LEISHMANIOSE: RESPOSTA IMUNE E MECANISMOS ANTIOXIDANTES DE ESCAPE

Leishmaniasis: immune response and antioxidants mechanisms of evasion

Pedro Roosevelt Torres Romo, PhD; 1Renata de Oliveira Dias, graduao em Cincias Biolgicas, 2Keith Karen Cruz, graduao em Cincias Biolgicas, 2Flvia Carina de Souza Marques, graduao em Medicina & 3Marta Chagas Monteiro, PhD. 1Laboratrio de Imunologia e Mutagnese, Unidade Acadmica de Cincias da Sade, Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000, Cricima/SC. 2 Laboratrio de Imunoparasitologia, Universidade do Sul de Santa Catarina, 88704-900, Tubaro/ SC. 3Universidade Estadual do Centro-Oeste, Departamento de Farmcia, Av. Simeo Camargo Varela de S, n 03, 85040-060, Guarapuava/PR.
1*

*Endereo para correspondncia: Laboratrio de Imunologia e Mutagnese, Unidade Acadmica de Cincias da Sade, Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000, Cricima, SC.

Resumo
Diferentes espcies de parasitas pertencentes ao gnero Leishmania so importantes causas de mortalidade e morbidade em reas tropicais e subtropicais. Dependendo da espcie do parasita e da resposta imune desenvolvida pelo hospedeiro, a infeco causa um espectro de doena que varia de leses autocicatrizantes a infeces disseminadas e fatais. Em modelo de infeco experimental com Leishmania major, linhagens de camundongos normalmente resistentes conseguem curar a leso espontaneamente. A resistncia depende da gerao de uma resposta Th1, com produo de IL-12, IFNg e TNF-a e conseqente induo da xido ntrico sintase tipo 2 (iNOS) em macrfagos infectados. Contrariamente, camundongos suscetveis BALB/c desenvolvem leses progressivas e infeco disseminada mediada pelo desenvolvimento de uma resposta Th2 com secreo de citocinas, como IL-4 e IL-10. Alm do tipo de resposta Th1 ou Th2 estabelecido em reao aos antgenos de Leishmania, outros fatores, como variao gentica e condio nutricional, podem influenciar a capacidade do hospedeiro em controlar a infeco. Entre os fatores de virulncia intrnsecos ao parasito, est sua

capacidade de escapar ao estresse oxidativo no interior de macrfagos ativados. Em Leishmanias, ambos os sistemas antioxidantes glutationa e tripanotiona/ tripanotiona redutase esto envolvidos na proteo contra os efeitos txicos do xido ntrico.

Palavras-chave : Leishmania. Leishmaniose. Parasita. Evaso. Resposta Imune. Abstract

Different species of intracellular parasites belonging to genus Leishmania cause significant morbidity and mortality in tropical and subtropical areas. Depending on the species involved and on the host immune response, the infection causes a spectrum of diseases ranging from self-healing ulcers to disseminated and often fatal infection. In experimental infection with Leishmania major resistant mouse strains normally heal lesions spontaneously. This resistance depends on the generation of a Th1 response with essential production of IL-12, IFN-g and TNF-a with consequent induction of inducible nitric oxide synthase 2 (iNOS) in the infected

macrophages. Conversely, susceptible BALB/c mice infected with L. major develop an uncontrolled lesion, followed by disseminated infection mediated by the development of a Th2 response with secretion of cytokines such IL-4 and IL-10. Besides Th1 or Th2 hosts immune response developed in response to Leishmania antigenes, others hosts factors such as genetic variations and nutritional conditions can influence the capacity of infected host to control the infection. Between the virulence factors intrinsec to parasites are their capacity to evade the oxidative stress inside macrophages. In Leishmanias, both antioxidant systems, glutathione and trypanothione/ trypanothione reductase are involved in protection of parasites against the toxic effect of nitric oxide.

