EFECTO DE LAS CONDICIONES DE AGITACIN Y AIRACIN EN LA
PRODUCCIN DE GIBERELINAS POR G. fujikuroi, EN UN CULTIVO TETRAFASICO
MICELAR Ma. de la Luz X. Negrete Rodrguez, M. D. Gonzlez Llanes, F. R. Reyes Garca, Eleazar M. Escamilla Silva Departamento de Ingeniera Qumica, Instituto Tecnolgico de Celaya Av. Tecnolgico y A. Garca Cubas S/N. Celaya, Guanajuato, 38010, Mxico. Resumen Las giberelinas (GAs) son hormonas promotoras del crecimiento, presentes en las plantas superiores y que tienen efecto en todas las etapas del crecimiento; desde la germinacin hasta la senescencia. En la actualidad estn identificadas y caracterizadas 126 GAs en plantas y caldos de cultivo de hongos y bacterias, pero slo una tercera parte presentan actividad biolgica; las ms importantes son GA 1 , GA 3 , GA 4 , GA 7 . La giberelina GA 3, tambin llamada cido giberlico, es la ms representativa de las biolgicamente activas. En la produccin de GAs es determinante el estudio de parmetros de proceso como el pH, la temperatura, el tipo de propelas, la velocidad de agitacin y el suministro de gas permiten establecer las mejores condiciones de crecimiento del hongo para la biosntesis de GAs, y as obtener la mayor productividad del bioproceso Introduccin La fermentacin con microorganismos filamentosos, en biorreactores con agitacin mecnica es compleja, debido a que con el incremento de la biomasa en el curso del cultivo se afecta la hidrodinmica y la transferencia de oxgeno [5,6,8]; estos aspectos son particularmente importantes en el cultivo de hongos filamentosos ya que tanto la generacin de biomasa como la produccin de diversos metabolitos dependen de stos factores, como consecuencia de la disminucin de la transferencia de masa, la productividad para el metabolito de inters se ve disminuida [3,6,7]. Al incrementar la velocidad de agitacin se puede mejorar la transferencia de oxgeno y disminuir los problemas de mezclado, sin embargo, tambin se incrementa la energa suministrada y la frecuencia a la que el microorganismo circula por la regin del impulsor. En la regin cercana al impulsor, los esfuerzos de corte son mayores que en la regin cercana a la pared del biorreactor, este gradiente se incrementa con el aumento de la biomasa. Entonces, las limitaciones en el mezclado y en la transferencia de oxgeno aumentan a medida que transcurre el tiempo de cultivo, debido al aumento de la viscosidad aparente. El incremento de la viscosidad aparente tambin es resultado de la interaccin entre las delgadas, largas y ramificadas hifas del hongo [1]. El aumento en los esfuerzos de corte, puede provocar la fragmentacin de las hifas, lo que puede afectar negativamente la productividad del metabolito de inters. Metodologa Se estableci un aceite vegetal como nica fuente de carbono, que present mayor produccin de GAs . Posteriormente se estudiaron diferentes condiciones hidrodinmicas mediante la aplicacin de un diseo experimental fraccionado completo, de donde se seleccion el arreglo de propelas a usar, la velocidad de alimentacin del gas de alimentacin y la velocidad de agitacin. Teniendo optimados estos parmetros se realiz el cultivo a dos pH superiores. XXXIII Encuentro Nacional y II Congreso Internacional AMIDIQ 1 al 4 de Mayo de 2012, San Jose del Cabo, BCS, Mexico
Pagina 2550 2012 Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenieria Quimica AMIDIQ Establecida la fuente de carbono, las condiciones de agitacin/aireacin y el pH de cultivo que reportaron la mayor productividad de GA 3 , se realizaron cultivos ahora a velocidades de agitacin superiores (mayor energa suministrada). En cada uno de los bloques de experimentos mencionados se analiz el efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento de G. fujikuroi, la biosntesis de GA 3 , GA 4 y GA 7 y productividad de GA 3 . La estrategia experimental seguida en este trabajo se muestra en la Tabla 1. Las condiciones de cultivo as como la formulacin del medio de cultivo se presentan para cada bloque de experimentos.En la Tabla 2 se presentan los niveles para los factores estudiados. Tabla 1: Estrategia de experimentacin. Seleccin de la fuente de carbono Efecto de la agitacin/aeracin Efecto del PH Efecto de la velocidad de la agitacin Aceite de arroz Factor A: Arreglo de propelas 3R y 2RM PH de 3.5 500 rpm Aceite de girasol Factor B: Vel. de agitacin, 500 y 600 rpm PH de 4.5 600 rpm Aceite de soya Factor C : Flujo de gas, 0.5 y 1.0 vvm PH de 5.5 700 rpm Aceite de crtamo 800 rpm 900rpm Tabla 2. Niveles para los factores estudiados en el efecto de la velocidad de agitacin/aireacin sobre la