PARASITOLOGIA (DMIP) GRUPO DE TRABALHO EM BIOSSEGURANA
BIOTRIO E ZOONOSES
Elaborada por:
Fabiana Cordeiro Lus Filipe P. Feliciano Vanessa Binatti
Rio de Janeiro, Novembro de 2006.
Biotrio e Zoonoses Ao longo da evoluo cientfica e tecnolgica, a necessidade de realizar pesquisas com animais e manipular agentes patognicos levou a comunidade cientfica a desenvolver um tipo de laboratrio ou recinto especial o biotrio, com o intuito de: Manter a sade e o bem-estar dos animais dentro de padres de excelncia, determinando maior confiabilidade aos resultados experimentais; Proporcionar a segurana da equipe envolvida no trabalho; Assegurar a preservao do meio ambiente, evitando a sada de agentes de risco. Biotrios so instalaes capazes de produzir e manter espcies animais destinadas a servir como reagentes biolgicos em diversos tipos de ensaios controlados, para atender as necessidades dos programas de pesquisa, ensino, produo e controle de qualidade nas reas biomdicas, cincias humanas e tecnolgicas segundo a finalidade da instituio.
Tipos de biotrios: Criao aquele que mantm as matrizes reprodutoras das vrias espcies animais. Apresenta como objetivo no s a manuteno das linhagens como tambm a manuteno das matrizes para o biotrio de produo. Produo ou manuteno onde so criados os animais destinados s pesquisas e normalmente em grandes quantidades. Experimentao o que recebe animais criados no biotrio de produo e abriga, temporariamente, para experimentao. geralmente, associado ao laboratrio de pesquisas. OBS: Espcies animais s devem ser utilizadas em pesquisas, se no existirem mtodos ou sistemas alternativos que forneam resultados vlidos. Se no for possvel dispens-las, consenso que a dor e o sofrimento inerentes ao experimento, sejam evitados ou minimizados.
Os nveis de biossegurana (NB), para o trabalho com animais vertebrados so designados em ordem crescente como (NB) 1, 2 , 3 e 4, de acordo com o grupo de risco dos microorganismos manipulados, em associao s caractersticas e complexidade das instalaes, equipamentos de segurana e na aplicao de prticas recomendveis para conteno de riscos. Macroambiente o ambiente interno, existente em torno das gaiolas dos animais que dever atender as condies ideais para cada espcie que abriga. Devem ser observados os seguintes fatores: temperatura, umidade, ventilao, iluminao, filtrao do ar, rudo, presso e pestes.
O nvel de definio sanitria e gentica do animal de laboratrio interfere diretamente na disposio fsica das reas do laboratrio. Existem, basicamente, dois tipos de distribuio interna das reas no biotrio, conforme descrito pela A.A.L.A.S.(1997). A principal diferena entre eles est na disposio do acesso e sada das salas. No primeiro tipo, o mais simples, denominado biotrio convencional, o transito nas salas de animais feito por uma nica porta, a qual comunica-se com o corredor de acesso e sada. No segundo tipo, separam-se os fluxos de acesso e retorno das salas, os quais passam a ser efetivados por corredores independentes.
Este segundo tipo de biotrio foi idealizado para abrigar animais de melhor padro sanitrio. Em sua concepo, separam-se duas reas bsicas: 1)aquela destinada ao preparo do material a ser enviado para as salas de animais, incluindo o corredor de distribuio; e 2)o corredor de retorno das salas e a rea destinada a higienizao de materiais provenientes das salas. A rea 1 denominada rea de preparo/corredor de acesso e a rea 2 de limpeza/corredor de retorno. O fluxo de materiais e pessoas deve obedecer ao sentido:
rea de preparo Corredor de acesso Salas de animais
rea de limpeza Corredor de retorno
O edifcio destinado ao biotrio dever ser planejado para apresentar um ambiente mais isolado possvel do exterior. No aconselhvel o revestimento cermico (azulejos e ladrilhos) para paredes ou piso, em virtude das frestas. Para pisos e tetos, aconselha-se revestimento monoltico.
Condies do ambiente O animal de laboratrio deve ser visto como um reagente biolgico. Tudo o que o circunda, de uma forma ou outra, pode exercer influencias nas caractersticas deste reagente. Essa diferena reflete-se principalmente na resposta do animal a determinados experimentos. A manuteno de condies ambientais estveis, portanto, ir assegurar a produo dos resultados experimentais, uma vez que resultados diferentes podero ser obtidos para idnticos parmetros experimentais com animais em diferentes condies ambientais.
Controle do ar atmosfrico O biotrio deve possuir ventilao local exaustora (VLE). fundamental que o ambiente possua o mnimo de variao climtica. Sendo que a temperatura recomendada para roedores est entre 20 e 24C; e para coelhos, 15 a 22C. A umidade relativa est entre 45 e 75%.
Iluminao Trs fatores associados com a luz so importantes para as condies ambientais doa animais de laboratrio: 1. Durao do fotoperodo (horas/luz x horas/escuro); 2. Intensidade, expressa em Lux (Lmen/m 2 ); 3. Comprimento de onda ou cor, expressa em Angstrons.
A luz visvel estimula fotorreceptores e responsvel pela fotoperiodicidade, a qual regula os ritmos circadianos, ciclos reprodutivos, atividade locomotora, consumo de alimento e gua, temperatura corprea, toxicidade e efetividade de drogas, nveis sricos de lipdios e outros elementos. A proporo entre os perodos de claro (C) e escuro (E) podem alterar a durao do ciclo estral em ratos. Portanto, utilizado o regime de 12C/12E ou de 14C/10E em muitos biotrios.
Rudos A maioria das espcies animais, incluindo as de laboratrio ouvem sons de freqncias superiores quelas audveis pelo homem, ou ultra-som. Lembramos que a diviso da faixa de freqncias em som e ulta-som est meramente relacionada capacidade auditiva humana. Tanto animais quanto o homem apresentam, dentro de suas faixas de freqncias de audio, as chamadas faixas de sensibilidade, ou seja, um ou mais intervalos de freqncias nos quais maior a percepo da intensidade do som.
