Tipo 1 receptor de rianodina ronda en la mutacin que causa la enfermedad del ncleo central de los msculos esquelticos tambin

muestra un fenotipo neuronal.

De Crescenzo V , Fogarty KE , Lefkowitz JJ , Bellv KD , Zvaritch E , MacLennan DH , Walsh JV Jr . Fuente
Departamento de Microbiologa y Fisiologa de Sistemas de la Universidad de Massachusetts Medical School, Worcester, MA 01655, EE.UU.. valerie.decrescenzo @ umassmed.edu

Abstracto
El receptor de rianodina tipo 1 (RyR1) se expresa ampliamente en el cerebro, con altos niveles en el cerebelo, hipocampo y el hipotlamo. Hemos demostrado que (2 +) canales de tipo L de Ca en las terminales de las neuronas hipotalmico magnocelular se acoplan a RyRs, como lo son en el msculo esqueltico, permitiendo tensin inducida por Ca (2 +) de liberacin (Vicario) de Ca interna (2 + ) tiendas sin Ca (2 +) afluencia. Aqu demostramos que RyR1 juega un papel en Vcar en las terminales nerviosas. Por otra parte, en los heterocigotos de la RYR1 (I4895T/WT) (TI / +) lnea de ratn, que lleva una mutacin knock-in correspondiente a uno que causa una forma grave de enfermedad del ncleo central humano, Vicario est ausente, lo que demuestra que el Tipo 1 media RyR Vicario y que estos ratones tienen un fenotipo neuronal. La ausencia de Vcar se muestra de dos formas: en primer lugar, la despolarizacin en ausencia de Ca (2 +) afluencia provocada Ca (2 +) syntillas (chispa, chispa, en una terminacin nerviosa, una estructura sinptica) en WT, pero no en terminales de mutantes; segundo, en presencia de Ca extracelular (2 +), terminales de TI / + mostraron una doble disminucin de la mundial Ca (2 +) transitorios, sin ningn cambio en plasmalemmal Ca (2 +) actual. A partir de estos estudios nos acercamos a dos conclusiones: (i) RyR1 juega un papel en Vcar en las terminales nerviosas del hipotlamo, y (ii) una alteracin neuronal acompaa a la miopata en IT / + ratones, y, posiblemente, en los seres humanos que llevan la mutacin correspondiente RyR1.

Palabras clave: microdominio, exocitosis, oxitocina, vasopresina En los ltimos aos se ha acumulado evidencia de un papel para el Ca 2 + tiendas en las terminales nerviosas ( 1 , 2 ). En terminales magnocelulares aislados, encontramos, espontneos, Ca focales, rianodina sensibles citoslicas 2 + transitorios (Ca 2 + syntillas). Inesperadamente, tambin encontramos que la despolarizacin de la membrana plasmtica, en ausencia de Ca externa 2 + y, por lo tanto, en ausencia de Ca 2 + afluencia, aumentamos syntilla frecuencia y mundial [Ca 2 + ] ( 3 ).Hemos designado este proceso, que slo se haba observado previamente en el msculo esqueltico, como Ca tensin inducida 2 + de liberacin (Vcar). Casi al mismo tiempo, tambin se encontr evidencia de Vicario en los axones columna dorsal ( 4 ) y, ms recientemente, en las neuronas piramidales del hipocampo ( 5 ). Adems hemos demostrado que Vicario en terminales nerviosas est mediada por receptores de rianodina (RyRs) y los receptores de dihidropiridina (DHPRs) como en el msculo esqueltico ( 6 ).

