Volume 9

Volume 9(3)
Dezembro 2012
ib.usp.br/revista
Especial Cronobiologia
Revista da Biologia
Publica textos de todas as reas da Biologia, abordando questes gerais (ensaios e revises) e especficas (artigos experimentais originais, descrio de tcnicas e resumos expandidos). H espao tambm para perspectivas pessoais sobre questes biolgicas com relevncia social e politica (opinio). A Revista da Biologia gratuita e exclusivamente on-line. Sua reproduo permitida para fins no comerciais. ISSN1984-5154 www.ib.usp.br/revista
Expediente
Editor Executivo Carlos Rocha Coordenadores Agustn Camacho Daniela Soltys Pedro Ribeiro Rodrigo Pavo Editor cientfico Mirian David Marques Consultores cientficos Barbara Mizumo Tomotani Cintia Etsuko Yamashita Crhistiane Andressa da Silva Cyrus Antnio Villas Boas Daiane Gil Franco Diego de Carvalho Emerson Castilho Martins rico Felden Pereira Erika Cecon Fbio Viegas Caixeta Felipe Beijamini Gisele Akemi Oda Ilton Santos da Silva Joo Paulo de Pontes Matsumoto Jos Eduardo Soubhia Natali Kathiane dos Santos Santana Marco Antonio Pires Camilo Lapa Marina Granado e S Mark Thomaz Ugliara Barone Pedro Leite Ribeiro Renata Brandt Nunes Renata Pereira Lima Rodrigo Pavo Srgio Arthuro Mota Rolim Wataru Sumi Editores grficos Juliana Roscito Leonardo M. Borges
Contato
revistadabiologia@gmail.com Revista da Biologia Rua do Mato, trav. 14, 321 Cidade Universitria, So Paulo So Paulo, SP Brasil CEP 05508-090
Volume 9(3) Publicado em dezembro de 2012
Imagem da capa: Ecuador circle of Life por glorious journey photoraphy (www.flickr.com/glorious_journey_photography/)
Editorial
Mirian David Marques Museu de Zoologia, Universidade de So Paulo
Todos os ambientes na Terra so cclicos e nossa vida construda em condies alternantes de claro e escuro, quente e frio, seco e mido... Esta relao permanente com ciclos ambientais provoca uma sensao de intimidade com fenmenos oscilatrios. Talvez tenha sido essa sensao que trouxe outra: a de que o conhecimento sobre ritmos biolgicos intuitivo e que no h necessidade de aprofundamento no assunto, sequer de formalizao de uma rea especfica do conhecimento, como a cronobiologia. Felizmente esta tendncia tem perdido foras e o estudo dos ritmos biolgicos vem se firmando como uma rea digna de respeito. Sua popularidade aumentou significativamente a partir dos anos 1990, com a descoberta das alas moleculares responsveis pela gerao dos ritmos. Como sempre acontece, o aspecto favorvel e altamente promissor, provocado pela popularidade, foi acompanhado por outro no to recomendvel, que o descaso com o tratamento formal e conceitual do fenmeno rtmico. A literatura cronobiolgica recente mostra exemplos de uso indevido de conceitos e terminologia, alm e muito pior de resultados obtidos em condies experimentais inadequadas e aplicao equivocada da metodologia pretensamente especializada. Com todos estes altos e baixos, ainda assim a rea cresce rapidamente, com descobertas e novos detalhamentos importantes. Entre as tendncias atuais favorveis est aquela que trs de volta a pesquisa de ritmos no ambiente natural. Procedimento fundamental para a compreenso de mecanismos adaptativos, a pesquisa de campo havia sido posta de lado em favor dos dados obtidos em laboratrio, o que pode explicar a raridade de interlocuo da cronobiologia com a ecologia. Cresce tambm o nmero de trabalhos que usam a biologia molecular como ferramenta aplicada a protocolos clssicos no estudo de ritmos. Praticamente, todo o conhecimento bsico das propriedades e mecanismos rtmicos foi baseado numa metodologia de caixa preta. As ferramentas moleculares esto auxiliando na abertura da caixa e melhorando a compreenso dos processos. Este breve apanhado da situao da cronobiologia no cenrio moderno explica um pouco as razes que me levaram a aceitar o convite dos editores da Revista da Biologia para que organizasse este nmero especial. Na posio de veterana, sinto-me responsvel pela divulgao de trabalhos daqueles que se iniciam na rea. E o que melhor do que divulgar resultados de alunos em diferentes nveis de formao? Os textos originais mostraram a diversidade de interesses e a diversidade do grau de envolvimento com o estudo de ritmos biolgicos. Mostraram tambm as dificuldades de muitos para lidar com os processos temporais, reflexos do ainda pequeno nmero de cursos e de publicaes bsicas em cronobiologia. Esperamos todos, que esta amostra dos trabalhos em desenvolvimento sirva de incentivo para aumentar o interesse pelo tema. Assuntos interessantes no o que falta, como se pode comprovar pelos trabalhos apresentados. Antes de encerrar, quero deixar aqui meus agradecimentos e dos editores a todos aqueles que muito colaboraram para que este nmero fosse possvel. Cada texto foi analisado por dois revisores. Os revisores eram ps-graduandos ou ps-doutorandos, voluntrios. importante dizer que nenhum convidado recusou-se a participar; pelo contrrio, todos se ofereceram para revises posteriores, caso fossem necessrias. Um agradecimento especial aos editores, pelo convite e pela oportunidade de divulgao do trabalho em cronobiologia. A disposio de manter esta revista elaborada por pesquisadores no docentes revela entusiasmo e interesse que tornam a vida acadmica ainda mais excitante. Por fim, preciso mencionar a pacincia enorme que precisaram ter para lidar com minhas muitas impossibilidades, provocadas por motivos acadmicos e pessoais. Mas, depois de tantos adiamentos, o nmero est pronto e com muitos pontos de interesse. Boa leitura.
Glossrio
Mirian David Marques1 & Gisele Oda2 1 Museu de Zoologia, Universidade de So Paulo 2 Departamento de Fisiologia, Instituto de Biocincias, Universidade de So Paulo
Estudando propriedades temporais, uma novidade dentro da biologia, especialistas em cronobiologia precisaram desenvolver mtodos experimentais especiais e uma nova terminologia que descrevesse adequadamente conceitos e fenmenos. Os termos foram surgindo aos poucos, medida que se fazia necessria uma descrio precisa dos processos encontrados. Atravs de uma vista geral nos termos abaixo, podemos ter uma ideia dos diferentes caminhos percorridos pelos pioneiros no estudo dos ritmos biolgicos, ora adotando a terminologia clssica da fsica de movimentos oscilatrios, ora criando neologismos, como zeitgeber, acrofase e circadiano. Neste glossrio, apresentamos apenas alguns dos termos empregados, aqueles usados mais frequentemente. Mantivemos a forma tradicional e mais aceita pela comunidade de cronobilogos, apesar de que novas denominaes tm surgido, causando, s vezes, problemas de compreenso dos fenmenos que deveriam descrever com preciso. Para outras definies, podero ser consultadas as referncias: Aschoff J, Klotter K, Wever R. 1965. Circadian vocabulary. In: Circadian Clocks, J Aschoff (ed.). Amsterdam: North-Holland Publishing Co. Glossrio. 2003. In: Cronobiologia: Princpios e Aplicaes, N Marques e L Menna-Barreto (orgs.) p. 361-368. Refinetti R. http://www.circadian.org/dictionary.html
Termos
Acoplamento (ingls coupling) interao de dois osciladores, resultando em ajustes mtuos de seus perodos e fases. Ad libitum (latim vontade) condio de manuteno de animais em laboratrio em que alimentos e/ou gua so disponibilizados continuamente. Acrofase (ingls: acrophase) fase na qual a varivel rtmica assume o valor mximo. Unidade: hora/minutos ou graus/ minutos. Actograma (ingls: actogram) representao grfica do padro de atividade/inatividade de um organismo. O grfico consiste no empilhamento de registros de 24 horas cada um, de modo a facilitar a visualizao da distribuio temporal da atividade e do repouso. Adiantamento de fase ver deslocamento de fase Amplitude (ingls: amplitude) diferena entre os valores mximo e mdio de uma varivel rtmica. Unidade: mesma da varivel medida. Arrastamento (ingls: entrainment) processo dinmico no qual um ciclo externo fora um oscilador, modificando o seu perodo e estabelecendo uma relao de fase fixa entre eles. Arrastamento paramtrico (ingls: parametric entrainment) forma de arrastamento devida principalmente ao foramento contnuo do zeitgeber. No arrastamento por um ciclo claro/escuro, a luz atua continuamente (parametricamente) sobre o oscilador durante toda a fotofase. Arrastamento no paramtrico (ingls: non-parametric entrainment) forma de arrastamento devida ao impulsiva do zeitgeber, restrita a fases discretas do oscilador. Em condies naturais, os impulsos acontecem nos crepsculos matutino e vespertino. Atraso de fase ver deslocamento de fase Catemeralidade padro exibido por animais que apresentam episdios de atividade em intervalos espordicos e randmicos durante o dia ou noite. Durante esses episdios, ocorrem forrageamento, interaes sociais e todas as atividades que garantem a sobrevivncia da espcie. Padres catmeros foram originalmente descritos em primatas. Circadiano (ingls: circadian) cerca de um dia. Circarritmo (ingls: circa-rhythm) ritmo endgeno, gerado por um oscilador cujo perodo semelhante quele de um ciclo ambiental (dia/noite, mars, lunar, etc) e que, em condies naturais, arrastado por ele. Criofase ver termoperodo. Curva de resposta de fase (acrnimo: CRF) (ingls: phase response curve, PRC) demonstrao grfica de deslocamentos de fase (atrasos e adiantamentos) causados por uma nica perturbao administrada nas diferentes horas circadianas de um oscilador em livre curso. Deslocamento de fase (smbolo ) (ingls: phase shift) mudana de fase, que pode ser: adiantamento de fase (smbolo +) (ingls: phase advance) ou atraso de fase (smbolo -) (ingls: phase delay). Dessincronizao (ingls: desynchronization) perda da sincronizao entre um ritmo e seu zeitgeber ou entre dois ritmos.
Dessincronizao interna (ingls: internal desynchronization) perda da sincronizao entre ritmos de um mesmo organismo, pela quebra da ordem temporal interna. Dia subjetivo (ingls: subjective day) dia na escala de tempo de organismo em livre-curso. Por exemplo, horrios em que um animal diurno expressa atividade, em condio ambiental constante de claro ou de escuro. Dirio (ingls: daily) com a durao precisa de um dia. Diurno (ingls: diurnal) caracterizao de um fenmeno peridico dirio que ocorre durante o dia, em ciclos dia/noite. Oposto de noturno. Fase (smbolo letra grega , fi) (ingls: phase) tempo correspondente a uma frao do perodo de uma oscilao. Fotoperodo (ingls: photoperiod) relao entre a durao das fases de claro e de escuro, em ciclo claro/escuro, dividido em: - fotofase (ingls: photophase): fase de claro do fotoperodo - escotofase (ingls: scotophase): fase de escuro do fotoperodo Fotoperodo esqueleto (ingls: skeleton photoperiod) regime de iluminao em que so empregados dois pulsos de luz que simulam os crepsculos matutino e vespertino. Frequncia (ingls: frequency) o recproco de perodo: nmero de vezes que um fenmeno ocorre em um determinado intervalo de tempo. Hora circadiana (ingls: circadian time) unidade de tempo que corresponde a /24h. Hora do zeitgeber (ingls: zeitgeber time) unidade de tempo que corresponde a 1/24 do perodo de um zeitgeber. Infradiano (ingls: infradian) que tem uma frequncia menor do que uma vez por dia, portanto com um perodo mais longo (at 28h) que o circadiano. Livre curso (ingls: free-run) estado do oscilador biolgico quando o organismo submetido condio experimental em que todas as variveis ambientais so mantidas constantes. Mascaramento (ingls: masking) processo de sincronizao ou de perturbao da expresso de um ritmo provocado por um fator ambiental sem que haja modificao do perodo ou da fase do oscilador. MESOR acrnimo de Midline Estimating Statistic of Rhythm o valor mdio da curva ajustada a uma srie temporal de varivel rtmica. Noite subjetiva (ingls subjective night) noite na escala de tempo de organismo em livre curso. Por exemplo, horrios em que um animal noturno expressa atividade, em condio ambiental constante de claro ou de escuro. Noturno (ingls: nocturnal) caracterizao de um fenmeno peridico que ocorre durante a noite, em ciclos dia/noite. Ordem temporal interna (ingls: internal temporal order) estado em que ficam arranjados os diversos ritmos de um organismo. expressa pelo estabelecimento de relaes de fase estveis entre os diferentes osciladores internos. Oscilador (ingls: oscillator) sistema capaz de gerar uma variao peridica em uma varivel de estado. Perodo (ingls: period) intervalo de tempo em que uma oscilao se completa. Ps efeitos (ingls: after-effects) propriedade do ritmo detectada em condio de livre curso, que faz com que a expresso rtmica mantenha traos de uma condio prvia de arrastamento. Relao de fase (smbolo letra grega , psi) (ingls: phase relation) Diferena entre duas fases de referncia correspondentes a dois osciladores. Ritmo biolgico (ingls: biological rhythm) varivel fisiolgica/comportamental que assume valores que variam periodicamente. Ritmo circadiano (ingls circadian rhythm) ritmo biolgico gerado endogenamente com um perodo de cerca de 24 horas, detectado em condies ambientais constantes. Ritmo dirio (ingls daily rhythm) ritmo biolgico exibido por um organismo em condies naturais, com perodo igual a 24 horas. Importante: nem todos os ritmos dirios so circadianos. Ritmo endgeno (ingls: endogenous rhythm) ritmo gerado pela ao de um oscilador e que pode ser detectado apenas em condies de livre curso. Tambm chamado ritmo em livre curso. Srie temporal (ingls: time series) conjunto de valores obtidos em observaes ou procedimentos experimentais, organizados cronologicamente. Sincronizao (ingls: synchronization) processo dinmico que resulta em dois osciladores apresentando uma relao de fases fixa. Tau (smbolo ) perodo do ritmo endgeno. Termofase ver termoperodo Termoperodo (ingls: termoperiod) relao entre as duraes das fases quente e fria, em um ciclo ambiental de temperatura dividido em duas fases: - termofase (ingls: termophase): fase com a temperatura mais alta - criofase (ingls: cryophase): fase com a temperatura mais baixa Transientes (sempre no plural) (ingls: transients) estados oscilatrios temporrios entre dois estados estveis. Termo usualmente empregado para descrever o estado do oscilador na passagem da condio em livre curso para a condio de arrastamento, ou na passagem de uma condio de arrastamento para outra em que h deslocamento de fase. Ultradiano (ingls: ultradian) que tem frequncia maior do que uma vez por dia, portanto com perodo mais curto (at
20h) que o circadiano. Zeitgeber (neologismo alemo, plural zeitgebers) ciclo ambiental que promove o arrastamento de um oscilador biolgico. O oscilador tem seu perodo ajustado pelo zeitgeber e mantm com ele uma relao de fase estvel.
Smbolos
C = fase de claro do fotoperodo E = fase de escuro do fotoperodo CE = ciclo claro/escuro. Ex. CE 14:10 representa 14 horas de claro e 10 horas de escuro em cada ciclo de 24 horas. CC = claro constante EE = escuro constante CRF = curva de resposta de fase = perodo do ritmo em livre curso; revelado apenas em condies ambientais constantes. T = perodo do zeitgeber = fase = deslocamento de fase + = adiantamento de fase - = atraso de fase = relao de fase
Principais Genes e Protenas do Relgio Biolgico

Clk (Clock) acrnimo de Circadian Locomotor Output Cycles Kaput, protena CLK. CLK, dimerizada com CYC (insetos) ou com BMAL1 (mamferos), tem papel central como fator de transcrio no oscilador circadiano. Descrio: Vitaterna MH, King DP, Chang AM, Kornhauser JM, Lowrey PL, McDonald JD, Dove WF, Pinto LH, Turek FW, Takahashi JS. 1994. Mutagenesis and mapping of a mouse gene, Clock, essential for circadian behavior. Science 264 (5159): 71925. cry (cryptochrome), protena CRY dois genes, cry1 e cry2 codificam para duas flavoprotenas, sensveis luz azul e encontradas tanto em plantas, quanto em animais. Em insetos e em plantas, CRY1 modula diretamente o acesso da luz ao oscilador circadiano. Em mamferos, CRY1 e CRY2 so repressores de transcrio, atuando diretamente no oscilador. Descrio da ao em Drosophila: Emery P, So WV, Kaneko M, Hall JC, Rosbash M. (1998). CRY, a Drosophila clock and light-regulated cryptochrome, is a major contributor to circadian rhythm resetting and photosensitivity. Cell, 95 (5): 66979. cyc (cycle), protena CYC fator de transcrio que se dimeriza com CLK. Correspondentes moleculares em mamferos so Bmal1 e Mop3. Descrio: Rutila JE, Suri V, Le M, So WV, Rosbash M, Hall JC. 1998. CYCLE is a second Bhlh-PAS clock protein essential for circadian rhythmicity and transcription of Drosophila period and timeless. Cell, 93: 805-813. frequency (frq), protena FRQ Componente principal do oscilador molecular do fungo Neurospora. Tanto o mRNA de frq, como sua protena expressam ritmo circadiano e FRQ reprime a abudncia de seu prprio transcrito. Descrio: Feldman JF, Hoyle MN. 1973. Isolation of circadian clock mutants of Neurospora crassa. Genetics, 75: 605-613. kai, protena KAI Componente positivo da ala de retroalimentao do oscilador da bactria Synechococcus. KAI liga-se ao DNA dos promotores de genes do relgio e ativa sua transcrio. Descrio: Ishiura M, Kutsuna S, Aoki S, Iwasaki H, Andersson CR, Tanabe A, Golden SS, Johnson CH, Kondo T. 1998. Expression of a gene cluster kaiABC as a circadian feedback process in cyanobacteria. Science, 281 (5382): 1519-1523. per (period), protena PER Gene originalmente detectado no cromossomo X de Drosophila melanogaster. PER dimeriza-se com TIM e o complexo volta para o ncleo, inibindo o fator de transcrio de per e tim, o heterodmero CLK/CYC. Em mamferos ocorrem trs genes da famlia per: per1, per2 e per3. Descrio: Konopka RJ, Benzer S. 1971. Clock mutants of Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 68 (9): 21126. tim (timeless), protena TIM Protena TIM age em conjunto com PER, formando um dmero. TIM degradada durante o claro, tendo, portanto, papel essencial no processo de arrastamento pelo ciclo claro/escuro. O papel de tim em outros grupos animais ainda no est esclarecido. Descrio: Sehgal A, Price JL, Man B, Young MW. 1994. Loss of circadian behavioral rhythms and per RNA oscillations in the Drosophila mutant timeless. Science, 263 (5153): 16031606. Tau mutao mutao de um nico gene, detectada no hamster, Mesocricetus auratus, que afeta a expresso circadiana, provocando um encurtamento do perodo do ritmo endgeno de 24h para 20h. Descrio: Ralph MR, Menaker M. 1989. A mutation of the circadian system in golden hamsters. Science, 241: 1125-1127.
Volume 9(3)
ndice
Diurnos ou Noturnos? Discutindo padres temporais de atividade
Diurnality and nocturnality: discussing activity patterns Barbara M. Tomotani, Gisele A. Oda
Investigando a sincronizao ftica na natureza

The photic synchronization in nature: an investigation Danilo Eugnio de Frana Laurindo Flres
Efeitos das variaes de temperatura ambiental em ritmos circadianos

Effects of environmental temperature changes on circadian rhythms Patricia Tachinardi
13
Gentica molecular dos ritmos circadianos em insetos vetores

Molecular genetics of circadian rhythms in insect vectors Gustavo Bueno da Silva Rivas
19
Period3: um gene relacionado com a sincronizao de ritmos circadianos pela luz

Period3: a gene related with synchronization of circadian rhythms to light Danyella Silva Pereira, Flavia Cal Sabino, Guilherme Silva Umemura
26
Fotopigmentos e arrastamento ftico

Photoentrainment and Photopigments Leonardo H. R. G. de Lima
32
As protenas de relgios e o eixo hipotlamo-hipfise-gonadal de fmeas de roedores 41

Clock protein and hypothalamus-pituitary gonadal axis of female rodents Maristela de Oliveira Poletini
Cronobiologia vegetal: aspectos fisiolgicos de um relgio verde

Plant chronobiology: physiological aspects of a green clock Ivan Santos Salles e Marcos Silveira Buckeridge
45
Coordenao temporal da degradao das reservas dos cotildones de jatob (Himenaea courbaril L.) 50
Temporal coordination of degradation of jatobs cotyledons reserves (Himenaea courbaril L.) Ivan Santos Salles e Marcos Silveira Buckeridge
Ritmos de populaes: o caso das abelhas sem ferro

Population rhythms: the case of stingless bee colonies Rodrigo Cantamessa Gonalves, Mirian David Marques
53
O valor biolgico do perodo circadiano
The biological value of the circadian period Bruno Jacson Martynhak, Flvio Augustino Back, Fernando Louzada
58
Gnese e ontognese do ritmo de sono/viglia em humanos

Genesis and ontogenesis of sleep/wake rhythm in humans Clarissa Bueno, Daniela Wey
62
Interao entre sincronizadores fticos e sociais: repercusses para a sade humana 68

Interaction between photic and social synchronizers: repercussions for human health rico Felden Pereira, Tmile Stella Anacleto, Fernando Mazzilli Louzada
Estimativa de tempo em humanos: bases, ontognese e variao diria Time estimation in humans: basis, ontogenesis and daily variation
Mario Andr Leocadio Miguel
74
Novo instrumento de aferio do ritmo de temperatura perifrica em humanos: um estudo de caso 80

New device for measuring peripheral temperature rhythm in humans: a case study Daniela Wey
Revista da Biologia (2012) 9(3): 16

DOI: 10.7594/revbio.09.03.01
Ensaio
Diurnos ou Noturnos? Discutindo padres temporais de atividade

Diurnality and nocturnality: discussing activity patterns
Barbara M. Tomotani1, Gisele A. Oda2
1,2
Departamento de Fisiologia, Instituto de Biocincias, Universidade de So Paulo
Contato dos autores: 1 babi.mt@gmail.com, 2gaoda@ib.usp.br Resumo. A classificao de um animal como diurno ou noturno parece, primeira vista, extremamente simples quando se caracteriza o comportamento geral. Entretanto, tal distino no to evidente nem na natureza e nem nas condies artificiais de laboratrio. Atualmente, os mecanismos fisiolgicos que definem mamferos diurnos e noturnos esto sendo investigados em diversos nveis biolgicos. Relatos de animais com fases diferentes de atividade em laboratrio e em campo esto aumentando, podendo revelar um aspecto fundamental da organizao temporal, especialmente em mamferos. Palavras-chave. Arrastamento, mascaramento, ritmo dirio, roedores. Abstract. The identification of nocturnality or diurnality in animals is thought to be simple and obvious when one is characterizing behavioral aspects. However, this distinction may be difficult both in nature and under laboratory artificial conditions. The physiological mechanisms that define diurnal and nocturnal animals are being studied and reports of animals which display a change from day- to nightactivity are increasing. This may reveal a fundamental aspect of the temporal organization, especially in mammals. Keywords. Daily rhythm, entrainment, masking, rodents. Recebido 14out10 Aceito 21ago12 Publicado 27dez12
Introduo
A atividade geral dos animais engloba uma srie de comportamentos caractersticos de uma espcie como aqueles relacionados busca por alimentos, defesa e reproduo. Os animais raramente esto ativos o tempo todo, alternando atividade e repouso e, em geral, a maior parte dos componentes da atividade se concentra durante o dia ou noite, dependendo da espcie. Ns nos referimos a esse momento no qual a atividade se concentra como a fase do ritmo de atividade. Dependendo dessa fase, os animais so tradicionalmente classificados como diurnos, noturnos ou crepusculares (Daan, 1981; Levy e cols., 2007). A fase de atividade relacionada a especificidades fisiolgicas, morfolgicas e comportamentais, pois dependendo da hora do dia em que um animal est ativo ele enfrenta desafios ambientais distintos, que eventualmente ocasionam a seleo de especializaes (Kronfeld-Schor e Dayan, 2008). Nesse sentido, verificamos, por exemplo, olhos com grande preciso em diversas espcies de aves diurnas, em contraposio a olfato aguado em mamferos noturnos, refletindo as diferentes estratgias de orientao espacial durante o dia e a noite. Estas consideraes nos permitem afirmar que as diferentes espcies ocupam nichos temporais distintos, uma vez que o nicho no compreende apenas quais recursos so utilizados ou qual a rea de utilizao dos mesmos, mas tambm quando esse animal utiliza tais
recursos (Kronfeld-Schor e Dayan, 2008). Apesar de parecer uma caracterstica bastante bvia, nem sempre fcil determinar a fase de atividade de uma espcie. Em uma reviso sobre a noturnalidade, Park (1940), dcadas antes da consolidao da Cronobiologia, comenta sobre a escassez de estudos sistemticos, investigando os padres temporais de atividade. Mesmo atualmente estudos caracterizando padres na natureza so raros e difceis de realizar, pois para a correta determinao dos padres de atividade so necessrias observaes em intervalos regulares, durante dias e noites consecutivas (Smale e cols., 2003). Alm dos problemas inerentes coleta de dados, a determinao da fase de atividade tambm dificultada pela existncia de vrios exemplos de animais que apresentam mudanas nessa fase, seja como reao a algum evento isolado ou mesmo fazendo parte de uma pr-programao fisiolgica. Nesse sentido, existem diversos exemplos de animais que mudam seu padro temporal de atividade em condies naturais. Podemos citar espcies de aves diurnas que, na poca da migrao mudam seu padro normal de atividade e concentram os voos migratrios durante a noite (Berthold, 2001). Alm disso, modificaes causadas pelo homem e interaes ecolgicas tambm poderiam ser responsveis por mudanas no padro de atividade de algumas espcies, tornando a questo importante, inclusive, na preservao das espcies. Existem evidncias de animais que mudam
Tomotani & Oda: Diurnos ou noturnos? Discutindo padres temporais de atividade

vestigao de padres em espcies selvagens distintas permite averiguar a generalidade dessa ocorrncia e especular quais seriam os mecanismos responsveis por essas trocas e por que elas ocorrem. Como podemos entender todas essas diferenas? Esta reviso enfoca, justamente, a dificuldade de se determinar um padro de atividade em campo e em laboratrio, com nfase em roedores, que j foram relativamente bem estudados.
sua fase de atividade devido caa, que fica concentrada nos momentos do dia em que so mais dificilmente localizados. Podemos citar como exemplo o urso marrom (Ursos arctos; famlia Ursidae) e o coiote (Canis latrans; Canidae), que passaram a se locomover mais durante a noite como reao s perseguies humanas; o coiote, inclusive, voltou a apresentar atividade diurna quando a presso da caa diminuiu (Kitchen e cols., 2000; Garshelis, 2009). Primatas dos gneros Aotus (Aotidae) e Eulemur (Lemuridae), por outro lado, so exemplos de animais que no apresentam a atividade concentrada em determinada fase do dia, com sua atividade ocorrendo ora durante a noite, ora durante o dia, o que impede uma classificao simples como noturnos ou diurnos (Erkert e Cramer, 2006). Tal padro incomum faz com que esses animais sejam classificados como catmeros, termo designado por Tattersall em 1987 (no original cathemerals). Em laboratrio possvel realizar experimentos com equipamentos especializados para o registro contnuo de atividade/repouso. Isso faz com que as dificuldades encontradas no campo para a obteno dos dados sejam minimizadas. Assim, foram realizados diversos estudos caracteri-
Ritmos biolgicos
Denomina-se ritmo biolgico qualquer evento biolgico que se repete periodicamente no tempo, como a alternncia diria entre atividade e repouso. A correspondncia do perodo de 24 horas desse ritmo de atividade/repouso com ciclos ambientais dirios, como o ciclo de claro/escuro, leva ideia intuitiva de que o organismo responde diretamente aos estmulos cclicos do ambiente. Dentro dessa proposta, um animal diurno acordaria durante o dia porque est claro e dormiria noite porque est escuro. Entretanto, atualmente, sabemos que grande parte dos rit-
Figura 1. Esquema do sistema de temporizao circadiano endgeno (que controla o ritmo de atividade/repouso).
zando minuciosamente os padres de atividade de camundongos e ratos (respectivamente, Mus musculus e Rattus norvegicus; Muridae), hamsters (Mesocricetus auratus; Cricetidae), dentre outros, por meses consecutivos. Nessas espcies, que acabaram se tornando modelos cronobiolgicos laboratoriais, os padres de atividade mostraram-se muito bem marcados, permitindo dcadas de estudos sistemticos do sistema de temporizao circadiano (Pittendrigh e Daan, 1976). Entretanto, a incluso lenta, mas persistente, de novas espcies selvagens no estudo cronobiolgico, comeou a revelar a complexidade da questo diurnalidade/ noturnalidade, mesmo nas condies controladas de laboratrio (Menaker, 2006). Por exemplo, ao menos duas espcies de roedores (Arvicanthis niloticus e Acomys russatus; Muridae), quando estudadas em condies naturais, mostram-se diurnas, mas, ao serem levadas ao laboratrio, mudam bruscamente sua fase de atividade (Blanchong e cols., 1999; Levy e cols., 2007). Esses resultados so intrigantes, pois mostram que nem sempre aquilo que se observa em campo corresponde ao que se registra em laboratrio. A in-
mos, em especial os ritmos dirios, so endgenos, ou seja, mesmo na ausncia de todas as pistas ambientais cclicas a ritmicidade persiste. Notavelmente, os ritmos persistem com perodo diferente de 24h, sendo denominados circadianos (circa = em torno de). A persistncia desses ritmos indica a existncia de osciladores circadianos associados a um sistema de temporizao circadiano endgeno (Fig. 1) responsvel pela gerao e controle da fase e perodo desse ritmo (Enright, 1970; Daan, 1981; Moore-Ede e cols., 1982). O sistema de temporizao circadiano permite aos organismos prepararem-se antecipadamente para os desafios ambientais dirios da Terra. Para ser completamente funcional na natureza, ele deve se sincronizar com os ciclos ambientais dirios. O principal ciclo ambiental sincronizador o ciclo claro/escuro. A informao temporal deste ciclo processada e transmitida ao oscilador por vias aferentes e consegue ajust-lo diariamente (Fig. 1). As bases anatmicas do sistema de temporizao circadiano foram bem estudadas em mamferos. Esses animais apresentam um oscilador central localizado na regio dos
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Revista da Biologia (2012) 9(3)

ncleos supraquiasmticos do hipotlamo (Moore, 1983). As aferncias incluem os fotorreceptores na retina, que recebem e processam a informao luminosa, e o trato retino-hipotalmico, uma via nervosa distinta da via de formao de imagens. A informao da ritmicidade do oscilador transmitida ao restante do organismo por meio das vias eferentes, que no mesmo organismo podem ser tanto nervosas quanto humorais (Enright, 1970; Moore-Ede e cols., 1982). A sincronizao do ritmo endgeno pelas pistas ambientais cclicas ocorre por meio de dois mecanismos distintos, denominados arrastamento e mascaramento. Denominamos arrastamento a modalidade de sincronizao diria na qual um ciclo ambiental ajusta o perodo e fase do oscilador, deslocando periodicamente sua fase (Moore-Ede e cols., 1982). A Figura 2 representa, esquematicamente, a determinao do perodo e fase da atividade pelo sistema de temporizao circadiano. Nessa figura, vemos a expresso endgena do ritmo de atividade de um organismo ao longo dos primeiros 10 dias, sob condies de constantes. Entre os dias 11 e 20, sob ciclo de claro-escuro 12:12 (12 horas de claro e 12 horas de escuro), o ritmo de atividade passa a expressar periodicidade de 24h, com a atividade concentrada na fase de claro. A inverso do ciclo de iluminao no dia 21 resulta na mudana do horrio da atividade, mas o organismo continua diurno. Isso ocorre porque o ciclo de iluminao arrasta o oscilador circadiano, o qual controla a fase do ritmo observado. Por outro lado, existe tambm a sincronizao por mascaramento (Aschoff, 1988). Nesse caso, vrios estmulos, cclicos ou no, podem modificar a expresso final do ritmo de atividade do organismo, sendo o controle exercido por vias que no incluem o oscilador circadiano (Fig. 1). Desse modo, existe uma plasticidade no sistema que permite aos animais tanto modular a amplitude da expresso de determinados ritmos como modificar a fase de ocorrncia de determinadas atividades. Por exemplo, na Figura 2, entre os dias 51 e 60, temperaturas elevadas durante o dia inibem a atividade de um organismo que diurno conforme determinado pelo oscilador circadiano arrastado, resultando na expresso da atividade nas horas frias da noite. Isso constitui um exemplo de sincronizao do ritmo com o ciclo dia/noite por mascaramento.
Figura 2. Esquema de um grfico do tipo actograma de um registro, durante 70 dias, da atividade/repouso de um animal diurno. O grfico est duplicado na horizontal para facilitar a visualizao dos dados. Cada linha horizontal representa um dia e as barras horizontais negras marcam o momento de atividade (sua ausncia indica repouso). A poro cinza do fundo do grfico mostra a fase de escuro e a branca, de claro. At o dia 10 o animal encontrava-se em escuro constante. A partir do dia 11, ele foi submetido a um ciclo claro/escuro (com 12 horas de claro e 12 de escuro) e no dia 21, o ciclo ambiental foi invertido. Do dia 41 ao dia 50, o animal foi submetido a um ciclo de temperatura sobreposto ao claro/escuro com temperaturas extremamente altas durante o dia, que mascararam seu ritmo. A remoo do ciclo de temperatura no dia 51 fez a atividade do animal voltar fase que estava antes da introduo do ciclo de temperatura.
Diferenas entre animais diurnos e noturnos

Em que componente do sistema de temporizao circadiano os animais diurnos seriam distintos dos noturnos: na aferncia, no oscilador ou na eferncia? Smale e cols. (2003), em uma reviso com enfoque em mamferos, levantaram as possveis diferenas que poderiam distinguir animais diurnos e noturnos. Por exemplo, o oscilador central dos mamferos, ou seja, os ncleos supraquiasmticos, poderia ter diferenas no tamanho, na forma e tambm nas conexes e organizao dos neurnios que o compem (ver tambm Cohen e cols., 2010). Ou poderiam existir diferenas nas aferncias, como nos fotorreceptores ou demais rgos sensoriais, que fariam com que animais permanecessem ativos em um momento e no em outro; nesse caso, vias responsveis pelo masca-
ramento poderiam tambm estar envolvidas (ver tambm Mrosovsky & Hattar, 2005). Por fim, as diferenas poderiam residir nas eferncias e, com isso, animais diurnos e noturnos seriam definidos pela resposta diferenciada dos alvos da informao temporal oriunda dos ncleos supraquiasmticos. At o presente momento no foram encontradas diferenas nos ncleos supraquiasmticos de mamferos diurnos e noturnos (Smale e cols., 2003). Dessa forma, as investigaes acabaram se concentrando nas eferncias, particularmente focadas nas clulas-alvo que recebem a informao rtmica dos ncleos supraquiasmticos e que poderiam, portanto, responder diferentemente em animais diurnos e noturnos (Mrosovsky, 2003; Smale e cols., 2003).
Mecanismos de mudana de fase de atividade

Alm de trabalhos que exploram as possveis diferenas entre diurnos e noturnos, existem diversos estudos tentando entender como um animal poderia modificar
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animais submetidos a diferentes graus de dificuldade na obteno de alimento. A inteno era criar um modelo, em laboratrio, que simulasse momentos de escassez de alimento pelos quais os animais passariam naturalmente. Nesse experimento, partindo de uma condio de alimentao ad libitum, aumentava-se gradualmente o nmero de vezes que o animal precisava correr na roda de atividades para ter acesso ao alimento. Conforme os animais precisavam se esforar mais para conseguir o alimento, mesmo em ciclo claro/escuro, eles passaram a apresentar um componente diurno de atividade, deixando de ser exclusivamente noturnos. Nesse experimento, a mudana de fase da atividade dos camundongos est relacionada com o gasto energtico associado ao trabalho realizado para obteno de alimento e no com sua fase de disponibilidade, j que os animais podiam coletar alimento em qualquer hora do dia. Verificou-se que os osciladores dos camundongos estavam sincronizados e sua fase de atividade correspondia a de um animal noturno e, portanto, a atividade que surgiu durante a fase de claro era independente do oscilador. Esse trabalho de grande importncia, pois mostra que a disponibilidade de alimento pode ser crucial na alocao temporal da atividade em roedores, trazendo subsdios para explicar, inclusive, padres de atividade em campo. Todos os estudos citados anteriormente sugerem que as mudanas no nicho temporal no esto relacionadas a modificaes no oscilador circadiano. Entretanto, no rato toupeira (Spalax ehrerbergi; Spalacidae) estudos em laboratrio mostraram que padres de atividade distintos parecem estar relacionados a osciladores em fases distintas (Oster e cols., 2002). Portanto, mecanismos distintos poderiam gerar mudanas nos padres de atividade. Os trabalhos tambm mostram que vrios tipos de manipulaes em laboratrio so capazes de gerar mudanas no momento que a atividade ocorre. Apesar do possvel envolvimento de mecanismos distintos em diferentes grupos, possvel verificar uma generalidade na presena de flexibilidade do ritmo de atividade/repouso. A complexidade da questo da diurnalidade/noturnalidade revelada pelo fato de que a fase de atividade de um organismo pode ser modificada na transferncia do campo para o laboratrio. Este dado curioso foi inicialmente relatado no roedor Acomys russatus (Muridae), que foi estudado tanto em condies naturais como em laboratrio. Seu padro de atividade de um animal diurno em campo, mas de um noturno em laboratrio. Quando esses animais so transferidos da natureza diretamente para o laboratrio e colocados em condies constantes, a fase de atividade passa imediatamente a corresponder quela de um noturno e no mais de um diurno. Assim, animais na natureza estariam com seus osciladores sincronizados e a atividade ocorrendo na fase de escuro, mas algum mecanismo faria com que sua atividade ocorresse na fase de claro, o que poderia ser devido a mascaramento ou a alguma modificao na eferncia (Levy e cols., 2007). Kronfeld-Schor e Dayan (2003) propem que essa plasti-
sua fase de atividade. Tais estudos podem ser divididos em duas categorias: trabalhos envolvendo manipulaes laboratoriais e investigaes comparativas entre campo e laboratrio. Diversos trabalhos tm investigado as causas das mudanas de nicho temporal observadas na natureza. Dentro dessa abordagem existem trabalhos com diversos grupos como roedores, primatas e crustceos. Por exemplo, os trabalhos com o roedor africano Arvicanthis niloticus (Muridae) sempre levantaram dvidas sobre os padres de atividade dessa espcie em campo: alguns autores afirmavam que seriam diurnos enquanto outros, que seriam noturnos. Blanchong e colaboradores (1999) e Blanchong e Smale (2000) estudaram de forma sistemtica o padro de atividade desses animais em laboratrio e em campo e constataram que a populao era diurna em ambos os casos, tornando-se noturna na presena de rodas de atividade. A retroalimentao exercida pela atividade intensa na roda sobre o passo do prprio oscilador que controla o ritmo de atividade um fenmeno conhecido e explorado por Redlin e Mrosovsky (2004). A controvrsia da literatura sobre as observaes em campo poderia ser devida a confuses taxonmicas na identificao das espcies de Arvicanthis (Blanchong e cols., 1999). Erkert e Cramer (2006) estudaram em laboratrio o padro incomum de atividade dos primatas dos gneros Aotus e Eulemur, que modificam sua atividade noturna dependendo da exposio a diferentes intensidades luminosas dos ciclos lunares. Os autores observaram que em laboratrio os animais apresentavam um ritmo endgeno de atividade e repouso, passvel de sincronizao por um ciclo claro/escuro dirio e com a atividade concentrada na fase de escuro. O padro de atividade desses animais foi reproduzido em laboratrio e a intensidade luminosa da fase correspondente ao escuro foi manipulada de forma a simular as diferentes fases da lua. Dessa forma, concluiu-se que os padres de atividade desta espcie poderiam ser resultado do mascaramento da expresso da atividade em fases determinadas do ciclo lunar. Ou seja, intensidades luminosas baixas em noites de lua nova inibiriam a atividade noturna, deslocando-a para os crepsculos. Por outro lado, noites de lua cheia, mais claras, permitiriam a expresso da atividade noturna. Chiesa e colaboradores (2010) estudaram em laboratrio uma espcie de lagosta (Nephrops norvegicus; Nephropidae) que apresenta mudana de fase de atividade, dependendo da intensidade luminosa a qual exposta. As situaes experimentais simularam as condies naturais, em que os animais apresentam fases de atividade distintas, dependendo da profundidade onde se encontram, sendo que animais de profundidades maiores tendem a ser diurnos. O mecanismo desta mudana de fases dependente da intensidade luminosa poderia estar tanto no nvel da aferncia quanto da eferncia. Recentemente, Hut e colaboradores (2011) realizaram com camundongos um experimento em laboratrio para testarem o que acontecia com a fase de atividade de
Manipulaes em laboratrio
Mudanas do campo para o laboratrio
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cidade do ritmo permite o compartilhamento do mesmo habitat em nichos temporais distintos por duas espcies de Acomys: A. russatus e A. cahirinus, que habitam o deserto de Israel. Curiosamente, os tuco-tucos, roedores do gnero Ctenomys (Ctenomyidae), encontrados na Argentina e estudados pelo nosso grupo, parecem apresentar um padro muito similar ao encontrado em Acomys, com mudana de fase de atividade quando transferidos do campo ao laboratrio. Isto possivelmente devido a diferenas na disponibilidade de alimento entre campo e laboratrio, semelhante ao caso explorado por Hut e colaboradores (2011) (Tomotani e cols., 2012).
Referncias Bibliogrficas
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Concluses
Todos os trabalhos aqui citados mostram que h animais que podem se tornar ativos em outras fases do dia e que tal caracterstica pode ser mais geral do que se imaginava. Com isto, a determinao do nicho temporal nem sempre tarefa fcil, pois mesmo em condies naturais, o sistema circadiano pode se mostrar muito plstico, o que poderia ser uma explicao para a capacidade dos organismos de lidar com os desafios cclicos ambientais. No caso dos roedores, interessante observar que espcies diurnas, de famlias distintas, apresentam um padro semelhante de troca de fase de atividade quando transferidas da natureza para o laboratrio, expressando, em laboratrio, sua atividade na fase noturna. Isso sugere que alguns roedores considerados diurnos so definidos como noturnos pelo oscilador circadiano arrastado; entretanto, expressam sua atividade durante o dia na natureza devido a outros fatores como a disponibilidade de alimento ou outros estmulos, mas nenhum deles interfere na expresso do oscilador. Assim, importante ter sempre um cuidado especial ao se caracterizar padres temporais de atividade, sobretudo quando se tenta inferir o que ocorre na natureza atravs de estudos em laboratrio. As condies artificiais do laboratrio muitas vezes fazem com que os padres se modifiquem e, desse modo, com que a realidade do laboratrio no reflita necessariamente o que ocorre na natureza. Mesmo assim, os estudos em laboratrio continuam sendo essenciais para a compreenso dos mecanismos de sincronizao, pois so a nica forma de se estudar sistematicamente as caractersticas do relgio circadiano.
Agradecimentos
A Mirian D. Marques e Revista da Biologia pela oportunidade, a Rodrigo B. Salvador e Joo Vitor Tomotani pela reviso do texto e aos revisores da Revista da Biologia por todas as sugestes.
Contribuio dos autores