TABELA Intervalo de frequncia e faixa de sensibilidade auditiva para diferentes espcies. Espcie
Faixa Auditiva (dB)
Faixa de Sensibilidade (dB) Camundongo
0.75 a 85
10 a 20: 55 a 65
Hamster 0.35 a 60 1 a 10 *Rato 0.1 a 65 35 a 40 Cobaia 0.1 a 35 0.2 a 1 Coelho 0.1 a 40 0.7 a 5 Co 0.1 a 55 0.5 a 30 Homem
0.02 a 20
0.7 a 8
A influncia do som nos animais de laboratrio pode ser dividida em dois grandes grupos: 1) efeitos auditivos, relacionados s leses experimentais provocadas por rudos de intensidade e freqncia variadas; e 2) efeitos no-auditivos, associados ao estresse. Neste ltimo, encontram-se os principais efeitos para os animais no biotrio.
Microambiente o ambiente existente em torno do animal em sua gaiola, e que envolve os seguintes fatores: gaiola propriamente dita, odor, cama, rao, gua e ninho. As gaiolas, atualmente confeccionadas em diversos tipos de plstico, tendem a manter dimenses padronizadas. Com relao quantidade de animais por caixa, recomendam-se os seguintes parmetros:
Riscos provenientes do manejo com animais: Infeco os animais podem excretar microrganismos nas fezes, urina, saliva ou aeroliz-los, originando, consequentemente, infeces. Os patgenos podem tambm ser inoculados por mordedura ou arranhaduras; bem como por transmisso direta (contato). Traumtico - por agresso. Aspectos inerentes a riscos biolgicos A higiene pessoal rigorosa uma das barreiras efetivas para preveno de infeces. O simples procedimento de lavagem de mos antes e aps a manipulao ou contato com animais e derivados, reduz o risco de contaminaes. Tanto os funcionrios do biotrio como pesquisadores e visitantes autorizados devem fazer uso de equipamentos de proteo individual (EPIs), ao entrar ou trabalhar em recintos de animais. Fumar, ingerir lquidos e alimentos, utilizar cosmticos e adornos, manipular lentes de contatos, so prticas que devem ser abolidas em salas de animais, reas de apoio e laboratrios. Cuidados especiais devem ser observados em unidades onde so mantidos primatas no humanos e animais silvestres, espcies em que o potencial zoontico alto ou no est ainda estabelecido. Equipamentos especiais para controle de contaminao ambiental: Sistema de conteno de animal de ar limpo previne a propagao de infeces entre os animais; um sistema parcial e necessita de equipamentos de proteo individual para os tcnicos. Autoclaves mtodos de aplicao de calor mido por presso so os mais eficazes de esterilizao de materiais oriundos de laboratrios de experimentao animal. Incineradores mtodo til para o descarte dos resduos dos laboratrios de experimentao animal. Os incineradores podem produzir fumaa, gases, cinzas e odores. Barreiras secundrias incluem paredes, pisos, tetos, portas e janelas, devendo todos serem lavveis para facilitar a higienizao.
Manejo de Animais Silvestres 1. Coletar soro e estocar a -20C. 2. Conhecer os sinais e sintomas das principais zoonoses que podem ocorrer nas diferentes regies de estudo, considerando as medidas de preveno. 3. Todo animal capturado no campo dever ser trabalhado no local de captura ou em lugar prximo, evitando a sua transferncia para centros de pesquisa. 4. Utilizar EPIS. 5. Manipular armadilhas contendo roedores somente com luvas de borracha resistentes. Estas armadilhas devero ser colocadas imediatamente dentro de saco plstico duplo at a sua abertura em local adequado, onde todo o pessoal envolvido dever estar utilizando roupas descartveis e equipamento de proteo respiratria. 6. Transportar animais capturados at a rea de processamento, em carroceria ou bagageiro, evitando-se contato com a equipe no interior do veculo. 7. Processar os animais em uma rea previamente escolhida, longe da circulao de pessoas ou presena de animais domsticos ou criaes. Em ambiente aberto, com boa ventilao e ao da luz ultravioleta natural, manter a direo do vento nas costas das pessoas. Caso o processamento seja realizado em sala fechada, maiores cuidados devero ser aplicados, incluindo desinfeco de toda rea e do material utilizado. 8. As pessoas que no participarem do processamento final dos animais silvestres devero permanecer a pelo menos 10 metros de distncia, contra o vento, evitando, assim a inalao de aerossis. 9. Anestesiar profundamente todos os animais antes de seu manuseio fora das armadilhas. Utilizar anestsicos inalatrios como metoxipluorane que mais seguro com a menor margem de erro quando comparado com outros. 10. Coletar sangue atravs do plexo retroorbital ou por puno cardaca, na dependncia do volume de sangue necessrio, do tamanho do animal e da prtica do pessoal envolvido. Evitar a formao de aerossis durante o processamento do material. 11. Utilizar desinfetantes como hipoclorito, lisol, fenol, entre outros na: limpeza das luvas aps manipulao de armadilhas, descontaminao de armadilhas, limpeza das luvas aps manipulao/ disseco de cada roedor e antes da remoo das luvas aps finalizao dos procedimentos, lavagem e desinfeco de todos os instrumentos usados e limpeza das superfcies de trabalho ou de outros materiais que possam estar contaminados. 12. A necropsia assim como a taquidermizao devero ser realizadas por pessoal previamente treinado, com instrumentos que reduzam a possibilidade de acidente. Evitar o uso de tesoura aps abertura da cavidade abdominal. Todo o material como luva, gaze, papel toalha, assim como a superfcie de trabalho devero ser desinfetadas antes do processamento de outro animal. O material a ser encaminhado para o museu dever ser colocado em soluo de formol a 10%. 13. Evitar a transferncia de ectoparasitas como carrapatos, pulgas e piolhos, transmissores de patgenos, para o pessoal que manipula animais silvestres utilizando roupas apropriadas (claras com punho bem justo) com luvas, podendo se utilizar, quando indicado repelentes. 14. Realizar o descarte do material em bolsas de polietileno impermeveis, opcas de cor vermelha, com espessura de 120 microns . Utilizar papel absorvente em caso de material lquido, impedindo o seu derramamento. O tratamento final ser autoclavao, seguida de incinerao. Todo material corto-perfurante dever ser desprezado em descartadores resistentes a perfuraes e a golpes, e submetido autoclave. 15. Procurar assistncia mdica, qualquer indivduo que apresente doena febril aps contato com animal silvestre, considerando o tempo potencial de exposio a cada patgeno. Uma amostra de sangue dever ser coletada e encaminhada, junto com a amostra padro, para a anlise.