RyRs son grandes homotetramers (2,2 MDA) que se encuentran en las membranas del retculo endoplsmico y sarcoplsmico o funcionan como Ca 2 + canales de liberacin, la realizacin de Ca 2 +en el citosol. Todas las tres isoformas de RyR estn presentes en el cerebro de los mamferos ( 7 ). A pesar de Ca 2 + inducida por Ca 2 + liberacin (CICR) a travs de RyR2 se ha implicado en la amplificacin de Ca 2 + transitorios en las neuronas, ningn papel an no se ha asignado a RyR1.Anteriormente, hemos presentado pruebas de inmuno que en las terminales nerviosas hipotalmico magnocelular RyR1 se encuentra cerca de la membrana plasmtica, colocndolo en la posicin para mediar en Vcar, pero hasta ahora no ha habido ninguna prueba funcional para un papel de RyR1 en los terminales. En contraste con su papel incierta en el sistema nervioso, RyR1 se sabe que juega un papel clave en la excitacincontraccin (CE) de acoplamiento en el msculo esqueltico ( 8 ). Un nmero creciente de trastornos del msculo esqueltico se han asociado con mutaciones en RyR1 , la hipertermia maligna siendo ms frecuente (MH) y miopatas bsicos, tales como enfermedad del ncleo central (CCD) y la enfermedad de multi y. Por ahora, ms de 300 mutaciones causantes de la enfermedad han sido identificados en RyR1 ( 9 ). RYR1 mutaciones que causan MH y CCD se producen en toda la molcula, pero hay tres puntos de acceso en la que se incrementa la frecuencia de mutaciones ( 9 ). Algunas mutaciones en la tercera regin de punto de acceso, cerca de la terminal C, perturban la estructura de la Ca 2 + poros y por lo tanto interfiere directamente con la funcin intrnseca de Ca 2 + en libertad. Estas mutaciones se han asociado predominantemente con miopatas ncleo. Uno de ellos es el humano Ryr I4898T mutacin, que se encuentra entre la ms frecuente de esos ryr1 mutaciones que estn asociadas con CCD y otras miopatas de ncleo ( 1012 ). La mutacin se encuentra en el filtro de selectividad del Ca 2 + poros ( 13 ) e interrumpe Ca 2 + permeacin sin afectar a la organizacin estructural y supramoleculares general de RyR1 ( 14- 16 ). Hemos generado una lnea de ratn knock-in, ryr1 I4895T/WT (en adelante denominado como TI / +), que lleva el anlogo murino de la mutacin I4898T humana ( 16 ). En el estado homocigtico, esta mutacin es neonatal letal debido a que los ratones han muy poco desarrollado msculo esqueltico, incluyendo que la formacin de la membrana, y no son capaces de respirar ( 16 ). En el estado heterocigoto, dependiendo en el fondo, la mutacin del ratn hace que un ncleo de miopata progresiva con ncleos y varillas, lo que perjudica significativamente la movilidad en alrededor de 1 ao de edad (14 , 17 , 18 ). Miopatas congnitas principales son un grupo de trastornos neuromusculares de la patologa altamente variable que normalmente presente en la infancia con la debilidad del esqueleto muscular, hipotona y retraso del desarrollo motor ( 19 ). La existencia de un componente neural en la etiologa de las miopatas ncleo mucho tiempo se ha

debatido ( 20- 22 ). La idea se basa en la sorprendente similitud entre las lesiones fundamentales observados en el msculo esqueltico de pacientes con miopatas centrales y las lesiones Targetoid reportados en el msculo denervado ( 20- 23 ) y despus de tenotoma ( 17 ). Una anomala en la funcin motora neuronal se propone, por tanto, pero nunca demostr experimentalmente. Por otra parte, la participacin de los distintos componentes del sistema nervioso central en la etiologa de las miopatas centrales tambin ha sido abordado nunca. Debido a que los investigadores han debatido durante mucho tiempo la posibilidad de que las miopatas congnitas tienen un componente neural, que razon que los ratones / TI + pueden proporcionar un modelo til para la investigacin de un posible defecto de los nervios que acompaa a las manifestaciones de miopatas ncleo. Aqu se demuestra que los ratones / TI + hacen, de hecho, tener un fenotipo neuronal. Por otra parte, el enfoque gentico ha aportado pruebas funcional directa que RYR1 media Vicario en las terminales nerviosas. Ir a:

RESULTADOS
Ca 2 + Syntilla frecuencia aumenta a -80 mV en IT / + En comparacin con WT.

Nuestros primeros experimentos fueron diseados para examinar si Ca 2 + syntillas estaban presentes en TI / terminales nerviosas hipotalmico magnocelular + + en condiciones que se aproximan estrechamente el estado de reposo fisiolgico (es decir, en presencia de 2,2 mM de Ca extracelular 2 + ) con el potencial plasmalemmal celebrada en -80 mV ( Fig.. 1 A ). En estas condiciones, las terminales nerviosas muestran espontneos Ca 2 + syntillas y, sorprendentemente, la frecuencia se increment ms de tres veces en el IT / + mutante, de 0,23 0,06 s -1 ( n = 22) en el WT a 0,87 0,18 s -1 ( n terminales en TI = 21) / + nerviosas ( P = 0,001) ( . Fig. 1 A y B1 y Tabla 1 ). La masa de seal para WT fue 44,20 10,28 10 -20 moles de Ca 2 + ( N = 6) y el IT / + mutante fue 73,39 8,07 10 -20 moles de Ca 2 + (N = 43), P = 0,193 ( Fig.. 1 B2 y Tabla 1 ). Vale la pena sealar que el aumento de la frecuencia syntilla no plante la citoslica de descanso [Ca 2 + ] (31,77 8,20 nM en IT / + terminales frente a 51,32 12,90 nM en WT, P = 0,380). Por lo tanto, en el nivel de la actividad espontnea, la TI / + mutante exhibe un fenotipo neuronal a nivel de la fisiologa celular.