As duas autoras contriburam igualmente na redao desse artigo.
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of comparative physiology. A, Neuroethology, sensory, neural, and behavioral physiology 19: 1011-1024. Oster H, Avivi A, Joel A, Albrecht U e Nevo E. 2002. A Switch from Diurnal to Nocturnal Activity in Spalax ehrenbergi Is Accompanied by an Uncoupling of Light Input and the Circadian Clock. Current Biology 12: 1919-1922. Pittendrigh CS e Daan S. 1976. A functional analysis of circadian pacemakers in nocturnal rodents: I. The stability and lability of spontaneous frequency. Journal of Comparative Physiology A 106: 223-252. Park O. 1940. Nocturnalism-The Development of a Problem. Ecological Monographs 10: 485-536. Redlin U e Mrosovsky N. 2004. Nocturnal Activity in a Diurnal Rodent (Arvicanthis niloticus): The importance of Masking. Journal of Biological Rhythms 19: 58-67. Smale L, Lee T e Nunez AA. 2003. Mammalian Diurnality: Some Facts and Gaps. Journal of Biological Rhythms 18: 356366. Tattersall I. 1987. Cathemeral activity in primates: a definition. Folia Primatologica 49: 200-202. Tomotani BM, Flres DEFL, Tachinardi P, Paliza JD, Oda GA e Valentinuzzi VS. 2012. Field and laboratory studies provide insights into the meaning of day-time activity in a subterranean rodent (Ctenomys aff. knighti), the tuco-tuco. PLoS One 7: e37918.
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DOI: 10.7594/revbio.09.03.02
Reviso
Investigando a sincronizao ftica na natureza

The photic synchronization in nature: an investigation
Danilo Eugnio de Frana Laurindo Flres
Contato do autor: danilo.eugenio.flores@gmail.com Resumo. A maioria dos organismos apresenta ritmos dirios que acompanham variaes dirias no ambiente. Alguns destes ritmos, denominados circadianos, so gerados por osciladores endgenos e sincronizados por ciclos ambientais, por meio de arrastamento. O ciclo claro/escuro dirio, reconhecidamente importante como agente sincronizador em vrias espcies, normalmente estudado em laboratrio sob a condio de 12 horas de claro e 12 horas de escuro, que no representa a condio a que os organismos esto expostos na natureza. Para alguns animais, os horrios de atividade fora dos abrigos e a sensibilidade do sistema fotorreceptor podem modificar a exposio ao ciclo de iluminao. Apesar da sua importncia, a sincronizao pelo ciclo claro/escuro no explica totalmente o padro temporal de atividade em campo, devido a outros fatores que modificam a expresso final do ritmo de atividade/repouso. Palavras-chave. Arrastamento, ciclo claro/escuro, light-sampling, ritmos circadianos. Abstract. Daily rhythms are observed in the majority of organisms, following day/night variations in their environment. Some of those rhythms are endogenously generated by oscillators which synchronize to environmental cycles, by means of entrainment. The daily light/dark cycle, recognized as an important synchronizing agent for various species, is frequently studied by protocols with alternating phases of 12 hours of light and 12 hours of darkness, which is not the real condition experienced in nature. For some animals, the dynamics of out-of-den activity and the sensitivity of photoreceptive pathways might modify the exposure to the light/dark cycle. Despite its importance, synchronization by light/ dark cycles cannot fully predict the activity pattern in the field, due to the effect of other environmental factors on the final activity/rest rhythm. Keywords. Circadian rhythms, entrainment, light-dark cycle, light-sampling. Recebido 18out10 Aceito 21ago12 Publicado 27dez12
A relevncia do tempo
Quando consideramos as interaes entre organismos e ambientes, costumamos pensar as caractersticas em sua morfologia e fisiologia que lhes permitem enfrentar os desafios inerentes natureza fsica das variveis ambientais. Plantas e animais que vivem em ambientes desrticos, por exemplo, possuem diversas particularidades na regulao do seu regime hdrico, diante do desafio representado pelas temperaturas extremas e a escassez de gua. Entretanto, na maioria das nossas reflexes, esquecemo-nos de levar em considerao a varivel tempo. Como apontado em um dos primeiros trabalhos de Pittendrigh (1958), o momento do dia em que o adulto de Drosophila sp. emerge de importncia crucial para sua sobrevivncia, visto que h variaes dirias cclicas no ambiente que o cerca. Ciclos de claro/escuro, temperatura, umidade do ar, presena de predadores e disponibilidade de alimentos so alguns dos possveis eventos dirios que um ambiente pode apresentar. No surpreendente que os seres vivos
possuam ritmos dirios que acompanhem estas variaes ambientais. Muitos ritmos biolgicos no so uma mera reao ao ambiente cclico, mas sim a expresso de um processo endgeno, gerado por osciladores internos, que se expressam mesmo em condies constantes de laboratrio (Aschoff, 1960). A endogenicidade de certos ritmos permite uma antecipao aos desafios do ambiente cclico, de modo que o organismo pode se preparar fisiologicamente e no ser surpreendido a cada manh pelo nascer do sol (Enrigth, 1970). Os ritmos circadianos, por exemplo, so expressos na ausncia de pistas ambientais dirias, e seu perodo endgeno (tau) sempre prximo, mas diferente, de 24 horas. Nessas condies diz-se que o ritmo est em livre-curso (Figura 1B). Somente quando submetido a ciclos ambientais dirios, o oscilador circadiano tem seu perodo ajustado para 24 horas, por meio de um processo dinmico denominado arrastamento. Em consequncia, o ritmo gerado pelo oscilador fica sincronizado com os ciclos ambientais (Figura 1A). Portanto, em condies de
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Flres: Investigando a sincronizao ftica na natureza

Oscilador arrastado af Perodo BB ef Perodo BB Ritmo sincronizado
A
B BB
trudo, com base nos novos elementos apresentados ao longo do texto.
Arrastamento em laboratrio
Os mecanismos envolvidos no arrastamento pelo ciclo claro/escuro vm sendo investigados desde os primrdios da cronobiologia (DeCoursey, 1960) e at hoje so motivo de debate (Roenneberg et al., 2010). Grande parte dos conceitos bsicos, que sero apresentados a seguir, foi desenvolvida por Colin Pittendrigh e Jrgen Aschoff com base em experimentos do tipo caixa-preta (Daan, 2000). Nesses experimentos, a dinmica das variveis biolgicas emergentes de um organismo, sob diferentes condies, usada para entender os mecanismos fisiolgicos subjacentes.
B
Condies constantes
B livrecurso af B) BB ef
B livrecurso
B) B BB
Figura 1. Funcionamento do sistema circadiano. A O ciclo ambiental arrastador, com perodo de 24 horas, percebido por um receptor (R), que envia o sinal para o oscilador circadiano por meio de vias aferentes (af). O oscilador arrastado para o perodo do ciclo ambiental. Em consequncia, o ritmo por ele gerado, e transmitido pelas eferncias (ef), observado em diversas variveis biolgicas, tambm com um perodo de 24 horas. B O sistema continua funcionando mesmo na ausncia de ciclos ambientais, porm o oscilador atua com um perodo prprio (), diferente de 24 horas, que se expressa tambm no ritmo final das variveis reguladas.
A importncia dos crepsculos

Uma das propostas para explicar o arrastamento sugere que a informao temporal sobre o momento dos crepsculos seja a mais importante. Nesse sentido, o oscilador seria sensvel a mudanas na intensidade luminosa, que ocorrem de forma acentuada no nascer e no pr-do-sol (Pittendrigh e Minis, 1964). A hiptese se baseia no ritmo dirio de sensibilidade do oscilador a estmulos luminosos, representado pela Curva de Resposta de Fase CRF (Figura 2) (Aschoff, 1965). Observa-se que o dia subjetivo (regio da CRF sincronizada com a fase de claridade do ciclo claro/escuro) insensvel a estmulos luminosos; por outro lado, durante a noite subjetiva (regio da curva sincronizada com a
arrastamento, o ritmo observado resultado de um componente endgeno (oscilador circadiano) modificado por ciclos ambientais dirios (Aschoff, 1960). Para muitos dos organismos terrestres estudados at hoje, o ciclo de claridade e escurido dado pelo movimento de rotao da Terra constitui um dos principais agentes arrastadores dos osciladores circadianos (Pittendrigh e Daan, 1976). De fato, esta a referncia ambiental mais confivel da hora do dia, pois varia pouco entre dias sucessivos. Voltemos para o exemplo das moscas de Pittendrigh. A emergncia dos adultos acontece diariamente e restrita ao momento do dia em que a umidade relativa do ar mais favorvel: o adulto recm-emergido vulnervel a dessecao e suas asas no se expandem corretamente sob baixa umidade. No entanto, esse ritmo de emergncia do adulto, que persiste em condies constantes sendo, portanto, circadiano, na verdade sincronizado pelo ciclo claro/escuro. Por mais que a umidade seja determinante para a sobrevivncia do adulto recm-emergido, o ciclo pouco regular de umidade relativa do ar no exerce o papel de agente arrastador. O ritmo de emergncia temporalmente alocado pelo ciclo claro/escuro e, em consequncia, as emergncias coincidem com os horrios de maior umidade relativa no dia (Pittendrigh, 1958). Nesta reviso, vou explorar os processos envolvidos na sincronizao dos ritmos circadianos pelo ciclo claro/ escuro. Primeiramente sero explicadas as bases conceituais desenvolvidas a partir de experimentos de laboratrio, com modelos simplificados do ciclo claro/escuro. Em seguida, sero levantados alguns trabalhos da literatura, que tentaram entender como se d a sincronizao no ambiente natural. Por ltimo, o modelo de sincronizao do sistema circadiano, apresentado na figura 1, ser recons-
NN
4 2 0 2 4
0 8
CB
CA
ZM
12 18 0
NNNN
NN
Figura 2. Curva de Resposta de Fase, CRF. A curva apresenta respostas do oscilador em funo do horrio em que um estmulo luminoso ministrado. As horas circadianas constituem uma escala de tempo, padronizada com base no perodo do oscilador em livre-curso. Respostas positivas (em azul) so adiantamentos e respostas negativas (em laranja) so atrasos de fase no ritmo gerado pelo oscilador. A maior parte do dia subjetivo no apresenta respostas, e por isso denominada zona morta (ZM), em verde. Portanto, as transies entre o dia subjetivo e a noite subjetiva, correspondentes aos crepsculos, so as nicas regies da curva que de fato respondem a estmulos luminosos quando o oscilador est sincronizado por um ciclo claro/escuro. CA Momento do oscilador que acontece no crepsculo do anoitecer. CB Momento do oscilador que acontece no crepsculo do amanhecer.
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A
dias
5 10 15 20 25 30
12 18 0 6
EE CE
tempo (hora do dia)
para um perodo de 24 horas (Figura 3B). Comparando esse arrastamento com o de um ciclo completo (Figura 3A), percebe-se que um dos pulsos interpretado como o amanhecer e o outro como o anoitecer. A este regime de iluminao constitudo por dois pulsos que mimetizam um ciclo completo de claro/escuro, realando a importncia dos crepsculos, chamamos fotoperodo-esqueleto (Pittendrigh e Minis, 1964).
Mecanismo de arrastamento
EE CE
= 23h
EE CE
= 26h
EE CE
Figura 3. Actogramas hipotticos, representando o arrastamento por diferentes tipos de ciclo claro/escuro. Cada linha horizontal representa o momento de atividade para um dia. Registros de dias sucessivos esto empilhados um abaixo do outro. As regies com fundo branco correspondem a momentos de claro e as regies com fundo cinza correspondem a momentos de escuro. A Arrastamento por um ciclo com 12 horas de claro e 12 horas de escuro (CE 12:12). B Arrastamento por fotoperodo esqueleto: um ciclo com dois pulsos de luz dirios. C e D Arrastamento por um ciclo com apenas 1 hora diria de claro. C Ritmo com menor que 24 horas; o pulso dirio interpretado como o anoitecer. D Ritmo com maior que 24 horas; o pulso dirio interpretado como o amanhecer. As linhas tracejadas em B, C e D delimitam uma fase de claro de 12 horas, ressaltando a que corresponderiam os pulsos de luz dirios. EE escuro constante. CE ciclo claro/escuro.
Com base nas Curvas de Resposta de Fase obtidas experimentalmente, sabemos que o oscilador circadiano apresenta diferentes respostas (deslocamentos de fase) de acordo com o momento em que recebe um estmulo luminoso. Como apresentado na figura 2, algumas fases respondem ao estmulo com atraso do ritmo e outras com adiantamento do ritmo gerado pelo oscilador. Pensemos em dois organismos, um organismo A cujo seja de 23 horas e um B, com de 26 horas. Ambos so submetidos a um ciclo claro/escuro de 24 horas constitudo de um nico pulso de luz dirio. Sabe-se que esse tipo de ciclo capaz de arrastar o oscilador (Figuras 3C e 3D). Quando o oscilador de A arrastado pelo ciclo, seu ritmo deve atrasar 1 hora a cada dia para compensar a diferena entre seu perodo prprio e o perodo do ciclo claro/escuro. Por sua vez, o ritmo de B deve se adiantar em 2 horas diariamente, para atingir o arrastamento. A ideia elegantemente colocada por Pittendrigh e Minis (1964) prope que, no arrastamento estvel, o pulso dirio cai em fases do oscilador, em que a CRF prev um deslocamento que compensa a diferena entre e o perodo do ciclo arrastador. Ou seja, para o arrastamento do oscilador circadiano do organismo A (Figura 3C), o pulso deve atingir o oscilador em uma fase que corresponde ao atraso de 1 hora na CRF. No caso, essa fase corresponde ao final do dia subjetivo (CA, Figura 2). Para o organismo B (Figura 3D), o pulso deve atingir diariamente uma fase correspondente a 2 horas de adiantamento, ou seja, o final da noite subjetiva (CB, Figura 2).
Arrastamento em condies naturais Modulao da exposio pelo comportamento

Em um estudo pioneiro com trs espcies de morcegos em condies naturais, Twente (1955) observou que os animais despertavam um pouco antes do pr-do-sol e se dirigiam para um local prximo sada das cavernas. Permaneciam ali parados ou fazendo excurses curtas para o exterior at que, em um determinado nvel de iluminao ambiente, saam todos juntos para a atividade noturna. Este comportamento, denominado light-sampling, tambm foi observado em experimentos de laboratrio com outra espcie de morcego (DeCoursey e DeCoursey, 1964). Estes estudos nos revelam que os morcegos vo voluntariamente para as sadas das cavernas minutos an-
Morcegos na caverna
fase de escuro do ciclo claro/escuro), estmulos luminosos promovem respostas mais intensas de atrasos e adiantamentos na fase do oscilador circadiano. Assim, em uma situao de arrastamento, o incio e o final da noite subjetiva, que acontecem nos crepsculos, so os nicos momentos do dia em que a luz ajusta o oscilador. Alm do formato da CRF, outra evidncia em laboratrio parece corroborar a importncia dos crepsculos. Quando um organismo em condies constantes exposto a dois pulsos dirios de luz, com 12 horas de intervalo entre si, o oscilador circadiano arrastado eficientemente
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crepsculos
nvel de iluminao
dias
5 10 15
(hora do dia)
tempo
12
tempo (hora do dia)
15
18
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fase de claro
B C D
Figura 4. Diferentes tipos de exposio luz. A Representao hipottica da variao da intensidade luminosa medida a cu aberto ao longo de um dia. Nas figuras B a D, as regies em amarelo so momentos de exposio luz e as regies em cinza so momentos em que o animal no se expe. B Exposio de um animal noturno que sai de sua toca durante o anoitecer, como os morcegos e escorpies. C exposio de um animal diurno que no percebe os crepsculos, como o esquilo de solo (Spermophilus citellus). D Esquema de um animal que se expe esporadicamente luz; possivelmente o roedor subterrneo Spalax ehrenbergi tem esse tipo de exposio.
Figura 5. Actograma esquemtico do processo de arrastamento do esquilo voador, proposto por DeCoursey (1986). Nos dias em que a atividade fora do ninho se restringe fase de escuro, o ritmo permanece em livre-curso, com perodo menor que 24 horas. Eventualmente, o animal sai de sua toca no fim da fase de claro, e acontece o light-sampling (em amarelo). Em consequncia, sua atividade atrasada no dia seguinte (seta vermelha), como previsto pela Curva de Reposta de Fase (ver CA na figura 2).
o ritmo permanece sincronizado, apesar das diferenas de exposio.
to
Esquilos voadores light-sampling e arrastamen-
tes do pr-do-sol, o que indica que sua exposio luz regulada ativamente pelo comportamento. Pode-se deduzir que todos os organismos que se locomovem tm a capacidade potencial de escolher seus padres temporais de exposio luz. Trabalhos em condies naturais com escorpies (Fleissner e Fleissner, 1998), e em condies semi-naturais com o hamster srio Mesocricetus auratus (Pratt e Goldman, 1986) e o camundongo Mus musculus (Refinetti, 2004) reportaram que estes animais s se expem a algumas parcelas do ciclo claro/escuro e permanecem o restante do tempo em seus ninhos, isolados do ciclo ambiental. O padro de exposio varia entre espcies, de acordo com o momento de atividade e o isolamento luminoso do abrigo onde passam as horas de repouso (Figura 4B a D) (Roenneberg e Foster, 1997). Em todos os casos,
Uma segunda concluso que podemos extrair dos dados de Twente (1955) que o nico momento do dia em que os morcegos se expem luz ao anoitecer (resultando em um padro dirio de exposio semelhante figura 3B) e, portanto, seu arrastamento depende apenas desta poro da fase de claro, o que parece estar de acordo com a hiptese de Pittendrigh e Minis (1964). Em 1986, valendo-se de experimentos com esquilos voadores noturnos (Glaucomys volans), DeCoursey (1986) formulou uma proposta para o mecanismo envolvido neste tipo de arrastamento, juntando o light-sampling e a teoria do arrastamento por pulsos de luz. Cada esquilo foi mantido em uma caixa-ninho isenta de iluminao, que se comunicava com uma segunda caixa submetida ao ciclo claro/escuro, onde os animais tinham acesso roda de atividade. Os momentos do incio de atividade em roda oscilaram ao longo dos dias em um padro de zigue-zague (Figura 5). Segundo a proposta da autora, a atividade noturna em roda se iniciava logo aps a transio do claro para o escuro, e os animais no tinham contato algum com a luz. Portanto, o ritmo de atividade-repouso permanecia em livre curso. Como o perodo endgeno da espcie menor que 24 horas, a atividade comeava cada dia mais cedo at atingir o fim da fase de claro, quando, em razo do estmulo luminoso, sofria um atraso, como previsto pela CRF. Depois disso, o ritmo voltava ao livre-curso e o processo se repetia periodicamente, resultando no ziguezague observado (Figura 5). Portanto, assim como os morcegos, este roedor tambm realizava light-sampling na transio do claro para o escuro, porm, apenas uma vez a cada vrios dias. Apesar da elegncia da hiptese, ela foi baseada em uma anlise visual, que uma aproximao imprecisa e no nos permite afirmar conclusivamente que o padro
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observado resultado dessa regulao. Refinetti (2004) aponta que o padro de ziguezague poderia ser igualmente explicado por uma variao diria ao acaso no horrio dos incios de atividade, assim como observou em seu prprio experimento. Uma hiptese semelhante proposta de DeCoursey foi usada para deduzir o arrastamento em campo do roedor subterrneo Spalax ehrenbergi. Apesar de cegos, esses roedores tm seus osciladores circadianos arrastados por ciclos claro/escuro em laboratrio (Goldman et al., 1997). Mesmo ciclos com apenas 20 segundos dirios de claro so suficientes para o arrastamento (Rado et al., 1991). Em campo, este roedor permanece a maior parte do tempo dentro de tneis subterrneos onde no tem acesso ao ciclo claro/escuro. Foi proposto que exposies espordicas luz durante a escavao dos tneis seriam como pulsos (Figura 4D) que, em conjunto, arrastariam o ritmo de atividade/repouso ao longo dos dias (Rado et al., 1991).
I II af ef
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Ciclo claro/escuro
Oscilador
mascaramento
Ritmo
Outros eventos ambientais
Figura 6. Esquema do sistema circadiano, considerando os efeitos diretos de alguns eventos ambientais no ritmo, por meio de mascaramento (em verde), e a possibilidade de duas alas de retroalimentao (em azul). I Ritmo no comportamento pode modular a exposio ao ciclo ambiental. II Oscilador pode modular ritmicamente a percepo de luz pelas aferncias. R receptor. af via aferente. ef via eferente.
O caso do esquilo de solo arrastamento sem crepsculos
Modulao da exposio luz pelas aferncias

Alm da modulao comportamental, outro tipo de regulao pode modificar a percepo do ciclo claro/escuro. Roenneberg e Deng (1997) demonstraram que no unicelular Lingulodinium polyedrum (sinnimo Gonyaulax poliedra) h uma modulao da percepo da luz ao longo do dia, no nvel das aferncias. Ou seja, por mais que estejam expostos, a priori, ao ciclo completo de claro/ escuro, o que estes organismos realmente percebem no necessariamente um ciclo igual quele medido por um luxmetro, mas sim um ciclo filtrado pelas suas aferncias. Um tipo anlogo de regulao est presente em escorpies. Estes animais so um caso bastante interessante, porque apresentam uma modulao comportamental evidente da exposio luz, dada pelo ritmo de entrada e sada da toca e, alm disto, os olhos medianos tm um ritmo de sensibilidade luz (Fleissner e Fleissner, 2001). Ambos os mecanismos (Figura 6, setas azuis) contribuem para a informao temporal do ciclo claro/escuro que percebido pelo oscilador e, portanto, para o seu padro de arrastamento (Friesen et al., 2001).
Os esquilos de solo (Spermophilus citellus) so uma espcie diurna que, assim como os morcegos e o esquilo voador, tambm regulam sua exposio ao ciclo claro/escuro a partir do comportamento. Estes animais passam o anoitecer e o amanhecer dentro de suas tocas, e se expem luz apenas na parte central das horas de claro (Hut et al., 1999). Dessa forma, esto expostos luz durante quase toda a fase de claro, exceto justamente pelos momentos de transio da intensidade luminosa (Figura 3C). O fato de no perceberem os crepsculos sugere que sua alocao temporal em campo envolve mecanismos diferentes daqueles propostos por DeCoursey (1986) para o esquilo voador. Se os momentos de transio entre claro e escuro fossem determinantes para a alocao temporal dos esquilos de solo em campo, esperar-se-ia que os animais estivessem expostos nesses momentos, ou que no apresentassem um ritmo marcado de atividade. Ao invs disso, a atividade diurna fora das tocas bastante regular ao longo dos dias, o que indica que os animais esto, de alguma forma, sincronizados com ambiente externo. O incio da atividade no ambiente externo, aps o amanhecer, tambm no depende da percepo do crepsculo, visto de dentro da toca, porque no h variaes na intensidade luminosa da toca nesse momento. Essa sada matutina para o ambiente externo, que se repete diariamente em uma fase estvel, parece ser regulada unicamente por sinais endgenos de um oscilador circadiano arrastado. Os autores (Hut et al., 1999) desconsideram a possibilidade de arrastamento por ciclos no fticos de temperatura ambiente ou de estmulos sonoros. Variaes na composio espectral da luz solar e possveis efeitos tnicos da intensidade luminosa sobre o oscilador circadiano so levantados como alternativa para explicar o arrastamento dos ritmos de esquilos de solo, sem a participao dos crepsculos. Neste caso, a alocao temporal em campo parece envolver mais elementos que os deslocamentos de fase previstos pela CRF.
Concluindo
Cada ambiente possui uma gama de ciclos ambientais biticos e abiticos, que se sobrepem dentro das 24 horas, constituindo ordem temporal. De acordo com o estado de cada uma das variveis ambientais dirias, formam-se diferentes contextos ou nichos temporais ao longo do dia. Tendo isso em vista, o arrastamento do oscilador circadiano em campo garante que as funes fisiolgicas do organismo estejam ordenadas no contexto mais adequado dentro das diferentes possibilidades encontradas nas 24 horas do ambiente. Comparado a outros ciclos ambientais, o ciclo claro/ escuro o que menos varia ao longo dos dias e constitui, portanto, uma referncia bastante confivel. Estudos em laboratrio mostram a importncia desse ciclo como agente arrastador do oscilador circadiano (Pittendrigh e
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and underlying neuronal mechanisms in scorpions. In: Touitou Y, editor. Biological clocks: Mechanisms and applications. Amsterdam: Elsevier p171-180. Fleissner G, Fleissner G. 2001. The scorpions clock. Feedback mechanisms in circadian systems. In: Brownell P, Polis G, editors. Scorpion biology and research. New York: Oxford University Press p138-158. Friesen WO, Fleissner G, Fleissner G. 2001. Role of feedback loops in the scorpion circadian system. Neurocomputing 38-40: 607-614. Goldman BD, Goldman SL, Riccio AP, Terkel J. 1997. Circadian patterns of locomotor activity and body temperature in blind mole-rats Spalax ehrenbergi. Journal of Biological Rhythms 12: 348-361 Hut RA, van Oort BEH, Daan S. 1999. Natural entrainment without dawn and dusk: The case of the European ground squirrel (Spermophilus citellus). Journal of Biological Rhythms 14: 290-299. Pittendrigh CS. 1958, Adaptation, natural selection and behavior. In: Roe A, Simpson GG, editors. Behavior and evolution. New Have: Yale University Press p390-416. Pittendrigh CS, Daan S. 1976. A functional analysis of circadian pacemakers in nocturnal rodents. IV. Entrainment: Pacemaker as a clock. Journal of Comparative Physiology 106: 291-331. Pittendrigh CS, Minis DH. 1964. The entrainment of circadian oscillations by light and their role as photoperiodic clocks. The American Naturalist 98: 261-294 Pratt BL, Goldman BD. 1986. Activity rhythms and photoperiodism of Syrian hamsters in a simulated burrow system. Physiology & Behavior 36: 83-89. Rado R, Shanas U, Terkel J. 1991. Entrainment of locomotor activity in the blind mole rat by brief light pulses. Mammalia 55: 479. Resumo. Refinetti R. 2004. Daily activity patterns of a nocturnal and a diurnal rodent in a seminatural environment. Physiology & Behavior 82: 285-294. Roenneberg T, Deng T-S. 1997. Photobiology of the Gonyaulax circadian system. I. Different phase response curves for red and blue light. Planta 202: 494-501. Roenneberg T, Foster RG. 1997. Twilight times: Light and the circadian system. Photochemistry and Photobiology 66: 549-561. Roenneberg T, Hut R, Daan S, Merrow M. 2010. Entrainment concepts revisited. Journal of Biological Rhythms 25: 329339 Twente JW. 1955. Some aspects of habitat selection and other behavior of cavern-dwelling bats. Ecology 36: 706-732.
Daan, 1976). Apesar de muitos experimentos utilizarem ciclos com 12 horas de claro e 12 horas de escuro (CE 12:12), o ciclo claro/escuro percebido por um organismo na natureza pode ser bem diferente disso. Alm da presena de transies graduais nos crepsculos (normalmente no reproduzidas em laboratrio), os organismos muitas vezes no se expem a ciclos completos. A exposio incompleta ao ciclo claro/escuro consequncia do padro de atividade fora da toca (no caso de animais). importante frisar que as propriedades do oscilador circadiano garantem o arrastamento por tipos de exposio bastante variados. Contudo, o arrastamento previsto pela Curva de Resposta de Fase no consegue prever todos os padres rtmicos observados na natureza. Isto explica-se, uma vez que o ritmo dirio observado em condies de campo no resultado somente da informao vinda do oscilador circadiano, mas tambm dos efeitos diretos de alguns eventos ambientais. Estes eventos atuam por mascaramento, modificando o ritmo final sem passar pelo oscilador (Figura 6, seta verde) (Aschoff, 1960). Alm disso, outros ciclos dirios tambm podem ser agentes arrastadores e seu efeito sobre o sistema circadiano pode modificar o arrastamento pelo ciclo claro/escuro (Daan e Aschoff, 2001). Portanto, uma anlise que simplesmente considera a CRF e o padro de exposio luz pode no ser suficiente para explicar a expresso rtmica em condies naturais.
Agradecimentos
Agradeo Mirian D. Marques e a Revista da Biologia pelo convite elaborao do texto, Gisele A. Oda pela orientao das referncias e reviso do texto, Barbara M. Tomotani pela ajuda com o ttulo, e o consultor Jos E. S. Natali pela reviso do texto e comentrios.
Bibliografia
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DOI: 10.7594/revbio.09.03.03
Reviso
Efeitos das variaes de temperatura ambiental em ritmos circadianos

Effects of environmental temperature changes on circadian rhythms
Patricia Tachinardi

Contato do autor: p.tachinardi@gmail.com Resumo. A maioria dos seres-vivos enfrenta variaes dirias e sazonais da temperatura ambiental, as quais afetam processos fisiolgicos e bioqumicos. Esta reviso abordar alguns dos efeitos dessas variaes sobre os ritmos circadianos de diferentes espcies. Primeiramente ser discutido como o oscilador circadiano, que gera esses ritmos, mantm seu perodo estvel, mesmo em diferentes temperaturas. Em seguida, sero apresentados casos em que a informao temporal do ciclo dirio de temperatura pode ser processada pelo oscilador, tornando esse ciclo uma pista ambiental importante para a sincronizao dos ritmos circadianos. Por fim, ser abordada a plasticidade da expresso rtmica, atravs de exemplos nos quais a modulao do ritmo circadiano pela temperatura ambiental ocorre sem que o oscilador seja diretamente afetado. Palavras-chave. Arrastamento, compensao temperatura, mascaramento, ritmos biolgicos. Abstract. Most living beings face daily and seasonal changes in the environmental temperature, which affect physiological and biochemical processes. This review will cover some effects of these temperature changes upon circadian rhythms of different species. First, it will be discussed how the circadian oscillator, which generates these rhythms, maintains a stable period even at different temperatures. Then, some cases will be presented in which the temporal information of the daily temperature cycle is processed by the oscillator, suggesting the importance of this cycle as an environmental clue to the synchronization of circadian rhythms. Finally, the plasticity of rhythmic expression will be explored with examples in which modulation of the circadian rhythm by environmental temperature occurs without the oscillator being directly affected. Keywords. Biological rhythms, entrainment, masking, temperature compensation. Recebido 18out10 Aceito 21ago12 Publicado 27dez12
Ritmos circadianos
Diversas variveis ambientais, como temperatura, intensidade luminosa e umidade relativa, variam de forma cclica e previsvel, resultando em ciclos ambientais, dentre os quais os mais evidentes so aqueles com perodo de 24 horas, decorrentes da rotao da Terra. Para o organismo sobreviver e garantir sucesso reprodutivo nesses ambientes altamente cclicos importante que processos fisiolgicos e comportamentais ocorram em fases especficas de cada ciclo, ou seja, que eles sejam expressos de forma rtmica e sincronizada com os ciclos ambientais (Pittendrigh, 1960). Dessa forma, observamos ritmos dirios de diversas variveis biolgicas, como, por exemplo, o ritmo dirio de atividade-repouso, expresso por muitos animais. Por muito tempo, acreditou-se que os ritmos biolgicos dirios eram uma mera reao presena ou ausncia de luz, ou alta ou baixa temperatura do dia. No entanto, hoje se sabe que muitos deles persistem mesmo na ausncia de pistas ambientais cclicas, pois so gerados endogenamente (Aschoff, 1960). A endogenicidade dos ritmos permite
que o organismo se prepare, em termos fisiolgicos e comportamentais, para a mudana previsvel decorrente dos ciclos ambientais e se antecipe aos desafios peridicos do ambiente (Enright, 1970). A gerao endgena do ritmo realizada por osciladores, que regem a expresso rtmica de diversas funes fisiolgicas e comportamentais. A sincronizao desses osciladores por ciclos ambientais essencial para que o organismo se integre temporalmente ao ambiente (Moore-Ede e col., 1984). Quando observamos a persistncia de um ritmo na ausncia de pistas ambientais, dizemos que este est em livre-curso. Nessas condies o ritmo expressa o perodo intrnseco ( - tau) do oscilador que o controla. Curiosamente, o de um ritmo dirio sempre prximo, mas nunca igual, a 24 horas. Por essa razo, esses ritmos foram denominados circadianos, termo do latim que significa em torno de um dia (Halberg, 1959). Todo ritmo circadiano, independente do organismo em que expresso, apresenta trs propriedades formais fundamentais: so comprovadamente endgenos, sincronizam-se com ciclos ambientais e apresentam compensao de seu perodo a variaes de temperatura (Marques e col., 2003).
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Tachinardi: Efeitos das variaes de temperatura ambiental em ritmos circadianos

a estabelecer a independncia de temperatura como caracterstica fundamental dos ritmos circadianos. Pittendrigh estudou os efeitos da temperatura no ritmo de emergncia de adultos da mosca Drosophila pseudoobscura e constatou que o Q10 era 1,02. Nesse trabalho, ele ressalta que a compensao de a variaes de temperatura essencial para que o oscilador circadiano seja um temporizador confivel. Nesse sentido, a compensao temperatura constitui a terceira propriedade fundamental na caracterizao de um ritmo circadiano, conforme apresentado na seo anterior. Ritmos circadianos ocupam um status especial em meio diversidade de ritmos biolgicos pelo fato deles serem controlados diretamente por osciladores com a funo de relgio biolgico, alocando temporalmente processos fisiolgicos em fases especficas de ciclos ambientais. Para que isso ocorra, necessrio que o oscilador seja sincronizado pelo ciclo ambiental em um processo denominado arrastamento, resultando no estabelecimento de uma relao de fase estvel entre este ciclo e o oscilador. Como a relao de fase dependente do perodo do oscilador (Figura 1), a compensao de temperatura garante que ela se mantenha estvel mesmo em ambientes nos quais h constantes variaes de temperatura (Pittendrigh, 1954). Salvo poucas excees, como o unicelular ThalasLivre-curso Arrastamento
Ritmos circadianos so observados em todos os grupos de seres vivos, de protistas a eucariotos multicelulares. Notavelmente, as propriedades fsicas e formais desses ritmos so essencialmente as mesmas em todas as espcies, fato que chamou a ateno de cientistas h mais de 50 anos (Pittendrigh, 1960). Mais recentemente, descobriu-se que a gerao desses ritmos ocorre no mbito molecular, cujo mecanismo consiste em alas de retroalimentao de transcrio e traduo gnica, formando um relgio molecular. Evidncias sugerem que esse cerne de alas de retroalimentao compartilhado por todas as espcies, embora as molculas envolvidas nas alas variem entre os diversos txons (Dunlap e col., 2004).
Compensao do perodo intrnseco () a variaes de temperatura
Muitos processos fisiolgicos e bioqumicos so sensveis a mudanas de temperatura. Em geral, eles so acelerados com a elevao da temperatura e desacelerados com a sua diminuio. A taxa de consumo de oxignio em animais, por exemplo, pode duplicar ou at triplicar quando a temperatura se eleva em 10oC (Schmidt-Nielsen, 1997). Para calcular o efeito do aumento de temperatura nas taxas de qualquer processo bioqumico utilizado um coeficiente denominado Q10. Grosso modo, Q10 a razo entre duas taxas, do mesmo processo, medidas com 10oC de diferena da temperatura ambiente. Dessa forma, se uma taxa duplica com o aumento de 10oC, tem Q10 igual a 2. Se triplica, tem Q10 igual a 3 e assim por diante. As taxas da maior parte dos processos fisiolgicos e bioqumicos tm Q10 entre 2 e 3 (Hochachka e Somero, 2002). Tendo em conta que as oscilaes circadianas so geradas no mbito da transcrio e traduo gnica cclica (Dunlap e col., 2004), inevitvel pensar no que aconteceria se as reaes bioqumicas envolvidas nesta gerao respondessem da mesma forma que outros processos s mudanas de temperatura. Se os mecanismos de gerao do ritmo circadiano tivessem Q10=2, por exemplo, um aumento de 10oC faria o oscilador ficar duas vezes mais rpido, o que poderia resultar, especulativamente, em um prximo de 12 horas. Seguindo o mesmo raciocnio, a diminuio em 10oC resultaria em um de 48 horas. Isso certamente comprometeria a sincronizao com ciclos ambientais e a alocao de determinado processo fisiolgico em uma fase especfica do ciclo. Essa questo comeou a ser explorada experimentalmente no incio do sculo XX, quando se intensificaram os estudos sobre ritmos biolgicos. Em 1931, o bilogo alemo Erwin Bnning observou que o do ritmo de movimento foliar da planta do feijo (Phaseolus multiflorus) era mais curto em temperaturas altas, mas que o Q10, de 1,3, era muito menor que o observado em outros processos metablicos (citado em Sweeney e Hastings, 1960). Aps a publicao do trabalho de Bnning, outros estudos investigaram a questo do efeito da temperatura no perodo intrnseco. A maior parte deles encontrou Q10 ainda mais prximos a 1 (Sweeney e Hastings, 1960). Foi Colin Pittendrigh (1954), entretanto, o primeiro
Varivel ambiental Oscilador com perodo curto Oscilador com perodo longo
Figura 1. Esquema da variao da relao de fase de acordo com o perodo do oscilador. Em livre-curso (esquerda), quando a varivel ambiental no apresenta oscilaes, o oscilador expressa seu perodo intrnseco, que pode ser mais curto ou mais longo. Quando a varivel ambiental passa a oscilar (coluna da direita) ocorre o arrastamento (uma das formas de sincronizao) e os osciladores passam a oscilar com o mesmo perodo do ciclo ambiental. Na figura, as cruzes vermelhas representam fases de referncia do ciclo ambiental ou do oscilador. Dependendo do perodo intrnseco do oscilador a relao entre essas fases diferente. Se, por exemplo, a fase de referncia do ciclo ambiental for o amanhecer e a fase de referncia do oscilador corresponder ao incio da atividade de um animal, o animal com oscilador de perodo curto iniciaria suas atividades poucas horas antes do amanhecer e seria diurno. J o animal com oscilador de perodo longo seria noturno, pois a atividade se iniciaria muitas horas depois do amanhecer. (Modificado de Aschoff, 1979).
somyxa (Sylin-Roberts e col., 1986) e mutantes do fungo Neurospora crassa (Loros e Feldman, 1986), Q10 prximos a 1 foram encontrados na maior parte dos ritmos circadianos estudados. Em vertebrados, a maioria dos trabalhos investigando a compensao de temperatura foi feita com ectotermos, mas h alguns estudos com mamferos. Animais que hibernam ou entram em torpor baixam consideravelmente sua temperatura corporal e seriam, portanto, um bom sistema para esse tipo de investigao. Em morcegos da espcie Myotis lucifugus, por exemplo, a temperatura corporal pode chegar a 3oC. Estudos com essa espcie demonstraram que o do ritmo circadiano de temperatura corporal compensado a essas variaes
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(Menaker, 1961). No entanto, em outros mamferos, como no hamster-comum (Cricetus cricetus), a expresso do oscilador circadiano deixa de ser detectada durante a hibernao ou torpor (Revel, 2007). Outras evidncias de compensao de a variaes da temperatura em mamferos vieram de experimentos in vitro. Na maior parte dos animais, h um conjunto de clulas anatomicamente distinto que atua como oscilador circadiano central. Em mamferos, esse oscilador localiza-se nos ncleos supraquiasmticos (NSQs) do hipotlamo (Moore, 1983). Uma caracterstica importante desses ncleos que a atividade eltrica, bem como as concentraes das protenas do relgio molecular, continua oscilando quando so extrados do animal e mantidos em cultura de tecidos. Os ritmos de disparos neuronais dos NSQs in vitro apresentam Q10=0,99 (Ruby e col., 1999). Porm, a temperaturas menores de 15oC h perda da atividade eltrica de neurnios dos NSQs (Miller, 1994) e de expresso rtmica de genes do relgio (Revel, 2007). Esses resultados indicam que os NSQs de mamferos tm compensao temperatura, mas, ao menos em algumas espcies, deixam de expressar seus ritmos quando a temperatura cai abaixo de determinado limiar.
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mecanismos dessa caracterstica fundamental dos ritmos circadianos (Nakajima e col., 2005).
Sincronizao por ciclos de temperatura: arrastamento

