CUANTIFICACIN DE PROTENAS, MTODO DE BIURET.

INTRODUCCIN Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas constituyentes de los seres vivos (biomolculas). Prcticamente todos los procesos biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo de molculas (Berg et al, 2008). Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para muchos otros propsitos. Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes (Segal, 2005).

La reaccin de biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la formacin de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen ms de un enlace peptidico, como las proteinas (Cambell et al, 2006):

Figura 1: Reaccin de Biuret.

La curva de patrn es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementos de concentracin conocida. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar (la concentracin). Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva patrn, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentracin (Harris, 2003)

OBJETIVO GENERAL Aplicar un mtodo colorimtrico para determinar la concentracin de protena en una muestra problema. OBJETIVOS PARTICULARES Aprender el manejo del espectrofotmetro y su aplicacin en los mtodos colorimtricos. Aprender el empleo de una curva patrn para la determinacin de la cantidad de molculas presentes en una muestra, en este caso de protenas. Determinar la concentracin de protenas en una muestra de leche, utilizando el mtodo de Biuret. HIPTESIS Si se mide la absorbancia a 540 nm de una muestra coloreada con el reactivo de Biuret sta ser proporcional a la concentracin de protena de dicha muestra.

MATERIAL Y MTODO Primero, se dispuso a tomar la casena y macerar con ayuda de un mortero con pistilo, despus se peso para ocupar 0.1g para una solucin de 1:10, al no

disolverse bien se le agregaron gotas de hidrxido de sodio hasta llegar a la homogenacin deseada, tambin se realizo la solucin de leche 0.05ml para una solucin 1:20 y se disolvieron en agua; Al mismo tiempo se calentaba agua hasta llegar a una temperatura de 500C a 550C. A continuacin, se separaron 24 tubos de ensaye en dos grupos de 12 A y B los seis primeros se utilizaron para obtener la curva patrn y los otros seis para obtener la curva problema esto en los dos grupos, el tubo 1 se ocup como blanco, al tubo 2 0.1ml, al 3 0.2ml, al 4 0.4ml, al 5 0.8ml, al 6 1.0ml de albumina srica bovina (BSA) con concentracin de 10 mg/ml, respectivamente. En seguida, los tubos 7 con 0.25ml y 8 con 0.5ml de casena, el 9 con 0.25ml y el 10 con 0.5ml de sobrenadante, el 11 con 0.25 ml y el 12 con 0.5ml de leche diluida, (todo esto obtenido en la prctica anterior); a todos los tubos se les agrego Cloruro de Sodio al 0.9% con diferente cantidad de 2.9ml al 2, 2.8ml al 3, 2.6ml al 4, 2.2ml al 5 y 2ml al 6. Para tener una solucin de 3ml y reactivo de Biuret con la misma cantidad de 3 ml, as logramos una solucin de 6ml, se homogenizo la solucin por medio de un agitado tipo vortex. (Solamente al tubo 1 se le agregaron 3 ml de reactivo de biuret y 3 ml de NaCl) Despus de tener todos los tubos con la solucin se colocaron en un vaso de precipitados de 1000 ml con agua caliente y se dejaron durante 10 minutos aproximadamente (hasta lograr tonalidades de azul cielo a violeta), al termino del tiempo se colocaron en agua a temperatura ambiente, hasta lograr que se enfriara la solucin. Posteriormente se realizo la cuantificacin de la solucin por medio de un espectrofotmetro a 540 nm de los tubos A y B, entre cada medicin se lavaban las celdas; al tener todas las mediciones se dispuso a realizar la curva obtenida.