Tabla 1. Resumen de datos

. Figura 1. Espontneas Ca 2 + syntillas se incrementan en las terminales nerviosas de TI / +. Los terminales son tensin-sujetada a -80 mV en presencia de 2,2 mM extracelular Ca 2 + , con fluo-3 en la pipeta de parche. ( A ) registros representativos de syntillas en WT (superior ) y ...
Tensin inducida por Ca 2 + Release, presente en el WT, se bloquea en IT / +.

A continuacin se examin el efecto de la mutacin en Vcar. Para observar Vicario, que exige la despolarizacin de la terminal, se utiliz una solucin sin extracelular [Ca 2 + ]. Ese proceso nos permiti evitar la posible interferencia debido a Ca 2 + afluencia y para asegurarnos de que no hay CICR que es evocado por Ca 2 + afluencia. Por otra parte, slo en este Ca 2 + libre de condiciones se puede ver un aumento en la frecuencia de syntillas, porque syntillas no queden ocultas por un aumento global de la [Ca 2 + ]. La despolarizacin de las terminales nerviosas desde -80 hasta 0 mV indujo un aumento en la frecuencia de syntilla de 0,98 0,24 s -1 ( n = 14) a -80 mV a 2,75 0,56 s -1 a 0 mV ( n = 7), P = 0,003 ( Fig.. 2 A y B1 y Tabla 1 ), lo que demuestra Vicario en los terminales de la cepa de ratn WT SV129. El aumento de la frecuencia fue similar a nuestros hallazgos anteriores en ratones Swiss Webster ( 6 ). Sin embargo, con las terminales nerviosas del SV129 IT / + compaeros de camada, frecuencia syntilla no fue cambiado de manera significativa en la despolarizacin (1,78 0,25 s -1 ( n = 8) a 80 mV y 1,00 0,60 s -1 ( n = 7) a 0 mV). Debido a que la cantidad de seal de syntillas registrado en WT y IT / bornes + a 0 mV fue similar [79,3 6,6 10 -20 moles de Ca 2 + ( N = 68) en el WT vs 98,0 16,1 10 -20moles de Ca 2 + ( N = 28) en IT / +] ( Fig. 1 B2 y Tabla 1 ), la ausencia de Vcar en el mutante no poda ser debido a syntillas no detectados. Llegamos a la conclusin de que el TI / + mutacin induce una prdida de Vicario, tal como se mide por la frecuencia syntilla.

. Figura 2. Vcar se bloquea en el IT / + mutante. ( A ) Imgenes representativas de Ca 2 + syntillas durante 4 s grabaciones a -80 mV y 0 mV en ausencia de Ca extracelular 2 + y el uso de fluo-3 como Ca 2 + indicador. En WT, la despolarizacin de 0 mV aumenta el nmero ... Tambin se observ una inusual cantidad de seal de los syntillas en el WT SV129 a 80 mV [220,6 30,1 10 -20 moles de Ca 2 + ( N = 40)] ( . Fig. 2 B2 y Tabla 1 ) en el Ca 2 + condicin libre, que no se ve en Swiss Webster ( 3 ) y puede representar una mayor susceptibilidad de las terminales nerviosas SV129 a las condiciones no fisiolgicas de la Ca 2 + -medio ambiente libre.
Global Ca 2 + transitorios En la despolarizacin es reducido Twofold en IT / + En comparacin con WT.

A continuacin examin el efecto de la ausencia de Vcar en las terminales nerviosas de TI / + en presencia de 2,2 mM externa Ca 2 + durante la despolarizacin, que elev mundial [Ca 2 + ].Comparamos IT / + y WT llevar y terminales nerviosas sobre la despolarizacin a 0 mV utilizando ratiometric fura-2 mediciones ( Fig.. 3 A ). El aumento de fura-2 en relacin TI / + fue de dos tercios del valor en WT (1,29 en TI / + vs 1,92 en WT, P = 0,009). En este potencial (0 mV), la magnitud del pico de plasmalemmal Ca 2 + actual ( Fig.. 3 B ) no fue significativamente diferente en WT y terminales + / TI -34,27 7,18 pA ( n = 10) en TI / + vs . -44,95 10,85 pA ( n = 6) en WT ( P = 0,375). Por lo tanto, la diferencia en los transitorios globales no parece ser causada por cambios en Ca 2 + afluencia, sino ms bien indica un defecto en Ca 2 + liberacin de los almacenes intracelulares. Debido a que estos experimentos se llevaron a cabo en las mismas condiciones en las que se estudi el mutante en el msculo esqueltico, una comparacin es posible, y los resultados en la terminal nerviosa son comparables a las de las fibras esquelticas ( 15 ).