Roupas e Equipamentos 1. Jaleco cirrgico descartvel Verificar a presena de punhos elastizados, considerando a necessidade de proteo contra carrapato e pulga. 2. Protetor de olhos e face Visor de policarbonato com ajuste facial. Verificar a existncia de bloqueio para o acesso de aerossis. 3. Luvas Verificar a especificao tcnica para determinar o grau de proteo. 4. Respirador Com a recente mudana na nomenclatura e na certificao dos filtros utilizados nestes respiradores, a denominao atual N-100 (99.97), equivalente ao filtro HEPA. recomendada para profissionais que trabalham com roedores, potencialmente reservatrios de hantavrus e arenavrus. Os equipamentos devero estar em conformidade com a norma 42CFR84 (EEUU). Marca: 3M do Brasil.
Tipos de populaes de animais: Populaes Vantagens Desvantagens Animais silvestres 1. permitem a avaliao da freqncia de uma doena; 2. os animais esto expostos ao ciclo natural da doena; 3. permitem a avaliao da patogenicidade de um agente em seu ambiente natural. 1. observao de resultados e registros de dados limitados; 2. informaes bsicas sobre vrias espcies ainda so escassas; 3. dificuldade de manuteno em laboratrio; 4. portadores potenciais de agentes patognicos para o homem e animais domsticos; 5. em geral, apresentam comportamento agressivo; 6. risco de extino da espcie. Animais domsticos 1. vivem em ambiente semelhante ao do homem; 2. permitem o estudo de doenas de ocorrncia espontnea, com via natural de infeco; 3. informaes bsicas sobre estas espcies so abundantes; 4. em geral, so animais muito dceis; 1. Difcil manuteno em virtude do custo elevado; 2. A utilizao para outras finalidades (companhia, produo) muitas vezes inviabiliza o emprego do animal em experimentao. Animais de laboratrio 1. fcil manuteno e observao; 2. permite que se trabalhe com uma quantidade muito grande de indivduos; 3. ciclos vitais curtos (prenhez, lactao, puberdade, etc); 4. permite a padronizao do ambiente; 5. permite a padronizao gentica; 6. permitem transplantes ou transmisso de tumores; 7. grande quantidade de informaes bsicas disponveis. 1. vivem em ambiente totalmente artificial; 2. dieta padronizada; 3. as doenas so artificialmente induzidas, na grande maioria dos experimentos.
Apesar de serem descendentes de espcies naturalmente agressivas, os animais de laboratrio, atualmente mantidos em biotrio, so muito distintos daqueles animais utilizados h sculos atrs, pois devido seleo gentica e convivncia com o homem, tornaram-se animais de fcil manipulao. As modificaes induzidas nesses animais so baseadas num complexo trabalho de acasalamentos direcionados, que visa manter nos filhotes algumas caractersticas dos pais, eliminando comportamento ou alteraes indesejveis. Como exemplo, pode ser citado a docilidade: os atuais ratos de laboratrio em nada se assemelham aos extremamente agressivos ratos de esgoto. Um outro importante exemplo diz respeito aos animais isognicos. Atravs de acasalamentos consangneos sucessivos entre irmo e irm, durante pelo menos 20 geraes, estabeleceram-se as linhagens isognicas de camundongos. Os isognicos so geneticamente idnticos entre si, fato que permite a transplantao de tecidos e rgos. Como algumas linhagens de camundongos desenvolvem tumores espontneos, tornou-se possvel um maior avano no estudo sobre doenas neoplsicas, e conseqentemente, grandes conquistas no tratamento contra o cncer humano.
Padro sanitrio dos animais de laboratrio Outro item merecedor de ateno diz respeito obteno de animais cujo padro sanitrio pode ser definido. Atravs de tcnicas especiais de criao e manuteno, podemos ter animais livres de qualquer forma de vida associada. O conjunto de formas de vidas associadas denominado microbiota (vrus, bactrias, fungos e parasitas). Quanto mais eficientes forem as barreiras sanitrias do biotrio, menores as chances de contaminao dos animais. Em funo das barreiras disponveis podemos classific-los em trs grupos, de acordo com seu padro sanitrio, ou seja, quanto microbiota que a eles esteja associada: 1. Convencionais ou holoxnicos: tal denominao se refere aos animais de padro sanitrio convencional, isto , queles que possuem microbiota indefinida por serem mantidos em ambiente desprovido de barreiras sanitrias rigorosas. Sua criao apresenta apenas princpios bsicos de higiene onde se procede somente limpeza e desinfeco do ambiente e material utilizado. Quanto ao pessoal tcnico, em geral, realiza-se apenas troca de uniformes (avental) para o trabalho com os animais. 2. Livres de patgenos especficos (Specific Pathogen Free = SPF) ou heteroxnicos: animais SPF so aqueles que no apresentam microbiota capaz de lhes determinar doenas, ou seja. albergam somente microorganismos no patognicos. Sua criao realizada em ambientes protegidos por barreiras sanitrias rigorosas que podem ser resumidas do seguinte modo: cada vez que se entra nas reas com animais, os tcnicos devem tomar banho e utilizar uniforme esterilizado; todo o material a ser utilizado (peas do vesturio, rao, gaiolas, cama, gua, bebedouros e outros) deve ser esterilizado, seja, por meio de autoclavagem, cmara com gs esterilizante, ou soluo desinfetante em tanque de passagem de materiais. Sua criao tambm pode ocorrer dentro de isoladores. 3. Gnotobiticos: so animais que possuem microbiota associada definida, e devem ser criados em ambientes dotados de barreiras sanitrias absolutas. A produo de indivduos de to alto padro sanitrio s alcanada atravs de sua manuteno em isoladores. Em funo da quantidade de microbiotas que estejam associados ao animal, este pode ser classificado como: Axnico ou "Germfree": refere-se ao animal totalmente livre de microbiota, isto , quaisquer vrus, bactrias, fungos, ou parasitas; Monoxnico: o animal que foi contaminado deliberadamente com apenas um tipo de microbiota, o que equivale a dizer que possui um microbiota associado; Dixnico: a designao dada ao animal que foi contaminado deliberadamente com dois tipos de microbiota; Polixnico: o termo relativo ao animal que foi deliberadamente contaminado com vrios microbiotas. Considerando o conceito de reagente biolgico, verifica-se que a obteno de animais de laboratrio, adequadamente padronizados, envolve a adoo de tcnicas de criao e manuteno especficas, que devem ser rigorosamente obedecidas. A esse conjunto de tcnicas denomina-se cincia de animais de laboratrio. O padro de qualidade dos animais pode interferir de modo significante no resultado fi nal de um experimento, e atentando para o fato de que o objetivo de quaisquer pesquisas servir, direta ou indiretamente, ao ser humano, pode-se avaliar o que significariam possveis falsos resultados obtidos em virtude do emprego de modelos inadequados. Deste modo, qualquer progresso na rea de bioterismo representa uma valiosa contribuio para o desenvolvimento da cincia e melhoria das condies de vida do homem.