O fato da temperatura no causar grandes alteraes no perodo endgeno no implica que o sistema circadiano seja insensvel a ela. A seguir sero explorados os efeitos dos ciclos dirios de temperatura ambiental sobre os ritmos circadianos. Ser a variao diria de temperatura um bom sinal para sincronizar os ritmos circadianos? Para responder a essa questo, devemos primeiramente conhecer um dos mecanismos de sincronizao desses ritmos por ciclos ambientais dirios: o arrastamento. Alguns ciclos ambientais ajustam o oscilador que gera o ritmo, levando-o a oscilar com o mesmo perodo do ciclo. Esse processo conhecido como arrastamento (Figura 2A) e o ciclo ambiental que arrasta o relgio chamado Zeitgeber (do alemo: Zeit=tempo, Geber=doador) (Aschoff, 1960). Para a maior parte dos seres vivos, o principal Zeitgeber dos ritmos circadianos o ciclo dirio
Mecanismos da compensao de a variaes de temperatura

importante notar que a variao do perodo endgeno em diferentes temperaturas pequena, mas existe, pois os Q10 observados so prximos, mas no exatamente iguais, a 1. Essa uma das evidncias de que h um mecanismo ativo de compensao e no apenas insensibilidade do relgio temperatura. Hipteses sobre as bases desse mecanismo vm sendo formuladas h mais de 50 anos. A primeira foi de que haveria duas reaes qumicas que atuariam na determinao do perodo do oscilador circadiano. Uma delas inibiria a outra e as duas seriam igualmente dependentes da temperatura. Sendo assim, a primeira reao seria acelerada pelo aumento de temperatura, mas ao mesmo tempo seria regulada pela outra reao, que responderia da mesma forma mudana de temperatura (Hastings e Sweeney, 1957). Posteriormente, abordagens semelhantes incorporaram conhecimentos sobre a gerao das oscilaes circadianas no mbito molecular, tentando identificar, explicitamente, quais seriam as reaes qumicas em questo (Ruoff e Rensing, 2004). Recentemente, uma srie de trabalhos com a cianobactrica Synechococcus elongatus apresentaram dados intrigantes que apontam novas direes para os estudos sobre os mecanismos de compensao temperatura, ao menos em procariotos (Nakajima e col., 2005). O grupo que estuda essa cianobactria descobriu que o ritmo circadiano de fosforilao e desfosforilao de uma das protenas do relgio molecular persiste mesmo quando a protena isolada, in vitro. At ento, no havia relatos de oscilao de fosforilao/desforforilao de uma molcula isolada da ala. Mais surpreendente ainda o fato de que o perodo dessa oscilao compensado temperatura, resultado que traz novas perspectivas para a elucidao dos
Figura 2. Diferenas entre arrastamento e mascaramento. A No arrastamento o ciclo ambiental (Zeitgeber) ajusta o oscilador circadiano, que passa a oscilar com o mesmo perodo do ciclo, assim como o ritmo gerado por ele. B No mascaramento o ciclo ambiental atua diretamente no ritmo observado, sem alterar o perodo do oscilador. C e D Representaes grficas do protocolo descrito no texto. Cada grfico est representado em duplicata, ou seja, em escala de 48h. Nesses grficos hipotticos, cada linha representa um dia e as barras pretas indicam os momentos de atividade locomotora de um animal. Supondo que a varivel ambiental hipottica testada seja a intensidade luminosa, o fundo cinza do grfico indica escuro e o branco indica claro. Inicialmente a varivel mantida constante e em seguida so introduzidas variaes cclicas. Ao final, a condio constante retomada. Em ambos os grficos, o perodo em condies constantes menor de 24 horas e quando o ciclo de claro/escuro introduzido a atividade se restringe fase de escuro. C Quando a condio constante restabelecida, a fase de atividade a mesma de quando havia o ciclo ambiental, e no aquele que se esperaria caso o oscilador continuasse oscilando com seu perodo endgeno (a fase esperada nesse caso est indicada pela linha pontilhada), indicando houve arrastamento. D Aps a retirada do ciclo ambiental a fase voltou a ser aquela esperada caso o perodo do oscilador no tenha sido alterada (linha pontilhada), indicando que houve mascaramento.
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se sabe sobre as vias que propiciam o arrastamento por ciclos de temperatura. Trabalhos relacionados ao oscilador que arrastado por esses ciclos so escassos, mas em algumas espcies, como o grilo Teleogryllus commodus e a barata Leucophaea maderae, h evidncias da existncia de um oscilador circadiano anatomicamente distinto daquele que arrastado pelo ciclo de claro/escuro (Page, 1985; Rence e Loher, 1975). Trabalhos com Drosophila melanogaster indicam que grupos diferentes de neurnios do relgio circadiano esto envolvidos nos arrastamentos ftico e por ciclo de temperatura (Miyasako e col., 2007). Em outros organismos, descobriram-se algumas similaridades entre esses dois tipos de arrastamento. Estudos com o fungo Neurospora mostram que a concentrao de uma protena envolvida no arrastamento ftico tambm se eleva com a administrao de um estmulo trmico, sugerindo que o oscilador responde de forma semelhante (mas no idntica) a estmulos fticos e trmicos (Liu e col., 1998). Para que o oscilador seja sincronizado por variaes de temperatura ambiental necessrio que as informaes temporais do ciclo de temperatura sejam recebidas por ele. Em alguns organismos, a temperatura pode ter efeito direto sobre o oscilador, ou seja, no so necessrias estruturas especficas para o processamento e transmisso da informao ambiental (Page, 1985). Entretanto, mesmo em organismos cuja temperatura corporal varia de acordo com a ambiental, podem existir estruturas que processam a informao temporal do ciclo de temperatura ambiental e uma via que a transmite para o oscilador. Aparentemente esse o caso em Drosophila melanogaster, na qual foi demonstrado que mecanoceptores perifricos, presentes em locais como pernas e asas, esto envolvidos no arrastamento por ciclos de temperatura (Sehadova e col., 2009). Em mamferos, termorreceptores da pele so bem conhecidos, mas no se sabe se existem projees ao oscilador. Refinetti (2010) sugere que essas projees podem no ser necessrias e que o arrastamento poderia ocorrer mesmo que a informao sobre temperatura ambiental no seja transmitida diretamente para o oscilador. Umas das hipteses do autor que a temperatura poderia modular o nvel de atividade locomotora do animal e o sinal para o arrastamento seria justamente essa mudana na atividade. Essa ideia est baseada no conhecimento de que os nveis de atividade podem exercer retroalimentao no passo do oscilador circadiano (Reebs e Mrosovsky, 1989). Outra alternativa seria a modulao, pela temperatura, da ingesto de alimentos, que resultaria em arrastamento pelo ciclo de alimentao (Mistlberger, 1994).
de claro/escuro, o qual tambm o mais bem estudado (Moore-Ede e col., 1984). O teste para saber se um ciclo ambiental um Zeitgeber deve ser feito sob condies em que todas as variveis ambientais so controladas. Um protocolo clssico, esquematizado nas figuras 2C e 2D, o seguinte: deixa-se o organismo em condies absolutamente constantes das variveis ambientais para que o ritmo se expresse em livre-curso, ou seja, com um perodo diferente de 24 horas. Introduz-se ento variao diria apenas da varivel ambiental a ser testada, enquanto as outras so mantidas constantes. Se o ciclo for um Zeitgeber espera-se que o ritmo passe a se expressar com o mesmo perodo do ciclo. Essa evidncia isolada, no entanto, no suficiente para provar que o ciclo est arrastando o oscilador e no modulando diretamente a expresso final do ritmo, sem alterar o passo do relgio (efeito conhecido como mascaramento). Para saber se a sincronizao ocorre de fato por arrastamento, preciso retornar condio constante. Caso a fase do ritmo seja a mesma de quando estava sincronizado, consistindo em um sinal de que o relgio estava no mesmo passo do ciclo ambiental, consideramos que houve arrastamento (Figura 2C). Se a fase for aquela que se esperaria caso o ciclo nunca tivesse sido introduzido indcio de que, apesar da expresso do ritmo ter sido modulada, o relgio circadiano continuou oscilando no seu prprio passo. Como esse estmulo no afeta o oscilador, os efeitos cessam assim que o estmulo retirado (Figura 2D) (Aschoff, 1960). Os ciclos de temperatura so os mais estudados dentre os ciclos no fticos. O primeiro relato de arrastamento por ciclo de temperatura foi feito por Stern e Bnning em 1929, com o ritmo de movimento foliar do feijo Phaseolus multiflorus (citado em Sweeney e Hastings, 1960). A partir de ento, foi testado em diversas espcies. O gnero de invertebrados mais estudado quanto a essa questo o das moscas Drosophila. Zimmerman e colaboradores (1968), por exemplo, demonstraram que o oscilador que gera o ritmo de ecloso de D. pseudobscura arrastado por ciclos de temperatura (12 horas a 28oC e 12 horas a 20oC). Dentre os vertebrados ectotrmicos, os mais estudados foram os lagartos. Em alguns, ciclos de temperatura de apenas 1,6oC de amplitude arrastam o oscilador circadiano (Hoffmann, 1968). Em outros, so Zeitgebers mais fortes que o ciclo de claro/escuro (Evans, 1966). J os trabalhos com vertebrados endotrmicos foram realizados principalmente com mamferos. Nesses estudos, muitas vezes o ciclo dirio de temperatura arrasta o oscilador de apenas alguns indivduos dentro de uma mesma espcie, ao contrrio do que acontece com o ciclo de claro/escuro, que na maioria das vezes Zeitgeber para todos os indivduos (Rensing e Ruoff, 2002; Refinetti, 2010).
Outra forma de sincronizao por ciclos de temperatura: mascaramento
Hipteses sobre mecanismos do arrastamento por ciclos de temperatura
Ao contrrio do arrastamento ftico, sobre o qual houve muito progresso em relao compreenso de seus mecanismos e bases anatmicas e moleculares, pouco
Como dito anteriormente, um estmulo ambiental tambm pode, por mascaramento, apenas modular a expresso final do ritmo dirio sem alterar o passo do relgio circadiano (Figura 2B). Como esse estmulo no age no relgio, os efeitos do mascaramento cessam assim que o estmulo retirado (Figura 2D). Enquanto o arrastamen-
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to garante a rigidez necessria para a funo de relgio (Pittendrigh e Daan, 1976), o mascaramento permite uma resposta imediata, por exemplo, a mudanas ambientais imprevisveis. uma propriedade importante do sistema temporal, pois confere plasticidade expresso rtmica e ajuste fino da sincronizao (Page, 1989). H diversos registros de mascaramento por ciclos de temperatura. O esquilo voador Glaucomys volans, por exemplo, quando submetido a ciclos de temperatura diminui a atividade locomotora na fase quente. No entanto, quando a temperatura volta a ser constante, a fase do ritmo passa a ser a mesma de quando o animal estava em livre curso (como na figura 2D), indicando que no houve arrastamento, mas sim mascaramento pelo ciclo de temperatura (De Coursey, 1960). O mesmo acontece com camundongos expostos a ciclos de temperatura, nos quais h diminuio da atividade na fase quente, mesmo nos indivduos que no apresentaram arrastamento (Refinetti, 2010). Esse tipo de mascaramento pode ser de grande relevncia para o organismo, permitindo que certos processos fisiolgicos ou comportamentais ocorram em uma fase na qual a temperatura mais adequada ou deixem de ocorrer quando a temperatura no permissiva (Rezende e col., 2003), mesmo se contrapondo fase determinada pelo oscilador circadiano.
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mantida constante a 15oC ou 20oC, o pico da atividade ocorre no meio da fase de claro. Por outro lado, sob temperatura de 26oC torna-se crepuscular, ou seja, apresenta um pico de atividade no incio e outro no fim da fase de claro. A 30oC ou 35oC, o pico ocorre no incio da fase de claro e h uma quantidade significante de atividade no escuro. Essa modificao da relao de fase em diferentes temperaturas (que ocorre a temperaturas constantes, diferentemente do arrastamento por ciclos de temperatura) pode ser vantajosa para o animal, no campo, pois a atividade se concentraria na fase mais propcia, dependendo se o dia fosse mais quente ou mais frio (Heckrotte, 1975).
Consideraes finais
Nesta reviso vimos que a compensao do perodo intrnseco temperatura garante que o oscilador circadiano seja um temporizador confivel para o organismo, mesmo frente s variaes de temperatura ambiental. Essa compensao, porm, no implica que o oscilador seja insensvel a variaes de temperatura, como evidenciado pelos casos em que h arrastamento por ciclos dirios de temperatura. Por fim, vimos que respostas diretas dos ritmos circadianos a estmulos de temperatura, seja na sincronizao por mascaramento ou na modulao de ritmos arrastados pelo ciclo de claro-escuro, conferem plasticidade expresso rtmica, o que pode ser crucial para a sobrevivncia de um organismo em um ambiente onde a temperatura nunca constante.
Modulao pela temperatura de ritmos sincronizados pelo ciclo de claro-escuro

A temperatura ambiental tambm pode modular ritmos sincronizados pelo ciclo de claro-escuro. Em alguns casos, variaes na temperatura mudam as relaes de fase entre o ritmo circadiano e o ciclo de claro-escuro. Em outros, h modulao da amplitude do ritmo. As bases desses efeitos ainda no esto elucidadas, mas importante destacar o valor que eles tm ao conferir, assim como nos casos de mascaramento citados anteriormente, plasticidade expresso rtmica. Tokura e Oishi (1985) investigaram a modulao do ciclo dirio de temperatura no ritmo de atividade-repouso de hamsters (Phodopus sungorus). Em um primeiro experimento, verificou-se que oscilador desses animais no arrastado pelo ciclo de temperatura utilizado (12 horas a 10oC e 12 horas a 25oC). Em seguida, o ciclo de temperatura foi aplicado em conjunto com o ciclo de claro-escuro. Quando os dois ciclos so aplicados em conjunto, o ritmo de atividade se expressa com perodo de 24 horas, indicando que houve sincronizao. Com a retirada do ciclo de temperatura, o ritmo continua sincronizado. No entanto, h uma drstica diminuio nos nveis de atividade, alm de um atraso de fase, ou seja, a atividade se inicia mais tarde do que quando o animal est exposto ao ciclo de temperatura. Outro exemplo do efeito da temperatura na relao de fase entre o ritmo de atividade e o ciclo de claro/escuro encontrado na serpente Thamnophis radix. Em laboratrio, quando seu ritmo de atividade locomotora est sincronizado com o ciclo de claro/escuro e a temperatura
Agradecimentos
Profa Gisele A. Oda, pela reviso do texto e valiosas sugestes; Profa Mirian D. Marques, cuja aula inspirou a estrutura do texto; Aline T. Matsumura, pela reviso ortogrfica, ao consultor Wataru Sumi, pelas crticas e sugestes; Revista da Biologia pela oportunidade.
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Reviso Ensaio
Gentica molecular dos ritmos circadianos em insetos vetores

Molecular genetics of circadian rhythms in insect vectors
Gustavo Bueno da Silva Rivas
Laboratrio de Biologia Molecular de Insetos, FIOCRUZ-RJ
Contato do autor: gbsrivas@ioc.fiocruz.br Resumo. A maioria dos seres vivos apresenta um marcapasso endgeno conhecido como relgio circadiano, responsvel por gerar e coordenar oscilaes rtmicas em sua fisiologia e comportamento com um perodo de aproximadamente 24 horas. Em insetos, as bases moleculares deste mecanismo tm sido elucidadas na espcie modelo Drosophila melanogaster. Em contrapartida, em insetos vetores pouco se sabe a este respeito apesar da importncia dos seus ritmos dirios de atividade e hematofagia para a dinmica de transmisso de patgenos. Neste resumo, revisamos alguns dos trabalhos publicados acerca da gentica molecular dos ritmos circadianos em insetos vetores. Palavras-chave. Relgio circadiano; Insetos vetores; Gentica molecular. Abstract. The majority of living organisms present an endogenous pacemaker, known as the circadian clock, responsible for driving rhythmic oscillations in their physiology and behaviour with a period of approximately 24 hours. In insects, the genetic bases of this mechanism have been elucidated in the model species Drosophila melanogaster. However, in insect vectors little is known about it despite the importance of their daily rhythms of activity and blood-feeding for the dynamics of pathogen transmission. We reviewed some of the published papers on the molecular genetics of circadian rhythms in insect vectors. Keywords. Circadian clock; Insect vectors; Molecular genetics.
Recebido 18out10 Aceito 20mar12 Publicado 27dez12
Introduo
Desde que as primeiras formas de vida surgiram no planeta, estas tm sido submetidas a ciclos dirios de luz e temperatura, causados pelas rotaes da Terra ao redor de seu prprio eixo. Os mais diversos organismos desenvolveram estratgias que permitiram sua adaptao s variaes cclicas do ambiente, passando a apresentar oscilaes dirias em sua fisiologia e comportamento. Estes ritmos, chamados de circadianos (lat. circa=cerca; diem=dia) por apresentarem um perodo de aproximadamente 24 horas em condies constantes, so gerados por um marcapasso endgeno de carter independente. Diversos estudos, envolvendo a espcie modelo Drosophila melanogaste,r mostram que seu relgio circadiano composto por diversos genes que interligados formam alas autorregulatrias (revisado em Hardin, 2011). Neste marcapasso, os fatores transcricionais codificados pelos genes Clock (Clk) e cycle (cyc) formam um heterodmero que ativa as expresses de period (per), timeless (tim), vrille (vri) e PAR domain protein 1 (Pdp1) pela ligao s regies E-box (CACGTG) em seus promotores (Figura1) (Darlington et al, 1998; Glossop et al, 2003; Cyran et al, 2003; Hardin, 2011). Em uma das alas regulatrias, as protenas codificadas pelos genes per e tim
formam um dmero (PER/TIM) que dentro do ncleo interage fisicamente com CLK/CYC, inibindo seu papel de fator transcricional (Figura 1). Desta forma, per e tim conseguem regular de forma indireta sua prpria transcrio (Chang e Reppert, 2003; Yu et al, 2006). Em outra ala regulatria, dois outros genes, vri e Pdp1, tambm so ativados por CLK/CYC (Cyran et al, 2003). Suas protenas, VRI e PDP1 (protena resultante de um dos transcritos alternativos de Pdp1) competem entre si para se ligar em um stio localizado na regio promotora de Clk, sendo o primeiro, um repressor e o segundo, um ativador desta transcrio (Figura 1) (Cyran et al, 2003). Como o acmulo de VRI e PDP1 ocorre em momentos diferentes (VRI no incio da noite e PDP1 no meio da noite), a cada 24 horas, isto acaba gerando um controle rtmico tanto na represso quanto na ativao da expresso de Clk (Cyran et al, 2003). Recentemente, uma terceira ala regulatria foi postulada, envolvendo o gene clockwork orange (cwo), que codifica um repressor transcricional que atuaria modulando alguns dos principais genes do relgio circadiano de Drosophila (Matsumoto et al, 2007). Entretanto, o papel de cwo no relgio ainda no est muito bem definido, visto que alguns trabalhos obtiveram resultados diferentes (Kadener et al, 2007; Lim et al, 2007; Matsumoto et al, 2007; Richier et al, 2008).
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Rivas: Gentica dos ritmos em insetos

represso prematura de per e tim, que seria prejudicial no estabelecimento do ritmo. Outro fato curioso o controle da atividade da protena CLK. Apesar de Clk ser expresso de forma rtmica (Figura1), sua protena no apresenta variao cclica de abundncia (Houl et al, 2006; Yu et al, 2006). Como ento este ativador transcricional, que no oscila, responsvel pela expresso rtmica de per e tim, por exemplo? A resposta para esta questo est no fato de que, apesar de no oscilar, pode-se observar que CLK est hiperfosforilada, entre o final da noite e o incio da manh (Yu et al, 2006), justamente nos momentos de mxima represso da transcrio de per e tim (Figura 2E), o que sugere que CLK seria mais ativa quando hipofosforilada (Kim e Edery, 2006; Yu et al, 2006). De fato, o relgio circadiano no completamente dependente de uma ritmicidade de seus transcritos e protenas. Alguns trabalhos discutem que alteraes na transcrio rtmica afetam relativamente pouco a funcionalidade do relgio de diversos organismos e que as modificaes ps-traducionais do relgio que seriam cruciais para o seu funcionamento (Lakin-Thomas, 2006; Zheng e Sehgal, 2008). O cerne do relgio circadiano, como discutido at aqui, gera padres rtmicos de expresso e atividade protica sustentando no somente sua prpria oscilao, mas tambm influenciando centenas de genes que controlam aspectos da fisiologia, metabolismo e comportamento (e.g. Keegan et al, 2007).
Figura 1. Esquema das alas regulatrias do relgio circadiano de Drosophila melanogaster. As senides em cores representam transcrio rtmica. As setas representam regulao positiva, enquanto que as linhas com barras no final representam regulao negativa. A descrio detalhada do esquema encontra-se no texto.
O processo de autorregulao negativa ocorre de maneira complexa, em diferentes etapas, conforme mostrado na figura 2. No incio do dia, o heterodmero CLK/CYC encontra-se livre da represso de PER/TIM (Figura 2A e B) graas ao indireta da luz intermediada por CRY. Isto ocorre porque CRY estimulada pela luz e sofre uma mudana conformacional que a torna ativa, acarretando a fosforilao de TIM, que marcada para degradao via proteossoma (Figura 2B) (Stanewsky et al, 1998; Ceriani et al, 1999). J PER fosforilada pela quinase DOUBLETIME (DBT) e tal processo marca PER para uma via de degradao (revisado em Hardin, 2011). Entretanto, no incio da noite, com CRY inativo, TIM comea a se acumular no citoplasma (Figura2C). Neste momento, PER torna-se estvel pela presena de TIM e tambm graas fosfatase PP2a (Protein phosphatase 2) (Sathyanarayanan et al, 2004), que remove os fosfatos em PER anteriormente adicionados por DBT (Figura 2C). Em seguida, por volta da metade da noite, aps o acmulo de PER e TIM, estas entram no ncleo (Figura 2D). Todavia, sua entrada regulada por mecanismos ps-traducionais. PER e TIM so fosforiladas pelas quinases Casena quinase 2 (CK2) e SHAGGY (SGG), respectivamente (Figura 2D) (Martinek et al, 2001; Lin et al, 2002; Akten et al, 2003). No final da noite, j dentro do ncleo, o heterodmero PER/TIM interage com CLK/CYC formando um complexo multimrico que impede a continuidade das transcries dos genes controlados por CLK/CYC (Figura 2E). Este processo persiste at as primeiras horas do dia (ZT1-ZT3) (Figura 2E). Uma vez que, em condies constantes os genes de relgio no oscilam com um perodo de exatamente 24 horas, a luz, diariamente, promove o acerto (arrastamento) das fases de oscilao circadiana de expresso destes genes, de acordo com o ciclo ambiental dia/noite. Isto porque a luz um fator associado degradao de TIM, conforme descrito anteriormente, determinando, portanto, o tempo de ativao dos genes regulados por CLK/ CYC. Alm disso, a ao de quinases e fosfatases (Figura 2B/C/D) em PER e TIM promove no somente a manuteno de um atraso entre as fases de suas protenas, mas tambm determina o tempo de sua entrada no ncleo (Figura 2D). Estes processos so cruciais, pois impedem uma
Gentica dos ritmos circadianos em insetos vetores

Assim como em outros organismos, os ritmos de atividade e de alimentao apresentados por insetos vetores so controlados por um marcapasso endgeno (revisado em Clements, 1999; Saunders, 2002). Estes ritmos so cruciais na determinao do tempo e do grau de contato com seus hospedeiros e consequentemente so importantes para a transmisso de patgenos. Apesar disso, pouco sabido a respeito das bases moleculares que controlam o relgio circadiano de insetos hematfagos. Abaixo revisamos alguns dos trabalhos feitos, estudando a gentica e biologia molecular do relgio circadiano de trs grupos de vetores: flebotomneos, mosquitos e triatomneos.
Flebotomneos
O flebotomneo Lutzomyia longipalpis s.l. (Diptera: Psychodidae: Phlebotominae) o principal vetor da leishmaniose visceral nas Amricas. Esta espcie, na natureza, mais ativa no crepsculo vespertino e noite (Morrison et al, 1995; Feliciangeli et al, 2004). De fato, este padro tambm observado em condies controladas artificialmente no laboratrio (Meireles-Filho et al, 2006a; Rivas et al, 2008). O estudo da gentica molecular do relgio nesta espcie parece indicar algumas diferenas em relao ao modelo Drosophila (Meirelles-Filho et al, 2006a; Meireles-Filho et al, 2006b). Embora os genes per e tim apresentem perfis de expresso similares nas duas espcies
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(Figura 3), o gene Clk de Lutzomyia apresenta um padro de expresso rtmica em antifase ao de seu homlogo em Drosophila (Figura 3). J o gene cyc apresenta expresso cclica em L. longipalpis, enquanto que em Drosophila, a expresso deste gene constitutiva (Figura 3) (Rutila et al, 1998; Meireles-Filho et al, 2006b). Alm disso, no caso de cyc, a diferena entre estas espcies no se limita apenas expresso gnica, j que a protena codificada por este gene em flebotomneos, assim como em muitos outros insetos, apresenta uma cauda de ativao que est ausente em Drosophila (Meireles-Filho et al, 2006b; Sandrelli et al, 2008). Acredita-se que ao longo da evoluo, CYC de Drosophila tenha perdido esta cauda devido presena na protena CLK de outra cauda (poli-Q) que exerce a mesma funo ativadora vista em CYC (Allada et al, 1998). Desta forma, enquanto que em Drosophila o ativador transcricional CLK, em flebotomneos, este papel seria possivelmente desempenhado por CYC como ocorre em vertebrados e em outros insetos (Takahata et al, 2000; Chang et al, 2003; Markova et al, 2003; Meireles-Filho et al, 2006a; Rubin et al, 2006).
Figura 2. Modelo representativo do relgio circadiano dentro de uma clula de D. melanogaster em diferentes momentos do ciclo (A-E). A descrio detalhada deste processo encontra-se no texto. As senides representam transcrio rtmica. As setas finas representam regulao positiva, enquanto que as linhas com barras no final representam regulao negativa. Setas largas, curvas e pretas, via de degradao. Setas largas, curvas e claras, interao de PER com TIM. Setas largas, retas e claras entrada no ncleo. P, stios de fosfolirao. Raio, ativao de CRY pela luz. PER e TIM, retngulos pontilhados, representam suas respectivas protenas degradadas. ZT (Zeitgeber Time: representao do ciclo ambiental medido em horas).
Figura 3. Expresso circadiana de quatro genes de relgio de Drosophila melanogaster e Lutzomyia longipalpis em um regime claro/escuro 12:12h. A rea em cinza representa a fase escura (noite) deste regime. A) Drosophila melanogaster (baseado em Hardin et al., 1990; Sehgal et al., 1995; Bae et al., 1998; Rutila et al., 1998. B) L. longipalpis (baseado em Meireles-Filho et al., 2006a; Meireles-Filho et al., 2006b). Em cada espcie: cycle (linha azul), period e timeless (linha preta) e Clock (linha vermelha). ZT (Zeitgeber Time: representao do ciclo ambiental medido em horas).
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tos, a expresso rtmica de diversos genes importantes na fisiologia, resposta imune e at mesmo resistncia a pesticidas (Ptitsyn et al, 2011; Rund et al, 2011). Outro trabalho recente, em Ae. aegypti, mostrou um aumento da atividade locomotora de fmeas infectadas com o vrus Dengue 2, o que sugere um papel do relgio circadiano na dinmica de transmisso desta doena (Lima-Camara et al, 2011).
Outro aspecto do relgio circadiano de Lutzomyia longipalpis que foi estudado a influncia da alimentao sangunea. A hematofagia capaz de reduzir os nveis de atividade locomotora desta espcie (Meireles-Filho et al, 2006a), assim como ocorre em culicdeos (Rowland, 1989; revisado em Clements, 1999). A reduo da atividade pode ser um reflexo do efeito da alimentao sangunea na regulao do relgio circadiano, pois dois genes de relgio, per e tim, apresentam nveis de expresso reduzidos nestas condies (Meireles-Filho et al, 2006a).
Triatomneos
Diversas espcies de triatomneos (Hemiptera: Reduviidae: Triatominae), conhecidas popularmente como barbeiros, so transmissores do agente causador da doena de Chagas nas Amricas. Uma das espcies mais estudadas o Rhodnius prolixus. O processo de muda deste inseto induzido e controlado por hormnios chamados ecdisterides, que apresentam um padro rtmico de acmulo na hemolinfa com um perodo de aproximadamente 24 horas, mesmo em condies constantes (regimes de escuro ou claro constante), indicando, portanto, um controle pelo relgio circadiano (Steel e Ampleford, 1984; Vafopoulou e Steel, 1991). As glndulas protorcicas (PG) sintetizam os ecdisterides (Vafopoulou e Steel, 1989) e estudos in vitro mostraram que estas apresentam um ritmo circadiano de sntese destes hormnios em escuro constante e que este ritmo pode ser arrastado por ciclos de claro/escuro (Vafopoulou e Steel, 1998). Nas PG, as protenas de relgio PER e TIM apresentam um padro cclico de acmulo citoplasmtico e entrada no ncleo, mostrando que as glndulas protorcicas possuem um oscilador molecular que importante para a sntese rtmica de ecdisterides (Terry e Steel, 2001). Entretanto este oscilador molecular presente nas glndulas protorcicas seria regulado pelo neuropeptdeo PTTH (hormnio protoracicotrpico) de forma circadiana (Warren et al, 1988). Em Rhodnius, o PTTH produzido ritmicamente e mesmo em condies constantes observa-se que este padro persiste (Vafopoulou e Steel, 1996a; Vafopoulou e Steel, 1996b). No crebro destes insetos, grupos de neurnios laterais (LN), juntamente com neurnios dorsais (DN) so responsveis pela liberao cclica de PTTH (Vafopoulou e Steel, 1996b). Recentemente foi demonstrado que estes neurnios apresentam um acmulo rtmico de PER e TIM (Vafopoulou et al, 2010). Os neurnios laterais de Rhodnius seriam homlogos ao grupo de neurnios laterais de Drosophila, considerados componentes do oscilador central desta espcie modelo e importantes para o controle de sua atividade locomotora (Steel e Vafopoulou, 2002; Helfrich-Frster, 2004; Vafopoulou e Steel, 2005; Vafopoulou et al, 2010). Sendo assim, especula-se que os LN de Rhodnius poderiam desempenhar papel semelhante ao das mesmas estruturas em Drosophila (Steel e Vafopoulou, 2006). Desta forma, em Rhodnius estes neurnios alm de modularem a ritmicidade locomotora desta espcie participariam tambm do controle circadiano do sistema endcrino, funcionando de maneira similar aos ncleos supraquiasmticos (NSQs) de mamferos.
Mosquitos
Os ritmos de atividade de mosquitos (Diptera: Culicidae) j foram extensamente estudados em laboratrio (revisado em Clements, 1999). Contudo os estudos moleculares do relgio circadiano ainda so incipientes. Em um dos primeiros estudos, Gentile et al. (2006) isolaram o gene tim de Aedes aegypti, vetor dos vrus da dengue e febre amarela, e analisaram a sua expresso circadiana. Em outro trabalho, o mesmo grupo realizou uma anlise comparativa da expresso circadiana em Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, vetor da filariose e do vrus do oeste do Nilo, duas espcies com ritmos de atividade locomotora distintos. Ae. aegypti apresenta atividade diurna, enquanto Cx. quinquefasciatus apresenta atividade essencialmente noturna (Clements, 1999; Gentile et al, 2009). A anlise da expresso circadiana de sete genes (Clk, cyc, per, tim, vri, Pdp1 e cry1) envolvidos no cerne do relgio de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus revelou uma grande conservao nos padres de expresso desses genes nas duas espcies. No entanto, o gene cry2 mostrou perfis diferentes nas duas espcies, apresentando apenas um pico de expresso em Cx. quinquefasciatus e um padro bimodal em Ae. aegypti (Gentile et al, 2009). CRY2 um repressor transcricional relacionado a criptocromos de mamferos, que encontrado em diversos insetos, mas que est ausente em Drosophila (Yuan et al, 2007). Acredita-se que esta diferena seja possivelmente causada por mecanismos distintos de regulao da expresso de cry2 nas duas espcies (Gentile et al, 2009). Os resultados sugerem tambm que cry2 possa ser um dos genes, direta ou indiretamente, associados ao controle das diferenas encontradas nos padres temporais da atividade nas duas espcies de mosquitos (Gentile et al, 2009). No mosquito Anopheles gambiae, vetor da malria, Das e Dimopoulos (2008) aplicaram pulsos de luz no incio da escotofase e obtiveram mudanas no padro de alimentao sangunea, alm de alteraes no transcriptoma desta espcie, entre eles, transcritos que so regulados pela hematofagia. Os autores mostraram tambm que o silenciamento de alguns genes de relgio, pela tcnica de RNAi (RNA de interferncia), promove uma mudana da atividade hematofgica deste mosquito (Das e Dimopoulos, 2008). Mais recentemente, essa conexo entre metabolismo, ritmos de alimentao e relgio circadiano, foi reforada por dois outros trabalhos com microarranjos de An. gambiae e Ae. aegypti (Ptitsyn et al, 2011; Rund et al, 2011). Nestes, observa-se pela primeira vez em mosqui-
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Em insetos, alm das glndulas protorcicas, diversos outros osciladores perifricos, como glndulas salivares, gnadas e tubos de Malpighi j foram identificados (revisado em Saunders, 2002). Entretanto, em triatomneos, a caracterizao dos seus relgios moleculares ainda encontra-se restrita s glndulas protorcicas. Apesar disso, a evidncia de um sistema circadiano multi-oscilatrio sugere que os relgios se organizem para assegurar a ordem temporal interna no organismo. Os relgios perifricos poderiam acoplar-se e/ou se tornar sensveis a sinais de sincronizao interna gerada pelo relgio central (Giebultowicz 2001). Como nestes insetos, diversas clulas, em vrios tecidos, so alvos da ao de ecdisterides, sua liberao circadiana propicia a sincronizao destas clulas e, por sua vez, a sincronizao de mudanas ao longo do desenvolvimento, de acordo com as variveis do meio ambiente (Steel e Vafopoulou, 2006).
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Consideraes Finais
O estudo da biologia e gentica molecular do relgio circadiano de insetos vetores ainda encontra-se em um estgio inicial, contudo alguns dados importantes j foram obtidos como aqueles descritos acima. Estes estudos so importantes j que diversos trabalhos apontam diferenas no relgio circadiano de diferentes grupos de insetos, indicando que o que sabido a respeito do modelo Drosophila nem sempre pode ser aplicado a outras espcies sem uma anlise prvia (revisado em Sandrelli et al, 2008). O relgio circadiano de insetos vetores fundamental em diversos aspectos do seu ciclo vital. Sendo assim, o conhecimento das suas bases moleculares poder permitir futuramente o uso de ferramentas que levem a alteraes do seu funcionamento, que possivelmente influenciariam sobremaneira sua capacidade vetorial, servindo assim como uma nova estratgia de controle.
Agradecimentos
Agradeo ao Dr. Alexandre Afranio Peixoto pela orientao durante a elaborao do texto. Tambm agradeo a Dra. Rafaela Bruno e a Dra. Samira Chahad pela reviso do texto final alm de Israel de Souza Pinto pela edio final das figuras.
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Reviso Ensaio
Period3: um gene relacionado com a sincronizao de ritmos circadianos pela luz

Period3: a gene related with synchronization of circadian rhythms to light
Danyella Silva Pereira1,*, Flavia Cal Sabino1, Guilherme Silva Umemura2
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Contato do autor: danyellap@gmail.com Resumo. O gene Period 3 (Per3) faz parte do mecanismo de temporizao dos mamferos. Os trabalhos publicados na literatura at hoje mostram alguns resultados conflitantes em relao funo deste gene, que ainda no est totalmente esclarecida. Em humanos, o gene Per3 possui um polimorfismo de repetio provavelmente associado com mecanismos homeostticos e circadianos do sono. Alguns estudos especulam sobre o papel deste gene e de seu polimorfismo em relao a sensibilidade luz e j foram publicados resultados bem interessantes. Estes estudos podem trazer grandes impactos teraputicos, ajudando no tratamento de distrbios dos ritmos biolgicos, na reduo de sintomas relacionados a jet lag e a trabalhos em turno. Palavras-chave. Genes do relgio; Gene Period3 (Per3); Sincronizao luz. Abstract. Period3 (Per3) is a clock gene that participates in the temporal mechanism in mammals. Papers have been published showing some conflicting results related with the function of this gene, which has not been completely established. In humans, Per3 gene contains a length polymorphism which is associated with homeostatic and circadian parameters of sleep. Some studies speculate on the function of this gene and its polymorphism in the sensitivity of light and recently, rather interesting data have been presented in the literature. These studies can help to improve the treatment of rhythms disorders and help to attenuate symptoms related with jet lag and shift work. Keywords. Clock genes; Period3 (Per3); Light synchronization.
Departamento de Psicobiologia, Universidade Federal de So Paulo, UNIFESP Escola de Artes, Cincias e Humanidades, Universidade de So Paulo, USP
Recebido 15out10 Aceito 26jul12 Publicado 27dez12
Introduo
O sistema circadiano tem um papel na escolha do horrio do sono e da viglia. Alguns ritmos so considerados marcadores circadianos, como, por exemplo, o ritmo da melatonina (tambm chamada hormnio do escuro, pois tem como funo sinalizar para o organismo a presena dessa fase) e o ritmo da temperatura central (que varia diariamente, atingindo valores mnimos entre a metade e o final da noite) (Derk-Jan e Simon, 2010). Uma srie de pesquisas realizadas em animais e humanos tem demonstrado que polimorfismos nos genes relgio podem estar envolvidos com a suscetibilidade a distrbios de ritmo e, em humanos, podem regular fentipos circadianos, como a matutinidade e a vespertinidade (Archer et al, 2003; Carpen et al, 2006; Ebisawa et al, 2001; Katzenberg et al, 1998; Pedrazzoli et al, 2007; Pereira et al, 2005; Robilliard et al, 2002). Dentre os inmeros genes reguladores do relgio biolgico, o gene PER3 possui um polimorfismo de repetio especfico de primatas que constitui um VNTR (nmero varivel de repeties em sequncia, em tradu-
o livre). O nmero de repeties dos 54 pares de bases nitrogenadas constituintes deste polimorfismo especfico para cada espcie de primatas. Em humanos, esta repetio pode variar entre quatro e cinco vezes, levando aos pesquisadores a buscarem respostas sobre como as variveis deste polimorfismo podem estar associadas com a ritmicidade circadiana. Estudos publicados na literatura especializada mostram associaes deste VNTR do gene Per3 com os chamados cronotipos (Archer et al, 2003, Pereira e col, 2005), que so fentipos de ritmos circadianos caracterizados pela preferncia em exercer atividades em horas especficas do dia. Alm da associao com os cronotipos, o VNTR do gene PER3 parece estar associado com a Sndrome de Fase Atrasada do Sono (Archer et al, 2003, Pereira et al, 2005), que um distrbio no qual o episdio de sono atrasado, levando a horrios de despertar e de dormir muito mais tardios que o normal, o que pode causar no paciente um prejuzo no desempenho escolar e no trabalho. Dentro deste contexto, esta reviso tem como foco principal o papel do gene PER3 no relgio biolgico, abor-
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dando a relao do VNTR existente neste gene com os fentipos circadianos e processos homeostticos do sono.
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O gene PER3 e sua participao no relgio biolgico