. Figura 3. La despolarizacin cambios inducidos por citoslica mundial [Ca 2 +] son ms pequeos en TI terminales / + que en WT. ( A ) Cintica de los cambios en la fura-2 en relacin WT (azul) y / + terminales informticos (rojo) sobre la despolarizacin de -80 mV a 0 mV de 500 ms. Traces ( Izquierda ...
IT / + y WT responden diferentemente a los protocolos de estimulacin fisiolgica.

Luego preguntamos si un mutante RyR1 fenotipo era evidente en las terminales nerviosas durante protocolos utilizados para simular la activacin fisiolgica. Las terminales nerviosas fueron estimuladas ya sea por una despolarizacin prolongada para imitar la despolarizacin causada por K + acumulacin fuera de las terminales nerviosas ( Fig.. 4 A ) ( 24 ) o un tren de despolarizaciones cortas para imitar una rfaga de potenciales de accin (NS80 en la figura. 4 C ) ( 24 , 25 ). Global Ca 2 + transitorios se midieron con fluo-3, que es suficientemente rpida para dar una indicacin de la velocidad de aumento de los transitorios ( 26 ). Con el paradigma de la despolarizacin a largo ( Fig.. 4 A ), el Ca 2 + transitorios en TI / + [huella roja, 1,46 0,11 ( n = 9)] fue significativamente menor que en WT [trazo azul, 2,51 0,13 ( n = 12)], como se espera de los datos de fura-2 en la figura. 3 A que se registraron en las mismas condiciones (es decir, con 2,2 mM externa Ca 2 + y la despolarizacin prolongada).

. Figura 4. Vicario es provocado por un plasmalemmal prolongada no despolarizante por un tren de breves despolarizaciones. Terminales nerviosas se patch-sujetados a fisiolgica 2,2 mM extracelular [Ca 2 + ] con fluo-3 en el parche pipeta. F 0 es la media de fluorescencia en el ... En la presencia de Cd 2 + para bloquear Ca 2 + actual, el Ca 2 + transitorios en WT disminuy de 2,51 0,13 ( n = 12) a 1,52 0,17 ( n = 12), p = 0,00013; la magnitud de la restante transitoria puede ser tomado como el componente provocada por Vcar. Por lo tanto, en consonancia con nuestros resultados anteriores, despolarizaciones largas fueron capaces de inducir Vicario en WT. Sin embargo, en terminales de TI / +, en presencia de Cd 2 + , se observ un aumento muy lento y pequeo en Ca mundial 2 + [1,21 0,05 ( n = 9), en comparacin con 1,52 0,17 ( n = 12, P = 0,05), en ausencia de Cd 2 + ], lo que indica que en IT / + terminales Vicario es bastante pequeo. En cada caso, el aumento mundial en [Ca 2 + ] hecho que dificulta el seguimiento syntillas debido al aumento de la fluorescencia de fondo. Loy et al. ( 15 ) demostraron que las fibras musculares individuales de IT / + ratones mostraron una reduccin significativa en la magnitud y la velocidad mxima de RyR1 mediada por Ca 2 + liberacin durante el acoplamiento CE. Para determinar si existe una disminucin similar en los terminales nerviosos, se compar la cintica de Ca 2

liberacin en WT y IT / terminales + durante el tiempo de despolarizacin que fue capaz de provocar Vicario en WT ( Fig. 4. B ). Hemos demostrado previamente que el fluo-3 era lo suficientemente rpido para estudiar el curso de tiempo de chispas en el msculo liso ( 27 ) y syntillas en terminales nerviosas ( 3 ). La cintica de unin de fluo-3 ( 26 ) tambin son suficientes para revelar diferencias en la Ca 2 + curso de tiempo transitorio, que aparece ms lento en este sistema que en el msculo esqueltico. El porcentaje mximo de Ca 2 + liberacin se aproxima desde el pico de la primera derivada de la fluo-3 fluorescencia (d [ F / F ] / dt) ( . Fig. 4 B ). El porcentaje mximo de Ca 2 + liberacin se redujo significativamente en los terminales nerviosos de TI / + (0,8 0,3) en comparacin con el WT (2,7 0,3, P = 0,0014). Por otra parte, en la presencia de Cd 2 + , donde se registra slo Vicario, sin aumento de Ca 2 + liberacin fue evidente en los terminales de TI / +.
+

