Estratgias para Diagnstico no Brasil

SFILIS

Ministrio da Sade Secretaria de Vigilncia em Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais

MINISTRIO DA SADE MINISTRO DE ESTADO DA SADE Jos Gomes Temporo SECRETARIA DE VIGILNCIA EM SADE Gerson Oliveira Penna DEPARTAMENTO DE DST, Aids e Hepatites Virais Dirceu Bartolomeu Greco UNIDADE DE LABORATRIO ULAB Lilian Amaral Inocncio COORDENAO DO TELELAB ULAB Nvea Orm de Oliveira Guedes Nbia Gonalves Dias COORDENAO De produo do PROJETO TELELAB 2009/2010 Maria Luiza Bazzo UFSC AUTORES: Elaine Sanae Sumikawa Leonardo Rapone da Motta Lilian Amaral Inocncio Luiz Alberto Peregrino Ferreira Maria Luiza Bazzo Miriam Franchini Mirthes Ueda REVISO TCNICA Neiva Sellan Lopes Gonales Projeto Grfico, edio e diagramao Virtual Publicidade Ltda. Design Instrucional Luciane Sato Ilustraes E FOTOS INDITAS Maurcio Muniz fotos dos vdeos Projeto Telelab 2009/2010 TIRAGEM: 1 edio 2010 6000 exemplares permitida a reproduo parcial ou total desde que citada a fonte. Produo, distribuio e informaes: Ministrio da Sade Secretaria de Vigilncia em Sade Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais 0800 61 24 36 www.aids.gov.br/telelab telelab@aids.gov.br ou telelab.sangue@aids.gov.br

Sfilis: Estratgias para Diagnstico no Brasil. Braslia: Ministrio da Sade, Coordenao de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. 2010. 100 p. (Srie TELELAB)

Apresentao
Seja bem-vindo (a) ao Sistema de Educao a Distncia TELELAB. Os cursos foram elaborados dentro de uma abordagem que favorece a aquisio de conhecimentos e o repensar da prtica profissional. Para o sucesso da aprendizagem e a garantia de um excelente aproveitamento, alm de assistir ao vdeo, leia este manual e releia as informaes sempre que tiver dvidas em sua prtica diria. Neste manual Sfilis Estratgias para Diagnstico no Brasil so apresentados aspectos histricos da sfilis e do seu diagnstico laboratorial, a histria natural, seu agente etiolgico e os testes utilizados para o diagnstico laboratorial. So descritos, ainda, os procedimentos e cuidados para os testes mais comumente utilizados no Brasil e a interpretao de seus resultados. Desejamos que este curso seja um incentivo para repensar e aperfeioar a sua prtica. Releia os contedos deste manual e assista ao vdeo sempre que precisar. Bons estudos!

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O sistema TELELAB de ensino a distncia foi criado em 1997, e produziu, ao longo do tempo, 23 cursos com ttulos dedicados ao diagnstico laboratorial das DST, Aids, hepatites virais e das atividades hemoterpicas. A evoluo tecnolgica e as novas polticas para ampliao do acesso dos usurios aos servios de sade tornaram necessria a atualizao de seus contedos. Este novo curso Sfilis Estratgias para Diagnstico no Brasil da srie TELELAB atualiza os contedos do manual Diagnstico laboratorial da sfilis da primeira srie e reconhece o trabalho dos pioneiros que criaram e trabalharam na produo dos cursos que agora esto sendo revisados e reformulados. Autores do manual Diagnstico laboratorial da sfilis da primeira srie: Claudia Renata Fernandes Martins (in memorian) Jos Antonio Pinto S Ferreira Luiz Alberto Peregrino Ferreira Luiz Fernado de Ges Siqueira (in memorian) Maria Luiza Bazzo Miriam Franchini Oscar Jorge Berro Silvio Valle Consultoria pedaggica da primeira srie: Maria Lcia Ribinick e Maristela Arantes Marteleto.

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Consideraes gerais
Agora voc faz parte do Sistema de Educao a Distncia TELELAB para profissionais da sade envolvidos no diagnstico laboratorial das doenas sexualmente transmissveis, da infeco pelo HIV/Aids e das hepatites virais. O projeto TELELAB foi criado para levar at voc informaes indispensveis para que o seu trabalho seja realizado nos padres de qualidade estabelecidos pelo Ministrio da Sade. Guarde este Manual para consultar sempre que necessrio. Ele seu, use-o!