Os genes relgio so bem conservados nas diferentes espcies. Para explicar o papel de cada um destes genes no controle do ritmo biolgico em mamferos, o seguinte mecanismo foi proposto: os genes Clock e Bmal1, so componentes positivos de uma ala de retroalimentao e codificam protenas que, quando sintetizadas, se unem formando o heterodmero CLOCK-BMAL1. Este heterodmero regula a expresso dos componentes negativos da ala de retroalimentao, que so os genes PER1, PER2, PER3, CRY1 e CRY2. Estes genes codificam protenas que se multimerizam no citoplasma e so fosforiladas pelas enzimas CKI e CKI. Regulados pela fosforilao, estes dmeros e heterodmeros interagem com o complexo CLOCK-BMAL1, inibindo a transcrio de seus prprios genes. Esta cascata de reaes gera uma ala de retroalimentao de transcrio e traduo que dura aproximadamente 24 horas (Akiyama et al, 1999; Darlington et al, 1998; Gallego e Virshup, 2007; Gekakis et al, 1998; Lowrey et al, 2000; Sangoram et al, 1998; Shearman et al, 2000a; Yagita et al, 2000; Zylka et al, 1998) (Figura 1). Os genes PER1 e PER2 expressam-se nos ncleos supraquiasmticos (NSQs), no hipotlamo, e seus RNAs exibem ritmicidade circadiana. A expresso de ambos os genes aumenta quando os NSQs recebem um pulso de luz durante a noite subjetiva, mas no durante o dia subjetivo (Zylka et al, 1998). No entanto, segundo trabalhos publica-
dos por dois grupos independentes em um curto intervalo de tempo (Zylka et al, 1998; Takumi et al, 1998), o gene PER3, isolado em camundongos, no responde a pulsos de luz em nenhum horrio circadiano. Os autores concluem que o gene PER3 foi o nico gene do relgio biolgico testado at aquele momento que no sensvel a luz. Como nos dois trabalhos foram empregadas linhagens diferentes de camundongos (Zylka et al,1998: C57BL/6; Takumi et al, 1998: Balb-c), pode-se supor que, a resposta do gene PER3 a pulsos de luz independe da linhagem. Em 2000, foi gerado o primeiro animal knockout PER3 (KO Per3) (Shearman et al, 2000b) que, portanto, no expressa a protena PER3. Foi observado um encurtamento de 30 minutos do perodo do ritmo endgeno () de atividade/repouso de animais KO Per3 da linhagem sv129, em escuro constante. Os animais KO Per3 de outras linhagens no mostraram nenhuma diferena no tamanho de quando analisados em escuro constante. Animais duplo KO (Per1-Per3 e Per2-Per3) tambm foram desenvolvidos (Bae et al, 2001) e os animais KO Per1-Per3 tm ritmo semelhante ao dos KO Per1, assim como os animais KO Per2-Per3 tm ritmo semelhante aos KO Per2. Desta maneira, ambos os estudos sugeriram que o gene Per3 no tem um papel importante nos mecanismos dos relgios biolgicos que regulam a atividade locomotora. At este momento, nenhuma evidncia sobre a importncia ou sobre a funo do gene PER3 no sistema de temporizao circadiana tinha sido publicado. Mais recentemente, Van der Veen e Archer (2010) analisaram animais KO Per3 da linhagem C57Bl6 e, assim como Shearman et al (2000b), no encontraram nenhuma diferena entre o do ritmo de atividade de animais sel-
Figura 1. Representao esquemtica do mecanismo molecular de temporizao em uma clula hipottica. Os crculos com um P no interior so molculas de fosfato adicionadas durante a fosforilao pela CKI. Os smbolos representam a inibio do heterodmero CLOCK-BMAL1 pelos dmeros formados pelas protenas CRYs e PERs e a inibio do gene Bmal1 pelo gene Rev-Erb (figura retirada de Pereira et al, 2009). ib.usp.br/revista
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Pereira et al: Period3: um gene relacionado com a sincronizao de ritmos circadianos pela luz
Nova Guin foi subdividida em subpopulaes e em uma delas, os Gimi, o alelo de quatro repeties est presente em somente 25% dos indivduos. Em outro estudo, foi analisada a frequncia deste polimorfismo em indivduos caucasianos e asiticos que vivem no Brasil (os indivduos foram classificados quanto etnia por meio de questionrio) e a frequncia genotpica dos indivduos homozigotos para o alelo de quatro repeties muito maior nos asiticos (74% dos indivduos) do que nos caucasianos (47% dos indivduos) (Barbosa et al, 2010). Estes estudos mostram a importncia de se caracterizar etnicamente uma populao antes de estud-la. Outros estudos mostraram a associao dos polimorfismos com fentipos circadianos e homeostticos do sono. Em 2003, Archer e colaboradores analisaram o polimorfismo de repetio do gene PER3 em grupos de indivduos matutinos, vespertinos e em pacientes com Sndrome de Fase Atrasada do Sono (SFAS). A SFAS um distrbio no qual o principal episdio de sono atrasado, resultando em sintoma semelhante insnia e dificuldade de levantar no horrio desejado pela manh. O estudo mostra associao do alelo de quatro repeties com a vespertinidade e do alelo de cinco repeties com a matutinidade. Este estudo tambm mostra uma associao do alelo de quatro repeties com a SFAS. Em 2005, Pereira e colaboradores obtiveram resultados semelhantes aos do grupo ingls (Archer et al, 2003). Foram encontradas as mesmas associaes com matutinidade-vespertinidade, mas quando foram analisados os pacientes com SFAS, um resultado contraditrio foi encontrado: a associao do alelo oposto (cinco repeties) com a SFAS. Uma possvel explicao para a diferena de resultados a latitude onde foram realizados os estudos, pois em ambos a maioria da populao analisada foi caucasiana: So Paulo, local onde foi desenvolvido o estudo no Brasil, est situado na latitude 2332S, enquanto que Londres est em 5130N. Latitudes diferentes implicam composies fotoperidicas diferentes ao longo do ano, alm de diferenas na intensidade de luz. No vero, em So Paulo, o dia mais longo dura cerca de 13,5 horas e, no inverno, a durao da fase de claro cerca de trs horas menor (10,5h). Em Londres, esta diferena muito maior: no vero, a fase de claro em mdia 16 horas e, no inverno, cerca de 8 horas. Estes resultados sugerem que provavelmente o gene PER3 e o polimorfismo de repetio nos humanos tenham um papel importante no mecanismo de arrastamento pelo ciclo claro/escuro. Os estudos de Archer e colaboradores (2003) e Pereira e colaboradores (2005) foram realizados em populaes jovens. Em 2007, Jones e colaboradores buscaram associaes do mesmo polimorfismo com a matutinidade-vespertinidade em populaes subdivididas pela faixa etria (18-29, 30-39, 40-49 e acima de 50 anos). Os resultados mostram que a fora da associao diminui conforme a idade aumenta: em jovens, a associao do polimorfismo com a matutinidade-vespertinidade muito mais forte do que nos idosos. Levando em conta a hiptese de que o polimorfismo de repetio do gene PER3 est relacionado com o mecanismo de sincronizao luz, a diminuio da
vagens e de KO Per3 em escuro constante. Por outro lado, quando eles analisaram os animais em claro constante, o do ritmo de atividade dos animais KO Per3 foi significativamente menor que o dos animais selvagens e esta diferena est diretamente relacionada com o aumento da intensidade de luz, ficando evidente que os animais KO Per3 so menos sensveis luz. Os autores sugerem que o gene Per3 seja predominantemente dependente da luz. Em resumo, os primeiros trabalhos publicados (Zylka et al, 1998; Takumi et al, 1998) no mostraram nenhuma diferena na fase de expresso do gene PER3 s respostas agudas a pulsos de luz. Porm, com o passar dos anos, novas hipteses foram sugeridas para o papel do gene PER3 (Pereira et al, 2005; Viola et al, 2007), especificamente com seu envolvimento na resposta luz. No entanto, os resultados publicados na literatura permanecem conflitantes.
Polimorfismo de repetio do gene PER3 em humanos

Sequncias repetitivas de nucleotdeos so frequentes no genoma de eucariotos. Embora estas repeties ocorram usualmente em regies no codificadoras de protenas, so encontradas, mais raramente, dentro de xons (regies codificantes). Nas protenas, variam desde repeties de um nico aminocido at a repetio de 100 ou mais aminocidos (Marcotte et al, 1998). Estudos sugerem que estas variaes no tamanho das repeties podem ajustar a expresso de caractersticas quantitativas nos organismos (King et al, 1997). Em humanos, o gene PER3 localiza-se no brao curto do cromossomo 1, e o VNTR, encontrado dentro do xon 18 do gene, codifica 18 aminocidos que se repetem quatro ou cinco vezes (Ebisawa et al, 2001). Na populao, ocorrem trs gentipos diferentes: indivduos homozigotos para quatro repeties (PER34/4: indivduos que herdaram o alelo com a sequncia repetida quatro vezes tanto do pai quanto da me), indivduos homozigotos para cinco repeties (PER35/5: indivduos que herdaram ambos os alelos com a sequncia repetida cinco vezes) e indivduos heterozigotos 4/5 (PER34/5: aqueles que herdaram um alelo com quatro e outro com cinco repeties). A frequncia deste polimorfismo razoavelmente estvel, sendo que aproximadamente 65% da populao tem o alelo de quatro repeties e cerca de 35% da populao tem o alelo de cinco repeties (Archer et al, 2003; Pereira et al, 2005). No entanto, em alguns casos especficos foi demonstrada uma variao da frequncia deste polimorfismo, dependendo da etnia estudada. Na Papua Nova Guin, cerca de 19% da populao apresenta o alelo de quatro repeties, enquanto que, na Monglia, o mesmo alelo est presente em 89% da populao (Nadkarni et al, 2005). Em 2008, Ciarleglio e colaboradores analisaram a frequncia do polimorfismo de repetio do gene PER3 em diversas populaes (americanos, europeus, africanos, chineses e papusios). Nos chineses, por exemplo, a frequncia do alelo de quatro repeties muito maior do que nas outras populaes estudadas. A populao da Papua
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fora de associao do polimorfismo com o aumento da idade faz sentido, uma vez que h uma atenuao da resposta ao ciclo claro/escuro com o envelhecimento e talvez o polimorfismo de repetio possa ter algum papel importante neste mecanismo (Klerman et al, 2001). Alm das associaes com os fentipos circadianos e com os distrbios do ritmo de sono e viglia, existem tambm correlaes do polimorfismo de repetio com algumas questes do questionrio de matutinidade-vespertinidade de Horne e Ostberg (1976). Uma questo sobre a necessidade de o indivduo usar o despertador pela manh mostrou uma clara distino entre os trs gentipos indivduos PER34/4 tm maior necessidade de usar o despertador do que indivduos PER34/5, e indivduos PER35/5 so os mais independentes do despertador para acordar pela manh. Em relao ao horrio em que os indivduos preferem dormir, os indivduos PeER34/5 preferem dormir mais tarde do que os PER35/5. Os indivduos com o gentipo PER35/5 tambm preferem fazer exerccios mais cedo e realizar tarefas mentalmente exaustivas mais cedo do que os PER34/4. E por fim, na ltima questo do questionrio, questo na qual os indivduos tm a liberdade de se autoclassificar em matutinos ou vespertinos, novamente os indivduos do gentipo PER35/5 mostram uma forte preferncia pela matutinidade (Ellis et al, 2009). Os resultados fortalecem estudos publicados anteriormente (Archer et al, 2003; Pereira et al, 2005), sugerindo uma associao do alelo de cinco repeties com a matutinidade e do alelo de quatro repeties com a vespertinidade. Alm destas associaes, foi demonstrado em 2008 por Archer e colaboradores que a acrofase (momento em que ocorre o pico da oscilao) de expresso do gene PER3 acontece durante o sono do indivduo. Esta associao foi mais forte em indivduos PER35/5 do que em indivduos PER34/4. Os autores sugerem que os indivduos PER35/5 sejam mais estveis e rgidos em relao aos horrios de dormir e acordar. O polimorfismo de repetio tambm j foi associado com mecanismos homeostticos do sono. Em 2007, Viola e colaboradores analisaram 24 sujeitos saudveis selecionados pelo gentipo do gene PER3 (PER34/4 e PER35/5). Os indivduos foram mantidos em condies constantes de laboratrio, sob iluminao atenuada (intensidade < 5 lux), mantidos em cama, numa posio semi-inclinada e monitorados durante 40 horas de privao de sono. Nenhuma diferena foi encontrada em relao aos padres de expresso do gene PER3, de secreo de melatonina e de cortisol entre os indivduos homozigotos PER34/4 e PER35/5. Em relao estrutura do sono e aos marcadores homeostticos do sono, algumas diferenas foram encontradas: indivduos PER35/5 caem no sono mais rpido (tm uma menor latncia do sono) e permanecem mais tempo em sono de ondas lentas (um marcador homeosttico bem conhecido) do que os indivduos PER34/4. Foram encontradas tambm algumas diferenas no padro de ondas do eletroencefalograma durante o sono paradoxal (sono REM) e a viglia, mostrando que o polimorfismo do gene PER3 afeta a homeostase do sono nos trs estados: viglia, sono de ondas lentas e sono REM. De maneira geral, os re-
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sultados sugerem que os indivduos Per35/5 vivem sob alta presso de sono. Aps a privao de sono, foi observado tambm um pior desempenho cognitivo dos indivduos PER35/5 do que dos indivduos PER34/4. De maneira geral, os resultados deste trabalho sugerem que o polimorfismo de repetio do gene PER3 afeta o padro homeosttico na regulao do sono. Em 2009, Goel e colaboradores selecionaram indivduos pelos gentipos do gene PeER3 e analisaram o padro de sono e as respostas neurocomportamentais. Os indivduos foram submetidos privao parcial e crnica de sono (os indivduos podiam dormir quatro horas por dia durante cinco dias). Ao contrrio do trabalho de Viola e colaboradores (2007), nenhuma diferena foi encontrada no desempenho cognitivo dos sujeitos aps privao de sono. Somente o sono de ondas lentas, mostrou diferenas significativas entre os gentipos. Os pesquisadores sugerem que provavelmente outros genes, e no o PER3, devem estar envolvidos com as respostas neurocomportamentais na privao parcial e crnica de sono. Pesquisas realizadas com seres humanos sugerem que o polimorfismo de repetio do gene PER3 est relacionado com mecanismos homeostticos de sono e tambm com a resposta luz ambiental. Ainda no foi possvel desvendar o papel exato do polimorfismo de repetio do gene PER3 em relao ao arrastamento pelo ciclo claro/ escuro, mas, aos poucos, os estudos esto mostrando fortes evidncias que, de alguma maneira, o gene PER3 est relacionado sensibilidade luz.
O gene Per3 em primatas no humanos

Visto que, em humanos, o gene PER3 possui repeties numa regio exnica associada aos fentipos circadianos e homeostticos do sono, seria interessante obter um modelo animal para testar as hipteses sugeridas e desvendar o papel do gene PER3 na resposta luz. Interessantemente, a anlise de bancos de dados do genoma de camundongos e ratos mostra que a regio repetitiva no existe no gene PER3 destes animais. No entanto, Jenkins et al (2005) analisaram o polimorfismo de repetio do gene PER3 em diferentes espcies de primatas (somente em um animal de cada espcie) e encontraram quatro repeties no gibo e no chimpanz, trs repeties no langur, sete repeties no sagui e trs ou quatro repeties no gorila (Tabela 1). Em 2009 (dados no publicados pelo nosso grupo, DS Pereira, e M Pedrazzoli, em colaborao com M Von Schantz e SN Archer, Inglaterra), foram analisados 42 chimpanzs na tentativa de detectar um polimorfismo na regio repetitiva, no entanto, todos os animais estudados eram homozigotos para o alelo de quatro repeties (Tabela 1). Sabino (2010) analisou a repetio do gene PER3 em diversas espcies de primatas. Uma espcie chamada popularmente de sagui de cara suja apresenta um polimorfismo nesta regio (10 ou 11 repeties de 54 pb). De maneira geral, os macacos do novo mundo (Platirrinos) mostram uma diversidade bastante grande no tamanho das repeties: existem animais com somente duas e ou-
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Pereira et al: Period3: um gene relacionado com a sincronizao de ritmos circadianos pela luz Agradecimentos
Agradecemos a FAPESP (Fundao de Apoio a Pesquisa do Estado de So Paulo), a AFIP (Associao Fundo de Incentivo a Psicofarmacologia) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico) pelo apoio financeiro nos estudos desenvolvido por ns, que foram citados no texto. Agradecemos tambm ao Parque Zoolgico de So Paulo, SP, e ao CENP (Centro Nacional de Primatas) pelo apoio no desenvolvimento do trabalho dos primatas (FCS, 2010).
tros com 11 repeties. Nos macacos do velho mundo e grandes macacos (Catarrinos), a variao da repetio bem menor: entre trs e cinco repeties nesta regio do gene PER3 (Tabela 1). Primatas noturnos, de maneira geral, no possuem a repetio no gene PER3, exceto o macaco-da-noite analisado por Sabino (2010), que apresenta o menor nmero de repeties encontradas (somente duas). Este fato mais uma vez sugere o envolvimento do gene PER3 com a senTabela 1. VNTR do gene PER3 em diferentes espcies de primatas. Dados obtidos por Jenkis e colaboradores (2005) e Sabino (2010). Espcies A. infulatus (macaco-da-noite) S. fuscicollis (sagui-de-cara-suja) C. aethiops (macaco verde africano) M. mulatta (rhesus) S. entellus (langur) L. lagothricha (macaco-barrigudo) S. midas (sagui-uma) G. gorilla (gorila) H. lar (gibo) P. troglodites (chimpanz) Alouatta sp. (bugio) A. paniscus (macaco-aranha) S. sciurus (macaco-de-cheiro) S. imperator (sagui-imperador) C. Goeldi (sagui-de-Goeldi) C. geoffroy (sagui-de-cara-branca) C. jacchus (sagui comum) N de repeties
o

Redao do artigo: Danyella Silva Pereira, Flavia Cal Sabino e Guilherme Silva Umemura. Figura: Danyella Silva Pereira. Tabela: Flavia Cal Sabino.
2 10 ou 11 3 3 3 3 3 3 ou 4 4 4 4 4 4 5 6 7 7
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sibilidade luz.
Consideraes finais e concluso

Diante dos fatos expostos, pode-se afirmar que o gene PER3 possui um importante papel no estabelecimento de fentipos circadianos e nos distrbios de ritmo, alm de estar relacionado com a regulao homeosttica do sono, mas o mecanismo pelo qual sua funo estabelece estes fentipos e processos ainda no est bem esclarecido. Tambm no se sabe o mecanismo pelo qual o papel do polimorfismo de quatro ou cinco repeties no gene PER3 humano se estabelece e como se d, exatamente, a participao deste gene na SFAS. Os resultados publicados por Pereira e colaboradores (2005) e Van Der Veen & Archer (2010) levam suposio que, de alguma maneira, o gene PER3 tem um papel na sincronizao pelo ciclo claro/escuro ambiental. Esclarecimentos do papel deste gene e de seus poliformismos podero ter grandes impactos teraputicos, ajudando no tratamento de distrbios temporais provocados pelo jet lag ou pelo trabalho em turnos.
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Ensaio
Fotopigmentos e arrastamento ftico

Photoentrainment and Photopigments
Leonardo H. R. G. de Lima

Contato do autor: leohrgl@ib.usp.br Resumo. O arrastamento ftico garantido pela ao de protenas fotorreceptoras, que possuem propriedades muito particulares. Dentre as diversas protenas fotossensveis que surgiram ao longo do processo evolutivo, apenas algumas participam do arrastamento ftico. Sendo assim, este texto tem como objetivo abordar o processo de arrastamento de osciladores circadianos pelo ciclo claro/escuro e descrever as protenas fotorreceptoras que atuam neste processo. Ser dada nfase para as propriedades e mecanismos de ao destas protenas e sero explicadas quais as diferenas entre os processos de formao de imagens por protenas visuais e por protenas circadianas capazes de ajustar os ritmos circadianos aos ciclos ambientais de 24 horas. Palavras-chave. Fotopigmentos, Arrastamento ftico, Criptocromos, Melanopsina. Abstract. Photoentrainment is a process that depends on the activity of photosensitive proteins. Throughout the evolutionary process many different photosensitive proteins arose, but just a few have a role in photoentrainment. Therefore the purpose of this text is to exploit photoentrainment and the active photoreceptor proteins related to the process. The mechanism of action of photosensitive proteins will be emphasized, as well as the differences between visual and entrainment processes. In conclusion, it will be explained how the light/dark cycle is able to adjust circadian rhythms to the environmental 24 hours of the day. Keywords. Photopigments, Photoentrainment, Cryptochromes, Melanopsin.
Recebido 18out10 Aceito 21ago12 Publicado 27dez12
Introduo
Ritmos biolgicos podem ser entendidos como manifestaes claras de organizao temporal. Se considerarmos que a sobrevivncia de determinado organismo devida s suas possibilidades de adequar-se ao meio em que vive e que os ambientes terrestres so cclicos, pode-se inferir que a existncia de uma organizao temporal interna nos seres vivos permite a eles ocupar um nicho temporal. Entretanto, sabe-se que na grande maioria das espcies o perodo dos ritmos endgenos diferente de 24 horas. Para que estas espcies no fiquem sujeitas aos perigos de uma deriva temporal, um ajuste dirio, por meio de uma forma particular de sincronizao, o arrastamento, necessrio. O arrastamento de um oscilador ocorre quando este acoplado e regido por outro, fazendo com que o primeiro oscilador assuma o perodo de seu regente. Esta precisamente a interao que ocorre entre os ritmos circadianos e os ciclos ambientais, resultando na sincronizao dos organismos hora local (Pittendrigh, 1993). Dentre as diversas pistas ambientais cclicas fornecidas pelo ambiente para arrastar os ritmos biolgicos, o ciclo claro-escuro tido como o principal agente sincronizador ou Zeitgeber (Aschoff, 1960).
Arrastamento
O arrastamento um processo que implica o controle da fase e do perodo do ritmo arrastado (Bruce e Pittendrigh, 1957). E em princpio isto pode ocorrer por duas vias distintas: O sistema circadiano pode responder continuamente aos nveis de intensidade luminosa com uma modulao de sua velocidade, ou seja, ao acelerar ou desacelerar, o sistema circadiano pode ajustar sua frequncia do meio ambiente. Este processo recebe o nome de arrastamento paramtrico. Por outro lado pode-se pensar que o oscilador ajustado uma ou duas vezes por dia, quando o ambiente fornece pistas discretas como, por exemplo, o amanhecer e o anoitecer. Este processo conhecido como arrastamento no paramtrico (Daan, 1977). Apesar dos indcios de que a modulao da frequncia por efeitos paramtricos est envolvida no arrastamento, a maior parte dos estudos est concentrada no arrastamento no paramtrico, empregando principalmente pulsos de luz ou de escuro (Aschoff, 1999). A amplitude e a direo dos deslocamentos de fase induzidos por tais estmulos dependem da fase em que estes so aplicados. Ao se plotar esses dados em funo da fase circadiana possvel obter uma curva de resposta dependente de fase (CRF) (Johnson, 1992). A partir de extensos estudos com roedores noturnos mantidos em escuro constante e expostos a pulsos luminosos de 15 minutos, ou a um fotoperodo esqueleto (dois pulsos luminosos por ciclo de 24 horas), Pittendrigh

e Daan (1976) concluram que: O mecanismo do arrastamento fundamentalmente no paramtrico. A ao paramtrica pequena e sua principal significncia funcional conservar a relao de fase dos animais diurnos com o ponto mdio da luz... atravs da abrangncia de fotoperodos que este animal procura explorar. H concordncia de que o arrastamento no paramtrico tenha papel mais importante do que o paramtrico (Daan, 1982; Ferraro e McCormack, 1984; Ferraro e McCormack, 1986). Esta concluso baseada no apenas na utilidade das CRFs na previso da relao de fase estabelecida entre o ritmo e o Zeitgeber dentro da abrangncia do arrastamento e fotoperodos variveis, mas tambm na frequncia do ritmo em livre curso (Pittendrigh, 1981).
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Fotorreceptores
Levando em conta o modelo clssico da cronobiologia que prope a sequncia de eventos e das estruturas envolvidas na expresso de um ritmo arrastado: Zeitgeber Aferncia Oscilador Eferncia Ritmo os fotorreceptores so as vias aferentes atravs das quais o zeitgeber claro/escuro percebido e cujo sinal enviado ao oscilador. Esta a etapa inicial do mecanismo do arrastamento. As diversas protenas fotorreceptoras (tambm conhecidas como fotopigmentos) descritas na literatura podem ser classificadas em um nmero restrito de famlias. Nesta classificao, os diferentes tipos de protenas fotorreceptoras so reunidos em famlias de acordo com a estrutura qumica de seu cromforo. O cromforo uma molcula no protica capaz de absorver e transmitir a energia dos ftons para a parte protica do fotopigmento. As famlias mais importantes de fotopigmentos so: rodopsinas, fito-
cromos, xantopsinas, criptocromos, fototropinas e protenas que utilizam dinucleotdeo flavina-adenina (FAD) para detectar a luz azul (protenas BLUF) (Tabela 1). Para as trs primeiras famlias citadas, a alterao da configurao de seus cromforos uma isomerizao (por exemplo, o cromforo 11-cis-retinal da rodopsina isomerizado para all-trans-retinal na presena de luz). Essa modificao configuracional inicia ento um estado sinalizador com estabilidade suficiente para comunicar os processos de absoro de ftons a um segundo mensageiro (Van Der Horst e Hellingwerf, 2004). Deve-se ressaltar que, mesmo correta, essa classificao pode gerar confuses, pois apesar do nome, as xantopsinas, tambm conhecidas como protenas fotoativas amarelas (do ingls: PYP), no so opsinas (Bjrn, 2010). As protenas fotorreceptoras atuam por distintas vias de transduo de sinal. Muitos detalhes so conhecidos para a maioria delas, porm ainda existem questes a serem elucidadas em todas as famlias (Van Der Horst e Hellingwerf, 2004). Sero apresentadas a seguir, as principais famlias de fotopigmentos envolvidas no arrastamento ftico at o momento.
Criptocromos
Os genes que codificam para criptocromos e fotoliases so agrupados em uma famlia diversificada que est presente desde arquebactrias at mamferos. Nesta famlia, o cromforo ligado protena FAD. Trs categorias principais de protenas so representadas nesta famlia: as fotoliases do dmero de ciclo butano (CPD), as fotoliases adutoras do foto-produto 6-4 pirimidina-pirimidona e os criptocromos (CRYs). Fotoliases so enzimas que utilizam energia luminosa para reparar danos induzidos por luz ultravioleta (UV) em molculas de DNA, tanto os foto-produtos 6-4, como os dmeros de ciclo butano (Chaves et al., 2011).
Tabela 1. Classes de cromforos e fotopigmentos bem caracterizados. Modificado de Van Der Horst e Hellingwef, 2004. Classes Cromforos Elemento estrutural chave Famlia Fotoqumica trans cis
Tetrapirris
Fitocromobilina
Fitocromos
Retinal Polienos cido Cumrico
Rodopsinas
trans
cis
Xantopsinas
trans
cis
Criptocromos Aromticos Flavina Fototropinas Protenas BLUF ib.usp.br/revista
Transferncia de eltrons? Formao de eltrons Transferncia de prtons?
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de Lima: Fotopigmentos e arrastamento ftico

visual tambm faam parte do processo de arrastamento (Helfrich-Frster et al., 2001). Sabe-se hoje que o dmero protico CLOCK e CYCLE age como um elemento positivo que estimula a transcrio de Per e Tim em Drosophila, atuando em regies regulatrias E-box nos promotores desses genes. Conforme as protenas PER e TIM se acumulam, estas formam dmeros no citoplasma e voltam para o ncleo, onde atuam como repressores, interferindo na ligao do dmero CLOCK e CYCLE com os elementos E-box de Per e Tim. Alm disso, sabe-se tambm que a transcrio de Cry controlada de forma circadiana pelo dmero CLOCK e CYCLE e que a interao da protena CRY com a protena TIM dependente de luz, pois na presena de luz, TIM degradada. Isto significa que, na presena de luz, os elementos repressores so degradados, permitindo que os elementos positivos iniciem um novo ciclo (Stanewsky, 2002). Os dois homlogos de Cry encontrados em mamferos, Cry1 e Cry2, pertencem ao tipo II e a funo destes genes foi elucidada em camundongos knockout para cada um destes genes, assim como para ambos. Nos animais com apenas um ou outro Cry, foram encontrados fentipos com perodos longos e curtos respectivamente para Cry1 e Cry2 (Van der Horst et al., 1999; Burnelle et al., 2007). J os duplos knockout so completamente arrtmicos e perdem a expresso rtmica de genes de relgio (Okamura et al.,1999; Van der Hortst et al.,1999; Brunelle et al., 2007). Estas observaes colocaram os criptocromos no corao do oscilador circadiano de mamferos (Fig. 1). Como a induo de Per em resposta a estmulo luminoso no abolida no animal duplo knockout para Cry, a possvel funo destes genes no arrastamento de mamferos foi descartada (Okamura et al., 1999). Os mamferos no so os nicos que apresentam criptocromos do tipo II, pois todos os vertebrados estudados at o momento como, por exemplo, o telesteo Danio rerio, a r Xenopus laevis e a galinha Gallus gallus apresentam este tipo de criptocromo. Interessantemente, D. rerio possui criptocromos tanto do tipo I, como do tipo II (Kobayashi
J os criptocromos funcionam como molculas sinalizadoras que regulam processos biolgicos, como o arrastamento circadiano em plantas e animais. Estruturalmente, as fotoliases e os criptocromos so muito similares e apresentam domnios fotoativos semelhantes, o que coloca as fotoliases como possveis ancestrais dos criptocromos. Em consequncia, atualmente o criptocromo definido como uma protena semelhante s fotoliases, que perdeu ou apresenta uma capacidade reduzida de promover reparos no DNA e ganhou uma funo de sinalizao (Chaves et al., 2011). Os criptocromos foram descobertos atravs de estudos de germinao da planta Arabidopsis thaliana. Nestes estudos, sementes que apresentavam um fentipo de inibio da elongao do hipoctilo quando iluminadas com luz azul, foram identificadas como mutantes para o gene que codifica esta protena (Ahmad e Cashmore, 1993). Em seguida, diversas funes que afetam aspectos do crescimento e desenvolvimento desta planta foram identificadas para Cry1 e para o seu homlogo Cry2. Sabe-se que o mecanismo molecular circadiano das plantas regulado por Cry1 e Cry2. Estes parecem agir de forma redundante no arrastamento ftico, encurtando o perodo. Em escuro constante, sementes desta planta apresentam perodo de 36 horas. Entretanto, quando estas sementes so colocadas em ciclo claro-escuro, os criptocromos ajustam o perodo para 24 horas (Devlin e Kay, 2000; Somers et al., 1998). Os criptocromos no so componentes do mecanismo molecular do sistema circadiano de plantas como ocorre nos animais, pois mutantes nulos para Cry1 e Cry2 ainda apresentam ritmos normais (Yanovsky et al., 2000). J os criptocromos encontrados nos animais podem ser divididos em dois grupos, de acordo com sua funo no sistema circadiano. Os criptocromos sensveis luz que agem como fotopigmentos circadianos em Drosophila e em outros insetos so chamados de criptocromos tipo I. Enquanto que os criptocromos que no respondem luz, agem como genes de relgio e funcionam como repressores da transcrio gnica como, por exemplo, em camundongos, humanos e outros vertebrados so designados criptocromos tipo II. Algumas espcies de animais, como por exemplo, o telesteo Danio rerio e a borboleta monarca Danaus plexippus, possuem os dois tipos de criptocromos (Chaves et al., 2011). O criptocromo do tipo I mais bem estudado at o momento o de Drosophila. Ao contrrio da maioria dos insetos que tambm possuem criptocromo do tipo II, esta mosca possui apenas um gene para o criptocromo (Chaves et al., 2011). Assim como os criptocromos de plantas, o criptocromo de Drosophila no capaz de fazer reparos no DNA. A funo deste gene em Drosophila foi determinada a partir de mutantes que possuem o alelo hipomrfico Cryb. Estes mutantes ainda apresentam ritmos circadianos, mas mostram forte reduo da capacidade de serem arrastados por ciclos claro-escuro (Emery et al., 1998; Stanevsky et al., 1998). Alm disto, o arrastamento completamente abolido em mutantes Cryb que tambm no possuem o sistema visual, o que sugere que outros fotopigmentos do sistema
Figura 1. Representao simplificada de trs osciladores moleculares, baseada na composio de seus criptocromos. As linhas vermelhas indicam a inibio e as linhas pretas pontilhadas indicam a degradao de TIM que ocorre na presena de luz e mediada pela interao com CRY. Tipo I em Drosophila, Tipo I+II em Danaus plexippus, Tipo II em camundongos. Modificado de Chaves et al. (2011).
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et al., 2000). O genoma de D. rerio apresenta seis genes Cry que podem ser subdivididos em tipo I (zCry3 e zCry4) e tipo II (zCry1a e b, e zCry2a e b) (Chaves et al., 2011).
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Rodopsinas
Rodopsinas so protenas de sete domnios transmembrnicos (com peso molecular entre 30-50kD) cuja poro protica denominada opsina. Estas opsinas utilizam como cromforo o retinal, o aldedo da vitamina A, ligado a uma lisina de sua stima ala transmembrnica por uma ligao covalente chamada Base de Schiff . As opsinas no absorvem energia de forma constante ao longo do espectro eletromagntico. A sensibilidade de cada opsina depende de sua estrutura atmica, principalmente no que se refere ao aminocido que funciona como contra on para estabilizar a ligao entre o retinal e a lisina da stima ala transmembrnica (Terakita, 2005). As opsinas so classificadas em tipo 1 e tipo 2. Opsinas tipo 1 so protenas muito antigas encontradas em Arquebactrias, Bactrias e Eucariotos. Os precursores destas opsinas podem ter existido antes da divergncia de arquebactrias, bactrias e eucariotos (Spudich, 2006; Sharma et al., 2006). Isto significa que o mecanismo de transporte de ons dependente de luz pode ter precedido a evoluo da fotossntese e representar um dos primeiros meios pelos quais os organismos passaram a utilizar a radiao solar como fonte de energia (Spudich, 2006; Sharma et al., 2006). Opsinas tipo 2 so encontradas somente em eucariotos (Sharma et al., 2006). A maioria dos estudos relacionados ao arrastamento ftico foi realizada neste tipo de opsina. Sendo assim, o restante desta reviso abordar as propriedades funcionais deste tipo de opsina relacionadas ao arrastamento e explicar a diferenas entre este processo e os processos de formao de imagem nos metazorios.
compem o segmento externo das clulas fotorreceptoras da retina de vertebrados. Cada disco membranoso do segmento externo das clulas fotorreceptoras contm milhares de molculas de pigmento visual. Quando um fton atinge o segmento externo dos fotorreceptores, o retinal-11-cis isomerizado para a forma all-trans, causando alteraes conformacionais na molcula da protena, o que inicia a sinalizao (Arendt et al, 2004). A partir de ento a metarodopsina II ativa a protena trimrica G, que libera sua subunidade a chamada de transducina, ativando a cascata de sinalizao resumida da seguinte forma: Ftons rodopsina rodopsina ativada (metarodopsina II) uma protena ligante de GTP (transducina) uma enzima que hidrolisa GMPc (GMPc-fosfodiesterase) fechamento de canais inicos ao se desligarem de GMPc. A fototransduo rabdomrica apresenta semelhanas e diferenas notveis em relao fototransduo ciliar. Em ambas, a via de transduo iniciada pela isomerizao da opsina por luz, e pela interao dessa protena com a protena trimrica ligante de GTP (protena G). Porm nos fotorreceptores rabdomricos, ao invs da opsina se ligar protena G transducina, que uma fosfodiesterase de GMPc, a opsina se liga a uma protena Gq que ativa uma fosfolipase C (PLC), que ento catalisa a converso de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2) a inositol-1,3,5-trisfosfato (IP3) e diacilglicerol (DAG). A produo de DAG, em insetos, leva abertura de canais inicos, o que permite o influxo de Na+ e de Ca2+. J em Limulus sp, IP3 libera clcio de compartimentos, o qual, combinado calmodulina, ativa uma guanilil ciclase. O aumento de GMPc ocasiona a abertura de canais de sdio dependentes de nucleotdeos cclicos e ocorre a despolarizao (Fig. 2) (Arendt, 2003; Arendt et al., 2004).
Tipos de clulas fotorreceptoras e vias de sinalizao utilizadas por rodopsinas

Fotorreceptores ciliares so clulas capazes de responder a estmulos luminosos por conterem opsinas embebidas na bicamada lipdica de discos membranosos ciliares que
Qual comprimento de onda responsvel pelo arrastamento?

O padro de sensibilidade de comprimento de onda, ou seja, o espectro de absoro como uma impresso digital nica de cada molcula de fotopigmento (Fig. 3). No campo da fotobiologia, o espectro de ao uma
Figura 2. Representao esquemtica das vias de sinalizao de fotorreceptores ciliares e rabdomricos. Modificado de Fernald (2006). ib.usp.br/revista
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Figura 3. Pico de sensibilidade espectral de trs tipos de cones e de bastonetes na retina de primatas. Extrado e modificado de www. webvision.med.utah.edu/
das principais ferramentas utilizadas para identificar o fotopigmento que inicia uma resposta induzida por luz. Um espectro de ao formado pela resposta relativa de um organismo a diferentes comprimentos de onda de radiao eletromagntica, visuais e no visuais. Existem dois tipos de espectro de ao: policromticos e analticos. Geralmente quando se inicia o estudo das reaes biolgicas sensveis luz, o primeiro passo determinar o espectro de ao policromtico de uma reposta. Pesquisas feitas com estmulos policromticos, tanto em humanos como roedores envolvendo respostas de sntese de melatonina pela glndula pineal, adiantamento de fase circadiana ou respostas fotoperidicas sugerem que a regio espectral entre 450-550nm fornea o maior estmulo para respostas circadianas e neuroendcrinas em mamferos (Figs. 4, 5 e Tabela 2) (Hanifin e Brainard, 2007). Estudos em pacientes com deficincia de viso indicaram que um sistema funcional normal com os trs cones e bastonetes no necessrio para a supresso de melatonina. Estes resultados deixaram claro que havia um fotorreceptor desconhecido, diferente de cones e bastonetes, atuando na fototransduo circadiana. Nos anos 1980, cronobiologistas e neuroendocrinologistas comearam a empregar comprimentos de onda monocromticos nesses estudos, sofisticando as tcnicas fotobiolgicas para determinao do espectro de ao analtico (Grossweiner, 1989; Horspool e Song, 1994; Coohill, 1991; 1999). O espectro de ao analtico de uma resposta determinado pela comparao dos efeitos de dois ou mais estmulos monocromticos com faixa de pico mdio de 15-20nm ou menos. O espectro de ao ento formado, plotando-se os ftons incidentes necessrios para produzir a resposta biolgica versus o comprimento de onda. Espectros de ao analticos recentes demonstram a sensibilidade a diferentes comprimentos de onda para diversas respostas fisiolgicas (Tabela 2).
Figura 4. Distribuio espectral da luz do dia versus a distribuio espectral da luz emitida por lmpadas incandescentes (grfico superior). No grfico inferior, a linha representada pela viso ftica indica a sensibilidade espectral da retina de mamferos baseada em trs tipos de deteco para cores. J a linha do input circadiano indica a sensibilidade para os sistemas circadiano e neuroendcrino, e processos comportamentais. Modificado de Hanifin e Brainard (2007).
Mas qual opsina atua no arrastamento?