Higiene, desinfeco e esterilizao Higiene o conjunto de princpios que propiciam a condio de sade fsica e sua manuteno para homens e animais. Nos biotrios, a boa higiene composta da limpeza, que a remoo mecnica de sujidades, e da desinfeco e/ou esterilizao das diferentes reas de trabalho e dos materiais utilizados nas rotinas. Todo material utilizado no biotrio deve ser devidamente desinfetado. As caixas devem ser lavadas com gua e detergente, sendo posta de molho em soluo de hipoclorito de sdio 1-2% por 10 minutos. Os bebedouros devem ser lavados periodicamente para se evitar a proliferao de microorganismos. OBS: gaiolas de metal no podem ser desinfectadas com soluo de hipoclorito, pois este corrosivo. Recomenda-se a sua desinfeco em Forno Pasteur. O piso e as paredes devem ser limpos com soluo de hipoclorito de sdio ou cresol (a famosa creolina uma mistura de cresis). A manuteno das rotinas de higiene nas colnias de animais de laboratrio , sem dvida, um dos pontos de maior importncia para o sucesso de uma criao ou de um experimento. Deve-se cuidar de todos os materiais que entraro na colnia, alm da rao, gua, com um cuidado extremo para que o trabalho no seja perdido em qualquer dessas etapas. Todos os estgios de limpeza em um biotrio, como troca de gaiolas, limpeza de estantes etc., geram aerossis com alta quantidade de bactrias, portanto, a limpeza do material deve ser em reas separadas das salas de criao. O descarte das camas por aspirao constitui um mtodo seguro. O microambiente do animal de extrema importncia, pois os animais confinados em gaiolas ou jaulas esto certamente em um ambiente diferente do seu habitat natural. Deve-se, portanto, promover a maior limpeza e higiene possvel para que o animal fique confortvel e no venha a desenvolver doenas e contuses. A degradao dos excretas por bactrias no interior das caixas gera a produo de amnia, que provoca alteraes inflamatrias no epitlio traqueal. As salas do biotrio de experimentao devem ser limpas antes e aps os testes. Deve-se desinfetar as salas com um desinfetante na forma de aerossol (formaldedo ou cido peractico) por no mnimo 24h. Os animais sacrificados ou mortos durante o experimento devem ficar conservados em congelador a -20C at o momento de seguir para o incinerador. OBS: no uso de agentes qumicos como desinfetantes ou anti-spticos, deve-se considerar a sua toxicidade, formao de vapores, manchas e efeitos destrutivos de instrumentos. Os desinfetantes ou anti-spticos usados sobre um ambiente onde esto os animais devem ser relativamente atxico para tecidos.
Alguns agentes qumicos utilizados em biotrio: lcoois: agem desnaturando as protenas e dissolvendo a membrana lipdica dos microorganismos. Utiliza-se na diluio 70%, pois o lcool absoluto menos ativo que as misturas lcool e gua, devido s protenas no serem desnaturadas to rapidamente como quando na presena de gua. Hipoclorito de sdio: inativa por oxidao dos grupos sulfidrilas livres. Utiliza-se na diluio 1-2% por 10 min. Atua na desinfeco de superfcies em todos os ambientes. OBS: No deve ser usado em metal por ser corrosivo. Tabela. Mtodos de esterilizao Mtodo
Tratamento
Aplicao
Calor mido
121C x l5 minutos 126C x 10 minutos 134C x 3 minutos
Rao, cama, caixas de metal e de plstico resistentes, tampas de gaiolas, prateleiras, bebedouros, tampas, instrumentos cirrgicos. Calor seco
160C x 45 minutos 170C x 18 minutos 180C x 7.5 minutos 190C x 1.5 minutos
Instrumentos cirrgicos, tampas de gaiolas, gaiolas de metal, cama.
xido de etileno com vapor
1.200 mg/litro a 80C x 1-2 horas
Rao, cama, todo tipo de caixa, bebedouros, tampas de gaiolas, papel e livros, microscpios e outros equipamentos delicados. Formaldedo com vapor
5 ml de formalina/ 0,03 m 3 a 80Cx 1-2 h
Salas, utenslios de limpeza.
Paraformaldedo em tabletes
Despolimerizao de 5 g/m 3 a 20Cx24 h
Cmaras para formol, salas, utenslios de limpeza.
cido peractico
2% x 20 minutos
Isoladores e air lock
radiao gama
l-5Mrads
Rao, seringas embaladas, material cirrgico. ladiao ultra violeta
1.000-1 50. 000 u W/cm 2
Sistemas simples de passagem de material.
Filtrao
Filtro HEPA (99.997% de eficincia para partculas <0,5 n
Sistemas de ventilao.
* Extrado de: The UFAW handbook on the care and management of laboratory animais. 1987.
