene el ttulo de virus durante la caducidad indicada para la vacuna. Estas pruebas deben realizarse bajo las condiciones de almacenamiento de la vacuna. El producto liofilizado debe tener una caducidad de 12 meses cuando se mantiene a 28C. Los fabricantes pueden doblar el contenido de virus para compensar alguna prdida en la titulacin durante su almacenamiento. Se suministran lquidos adecuados para la dilucin con las vacunas asociadas a clulas y con las liofilizadas. Se debe comprobar la estabilidad de la vacuna reconstituida en un perodo superior a 2 horas.

e)

Conservantes
No se aaden conservantes a la vacuna ni a los diluyentes.

f)

Precauciones (riesgos)
Con las vacunas asociadas a clulas, es necesario evitar daos en las ampollas, que pueden explotar al retirarlas del nitrgeno lquido. Se debe utilizar proteccin ocular. Las vacunas reconstituidas se deben

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mantener en fro durante su aplicacin y las asociadas a clulas deben agitarse para mantener las clulas en suspensin.

5.
a)

Pruebas sobre el producto final

Inocuidad
Vase la seccin C.4.b.

b)

Potencia
Vase la seccin C.4.c.

REFERENCIAS
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* * *
NOTA: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de Marek (vase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int)

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