Con el protocolo NS80 ( Fig. 4 C ), no se observ una diferencia en la F / F 0 incremento entre el TE y TI / +. Por otra parte, en la presencia de Cd 2 + , no haba ninguna indicacin de Vicario en WT o TI / + mediante el control global de Ca 2 + . Sin embargo, como no hubo un aumento global en Ca 2 + cuando Cd 2 + estaba presente, hemos sido capaces de controlar syntillas, que no era posible con el protocolo de la despolarizacin de largo ( Fig.. 4 A ). En la presencia de Cd 2 + , se observ un aumento significativo en la frecuencia syntilla en terminales WT (de 0,36 0,08 s -1 a 80 mV a 0,85 0,13 s -1 bajo NS80, P= 0,019). Por lo tanto, parece que el protocolo de la despolarizacin prolongada es ms efectivo que el protocolo de NS80 en la obtencin de Vicario. Con el protocolo de despolarizacin prolongada, Vicario provoca un aumento en global de [Ca 2 + ], mientras que con el protocolo NS80 el aumento en la frecuencia syntilla no se unen en un aumento mundial en [Ca 2 + ]. En los terminales + / TI en la presencia de Cd 2 + , Vicario no era demostrable (frecuencias syntilla fueron 0,48 0,11 a -80 mV y 0,69 0,16 en virtud NS80 en TI / +). Ir a:

DISCUSIN
Dos conclusiones principales se derivan del trabajo presentado aqu en IT / + ratones. En primer lugar, la mutacin del CCD I4895T, que hemos encontrado para dar lugar a los cambios miopticos en el msculo esqueltico, tambin tiene un fenotipo neuronal, una demostracin nica de un fenotipo neuronal para un RyR1 mutacin. En segundo lugar, RyR1 media Vicario en las terminales nerviosas hipotalmico magnocelular, como lo hace en el msculo esqueltico. Hemos demostrado previamente que DHPRs y RyRs proporcionan la base molecular de Vcar en las terminales nerviosas ( 6 ). Aqu nos implicamos el 1 RyR tipo definitivamente, mostrando un efecto de laRyR1 IT / + mutacin en Vcar. En s mismo, este hallazgo no descarta un papel adicional para RyR2 tambin, porque

ambos son abundantes en estas terminales nerviosas ( 6 ). Puede ser que las obras Vicario travs de la activacin de DHPR RyR1 y Ca 2 + liberacin del RYR1 activa RyR2 por CICR para producir la amplificacin y un syntilla visible. El RyR1 IT / Se propone + mutacin que se encuentra en la regin del poro y esa es la razn por la cual se manifiesta disminucin de la permeabilidad. Baja la conductancia en la RyR1 TI / + mutante podra entonces resultar en insuficiente Ca 2 + liberacin para activar RyR2, por lo que la frecuencia de syntillas visibles gotas. Este proceso es anlogo al mecanismo en el msculo esqueltico de anfibios, donde el DHPR activa RyR1 directamente y la resultante Ca 2 +liberacin, a su vez, activa a travs de RyR3 CIcR ( 28 ). La principal conclusin es que el IT / + mutante muestra un fenotipo neuronal. Este hallazgo es una demostracin funcional y fisiolgica nica que el 1 RyR tipo juega un papel en las clulas nerviosas. Es interesante que las clulas cromafines, que, al igual que las neuronas magnocelular, se utilizan a menudo como un sistema modelo para estudiar la exocitosis, no tienen RyR1s y tampoco Vcar ( 29 ).Por lo tanto, en donde se encuentra RyR1, Vicario tambin puede ser encontrado. Por lo menos, que ya no se puede suponer que CIcR ( 30 ) es el nico mecanismo de vinculacin de la actividad elctrica en las neuronas para liberar de intracelular de Ca 2 + tiendas. Nuestros datos son consistentes con aquellos en el msculo esqueltico, donde la mutacin reduce RyR1 Ca 2 + ion de permeacin de una manera que conduce a una reduccin paralela en tanto la magnitud ( Fig.. 4 A ) y la velocidad ( . Fig. 4 B ) de RyR1 mediada Ca 2 + liberacin durante el acoplamiento EC (15 ). Aunque el RyR1 mutacin I4895T CCD causa una miopata central en nuestra lnea de ratn ( 14), que todava no tenemos evidencia de una neuropata en estos mismos ratones.
Espontnea Ca 2 + Release interior de las tiendas de IT / +.