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Certificado:

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Ao final do curso Sfilis Estratgias para Diagnstico no Brasil, voc ser capaz de: Conhecer a histria da sfilis na sociedade ocidental e o desenvolvimento dos testes laboratoriais. Identificar o agente etiolgico da sfilis Treponema pallidum e a histria natural da doena. Realizar os testes trepnemicos (FTA-abs, MHA-TP/TPHA/TPPA e ELISA) e os no treponmicos quantitativos e qualitativos (VDRL com amostra de soro e de lquor) disponveis no pas, os testes quantitativos e qualitativos, os testes rpidos e as etapas do diagnstico da sfilis a triagem e a etapa confirmatria. Para esclarecimento de dvidas e sempre que precisar, comunique-se diretamente com: TELELAB Por telefone: 0800-61-2436 Por e-mail: telelab@aids.gov.br

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Sumrio
Introduo..................................................................................................................................... 9 Captulo 1: Histria da sfilis e dos testes para o diagnstico laboratorial................................................................................................................................. 11 Primeiros escritos sobre a sfilis. ................................................................................13 Quando surgiram os testes laboratoriais da sfilis.........................................14 Captulo 2: A histria natural da sfilis: fases evolutivas e o surgimento de anticorpos. ............................................................................................. 17 Descoberta do agente etiolgico da sfilis........................................................19 Treponema pallidum........................................................................................................19 A histria natural da doena......................................................................................20 O diagnstico laboratorial da sfilis........................................................................24 Captulo 3: Testes para o diagnstico laboratorial da sfilis..................25 Testes treponmicos.......................................................................................................27 Testes no treponmicos.............................................................................................27 O fenmeno de prozona..............................................................................................28 Diferenas entre os testes no treponmicos e os treponmicos.....28 Tcnicas utlizadas nos testes para o diagnstico da sfilis.......................29 Os exames laboratoriais para o diagnstico da sfilis primria.............30 Captulo 4: Teste no treponmico de floculao e seus procedimentos...31 Os testes de floculao..................................................................................................33 Testes de floculao e sua composio antignica.....................................35 Principais caractersticas dos testes de floculao.......................................35 Escolha do teste de floculao para diagnstico da sfilis.......................36 Captulo 5: A reao de VDRL com amostra de soro.................................... 37 Ao 1 Organizao dos materiais necessrios para o teste de VDRL. .....40 Ao 2 Preparar os protocolos de trabalho..................................................41 Ao 3 Preparar a suspenso antignica de VDRL...................................42 Ao 4 Calibrar a agulha...........................................................................................43 Ao 5 Utilizar soros controle................................................................................45
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Ao 6 Validar a suspenso antignica............................................................45 Ao 7 Realizar reao de VDRL qualitativa..................................................48 Ao 8 Realizar reao de VDRL quantitativa .............................................50 Ao 9 Registrar e liberar os resultados do teste de VDRL..................52 Captulo 6: A reao de VDRL em amostras de lquor................................. 53 Cuidados com a amostra de lquor para fazer o VDRL...............................55 Passo a passo do vdrl em amostras de lquor..............................................56 Reao de vdrl quantitativa no lquor..............................................................59 Captulo 7: Controle de qualidade dos testes de floculao.................. 61 Soros-controle.....................................................................................................................63 Cuidados com os soros-controle............................................................................65 Recomendaes para o teste rpr ........................................................................67 Captulo 8: Testes treponmicos. ............................................................................... 69 Caractersticas gerais dos testes treponmicos.............................................71 Testes treponmicos mais utilizados no Brasil................................................72 TESTE FTA-abs (Fluorescent treponemal antibody absorption)................73 Testes MHA-TP (Micro-hemaglutinao para Treponema pallidum) e da aglutinao indireta..................................................................................................76 Teste treponmico imunoenzimtico elisa ou de quimioluminescncia ...................................................................................................80 Captulo 9: Testes rpidos para sfilis....................................................................... 83 Princpios metodolgicos dos TR para diagnstico da sfilis.................84 Leitura do teste rpido para sfilis...........................................................................85 A escolha do teste rpido............................................................................................87 Captulo 10: Interpretao dos resultados dos testes de sfilis............. 89 Como deve ser a interpretao dos resultados. .............................................91 Cicatriz sorolgica e baixos ttulos.........................................................................92 Como avaliar a resposta ao tratamento da sfilis...........................................92 Negativao dos testes no treponmicos......................................................92 Limitaes dos testes treponmicos....................................................................93 Outros cuidados necessrios.....................................................................................94 Glossrio..................................................................................................................95 Referncias.............................................................................................................97
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Introduo
A sfilis uma enfermidade sistmica, exclusiva do ser humano, conhecida desde o sculo XV, e seu estudo ocupa todas as especialidades mdicas. Tem como principal via de transmisso o contato sexual, seguido pela transmisso vertical para o feto durante o perodo de gestao de uma me com sfilis no tratada ou tratada inadequadamente. Tambm pode ser transmitida por transfuso sangunea. A apresentao dos sinais e sintomas da doena muito varivel e complexa. Quando no tratada, evolui para formas mais graves, podendo comprometer o sistema nervoso, o aparelho cardiovascular, o aparelho respiratrio e o aparelho gastrointestinal. Embora o tratamento com penicilina seja muito eficaz nas fases iniciais da doena, mtodos de preveno devem ser implementados, pois adquirir sfilis expe as pessoas a um risco aumentado para outras DST, inclusive a Aids. O nmero de casos de sfilis vem aumentando no Brasil e, por isso, todos os profissionais da rea da sade devem estar atentos s suas manifestaes. Nesse contexto, o diagnstico laboratorial desempenha papel fundamental no combate sfilis, por permitir a confirmao do diagnstico e o monitoramento da resposta ao tratamento. Finalmente, lembre-se que o resultado de todo exame laboratorial deve ter qualidade e que isso s ser possvel se houver padronizao dos processos, controle da qualidade, desde a aquisio dos insumos e reagentes at a emisso do resultado, treinamento e comprometimento dos profissionais envolvidos.

