TRABAJO PRCTICO N 7 M3- BIOLOGA CINTICA ENZIMTICA

TRABAJO PRCTICO N 6 ESTUDIO CINETICO DE LA ENZIMA ALFA-AMILASA. INTRODUCCION. La cintica enzimtica tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, as como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren. La velocidad de las reacciones enzimticas se puede medir: - por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo - por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo En esta prctica de laboratorio se comprobar la influencia de la concentracin del sustrato (S) y de la enzima (E) en la cintica del alfa-amilasa en su accin sobre los enlaces alfa 1-4 del almidn. Para ello nos basaremos en la desaparicin del almidn en la unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reaccin de color que produce el mismo, as como sus productos de hidrlisis con el Iodo en disolucin de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol). Dado que el almidn est integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (as como sus respectivos productos de hidrlisis) con el reactivo de Lugol: AMILOSA AMILOPECTINA + Amilasa -------------- AMILODEXTRINAS +IODO = resultado Color azul violeta

MALTOSA + GLUCOSA -----------------------+IODO No dan coloracin

Basndonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cintica enzimtica la variacin de los factores que en ella influyen: c(S), c(E), pH y T, fundamentalmente. En Esta prctica no estudiaremos el efecto del pH y la temperatura. La influencia de la c(E) podremos estudiarla midiendo la velocidad de la reaccin de la forma ya descrita pero utilizando diferentes c(E), manteniendo constante los dems factores. De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la c(S). FORMULE LA PREGUNTA DE INVESTIGACIN: -------

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FORMULE UNA HIPTESIS: -----FORMULE UN APREDICCIN: ---------

IDENTIFIQUE VARIABLE INDEPENDIENTE:---INDENTIFIQUE VARIABLE DEPENDIENTE:----IDENTIFIQUE VARIABLES DE CONTROL:. Debido a que utilizaremos amilasa comercial extrada de hongos Aspergillus sp debe considerar que la temperatura ptima en este caso es de 50 y su pH ptimo es 7. Cul es la temperatura y pH ptimos de la alfa amilasa salival (ptialina)? Responda las siguientes preguntas (si es necesario consulte y busque en la bibliografa): 1. Cules son las caractersticas estructurales del almidn? 2. Qu tipo de enzima es la alfa-Amilasa salival? 3. Cules son los productos que origina la accin de este enzima sobre el almidn? 4. Cul es el efecto del co-factor ClNa? 5. Qu funcin cumple el cido clorhdrico en este experimento? 6. Explique cmo influyen en la velocidad de las reacciones enzimticas una variacin en la concentracin del enzima presente, en la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. MATERIALES

Solucin del enzima amilasa al 1% M/V + ClNa % M/V Disolucin de almidn al 0,25 %. Lugol Tubos de ensayo. placa de porcelana, vasos de precipitado, bao de agua termostatado a 50 C, cronmetro,

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Mechero Gradilla Termmetro PIPETAS Gotero de HCl puro (cido clorhdrico)

EXPERIMENTO 1: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA de la CONCENTRACIN DE LA ENZIMA PROCEDIMIENTO: 1. Tome 4 tubos de ensayo y aada a cada uno 2 ml de disolucin de almidn al 0,25 %. 2. Agregue en cada tubo 3 ml de agua
3. Aada a cada tubo 1; 2; 3 y 4 ml de disolucin del enzima respectivamente, Aada

primero el agua y luego la disolucin del enzima, pues de lo contrario la reaccin comenzar a verificarse y usted no tendr en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente despus de adicionar la solucin del enzima en cada tubo ponga en marcha el cronmetro y comience a medir el tiempo del experimento. 4. En cada intervalo de 5 minuto ensaye en la placa de cermica la reaccin de la solucin experimental con el Lugol: para ello slo tiene que extraer 0.5 ml del tubo con la enzima y el almidn colocarlo en la placa y luego adicionar una gota de HCl puro (cido clorhdrico) y dos gotas del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados. 5. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reaccin alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solucin de control. Construya una tabla de datos brutos que contemple el nmero de cada tubo, el volumen de la enzima (ml.), Tiempo total de reaccin (min), Velocidad de la reaccin (1/t)

6. Con estos datos construya un grfico de c(E) en el eje ordenado contra velocidad de reaccin (vol/t) en el eje de abscisas.

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EXPERIMENTO # 2 ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO PROCEDIMIENTO: 1. Tome 4 tubos de ensayo y aada a cada 2 ml de solucin de almidn al 0,1%, 0,20%, 0,25 y 0,30% respectivamente. 2. Complete el volumen de cada tubo con 3 ml de agua destilada. 3. Adicione a cada tubo 4 ml de disolucin del enzima Alfa amilasa e incbelos a 50 grados Celsius. 4. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidn mediante la reaccin con Lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental # 1. 5. Con los datos obtenidos construya una de tabla de datos brutos. 6. Con los datos de la tabla construya un grfico de velocidad de reaccin (1 / tiempo) en el eje ordenado contra concentracin de sustrato en el eje de abscisas.

REPORTE DE LABORATORIO. Experimento # 1: Estudio de la influencia de la concentracin del enzima. 1. Describa qu caractersticas estructurales del almidn permiten su identificacin mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidn (esto ser la Introduccin de su informe). Describa en este aparatado la pregunta de investigacin puesta a prueba, la hiptesis y las predicciones, seale las variables involucrados as como el mtodo que utiliz para controlar al menos una de las variables control. 2: Materiales y Mtodo: explique con SUS PALABRA LOS MTODOS UTILIZADOS. 3. RESULTADOS: Anexe la tabla y el grfico de velocidad de reaccin contra c(E), tomando como concentracin del enzima el volumen de la solucin utilizado en cada tubo. Por qu se puede tomar como velocidad de reaccin el inverso del tiempo?. DESCRIBA LOS RESULTADOS 3. CONCLUSIONES Y EVALUACIN: Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados del experimento. EXPLIQUE LOS RESULTADOS ENCONTRADOS 4. Resuma las dificultades encontradas en el ensayo DEBIDO A LOS ERRORES DE DISEO EXPERIMENTAL

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Experimento # 2: Estudio de la influencia de la concentracin del sustrato. 1. Describa en este aparatado la pregunta de investigacin puesta a prueba, la hiptesis y las predicciones, seale las variables involucradas as como el mtodo que utiliz para controlar al menos una de las variables control. 2. 2: Materiales y Mtodo: explique con SUS PALABRA LOS MTODOS UTILIZADOS.

3. RESULTADOS: Anexe la tabla y el grfico elaborados segn las indicaciones del trabajo prctico, tomando como valor de c(S) la concentracin de sustrato en cada caso. Por qu en este caso para calcular la velocidad de la reaccin es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo? DESCRIBA LOS RESULTADOS 4. CONCLUSIN Y EVALUACIN: Analice el grfico y plantee las conclusiones a que puede llegaren este caso. EXPLIQUE LOS RESULTADOS 5. Describa las dificultades presentadas en este ensayo PUNTUALIZANDO EN LOS ERRORES DEL DISEO.