Nuestros resultados ( . Fig. 1 ) muestran que la frecuencia es mayor en syntilla TI / + que en WT a -80 mV en presencia de fisiolgica [Ca 2 + ].A primera vista, esta conclusin puede parecer estar en contradiccin con la disminucin de Ca 2 + de liberacin de la despolarizacin, aunque implica claramente de tipo 1 RyR en que descansa la liberacin, as como vicario. Sin embargo, un doble efecto de la mutacin tal no es necesariamente contradictoria.Por ejemplo, la mutacin, adems de afectar la conductancia, puede simplemente cambiar la induccin de voltaje de Ca 2 + liberacin de los potenciales negativos, causando menos libertad bajo despolarizacin y ms en reposo. O puede ser que el DHPR ejerce una accin inhibidora sobre RyR1 en reposo y la despolarizacin elimina la inhibicin y provoca la activacin. El RyR1 mutacin puede debilitar ambas interacciones, lo que resulta en ms syntillas en reposo y menos Ca 2 + de liberacin de la despolarizacin. Tendr que hacer para resolver estas posibilidades de trabajo adicional.

En los miocitos cardacos, la presencia de Ca 2 + chispas en reposo se utiliza como un ndice de descansar Ca 2 + fuga desde el retculo sarcoplsmico a travs RyR2 ( 31 ). Sin embargo, como se estudian en bicapas y en miotubos en cultivo de IT / + ratones mutantes, la mutacin que no es una mutacin fugas: la presencia de ms de dos subunidades de TI mutantes en un tetrmero se ha demostrado que hacer RyR1 nonpermeant de Ca 2 + ( 15 ). No encontramos aumento mundial en [Ca 2 + ] en reposo, por lo que el aumento en la frecuencia syntilla no es suficiente para afectar a la detectable global de [Ca 2 + ] ( . Fig. 3 ).
Papel de RyR1 en la exocitosis.

Una caracterstica especial de neuronas hipotalmico magnocelular es su participacin directa en la secrecin de neuropptidos. Hemos demostrado que un syntilla no provoca un evento exoctica en las terminales nerviosas de estas clulas ( 32 ). La misma conclusin es cierto en las clulas cromafines, a pesar de que hay suficiente Ca 2 + a hacerlo si el Ca 2 + de un syntilla fueron puestos en libertad en el lugar de la etapa de exocytic final ( 29 ). Estos hallazgos sugieren que el Ca 2 +de syntillas provocada por cualquiera de 1 RyRs tipo (en terminales nerviosas) o tipo 2 (en las clulas cromafines) se libera en un microdominio diferente de aquel en el que se produce el paso exoctica final.Por otra parte, en las clulas cromafines, se ha encontrado que syntillas que surgen de RyR2s suprimen la exocitosis monitoreado amperomtrica ( 33 ). Un estudio sobre el sndrome de estrs porcino indica que un mecanismo similar puede estar presente en las neuronas parvocelulares. En este caso, los verracos que tienen una condicin cerca de MH exhiben menor de ACTH en plasma basal ( 34 ). Debido a que el RyR1 mutacin R615C que causa MH en estas porcina tiene una ganancia de funcin, las neuronas parvocelulares pueden tener un aumento en la frecuencia syntilla que a su vez podra bloquear la liberacin de hormonas. Esta capacidad de Ca 2 + a tiene divergente o incluso acciones antagnicas puede entenderse si los diferentes objetivos de la Ca 2 + liberado tener baja afinidad y se encuentran en diferentes microdominios de modo que slo se activan por una fuente cercana de Ca 2 + . En los cuerpos celulares de las neuronas ganglionares de la raz dorsal, sin embargo, focal Ca 2 + transitorios derivados de RyR3s hacer causa exocitosis, por lo que es posible para tales transitorios tener diversos efectos, dependiendo del tipo de clula y la localizacin dentro de la clula ( 35 ). Por ltimo, las neuronas magnocelular utilizados en este estudio como modelo son responsables para el nivel de las hormonas oxitocina y la vasopresina que se han asociado con el comportamiento social ( 36). Por lo tanto, podra valer la pena investigar si miopatas RyR1 relacionados tambin pueden estar asociados con variaciones en el comportamiento social. Estos resultados tambin sealan la importancia de microdominios focales y breves Ca 2 + transitorios.Entre otras cosas, los microdominios permiten una nica seal, Ca 2