Primeiramente necessrio enfatizar que os criptocromos no so as nicas protenas fotorreceptoras que atuam no arrastamento dos ritmos circadianos dos invertebrados. Em Drosophila, a rodopsina 1 e a rodopsina 6 esto envolvidas com o arrastamento por luz vermelha (Hanai et al.,
Figura 5. Ritmo de melatonina em camundongos com degenerao retiniana, mostrando que cones e bastonetes no so necessrios para a supresso de melatonina por luz. rd/rd camundongos com degenerao retiniana; rds/rds camundongos com reduo de 50% do segmento externo de cones e bastonetes na retina. Modificado de Lucas e Foster (1999).
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2008) e as rodopsinas 1, 5 e 6 por luz verde e amarela (Hanai e Ishida, 2009). Depois, a hiptese de que um novo fotorreceptor seria crucial para a captao de luz pelo sistema circadiano ganhou fora com a descoberta que camundongos que apresentam certos tipos de cegueira e camundongos rd/rd que sofrem de degenerao da retina, com a ausncia de bastonetes, e progressiva perda de cones, continuam a apresentar um efeito robusto de percepo de luz pelo sistema circadiano (Foster et al., 1991; Lucas et al.,1999; Freedman et al., 1999) (Fig. 5).
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Melanopsina (Opn4)
Tabela 2. Espectro de ao analtico para respostas circadianas, neuro endcrinas e oculares. Modificado de Hanifin e Brainard (2007). Pico Referncia (Max) Yoshimura e 480 Ebihara, 1996 Brainard et al, 464 2001 459 Thapan et al, 2001 479 Lucas et al, 2001
melanopsina, ser intrinsecamente fotossensvel sugeriu que a melanopsina teria uma funo crtica. De fato, utilizando camundongos knockout para melanopsina e mutantes rd/ rd, que tm degenerao retiniana, Panda e colaboradores (2003) demonstraram que as clulas ganglionares fotossensveis onde a melanopsina expressa so essenciais para o ajuste do relgio aos ciclos de claro-escuro e para respostas fticas no visuais, como constrio pupilar e supresso de melatonina. Nesse estudo foi demonstrado tambm que o padro de arrastamento em camundongos knockout para a melanopsina (Opn4-/-) (Fig. 8B) no to preciso quanto em animais selvagens (Fig. 8A) ou em animais com degenerao de cones e bastonetes (rd/rd) (Fig. 8C). J os animais Opn4-/-; rd/rd que sofrem de degenerao retiniana e no expressam melanopsina, mostram-se completamente incapazes de perceber o estmulo luminoso e seus ritmos no so arrastados.
Espcie
Resposta
Concluso
Camundongo Circadiana rd/rd Deslocamento de fase Humano Humano Supresso de Melatonina Supresso de Melatonina
Camundongo Constrio pupilar rd/rd Reflexos luminosos Humano Rato Cones Ondas-ERG Clulas ganglionares Despolarizao Camundongo rd/rd Deslocamento de fase Macaco Despolarizao de clulas ganglionares
Hankins e Lucas, 483 2002 484 Berson et al, 2002
Figura 6. Melanforos de Xenopus laevis. Escuro - grnulos de pigmento agregados na regio perinuclear. Claro grnulos de pigmento dispersos no citoplasma. Modificado de Rollag et al (2000).
481 Hattar et al, 2003 482 Dacey et al, 2005
rd/rd - camundongos com mutao na subunidade B da fosfodiesterase de GMPc de bastonetes; resulta na total destruio dos bastonetes e tambm na destruio de 50% dos cones. rd/rd cl - camundongos com total destruio de cones e bastonetes.
Foi buscando uma nova opsina em um modelo de percepo luminosa, os melanforos do anfbio Xenopus leavis, que Ignacio Provencio (Provencio e col., 1998) descobriu a melanopsina, uma nova opsina expressa na retina em todas as classes de vertebrados examinadas at o momento, sendo encontrada desde o cefalocordado anfioxo Branchiostoma belcheri, at mamferos (Figs. 6 e 7). O padro de expresso de melanopsina difere nas classes de vertebrados, no entanto sua presena em clulas ganglionares da retina constante. Nos mamferos, essas so as nicas clulas que expressam melanopsina (Provencio et al, 2002; Berson et al, 2011). Como a chegada da luz no sistema circadiano dos mamferos depende de fotorreceptores oculares, o fato de que uma pequena populao de clulas ganglionares, contendo
Figura 7. Rede de clulas ganglionares fotossensveis, imunopositivas para a melanopsina, na retina de camundongos. Extrado de Provencio et al. (2002).
Embora esta reviso tenha abordado aspectos crticos do conhecimento atual sobre a fotorrecepo ligada ao arrastamento de ritmos circadianos, muitas perguntas continuam sem resposta. Conforme a cincia progride e passa a estudar animais nos mais diversos ambientes, as peas do quebra cabea chamado sistema circadiano vo se encaixando. Assim, os temas abrangidos aqui comeam, por meio de novas palavras, a responder antigas questes como,
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Figura 8. Arrastamento ftico em (A) camundongos selvagens, (B) camundongos knockout para a melanopsina, (C) camundongos com degenerao de cones e bastonetes e (D) camundongos knockout para a melanopsina e com degenerao de cones e bastonetes. As retas de ajuste em preto representam o ngulo do incio de atividade. As linhas pontilhadas ou cinza representam o ngulo do incio de atividade de outros quatro camundongos knockout para melanopsina e com degenerao de cones e bastonetes. Aps duas semanas em escuro constante, trs camundongos knockout para melanopsina e com degenerao de cones e bastonetes foram submetidos a ciclo claro/escuro 18:6 (luz branca, com intensidade de 800 lux). A hora local indicada no topo das figuras e o ciclo claro/escuro representado no fundo pelas barras brancas e cinza Extrado de Panda et al. (2003). Figura 9. Via neural da retina para os ncleos supraquiasmticos (NSQs). (a) Uma pequena populao de clulas ganglionares imunopositivas para a melanopsina (vermelho) forma o trato retino-hipotalmico que se projeta para os NSQs. Estas clulas ganglionares (G) respondem diretamente luz. Elas tambm recebem informao luminosa dos bastonetes (R) e cones (C) atravs das clulas bipolares (B) e amcrinas (A), algumas das quais podem conter criptocromos (azul). (b) Pulso luminoso aplicado durante a noite subjetiva ativando a expresso de Per nos NSQs atravs de uma via de sinalizao dos terminais ps-sinpticos das clulas ganglionares nas clulas dos NSQs. Modificado de Reppert e Weaver (2002).
por exemplo, o mecanismo molecular do arrastamento ftico em mamferos. Neste sentido, o modelo proposto por de Reppert e Weaver em 2002, em que a luz excita a melanopsina nas clulas ganglionares da retina e estas por sua vez liberam glutamato nas clulas dos NSQs, cujos receptores ativam uma via de sinalizao que induz a expresso dos genes Per e com isto ajusta a fase e o perodo dos ge-
nes de relgio (Fig. 9), pode ser entendido como o modelo mais bem estudado de fotorrecepo e arrastamento ftico da atualidade.
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Ensaio
As protenas de relgios e o eixo hipotlamo-hipfise-gonadal de fmeas de roedores

Clock protein and hypothalamus-pituitary gonadal axis of female rodents
Maristela de Oliveira Poletini
Departamento de Fisiologia e Biofsica, Instituto de Cincias Biolgicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Contato do autor: marispoletini@icb.ufmg.br Resumo. A liberao hormonal de cada componente do eixo hipotlamo-hipfise-gonadal ocorre numa janela temporal circadiana, o que fundamental para garantir o sucesso reprodutivo e a ovulao de fmeas de mamferos quer sejam ovuladores espontneos ou induzidos. Um pico na secreo do hormnio luteinizante (LH) garante a ruptura do folculo ovariano e expulso do ocito. Este pico precedido pela hipersecreo do hormnio liberador de gonadotrofinas (GnRH) dos neurnios hipotalmicos. Em roedores, est bem definido que a ativao destas secrees o resultado da integrao de mecanismos neuroendcrinos cclicos, tais como um aumento das concentraes plasmticas de estradiol durante a fase folicular do ciclo estral e um sinal neural vindo dos ncleos supraquiasmticos (NSQs). Alm disso, tm-se acumulado evidncias de que o funcionamento de cada um dos componentes do eixo hipotlamo-hipfise-gonadal tem a intermediao de protenas do relgio biolgico. Esta reviso discute estas evidncias. Palavras-chave. Protenas de relgio; Ovulao; Ratas; Hormnio luteinizante. Abstract. The components of hypothalamus-pituitary-gonadal axis release their products in a circadian-temporal window; this is crucial for the reproductive success in either spontaneous or inducible ovulators. The preovulatory surge of luteinizing hormone (LH) is preceded by a hypersecretion of the gonadotrophin-releasing hormone (GnRH). In rodents, it is already known that the timed, preovulatory activation of GnRH-secreting neurons depends on a complex interacting neuroendocrine mechanism involving two cyclic signals: an ovarian estradiol rise in plasma levels during the follicular phase of the estrous cycle and a neural signal from the suprachiasmatic nuclei (SCN). Evidences supporting the hypothesis that the hypothalamic-pituitary axis function depends on the integrity of an autoregulatory loop of expression of clock proteins on each of its components are increasing. This review discusses these evidences. Keywords. Clock protein; Ovulation; Female rats; Luteinizing hormone.
Recebido 18out10 Aceito 03mai12 Publicado 27dez12
Do ponto de vista evolutivo, a reproduo serve como uma maneira de perpetuar caractersticas de uma espcie, por meio de uma linguagem universal composta de sequncias de nucleotdeos. O sucesso do processo depende, na reproduo sexual, das diferentes estratgias encontradas pelos organismos que garantem que ocorra a unio entre os gametas. Em vertebrados, o comportamento sexual, a produo e a liberao dos gametas so eventos orquestrados pelos produtos de liberao do eixo hipotlamo-hipfise-gonadal. Esta liberao ocorre de acordo com o ciclo de claro e escuro em que o animal est exposto, garantindo o controle temporal da fertilidade. Alm disso, a fertilidade aumentada em determinadas estaes, garantindo que o nascimento da prole ocorra no momento em que o clima seja o mais adequado s caractersticas da espcie
e quando a disponibilidade de alimento maior. Dentre todas as pistas ambientais, a variao fotoperidica anual parece ser a pista decisiva que determina as variaes sazonais da fertilidade (Kennaway, 2005). As mudanas da durao do claro e do escuro ao longo do ano controlam a liberao de melatonina, alm de outros sinais hormonais e neurais (Reiter, 1980). O hormnio liberador de gonadotrofinas (GnRH) um neuropeptdeo hipotalmico, o qual estimula a adeno-hipfise a liberar o hormnio luteinizante (LH) e o hormnio folculo estimulante (FSH). Estes hormnios, por sua vez, garantem a liberao pelas gnadas de hormnios de natureza esteroidal, dentre eles os estrgenos, os progestgenos e a testosterona, que so os mais importantes para a funo reprodutiva. Estes esterides podem exercer
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Poletini: Protenas de relgio e ovulao

al, 1999; Miller et al, 2004). Nos mamferos, so os ncleos supraquismaticos (NSQs), localizados no hipotlamo, os responsveis pela gerao da ritmicidade e pela sincronizao do relgio biolgico com as pistas ambientais, traduzindo as informaes do comprimento do ciclo de claro/escuro. So, por isto, considerados o relgio biolgico central. Existem projees diretas desta rea do sistema nervoso central para os neurnios produtores de GnRH (Kalsbeek e Buijs, 2002) e a integridade dos NSQs necessria para a ovulao (Wiegand et al, 1980). Assim, o sinal neural que participa do processo ovulatrio, em roedores, pode ter sua origem nestes ncleos. Mutaes genticas podem levar a alteraes nos ritmos circadianos demonstrando que os relgios biolgicos esto codificados no DNA (Hall e Rosbash, 1988). As primeiras mutaes foram observadas em Drosophila melanogaster (mutao no gene period) (Konopka e Benzer, 1971) e depois em hamsters (mutao no gene tau) (Ralph e Menaker, 1988). Atualmente sabe-se que diversos genes constituem alas de retroalimentao positiva e negativa que so a base molecular da gerao do ritmo biolgico. Suas protenas acumulam-se no citoplasma de maneira circadiana. Nos mamferos, dois genes tm ao bastante importante: Bmal1 e Clock, que constituem um heterodmero. A descoberta de que os genes de relgio so expressos de maneira circadiana em vrios tecidos perifricos e em vrias regies cerebrais (Balsalobre, 2002) mostra que o relgio biolgico composto, alm do relgio central, por osciladores perifricos. Experimentos de transplantes de tecido dos NSQs em animais em que estes ncleos haviam sido lesados (Guo et al, 2006; LeSauter et al, 1996), ou em animais nocautes para Bmal1, restauram os ritmos circadianos nestes animais (Sujino et al, 2003). Transplantes de NSQs, provindos de animais geneticamente modificados que apresentam ritmos endgenos com diferentes perodos, para animais com leso dos NSQs, induzem oscilaes em que o perodo determinado pelo doador (Pando et al, 2002). Com base nestes resultados, aceita-se a preponderncia do relgio central sobre os relgios perifricos (tecidos perifricos e regies cerebrais fora dos NSQs), cabendo ao primeiro, o papel de sincronizar os mltiplos relgios endgenos. Acumulam-se evidncias a favor da possibilidade de que as protenas de relgio sejam parte do sinal circadiano responsvel pelo pico pr-ovulatrio de LH, o qual ocorre em sincronia com as variaes no fotoperodo. Os genes de relgio so expressos de maneira circadiana em neurnios GnRH, nos gonadotrfos hipofisrios e nos ovrios. Esta expresso est intimamente relacionada com a funo dos componentes do eixo hipotlamo-hipfise-gnadas. Culturas de neurnios GnRH de camundongos, submetidas a tratamento com altas concentraes de soro fetal bovino, mostram expresso circadiana dos genes de relgio (Gillespie et al, 2003). A secreo pulstil de GnRH determinada pelas protenas de relgio (Chappell et al, 2003). O estradiol garante indiretamente a hipersecreo de GnRH, atuando principalmente em uma populao de neurnios
diversas funes, que vo desde a plasticidade do sistema auditivo das fmeas do peixe, Porichthy notatus, as quais so capazes de ouvir um som emitido pelos msculos snicos das bexigas natatrias dos machos, somente na estao reprodutiva (Sisneros, 2009), at a participao em mecanismos de retroalimentao positiva e negativa. Estes mecanismos permitem que os esterides exeram uma ao estimulatria e/ou inibitria sobre o hipotlamo e a adeno-hipfise, garantindo variaes cclicas nas secrees dos hormnios adeno-hipofisrios, essenciais oognese em fmeas de mamferos. A liberao de GnRH pulstil em machos e fmeas de todas as espcies de mamferos estudadas. A pulsatilidade crtica para sustentar a secreo hipofisria do LH e do FSH em fmeas. Em roedores, o estradiol liberado pelos ovrios tem ao inibitria sobre o eixo hipotlamo-hipfise durante a maior parte do ciclo estral. Entretanto, esta retroalimentao negativa quebrada durante a fase folicular, quando o estradiol secretado abundantemente pelos folculos ovarianos passa a exercer ao estimuladora sobre o hipotlamo e a hipfise. A ao do estradiol ovariano leva a um aumento da secreo de GnRH por neurnios hipotalmicos. Alm disso, este aumento, provoca um pico de LH na fase do proestro. Em fmeas de camundongos e de ratos (roedores noturnos), o horrio do pico precede o incio da atividade do animal (Christian et al, 2005; Legan e Karsch, 1975). no momento do pico que ocorre a expulso do ocito do folculo ovariano. Assim, na ocorrncia da cpula, os vulos estaro depositados nas trompas uterinas espera dos espermatozides (Freeman et al, 1994). A quebra do mecanismo de retroalimentao negativa desempenhado pelos esterides ovarianos sobre o hipotlamo e a hipfise e o estabelecimento do mecanismo de retroalimentao positiva que os mesmos hormnios assumem, um dos aspectos mais desafiadores do controle neuroendcrino da reproduo. Em roedores, a retroalimentao positiva exercida pelo estradiol (Freeman et al, 1994), e em aves pela progesterona (Johnson et al, 1985). Em ambos grupos de animais, acumulam-se evidncias a favor da existncia de uma janela temporal circadiana, em que os mecanismos de deflagrao do pico de LH so ativos. O trabalho de Everet e Sawyer, realizado em 1950 (Everett e Sawyer, 1950), em fmeas de ratos, comprova de forma clara a existncia dessa janela. Estes pesquisadores e posteriormente outros, realizando experimentos em fmeas de hamsters (Norman et al, 1972), observaram um atraso de 24 horas da ovulao e do pico de LH aps a aplicao de anestesia profunda. A anestesia era administrada num momento preciso do dia do proestro e, se fosse repetida no dia seguinte no mesmo horrio, o atraso de fase observado era prolongado por mais 24 horas. Em roedores, outras evidncias apontam para a existncia dessa janela temporal. Em fmeas de ratos, atrasos ou adiantamentos no incio da fase de claro provocam uma alterao no horrio da ovulao (Hoffmann, 1969) e, em fmeas de camundongos e de hamsters, alteraes no perodo endgeno do ritmo de atividade so acompanhadas por alteraes no horrio do pico de LH (Lucas et
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secretores de um peptdeo denominado kisspeptina (Tena-Sempere, 2006). A kisspeptina estimula a secreo de GnRH. Em fmeas de camundongos, a expresso do receptor para este peptdeo em neurnios GnRH depende da expresso das protenas de relgio (Tonsfeldt et al, 2011), e em fmeas de hamsters, a atividade dos neurnios kisspeptinrgicos oscila com um pico no meio do ciclo claro/escuro (Williams et al, 2011). Em relao hipfise, a sensibilidade dos gonadotrfos hipofisrios ao LH depende das protenas de relgio, uma vez que a expresso do receptor para este hormnio regulada pela protena PERIOD 1 (Resuehr et al, 2009). A sensibilidade ovariana ao LH tambm dependente do ciclo claro/escuro (Sellix e Menaker, 2010). Alm disso, a cascata enzimtica que leva produo de esterides pelos ovrios depende do funcionamento da ala auto-regulatria de expresso dos genes de relgio (Nakao et al, 2007). Estes resultados, em conjunto, corroboram a hiptese de que, alm da ao sincronizadora exercida pelos NSQs sobre o eixo hipotlamo-hipfise-gnadas, cada um dos componentes desse eixo funciona como um oscilador endgeno, garantindo que seu produto de liberao atue numa janela temporal determinada pela expresso das protenas de relgio. Camundongos mutantes que no expressam o gene Clock apresentam menor sucesso reprodutivo, reduo no nmero de filhotes e prolongamento do ciclo estral (Miller et al, 2004). Estas descobertas sobre a participao das protenas de relgios na funo reprodutiva levam a novas anlises sobre o paradigma dos mecanismos de retroalimentao exercidos pelos esterides ovarianos. Juntamente com o fato de que estes mecanismos funcionam dentro de uma janela temporal circadiana, podemos concluir que podem ser gerados por um relgio biolgico endgeno.
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ib.usp.br/revista
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Poletini: Protenas de relgio e ovulao
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ib.usp.br/revista

DOI: 10.7594/revbio.09.03.08
Ensaio
Cronobiologia vegetal: aspectos fisiolgicos de um relgio verde

Ivan Santos Salles* e Marcos Silveira Buckeridge
*Contato do autor: ivanss7@gmail.com
Plant chronobiology: physiological aspects of a green clock
Departamento de Botnica, Instituto de Biocincias, Universidade de So Paulo
Resumo. Apesar de a maior parte dos trabalhos em cronobiologia ser desenvolvida em animais, os ritmos biolgicos foram inicialmente detectados em plantas e importantes descobertas cronobiolgicas ocorreram no campo da biologia vegetal. Muitos conceitos centrais, hoje amplamente aplicados para diversos organismos, foram inicialmente identificados em plantas. Esta reviso tem por objetivo apresentar as principais descobertas no campo da cronobiologia vegetal, a partir de uma perspectiva histrica, bem como, expor os principais eventos fisiolgicos envolvidos em processos temporais nas plantas. Palavras-chave. Cronobiologia, osciladores e ritmo circadiano. Abstract. Although animals are the most frequent biological system in chronobiologic works, biological rhythms were originally described in plants and the history of chronobiology is permeated by important discoveries in the plant biology field. Many central concepts, nowadays widely applied to diverse organisms, have initially been identified in plants. The present review aims to introduce the main discoveries in plant chronobiology, adopting a historical approach, and to introduce the main physiological events involved in plants endogenous timekeeping as well. Keywords. Chronobiology, oscillators and circadian rhythm.
Recebido 31ago10 Aceito 21ago12 Publicado 27dez12
Cronobiologia: uma viso histrica

A percepo da existncia e da importncia dos ciclos naturais permeia a cultura de diversos povos, muitas vezes refletidos em lendas, mitos ou cultos religiosos. No entanto, a noo de que os organismos vivos poderiam acompanhar e responder a esses ciclos naturais mais recente. Provavelmente o primeiro relato descritivo de um ciclo biolgico foi feito por Andrstenes de Thasos em 325 a.C. Andrstenes era historiador e acompanhava o exrcito de Alexandre, o Grande, em suas excurses de batalha. Em um dos acampamentos, ele passou a observar uma rvore de Tamarindus indica, o tamarindeiro, e descreveu a forma peculiar com que as folhas se fechavam durante a noite e se abriam durante o dia (Bretzl, 1903; Schildknecht, 1983). A percepo da existncia de ritmos em seres vivos foi um elemento importante na histria. Porm, mais de dois mil anos se passaram at o surgimento da ideia de tais ciclos no serem uma mera resposta ao ambiente, mas sim o resultado de um mecanismo endgeno de gerao de ritmos biolgicos, influenciado pelo ambiente. Esta ideia surgiu em 1729, proposta pelo astrnomo francs Jean Jacques de Mairan. Assim como Andrstenes,
de Mairan percebeu a existncia de ciclos dirios na movimentao foliar de uma planta, provavelmente uma mimosa, e decidiu isol-la em um compartimento sem luz. A constatao de que o ritmo nictinstico (movimentao foliar) mantinha-se mesmo em escuro constante foi objeto de publicao cientfica, mas na poca no foi dada a devida importncia ao fato. Somente 30 anos depois estes experimentos foram retomados (apud Moore-Ede e col., 1982, apud McClung, 2006). Em 1759, Johann Gottfried Zinn, ao cultivar plantas de Mimosa virgata em um poro sob escuro constante, observou que a movimentao foliar no era afetada por variaes de temperatura. Este fato inesperado fez com que Zinn propusesse, pela primeira vez, a existncia de um mecanismo endgeno de gerao de ritmos independente da temperatura ambiente (Cumming e Wagner, 1968). Em 1832, Augustin Pyrame de Candolle, um botnico suo, conseguiu medir o perodo do ritmo de movimentao foliar de uma planta em escuro constante. Ele mostrou que o perodo no era exatamente de 24h, sendo esta mais uma caracterstica que indicaria a existncia de um mecanismo endgeno de marcao do tempo (apud McClung, 2006). No mesmo trabalho, de Candolle conseguiu ainda
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ritmos circadianos vai de 0,8 a 1,4 (Dunlap e col., 2004). Um exemplo Phaseolus coccineus, que exibe um Q10 de 1,2 no perodo da movimentao foliar (Bnning, 1931).
inverter as fases do ritmo da movimentao foliar ao inverter as fases do ciclo claro/escuro ao qual as plantas estavam submetidas, demonstrando assim a importncia do ciclo ambiental na expresso final do ritmo (apud Cumming e Wagner, 1968). Em meados dos anos 1940, Erwin Bnning props, ao discutir fotoperiodismo, que o mecanismo de medida da durao do dia fosse controlado por um oscilador endgeno, com perodo de aproximadamente 24h (circadiano) (apud Cumming e Wagner, 1968). O mesmo Bnning ainda sugeriu que este oscilador teria sua expresso dividida em duas fases de aproximadamente 12h cada uma (uma vinculada ao claro e outra ao escuro), sendo que cada uma das fases apresentaria sensibilidade diferente a estmulos ambientais (apud Cumming e Wagner, 1968). Nesta poca, muitos estudos vinham sendo desenvolvidos, em diversas espcies animais e vegetais, com o objetivo de melhor entender os ciclos biolgicos. Foi ento que em 1960, no encontro sobre Relgios Biolgicos (Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology), ocorrido nos EUA, que a cronobiologia (do grego: cronos = tempo; bios = vida e logos = estudo) foi sistematizada como uma disciplina (Marques e Menna-Barreto, 2003). Este evento compilou as principais ideias e conhecimentos adquiridos ao longo dos anos e levantou novas questes a serem entendidas, gerando uma nova era no estudo dos ritmos biolgicos, na qual as perguntas bsicas seriam voltadas ao entendimento do funcionamento do prprio oscilador.
Osciladores e acoplamento
A base molecular de gerao da oscilao circadiana baseia-se em alas de retroalimentao, com componentes positivos e negativos, envolvendo transcrio e traduo gnicas. Em plantas, j foram descobertas trs alas principais, sendo uma central (responsvel pela gerao do ritmo) e duas de regulao fina do sistema (Harmer, 2009). Esta descoberta interessante, principalmente ao pensarmos que todas as clulas carregam a maquinaria necessria para compor um oscilador endgeno, gerando a possibilidade de uma mirade de osciladores em uma mesma planta. Atualmente as evidncias apontam exatamente para isso. No encontramos uma regio, ou rgo, que concentre a funo de relgio endgeno em vegetais; cada clula gera seu prprio ritmo, e muitas vezes, uma nica clula apresenta mais de um oscilador (Lumsden e Millar, 1998; McClung, 2006; Harmer, 2009) Os osciladores no geram ritmos exatamente iguais 24h e, numa mesma planta, cada oscilador apresenta um perodo prximo, mas no exatamente igual aos outros (Lumsden e Millar, 1998). Ento como a planta como um todo no fica dessincronizada? Devemos primeiro pensar que os osciladores, quando em condies naturais, no esto em livre curso, mas arrastados por ciclos do ambiente. Alm dos ciclos ambientais, sinais cclicos da prpria planta propiciam a sincronizao dos osciladores entre si. Em pequena escala, sinais de curta distncia podem ser transmitidos para as clulas adjacentes por meio de plasmodesmata (junes citoplasmticas entre clulas atravs de poros na membrana e parede celular). Os sinais transmitidos podem ser qumicos ou eltricos (Ding,1997). Para transmisses em maiores distncias, outros mecanismos esto presentes, como por exemplo, sinais hidrulicos, hormonais ou at acares (James e col., 2009). Diversos trabalhos mostram que tambm hormnios podem atuar como sinais de sincronizao endgena fraca. Giberelina, auxina e etileno so apontados como efetores em mudanas nas fases dos osciladores (Viswanathan e Subbaraj, 1983; Foster e Morgan, 1995; Machackova e col., 1997; Morgan e col., 1990; Ievinsh e Kreicbergs, 1992). No entanto, todos os agentes sincronizadores endgenos conhecidos apresentam uma baixa capacidade de manter uma relao de fase estvel entre os osciladores da planta. Thain e colaboradores (2000) demonstram que os osciladores de uma planta de tabaco podem ser regionalmente desacoplados, ou seja, rgos distintos podem ser arrastados por ciclos ambientais em diferentes relaes de fase. Neste experimento, diferentes rgos de uma mesma planta (no caso duas folhas distintas) foram submetidos ao mesmo tempo, a tratamentos com ciclos claro/escuro
Circarritmos
O termo circadiano (do latim circa = cerca de e dies = dia) foi originalmente cunhado por Franz Halberg para definir ritmos com durao aproximada de 24h (McClung, 2006). O mesmo autor props a denominao ultradianos para ritmos com perodos menores que 20h e infradianos para aqueles com perodos maiores que 28h (Marques e Menna-Barreto, 2003). Atualmente, todo ritmo, seja qual for seu perodo, controlado por um ou mais osciladores endgenos chamado circarritmo (como circamar, circalunar, etc.) (Lumsden e Millar, 1998). Mas, como saber se um ritmo gerado por um relgio endgeno? Para um ritmo ser considerado um circarritmo ele deve apresentar trs caractersticas bsicas: A) persistir em condies ambientais constantes (condio de livre curso). B) ser passvel de arrastamento: o oscilador deve entrar em ressonncia com um ciclo ambiental e estabelecer com ele uma relao de fase estvel. Em consequncia, seu perodo torna-se igual ao do ciclo ambiental. C) o perodo do ritmo endgeno deve apresentar compensao temperatura, ou seja, apresentar um Q10 prximo a 1 (Harmer, 2009). Q10 a taxa de modificao exibida por um processo biolgico, quando a temperatura ambiente sofre uma variao de 10C. Normalmente a velocidade das reaes bioqumicas dobra ou triplica com o aumento de 10C na temperatura, ou seja, apresentam um Q10 = 2 ou 3. No entanto, o Q10 da variao do perodo dos
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em oposio de fase, que mantinha uma das folhas no claro e a outra no escuro. Como resultado, as folhas apresentavam-se em oposio de fase, situao que se manteve quando a planta foi transferida para condies constantes. Isso indica que os resultados obtidos no foram devidos presena de luz, e sim que os osciladores foram arrastados pelo ciclo claro/escuro. Esta independncia entre rgos um fenmeno aceitvel ao observarmos a parte area das plantas, a qual est diretamente submetida ao ciclo claro/escuro. No entanto, ao analisarmos o conjunto de osciladores presentes nas razes, torna-se pouco intuitivo pensarmos em uma sincronizao direta pelo ciclo claro/escuro, o qual o principal sincronizador em plantas. De fato, estudos feitos com razes de Arabidopsis indicam a importncia de fatores endgenos para a sincronizao dos osciladores desse rgo (James e col., 2009). Este estudo aponta para uma sincronizao do conjunto de osciladores das razes de Arabidopsis proporcionada por um sinal advindo da parte area da planta. levantada a possibilidade de a fotossntese ser a responsvel por tal sinalizao (provavelmente um sinal de acar) (James e col., 2009). Na verdade, o mecanismo molecular dos osciladores da poro radicular parece ser simplificado. H evidncias de que ocorra inativao de duas das alas de retroalimentao que compem os osciladores. Esta situao sugere um papel secundrio dos osciladores da raiz, que dependeriam de sinais temporais da parte area da planta (James e col., 2009). Como plantas no possuem um sistema circulatrio, qualquer informao advinda de sinais bioqumicos deve ser primeiramente enviada para a parte radicular e posteriormente redirecionada para outras partes do organismo (como no caso de hormnios no volteis). Portanto, a raiz seria o local com a maior probabilidade de abrigar um oscilador central (que concentrasse informaes ambientais e coordenasse os demais osciladores). Os resultados de James e colaboradores (2009) no corroboram esta hiptese. Os autores no identificaram um coordenador central nas razes de Arabdopsis, mas demonstraram a existncia de osciladores menos complexos, que dependem de outros osciladores para seu correto funcionamento. A situao atual indica a existncia de um sinal sistmico capaz de acoplar os osciladores. Entretanto, o acoplamento parece ser fraco, o que depe contra a ideia da existncia de um sistema central de coordenao rtmica das plantas.
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dois. Os fitocromos atuam principalmente absorvendo luz na faixa do vermelho, enquanto os criptocromos atuam primordialmente na faixa do azul. Porm, sobreposies entre os espectros de absoro nas duas famlias so comuns (Ahmad, 1999; Briggs e Olney, 2001). Todos os membros das duas famlias participam como transdutores de informao luminosa para os osciladores (Devlin e Kay, 2000). Em plantas difcil diferenciar a via de transduo do sinal luminoso (aferncia) do prprio oscilador. Isso porque os fotopigmentos mencionados, em associao com outras protenas, podem induzir ou reprimir a expresso de genes do relgio diretamente no ncleo celular (Harmer, 2009). Da mesma forma, algumas protenas componentes das alas de retroalimentao do relgio so apontadas como fotopigmentos que respondem a comprimentos de onda na faixa do azul (Martin-Tryon e col., 2007). Uma vez que a concentrao dos fotopigmentos oscila circadianamente (assim como a concentrao das protenas fotossensveis, componentes das alas de retroalimentao do relgio) o organismo apresenta fases de maior ou menor sensibilidade ao sinal luminoso ambiental (Bognar e col., 1999; Hall e col., 2001; Toth e col., 2001). Esta caracterstica do relgio de plantas faz com que a prpria entrada do sinal luminoso seja controlada pelo relgio. Outro fator que controla a entrada de luz a produo, no final do dia, de uma protena (ELF3) que diminui a fotossensibilidade da planta. O papel deste controle da entrada de luz no relgio ainda mal entendido, mas sabemos que importante para o correto funcionamento do relgio quando a planta est submetida a longas fotofases (fase de claro) (McWatters e col., 2000; Millar, 2004).
Eferncias: fisiologia controlada pelo relgio

Como observado anteriormente, a comunicao entre os diversos relgios em uma planta pode ser fraca. No entanto, existe um controle altamente regulado dos processos fisiolgicos circadianos. A transduo do sinal do relgio para os eventos fisiolgicos pode ser regulada em diferentes nveis. O primeiro nvel se d no controle da transcrio gnica, ou seja, o relgio pode induzir ou reprimir a expresso de determinados genes (como ativar a produo hormonal ou genes envolvidos com a cadeia de transporte de eltrons) ao longo do dia e de acordo com a fase em que o oscilador se encontra (Harmer, 2009). De fato, j foram identificadas sequncias especficas de nucleotdeos da regio promotora de alguns genes, que definem a fase na qual esses genes sero expressos (Harmer e col., 2000). O segundo nvel do controle circadiano ocorre no momento da traduo. Alguns genes podem apresentar um nvel constitutivamente constante de transcrio, mas a concentrao de suas protenas claramente exibe um ritmo, originado pela regulao direta da traduo destes genes (McClung, 2001). O terceiro nvel conhecido o controle da atividade
Vendo o mundo em vermelho e azul: sinais ambientais

Sabe-se que, de todos os ciclos ambientais, o ciclo claro/ escuro aquele que mais eficientemente arrasta os ritmos de uma planta (Lumsden e Millar, 1998). Os osciladores recebem a informao luminosa atravs da mediao de dois grupos principais de fotopigmentos, os fitocromos e os criptocromos (Devlin e Kay, 2000). A famlia dos fitocromos dividida em cinco componentes, enquanto a famlia dos criptocromos em apenas
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es de fases distintas e variveis ao longo do ano. Assim, quando o rgo como um todo analisado encontramos processos mutuamente excludentes sendo coordenados de formas distintas ao longo do ano. difcil especular sobre as situaes que favoreceram o surgimento de um conjunto de osciladores fracamente acoplados. Podemos sugerir que tal fato seja relevante quando se pensa na composio da copa de uma planta. Eventualmente cada ramo est submetido a uma condio luminosa diferente dos demais. Assim a possibilidade de coordenao independente de cada ramo, ou at de cada folha, maximizaria a eficincia energtica da planta como um todo.
de determinadas protenas. O controle proporcionado principalmente pela fosforilao rtmica delas. A fosforilao pode ativar, desativar ou marcar as protenas para degradao (Harmer, 2009). O ltimo, e menos rgido controle exercido pelo relgio biolgico, aquele que atua sobre as redes metablicas como um todo. O processo consiste no controle circadiano de um ou mais componentes de uma rede metablica, o que gera o controle de toda a rede (Harmer, 2009). Este mecanismo muitas vezes chamado de controle em gate (do ingls, porto), em que o evento fisiolgico limitado pelo relgio, mas no totalmente controlado por ele (Lumsden e Millar, 1998) (Nota: esta denominao pode causar alguma confuso, uma vez que em populaes de animais, principalmente insetos, o termo gate associado a outro processo; sugiro a leitura desta definio em Dunlap e col., 2004).
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Mltiplos osciladores: vantagens adaptativas da marcao temporal

A existncia de um mecanismo de marcao temporal endgeno possibilita ao organismo antecipar-se s variaes cclicas ambientais e no apenas responder a elas. Isso permite uma preparao fisiolgica a diversas condies crticas, como preparar os fotossistemas para a chegada da luz no comeo do dia ou, no caso de unicelulares, aumentar a proteo contra radiao UV nas horas crticas do dia (Enright, 1970; Lumsden e Millar, 1998; McClung, 2001;). Experimentos em diferentes linhagens de cianobactrias (mutantes quanto ao perodo de seus ritmos) demonstram que quanto mais prximo o perodo do ritmo endgeno do perodo do ciclo ambiental, maior a probabilidade de sobrevivncia da linhagem (Ouyang e col., 1998). Estes resultados demonstram a importncia da existncia de um ritmo endgeno, cuja oscilao intrnseca favorece a adaptao a um ambiente cclico. A existncia de mltiplos osciladores pode facilitar ainda mais os mecanismos adaptativos, por aumentarem a plasticidade do sistema circadiano. Isto porque dois eventos controlados por dois osciladores diferentes podem estabelecer qualquer relao de fase entre si. Tal padro ajuda a coordenar eventos metablicos distintos ou mutuamente excludentes. Por exemplo, a atividade do metabolismo CAM (Crassulacean Acid Metabolism), o qual apresenta duas fases distintas, a fase de fixao de carbono e a de captao da energia luminosa (Lumsden e Millar, 1998; Duarte e col., 2005). Este padro se altera ao longo do ano, dependendo das condies ambientais s quais o organismo est submetido, exigindo que a planta se adapte para melhor aproveitamento da gua e energia luminosa disponveis. No entanto, devido ao fraco acoplamento entre osciladores em plantas, outro mecanismo capaz de coordenar processos mutuamente excludentes e variveis ao longo do tempo seria a separao espacial destes processos (em tecidos ou mesmo clulas distintas de um mesmo tecido que apresentem relaes de fase variveis). Estes conjuntos celulares poderiam apresentar osciladores em rela-
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James AB, Monreal JA, Nimmo GA, Kelly CL, Herzyk JP, GI, Nimmo HG. 2009. The Circadian Clock in Arabidopsis Roots Is a Simplified Slave Version of the Clock in Shoots. Science 322:1832-1835. Lumsden PJ e Millar AJ. 1998. Biological Rhythms and Photoperiodism in Plants. Ed. BIOS Scientific Publishers Limited, UK. Machackova I, Chauvaux N, Dwitte W e Onkelen H. 1997. Diurnal fluctuations in ethylene formation in Chenopodium rubrum. Plant Physiology 113:981-985. Marques N e Menna-Barreto. 2003. Cronobiologia: Princpios e Aplicaes. 3 ed. Edusp: So Paulo. Martin-Tryon, EL, Kreps, JA, e Harmer, SL 2007. GIGANTEA acts in blue light signaling and has biochemically separable roles in circadian clock and flowering time regulation.Plant Physiol.143473486 McClung RC. 2001. Circadian Rhythms in Plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology 52:139-162. McClung RC. 2006. Plant Circadian Rhythms. The Plant Cell 18:792-803. McWatters HG, Bastow RM, Hall A. e Millar AJ. 2000. The ELF3 zeitnehmer regulates light signalling to the circadian clock. Nature 408:716720. Millar AJ. 2004. Input signals to the plant circadian clock. Journal of Experimental Bototany 55:277283. Moore-Ede MC, Sulzman FM, Fuller CA. 1982. The Clocks that Time us: Physiology of the Circadian Timing System. Cambridge, Harvard University Press. Morgan PW, He CJ, Degreef JA e Deproft MP. 1990. Does water deficit stress promote ethylene synthesis by intact plants? Plant Physiology 94:16161624. Ouyang Y, Ersson CR, Kondo T, Golden SS e Johnson CH. 1998. Resonating circadian clocks enhance fitness in cyanobacteria. Proceedings of the National Academy of Science USA 95:8660-8664. Schildknecht H. 1983. Turgorins, Hormones of the Endogenous Daily Rhythms in Higher Organized Plants-Detection, Isolation, Structure, Synthesis, and Activity. Angewandet Chemie International Edition in English 22:695-710. Thain SC, Hall A, Millar AJ. 2000. Functional independence of circadian clocks that regulate plant gene expression. Current Biology 951-956. Toth R, Kevei E, Hall A, Millar AJ, Nagy F, Kozma-Bognar L. 2001. Circadian clock-regulated expression of phytochrome and cryptochrome genes in Arabidopsis. Plant Physiology 127:1607 1616. Viswanathan N e Subbaraj R. 1983. Action of gibberelic-acid in plants-shifts of the circadian leaf-movement rhythm of a cotton plant, Gossypium hirsutum. Caneidian Journal of Botany 61:2527-2529
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DOI: 10.7594/revbio.09.03.09
Reviso
Coordenao temporal da degradao das reservas dos cotildones de jatob (Himenaea courbaril L.)
Temporal coordination of degradation of jatobs cotyledons reserves (Himenaea courbaril L.)
Ivan Santos Salles* e Marcos Silveira Buckeridge
*Contato do autor: ivanss7@gmail.com
Departamento de Botnica, Instituto de Biocincias, Universidade de So Paulo
Resumo. A germinao das plantas uma fase delicada do desenvolvimento. O uso correto das reservas nutricionais pode definir o estabelecimento ou a morte das plntulas. Neste trabalho apontamos as principais particularidades da germinao do jatob, apresentando os pontos de controle metablicos j conhecidos e discutindo possibilidades futuras na rea, tendo como foco a coordenao temporal deste processo. Palavras-chave. Cronobiologia, fotossntese, metabolismo de reservas, relgio endgeno. Abstract. The plant germination is a delicate phase of the development. The correct use of the nutritional reserves could define seedling or death. In this work we highlight the main particularities of jatob germination, presenting the already known metabolic control points and discussing the future perspectives in the field, focusing the temporal coordination involved in this process. Keywords. Chronobiology, endogenous clock, photosynthesis, reserve metabolism.
Cotildones e Reserva
Os cotildones so rgos que evoluram de folhas, sendo assim, podemos consider-los folhas modificadas com a funo de armazenamento. Os nutrientes reservados nos cotildones auxiliam a germinao e o desenvolvimento da planta at o estabelecimento da fotossntese (Taiz e col., 2006). Os cotildones do jatob (Himenaea courbaril L.) apresentam caractersticas interessantes com relao ao armazenamento e liberao das reservas. Diferentemente da maioria das plantas, os principais componentes das reservas de jatob so polissacardeos constituintes da parede celular, primordialmente xiloglucanos (hemiceluloses) (Buckeridge e col., 2000), depositados entre duas camadas de parede celular primria (Santos e Buckeridge, 2004; Buckeridge e col., 2008). As hemiceluloses so formadas por uma cadeia central de polmeros de acar e apresentam ramificaes laterais variadas. Esta conformao faz com que o conjunto hemicelulose seja de difcil degradao, exigindo um grande nmero de enzimas atuando em srie (Tin e col., 2000). A maior complexidade deste metabolismo, apesar de mais dispendioso energeticamente, representa uma
vantagem para o organismo por dificultar a predao. Isso porque, o predador dever apresentar todas as enzimas envolvidas na degradao destes polmeros. Podemos inferir, portanto, que exista um nmero reduzido de organismos que se alimentem de sementes de jatob (Buckeridge e col., 2008).
Regulao Enzimtica
O complexo metabolismo, apesar de representar uma vantagem contra predao, necessita de uma intrincada rede de coordenao para a correta liberao das reservas. O conhecimento sobre os pontos de controle desse processo ainda fragmentado, mas j nos permite vislumbrar alguns efetores envolvidos e inferir a forma geral desta rede. Sabemos que nela esto envolvidos diversos sinais, endgenos e exgenos (Brando e col., 2009), como sinalizao hormonal (Santos e col., 2004), regulao por acar (Tin e col., 2000), regulao por luz (Santos e Buckeridge, 2004) e coordenao temporal pelo relgio endgeno (Lumsden e Millar, 1998; Amaral, 2005). Santos e colaboradores (2004) demonstraram que a presena de auxina gera um aumento na atividade enzimtica do metabolismo de reservas. O mecanismo por eles proposto, para explicar tal fenmeno, baseia-se em
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alteraes de pH induzidas pela auxina na matriz extra celular. As enzimas que desmontam o xiloglucano (polmeros de acares constituintes de parede com funo de reserva em cotildones) apresentam atividade mxima em pH cido. Como a auxina ativa o transporte de prtons para a regio da parede celular, ela tambm aumentaria a degradao das reservas. Isso porque a atividade das enzimas seria aumentada pela diminuio do pH (Tin e col., 2000; Taiz e col., 2006). No entanto, a produo de auxina regulada pela luz (Taiz e col., 2006). No contexto atual, sabemos que a luz e os acares livres so particularmente importantes na coordenao da mobilizao das reservas. No jatob, grande parte desta importncia devida ao fato de o estabelecimento da fotossntese se dar antes do trmino das reservas dos cotildones. Com isso, passa a existir uma fase em que as plantas dispem de duas fontes de carbono; uma devida fotossntese e outra, reserva dos cotildones (Santos e Buckeridge, 2004). Experimentos anteriores mostraram que existe uma aparente coordenao temporal entre a liberao dos acares dos cotildones e a fotossntese. Isso porque, tais eventos apresentam-se em antifase, com o pico da atividade enzimtica nos cotildones ocorrendo no meio da noite, o que evita a sobreposio com a fotossntese (Amaral, 2005). Este fenmeno pode ser gerado pela prpria fotossntese, uma vez que a presena de acares livres atua como regulador negativo na mobilizao das reservas (Tin e col. 2000). Caso a taxa de crescimento da planta ou do transporte dos acares para os drenos (locais com alta taxa de consumo de energia, como folhas em desenvolvimento) seja baixa em relao liberao de acares, molculas de acar ficaro acumuladas nos cotildones, bloqueando a atividade enzimtica e parando o processo de mobilizao (Tin e col., 2000). A razo entre o consumo de acares dos drenos e a produo pelas fontes (locais de exportao de molculas altamente energticas), pode ser influenciada pela existncia de mais de uma fonte ativa no sistema. Isto porque, a capacidade de consumo de acares dos drenos limitada. Assim sendo, uma vez que a degradao de reservas e a fotossntese esto concomitantemente ativas, a relao fonte/dreno modificada para um patamar de produo maior que o consumo. O eventual acmulo de acares livres no sistema bloqueia a degradao de reservas e pode diminuir a assimilao de carbono pela fotossntese. Portanto, existe uma interdependncia entre as fases de ativao das duas fontes (fotossntese / metabolismo de reservas), as quais, dependendo da relao fonte/dreno, podem se tornar mutuamente excludentes. Assim, uma vez que a luz ativa a cadeia fotossinttica, bem como, induz a transcrio de diversos genes envolvidos com a fotossntese (Bennett, 1983; Schrmann e Jacquot, 2000), podemos supor que o ciclo claro/escuro exera um controle direto sobre o controle da ativao dos rgos fonte. Por outro lado, sabemos que tanto a fotossntese quanto a concentrao de auxinas so controladas pelo relgio biolgico. Neste sentido, a degradao das reservas dos cotildones seria controlada, no mnimo
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indiretamente, pelo relgio endgeno (Lumsden e Millar, 1998; Covington e Harmer, 2007).
O Relgio Endgeno e as Reservas