produccin de GAs. Factor Nivel 1 Nivel 2 A-arreglo de propelas 3R 2RM B-velocidad de agitacin, rpm 500 600 C-flujo de gas (aire), vvm 0.5 1.0 Se emple un diseo experimental factorial completo 2 3 ,usando dos tipos de arreglo de propelas: Uno con tres propelas Rushton y otro con dos Rushton y una marinera. La velocidad de agitacin se trabaj a 500 y 600 rpm y el flujo de aire fue de 0.5 y 1.0 vvm. Resultados y discusin Las fuentes y concentracin de los diferentes nutrientes en el medio de cultivo se establecieron a partir de trabajos [2,4]. Los aceites vegetales, como el aceite de linaza, de girasol, de oliva y de algodn, estn reportados como una buena opcin en la produccin de GAs, ya que reportaron incrementos del 300 al 559% en el rendimiento de GAs; con respecto al uso de sacarosa como fuente de carbono. El incremento en el rendimiento de GAs se atribuye a que los aceites son inertes a la represin catablica por carbono y a que favorecen la disponibilidad de acetil-CoA [9]; pero tambin a que pueden comportarse como vectores de oxgeno, favoreciendo la concentracin de oxgeno disuelto en el medio de cultivo. XXXIII Encuentro Nacional y II Congreso Internacional AMIDIQ 1 al 4 de Mayo de 2012, San Jose del Cabo, BCS, Mexico
Pagina 2551 2012 Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenieria Quimica AMIDIQ La Figura1 muestra las curvas de crecimiento de G. fujikuroi obtenidas con los diferentes aceites empleados como nica fuente de carbono; las cuales no presentaron la fase de adaptacin, debido a que el medio de cultivo empleado estuvo limitado por nitrgeno. Figura 1. Cintica de crecimiento de G. fujikuroi empleando aceites vegetales La biomasa acumulada en la fase de balance (I) fue muy similar (10-14 g l -1 ) con los aceites de crtamo, girasol y arroz, pero inferior con el aceite de soya. La mxima biomasa en la etapa de almacenamiento (II) mostr relacin con la composicin de cidos grasos saturados de los diferentes aceites, lo anterior se muestra en la Figura 2. El aceite de arroz, que tiene con la mayor composicin de cidos grasos saturados, report la menor biomasa y los aceites con menor composicin de estos cidos grasos reportaron la mayor biomasa; esto se atribuye a que los cidos grasos insaturados presentan mayor facilidad en su transporte a las clulas que los cidos grasos saturados. Figura 2. Mxima biomasa lograda con cada uno de los aceites vegetales y su relacin con la composicin de A.G.S. A.G.S-cidos grasos saturados A.G.M-cidos grasos mono-insaturados, A.G.P.-cidos grasos poli-insaturados. La etapa de mantenimiento (III), es la de mayor inters en el cultivo para la produccin, ya que es donde se presenta la produccin de GAs; el aceite de arroz present la etapa de mantenimiento ms larga. La etapa de disminucin de la biomasa (IV) se present con el aceite de crtamo y el aceite de soya, y el que sta etapa se presente, es indicacin de que las reservas de carbohidratos y lpidos se han agotado o no fueron suficientes para mantener la biomasa y por lo tanto la biosntesis de GAs se ver afectada. Las curvas de crecimiento obtenidas fueron bien descritas por el modelo de Gompertz, con coeficientes de correlacin mayores a 0.99 y sin tendencia en las grficas de dispersin. El modelo XXXIII Encuentro Nacional y II Congreso Internacional AMIDIQ 1 al 4 de Mayo de 2012, San Jose del Cabo, BCS, Mexico
Pagina 2552 2012 Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenieria Quimica AMIDIQ de Gompertz con dos parmetros fue adecuado para describir las curvas de crecimiento, sin embargo, cuando se present disminucin en la biomasa el modelo de Gompertz con tres parmetros present mejor correlacin, por lo que se decidi trabajar con l para describir las cinticas de crecimiento de G. fujikuroi en el desarrollo de ste trabajo. Las encontradas con los diferentes aceites fueron de 1.37x10 -2 a 3.45x10 -2 h -1 , la menor la report el aceite de soya y la mayor el aceite de arroz. Las curvas de crecimiento obtenidas se presentan en la Figura 3. La mxima biomasa obtenida en los cultivos realizados con el arreglo de propelas 3R fue superior, independientemente de la velocidad de agitacin y aireacin a la encontrada en los cultivos realizados con el arreglo de propelas 2RM. En promedio, los cultivos con las propelas 2RM reportaron 15 g l -1 de biomasa mxima, con una desviacin estndar de 1.54, mientras que las fermentaciones con las propelas 3R reportaron 20.81 g l -1 de biomasa mxima, con una desviacin estndar de 1.64. La biomasa mxima promedio de los cultivos realizados fue de 17.91 g l -1 ,con desviacin estndar de 4.10.