, que tienen una amplia gama de efectos ( 31 ). Transitorios de Ca Focales mediadas por RyRs se encontraron por primera vez como "chispas" en las clulas cardacas ( 37 ), en el que estn mediadas por RyR2, y luego bajo condiciones de estrs osmtico en el msculo esqueltico ( 38 ), en el que estn mediadas por RyR1. En cada uno de estos casos, las chispas que sirven como bloques de construccin elementales para aumentos globales de Ca 2 + , lo que proporciona una accin fisiolgica clara. A continuacin, se encuentran las chispas en el msculo liso ( 39 celdas en las que se ha aadido una nueva dimensin a su importancia). En el msculo liso el resultado chispas en la activacin de la cercana gran Ca 2 + -activated K + (BK) canales, dando lugar a espontneos corrientes hacia el exterior transitorios que hiperpolarizan el msculo y por lo tanto causan relajacin, el efecto contrario de un aumento de la citoslica mundial [Ca 2 + ] ( 39 ). La clave para esta dualidad es la relativa falta de sensibilidad de los canales BK a Ca 2 + y su localizacin en el microdominio chispa, donde estn expuestos a altas concentraciones de Ca 2 + en el orden de 10 mM, un nivel no alcanzado por global de [Ca 2 + ] ( 40- 42 ). Por lo tanto, la microdominios en el msculo liso es la base para el Ca 2 + para ejercer mltiples, incluso opuesta, efectos y proporciona un precedente para su accin inesperada en las clulas cromafines ( 33 ).
+

Terminales nerviosas de la neurohipfisis segregan oxitocina o vasopresina en respuesta a las rfagas de potenciales de accin ( 25 ). In situ, los terminales neurohypophysial estn muy juntos, con los espacios intersticiales apretados que la difusin lmite, dando como resultado la remocin de iones externa retardada. La estimulacin de la neurohipfisis intacto se ha demostrado que aumenta externa K +dentro de los primeros 3 s ( 24 ). Este aumento en K externa + induce una despolarizacin constante de los terminales de los nervios durante la rfaga de potenciales de accin. Por lo tanto, en los terminales aisladas sin restricciones en la situ sobre la difusin, la despolarizacin a largo es necesaria para imitar la situacin fisiolgica ( 43 ). Nuestros datos muestran que a largo despolarizacin es ms eficaz que un tren de potenciales de accin en la activacin de Vcar. Por lo tanto, se propone un modelo en el que cada potencial de accin permite a Ca 2 + entrada a travs de la N-tipo Ca 2 + canales, provocando la secrecin ( 44 , 45 ), pero, adems, el tiempo de despolarizacin activa tambin vicario a travs de una interaccin entre la L- tipo Ca 2 +canales y RYR1. Por lo tanto, Ca 2 + de los espacios extracelulares que activan la exocitosis y Ca 2 +intracelular de las tiendas liberadas a travs RyRs puede entrar en diferentes microdominios. Por ejemplo, una rfaga de potenciales de accin desencadenara exocitosis, pero la eventual acumulacin de K + y la despolarizacin sostenida favorecera Vicario, la generacin syntilla, y tal vez la supresin de la exocitosis, que podra actuar como un freno a la exocitosis. Es evidente a partir de estas consideraciones que el efecto preciso de Vicario y syntillas en la exocitosis es potencialmente muy complejo y necesita ser cuidadosamente, se separan.

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MATERIALES Y MTODOS
Manejo Animal.

Protocolos experimentales para la investigacin con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y Comits uso tanto en la Universidad de Massachusetts Medical School y la Universidad de Toronto. La generacin y determinacin del genotipo de ratones A / TI + se describi previamente ( 16 ). Para los experimentos, IT / + ratones, generados sobre un fondo SV129, se cruzaron con ratones WT 129S2/SvPasCrl (Charles River).
Parches Whole-Terminal.