A grande questo saber se o prprio metabolismo de degradao das reservas controlado diretamente por um oscilador endgeno (ver reviso sobre cronobiologia vegetal publicada nesta mesma edio da Revista da Biologia). Alternativas possveis so: 1. o processo oscila circadianamente e 2. a relao de antifase, descrita anteriormente, seria gerada diretamente pelas concentraes de auxina e de acar. Como estamos discutindo a situao em plntulas, primeiramente necessrio demonstrar que a prpria maquinaria de marcao temporal endgena encontra-se estabelecida e funcional. Um estudo de 2008, com Arabidopsis (Salom e col., 2008), mostrou a presena de um oscilador funcional em plntulas. Neste trabalho foi demonstrado que o relgio biolgico passa a funcionar momentos aps a embebio da semente. Assim sendo, o controle temporal da relao entre a fotossntese e a degradao das reservas dos cotildones de jatob poderia ser coordenado circadianamente. No entanto, era impossvel transpor os resultados para o caso do jatob por ser Arabidopsis uma planta herbcea. Assim, fez-se necessrio demonstrar que o relgio biolgico do jatob se comportaria de forma semelhante ao de Arabidopsis, ou ao menos, que este j estaria funcional no momento do estabelecimento da fotossntese. Para tal, acompanhamos durante trs dias o ritmo de assimilao de carbono das plntulas logo aps a expanso total das primeiras folhas (uma garantia de que estas j estavam atuando como fontes). Observamos ento, um ritmo evidente de assimilao de CO2 (com pico prximo ao meio da fase de claro) quando as plantas encontravam-se em condio de 12 horas de claro e 12 horas de escuro. Em seguida, as plantas foram mantidas, por trs dias, em condies constantes, para garantir que o ritmo anteriormente detectado no teria sido gerado como resposta direta ao ciclo claro/escuro ambiental. Assim, verificamos que, tanto em claro constante, como em uma condio de penumbra constante, o ritmo se mantinha, o que representa uma forte indicao da existncia de um oscilador funcional em plntulas de jatob. A partir destes resultados, podemos tentar esclarecer se a degradao das reservas controlada diretamente pelo relgio endgeno ou indiretamente atravs do controle temporal exercido sobre os outros agentes sinalizadores, como auxina e fotossntese. Com este objetivo, utilizaremos a atividade de enzimas chave no controle do metabolismo de reservas, como indicativo de sua degradao. Caso observemos um ritmo nas atividades enzimticas em condies constantes, teremos uma indicao de que o processo apresenta controle temporal endgeno. Mas esta situao levaria a outra pergunta: um nico oscilador controlaria a fotossntese e a degradao de reservas? Registrando os perodos dos ritmos da fotossntese
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Salles & Buckeridge: Coordenao temporal da degradao das reservas dos cotildones de jatob
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e da atividade enzimtica poderamos inferir se ambos os processos so controlados por osciladores diferentes. Isto porque, caso existam dois osciladores no sistema, cada um deles apresentar um perodo distinto, em condies constantes (Lumsden e Millar, 1998; Harmer, 2009). Em outras palavras, caso os perodos dos ritmos de fotossntese e das atividades enzimticas sejam diferentes teremos evidenciado dois osciladores independentes. Por outro lado, caso apenas um perodo seja detectado, no ser possvel determinar se a degradao de reservas realmente controlada diretamente pelo relgio, uma vez que esta poderia ser uma mera resposta ao padro de oscilao da fotossntese ou apenas resultado de um equilbrio qumico entre as enzimas de degradao. Para solucionar tal problema poderemos lanar mo de outra propriedade dos osciladores biolgicos, cujos perodos apresentam compensao a variaes da temperatura ambiente (Bruce e Pittendrigh, 1956; Lumsden e Millar, 1998). Assim, se variarmos a temperatura (geralmente de 5 a 10 C), o perodo do ritmo de assimilao de CO2 no dever sofrer grandes alteraes, enquanto a atividade enzimtica, caso no seja controlada diretamente pelo oscilador, variar de acordo com as mudanas de temperatura, o que nos indicar a natureza do controle da degradao das reservas. Muito provavelmente, este conjunto de resultados nos indicar uma rede de sinalizao dependente de coordenao temporal endgena. Caso tal cenrio se mostre verdadeiro, ser possvel indicar a sinalizao gerada pela luz, acares e hormnios, como controladores finos de um processo mais amplo, o controle circadiano da degradao das reservas.
Referncias bibliogrficas
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DOI: 10.7594/revbio.09.03.10
Reviso
Ritmos de populaes: o caso das abelhas sem ferro

Population rhythms: the case of stingless bee colonies
Rodrigo Cantamessa Gonalves*, Mirian David Marques
Museu de Zoologia, Universidade de So Paulo
*Contato do autor: rodrigocantamessa@gmail.com
Resumo. Abelhas sem ferro so himenpteros eussociais e a unidade biolgica da espcie a colnia. A colnia compreende castas diferentes (rainhas, zanges e operrias) e constitui-se em um superorganismo, porque indivduos isolados no sobrevivem. A colnia tem uma organizao espacial, estabelecida por sua arquitetura, que caracterstica para cada espcie e uma organizao temporal, revelada por sequncias de processos e comportamentos repetidas a intervalos regulares, igualmente espcie-especficos. Numa mesma colnia diversos ritmos esto presentes e so detectados tanto em indivduos, quanto na colnia como um todo. Esses ritmos diferem entre si, mas ainda assim relaes de fase so estabelecidas entre eles, gerando uma ordem temporal interna e garantindo a expresso rtmica geral da colnia. Tal como acontece em um organismo metazorio, o estabelecimento da ordem temporal interna garante a sobrevivncia do superorganismo. Palavras-chave. Abelhas sem ferro, Meliponini, ordem temporal interna, superorganismo. Abstract. Stingless bees are eusocial hymenopteran and the colony is the biological unit of the species. Different castes (queen, drones and workers) are present in the colony that may be considered a superorganism since isolated individuals do not survive. The colony shows a spatial organization, given by its architecture, characteristic of each species, and a temporal organization, established by sequences of processes and behaviours repeated at regular intervals, equally species-specific. In the same colony several rhythms can be detected both in individuals and in the colony altogether. The properties of these rhythms may be different but phase relations are established among them, originating a general rhythmic expression, consequence of the internal temporal order of the colony. As is the case with metazoan organisms, the establishment of the internal temporal order assures the super-organism survival. Keywords. Internal temporal order, Meliponini, stingless bees, super-organism.
Abelhas sem ferro

Abelhas sem ferro pertencem tribo Meliponini, membro da famlia Apidae. Os meliponneos apresentam caractersticas bastante particulares em sua organizao social, no comportamento e na arquitetura da colnia. Tal como acontece em todos os insetos eussociais, a colnia de abelhas sem ferro apresenta sobreposio de geraes, castas diferenciadas, impossibilidade de a rainha formar e manter o ninho solitariamente, por no possuir estruturas que possibilitem a coleta de plen ou nctar. A colnia perene, com estrutura arquitetnica especfica para cada espcie (Michener, 1974; Sakagami, 1982). Arquitetonicamente, a colnia dividida em trs reas: o ninho, onde os ovos so depositados nas clulas de cria; a regio dos potes de alimento, onde so armazenados os nutrientes necessrios para toda a colnia; e o tubo de sada, que proporciona acesso ao exterior da colnia e bloqueia a entrada de luz. O interior da colnia
completamente escuro, condio garantida pela existncia de placas de vedao, constitudas por batume, mistura de ceras, resina e materiais coletados no meio ambiente (Michener, 2000). Na colnia encontram-se rainha e operrias, sendo que machos esto presentes apenas nos momentos que precedem o voo nupcial. Na grande maioria das espcies de Meliponini, h somente uma rainha fisogstrica na colnia (Cepeda, 2006), que permanece no ninho aps a cpula. Ela bastante longeva e as novas rainhas que nascem fundam novas colnias. As operrias diferenciam-se em grupos, de acordo com sua idade, sendo as mais jovens, nutrizes; aquelas de idade intermediria, construtoras, e as mais velhas, forrageiras. Sua atividade organiza-se segundo uma diviso de trabalho e tarefas especficas so desempenhadas por indivduos especializados. Ao longo de sua vida, uma operria passa por todas elas, configurando-se uma situao de polietismo etrio (Robinson, 1992).
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Gonalves & Marques: Ritmos de abelhas sem ferro

diferente de 24 horas, os mesmos autores demonstraram que o ciclo ambiental de dia/noite ajustava o perodo para 24 horas exatas, num processo conhecido como arrastamento. Alm da endogenicidade e da possibilidade de arrastamento, a terceira propriedade dos ritmos endgenos a compensao do perodo (t) a variaes de temperatura tambm foi descrita no mesmo trabalho. A compensao de a variaes da temperatura ambiente uma caracterstica dos ritmos biolgicos que impede atrasos e adiantamentos de fase do ritmo provocados por diminuies e aumentos da temperatura ao longo do dia. Esta propriedade importante para qualquer espcie, particularmente para animais ectotrmicos como as abelhas. Sua sobrevivncia depende de visitas regulares e frequentes ao meio ambiente, quando ocorre o forrageamento. Eventuais aceleraes ou retardamentos das oscilaes circadianas provocariam uma perda da preciso do momento de sada das forrageiras e da memria temporal. A primeira demonstrao da compensao de t a variaes de temperatura em himenpteros foi feita em A. mellifera. O ritmo de atividade de forrageiras foi registrado em condies constantes inicialmente sob 20C e depois de vrios dias sob 30C. Comparaes dos registros nas duas temperaturas mostraram apenas variaes no significativas no perodo do ritmo endgeno (Moore e Rankin, 1985). Estes resultados permitiram explicar como o forrageamento ocorre sempre com a mesma regularidade, seja qual for a temperatura ambiental. A gerao dos ritmos de abelhas est a cargo de osciladores localizados em diversos rgos e sistemas. Tal como acontece em outros insetos, os osciladores centrais, que coordenam a ao dos demais, ficam localizados no sistema nervoso central, especialmente na regio protocerebral (Saunders, 2002). A gerao de um ritmo, em todas as espcies j estudadas, depende de mecanismos moleculares baseados em alas interligadas de retroalimentao negativa. Abelhas no so exceo. Alguns dos principais genes integrantes das alas j esto bem descritos para A. mellifera, tais como: period, timeless, cycle, Clock e cryptochrome (Bloch e col., 2001). Surpreendentemente foi demonstrado que alguns destes genes no so homlogos verdadeiros aos genes de relgio de Drosophila melanogaster, mas ortlogos a genes de camundongos (Rubin e col., 2006).
interessante salientar que ao polietismo corresponde uma distribuio espacial centrfuga das operrias no interior da colnia (Bourke e Franks, 1995). Segundo esta dinmica, as nutrizes permanecem na regio mais interna do ninho e, medida que envelhecem, passam a exercer tarefas cada vez mais prximas periferia e ao tubo de sada. Ao contrrio do que ocorre em Apis mellifera, a clula de cria dos meliponneos usada apenas uma vez (Sakagami, 1982). As nutrizes so responsveis pela construo das clulas, que recebero os ovos colocados pela rainha. O processo obedece a uma sequncia bastante rgida, que consiste na construo da clula, seguida pela deposio de alimento, depois a oviposio pela rainha e, finalmente, pelo fechamento da clula pelas operrias. A cadeia de eventos denominada Processo de construo, aprovisionamento e oviposio, abreviadamente POP (do ingls Provisioning and Oviposition Process) e envolve complexas interaes da rainha com as nutrizes e destas entre si (Sakagami, 1982). As construtoras so as operrias responsveis por tarefas diversificadas como a limpeza do ninho, reparos no invlucro da colnia, construo dos potes de alimento e outras. medida que se tornam mais velhas, passam a guardar a entrada do ninho, quando realizam voos curtos no meio externo. Quando chegam fase madura, saem da colnia em voos mais longos, tornando-se forrageiras (Wille, 1983).
Ritmos biolgicos e abelhas

O primeiro ritmo detectado em abelhas foi a memria temporal, descrita por Forel em 1900 (apud Saunders, 2002). Este ritmo o mecanismo que permite s abelhas melferas, Apini, retornar ao recurso alimentar sempre mesma hora do dia, ou seja, no momento em que a fonte propicia o alimento com as propriedades mais importantes para a colnia, como a composio e concentrao de acares. A memria temporal depende da existncia de um relgio biolgico e a evidncia de sua existncia foi a demonstrao de que as forrageiras continuavam a retornar fonte de alimento, sempre na mesma hora, mesmo quando o alimento j no estava mais disponvel (Forel 1900, apud Saunders, 2002). A experincia foi repetida em uma mina de sal a 180m de profundidade, portanto sem a presena do ciclo claro/escuro. Ainda assim, as abelhas voltavam pontualmente ao local onde o alimento havia sido disponibilizado no incio do experimento (Wahl, 1932, apud Saunders, 2002). A memria temporal, observada nas forrageiras, gerada pelo sistema circadiano, que igualmente responsvel pelo ritmo de atividade da espcie. Este ritmo foi estudado em indivduos isolados, mantidos em condies ambientais constantes (livre curso), situao esta essencial para a demonstrao de um eventual carter endgeno do ritmo. A endogenicidade do ritmo locomotor de forrageiras de A. mellifera foi comprovada por Moore e Rankin (1985). Como o ritmo endgeno tem sempre um perodo
Ritmos em meliponneos
As particularidades da estrutura da colnia e do comportamento das abelhas sem ferro, especialmente a existncia do POP, fazem com que o padro rtmico que exibem seja muito diferente daquele das abelhas melferas. Tal como aconteceu na pesquisa com A. mellifera, tambm nos Meliponini, o ritmo mais estudado e melhor descrito o ritmo de atividade das forrageiras. Sua origem endgena j foi demonstrada em Scaptotrigona aff depilis (Figura 1) (Bellusci & Marques, 2001), Frieseomelitta varia e F. duoderleini (Bellusci, 2003; Oda e col., 2007). Todas as espcies estudadas at o momento so diurnas e essa diurnalidade avaliada pela atividade das forrageiras,
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Figura 1. Ritmo circadiano de atividade de voo de forrageiras de Scaptotrigona aff. depilis, claro constante (Bellusci & Marques, 2001).
que acontece durante a fase de claro, na maioria das espcies (Marques e Yamashita, 2008). Registros de comportamentos e de atividade locomotora no interior da colnia mostram uma situao muito diferente daquela encontrada em A. mellifera. Na regio do ninho, onde ocorre o POP, a atividade parece ininterrupta, na maioria das espcies. A atividade, em situaes como esta, frequentemente considerada arrtmica (Moore e col., 1998). No caso de meliponneos, ficou demonstrado que se trata de uma condio em que o padro final observado resultante da expresso de diversos componentes rtmicos, de que fazem parte intrincados ritmos comportamentais de interaes rainha/nutrizes, o ritmo de oviposio da rainha e de atividade das operrias. Uma aproximao para a anlise destes componentes foi feita atravs de medidas do consumo de oxignio de operrias de diferentes idades, mantidas isoladas umas das outras e em condies ambientais constantes. A respirometria mostrou a existncia de componentes ultradianos ritmos de alta frequncia, cujo perodo vai de segundos at 20 horas e de um componente circadiano, em S. depilis (Gianinni, 1998) e em Melipona quadrifasciata (Teixeira e col., 2011). Apesar de os dois componentes coexistirem em todos os grupos etrios de operrias, sua fora de expresso modifica-se ao longo da ontognese. Nas nutrizes, o ultradiano muito mais significativo que o circadiano e a situao fica invertida nas forrageiras (Teixeira e col., 2011).
Figura 2. Ritmo ultradiano de construo das clulas da cria por operrias e de oviposio pela rainha de Melipona quadrifasciata (Teixeira, 2006)
Ao do mascaramento
Qualquer ritmo biolgico pode ter sua expresso instantaneamente modificada por um evento ambiental, cclico ou no, bitico ou abitico. A esta modificao d-se o nome de mascaramento e ela no registrada pelo sistema circadiano, desaparecendo assim que o evento ambiental se extingue. O mascaramento altera a expresso final do ritmo, mas sua ao no chega ao oscilador, por isso seu efeito instantneo e pode ser negativo, quando diminui ou suprime a expresso do ritmo, ou positivo, quando incrementa sua amplitude. (Aschoff, 1960). Um exemplo de mascaramento aquele que acontece no interior da colnia de M. quadrifasciata. Mesmo sendo de baixa amplitude, um componente circadiano est
presente no ritmo respiratrio de nutrizes jovens (Teixeira e col., 2011). No entanto, no se detecta uma expresso circadiana na atividade de nutrizes e da rainha na regio do ninho (Teixeira, 2006). Muito possivelmente o componente circadiano est mascarado pelas tarefas ligadas ao POP. O perodo em que o POP se completa (Figura 2), na grande maioria das espcies de meliponneos, ultradiano (Zucchi e col., 1999). Como a postura dos ovos da rainha faz parte do POP, bastante provvel que o agente principal do mascaramento seja o ciclo de oviposio da rainha (Oda e col., 2007). Entretanto, preciso salientar que, em colnias de abelhas melferas, o mascaramento do ritmo circadiano de nutrizes tambm acontece. Nestas abelhas, foi igualmente detectado um componente circadiano que, no entanto, no tem expresso aparente. No caso de Apis, o mascaramento do ritmo foi atribudo interferncia da cria (ainda no interior das clulas do favo) (Shemesh e col., 2007). O oposto deve acontecer com as forrageiras de M. quadrifasciata, quanto ao componente ultradiano presente no ritmo de consumo de oxignio. Seu mascaramento pelo componente circadiano deve ser devido prpria atividade de forrageamento. Nesta atividade, os episdios de coleta ocorrem em momentos bem determinados do dia; no caso da maioria das espcies de meliponneos, durante a fotofase. O ritmo encontra-se, ento, no estado arrastado e o zeitgeber o ciclo claro/escuro. Sabe-se que o ciclo dia/noite um poderoso agente arrastador (Pittendrigh, 1981) e que arrastamento e mascaramento atuam simultaneamente em um processo de ajuste fino dos ritmos do indivduo s condies cclicas do ambiente (Aschoff, 1988). Assim, no caso das forrageiras, o componente ultradiano perde relevncia diante do circadiano.
Ritmos de um superorganismo
O estabelecimento da colnia de uma espcie social implica organizao e cooperao entre os indivduos componentes. No entanto, o tipo de organizao final determinado pelo tamanho do grupo (Camazine e col., 2001).
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Gonalves & Marques: Ritmos de abelhas sem ferro

No organismo metazorio, a maioria das funes e processos acontece segundo padres rtmicos bem definidos. Cada um deles exibe frequncia prpria de batimento, sendo alguns de frequncia bastante rpida (ultradianos), como aquela de disparos de neurnios ou de batimento cardaco; outros ocorrem uma vez ao dia (circadianos) e, finalmente aqueles que se repetem uma vez a cada vrios dias (infradianos), como processos ligados aos ciclos estrais. Os diferentes ritmos presentes no organismo so mutuamente interdependentes e sincronizados entre si. Esta sincronizao baseada no estabelecimento de relaes de fase estveis entre os diversos ritmos, cuja consequncia um estado de equilbrio dinmico, descrito como ordem temporal interna (Moore-Ede & Sulzman, 1981). A sincronizao mtua dos ritmos no implica a coincidncia de suas respectivas fases. De fato, uma anlise da expresso de diversos ritmos ao longo de um dia mostra que na mesma fase em que se verifica a ocorrncia de picos determinadas funes, outras funes apresentam sua menor amplitude de expresso (Moore-Ede & Sulzman, 1981).
A sobrevivncia de um grupo social pequeno depende do desempenho individual de seus membros, mas, para grupos numerosos, como aquele das savas e das abelhas melferas e sem ferro, o nmero de indivduos envolvidos em uma tarefa mais importante que o desempenho de cada um deles (Wilson e Hlldobler, 2005). A verificao da total impossibilidade de sobrevivncia de um indivduo separado do grupo social levou Wheeler (1928) a propor o conceito de superorganismo, que postula uma analogia de uma colnia de indivduos sociais com o organismo metazorio. A proposta foi bastante combatida por ser considerada simplista demais, com base no argumento de que as clulas somticas do corpo de um metazorio so todas geneticamente idnticas, mas os indivduos de uma colnia de insetos no so. A partir de anlises detalhadas do comportamento e da fisiologia de indivduos e da organizao intracolonial, Moritz & Southwick (1992) reafirmaram a adequao do conceito e ampliaram o conjunto de elementos para defini-lo. A proposta foi aceita por Wilson (2000), que expandiu as possibilidades, sugerindo no mais paralelos entre estruturas anatmicas, mas analogias entre castas e suas funes com as propriedades fisiolgicas de um organismo. Assim, castas ligadas reproduo seriam anlogas s gnadas e as operrias aos tecidos somticos; a transferncia de alimento atravs da trofalaxis, s funes do sistema circulatrio, etc. A ao conjunta dos indivduos melhora as possibilidades de defesa da colnia. Tambm a manuteno da temperatura, dentro de uma faixa adequada para a espcie, no interior do ninho atingida pela atividade sincrnica de operrias que geram ou dispersam o calor por contrao e relaxamento da musculatura do voo (Moritz & Southwick, 1992). Estes so exemplos, mas a dinmica da colnia como um todo possibilitada pela estrutura do superorganismo. As propriedades descritas acima podem ser identificadas na colnia de meliponneos. Alm delas, a interao dos indivduos tem consequncias diretas na expresso de seus padres rtmicos. Em experimentos com respirometria de M. quadrifasciata, foram empregadas nutrizes, cuja emergncia aconteceu em estufa, fora da colnia. Metade dos indivduos foi reintroduzida na colnia e a outra metade, no. O ritmo circadiano de consumo de oxignio detectado nos indivduos devolvidos colnia tinha expresso mais robusta do que naqueles que no tinham tido contato com outros indivduos (Teixeira e col., 2011). Robinson e col. (2008) demonstraram que as informaes do grupo social nos insetos exercem efeitos globais sobre a expresso gnica no crebro, que eventualmente ativam genes particulares dos circuitos neurais. Esta pode ser a explicao para o surgimento de um ritmo circadiano nos indivduos que retornaram colnia, mas no naqueles que foram testados diretamente aps o nascimento, reforando a adequao do uso do conceito de superorganismo para descrever a situao de uma colnia de meliponneos.
A ordem temporal interna de um super-organismo

O conceito de ordem temporal interna pode ser transposto diretamente para um superorganismo. A ordem temporal interna de uma colnia de abelhas sem ferro envolve ritmos de diferentes frequncias: ultradianos (ex. ritmos ligados ao POP), circadianos (ex. ritmos de coleta de plen e de remoo de lixo da colnia), alm de componentes sazonais (ex. acasalamento, diapausa). Aparentemente, o padro altamente repetitivo da sequncia de tarefas desempenhadas pelas operrias e pela rainha um componente essencial da organizao temporal da colnia. Interferncias com qualquer uma das sequncias provocam alteraes at de funes que no esto diretamente relacionadas com aquela que foi modificada (Bellusci, 2003). Entretanto, a colnia, como um todo, quando colocada em condies ambientais constantes tem sua expresso rtmica mantida, exibindo perodo circadiano. Nesta situao, a ordem temporal interna preservada, mesmo com modificaes dos diferentes perodos componentes. Percebe-se, ento, que as relaes de fase entre eles so restabelecidas em outro patamar, mas o arranjo geral mantido. Nos casos em que ocorre uma perturbao interna da colnia, em que a sequncia de etapas rompida ou alterada, surgem modificaes comportamentais. Experimentos em que se provocava um atraso na construo de novas clulas da cria causaram, inicialmente, uma desorganizao do POP e depois alteraes gerais do comportamento, inclusive de operrias construtoras que no participam do POP (Giannini, 1998; Bellusci, 2003). Estas alteraes comeam quase que imediatamente aps as intervenes e podem levar morte da colnia.
O conceito de ordem temporal interna
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Revista da Biologia (2012) 9(3) Concluso

A expresso rtmica de uma colnia de insetos eussociais representa uma situao bastante nica e interessante para a cronobiologia. Se numa primeira aproximao, a colnia pode ser considerada uma populao, em outra perspectiva, ela se mostra altamente organizada e fundamentalmente dependente da interao de seus integrantes, comportando-se com um nico indivduo. O estabelecimento de uma ordem temporal interna mostra-se um componente essencial para a sobrevivncia da colnia. Para chegar a este estabelecimento, a plasticidade dos ritmos e a possibilidade de modulao de sua expresso pela prpria interao dos indivduos representam uma situao bastante peculiar do conceito de ordem temporal interna.
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Agradecimentos
Agradecemos a colaborao de Cintia E. Yamashita e de Jssica M. Camargo, pelas sugestes e discusses muito produtivas.
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DOI: 10.7594/revbio.09.03.11
Ensaio
O valor biolgico do perodo circadiano

The biological value of the circadian period
Bruno Jacson Martynhak1, Flvio Augustino Back2, Fernando Louzada2
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Departamento de Farmacologia, Universidade Federal do Paran Departamento de Fisiologia, Universidade Federal do Paran
Contato do autor: brunojm@ymail.com
Resumo. Protocolos experimentais que visam mensurar o perodo do ritmo circadiano em seres humanos e outras espcies envolvem condies artificiais dos esquemas de iluminao. Desta forma, uma vez que condies ambientais constantes no existem naturalmente, questionamos o significado de se medir o perodo circadiano. O fato de essa medida ser avaliada de forma descontextualizada socialmente leva a uma compreenso mais esttica dos processos biolgicos. Finalmente, a viso tradicional do perodo circadiano contrastada neste ensaio com a sua possvel relao com o estado atual do sistema de temporizao. Palavras-chave. Perodo circadiano endgeno, plasticidade, tau. Abstract. Experimental protocols that aim to measure the circadian period in humans and other species usually imply the use of artificial, constant conditions of illumination. Since these conditions do not occur naturally, we argue the meaning of measuring the circadian period. Its determination in a situation out of the social context may lead to a more static understanding of biological processes. Finally, the traditional view of the intrinsic circadian period is contrasted in this essay with its possible relation with the current status of the temporization system. Keywords. Circadian period, plasticity, tau.
Definindo um conceito cronobiolgico: perodo endgeno

O perodo circadiano (tau - t) tem sido definido como a durao do ciclo de um ritmo circadiano quando o organismo encontra-se isolado de pistas ambientais temporais, ou seja, quando se encontra em condies de livre-curso. A expresso de um ritmo de 24h ocorre atravs do processo de sincronizao. Em 1729, o astrnomo francs De Mairan apresentou o primeiro relato cientfico da ritmicidade endgena. De Mairan observou que o movimento de abrir e fechar das folhas sensitivas de Mimosa continuava a apresentar um ritmo prximo de 24h mesmo em condies de escuro constante (De Mairan, 1729). A existncia de outros fatores que poderiam estar fornecendo pistas ambientais cclicas, mesmo em escuro constante, colocou em questo se de fato o ritmo era endgeno ou gerado pela oscilao de outras variveis ambientais, como por exemplo, o geomagnetismo. O debate sobre o fato de a ritmicidade ser ou no endgena se prolongou por dcadas, at os estudos de Hamner e colaboradores (1962) no plo sul. Estes pesquisadores estudaram diferentes organismos em condies de iluminao constante, mantidos sobre aparatos que giravam em sentido oposto ao da rotao da Terra. Um padro rtmico tanto da atividade locomotora de hamsters,
da ecloso dos ovos de Drosophila, quanto da conidiao do fungo Neurospora persistiram nestas condies. Os resultados obtidos nestes experimentos tornaram-se um marco para a aceitao do carter endgeno da ritmicidade biolgica pelo cronobiologistas. O estudo da endogenicidade no plano molecular tambm passou a ser alvo de investigaes. A primeira relao entre genes e o perodo circadiano foi proposta por Konopka e Benzer (1971) em Drosophila. Os pesquisadores observaram que algumas moscas mutantes apresentavam alteraes no ritmo de ecloso dos ovos. O ritmo endgeno dos mutantes poderia ser muito curto, muito longo ou poderia no haver ritmo. O gene responsvel por essa alterao de perodo recebeu o nome de Period. Ralph e Menaker (1998) descreveram uma mutao associada drstica reduo do perodo circadiano em hamsters da Sria. Enquanto os hamsters selvagens apresentavam o tau prximo de 24h, os mutantes heterozigotos expressavam um tau de 22h e os homozigotos de apenas 20h. O padro de herana desta mutao levou os autores concluso de que se tratava de uma mutao em um nico gene. Devido ao fentipo expresso pelos animais, ela ficou conhecida como mutao tau (t). Alm disso, os animais homozigotos para a mutao apresentavam dificuldades de sincronizao a um ciclo claro/escuro de 24h, e alguns indivduos at mesmo no eram capazes de se sincroni-

zarem. Atualmente vrias mutaes dos chamados genes relgio ou relacionadas ao sistema de temporizao so associadas alterao do tau em roedores. Por exemplo, se contrapondo ao efeito da mutao tau, a mutao after hour, no gene Fbxl3 em camundongos, aumenta o perodo circadiano endgeno para aproximadamente 27h (Godinho et al., 2007).
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A construo do conceito do perodo circadiano em humanos

Os primeiros estudos de isolamento temporal em humanos foram conduzidos em cavernas, onde a temperatura ambiental constante e os sujeitos podem ser isolados do ambiente externo. Nathaniel Kleitman e Bruce Richardson permaneceram 32 dias isolados em uma caverna em Kentucky, Estados Unidos (Kleitman, 1939). Durante os 32 dias foram avaliados os ritmos de atividade, de temperatura corporal e de sonolncia. O perodo do ritmo de atividade de ambos passou das 24h habituais para 28h. Em 1962, o pesquisador francs Michel Siffre, ento com 23 anos, permaneceu dois meses no subsolo de uma cordilheira na Frana. Em seu terceiro experimento de isolamento temporal, em 2000, j com 61 anos de idade, Siffre permaneceu por 73 dias no subsolo. Nestes experimentos, o perodo circadiano foi estimado como sendo maior que 25h. Entretanto, medidas do perodo do ritmo endgeno de atividade em humanos mostram uma grande variao, de 13 a 65h (Wever, 1979). Para estes valores, diferentes metodologias foram utilizadas, como condies constantes iluminao e o controle do voluntrio de acender e apagar as luzes. O perodo endgeno tambm j foi medido em indivduos cegos, quando foi detectada a durao de 25h (Sack et al., 2000). Atualmente, o mtodo que vem sendo mais utilizado para se avaliar o perodo circadiano endgeno humano o protocolo da dessincronizao forada. Neste mtodo, os indivduos so expostos artificialmente a ciclos claro/ escuro de 20 ou 28h. Este ciclo muito diferente das 24h est alm de nossa capacidade de sincronizao. Com isto, ocorre um desacoplamento dos ritmos de atividade, de temperatura interna e de melatonina, que entram em livre curso, possibilitando assim a medida de tau.
Valor biolgico do perodo endgeno

Em condies naturais, o ambiente ocupado pela imensa maioria dos organismos cclico e os ciclos naturais sincronizam os ritmos biolgicos. Para os mamferos, o ciclo claro/escuro natural, dia/noite, parece ser o mais importante sincronizador. A criao de mtodos e protocolos para se avaliar a representao do sistema de temporizao, o tempo interno, em um ambiente laboratorial artificial que permitiu a criao do construto terico perodo endgeno. Esta forma de mensurao nos faz refletir at que ponto o significado deste conceito, atrelado a sua discutvel forma de mensurao, aplica-se compreenso de processos vivos.
Entretanto, apesar deste questionamento, o conceito vigente do perodo endgeno tem demonstrado relaes com outros processos biolgicos. Por exemplo, a maior proximidade do tau com relao ao ciclo ambiental exposto favorece a sobrevivncia em cianobactrias do gnero Synechococcus (Ouyang et al., 1998). De forma similar, a maior proximidade do tau com 24h se relaciona com maior expectativa de vida, tanto em roedores como em primatas no humanos (Wyse et al., 2010). J em humanos, a durao do perodo endgeno tem sido relacionada com a capacidade de sincronizao a um ciclo artificial diferente de 24h em exposio a sincronizadores fracos (Wright et al., 2001). Voluntrios submetidos a um ciclo claro/escuro uma hora maior que seu perodo endgeno no eram capazes de se sincronizar quando a intensidade luminosa da fase de claro era 25 lux (Gronfier et al., 2007). Tambm, se tem encontrado uma relao entre a durao do perodo endgeno e a preferncia por horrios de sono. Indivduos que apresentam perodo circadiano mais curto tendem a adiantar os horrios de dormir e acordar, enquanto que indivduos com perodo endgeno maior tendem a ser mais vespertinos (Duffy et al., 2001). Tambm j foi levantada a hiptese de que a diminuio do perodo endgeno pode ser responsvel pelo adiantamento de fase que ocorre no envelhecimento (Pittendrigh e Daan, 1974). O ritmo endgeno de indivduos completamente cegos foi estudado duas vezes, com um intervalo de 10 anos entre as medidas. Os autores observaram que o perodo endgeno expressso era ligeiramente maior na segunda avaliao, resultados que iria contra a hiptese inicial (Kendall et al., 2001). Entretanto, Carskadon e colaboradores (1998) avaliaram o perodo endgeno do ritmo de atividade de adolescentes e obtiveram o valor de tau maior que 24h em todos os 10 participantes do estudo. Os valores foram maiores do que os encontrados em estudos com adultos, reforando a ideia de que o perodo circadiano endgeno diminui com a idade. Entretanto, pode-se perguntar se o perodo circadiano endgeno reflete de fato um atributo fundamental de cada indivduo ou, ao invs, reflete o estado momentneo do sistema de temporizao do indivduo. Existem evidncias sugerindo a plasticidade do perodo endgeno. Por exemplo, o consumo forado de lcool reduz o perodo endgeno de camundongos C57BL/6, animais com alta preferncia por etanol (Seggio et al., 2009). Camundongos knockout para o gene Clock apresentam reduo do tau (Debruyne et al., 2006), enquanto que os mutantes Clock9 apresentam o perodo endgeno longo. Alm disso, os mutantes Clock9 possuem comportamentos similares mania, que so revertidos pelo tratamento com ltio (Roybal et al., 2006). Tanto em Drosophila como em roedores, o perodo endgeno aumenta com a administrao de ltio e diminui com a administrao de inibidores da enzima GSK3-B (Hirota et al., 2008). Em roedores, conhecido que o acesso roda de atividade promove aumento do tau, possivelmente devido atividade fsica (Mrosovsky, 1993). Em humanos, por outro lado, pelo menos da forma como foi avaliado, a prtica
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Martynhak et al.: Perodo Circadiano Endgeno

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de atividades fsicas parece no alterar o perodo circadiano (Beersma e Hiddinga, 1998; Cain et al., 2007). Ainda assim, existem evidncias da plasticidade do tau tambm em humanos. Scheer et al. (2007) observaram que o perodo do ritmo circadiano de atividade dos participantes era maior aps a sincronizao a um ciclo de 24,65h do que aps a sincronizao a um ciclo de 23,5h. Importante ressaltar que o tempo em que os sujeitos permaneciam nos ciclos diferentes de 24h era de apenas 14 dias. Assim, percebemos que mesmo um tratamento relativamente curto pode alterar a expresso circadiana. Assim, pode-se perguntar se os indivduos matutinos dormem cedo por apresentarem o tau menor em relao a outras pessoas, ou, se devido ao histrico de hbitos antecipados de sono e do padro de exposio luz natural, o tau torna-se menor. Por exemplo, existem relatos da associao entre a data de nascimento com a preferncia por horrios de sono (Natale et al., 2002; Mongrain et al., 2006), embora outros pesquisadores no tenham encontrado os mesmos resultados (Takao et al., 2009). Esta questo foi discutida por um dos autores (FAB) em sua dissertao de mestrado. Foram estudados dois grupos de trabalhadores de uma regio rural com 2000 habitantes, um que atuava em ambiente aberto e outro em ambiente fechado. Foi avaliado o padro de exposio ao ciclo claro/escuro natural e a preferncia por horrios de sono e atividade, cronotipo. O grupo de trabalhadores da lavoura demonstrou ser mais matutino do que o grupo de trabalhadores de ambiente fechado. Foi discutida a relao que os horrios e o ambiente de trabalho tm com o estabelecimento do arrastamento pelo ciclo claro/escuro e algumas das possveis implicaes (Back, 2008). Podemos concluir que o valor biolgico do perodo circadiano endgeno inegvel. Entretanto, tambm podemos concluir que condies externas ao indivduo podem alterar seu valor. Assim, quando medimos a sua durao talvez estejamos, na realidade, avaliando o resultado do histrico das situaes de claro/escuro a que o indivduo foi submetico. Ao invs do perodo endgeno ser o determinante de variveis como o cronotipo, por exemplo, talvez o prprio histrico do indivduo modifique o perodo endgeno. O mundo no assim, ele est sendo assim (Paulo Freire).
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Reviso
Gnese e ontognese do ritmo de sono/ viglia em humanos

Genesis and ontogenesis of sleep/wake rhythm in humans
Clarissa Bueno1,*, Daniela Wey2
1Departamento de Fisiologia e Biofsica, Instituto de Cincias Biomdicas, USP 2Departamento de Sade Ambiental, Faculdade de Sade Pblica, USP
*Contato do autor: cbueno@usp.br Resumo. Os organismos sofrem transformaes ao longo do tempo, seja ao longo de anos, um dia Recebido 18out10 ou algumas horas. Os ritmos biolgicos referem-se s oscilaes cclicas observadas na matria viva e Aceito 02abr12 apresentam um componente endgeno que se relaciona com o ambiente. A expresso destes ritmos Publicado 27dez12 e sua relao com o ambiente se modifica durante a vida, como ocorre com os padres de sono/viglia. Neste artigo apresentamos uma reviso sobre o desenvolvimento do ritmo de sono/viglia ao longo da vida, descrevendo o processo de consolidao de um ritmo circadiano sincronizado durante a infncia, as modificaes na fase deste ritmo na adolescncia e, posteriormente, suas mudanas de fase e amplitude na terceira idade, enfocando a interao com fatores cclicos ambientais. Palavras-chave. Ritmo; Circadiano; Ontognese; Recm-nascido; Envelhecimento.. Abstract. Living organisms undergo changes over time, which can be seen along years, one day or several hours. Biological rhythms are understood as cyclical fluctuations observed in the living matter and present an endogenous component which is influenced by the environment. The expression of these rhythms and its relation to the environment also changes along the individuals life, as we observe with sleep/wake patterns. In this article we present a review about the development of sleep/wake rhythm throughout life, describing the consolidation process of a synchronized circadian rhythm along childhood, the phase changes of sleep/wake cycle along adolescence and, afterwards, its phase and amplitude modifications in the elderly, focusing the interaction with environmental cyclical factors. Keywords. Rhythm; Circadian; Ontogenesis; Newborn; Aging. As coisas (objetos) depois de prontas vo se gastando, observado. A partir de ento, e com os estudos posteriores, envelhecem. Gente no nasce pronta e vai se gastando; foi possvel identificar a existncia de ritmos em diversas gente nasce no-pronta, e vai se fazendo variveis fisiolgicas e comportamentais, endogenamente Mario Sergio Cortella gerados e presentes de forma ubqua entre os seres vivos,
Introduo
Os seres vivos devem ser compreendidos como organismos dinmicos, em constante transformao, a qual pode ser observada tanto em escalas temporais longas, como o processo de amadurecimento e envelhecimento, como em oscilaes peridicas em escalas temporais menores, como os processos de contrao e relaxamento muscular envolvidos no ciclo dos batimentos cardacos. Modificaes nos organismos vivos em escalas temporais menores, por exemplo, ao longo de 24 horas e de forma rtmica, foram inicialmente atribudas atuao direta do ambiente, como agente causador. Esta concepo comeou a mudar a partir dos estudos de De Mairan, no sculo XVIII, demonstrando a persistncia dos movimentos das folhas da planta Mimosa pudica mesmo em situao de isolamento ambiental (apud Moore-Ede et al, 1982), o que sugeria a existncia de um mecanismo endgeno gerador do ritmo
os assim chamados ritmos biolgicos. O padro rtmico gerado endogenamente sensvel a diferentes fatores ambientais, que podem atuar sobre a expresso dos ritmos biolgicos, sincronizando-os atravs de mecanismos de arrastamento e/ou de mascaramento. No arrastamento, pistas ambientais cclicas, tambm denominadas zeitgebers, atuam sobre o sistema de temporizao, promovendo ajustes no perodo e/ou na fase dos ritmos endgenos (Aschoff, 1954 apud Rotenberg et al, 2003). Amplo trabalho tem sido feito no intuito de desvendar os mecanismos endgenos responsveis pela gerao dos ritmos biolgicos. Em mamferos, o sistema temporizador circadiano inclui os ncleos supraquiasmticos (NSQs) no hipotlamo e recebe aferncias da retina por meio do trato retino-hipotalmico, as quais mediam sua sincronizao ao ciclo claro/escuro ambiental (Moore et al, 1972, Moore-Ede et al, 1982). Entretanto, a idade a partir da qual as vias que trazem informaes fticas para
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os NSQs esto mielinizadas e maduras o suficiente para permitir que o ciclo claro/escuro torne-se um importante zeitgeber, ainda no est esclarecido. Este um dos vrios pontos ainda a serem investigados no estudo sobre a ontognese dos ritmos biolgicos. A presente reviso tem por objetivo abordar o desenvolvimento dos ritmos biolgicos, particularmente do ritmo de sono/viglia, no lactente e na adolescncia e as modificaes observadas na expresso do mesmo ao longo do processo de envelhecimento, enfocando a terceira idade.
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Como a expresso dos ritmos biolgicos nasce e cresce.