Formas clnicas da doena e epidemiologia

Protozorios do gnero Leishmania so responsveis por um grupo de doenas cujos sintomas variam de leso cutnea, em muitos casos autocicatrizantes, a infeces viscerais freqentemente fatais se no tratadas adequadamente. As Leishmanioses so endmicas em 88 pases e a populao sob risco de infeco estimada em 350 milhes de pessoas. Segundo estimativas da Organizao Mundial da Sade (OMS), a prevalncia mundial de 12 milhes de pessoas infectadas, com uma incidncia anual de dois milhes de novos casos (Desjeux, 1999). No Novo Mundo, a Leishmaniose pode ser dividida em dois grupos principais: Leishmaniose Visceral Americana (LVA) e Leishmaniose Cutnea Americana (LCA) (Grimaldi & Tesh, 1993). A ltima inclui a forma cutnea (LC), mucocutnea (LM) e cutnea difusa (LCD). A LVA geralmente causada por Leishmania chagasi ( L. chagasi ), embora, ocasionalmente, a Leishmania amazonensis tenha sido isolada de pacientes com a forma visceral da doena (Barral et al., 1991). Do mesmo modo, a L. chagasi tem sido associada a manifestaes cutneas com ausncia de envolvimento visceral (Oliveira Neto et al., 1986). Em contraste, a LCA geralmente causada por espcies pertencentes aos complexos de L. braziliensis ou L. mexicana. Porm, alguns casos de LCA ocorridos no Brasil (Momen et al., 1985), Equador e Venezuela (Hashiguchi et al., 1991) tm sido associados a um parasito similar a L. major do Velho Mundo. A LC (forma ulcerativa, autocicatrizante) tem sido associada a todas as espcies dermatotrpicas do Novo Mundo. Em contraste, a LCD (forma no ulcerativa, progressiva, anrgica) tem sido observada somente com espcies do complexo de L. mexicana. A forma LM (ulcerativa invasiva hiperrgica) mais freqentemente associada a L. braziliensis (Grimaldi et al., 1989), mas L. panamensis (Saravia et al., 1985), L. guyanensis (Santrich et al., 1990), e membros de L. mexicana (Barral et al., 1991) podem causar formas mutilantes da doena. A LVA mundialmente uma das doenas emergentes de maior relevncia, causando at 98% de mortalidade em pacientes no tratados (Tesh, 1995). Nos ltimos 19 anos, 48.455 casos de leishmaniose visceral foram notificados no Brasil

Keywords: Leishmania; leishmaniasis; oxidative

stress; glutathione; trypanothione.

Introduo
As doenas negligenciadas, embora afetem milhares de pessoas ao redor do mundo, ainda no dispem de tratamentos eficazes ou adequados. Em sua maioria, so doenas tropicais infecciosas que atingem principalmente pessoas pobres, a exemplo da Leishmaniose. H um grande volume de trabalhos cientficos dedicados biologia, imunologia e gentica dos parasitas causadores dessas doenas, porm no se consegue reverter todo esse conhecimento em novas ferramentas teraputicas para as pessoas afetadas. A razo para que isso acontea que quem sofre de doenas negligenciadas possui baixo poder aquisitivo e no oferece um retorno lucrativo suficiente para que a indstria farmacutica invista em pesquisa e desenvolvimento de novos medicamentos voltados a esse fim. Nesta reviso, os autores faro consideraes a respeito da biologia dos parasitos e seus mecanismos de subverso resposta imunolgica do hospedeiro ou aos efeitos citotxicos dos frmacos.

(Brasil, 2003). Estima-se que, em todo o mundo, ocorram dois milhes de novos casos de LTA a cada ano e que 10% da populao mundial estejam sob risco de infeco (Roberts et al., 2000).

Transmisso e ciclo de vida da Leishmania

O gnero Leishmania possui um ciclo de vida do tipo heteroxnico, vivendo alternadamente em hospedeiros vertebrados, e insetos vetores. No tubo digestivo de vetores invertebrados, so encontradas as formas promastigotas infectantes (formas alongadas e com flagelos), enquanto em hospedeiros vertebrados (mamferos) so encontradas as formas amastigotas (arredondadas e sem flagelo aparente), no interior de clulas como macrfagos (Muller & Baker, 1990; Titus et al., 1994), clulas de Langerhans (Blank et al., 1993), neutrfilos e eosinfilos (Grimaldi et al., 1984; Beil et al., 1992). No Novo Mundo (Amricas), as Leishmanias so transmitidas ao homem geralmente por fmeas do gnero Lutzomyia. No Velho Mundo (Europa, frica e sia), tais vetores pertencem ao gnero Phlebotomus (Killick-Kedrick, 1990). Ao picar um hospedeiro vertebrado infectado, no momento do repasto sangneo, a fmea do vetor ingere clulas parasitadas com for mas amastigotas contidas no tecido do hospedeiro vertebrado. No intestino do vetor, as clulas se rompem e as formas amastigotas liberadas se diferenciam em formas promastigotas, as quais sero transmitidas para um hospedeiro mamfero no infectado. Durante um novo repasto sangneo, a fmea infectada ir regurgitar as formas promastigotas, juntamente com a sua saliva, dentro da pele do hospedeiro vertebrado (Schlein et al., 1992). No hospedeiro vertebrado, essas formas infectaro rapidamente clulas do sistema fagoctico, diferenciando-se em formas desprovidas de flagelo a chamadas de amastigotas (Chang et al., 1990). Essas formas amastigotas sobrevivem e se replicam por diviso binria no ambiente cido do fagolisossomo. medida que as formas amastigotas vo se multiplicando, as clulas infectadas so lisadas e as formas amastigotas so