Para los experimentos, los ratones de ambos sexos y 10-12 semanas de edad murieron rpidamente por dislocacin cervical, de conformidad con el Cuidado de Animales institucional local y utilizar las directrices del Comit (protocolo A-124 a JVW y A-1964 a VCC). Las terminales nerviosas hipotalmico magnocelular estaban recin preparados como se ha descrito previamente ( 3 ). Tight-seal, grabacin de "Todoterminal" en las terminaciones nerviosas, se hizo con un amplificador HEKA EPC10. Solucin de la pipeta era: 0,05 mM de K 5 fluo-3 o K5fura-2 (Molecular Probes), 135 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2 , 30 mM de Hepes, 4 mM de MgATP, 0.3 mM de Na-GTP, pH 7,2. Solucin del bao fue: 135 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 10 mM de Hepes, glucosa 10 mM, 1 mM de MgCl 2 , y 2,2 mM CaCl 2 , pH 7,2. Para el Ca 2 + sin solucin de bao de CaCl 2 se retira y se aade 0,2 mM EGTA. Para evitar el agotamiento de Ca 2 + a partir de depsitos internos, los terminales se mantuvieron en solucin de normal Locke (2,2 mM Ca 2 + ) hasta el comienzo del experimento, y la duracin de la Ca 2 + protocolo-libre fue de ~ 15 min ( 40 ) . Para medir la magnitud de la plasmalemmal Ca 2 + actual en la figura. 3 B en la configuracin de clula completa, la solucin interna se cambi para bloquear corriente hacia el exterior y aislar el Ca 2 +actual: 130 mM de NMG-Cl, 10 mM de CsCl, 30 HEPES, 2 mM de Mg-ATP, y 0,3 mM de Tris-GTP .Por otra parte, se aadi TTX (1 M) en la solucin externa para bloquear Na + actual. A partir de un potencial de mantenimiento de -80 mV, se utiliz 100-ms pasos positivos desde -70 mV hasta +50 mV en incrementos de 10 mV y 60 s entre cada paso. Despus de un protocolo de control, que Cd "hinchado"2 + durante 2 min y luego se construy un nuevo protocolo de trama voltaje de corriente mientras Cd 2 + fue todava est hinchado. No hay corriente de entrada se podra registrar en presencia de Cd 2 + . Slo se inform el valor de la corriente a 0 mV. Reactivos (de Sigma, a menos que se indique lo contrario) eran bao de perfundido o entregado por un "Picospritzer" (Vlvula general). Terminales fueron suspendidos de la punta de la pipeta, fuera de contacto con el suelo de la cmara.

Grabaciones de fluorescencia.

Se utiliz el indicador radiomtrica fura-2. Los datos presentados representa la relacin de excitacin de 340/380 nm para fura-2 que es representativa de mundial citoslico [Ca 2 + ] ( 46 , 47 ). Para Fluo-3, imgenes de fluorescencia se obtuvieron con un sistema de imagen digital de gran campo hecha a la medida a 50 Hz (exposicin de 10 ms) ( 40 ). Los terminales se obtuvieron imgenes como se ha descrito previamente ( 3 ). Procesamiento de imgenes y anlisis posterior se llev a cabo fuera de lnea usando un paquete de software de diseo personalizado. Dos medidas de Ca 2 + se utilizaron: uno para evaluar las propiedades de los aumentos transitorios de coordinacin en Ca 2 + (es decir, Ca 2 + syntillas) de forma cuantitativa, y otro para evaluar los aumentos globales de Ca 2 + .
Seal Misa

Para evaluar las propiedades de Ca 2 + syntillas y no lo cuantitativo, se utiliz el mtodo de seal de masa. En resumen, con esta tcnica la cantidad total de Ca 2 + liberado en un syntilla se mide con el Ca 2 + tinte sensible, fluo-3. El mtodo de la masa de seal se describe en detalle en ZHUGE et al.( 27 ) y una adaptacin a las terminales nerviosas magnocelulares en De Crescenzo et al. ( 3 ), donde la calibracin para relacionar aumento medido en la fluorescencia a la cantidad total de Ca 2 + liberado en una sola syntilla tambin se describe.
Anlisis de los datos.

En todos los casos, los datos se presentan como media SEM; N es el nmero de syntillas que se utilizan en el anlisis de la masa de la seal y n es el nmero de observaciones. El anlisis estadstico de las diferencias se hace con unpaired, dos colas t de prueba y los P -valores se han ajustado Bonferroni estado (indicado por **), segn proceda, con P <0,05 consider significativo (marcadas con *). Ir a:

AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a los Dres. R. Dirksen (Universidad de Rochester Facultad de Medicina y Odontologa) y R. Zhuge (University of Massachusetts Medical School) para discusiones interesantes y tiles. Este estudio fue financiado por el subsidio HL21697 (a JVW) de los Institutos Nacionales de Salud; Subvencin 0835580D (a VDC) de la Asociacin Americana del Corazn, y Grant RP-3399 (a DHM) de los Institutos Canadienses de Investigacin en Salud. Ir a:

NOTAS AL PIE
Los autores declaran no tener ningn conflicto de intereses.

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