Estudos em primatas mostram que a neurognese nos NSQs ocorre entre 27 e 48 dias de gestao e estudos funcionais identificaram que os NSQs exibem oscilaes na sua atividade metablica j no final da gestao e sua capacidade de resposta ao ciclo claro/escuro pode ser demonstrada em primatas logo aps o nascimento, mesmo com baixa intensidade de luz (Rivkees, 2004). Durante a vida intra-uterina, o sistema de temporizao fetal seria amplamente dirigido pela me, por meio de sinais rtmicos (nutrientes, melatonina e outros hormnios) que ultrapassariam a barreira placentria e seriam responsveis pela sincronizao do sistema de temporizao fetal ao relgio materno e, consequentemente, aos ciclos do meio externo (Rivkees et al, 2000). O desenvolvimento do sistema de temporizao de ratos tem sido o mais bem estudado at o momento. Neles foi demonstrado que influncias ambientais podem interferir na organizao das estruturas do sistema de temporizao durante seu desenvolvimento e, consequentemente, na posterior manifestao da ritmicidade circadiana no animal adulto. Cambras et al (1998) demonstraram que ratos mantidos em condies de claro constante durante a lactao desenvolvem um ritmo circadiano estvel ao longo dos primeiros dias de vida. Este ritmo persiste na vida adulta, mesmo quando os indivduos so submetidos luz constante, sob uma intensidade luminosa que habitualmente provoca arritmicidade na espcie (Canal-Corretger et al, 2001). Em seres humanos, o estudo da ontognese dos ritmos biolgicos e o papel de sincronizadores fticos e no-fticos tambm tm sido objeto de estudo h vrias dcadas. Desde os estudos iniciais, parece evidente que o funcionamento do sistema endgeno de temporizao modifica-se ao longo da vida, levando a mudanas no padro de expresso rtmica e na sua interao com o ambiente. O estudo da ritmicidade biolgica em lactentes tem como marco o trabalho clssico de Kleitman e Englemann em 1953, o qual demonstrou assimetria entre o dia e a noite, a partir da 3a semana de vida, no comportamento de sono de um grupo composto por 19 crianas, o qual se tornou mais evidente a partir do segundo ms de vida. Em 1961, Parmelee descreveu o comportamento de sono/viglia de uma criana desde o nascimento at 35 semanas de
vida, identificando a emergncia de um padro de cerca de 24 horas (circadiano) a partir da 6a semana e sua consolidao aps a 12a semana. Posteriormente, Hellbrgge (1960) estudando diferentes parmetros (temperatura corporal, resistncia eltrica da pele, diurese e comportamento de sono/viglia) em crianas de diversas idades definiu a progresso da ritmicidade do ciclo viglia/ sono (CVS) como uma transio de um padro polifsico (composto por mltiplas frequncias ultradianas aquelas com perodo inferior a 20 horas) para um padro monofsico (com predomnio do ritmo circadiano). J nesta ocasio foi descrita a consolidao de um padro circadiano no ritmo de temperatura (medida na pele sobre a regio abdominal) mais precocemente que o observado para o CVS. Estudos posteriores, utilizando novas metodologias de anlise, evidenciaram um CVS composto por mltiplas frequncias ultradianas de baixa amplitude, que se reduziram com o avano da idade, sendo progressivamente substitudas por um ritmo circadiano, o qual se instala de forma no linear (com momentos de progresso e regresso) e com ampla variabilidade individual (Menna-Barreto et al, 1993, Menna-Barreto et al, 1996). Mais recentemente, o desenvolvimento de novos equipamentos de coleta, como detectores de movimento (actmetros) e termstores (Areas et al, 2006) utilizados para medir a temperatura do punho passaram a oferecer a possibilidade de monitorao contnua, facilitando a realizao de estudos longitudinais. Famlias monitoradas durante o final da gestao e aps o nascimento exibem episdios de atividade noturna no comportamento materno durante a gestao, com o surgimento de frequncias ultradianas na sua atividade/repouso e, aps o nascimento, foi identificada alta concordncia no espectro de frequncias ultradianas e circadiana entre a me e o beb (Wullf et al, 2000 e 2001). Torna-se, assim, cada vez mais evidente a atuao de fatores de sincronizao social em humanos alm do j bem conhecido papel do ciclo claro/escuro ambiental no arrastamento dos ritmos biolgicos. Outra contribuio para o estudo de fatores no fticos na sincronizao dos ritmos endgenos vem do estudo de recm-nascidos pr-termo mantidos em unidades de cuidado neonatal (Glotzbach et al, 1995), nos quais se observa a presena de ritmos de frequncia ultradiana associados rotina hospitalar. Shimada et al (1993) sugerem que o aparente atraso na expresso ps-natal de um ritmo circadiano do CVS em prematuros seria devido ao fato de permanecerem mais tempo em berrios, sob ciclos de iluminao e temperatura muito atenuados e longe da influncia social. Pesquisas realizadas no nosso laboratrio monitorando o padro de atividade, alimentao, CVS e temperatura em recm-nascidos pr-termo identificam a presena de um ritmo circadiano precoce no ciclo de temperatura, enquanto o CVS permanece com um padro ultradiano durante a internao hospitalar, claramente vinculado ao horrio pr-determinado de alimentao (Bueno et al, 2001). Poucos estudos avaliaram concomitantemente as mudanas do padro de ingesto alimentar e do ritmo de
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fatores ambientais para a dificuldade de adaptao do adolescente e para este atraso de fase. O atraso de fase na adolescncia poderia ser potencializado pelo estilo de vida moderno, com a presena de luz eltrica e seus derivados (televiso, computador, Internet), bem como os atuais hbitos sociais, que criam um ambiente propcio para o prolongamento da atividade humana durante a fase noturna (Louzada et al, 2003). Neste contexto interessante observar o comportamento de adolescentes em comunidades com organizao social distinta, como locais isolados, sem energia eltrica. Entretanto, estudos realizados nestas condies tm mostrado resultados conflitantes, sendo possvel identificar atraso de fase em adolescentes de aldeias indgenas, mas no em comunidades caiaras no Estado de So Paulo ou outras comunidades sem energia eltrica (Torres, 2005; Peixoto, 2009). Assim, possvel que outros fatores sociais alm da questo da iluminao noturna interajam para a expresso final do padro dos ritmos biolgicos.
atividade/ repouso em recm-nascidos, identificando ritmo circadiano no CVS em vrios bebs de termo j no primeiro ms de vida. Por outro lado, o comportamento alimentar apresenta apenas componentes ultradianos, com perodos entre 2 e 4 horas, sugerindo um desenvolvimento independente da ritmicidade do CVS e do comportamento alimentar (Lohr et al, 1999). Embora encontremos diferentes padres de desenvolvimento da expresso rtmica de acordo com a varivel estudada, bem como a presena de importantes diferenas individuais, ao final do primeiro ano de vida, todas as crianas apresentam predomnio do ritmo de 24 horas, com um padro de sono semelhante ao do adulto (Parmelee, 1961, Menna-Barreto, 1996). Durante a infncia ocorre uma progressiva reduo do tempo total de sono, o qual passa a se concentrar na fase noturna, com um a dois cochilos durante o dia inicialmente, havendo, para muitos, desaparecimento destes cochilos a partir da idade pr-escolar.
Adolescentes: ritmos rebeldes?

Novas modificaes ocorrem a partir da adolescncia, quando observamos tendncia a um atraso na fase dos ritmos biolgicos. Durante a infncia os seres humanos apresentam um comportamento mais matutino; assim observamos que crianas habitualmente acordam mais cedo que adolescentes. A partir da adolescncia ocorre atraso de uma a duas horas no momento de incio e de final do sono, acompanhado por um atraso no ritmo de temperatura e no surto noturno de melatonina (Carskadon et al, 1998). Este fenmeno, denominado atraso de fase da adolescncia, atinge um pico por volta dos 16 anos para as mulheres e dos 21 anos para homens, sendo proposto por Roenneberg et al (2004) que este poderia configurar um marcador do final da adolescncia. Os horrios escolares geralmente atuam para as crianas como um forte sincronizador do CVS e tornam semelhantes os horrios de acordar nos dias letivos (Louzada et al, 1996). Na maioria das escolas pblicas brasileiras os alunos entre seis e nove anos de idade, que frequentam o ensino fundamental, assistem s aulas no turno da tarde. Aps o sexto ano (ou quinta srie) as aulas passam a acontecer no turno da manh. A rotina escolar estabelecida sem que se considere a tendncia ao atraso de fase dos ritmos biolgicos observada para a maioria dos adolescentes (Crowley et al, 2007, Mello et al, 2001, Thorpy et al, 1988). Como resultado desse conflito entre o tempo escolar e o tempo biolgico, ocorre uma reduo na durao de sono, aumento na sonolncia diurna, comprometimento do desempenho escolar, maior incidncia de uso de substncias estimulantes e de substncias alcolicas e um aumento na percepo de cansao crnico (Carskadon, 1991; Fischer et al, 2003 e 2008; Andrade e Menna-Barreto, 1996). Tais sintomas limitam as perspectivas do adolescente quanto ao seu desenvolvimento intelectual, geram discrdia no ambiente familiar e a excluso deste aluno no ambiente escolar. Tambm investigamos a contribuio de outros
No final da vida nos deparamos com os mesmos desafios da infncia?

Enquanto na adolescncia podemos verificar um conflito entre os horrios sociais e a expresso dos ritmos biolgicos, quando envelhecemos os desafios temporais so outros. Sinais temporais que so importantes na juventude, como o horrio da escola ou da faculdade, perdem seu significado. No idoso, ocorre uma diminuio da funcionalidade do sistema temporal. A capacidade de sincronizao a determinados estmulos cclicos ambientais perdida (para uma ampla reviso veja Gibson et al, 2009; Pandi-Perumal et al, 2002; Weinert, 2000). Com o envelhecimento, a vinculao com grupos sociais e a resposta aos ciclos ambientais tornam-se mais dbeis (Samis Jr., 1968; Van Gool e Mirmiran, 1986). Van Reeth e colaboradores (1992) observaram que ratos idosos respondem menos a estmulos no fticos e esse resultado pode ser decorrente de um acoplamento fraco entre o ciclo de atividade/repouso e o sistema de temporizao circadiano decorrente de um dficit nas vias serotoninrgicas, as quais medeiam os efeitos fticos e no fticos sobre os ritmos circadianos. Alm das mudanas nas aferncias, que permitem o reconhecimento dos sinais temporais, o prprio oscilador circadiano perde sua funcionalidade com o passar dos anos. O transplante de tecido do NSQ fetal para ratos idosos restaura os ritmos circadianos de temperatura central, atividade locomotora, ingesto de lquidos (Li e Satinoff, 1998) e de RNAm em clulas hipotalmicas (Cai et al, 1997). As mudanas decorrentes do envelhecimento so mais profundas em tecidos extra-NSQs e afetam tanto o processo de ressincronizao quanto a relao entre os zeitgebers internos e externos (Davidson et al, 2008). Em estudo realizado por Aujard e colaboradores (2001), verificou-se uma reduo na amplitude e maior variabilidade na taxa de disparos de neurnios isolados dos NSQs de camundongos de meia idade, sugerindo que as mudanas ontogenticas podem acontecer em clulas individuais e
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comprometer o acoplamento entre os osciladores. Em humanos tambm, a resposta a um estmulo temporal torna-se diferente, por causa de mudanas fisiolgicas e/ou anatmicas decorrentes do envelhecimento (Weinert, 2010). Como mudanas nas eferncias, que permitem a expresso dos ritmos biolgicos, decorrentes do envelhecimento temos: 1) reduo na amplitude: observada, por exemplo, na reduo da durao do sono ou repouso (Carrier et al, 1996; Ceolim et al, 1996; Huang et al, 2002). Os ritmos de 24h de atividade/repouso e do ciclo viglia/sono tornam-se amortecidos; 2) aumento na fragmentao: parecido com o que acontece no incio da vida. A desorganizao temporal interna entre os ritmos biolgicos resulta em horrios de CVS mais irregulares e fragmentados (Carskadon, et al, 1982; Huang et al, 2002); 3) adiantamento de fase dos ritmos biolgicos: de maneira geral, observa-se que os horrios de sono, o ciclo de temperatura corporal, de secreo hormonal e o ciclo de atividade/repouso passam a acontecer mais cedo nos idosos (Copinschi e Van Cauter, 1995; Czeisler et al, 1992; Renfrew, et al, 1987). O idoso acorda mais cedo pois seu sono mais superficial (leve), sobretudo no incio do dia, tornando-o mais suscetvel aos estmulos ambientais que causam o despertar precoce (Dijk et al, 2002). A dificuldade de iniciar e manter o sono noturno de forma consolidada para o idoso pode ser decorrente de uma reduo na capacidade de aquecer as extremidades e de responder a pequenos aumentos de temperatura na cama (Raymann et al, 2007; Raymann e Van Someren, 2008; Van Someren et al, 2002). Alteraes na temperatura da pele modulam a ativao neuronal de estruturas cerebrais relacionadas viglia e atuam como um terceiro sinal, alm do sinptico e humoral, para a modulao do sono noturno (Krauchi e Wirz-Justice, 1994; Van Someren, 2004). Existem diferenas individuais no processo de envelhecimento e na expresso dos ritmos biolgicos. Mulheres idosas podem apresentar amplitudes maiores. Essas diferenas podem ser explicadas pela rotina e estilo de vida de cada um. Anatomicamente o envelhecimento inevitvel, mas a prtica regular de atividades fsicas ou de atividades sociais e a adoo de hbitos de vida saudveis ajudam a preservar o bom funcionamento do sistema de temporizao circadiano e podem atenuar os efeitos indesejveis do envelhecimento no sistema de temporizao circadiano (Ceolim, 2000; Weinert, 2010).
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ritmo, associado a novos desafios temporais ambientais representados pela escola e pelos novos hbitos sociais. J na terceira idade, ocorre o fenmeno inverso, com um avano de fase no CVS e em outras variveis fisiolgicas, sendo que agora um sistema de temporizao com maior dificuldade de acoplamento interno tambm sofre o desafio de sincronizar-se a um ambiente no qual, muitas vezes, os sinais temporais sociais passam a ser menos regulares e mais escassos para o indivduo.

Redao do artigo: Clarissa Bueno e Daniela Wey.
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Consideraes finais
Procuramos descrever algumas das principais mudanas observadas na expresso dos ritmos biolgicos ao longo da vida. Assim, possvel identificar evidncias de um sistema de temporizao endgeno funcional ainda na vida intra-uterina, o qual, aps o nascimento, amadurece, permitindo a expresso de um ritmo predominantemente circadiano de sono/viglia, que ir consolidar-se e sincronizar-se ao ambiente ao longo do primeiro ano de vida. Na adolescncia, ocorre um atraso de fase neste
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Reviso Ensaio
Interao entre sincronizadores fticos e sociais: repercusses para a sade humana
Interaction between photic and social synchronizers: repercussions for human health
rico Felden Pereira*, Tmile Stella Anacleto, Fernando Mazzilli Louzada
Laboratrio de Cronobiologia Humana, UFPR
*Contato do autor: ericofelden@gmail.com Resumo. O ciclo claro/escuro considerado o mais importante zeitgeber dos ritmos de mamferos. No entanto, em humanos, o advento da luz eltrica alterou os padres de sincronizao. A exposio luz artificial durante a fase escura, especialmente em funo de situaes de trabalho e estudo noturno, viagens transmeridianas e hbitos como TV e internet, est associada dessincronizao dos ritmos circadianos. Uma variedade de pesquisas bsicas e aplicadas vem demonstrando as consequncias dessa falta de sincronizao. Assim, o objetivo deste estudo foi discutir, em estudos com populaes brasileiras, as principais consequncias das interaes entre sincronizadores sociais e o ciclo claro/escuro, com especial ateno s questes de sade humana. Palavras-chave. Ciclo claro/escuro; Exposio luz artificial; Trabalho em turnos; Viagens transmeridianas; Atraso de fase; Sade humana. Abstract. The light/dark cycle is considered the most important zeitgeber of mammals rhythms. For humans, however, the advent of electric lighting changed synchronization patterns. The exposure to artificial light during the dark phase, especially due to work and evening school, and TV/internet habits, has been associated with desynchronization of circadian rhythms. A variety of basic and applied research has demonstrated the consequences of being out-of-sync for health. The objective of this paper is to discuss the main consequences of the interaction between social synchronizers and the natural light/dark cycle, especially considering studies on the consequences for the human health in Brazilian populations. Keywords. Light/dark cycles; Exposure to artificial light; Shift work; Transmeridian travel; Sleep phase delay; Human health.
Exposio ao ciclo claro/escuro e ritmicidade biolgica
Desde os tempos mais remotos, os organismos convivem com processos cclicos do ambiente. Em funo da organizao do sistema solar, a Terra submetida a interaes que envolvem foras de atrao entre os diferentes planetas e corpos celestes. As interaes da Terra com o Sol e a Lua, aliadas inclinao de seu eixo, resultam nos ciclos ambientais, tais como o ciclo claro/escuro (Rotenberg et al, 2003). A relao entre os ritmos biolgicos e os ciclos ambientais conhecida h muito. No entanto, a ideia inicial de que esses ritmos seriam passivos, ou seja, determinados pelos ciclos ambientais, comeou a ser desconstruda apenas a partir da publicao do experimento realizado em 1729 pelo astrnomo Jean-Jacques d Ortous de Mairan.
No trabalho, foi demonstrado que plantas sensitivas (provavelmente Mimosa pudica), mesmo isoladas em escuro constante eram capazes de manter o ritmo de abertura e fechamento das folhas. Esse experimento, bem como estudos subsequentes, demonstrou que, organismos mantidos em condies constantes e, portanto, isolados das pistas do ambiente, continuam expressando ritmos circadianos, com perodos maiores ou menores do que 24 horas. Nos mamferos, a sincronizao dos ritmos biolgicos possvel em funo da presena de dois conjuntos de neurnios hipotalmicos, localizados sobre o quiasma ptico, denominados ncleos supraquiasmticos (NSQs). Tais neurnios apresentam papel central na gerao dos ritmos biolgicos, sendo, considerados osciladores centrais - termo adotado em substituio a relgios biolgicos. Essa denominao relaciona-se descoberta da expresso de genes encontrados nos NSQs (genes do relgio)
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e em outras regies do organismo, tais como fgado e rins. Estas estruturas so capazes de gerar sua prpria ritmicidade, mas a expresso rtmica final coordenada pelos NSQs. Dada essa relao estabelecida com os osciladores centrais, tais regies so consideradas osciladores perifricos. Alm de capazes de gerar ritmos endgenos, os neurnios dos NSQs comunicam-se com a retina, via trato retino-hipotalmico, recebendo, dessa forma, informao luminosa do ambiente. Comunicam-se tambm com outras estruturas, transmitindo-lhes as informaes sobre as condies de luminosidade captadas. Exemplo disso a relao estabelecida com a glndula pineal, responsvel pela produo do hormnio melatonina. A secreo desse hormnio ajustada por meio da relao entre glndula e NSQ e ocorre durante a noite. Nos humanos, a secreo de melatonina est relacionada ocorrncia do sono noturno. Sendo assim, sabido que a exposio luz durante a fase escura do ciclo pode inibir a secreo desse hormnio, antecipando ou atrasando a fase dos ritmos biolgicos, em especial do ciclo viglia/sono. Alm da secreo de melatonina noite, a secreo de cortisol antes do amanhecer e o pico de temperatura corporal antes do anoitecer so outros exemplos das relaes de fase estabelecidas entre os ritmos e o ciclo claro/escuro ambiental. A manuteno dos ritmos em ambiente constante demonstra o carter endgeno da ritmicidade biolgica (Marques et al, 2003), o que permite que o organismo prepare-se progressivamente para as transies entre as diferentes fases e ajuste seus ritmos ao ciclo ambiental. Esse processo pode ser promovido por ciclos geofsicos ou biticos, conhecidos como zeitgebers (Aschoff, 1960). Em condies normais, o ritmo endgeno gerado pelo sistema de temporizao pode ser sincronizado por pistas de tempo externas, como o ciclo claro/escuro - chamado, ento, de sincronizador ftico. No entanto, essa exposio pode ser influenciada por outros eventos. No caso da espcie humana, os horrios escolares, o trabalho noturno e em turnos e os vos transmeridianos (Rea et al, 2008) podem ser tomados como exemplo disso, sendo chamados de sincronizadores sociais (social zeitgebers) (Mistlberger e Skene, 2004). Dessa forma, considerando as importantes consequncias da interao entre os sincronizadores sociais com o ciclo claro/escuro, especialmente com relao sade humana, sero abordadas neste ensaio as principais situaes de alteraes na exposio luz, desde o natural atraso de fase na adolescncia, que exacerbado por hbitos como a utilizao de TV e internet noite; as importantes modificaes na expresso do ciclo viglia/sono em situaes de trabalho noturno, tanto na adolescncia como na vida adulta, e as mudanas radicais nos ritmos biolgicos que podem ocorrer em viagens transmeridianas. Buscou-se ainda, revisar algumas das principais publicaes relacionadas ao tema com especial ateno aos estudos com amostras brasileiras.
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O atraso de fase na adolescncia

A adolescncia vem chamando ateno dos pesquisadores
dos ritmos biolgicos. Nesta fase mudanas importantes ocorrem no comportamento social, no desenvolvimento fisiolgico e na expresso do ciclo viglia/sono. As possibilidades de ocorrncia de atrasos de fase do sono so maiores nos adolescentes. Os atrasos so caracterizados por horrios mais tardios, tanto de dormir como de acordar, exacerbados pela exposio luz na fase escura do ciclo (Carskadon et al, 2004). Esse quadro, somado aos horrios de incio das atividades escolares, especialmente naqueles jovens que estudam pela manh, bem como de fatores comportamentais e ambientais, acarreta situaes negativas como aumento excessivo da sonolncia diurna, problemas de ateno e aprendizado, privao crnica de sono, dentre outras (Pereira et al, 2010). Assim, exposies luz durante a noite causariam um atraso maior de fase do sono relacionado, especialmente com alteraes no processo homeosttico de regulao do sono (processo S), provocando um aumento da propenso ao sono ao longo do dia e possveis dbitos de sono (Carskadon et al, 2004). No entanto, durante a adolescncia, fatores biolgicos, alm da exposio luz artificial, parecem estar relacionados a este atraso de fase. Adolescentes mais velhos adormecem mais lentamente e apresentam um acmulo de presso do sono menor durante o dia. Alm disso, existe a hiptese de que a sensibilidade luz seja alterada durante a puberdade, tanto em humanos como em animais (Carskadon et al, 2004; Crowley e Carskadon, 2010). Esta hiptese ainda no est inteiramente comprovada. A magnitude do atraso de fase parece ser maior no sexo masculino e ocorrer de forma mais tardia na espcie humana, na qual seu pico se d nas fases finais de desenvolvimento gonadal. Em outras espcies de mamferos, o atraso ocorre concomitantemente com o desenvolvimento das caractersticas sexuais secundrias. As causas do atraso de fase mais tardio na espcie humana so desconhecidas e as pesquisas apresentam limitaes metodolgicas, mas a iluminao artificial pode ter papel importante neste processo. Alm disso, o fato de algumas regies cerebrais continuarem a se desenvolver nos humanos mesmo aps os 20 anos pode colaborar para tais caractersticas (Crowley e Carskadon, 2010). Em recente publicao, Kurth et al (2010), apresentaram uma descrio das alteraes dos estgios de sono durante a adolescncia. Esses pesquisadores analisaram os estgios de sono em um grupo de jovens pberes e pr-pberes e identificaram que adolescentes maturados (pberes) apresentam maior tempo para incio de sono (latncia de sono) e maior nmero de despertares. Alm disso, foi identificada uma diminuio mais acentuada de sono de ondas lentas em crianas pr-pberes nos cinco primeiros episdios de sono quando comparadas com as pberes. Segundo os autores, os resultados podem indicar maior fora sinptica dos neurnios envolvidos na gerao de ondas lentas no sono de crianas pr-pberes. Isto pode ser devido maior densidade de sinapses corticais, j que o curso da adolescncia acompanhado por uma reduo na densidade de sinapses e no volume da substncia cinzenta.
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te com a experincia e o sucesso profissional. Os autores salientam que, alm de evitar a sada precoce da escola, previnem-se agravos sade decorrentes da sobrecarga trabalho/estudo, inclusive com relao aos problemas de dbito de sono e desfechos relacionados. Fischer et al (2008) acrescentaram alguns importantes resultados em pesquisa com estudantes de 14 a 21 anos de idade, em cursos noturnos na cidade de So Paulo. Os pesquisadores verificaram uma reduo de mais ou menos duas horas dirias de sono nos dias da semana nos adolescentes trabalhadores e associao da durao do sono com fatores como alcoolismo, tabagismo e baixo nvel de atividade fsica. Alm disso, a carga de trabalho de seis a oito horas ou de oito a 10 horas tambm esteve associada menor durao do sono no grupo de trabalhadores investigados. Em outra pesquisa realizada tambm com adolescentes paulistas, Teixeira et al (2010) verificaram que a maioria dos adolescentes que trabalha atua em lojas ou escritrios, recebe at um salrio mnimo e cumpre, pelo menos, 40 horas semanais de trabalho. O estudo detectou em trabalhadores jovens diferenas na durao do sono nos dias de semana quando comparados aos finais de semana, o que no ocorre em adolescentes no trabalhadores. Em algumas faixas etrias, em torno de 70% dos adolescentes trabalhadores relataram sonolncia diurna excessiva. No foram observadas diferenas quanto ao sexo, tabagismo, cafena e nvel de atividade fsica entre adolescentes trabalhadores e no trabalhadores. Os autores acrescentam ainda que adolescentes que no possuem compromissos com horrios regulares se permitem dormir mais tarde e participam de atividades sociais noite. Inmeras variveis podem estar associadas ao contexto de trabalho e sono na adolescncia. O estudo de Bernardo et al (2009) avana em algumas anlises e apresenta dados de um grupo de adolescentes trabalhadores de So Paulo SP, os quais apresentaram menor durao do sono, independente da classe socioeconmica, que um importante fator de insero dos jovens no mercado de trabalho. Os autores verificaram tambm que adolescentes que trabalham apresentaram uma prevalncia 1,40 vez (IC 95%: 1,20-1,72) maior de baixa durao do sono com relao aos no trabalhadores. Apesar de apresentarem importantes resultados, os estudos com sono em adolescentes que trabalham so ainda restritos e recentes no Brasil. Alm disso, apresentam limitaes como o nmero de sujeitos investigados, os inmeros fatores que podem ser importantes na relao entre sono e trabalho na adolescncia bem como nas anlises estatsticas que foram realizadas. Alm da reduzida durao do sono nos adolescentes trabalhadores e maior regularidade no sono dos adolescentes no trabalhadores, outras tendncias, especialmente quanto a outros possveis fatores associados curta durao do sono nos jovens trabalhadores, necessitam de maiores anlises para serem confirmadas. Torna-se importante uma investigao mais aprofundada a respeito do efeito do trabalho em adolescentes de diferentes classes sociais, para caracterizar: tipo de
No contexto do atraso de fase, os adolescentes podem, de forma geral, estar expostos a trs situaes que alteram mais claramente a exposio natural ao ciclo claro/ escuro: a) pelo atraso natural nos horrios de dormir, tpico da adolescncia; b) pelos comportamentos sociais e a exposio a TV, videogames e internet noite e c) pela insero dos adolescentes no mercado de trabalho, o que os obriga a estudar noite e trabalhar durante o dia. Em tese, tais situaes abrangeriam a maior parte das situaes de exposio peculiares de adolescentes ao ciclo claro/escuro, e no se excluem entre si. Embora a literatura sobre sono na adolescncia seja ampla, as repercusses das trs situaes descritas, especialmente em longo prazo, foram pouco investigadas, analisando-se normalmente o efeito dessas situaes na diminuio da durao do sono.
Trabalho noturno ou em turnos

O trabalho ocupa importante papel na sociedade, pois as pessoas passam boa parte de suas vidas dentro de organizaes e comeam a trabalhar cada vez mais cedo, inclusive durante a adolescncia. Nesse contexto, Dejours (1992) sugere que o trabalho possa ser fonte tanto de sade e prazer como de doenas e infelicidade e, de qualquer forma, so necessrios vrios ajustes psquicos para que as condies de trabalho no provoquem estados patolgicos. As condies de insero dos jovens brasileiros no mercado de trabalho vem se tornando objeto de pesquisa. Os estudos de Machado et al (1998) e Vinha et al (2002) foram pioneiros em analisar com maior profundidade o sono de adolescentes trabalhadores no Brasil. Machado et al (1998) investigaram as relaes entre o turno escolar e trabalho para o sono dos adolescentes do sexo feminino. Neste estudo, foi identificada menor durao do sono em adolescentes que trabalham durante a semana. Verificaram ainda que aquelas que estudavam noite e que trabalhavam durante o dia, apresentavam maior irregularidade do sono e aumento da durao no final de semana. A durao mdia de sono das adolescentes trabalhadoras passou de 6.7h para 9.67h nos finais de semana, supostamente uma forma de recuperar os dbitos de sono acumulados nos dias de trabalho. Corroborando os resultados de Machado et al (1998), Vinha et al (2002), investigando adolescentes trabalhadores e no trabalhadores, com mdia de idade de 17,4 anos, verificaram tambm uma maior irregularidade nos padres de sono nos adolescentes trabalhadores, alm de uma reduo da durao do sono nos dias de semana. Observaram ainda que, enquanto nos adolescentes a durao do sono aumentava nos finais de semana, como forma de compensao, os no trabalhadores mostraram uma tendncia compensao no incio da semana. A partir de ento, outras publicaes trouxeram importantes contribuies para a compreenso do contexto da sade e sono nos adolescentes brasileiros que trabalham (Fischer et al, 2003; Teixeira et al, 2007; Fischer et al, 2008; Teixeira et al, 2010). Fischer et al (2003), investigando as representaes sociais dos jovens trabalhadores, destacam que se deve superar a viso de associar o trabalho somen-
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ocupao, horrio e cargas diria e semanal de trabalho, caractersticas psquicas, alimentares e de estado nutricional, diferenas regionais e culturais, anlises ergonmicas detalhadas dos postos de trabalhos nas mais diferentes ocupaes que os adolescentes desempenham. Alm disto, so necessrias medidas de interveno, tanto no local de trabalho, como na educao para o trabalho e sade na escola, bem como uma reviso das leis trabalhistas para essa populao. Apesar da relevncia desta discusso, os adolescentes so apenas uma parcela da populao trabalhadora que sofre com os efeitos da privao de sono gerada pelo trabalho noturno ou em turnos. Segundo estatsticas, durante o ano de 2004, 27 milhes de americanos realizavam esse tipo de jornada (Mahoney, 2010). Em trabalho publicado em 2003, Moreno et al estimaram que 10% da populao brasileira ativa trabalhava em turnos ou noite. Estudos epidemiolgicos mostraram que trabalhadores em turnos apresentam um aumento na prevalncia de problemas metablicos (diabetes, nveis de triglicerdeos e colesterol), de sono e cardiovasculares (hipertenso e doenas coronarianas), alm de maior risco de cncer (Kanterman et al, 2010; Davis e Mirick, 2006). Em estudo com 4.878 motoristas de caminho brasileiros, Moreno et al investigaram a associao entre reduo das horas de sono e obesidade (Moreno et al, 2003). Nesse estudo, identificaram tambm que ronco, hipercolesterolemia, hipertenso, hiperglicemia e durao de sono menor do que oito horas so fatores associados obesidade. Entretanto, o elevado ndice de massa corporal pode ser explicado pela trade de fatores que inclui, alm da privao parcial de sono, o sedentarismo e a ingesto de dieta pouco diversificada (Moreno et al, 2003). A obesidade tambm foi descrita em estudo prvio de Moreno et al, com 10.101 motoristas de caminho, como um dos fatores associados presena de apneia obstrutiva do sono (Moreno et al, 2004). Mello et al, por sua vez, ao estudarem 400 motoristas de nibus interestaduais brasileiros, constataram que 60% dos trabalhadores apresentavam queixa de, pelo menos, um problema de sono (Mello et al, 2000). De acordo com recomendaes da International Agency for Research on Cancer (IARC), o trabalho em turnos, envolvendo ruptura dos ritmos biolgicos, foi classificado como uma provvel causa de cncer de mama, sendo que evidncias epidemiolgicas e experimentais embasaram tal concluso. (Pronk et al, 2010). O crescimento de tumores inoculados j foi tambm evidenciado em experimentos com ratos que tiveram seus NSQs lesionados ou que foram submetidos a repetidos adiantamentos do ciclo claro/escuro. Os resultados so explicados pela secreo alterada de melatonina, j que esse hormnio parece ter efeito protetor sobre o crescimento de tumores, pelo menos in vitro (Davis e Mirick, 2006). Entre as mulheres, observam-se os efeitos da alterao dos ritmos biolgicos sobre o ciclo menstrual, dadas as queixas de mais dor durante o perodo menstrual, maior fluxo e maior durao do sangramento. Tambm foram encontrados relatos de maior nmero de nascimentos de bebs de baixo peso, abortos espontneos e subfe-
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cundidade entre mulheres com alterao da ritmicidade circadiana em funo dos turnos de trabalho, tais como os enfrentados por comissrias de bordo ou enfermeiras. (Mahoney, 2010). Entretanto, deve-se considerar que os prejuzos da adoo de uma rotina de trabalho noturno ou em turnos no se restringem apenas sade do indivduo. Em trabalho publicado em 2002, Fischer et al chamam ateno para o fato de que enfermeiros que trabalhavam em regime de trabalho de 12 horas noturnas, com descanso de 36 horas, apresentavam diminuio significativa da capacidade de manuteno da ateno ao longo das horas de trabalho, sendo que o mesmo no ocorria com trabalhadores diurnos (Fischer et al, 2002). A queda no alerta esperada porque noite ocorre o menor valor da expresso do componente circadiano da regulao do alerta, aumento da fadiga e dbito de sono, gerando maior sonolncia (Akerstedt, 1996). Dessa forma, so aumentados os riscos de acidentes e erros durante a jornada de trabalho. Somada a isto, est a dificuldade de socializao, porque horrios de dormir e acordar dos trabalhadores noturnos divergem dos horrios comumente adotados pela famlia e amigos. Neste contexto, segundo Moreno et al (2003), as mulheres trabalhadoras parecem sofrer mais do que os homens, j que a preocupao com as tarefas de casa e com os cuidados com os filhos, costumeiramente realizados por elas, interfere na capacidade de adormecer durante o dia.
Voos transmeridianos
Alm da submisso a uma rotina de trabalho noturno ou em turno, outros eventos, tais como longas viagens transmeridianas, podem gerar alteraes da ritmicidade circadiana. Aps longas viagens, costuma-se observar quadros de fadiga, geralmente superados aps uma noite de sono. Entretanto, vos transmeridianos geralmente criam uma condio conhecida como jet lag. Esta condio caracterizada pela dificuldade de adaptao aos novos horrios impostos pela mudana de fuso horrio (Waterhouse et al, 2007). Isso ocorre porque nossos ritmos esto sincronizados ao local de origem, demorando alguns dias para sincronizarem-se aos ciclos ambientais e sociais do local de destino. A intensidade dos sintomas do jet lag varia de acordo com o nmero de fusos horrios percorridos, bem como com a direo tomada, sendo que vos em sentido leste parecem estar relacionados a sintomas mais severos (Waterhouse et al, 2007). Segundo alguns autores, o jet lag causa uma mirade de problemas fsicos, emocionais e psiquitricos (Mahoney, 2010), que variam desde dores de cabea, problemas gastrointestinais, diminuio do apetite, dificuldades de manuteno de ateno e concentrao e baixo rendimento em tarefas fsicas e mentais (Waterhouse et al, 2007). Tanto em situaes de jet lag como em situaes de trabalho noturno ou em turnos algumas medidas podem ser adotadas na busca pela reduo dos efeitos causados pela dessincronizao ao ciclo dia/noite. Entre essas medidas, deve-se considerar a rpida alternncia de turnos
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de trabalho, evitando-se que durante os dias de semana o indivduo adote uma rotina noturna que tende a ser substituda por uma rotina diurna durante os finais de semana, causando grande dificuldade de tolerncia. Alm disso, medidas como uso de culos de sol durante a volta para casa, evitando-se a exposio luz durante a manh e a exposio luz artificial durante a noite so medidas que poderiam ajudar o indivduo na sua sincronizao ao ciclo claro/escuro ao qual est exposto. Essas duas prticas, no entanto, ainda precisam ser investigadas, pois a exposio luz tem efeitos tanto de adiantamento quanto de atraso da fase dos ritmos, de forma que a aplicao imprpria dessa medida pode trazer prejuzos maiores ao organismo (Moreno et al, 2003). No caso da dessincronizao causada pela mudana de fusos horrios, embora no se conheam formas de curar ou evitar totalmente os sintomas do jet lag, sabe-se que o uso de drogas indutoras do sono ou que melhoram o estado de alerta pode amenizar os efeitos de fadiga. A ingesto do hormnio melatonina, secretado naturalmente pela glndula pineal durante a fase de escuro do ciclo claro/escuro, parece garantir melhora dos sintomas (Waterhouse et al, 2007). Apesar disso, a comercializao desse hormnio proibida no Brasil, sendo ainda pouco conhecidas todas as consequncias do seu uso para o organismo. Por fim, importante mencionar que o conhecimento acerca dos vrios problemas decorrentes da dessincronizao entre ritmos sociais e circadianos deveria ser motivo de reavaliao da real necessidade da adoo de rotinas que levem a esse conflito. Se em algumas situaes, tais como atendimentos de emergncia em hospitais, corpo de bombeiros ou delegacias extremamente necessria a presena de atendentes de planto, outras situaes, como funcionamento de lojas de convenincia e lanchonetes 24 horas, poderiam ser facilmente abolidas, em detrimento da preservao da sade de trabalhadores desse setor. Da mesma forma, a preferncia pela escola deveria ser incentivada, evitando que os jovens tenham uma rotina de trabalho que os obrigue a estudar noite e, consequentemente, privar-se de sono. Estas medidas seriam a melhor forma de preservar a sade e garantir uma slida formao profissional.
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Reviso
Estimativa de tempo em humanos: bases, ontognese e variao diria

Time estimation in humans: basis, ontogenesis and daily variation
Mario Andr Leocadio Miguel
Escola de Artes, Cincias e Humanidades e Departamento de Fisiologia e Biofsica, Instituto de Cincias Biomdicas, USP
Contato do autor: mmiguel@usp.br Resumo. A capacidade de estimar a passagem de tempo necessria para a expresso de comportamentos complexos como o falar e o atravessar uma rua. Diversos modelos foram elaborados para descrever o fenmeno e as bases neurais subjacentes estimativa de tempo indicam o envolvimento, tanto de reas corticais, quanto subcorticais. A capacidade de estimar a passagem de tempo varia conforme as diferentes etapas da vida; sofre influncia de aspectos emocionais e da presso do sono, alm de ser controlada, ao menos em parte, pelo sistema de temporizao circadiano. uma rea de estudo em franca expanso e visa compreender o processamento temporal nos mais diversos nveis. Palavras-chave. Cronobiologia; Percepo de tempo; Sistemas de temporizao. Abstract. Timing is necessary for the expression of complex behaviors such as to speak and to cross a street. Several models have been elaborated to describe the phenomenon and the underlying neural basis indicates the role of cortical and sub-cortical areas. Time estimation varies in an age-dependent way and is influenced by emotions and sleep pressure, besides being, at least in part, controlled by the circadian timekeeping system. It is a booming area of research and is intended to understand how temporal processing occurs in different levels. Keywords. Chronobiology; Time perception; Timekeeping systems.
Introduo
Tempo e Espao so dimenses fundamentais de nossa existncia. Enquanto a dimenso espacial est perdendo seu valor em uma realidade dominada pelas redes de computadores, bibliotecas virtuais e dispositivos multi-tarefa, a dimenso temporal est se tornando a essncia de nosso cotidiano, sendo crucial para as atividades rotineiras, como nos horrios de dormir e acordar, na prtica esportiva, na apreciao da msica e na compreenso da fala (Buhusi e Meck, 2005). A capacidade de perceber da passagem do tempo, da ordem de milissegundos a minutos, horas, dias, meses e anos, est intrinsecamente relacionada a atos corriqueiros, como dirigir, atravessar uma rua ou decidir se deve aguardar ou no a abertura de uma pgina na internet (Block et al, 1998). Esta reviso tem como objetivo descrever os modelos que explicam a capacidade de estimar a passagem do tempo, suas bases neurofisiolgicas, as questes ontogenticas e de variabilidade individual e os aspectos cronobiolgicos deste comportamento.
Modelos de sistemas de temporizao