liberadas a fim de parasitar novas clulas (Mosser & Brittingham, 1997). Embora a infeco inicial possa no resultar em sintomas clnicos, o parasitismo intracelular da Leishmania no organismo pode persistir num curso crnico localizado ou difundido para tecidos mucocutneos ou rgos viscerais, resultando na doena propriamente dita (WHO, 1990). Em termos imunolgicos, a doena crnica pode estar associada exacerbao ou completa anergia da resposta imune do hospedeiro, resultando, assim, na incapacidade do hospedeiro em controlar a infeco (Foli et al., 1995).

A importncia da saliva do vetor no processo inflamatrio e a modulao da resposta imune

De maneira geral, a saliva do inseto vetor muito importante no processo inflamatrio, visto que a mesma apresenta componentes associados vasodilatao, inibio da agregao plaquetria e coagulao sangnea, o que aumenta o fluxo sangneo e possibilita a alimentao do inseto (Ribeiro, 1987). Vrias investigaes j demonstraram que o lisado da glndula salivar dos vetores do gnero Lutzomyia e Phlebotomus acentuam a infeco com Leishmania major, L. mexicana, L. braziliensis e L. donovani em modelos animais (Samuelson et al., 1991; Theodos et al., 1991). Alm disso, foi demonstrado que componentes imunossupressores presentes na saliva inibem o desenvolvimento da resposta imune contra o parasita, facilitando o estabelecimento da infeco (Ribeiro et al., 1989). Vrios mecanismos tm sido propostos para explicar a ao imunossupressora da saliva: 1) reduo da capacidade de produo de xido ntrico, perxido de Hidrognio (H2O2) e apresentao de antgeno por macrfagos infectados (Hall & Titus, 1995; Titus & Ribeiro, 1990; Theodos & Titus, 1993); 2) induo da produo de IL-4 por linfcitos em animais infectados (Lima & Titus, 1996); 3) inibio do desenvolvimento da resposta Th1 (Mbow et al., 1998) e 4) reduo da expresso de molculas coestimulatrias, como B7-1/B7-2 ou CD40, nas clulas apresentadoras de antgenos (APCs) (Theodos & Titus, 1993).

Papel de citocinas e xido ntrico na Leishmaniose

Para um melhor entendimento de infeces humanas e mecanismos imunolgicos e/ou genticos de resistncia frente a parasitas intracelulares como Leishmania, tm sido utilizados modelos de infeces experimentais com diferentes linhagens de camundongos. As diferentes linhagens utilizadas so capazes de mimetizar a infeco humana. Quando camundongos suscetveis da linhagem BALB/c so infectados com L. major, eles apresentam doena progressiva e visceralizante (Scott & Scharton, 1994; Fonseca et al., 2003). Entretanto, camundongos das linhagens C57BL/6, C3H/HeJ e CBA so capazes de controlar a infeco por L. major (Fonseca et al., 2003). O perfil de resistncia infeco por L. major est associado ao desenvolvimento de uma resposta tipo Th1 (linfcito T helper tipo I), enquanto o padro de susceptibilidade decorrente de uma resposta Th2. A entrada do protozorio na pele do hospedeiro vertebrado atravs da picada do vetor infectado provoca uma reao inflamatria local na tentativa de estabelecer a homeostasia. A importncia dessa resposta inflamatria, que se desenvolve logo aps a infeco por Leishmania spp., durante o processo de evoluo da doena, no est esclarecida. Lima e colaboradores (1997) demonstraram que, na fase inicial da infeco por L. major, os neutrfilos so importantes para controlar a disseminao do parasito. Nesse sentido, demonstrou-se que os eosinfilos ativados so capazes de produzir NO e matar formas amastigotas de L. major (Oliveira et al., 1998). Atualmente, nosso grupo est investigando o efeito imunomodulatrio dos mastcitos em modelo animal de Leishmaniose cutnea. A incapacidade dos camundongos BALB/c em controlar a infeco est relacionada com a produo de interleucina-4 (IL-4) (Heinzel et al., 1993; Sypek et al., 1991; Launois et al., 1995; Mattner et al., 1996; Kopf et al., 1996; Himmelrich et al., 2000) e IL-13 (Matthews et al., 2000). Contrariamente, a capacidade de resolver a infeco (camundongos C57BL/6) parece ser dependente de IL-12, IL-18 e interferon-g (IFN-g). Nesse sentido, foi demonstrado que a IL-18 e a IL-12 atuam sinergicamente, influenciando o desenvolvimento de clulas Th1 por meio da regulao positiva sobre os