Identificao e registros Em determinadas situaes necessrio identificar individualmente os animais. A marcao deste tipo deve, sempre que possvel, ser permanente e no prejudicial sade dos animais. de fcil aplicao e visualizao e ainda deve permitir a marcao de um grande nmero de indivduos, possibilitando sua discriminao.
Alguns tipos de marcaes individuais mais utilizadas: Aplicao de corantes: geralmente so utilizadas solues concentradas de cido pcrico (amarelo), fuccina (roxo), violeta de metila ou genciana(violeta), verde brilhante ou de etila (verde) ou azul de trypan (azul). Com uma haste com algodo, pinta-se preferencialmente a regio do dorso do animal. Tambm pode ser corada a cauda e a regio abdominal; Perfuraes ou chanfraduras: Tcnica adotada principalmente em camundongos e ratos. As perfuraes ou chanfraduras so realizadas nas orelhas, o que apresenta a vantagem de ser facilmente visualizvel, alm de permanente. Antes de se efetuar a identificao dos animais por esse mtodo, realiza-se a assepsia do pavilho auricular e, no caso de animais adultos, recomenda-se proceder anestesia; Tatuagens: Mtodo utilizado preferencialmente em coelhos e cobaias. So tatuados nmeros e letras. As tatuagens so feitas em regies menos vascularizadas da superfcie interna do pavilho auricular e indispensvel a assepsia e anestesia local. Coleiras ou brincos: As coleiras so adequadas para ces e gatos, enquanto os brincos, so utilizados em animais de grande porte, como caprinos, sunos, ovinos, eqinos e bovinos. Fichas de identificao e livro de registros: Talvez o trabalho de maior responsabilidade a ser executado no biotrio seja o de anotar os eventos ocorridos com os animais, nas respectivas fichas de identificao de gaiolas, e em livros de registro. As fichas e os livros devem conter informaes suficientes para que se tenha, a cada momento, uma posio exata de tudo o que acontece no biotrio. Somente atravs de um rigoroso sistema de fichas de identificao de gaiolas podemos compor todo fluxo de informaes do biotrio. Sendo assim, as informaes so provenientes de pelo menos quatro diferentes fontes: . 1. Gaiolas: cada uma deve ter uma ficha de identificao contendo informaes atualizadas de todos os eventos ocorridos em seu interior como: acasalamentos, datas de nascimentos, quantidade de filhotes nascidos, mortes, etc. 2. Salas: as informaes obtidas de cada gaiola passam a compor o respectivo livro de registros, que resume todos os eventos ocorridos em cada uma das salas. 3. Biotrio: as informaes provenientes de cada uma das salas devem compor o relatrio dirio dos eventos ocorridos no biotrio. 4. Chefia: com base em todos os dados anteriores, orienta a entrega de animais, direciona os acasalamentos e a manuteno de estoque de cada espcie produzida.
Tcnicas anestsicas O animal de laboratrio, utilizado frequentemente como material de pesquisa que envolve procedimentos cirrgicos diversos, necessita, por questes de melhor manejo e acima de tudo humanitrias, ser submetido anestesia. A diversidade de espcies animais utilizadas para experimentao, bem como as diferentes linhagens e variaes individuais, propiciaram o incremento de diversas drogas e tcnicas anestesiolgicas com a finalidade de melhor induzir a anestesia, objetivando eficincia, segurana e reduo de custos. TABELA. Vias e locais de administrao, volume mximo recomendado para injeo e dimenso de agulhas para cada espcie. ESPCIES
r.nucal.- regio nucal; f.p.coxa - face posterior da coxa
O exame clnico deve ser realizado por mdico veterinrio ou tcnico especializado habituado com o manejo das espcies em questo. Alteraes "grosseiras" como estado de alerta, padro respiratrio, presena de secrees nasais ou oculares e diarreia podem ser facilmente diagnosticadas evidenciando a ocorrncia de anormalidades. Uma vez detectada a alterao, o procedimento experimental deve ser adiado e a causa identificada.
Medicao pr-anestsica (MPA) So drogas administradas previamente aos anestsicos, objetivando a reduo do estresse e da dor, diminuio da dose do agente anestsico, induo e recuperao suave da anestesia e reduo das secrees. Exemplos: Atropina: Reduz secrees salivares e brnquicas; promove discreta taquicardia sendo indicada no preparo dos animais tratados com" xilazina e fentanil; Diazepam e midazolam: Promovem sedao, e relaxamento muscular. Geralmente so associados aos anestsicos dissociativos como a quetamina e a tiletamina. Anestsicos
Anestsicos Dissociativos (quetamina e tiletamina) Isoladamente promovem apenas imobilizao acompanhada de rigidez muscular. Em doses rotineiras, induzem analgesia superficial (pele, musculatura). Aumentam a secreo salivar: e portanto recomenda-se a administrao prvia de atropina. Mantm reflexos protetores presentes, no permitindo adequada monitorizao da anestesia. Para atenuar seus efeitos colaterais, a quetamina deve ser associada xilazina ou aos benzodiazepnicos (diazepam e midazolam). A tiletamina j se apresenta no mercado associada ao benzodiazepnico denominado zolazepam. Barbitricos (tiopental e pentobarbital) So agentes hipnticos que induzem desde simples sedao at anestesia geral. O pentobarbital tem tempo de ao entre 30 e 90 minutos dependendo da espcie e via de administrao (intravenosa ou intraperitoneal). O tiopental promove anestesia durante um perodo de 10 a l5 minutos e deve ser administrado exclusivamente pela via intravenosa. So importantes depressores da respirao. No so bons analgsicos, porm, excelentes miorrelaxantes. O perodo ps-operatrio faz parte do protocolo analgsico, sendo extremamente importante os cuidados ministrados ao animal neste momento. Complicaes como a depresso respiratria, que ocorre durante o ato anestsico e que pode se prolongar aps o mesmo, torna-se fatal, se o profissional no estiver atento.