Figura 3. Cinticas de crecimiento de G. fujikuroi bajo diferentes condiciones de agitacin/aireacin (diseo 2 3 ) El anlisis de varianza de la mxima biomasa report que el arreglo de propelas fue el nico factor significativo, con confianza de 95%. En la Figura 4a se muestra la grfica de superficie de respuesta para la productividad en funcin del arreglo de propelas y velocidad de agitacin. Donde se observ que el arreglo de propelas 3R a 600 rpm increment la productividad. La Figura 4b muestra la superficie de respuesta de la productividad en funcin del arreglo de propelas y del flujo de aire, donde se observ que el arreglo 3R y el flujo de 1 vvm de gas favorecieron la productividad. La Figura 4c muestra la superficie de respuesta de la productividad en funcin de la velocidad de agitacin y el flujo de aire, en esta grfica se observ que 600 rpm y 1 vvm de aire incrementaron la productividad.
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Figura 4. Superficie de respuesta para la productividad de GA 3 en funcin: a) del arreglo de propelasy de la velocidad de agitacin, b) del arreglo de propelas y del flujo de aire, y c)de la velocidad de agitacin y del flujo de aire. El anlisis estadstico sobre la productividad de GA 3 mostr que el arreglo de propelas 3R, la mayor velocidad de agitacin, 600 rpm, y de aireacin, 1 vvm, favoreci la productividad. Los diferentes experimentos generaron como ya se mencion diferentes condiciones de suministro de oxgeno, pero adems las diferentes condiciones de operacin influyeron en la dispersin de la fase orgnica (aceite vegetal) en el medio de fermentacin.
Conclusiones Se encontr una relacin inversa entre la composicin de cidos grasos saturados de los diferentes aceites estudiado con la mxima biomasa lograda; el aceite de arroz que presenta la mayor composicin de cidos grasos saturados, report la menor biomasa. El medio de cultivo formulado para estudiar la produccin de GA 3 , empleando como nica fuente de carbono diferentes aceites vegetales, report las ms altas concentraciones de GA 3 con aceite de arroz y con aceite de crtamo. El cultivo con aceite de arroz report la mayor productividad de GA 3 ; adems, tambin report uno de los ms bajos rendimientos y productividades para GA 7 . El cultivo con aceite de crtamo report la segunda mayor productividad para GA 3 , pero la mayor XXXIII Encuentro Nacional y II Congreso Internacional AMIDIQ 1 al 4 de Mayo de 2012, San Jose del Cabo, BCS, Mexico
Pagina 2554 2012 Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenieria Quimica AMIDIQ para GA 7 . Reformulando el medio de cultivo se logr incrementar la productividad de GA 3 empleando aceite de arroz como nica fuente de carbono. Las diferentes condiciones hidrodinmicas estudiadas no presentaron un claro efecto sobre la . En general, la mxima biomasa obtenida fue mayor con el arreglo de propelas 3R que con el arreglo de propelas 2RM. Sin embargo, s se observ un claro efecto en la produccin de GA 3 , los cultivos con el arreglo de propelas 3R reportaron las mayores productividades de GA 3 . El arreglo de propelas 3R (D/d=3), 600 rpm y 1 vvm de gas (aire) report la mayor productividad de GA 3 . Slo el cultivo a 600 rpm mostr un efecto en la . Al incrementar la velocidad de agitacin (energa suministrada) se favoreci la disminucin del tiempo en que se alcanz la mayor concentracin de GA 3 . Referencias 1. Cui YQ, van der Lans R.G.J.M. y K.Ch.A.M. Luyben. Effect of agitation intensities on fungal morphology of submerged fermentation.Biotechnology and Bioengineering, (1997). 2.Escamilla-Silva, E. M., Dendooven, L., Uscanga-Reynell, J.A., Monroy-Ramrez, A.I., Gonzlez-Alatorre, G. y M. M. de la Torre.Morphological development and gibberellin production by different strain of Gibberellafujikuroi in shake flask and biorreactor. World Journal of Microbiology and Biotechnology, (1999). 3. Galindo, E., Velasco, D. y A. Snchez. Reologa y mezclado de caldos de fermentacin de alta viscosidad. Fronteras en Biotecnologa y Bioingeniera. (1996). 4. Gzman, G. Y. Obtencin de giberelinas utilizando diversas fuentes de carbono. Tesis de Licenciatura en Ingeniera Qumica. ITC. Celaya, Guanajuato. Mxico.(2000). 5. Kossen, N.W.F., The morphology of filamentous fungi. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnoogy, (2000). 6. Papagianni, M., Fungal morphology and metabolite production in submerged micelial processes. Biotechnology Advances, (2004. 7. Patio, V. M., Establecimiento de un proceso de fermentacin sumergida para la produccin de cido giberlico a nivel laboratorio y su escalamiento a planta piloto. Tesis de Maestra en Biotecnologa. Instituto de Biotecnologa, UNAM, Cuernavaca, Morelos. (1995). 8. Riley G.L., Tucker K.G., Paul G.C. y C.R. Thomas. Effect of biomass concentration and mycelial morphology on fermentation broth rheology.Biotechnology and Bioengineering, (2000). 9. Tudzynski, B y K. Holter., Gibberellin biosynthetic pathway in Gibberellafujikuroi: evidence for gene cluster. Fungal Genetics and Biology,(1998).
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