receptores para IL-12 e IL-18, respectivamente (Xu et al., 1998; Wei et al., 1999). No entanto, a IL-18 parece no ser fundamental para o desenvolvimento da resposta tipo Th1. Em tal contexto, verificou-se que o tratamento de camundongos BALB/c infectados com L. major com IL-18 recombinante no modificou o fentipo de doena tpico dos animais. Alm disso, na presena de IL-4, a IL-18 induz a produo de citocinas do padro Th2 (Xu et al., 2000). Apesar do modelo de resistncia e susceptibilidade infeco por L. major parecer muito simples inicialmente, a produo de IL-12 ou IL-4 no implica resistncia ou susceptibilidade. Na verdade, camundongos BALB/c so capazes de produzir IL-12 no primeiro dia aps a infeco por L. major. Essa produo, inesperadamente, foi igual ou at maior que aquela gerada por camundongos resistentes (Scharton-Kersten et al., 1995). A expresso diferencial do receptor para IL-12 importante para a manuteno e o desenvolvimento da resposta Th1 protetora (Hondowicz et al., 2000). Nesse sentido, IL-4 modula negativamente a expresso desse receptor em clulas de linfonodo de camundongos BALB/c (Jones et al., 1998; Himmelrich et al., 2000). Atualmente, sabe-se que o xido Ntrico (NO) efetivo contra vrios patgenos, incluindo T. cruzi (Gazzinelli et al., 1992), T. musculis (Vincendeau & Dalaude, 1991), M. avium (Denis, 1991), M. leprae (Adams et al., 1991), Toxoplasma gondii (Adams et al., 1990), Candida albicans (Cenci et al., 1993) e L. major (Green et al., 1990; Liew et al., 1990). O NO sintetizado a partir da oxidao do tomo de nitrognio guanidnico terminal da L-arginina (Palmer et al., 1988; Sakuma et al., 1988) por ao da enzima xido-ntrico-sintase induzida (iNOS). As citocinas so importantes moduladoras da expresso da iNOS. De uma maneira geral, citocinas do perfil Th1 induzem a iNOS (Drapier et al.,1988), enquanto as do padro Th2 inibem a sua induo (Nelson et al., 1991; Cunha et al., 1992; Gazzinelli et al., 1992). Especificamente em relao Leishmaniose, macrfagos peritoneais de camundongos estimulados in vitro com IFN-g, em presena de lipopolissacardio (LPS), liberam grandes quantidades de NO e destroem o parasito eficientemente. Alm disso, formas promastigotas de L. major so destrudas quando incubadas na presena de doador de NO, S-Nitroso-N-Acetil-D, L-penicilamina SNAP. Essa atividade leishmanicida inibida de

maneira dose-dependente pelo tratamento com LNMMA (anlogo da L-arginina) (Liew et al., 1990). In vivo, vrias evidncias correlacionam a produo de NO com o controle da infeco (Wei et al., 1995; Stenger et al., 1996).