Eutansia
A eutansia a conduta atravs da qual busca-se abreviar a vida de um ser vivo, sem dor ou sofrimento, cuja prtica adotada tambm pelo tcnico de biotrio, em vrias ocasies. O mtodo de eleio para a prtica da eutansia deve ser rpido, indolor, adequado espcie, idade e nmero de animais, e o tcnico deve realiz-lo distante de outros animais, fora da rea de criao e manuteno, e de preferncia em um laboratrio. Tambm a finalidade para a qual o animal foi utilizado deve ser considerada, pois o mtodo adotado pode interferir no resultado final de um experimento. Mtodos fsicos como deslocamento cervical e traumatismo craniano so satisfatrios para eutansia de camundongos e ratos com menos de 200g de peso, ms tambm podem ser indicados para coelhos e aves. Alm desses, a decapitao realizada atravs do auxlio de uma guilhotina tambm recomendada para roedores e coelhos de pequeno porte. Quando possvel, os animais devem ser sedados ou anestesiados, antes de sua realizao. Tambm pode ser realizada a Exanguinao. Este mtodo, realizado por meio de puno cardaca ou de vasos sanguneos de grande calibre, frequentemente utilizado para obteno de soro hiperimune de roedores e coelhos, os quais devem ser previamente sedados ou anestesiados, pois pode-se observar inquietao associada hipovolemia. Caso isso no seja possvel, devido interferncias indesejveis das drogas, a eutansia deve ser realizada por pessoas muito bem treinadas. Tambm pode ser realizada a eutansia por inalao de CO 2 . Para sua utilizao, devemos contar com cmara previamente preenchida com esse gs puro. Este gs tem rpida ao letal por provocar depresso do sistema nervoso central. So utilizados pela via intravenosa o pentobarbital sdico e derivados, que so barbitricos, mas caso outras vias forem utilizadas, verifica-se um retardo de tempo do efeito anestsico da droga, e conseqentemente do tempo para realizao da eutansia. O pentobarbital sdico frequentemente utilizado para anestesia e eutansia, e pode ser administrado por via intravenosa, intracardaca ou intraperitoneal, com pelo menos o dobro, ou o triplo da dose anestsica. Para eutansia de ratos e hamsters o pentobarbital pode ser administrado por via intraperitoneal, na dose de 100 mg/Kg e 80-150 mg/Kg, respectivamente, enquanto que para coelhos utilizado na dose de 200 mg/kg, por via intravenosa. O tempo observado para sacrifcio dos animais varia de 10 a 15 minutos, todavia um exame cuidadoso deve ser realizado para constatao de total parada respiratria e morte, antes de seu descarte ou utilizao.
Animais mais utilizados: Co domstico (Canis familiares). Este animal, apesar do alto custo, dificuldade de manuteno e elevado risco de uso, muito empregado em pesquisa experimental na rea da fisiologia, tanto no estado de viglia quanto anestesiado, particularmente como preparao aguda e crnica para estudo do aparelho cardiovascular, com ou sem instrumentao permanentemente implantada, a exemplo de cateteres vasculares e intracardacos. O co de uso corrente o chamado co de rua, de raa mista, conhecido como mongrel. usualmente capturado pelos servios sanitrios de controle da raiva, doena 100% mortal para o homem, pelo que se deve prudentemente usar animais vacinados e devidamente quarentenados, ou proteger-se devidamente com luvas e jalecos e evitar mordidas pelo emprego de mordaas, bem como contato com a saliva. um animal muito sensvel emocionalmente, o que pode comprometer experimentos mal controlados conduzidos no estado de viglia. Principais zoonoses: raiva, leptospirose, salmonelose, brucelose, tuberculose, leishmaniose, dermatofitose e escabiose. Cobaia (Cavia porcellus). Podem atingir entre 600 e 800 g. um animal dcil, largamente usado, pouco dispendioso e de fcil criao e manuteno em cativeiro. Tolera repetidas punes cardacas para coleta de sangue e para administrao de drogas. No possuem boas veias para injeo de substncias. So excelentes para fornecimento de rgos e tecidos para preparaes in vitro, a exemplo do leo, que clssica e amplamente empregado em farmacologia. Principais zoonoses: salmonelose, pasteurelose, listeriose, pneumonia por Bordetella bronchiseptica, leptospirose e dermatofitoses. Coelho (Oryctolagus cuniculus). No um animal roedor, pertencendo ordem Lagomorpha. A variedade albina de fcil criao, especialmente a raa New Zealand, que chega a ter 45 kg de peso corporal. Apresenta algumas dificuldades de manuteno em biotrios, pois relativamente dispendioso, sensvel manipulao e pouco resistente s infeces. Existem muitas raas, todas excelentes para estudos farmaco1gicos e imunolgicos. um bom modelo experimental para estudo da aterosclerose. Drogas podem ser administradas por via oral, por meio de sonda gstrica ou na gua de beber, bem como por outras vias. Injees intravenosas podem ser feitas com muita facilidade na veia marginal da orelha, pela qual tambm se podem colher facilmente amostras de sangue para diferentes anlises. No muito utilizado para estudos do aparelho cardiovascular. Principais zoonoses: pasteurelose, salmonelose, listeriose, leptospirose e pneumonia por Bordetella bronchiseptica. Camundongo (Mus musculus). Os adultos, que pesam cerca de 30-40 g, so muito utilizados em grande variedade de experimentos, pelo baixo custo e facilidade de criao em larga escala. So particularmente empregados nas reas da imunologia e da patologia. Diversas vias de administrao de drogas podem ser usadas sem dificuldades, inclusive a venosa e a intracerebral. Pode-se provocar fcil sangria pela puno do seio venoso orbital. Representam modelos experimentais de muitas condies patolgicas humanas. Principais zoonoses: coriomeningite linfoctica, micoplasmose, pasteurelose, raiva, salmonelose e hantavrus. Rato (Rattus norvegicus). maior que o camundongo, com tamanho bastante satisfatrio para grande multiplicidade de estudos; de baixo custo e de fcil manejo e acomodao em laboratrios e biotrios. Apresenta grande resistncia s infeces. Juntamente com o camundongo, constitui-se no animal