RESULTADOS Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotmetro a 540 nm para cada una de las 12 soluciones se muestran a continuacin (solamente se muestran los tubos A y no los duplicados):

Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras. Absorbancia a 540 nm 3 ml NaCl, 0 Blanco 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 1 0.034 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 2 0.071 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 0.142 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 8 0.277 1 ml BSA y 2 ml NaCl 10 0.345 0.25 ml casena y 2.75 ml NaCl ? 0.079 0.5 ml casena y 2.5 ml NaCl ? 0.198 0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl ? 0.221 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl ? 0.240 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl ? 0.044 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl ? 0.068 *A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret. Solucin * Protena (mg)

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Con los valores de la tabla anterior, tubos dos a seis, se realiz la grfica 1, de la curva patrn de protena, obtenida por el mtodo de regresin lineal de mnimos cuadrados; donde las abscisas (x) representan la concentracin en mg de protena, y las ordenadas (y) los valores de la absorbancia de cada concentracin.

0.35

0.3

y = 0.0344x + 0.0017 R = 0.9998

Absorbancia a 540 nm

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Proteina (mg) Figura 2: Curva patrn de protena.

La determinacin de la cantidad de protena en las muestras problema, tubos siete a doce, se obtuvo con el valor de la absorbancia obtenida por el espectrofotmetro para cada muestra (tabla 1), mediante la interpolacin de estos valores en la curva patrn (figura 3) y despejado los valores respectivos de x de la ecuacin de la recta (y= mx + b) tal como se muestra a continuacin (tabla 2):

Figura 3: interpolacin de los valores de absorbancia de las muestras problemas en la curva patrn. De acuerdo a la figura anterior, la cantidad aproximada de protena en las muestras problema, de la siete a la doce, seria: 2.35, 5.7, 6.2, 6.9, 1.05 y 1.9 mg, respectivamente. La determinacin de la cantidad de protena en las muestras problema despejando los valores de x de la ecuacin de la recta (y = 0.0344X +0.0017) quedara:

Tabla 2: determinacin de la cantidad de protena utilizando la ecuacin de recta. Tubo No. Absorbancia (y) a 540 nm Protena (mg)
7 8 9 10 11 12 0.079 0.198 0.221 0.240 0.044 0.068 2.218 5.706 6.375 6.927 1.229 1.927

Tomando en cuenta los factores de disolucin, por cada mililitro de muestra se obtiene la siguiente tabla: Tabla 3: Concentracin de protena en las muestras problema. Tubo No. Protena (mg) Factor de disolucin Protena (mg/ml)
7 8 9 10 11 12 2.218 5.706 6.375 6.927 1.229 1.927 4x100 2x100 4x10 2x10 4x20 2x20 887.2 1141.2 225 138.54 98.32 77.08

A continuacin se resumen los resultados finales en la siguiente tabla: Tabla 4: resultados finales de la concentracin de protena Tubo Protena Protena Solucin * No. (mg) (mg/ml) 3 ml NaCl, 1 0 0 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl 2 1 10 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl 3 2 10 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl 4 4 10 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl 5 8 10 1 ml BSA y 2 ml NaCl 6 10 10 0.25 ml casena y 2.75 ml NaCl 887.2 7 2.218 0.5 ml casena y 2.5 ml NaCl 1141.2 8 5.706 0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl 225 9 6.375 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl 138.54 10 6.927 98.32 11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl 1.229 77.08 12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl 1.927 *A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret. Absorbancia a 540 nm Blanco 0.034 0.071 0.142 0.277 0.345 0.079 0.198 0.221 0.240 0.044 0.068

DISCUSIN De acuerdo a los resultados finales (tabla 4) obtenidos en la determinacin de la concentracin de protena en las muestras de casena, sobrenadante y leche diluida, que aunque no son los esperados, pues, la concentracin de protenas tendra que ser mayor en la leche diluida que en el sobrenadante y los valores de la concentracin de cada muestra problema iguales entre s, no se descarta este mtodo de cuantificacin de protenas, pero es recomendable utilizar los

materiales de laboratorio correctos para hacer las diluciones y ser precisos, mas aun exactos, en la medicin de volmenes. El sobrenadante consiste en una suspensin a la cual se le ha eliminado la mayor cantidad de protenas contenidas en la leche, por lo que su concentracin de protena tendra que ser mejor que el de la leche pura. CONCLUSIN Efectivamente, aplicando el mtodo Biuret se puede determinar la concentracin de protena en una o varias muestras problema, que resultan al interpolar los valores de absorbancia en una curva patrn originada a partir de concentracin de protena conocida.