Evaso do parasita ao sistema imune por mecanismos dependentes de glutationa e tripanotiona/tripanotiona redutase
As manifestaes clnicas da Leishmaniose e sua severidade, que variam de leses localizadas autocicatrizantes a infeces viscerais potencialmente fatais, dependem da espcie e dos fatores intrnsecos ao parasito infectante, como, por exemplo, o desenvolvimento de resistncia a antimoniais (Mukhopadhyay et al., 1996; Hadighi et al., 2006; Rojas et al., 2006) e do perfil de resposta imune induzido no hospedeiro infectado (Malla & Mahajan, 2006). Atualmente, no existe vacina protetora adequada contra infeces por tripanossomatdeos. Embora os antimoniais pentavalentes, como o estibogluconato de sdio e o antimoniato de meglumina, continuem sendo as principais drogas utilizadas no tratamento das Leishmanioses, tm sido descritas cepas de Leishmania resistentes ao tratamento antimonial e casos de pacientes refratrios ao tratamento (Mukhopadhyay et al., 1996; Molyneux, 1997; Rodrigues et al., 2006; Rojas et al., 2006; Singh, 2006). Com relao ao mecanismo de ao, foi proposto que esses quimioterpicos atuam no parasito pela induo do efluxo de glutationa (GSH) e tripanotiona (T[SH]2) e a inibio da atividade da enzima tripanotiona redutase (TryR) (Wyllie et al., 2004). Desse modo, uma das prioridades na rea de pesquisa em doenas tropicais tem sido a identificao e caracterizao de biomolculas parasito-especficas que possam ser exploradas como alvo molecular ou quimioterpico de ataque seletivo (Dumas et al., 1997; Tovar et al., 1998; Castro-Pinto et al., 2004). A glutationa (GSH) um abundante antioxidante que tem sido relacionado com a proteo celular. Os tripanossomatdeos como a Leishmania mantm o balano de xido-reduo (redox) por um mecanismo singular, pois so desprovidos de

glutationa redutase que, na maioria dos outros organismos, responsvel pela manuteno de um ambiente intracelular redutor/protetor dependente de GSH. Em substituio, eles possuem um sistema antioxidante baseado em tripanotiona (T[SH]2; duas molculas de GSH ligadas por uma unidade de espermidina) como principal til reduzido (Fairlamb et al., 1985; Fairlamb & Cerami, 1992). Juntamente com trs outras xido-redutases, tripanotiona redutase (TryR), tryparedoxin (TryX) e triparedoxin peroxidase (TryP) (Nogoceke et al., 1997; Ariyanayagam & Fairlamb, 2001), a T[SH]2 responsvel pela defesa contra oxidantes, metais pesados (Mukhopadhyay et al., 1996) e xenobiticos (Fairlamb & Cerami, 1992). A tripanotiona mantida em sua forma reduzida pela enzima tripanotiona redutase (TryR), de modo que a TryR exerce um papel central na proteo de Leishmania spp. contra espcies reativas derivadas do oxignio e nitrognio (produzidos pelo hospedeiro) por meio da reciclagem de tripanotiona oxidada (Dumas et al., 1997; Tovar et al., 1998; Romo et al., 2006). Desse modo, uma funo fisiolgica vital tem sido descrita para a TryR na manuteno dos nveis de T[SH]2, particularmente no interior de clulas do hospedeiro, sob condies altamente oxidantes geradas durante a resposta de defesa. Estudos realizados em nosso laboratrio demonstram que a GSH protege L. major da morte mediada pelo NO (Romo et al., 1999). Comparando os nveis do antioxidante GSH de diferentes espcies de Leishmania (L. amazonensis, L. braziliensis, L. donovani e L. major) com a sensibilidade dos parasitos ao NO, ns verificamos que o grau de resistncia das diferentes espcies de Leishmania ao NO correlacionou-se inversamente com os nveis de GSH, mas no com o nvel de til total (Romo et al., 2006). Quando investigamos a funo da TryR na proteo contra o NO, usando mutantes de L. donovani para o gene da trypanotiona redutase (tryR), verificou-se que em comparao aos parasitos wildtype, o clone expressando apenas uma cpia do alelo tryR foi significantemente mais sensvel aos efeitos citotxicos do NO (Romo et al., 2006).

Concluses
O controle da infeco causada por Leishmania depende no s do tipo de resposta imune desenvolvida no hospedeiro infectado, mas tambm de fatores que so determinantes para a virulncia dos parasitos, como sua capacidade de seqestrar e neutralizar intermedirios reativos derivados do oxignio e nitrognio e ainda a aquisio de resistncia a antimnios pentavalentes. O estudo detalhado desses sistemas antioxidantes e, talvez, a inibio especfica dessas vias de proteo podem propiciar o desenvolvimento de novos frmacos ou vacinas que podero auxiliar no futuro controle dessa infeco.

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