A abordagem tradicional utilizada para descrever a capa-
cidade de um organismo em estimar a passagem do tempo baseada no modelo de processamento de informao ou Modelo Marcapasso-Acumulador (Treisman, 1963). Este modelo foi desenvolvido para descrever o funcionamento de um relgio interno que, presumidamente, medeia a habilidade de estimar intervalos de tempo em humanos e outros animais. Este modelo baseado nas primeiras tentativas de se criar uma modelagem para o comportamento de estimativa de tempo, especialmente nos esforos de Creelman (1962), que chegou a propor que a capacidade de um organismo em estimar a passagem do tempo era dependente da presena de um mecanismo interno responsvel pelo acmulo de pulsos gerados por um marcapasso. O modelo de Treisman compreende trs componentes distintos, um marcapasso, responsvel por gerar pulsos em uma determinada frequncia, um acumulador, dedicado contagem dos pulsos gerados, e um comparador, que faz a ligao entre o nmero de pulsos presentes no acumulador e as representaes de memria de intervalos de tempo anteriormente experimentados. Um detalhe interessante no modelo a presena de um mecanismo de controle do marcapasso, o qual tem o seu funcionamento dependente de um estado geral de excitabilidade do sistema nervoso, controlando assim a frequncia dos pulsos gerados (Figura 1).
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ou no, qual a faixa de durao dos estmulos apresentados, qual o contedo emocional do contexto experimental (Wittmann, 2009). Contudo, seja qual for o modelo aplicado, a busca pelas bases neurais que suportam a capacidade de estimar o tempo a tendncia atual mais evidente desta rea de estudo.
Bases neurofisiolgicas do comportamento de estimativa de tempo

Como se d e como representada a capacidade de estimativa de tempo no sistema nervoso? A atividade sinrgica de reas como os gnglios da base, a rea motora suplementar, o cerebelo e o crtex frontal anterior (ou pr-frontal) est relacionada com a estimativa explcita da durao do intervalo de tempo, constituindo a base neural para este comportamento (Figura 2) (Coull et al, 2011).
Figura 1. Modelo de relgio interno proposto por Treisman (1963). Adaptado de Droit-Volet e Meck (2007).
Embora o modelo de Treisman seja capaz de dar suporte existncia de uma variabilidade no comportamento de estimativa de tempo de acordo com as variaes no metabolismo e no grau de excitabilidade do sistema nervoso, no compreende a capacidade de partio da ateno entre diferentes aspectos em um determinado contexto. Como exemplo, consideremos um indivduo parado no passeio e aguardando para atravessar a rua. Neste contexto, alm de ser capaz de descrever em detalhes a situao, como quais carros esto passando, se h ou no pessoas por perto, este indivduo tambm consegue estimar o tempo de chegada de um carro vindo em sua direo e assim determinar se seguro atravessar ou no. Portanto, assumindo que o processamento da informao temporal ocorre, em situaes cotidianas, imerso em um intrincado contexto temporal e no-temporal, no qual diversas tarefas so realizadas simultaneamente, h a necessidade de uma diviso contnua dos recursos atencionais entre as tarefas, atravs de estratgias de alocao de recursos. O modelo de Meck e Church (1983) introduz um elemento ao modelo anterior com a finalidade de controlar, binariamente, a alocao da ateno passagem do tempo. Tal elemento atua como um interruptor que dirige o foco atencional ao tempo ou aos outros elementos dentro de um determinado contexto. Posteriormente foi proposto o Modelo do Porto Atencional (Block e Zakay, 1996), o qual adiciona ao modelo tradicional de Treisman a ideia de um porto atencional. De maneira geral, quanto mais ateno alocada ao tempo, maior o nmero de pulsos gerados pelo marcapasso, resultando em uma superestimao do tempo. A adio deste controle do foco atencional, no mais binrio, ajusta-se aos dados obtidos experimentalmente que descrevem o papel da excitabilidade do sistema nervoso, dos estados de humor e da emoo sobre a capacidade de estimar a passagem de tempo. Especificamente, Gil e Droit-Volet (2012) descreveram em indivduos expostos a contextos emocionalmente ativos, como imagens que incitem nojo e medo, superestimam o tempo. Interessantemente, tal fenmeno apresenta correlao direta com o grau de ativao emocional envolvida no contexto. Diferentes fatores influenciam o ajuste dos modelos tericos aos dados experimentais coletados, principalmente com relao ao tipo de protocolo utilizado: se solicitado ao voluntrio para prestar ateno ao tempo
Figura 2. reas neurais envolvidas no comportamento de estimativa de tempo. Resultado de imageamento funcional por ressonncia magntica (fMRI). Adaptado de (Ortuno e col., 2011).
Foi descrito um modelo com base neurofisiolgica para o comportamento de estimativa de tempo baseado no funcionamento da circuitaria neural estriado-frontal. De acordo com este modelo, a representao do tempo deve-se habilidade do corpo estriado dos ncleos da base em detectar padres coincidentes de oscilaes corticais e talmicas, ou seja, sincronizao de disparos neuronais destas reas em resposta s tarefas de percepo de tempo. (Matell e Meck, 2000). Utilizando a tcnica de imageamento funcional por ressonncia magntica, Rao et al (1997) estudaram indivduos que foram solicitados a sincronizar movimentos de dedos com um estmulo auditrio numa primeira fase e manter a mesma frequncia de movimentos aps o final de uma srie de estmulos segunda fase. A ideia era observar o padro de ativao cerebral, comparando as duas fases. Os autores observaram que o tlamo, o crtex e o ncleo estriado apresentaram atividade sincronizada apenas na segunda fase do experimento, quando a estimativa de tempo era fundamental diante da interrupo da pista temporal dada pela srie de estmulos. Em experimento semelhante realizado com indivduos portadores de leses cerebelares, foi demonstrado que quando esto afetadas as reas laterais do cerebelo, o movimento de tamborilar os dedos em uma dada frequncia fica prejudicado (Ivry et al, 1988). Mais recentemente, foram estabelecidas correlaes entre leses em reas do cerebelo humano e diferentes formas de percepo e estimativa de tempo. Os dficits mais significativos foram encontrados em indivduos portadores de leses nas reas
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cidade de estimar diferentes intervalos de tempo em uma populao de idade variada, num total de 140 voluntrios com idade entre 08 e 70 anos. A tarefa consistia em produzir intervalos de 10 segundos, 01 minuto e 05 minutos. A tendncia geral encontrada neste estudo foi um aumento na subestimao do intervalo de tempo para os indivduos de maior idade, ou seja, o tempo passa mais rpido para os mais velhos. Esta subestimao, segundo os autores, deve-se modificao na velocidade dos processos fisiolgicos ou do relgio interno ou, ainda, poderia ser resultado de uma menor ateno despendida passagem de tempo. Com base na ideia da variao ontogentica e na alta sensibilidade do comportamento de estimativa de tempo em procedimentos que envolvam ateno e memria, Lustig e Meck (2001) propuseram um experimento com a finalidade de evidenciar os efeitos do envelhecimento sobre a capacidade de estimar a durao de estmulos de diferentes naturezas, auditiva e visual, apresentados simultaneamente. Neste tipo de tarefa, os voluntrios devem prestar ateno aos diferentes estmulos com diferentes duraes, como um som e uma imagem apresentados atravs de um computador. Para que o desempenho seja mximo, os voluntrios devem ser capazes de dividir a ateno entre os estmulos (visual e auditivo) e estimar, independentemente, as duraes. Entre outros resultados, este estudo demonstra que os indivduos idosos apresentam um dficit significativo na tarefa de partio da ateno entre os estmulos, quando comparados com indivduos adultos jovens. Ademais, curiosamente, tal dficit foi apresentado apenas pelos idosos submetidos aos testes na fase da manh, em contraste com o desempenho dos submetidos na fase da tarde.
superiores dos hemisfrios laterais e no ncleo denteado, reafirmando o papel destas estruturas na estimativa de tempo (Gooch et al, 2010). Os estudos de percepo de tempo em portadores da doena de Parkinson ajudaram a elucidar os seus mecanismos neurais. Estes pacientes tm os ncleos da base afetados, apresentando neurodegenerao das clulas dopaminrgicas na substncia nigra pars compacta e consequente dficit funcional do corpo estriado, este ltimo intrinsecamente envolvido no sucesso do comportamento de estimativa de tempo. Pacientes portadores de Parkinson apresentam dficit na habilidade de sincronizar toques de dedos com um estmulo sonoro de intervalos entre 300 e 600ms (Harrington et al,1998). A doena de Parkinson afeta, diferentemente, estimativas em faixas distintas de tempo, entre 100 e 500ms e entre 1 e 5 segundos. Pacientes expostos a tarefas de estimativa de intervalos de tempo da ordem de segundos apresentam dficits mais significativos, quando comparados com o seu prprio desempenho face a intervalos mais curtos, confirmando o papel dos ncleos da base na percepo temporal em nveis mediados pela ateno, pela memria e por processos de tomada de deciso, alm de protocolos com intervalos da ordem de sub-segundos (Smith et al, 2007). Os estudos mais recentes apontam para o envolvimento de uma grande parte do sistema nervoso no controle da percepo subjetiva de tempo (Morillon et al, 2009). Especialmente com o avano das tcnicas de imageamento funcional, esto sendo expostas particularidades dos padres de atividade do sistema nervoso de acordo com a durao dos eventos propostos. De acordo com Lewis e Miall (2003), a durao trs consigo a necessidade ou no de um controle cognitivo atencional ou de memria. A estimativa de intervalos da ordem de milissegundos apresenta uma menor necessidade de ativao das reas corticais relacionadas ateno e memria, quando comparada estimativa de intervalos mais longos.
A cronobiologia e a estimativa de intervalo de tempo

Todo organismo vivo pode ser descrito em relao a dois conjuntos distintos de caractersticas. As configuraes espaciais da estrutura fsica de cada organismo e do seu meio ambiente so familiares a todos. Muito mais sutil e menos percebido aos olhos destreinados a estrutura ou organizao temporal de cada organismo frente aos elementos rtmicos de seu ambiente. Enquanto a estrutura espacial, suas clulas, tecidos, rgos e sistemas do forma matria viva, o aspecto temporal promove relevncia ao comportamento por relacionar as funes orgnicas aos aspectos rtmicos do ambiente, como o ciclo claro-escuro ambiental (Dunlap et al, 2004). A maioria dos animais superiores possui dois sistemas endgenos e complementares de controle da temporizao: um sistema que mede a passagem do tempo sob a forma de um cronmetro envolvido na percepo subjetiva de tempo e um sistema de temporizao circadiano, cujo papel a gerao de variaes ou ritmos biolgicos frente s oscilaes ambientais (Morell, 1996). A avaliao de diversos aspectos do desempenho cognitivo revelou variao ao longo do dia. Alerta, vigilncia, percepo visual, processamento central e respostas motoras so exemplos de variveis expressas diferente-
Ontognese do comportamento de estimativa de tempo

de conhecimento geral a noo de que o tempo passa mais rpido conforme envelhecemos. Baseado nessa premissa, Cohen (apud Block et al 1998) especulou sobre a relao entre o envelhecimento e a percepo subjetiva da passagem do tempo. Ele atribui esta impresso, em parte, mudana na taxa metablica, o que afetaria o julgamento de estimativa de tempo. De acordo com Block et al (1998), as diferenas ontogenticas no julgamento da durao de intervalos de tempo podem derivar de alteraes em vrios parmetros fisiolgicos e processos cognitivos, incluindo: a velocidade dos processos biolgicos, como a velocidade de funcionamento do marcapasso interno; a taxa metablica basal ou a temperatura cerebral, talvez influenciando o funcionamento do marcapasso; a fora, clareza, durao e variabilidade dos processos de memria; e os recursos atencionais ou a alocao da memria, especialmente envolvendo ateno ao tempo. Espinosa-Fernandez et al (2003), avaliaram a capa-
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mente ao longo do dia sob a forma de ritmos circadianos (Folkard, 1990). Johnson et al (1992) demonstraram haver um declnio ao longo do dia no desempenho de tarefas envolvendo a memria de curto prazo. Entretanto, quando os sujeitos foram submetidos a um protocolo de rotina constante de 40 horas, emergiu o paralelismo entre desempenho e temperatura central, ou seja, uma coincidncia entre o aumento de temperatura e o desempenho. Tal protocolo experimental, amplamente utilizado na cronobiologia, compreende a manuteno de um sujeito isolado de pistas temporais, em situao de relativa imobilidade e impedimento de ocorrncia de episdios de sono, sob a premissa da eliminao de interferncias do ambiente sobre as variaes rtmicas do organismo. Mudanas nos valores da temperatura interna podem refletir alteraes nos processos metablicos que poderiam facilitar o desempenho pelo simples aumento na velocidade do processamento da informao. Monk et al (1997) exploraram a relao entre os ritmos circadianos da temperatura retal, do desempenho, do cortisol, da melatonina plasmtica e do alerta em indivduos submetidos ao protocolo de rotina constante durante 36 horas. Como resultado, os autores demonstraram uma significativa correlao positiva entre a temperatura retal, o alerta e o desempenho, bem como uma correlao negativa entre o ltimo e o nvel plasmtico de cortisol. A resposta para esta simples pergunta Que horas so? pode servir para se inferir a noo da passagem de tempo. Embora pouco explorada na literatura, a preciso da estimativa quanto ao horrio do dia apresenta correlao positiva com a temperatura central (Campbell et al, 2001, Spti et al, 2009). Na tentativa de encontrar uma correlao entre a percepo de intervalos de tempo curtos e longos e a temperatura central, Aschoff (1998) submeteu indivduos a um protocolo de isolamento temporal, ou seja, livre de pistas que indicassem a passagem do tempo, como o ciclo claro/escuro, variaes de temperatura e o convvio social. Foi pedido aos indivduos que estimassem os intervalos de uma hora, cinco e dez segundos, durante trs semanas de isolamento, com monitoramento da temperatura retal. Os resultados mostraram que a estimativa do intervalo de uma hora no apresentava correlao com a flutuao da temperatura central, em contraste com a estimativa dos intervalos mais curtos. Ainda segundo o autor, a percepo de intervalos de tempo curtos, da ordem de segundos, segue a regra geral dos processos fisiolgicos, ou seja, acelerada com o aumento da temperatura. A descoberta de Aschoff (1998) contrasta com os resultados de um trabalho anterior, no qual indivduos que permaneceram em situao livre de pistas temporais deveriam estimar, sequencialmente, a passagem do intervalo de uma hora. Neste estudo foi evidenciada correlao positiva entre a durao da hora subjetiva e a temperatura central (Murphy e Campbell, 1996). No apenas as variveis endgenas, como a temperatura central, mas tambm o ambiente merece papel na modulao da estimativa da passagem de tempo ao longo do dia. A estimativa de intervalos de tempo de volunt-
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rios submetidos ao protocolo de isolamento temporal, sob iluminao ambiental de diferentes intensidades, positivamente correlacionada com a intensidade luminosa (Aschoff e Daan, 1997; Morita et al, 2007). Particularmente quanto estimativa de intervalos curtos de tempo, da ordem de segundos, e corroborando os resultados de Aschoff (1998), a estimativa de intervalos de 10 segundos por indivduos mantidos na mesma postura entre 09:00h e 21:00h mostrou correlao negativa com a temperatura central (Kuriyama et al, 2003). Em um protocolo similar, empregando rotina constante de 30 horas, Kuriyama et al (2005) tinham como objetivo caracterizar a variao diria na estimativa de tempo em situao de controle do ciclo viglia-sono. Os voluntrios deste estudo ficaram impedidos de dormir durante todo o experimento e os resultados mostraram que o ritmo de estimativa de tempo mantido mesmo sob uma condio de presso homeosttica do sono.
Consideraes Finais
A habilidade de perceber o tempo e de ajustar seu comportamento de acordo com os padres temporais do ambiente pode ser um requisito fundamental para o sucesso comportamental de um indivduo. A percepo da passagem do tempo um componente de muitos comportamentos complexos, alm do fato de uma ampla gama de organismos apresentarem comportamentos temporalmente controlados (Mattel e Meck, 2000). Do ponto de vista prtico, do cotidiano, um exemplo da importncia da preciso na estimativa de tempo o ato de atravessar a rua. Em termos bsicos, este comportamento compreende a determinao da frequncia da passagem de veculos e a sua velocidade relativa, o clculo da distncia entre um passeio e outro, o preparo postural para o incio da marcha e o gatilho do movimento (Lobjois e Cavallo, 2009). O estudo da estimativa de tempo est em sua infncia, em especial quanto s suas bases neurais e quanto interao entre este comportamento e o sistema de temporizao circadiano. Na perspectiva neurofisiolgica, a tendncia primordial dos futuros trabalhos est na demonstrao da especializao de subsistemas de temporizao e a sua relao com tarefas de estimativa de tempo com caractersticas e naturezas diversas, em especial quanto participao de reas envolvidas com controle cognitivo, como reas atencionais e mnemnicas, cuja participao seria dependente da durao do intervalo de tempo a ser estimado, conforme apontado por Lewis e Miall (2006). Ainda, alguns autores admitem que futuros experimentos devam ser conduzidos, visando estabelecer se o processamento da informao temporal realizado de forma contexto-dependente, resultando em mltiplos focos neurais de processamento ou se ocorre em centros especializados, ou relgios internos e independentemente do contexto (Coull et al, 2010; Ivry e Hazeltine, 1995). Diversos estudos apontam para uma variao diria no comportamento de estimativa de tempo (Aschoff, 1998; Campbell et al, 2001; Hinton e Meck, 1997; Spti e
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Agradecimentos
Agradeo aos Professores Doutores Luiz Menna-Barreto e Mario Pedrazzoli Neto pelo apoio na elaborao e pela reviso crtica do texto.
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DOI: 10.7594/revbio.09.03.15
Ensaio
Novo instrumento de aferio do ritmo de temperatura perifrica em humanos: um estudo de caso

New device for measuring peripheral temperature rhythm in humans: a case study
Daniela Wey
1
Departamento de Sade Ambiental, Faculdade de Sade Pblica, Universidade de So Paulo

Contato do autor: danicrono@gmail.com
Resumo. Pesquisas recentes indicam a temperatura do punho como um possvel marcador da fase do sistema circadiano humano. Neste estudo apresentamos resultados de um novo equipamento (ACT10) que monitora de forma contnua e em longo prazo a temperatura do punho e o ritmo de atividade/ repouso. Durante 48 h um sujeito adulto usou o ACT10 e outros sensores trmicos posicionados no punho (superfcie dorsal e ventral) axila e reto para monitorar sua temperatura. As diferenas nas acrofases das temperaturas do punho e retal podem ser explicadas pelo processo de termorregulao. Os resultados obtidos confirmam o uso do ACT10 como uma alternativa menos invasiva e confivel para aferir o status do sistema circadiano humano. Palavras-chave. Acrofase; atividade/repouso; temperatura do punho; temperatura retal; termorregulao. Abstract. Recent studies have considered wrist temperature as a possible phase indicator in human circadian system. The present study shows results of a new device ACT10 which provides longterm data and continuously measures wrist temperature and rest/activity rhythm. An adult man wore the ACT10 and other thermal sensors positioned in the wrist (dorsal and ventral superficies), axillar and rectal regions to monitor his temperature during 48 h. Differences in wrist and rectal temperature acrophases can be explained by the thermoregulation process. The results obtained confirm the use of ACT10 as a reliable and less invasive alternative to access the status of the human circadian system. Keywords. Acrophase; rest/activity; rectal temperature; thermoregulation; wrist temperature
Introduo
O funcionamento adequado de um ser vivo promovido pela organizao temporal de variveis fisiolgicas e/ ou comportamentais que se expressam numa sequncia que pouco se altera dia aps dia (Aschoff, 1976; Moore-Ede e col., 1976; Moore-Ede e col., 1982a). A gnese da organizao temporal dos ritmos biolgicos ao longo de um dia depende de um processo de acoplamento entre osciladores centrais e perifricos. O conjunto de neurnios localizados na regio anterior do hipotlamo, conhecido como ncleos supraquiasmticos (NSQs), constituem os osciladores circadianos centrais nos mamferos (Moore, 1992; Stephan e Zucker, 1972). Alm dos NSQs, expresso cclica de genes ligados gerao da ritmicidade circadiana j foi detectada em diversos rgos como fgado, corao, rim e pncreas (Albrecht e col., 2001; Balsalobre e col., 2000; Stokkan e col., 2001) (para uma reviso veja Schibler e col., 2003).
Variveis fisiolgicas e/ou comportamentais so geradas endogenamente e moduladas por ciclos ambientais (Aschoff, 1960). No caso da espcie humana, cuja atividade se concentra durante o dia e o repouso noite, observa-se que a temperatura central tambm apresenta uma variao ao longo do dia com valores mximos tarde e mnimos durante a noite e no incio da manh. Segundo a descrio feita por Hunter no final do sculo XVIII o ritmo de temperatura humana seria decorrente de diferentes estados de atividade (apud Moore-Ede e col., 1982b). A relao temporal estvel entre os ritmos endgenos de um organismo pode ser perdida diante de determinados desafios temporais, por exemplo, durante viagens transmeridiana ou trabalho noturno (Rea e col., 2008). Quando somos submetidos a um fuso horrio diferente a mudana de horrio social afeta a expresso rtmica de nossas variveis fisiolgicas. O ciclo viglia/sono e o ritmo da temperatura central esto temporalmente associados, no entanto, aps uma mudana de fuso horrio apresen-

tam diferentes velocidades de sincronizao (Moore-Ede e Sulzman, 1981). Os horrios de sono e viglia sincronizam-se mais rapidamente aos novos horrios sociais do que os horrios dos valores mximos e mnimos da temperatura central (Aschoff, 1976). Variveis biolgicas que se expressam de forma mais conservadora e pouco alteram suas fases (ou horrios) diante de desafios temporais so usadas como indicadores do status do sistema circadiano, entre as principais podemos citar alm da temperatura central, a melatonina e o cortisol (Kennaway e Van Dorp, 1991; Zulley e col., 1981). Os valores de temperatura central variam diariamente atravs de um processo complexo de termorregulao que envolve dois mecanismos de ajuste: o circadiano e o homeosttico (Aschoff, 1976). A variao circadiana na produo e perda de calor gerada endogenamente e nos indivduos saudveis, a temperatura central apresenta valores em torno de 36 C com uma pequena variao de 1 C, dependendo da hora do dia (Kruchi e Wirz-Justice, 1994; Zulley e col., 1981). O ajuste homeosttico ocorre no sentido de preservar os valores de temperatura corporal em relao s variaes da temperatura ambiente (Moore-Ede e col., 1982b). O registro da temperatura central, feita na regio retal, requer um cuidadoso controle da posio do termistor e no muito fcil conseguir voluntrios para pesquisas de campo, sobretudo quando a coleta acontece por muitas semanas (Motohashi e col., 1987). Com o intuito de minimizar o desconforto e aumentar a adeso de voluntrios em estudos de campo, nosso grupo (Areas e col., 2006; Wey e col., 2012) e de outros pesquisadores (Harper-Smith e col., 2010; Marken-Lichtenbelt e col., 2006; Sarabia e col., 2008) testaram o uso de diferentes tipos de sensores de temperatura em outras regies do corpo. Os valores de temperatura na pele (ou perifrica) so distintos temporalmente dos valores de temperatura central (Kruchi e Wirz-Justice, 1994). Durante o dia, quando a temperatura do ambiente aumenta, o nosso corpo reduz a produo de calor e aumenta sua dissipao atravs de um processo conhecido como termlise. Durante a noite, a temperatura do ambiente diminui, a produo de calor ultrapassa a perda e, atravs da termognese, h um aumento na temperatura corporal (Kruchi, 2002). Neste artigo, apresentaremos os resultados obtidos da comparao entre a temperatura obtida no punho por um novo equipamento, o ACT10, e a temperatura obtida por outros sensores colocados em quatro locais do corpo (retal, axilar e regies ventral e dorsal do punho) de um voluntrio. Nossa proposta verificar se a medida obtida pelo ACT10 compatvel com as medidas obtidas em outros locais do corpo.
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de ao inoxidvel (espessura 1 mm) que fica em contato com a superfcie dorsal do punho. Alm do ACT10, mais quatro sensores trmicos (modelo YSI 400, R-Rui http://www.r-rui.com/product_en.asp?id=423) foram fixados com esparadrapo cirrgico (Micropore) em outras regies do corpo: na axila, no punho no dominante (superfcies dorsal e ventral) e no nus. A preciso dos sensores de 0,1 C com valores que variam entre 25 e 45 C. O sensor de temperatura do ACT10, bem como os sensores mdicos utilizados na coleta, so termorresistores com memria e foram programados para coletar a temperatura simultaneamente em intervalos de 1 min. Durante 48 h de coleta, o voluntrio seguiu sua rotina habitual, permaneceu em casa nas primeiras 24 h e, no dia seguinte, realizou algumas atividades fora de casa. No houve registro do tipo de atividade realizada em cada momento do dia. Os equipamentos foram retirados quando o voluntrio tomava banho e nos eventos de evacuao e mico.
Anlise dos dados

Os valores de temperatura aferidos por cada sensor foram analisados graficamente no sentido de verificarmos pontos discrepantes, resultantes da retirada dos termstores. Os valores discrepantes foram detectados e removidos atravs do clculo da mediana duas vezes a distncia entre os quartis para a srie de dados coletados. Em seguida, calculamos os valores mdios de temperatura a cada 10 min. Aplicamos o teste de Friedman e de concordncia estatstica Kendall (programa Statistica verso 6.0) srie temporal resultante, no sentido de verificarmos possveis diferenas entre os valores de temperatura aferidos em cada regio do corpo. O teste de Friedman uma alternativa no paramtrica ao teste de anlise de varincia para medidas repetidas (ANOVA) e o teste de concordncia estatstica Kendall um teste de correlao usado em amostras no paramtricas que compara medidas mltiplas. Por ltimo, submetemos a srie de dados ao mtodo cosinor (Nelson e col., 1979) para a obteno de parmetros rtmicos (acrofase, MESOR e amplitude). Este mtodo de anlise permite a construo de uma curva cossenide a partir da srie temporal atravs do mtodo dos quadrados mnimos. O perodo especificado em 24 h e a amplitude diferente de zero definida pela significncia estatstica (p<0,05). A acrofase a medida do tempo transcorrido entre um instante (fase) de referncia e a fase em que h uma maior probabilidade de ser encontrado o valor mais elevado de uma varivel, a partir da curva senoidal ajustada aos dados. O MESOR (Midline Estimating Statistic of Rhythm) o valor mdio da curva ajustada. A amplitude representa a distncia entre o valor mximo (ou mnimo) da curva ajustada e o MESOR (Marques e Menna-Barreto, 2003).
Metodologia Procedimento de coleta

Um voluntrio de 32 anos utilizou no punho no dominante um modelo de actmetro (ACT10 43 x 43 x 11 mm, 35 g) produzido pela Consultoria Eletrnica (www.cebrasil.com.br) com sensor interno de temperatura. O sensor interno se localiza prximo a uma chapa
Resultados
O voluntrio retirou os termstores trs vezes. A primeira retirada ocorreu entre 13 h 56 min e 14 h 06 min, a
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Wey: Temperatura do punho, retal e axilar: estudo de caso
segunda entre 22 h e 57 min e 23 h e a terceira entre 23 h 10 min e 23 h 42 min. Na figura 1 observamos a disperso dos valores de temperatura aferida nas cinco regies (valores mdios calculados a cada 10 min, como foi descrito no item anterior). Houve diferena significativa entre as medidas realizadas em diferentes regies do corpo (p<0,0001), no entanto o ndice de concordncia entre os valores de temperatura foi alto (Kendal = 0,85). Na figura 1, podemos observar que os valores mximos de temperatura registrados pelos sensores do ACT 10 e os posicionados na axila e superfcies ventral e dorsal do punho foram muito prximos. Por outro lado a disperso dos valores mnimos foi diferente entre os sensores. Os valores de mediana da temperatura regio dorsal do punho e do ACT10 so mais parecidos, pois o sensor do ACT10 fica posicionado na regio dorsal. O maior valor de mediana da temperatura foi observado para o sensor posicionado na regio retal. A temperatura coletada nas cinco regies apresentou ritmicidade significativa (p<0,0001) e os parmetros rtmicos esto representados na tabela 1. A acrofase da temperatura retal (ou temperatura central) aconteceu no final da tarde e para as demais medidas, as acrofases aconteceram durante a madrugada. Tomando como referncia a acrofase da temperatura retal, temos respectivamente a seguinte sequncia temporal: ventral ACT10 axilar dorsal. A temperatura retal apresentou uma amplitude menor e um MESOR de aproximadamente 36 C. A temperatura medida pelo ACT10 apresentou a maior amplitude e o menor valor de MESOR. Na figura 2, temos a disperso dos valores reais de temperatura aferidos pelos cinco sensores (A) e a disperso dos valores resultantes do mtodo cosinor (B). Durante o dia a temperatura retal apresenta valores mximos
Figura 2: (A) Valores reais de temperatura (a cada 10 min) aferidos pelo sensor do ACT10 (regio dorsal do punho) e pelos sensores posicionados no punho (dorsal e ventral) e nas regies axilar e retal. (B): Curvas ajustadas resultantes do mtodo cosinor.
enquanto que, para o mesmo momento, nas regies perifricas observamos os valores mnimos de temperatura. noite ocorre uma inverso, a temperatura retal mnima e os sensores localizados na pele detectam valores mais elevados. A diferena temporal no perfil destas curvas confirma as observaes contidas na tabela 1. A curva da temperatura retal est em antifase em relao s curvas obtidas para as outras regies do corpo.
Discusso e Concluses
No presente trabalho apresentamos os resultados obtidos para a temperatura do punho, retal e axilar de um sujeito que foi acompanhado por 48 h em condies de rotina habitual. As caractersticas observadas em cada uma das temperaturas aferidas assemelham-se s descries feitas sobre temperaturas medidas em diversas regies do corpo seja sob condies constantes (Kruchi e Wirz-Justice, 1994) e ou rotina habitual, como as pesquisas realizadas em nosso grupo (Areas e col. 2006, Wey e col. 2012). A opinio unnime entre estes pesquisadores a de que a temperatura obtida no punho pode ser usada como parmetro confivel para acessar o status do sistema circadiano ou avaliar as relaes temporais entre ritmos biolgicos. A temperatura medida em qualquer regio do corpo sofre modulao da temperatura do ambiente e tambm do tipo de atividade que realizamos (Moore-Ede e col., 1982b; Minors e Waterhouse 1984). Neste estudo de
Figura 1. Valores de mediana da temperatura obtida com o actmetro (ACT10) e com os demais sensores posicionados no punho (superfcie dorsal e ventral) e nas regies axilar e retal. Os intervalos entre quartis so representados por caixas e as linhas verticais representam os valores mximos e mnimos.
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Revista da Biologia (2012) 9(3) Sensores ACT10 Dorsal Ventral Axilar Anal Amplitude - EP (C) 1,59 - 0,11 1,14 - 0,09 1,29 - 0,07 1,28 - 0,08 0,57 - 0,02 Acrofase - EP (C) 03:32 - 00:17 04:08 - 00:18 03:07 - 00:13 03:56 - 00:15 17:06 - 00:08 MESOR - EP (C) 31,56 - 0,08 32,34 - 0,06 33,29 - 0,05 33,50 - 0,06 36,29 - 0,01
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Tabela 1. Parmetros rtmicos obtidos atravs do cosinor para os cinco sensores de temperatura. EP - erro padro.
caso, observamos uma diferena temporal e de valores nas temperaturas medidas nas regies retal, axilar e do punho (figs. 1 e 2). Considerando-se que o participante seguiu sua rotina habitual, os valores de temperatura retal apresentaram, ao longo das 24 h, uma menor disperso em torno da mdia do que os valores de temperaturas obtidas na pele (axila e punho). A temperatura medida em regies distais (ps, mos e coxas) geralmente atinge valores inferiores 36 C (Kruchi e Wirz-Justice, 1994). Quanto s diferenas temporais (tabela 1), nota-se que durante o dia os valores de temperatura retal so maiores do que a temperatura obtida em regies distais, como ps e mos, por causa de uma menor vasodilatao perifrica de calor nestas regies. noite, a temperatura central diminui enquanto que a temperatura de regies distais aumenta, pois ocorre uma maior vasodilatao perifrica (Kruchi e Wirz-Justice, 1994; Kruchi, 2002). O sensor do ACT10 registrou um valor de MESOR de aproximadamente 32 C similar ao valor obtido pelo sensor colocado na regio dorsal do punho e tambm aos valores obtidos na mesma regio em estudos prvios realizados pelo nosso grupo (Areas e col. 2006; Wey e col. 2012). O ACT10, alm de medir a temperatura do punho, realiza medidas de atividade, que podem ser usadas para inferir horrios de sono e viglia. Alguns autores j descreveram que o aumento na temperatura da pele, dentro de padres fisiolgicos, contribui para a reduo dos valores da temperatura central e aumenta a sonolncia (Kruchi e col. 1999 e 2000; Van Someren 2004). O aumento da temperatura perifrica associado a mudanas no padro de atividade de neurnios em reas do sistema nervoso que esto envolvidas com o controle do sono (Kruchi, 2007; Van Someren 2000 e 2004). A descrio combinada destas duas variveis (ciclo viglia/sono e ritmo de temperatura) poder contribuir para o entendimento de conflitos resultantes das relaes temporais entre ritmos biolgicos e horrios sociais.
figuras.
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Agradecimentos
Agradeo ao engenheiro Vincius Lanfranchi da Consultoria Eletrnica (CEBrasil www.cebrasil.com.br) pela coleta de dados e confeco do actmetro ACT10. O equipamento foi financiado com verba do projeto CEPID/FAPESP concedido ao Instituto do Sono/UNIFESP. Agradeo ao professor Luiz Menna-Barreto pela reviso do texto e a biloga Amanda de Oliveira Ribeiro pela edio das
ib.usp.br/revista
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Wey: Temperatura do punho, retal e axilar: estudo de caso
de So Paulo, 3 edio, 361-68. Minors D, Waterhouse J. 1984. The use of constant routine in unmasking the endogenous component of human circadian rhythm. Chronobiology International 01(03):205-16. Moore-Ede MC, Schmelzer WS, Kass DA, Herd JA. 1976. Internal organization of the multicelular animals. Physiological and Biochemical Aspects of Circadian Rhythms. Federation Proccedings 35(12):2333-2338. Moore-Ede MC, Sulzman FM. 1981. Internal temporal order. In: Aschoff J, editor. Handbook of behavioral neurobiology. Biological Rhythms. New York: Plenum Press 215-241. Moore-Ede MC, Sulzman FM, Fuller CA. 1982a. Organization of the Circadian Timing System. In: Moore-Ede MC, Sulzman FM, Fuller CA, editors. The clocks that time us. Cambridge, Harvard University Press 113-151. Moore-Ede MC, Sulzman FM, Fuller CA. 1982b. Circadian timing of physiological system. In: Moore-Ede MC, Sulzman FM, Fuller CA, editors The clocks that time us. Cambridge, Harvard University Press 201-298. Moore RY. 1992. The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system. Discussion in Neuroscience: circadian rhythms 08(2/3): 26-33. Motohashi Y, Reinberg A, Levi F, Nougier J, Benoit O, Foret J, Bourdeleau P. 1987. Axilary temperature a circadian marker rhythm for shift workers. Ergonomics 30(09):12351247. Nelson W, Tong YL, Lee JK, Halberg F. 1979. Methods for cosinor-rhythmometry. Chronobiologia 06:305-23. Rea M, Bierman A, Figueiro MG, Bullough JD. 2008. A new approach to understanding the impact of circadian disruption on human health. Journal of Circadian Rhythms 6(07). Sarabia JA, Rol MA, Mendiola P, Madrid JA. 2008. Circadian rhythm of wrist temperature in normal-living subjects - A candidate of new index of the circadian system. Physiology & Behavior 95:570-580. Schibler U, Ripperger J, Brown SA. 2003. Peripheral Circadian Oscillators in Mammals: Time and Food. Journal of Biological Rhythms 18:250-260. Stephan FK, Zucker I. 1972 Circadian rhythms in drinking behavior and locomotor activity of rats are eliminated by hypothalamic lesions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 69:1583-1586. Stokkan KA, Yamazaki S, Tei H, Sakaki Y, Menaker M. 2001. Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science 291:490-493. Van Someren EJW. 2000. More than a marker: interaction between the circadian regulation of temperature and sleep, age-related changes, and treatment possibilities. Chronobiology International 17(03):313-54. Van Someren EJW. 2004. Sleep propensity is modulated by circadian and behavior-induced changes in cutaneous temperature. Journal of Thermal Biology 24:437-444. Wey D, Bohn A, Menna-Barreto L. 2012. Daily rhythms of native Brazilians in summer and winter. Physiology & Behavior 105: 613620. Zulley J, Wever R, Aschoff J. 1981. The dependence of onset and duration of sleep on the circadian rhythm of rectal temperature. Pflgers Archiv European Journal of Physiology 391:314-318.
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Volume 9(3)

Volume 9(3) Publicado em dezembro de 2012

Principais Genes e Protenas do Relgio Biolgico

Investigando a sincronizao ftica na natureza

Efeitos das variaes de temperatura ambiental em ritmos circadianos

Gentica molecular dos ritmos circadianos em insetos vetores

Period3: um gene relacionado com a sincronizao de ritmos circadianos pela luz

Fotopigmentos e arrastamento ftico

As protenas de relgios e o eixo hipotlamo-hipfise-gonadal de fmeas de roedores 41

Cronobiologia vegetal: aspectos fisiolgicos de um relgio verde

Ritmos de populaes: o caso das abelhas sem ferro

O valor biolgico do perodo circadiano

Gnese e ontognese do ritmo de sono/viglia em humanos

Interao entre sincronizadores fticos e sociais: repercusses para a sade humana 68

Novo instrumento de aferio do ritmo de temperatura perifrica em humanos: um estudo de caso 80

Revista da Biologia (2012) 9(3): 16

Diurnos ou Noturnos? Discutindo padres temporais de atividade

Departamento de Fisiologia, Instituto de Biocincias, Universidade de So Paulo

Tomotani & Oda: Diurnos ou noturnos? Discutindo padres temporais de atividade

Revista da Biologia (2012) 9(3)

Diferenas entre animais diurnos e noturnos

Mecanismos de mudana de fase de atividade

Tomotani & Oda: Diurnos ou noturnos? Discutindo padres temporais de atividade

Mudanas do campo para o laboratrio

Revista da Biologia (2012) 9(3)

Contribuio dos autores

Tomotani & Oda: Diurnos ou noturnos? Discutindo padres temporais de atividade

Revista da Biologia (2012) 9(3): 712

Investigando a sincronizao ftica na natureza

Departamento de Fisiologia, Instituto de Biocincias, Universidade de So Paulo

Flres: Investigando a sincronizao ftica na natureza

trudo, com base nos novos elementos apresentados ao longo do texto.

A importncia dos crepsculos

Revista da Biologia (2012) 9(3)

Arrastamento em condies naturais Modulao da exposio pelo comportamento

Flres: Investigando a sincronizao ftica na natureza

tempo (hora do dia)

o ritmo permanece sincronizado, apesar das diferenas de exposio.

Esquilos voadores light-sampling e arrastamen-

Revista da Biologia (2012) 9(3)

Outros eventos ambientais

O caso do esquilo de solo arrastamento sem crepsculos

Modulao da exposio luz pelas aferncias

Flres: Investigando a sincronizao ftica na natureza

Revista da Biologia (2012) 9(3): 1318

Efeitos das variaes de temperatura ambiental em ritmos circadianos

Departamento de Fisiologia, Instituto de Biocincias, Universidade de So Paulo

Tachinardi: Efeitos das variaes de temperatura ambiental em ritmos circadianos

Compensao do perodo intrnseco () a variaes de temperatura

Revista da Biologia (2012) 9(3)

Sincronizao por ciclos de temperatura: arrastamento

Mecanismos da compensao de a variaes de temperatura

Tachinardi: Efeitos das variaes de temperatura ambiental em ritmos circadianos

Outra forma de sincronizao por ciclos de temperatura: mascaramento

Hipteses sobre mecanismos do arrastamento por ciclos de temperatura

Revista da Biologia (2012) 9(3)

Modulao pela temperatura de ritmos sincronizados pelo ciclo de claro-escuro

Tachinardi: Efeitos das variaes de temperatura ambiental em ritmos circadianos

Revista da Biologia (2012) 9(3): 1925 DOI: 10.7594/revbio.09.03.04

Gentica molecular dos ritmos circadianos em insetos vetores

Recebido 18out10 Aceito 20mar12 Publicado 27dez12

Rivas: Gentica dos ritmos em insetos

Gentica dos ritmos circadianos em insetos vetores