BIBLIOGRAFA Berg, J.M.; John, L.T.; Lubert, S. (2008) Bioqumica. 2 ed. Revert, Barcelona. Segal, C. (2005) Manual de prcticas de biologa molecular de la clula. Editorial publidisia. Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006) Bioqumica ilustrada: bioqumica y biologa molecular en la era posgenmica. Masson, Espaa. Harris, D.C. (2003). Quantitative chemical analysis. San Francisco: W.H. Freeman. ANEXO (CUESTIONARIO) 1.- describa que es el espectrofotmetro y para que sirve. Sirve para calcular las concentraciones de las distintas sustancias en funcin de la absorcin del color. Tcnicas de bioqumica y biologa moleculas.freifelder David. Editorial reverte.2003

2.- mencione que es un espectro de absorcin y las diferentes longitudes de onda del espectro. La espectroscopia de absorcin es la medida de la cantidad de luz absorbida por un compuesto en funcin de la longitud de onda de la luz. En general, se irradia una muestra con una fuente de luz y se mide la cantidad de luz transmitida a varias longitudes de onda, utilizando un detector y registrando el fenmeno en una

grafica. Tcnicas de bioqumica y biologa moleculas.freifelder David. Editorial reverte.2003 3.- defina con sus propias palabras que es una curva patrn. Son las medidas conocidas en orden ascendente que sirven de gua para ajustar una solucin problema. 4.- cuales son las ventajas y las desventajas, de emplear los reactivos de biuret para cuantificar protenas explique. Dentro de las ventajas del reactivo de Biuret es que es bastante especfico para protenas, muestra pocas interferencias y es barato. Y la desventaja es que es poco sensible. 5.- mencione cual es la razn de que en el mtodo de biuret la absorbancia de una protena se lea a una longitud de 540 nm. El color violeta caracterstico se presenta a esa longitud la cual se da por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los tomos de oxigeno y de nitrgeno del pptido. Tcnicas de bioqumica y biologa moleculas.freifelder David. Editorial

reverte.2003

6.- explique si una curva patrn puede ser empleada para cuantificar sustancias diferentes a las protenas y cual seria la diferencia con estas.

7.- Cul es la finalidad de utilizar un tubo como blanco? Mencione si siempre se utiliza agua como blanco. Tomar la medida de la cual parte la curva patrn, no siempre se utiliza agua como blanco, si no una mezcla concentrada de la sustancia con la cual se esta trabajando. Tcnicas de bioqumica y biologa moleculas.freifelder David. Editorial reverte.2003

8.-realice una curva patrn con los datos de absorbancia y protena obtenidos en una determinacin hipottica: Se realizo una solucin estndar de albmina (10mg/ml). Los valores de absorbancia referidos se determinaron por duplicado. 9.-con los datos obtenidos en el ejemplo anterior, determina la ecuacin de la recta que representa la curva patrn.

10.- basndose en la curva patrn y la ecuacin de la lnea recta, determine la cantidad de protena en MG/ml de las siguientes muestras, cuyos valores de absorbancia se indican

11.- elabore una lista de 5 compuestos que se podran cuantificar empleando una curva patrn, y menciona que importancia tiene determinar la cantidad de dichos compuestos.

a) inmunoglobulinas. Mal funcionamiento inmunolgico b) hemoglobina. Una concentracin baja produce anemia. c) insulina. Una concentracin baja produce diabetes. d) fibrilinas. La falta de esta produce deformacin en los huesos. e) seroalbumina. Su falta produce deformaciones.

Bioquimica.berg Jeremy.editorial reverte.2008