mais comumente empregado para pesquisa experimental. O animal adulto pesa entre 150 e 500 g, dependendo da espcie. muito til e amplamente empregado para experimentao cardiovascular, permitindo fcil obteno direta e registro da presso arterial sistmica, via artrias femoral e cartida comum. Drogas podem ser administradas no animal acordado, pelas veias da cauda e peniana ou por via peritoneal, e no animal anestesiado, pela veia jugular. Fornece tecidos que se constituem em excelentes preparaes farmaco1gicas para emprego in vitro. Tambm constituem-se em modelos experimentais de muitas patologias do homem. Principais zoonoses: leptospirose, micoplasmose, raiva, febre da mordida do rato, pasteurelose e hantavrus. Hamster (famlia Cricetidae). Os hamsters por suas caractersticas imunogenticas podem ser utilizados para estudos com tumores, parasitas, vrusm, bactrias e em pesquisas em dentes, pois a forma e ocluso dos molares semelhante ao humano e possvel induzir leses sem fraturas. Os hamsters hibernam sob condies ambientais apropriadas permitindo conduzir estudos sobre fisiologia em baixas temperaturas ambientais. Principais zoonoses: leptospirose, salmonelose, micoplasmose e raiva. Zoonoses: so doenas e infeces naturalmente transmissveis entre os hospedeiros vertebrados e o homem. Principais zoonoses: Raiva - Agente etiolgico vrus rbico, pertencente ao gnero Lyssavirus. - Transmitida ao homem pela inoculao do vrus rbico, contido na saliva de animal infectado, principalmente pela mordedura. - Perodo de incubao varivel de dias at um ano (em mdia 45 dias no homem); intrinsecamente ligado localizao e gravidade da mordedura, arranhadura ou lambedura de animais infectados, proximidade de troncos nervosos, e quantidade de partculas virais inoculadas. - Sintomas no animal: alteraes de comportamento, depresso, demncia ou agresso, dilatao da pupila, fotofobia (medo do claro), falta de coordenao muscular, mordidas no ar, salivao excessiva, dificuldade para engolir devido paralisia da mandbula, dficit mltiplo de nervos cranianos, e paralisia dos membros posteriores. No homem: febre pouco intensa (38 C) acompanhada de dor de cabea e depresso nervosa, inquietude, agitao, espasmos dolorosos na laringe e faringe e passando a respirar e engolir com dificuldade. Os espasmos estendem-se depois aos msculos do tronco e das extremidades dos membros, de forma intermitente e acompanhado de tremores generalizados, taquicardia e parada de respirao. - Reservatrio - co, camundongo, rato e hamster. - Medidas de controle vacinao preventiva para os animais; observao clnica por 7 a 10 dias de animais que tiverem mordido algum ou que apresentarem sinais suspeitos de raiva; remessa imediata a um laboratrio para o exame correspondente; imunizao pr-exposio das pessoas que correm alto risco de infectar-se. - Instrues para tratamento de mordeduras limpar e lavar imediatamente o ferimento (primeiros socorros); limpar cuidadosamente o ferimento, sob superviso mdica; administrar soro anti-rbico e/ou vacina, conforme indicado; desaconselha-se suturar ou fechar a ferida a menos que seja imperioso. Dermatofitose - Agente etiolgico (fungo) Microsporum sp ,Trichophyton sp, Epidermophyton floccosum. - Transmitida atravs do contato direto com as leses do animal e indireto, atravs de pelos ou escamas contaminadas. - Sintomas no homem e no animal: leso que provoca queda dos plos ou cabelos em reas circulares e deixando em seu centro placas escamosas. - Reservatrio homem, co, gato e bovinos. - Perodo de incubao 1 a 2 semanas. - Medidas de controle evitar contato com animais e/ou objetos utilizados pelos mesmos; queimar os objetos contaminados. Escabiose (ou sarna) - Doena causada por artrpode. - Agente etiolgico Sarcoptes scabiei. - Transmitida atravs do contato direto com as leses do animal ou por intermdio de objetos, panos e/ ou roupas que entrarem em contato com o animal doente e em seguida com uma pessoa. - Sintomas no homem e no animal: leses em formas de vesculas, ppulas ou pequenos sulcos, nos quais ele deposita seus ovos. O prurido intenso, principalmente durante a noite, por ser o perodo de reproduo e deposio de ovos. - Reservatrio homem, co e cobaia. - Perodo de incubao de 1 dia a 6 semanas. - Medidas de controle Tratamento dos animais e pessoas doentes; lavar objetos e panos contaminados com gua quente (pelo menos 55 C); buscar casos nos outros animais residentes no biotrio. Leptospirose - Doena causada por bactria. - Agente etiolgico Leptospira interrogans. - Transmisso contato da pele por soluo de continuidade, por gua, solo mido ou vegetao contaminada com urina de animais infectados; ocasionalmente atravs de ingesto de alimentos contaminados com urina de rato contaminado. - Sintomas no homem: febre, dor de cabea, dores musculares, conjuntivite, vmitos e diarria com sangue, pode haver ictercia e pequenos pontos avermelhados na pele. No animal: febre, rigidez muscular nas patas, feridas na boca e ictercia. - Reservatrio co, cobaia, coelho, rato e hamster. - Perodo de incubao de 3 a 13 dias, com variao de at 24 dias. OBS: A leptospira pode ser excretada na urina durante 11 meses. - Medidas de controle isolar os animais suspeitos e tratar; vacinao animal; educao sanitria; proteo dos trabalhadores. Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) - Doena causada por protozorio. - Agente etiolgico no Brasil os mais importantes so: Leishmania Viannia braziliensis, Leishmania Leishmania amazonensis, Leishmania Viannia guyanensis. - Transmisso picada de insetos flebotomdeos do gnero Lutzomya. - Sintomas no homem: presena de ppulas, que evoluem para ulceraes com bordas elevadas e fundo granuloso, que podem ser nicas ou mltiplas e so indolores. No animal: ???? - Reservatrio roedores, co, homem, dentre outros. - Perodo de incubao pode variar de duas semanas a 12 meses, com mdia de 2 a 3 meses. - Medidas de controle eliminao de vetores; eliminao de acmulo de detritos e outros criadouros de vetores; eliminao dos animais que atuam como reservatrios; educao sanitria; investigao de contatos e da fonte de infeco; tratamento especfico. Leishmania Visceral - Doena causada por protozorio. - Agente etiolgico no Brasil: Leishmania chagassi. - Transmisso - picada de insetos flebotomdeos do gnero Lutzomya. - Sintomas no homem: doena crnica sistmica com febre de longa durao. No animal: emagrecimento, eriamento e queda de plos, ndulos ou ulceraes, hemorragias intestinais, paralisia de membros posteriores cegueira e caquexia. - Reservatrio co; o homem tambm pode ser fonte de infeco. - Perodo de incubao varia de 10 dias a 24 meses, sendo em mdia de 2 a 4 meses. - Medidas de controle eliminao de vetores; eliminao de acmulo de detritos e outros criadouros de vetores; eliminao dos animais que atuam como reservatrios; educao sanitria; investigao de contatos e da fonte de infeco; tratamento especfico. Manejo de Animais Silvestres
16. Coletar soro e estocar a -20C 17. Conhecer os sinais e sintomas das principais zoonoses que podem ocorrer nas diferentes regies de estudo, considerando as medidas de preveno 18. Todo animal capturado no campo dever ser trabalhado no local de captura ou em lugar prximo, evitando a sua transferncia para centros de pesquisa 19. Utilizar EPIS 20. Manipular armadilhas contendo roedores somente com luvas de borracha resistentes. Estas armadilhas devero ser colocadas imediatamente dentro de saco plstico duplo at a sua abertura em local adequado, onde todo o pessoal envolvido dever estar utilizando roupas descartveis e equipamento de proteo respiratria 21. Transportar animais capturados at a rea de processamento, em carroceria ou bagageiro, evitando-se contato com a equipe no interior do veculo 22. Processar os animais em uma rea previamente escolhida, longe da circulao de pessoas ou presena de animais domsticos ou criaes. Em ambiente aberto, com boa ventilao e ao da luz ultravioleta natural, manter a direo do vento nas costas das pessoas. Caso o processamento seja realizado em sala fechada, maiores cuidados devero ser aplicados, incluindo desinfeco de toda rea e do material utilizado 23. As pessoas que no participarem do processamento final dos animais silvestres devero permanecer a pelo menos 10 metros de distncia, contra o vento, evitando, assim a inalao de aerossis 24. Anestesiar profundamente todos os animais antes de seu manuseio fora das armadilhas. Utilizar anestsicos inalatrios como metoxipluorane que mais seguro com a menor margem de erro quando comparado com outros. 25. Coletar sangue atravs do plexo retroorbital ou por puno cardaca, na dependncia do volume de sangue necessrio, do tamanho do animal e da prtica do pessoal envolvido. Evitar a formao de aerossis durante o processamento do material. 26. Utilizar desinfetantes como hipoclorito, lisol, fenol, entre outros na: limpeza das luvas aps manipulao de armadilhas, descontaminao de armadilhas, limpeza das luvas aps manipulao/ disseco de cada roedor e antes da remoo das luvas aps finalizao dos procedimentos, lavagem e desinfeco de todos os instrumentos usados e limpeza das superfcies de trabalho ou de outros materiais que possam estar contaminados 27. A necropsia assim como a taquidermizao devero ser realizadas por pessoal previamente treinado, com instrumentos que reduzam a possibilidade de acidente. Evitar o uso de tesoura aps abertura da cavidade abdominal. Todo o material como luva, gaze, papel toalha, assim como a superfcie de trabalho devero ser desinfetadas antes do processamento de outro animal. O material a ser encaminhado para o museu dever ser colocado em soluo de formol a 10 % 28. Evitar a transfer~encia de ectoparasitas como carrapatos, pulgas e piolhos, transmissores de patgenos, para o pessoal que manipula animais silvestres utilizando roupas apropriadas ( claras com punho bem justo) com luvas, podendo se utilizar, quando indicado repelentes 29. Realizar o descarte do material em bolsas de polietileno impermeveis, opcas de cor vermelha, com espessura de 120 microns . Utilizar papel absorvente em caso de material lquido, impedindo o seu derramamento. O tratamento final ser autoclavao, seguida de incinerao. Todo material corto-perfurante dever ser desprezado em descartadores resistentes a perfuraes e a golpes, e submetido autoclave 30. Procurar assistncia mdica, qualquer indivduo que apresente doena febril aps contato com animal silvestre, considerando o tempo potencial de exposio a cada patgeno. Uma amostra de sangue dever ser coletada e encaminhada, junto com a amostra padro, para a anlise.
Roupas e Equipamentos 1) Jaleco cirrgico descartvel Verificar a presena de punhos elastizados, considerando a necessidade de proteo contra carrapato e pulga.
2) Protetor de olhos e face Visor de policarbonato com ajuste facial. Verificar a existncia de bloqueio para o acesso de aerossis. 3) Luvas Verificar a especificao tcnica para determinar o grau de proteo 4)Respirador Com a recente mudana na nomenclatura e na certificao dos filtros utilizados nestes respiradores, a denominao atual N-100 (99.97), equivalente ao filtro HEPA. recomendada para profissionais que trabalham com roedores, potencialmente reservatrios de hantavrus e arenavrus. Os equipamentos devero estar em conformidade com a norma 42CFR84 (EEUU). Marca: 3M do Brasil.
Referncias Bibliogrficas
1. ANDRADE, A. O bioterismo: Manual para tcnicos em animais de biotrio. Rio de Janeiro, Fiocruz, 1994.
2. ACHA, P. N.; SZYFRES, B. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales. Washington: Organizacin Panamericana de la Salud, 1986.
3. Fiocruz, 2004. 11 Curso de sensibilizao em Biossegurana. Rio de Janeiro.
4. COBEA (Colgio Brasileiro de Experimentao Animal); Manual para tcnicos em bioterismo; 2edio; 1996;
5. Ubatuba, F. B.; Junqueira Jr., L. F.; Espcies de animais empregadas em experimentao laboratorial; Universidade de Braslia, Departamento de Clnica Mdica; 6. Fiocruz, 2004. 11 Curso de sensibilizao em Biossegurana. Rio de Janeiro.