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Histria da sfilis e dos testes para o diagnstico laboratorial

Captulo 1

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Histria da sfilis e dos testes para o diagnstico laboratorial

Neste captulo voc vai conhecer um pouco sobre a histria da sfilis na sociedade ocidental e o desenvolvimento dos testes laboratoriais.

Primeiros escritos sobre a sfilis

O termo sfilis originou-se de um poema, com 1.300 versos, escrito em 1530 pelo mdico e poeta Girolamo Fracastoro em seu livro intitulado Syphilis Sive Morbus Gallicus (A sfilis ou mal glico). Ele narra a histria de Syphilus, um pastor que amaldioou o deus Apolo e foi punido com o que seria a doena sfilis. Em 1546, o prprio Fracastoro levantou a hiptese de que a doena fosse transmitida na relao sexual por pequenas sementes que chamou de seminaria contagionum. Nessa poca, essa ideia no foi levada em considerao e, apenas no final do sculo XIX, com Louis Pasteur, passou a ter crdito. Uma breve histria da sfilis Todos ns herdamos no sangue lusitano uma boa dosagem de lirismo. Alm da sfilis, claro. Calabar, Chico Buarque e Ruy Guerra Atualmente, h certo consenso quanto ao fato da sfilis ter sido uma doena desconhecida no Velho Mundo at o final do sculo XV, porm sua origem geogrfica continua causando polmicas.

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Sabe-se que no ano de 1495, quando a cidade de Npoles foi cercada por tropas francesas comandadas pelo Rei Carlos VIII, as tropas espanholas foram enviadas cidade para reforar a sua defesa. Aps a tomada da cidade pelos franceses, surgiu em suas tropas uma doena, causadora de muitas mortes e que, por intermdio de mercenrios, rapidamente espalhou-se pela Europa. Foi originalmente denominada Mal de Npoles, mas na Itlia e na Alemanha ficou conhecida como Mal francs; na Frana chamaram-na de Mal italiano, na Polnia a denominaram de Mal alemo e na Rssia de Mal polons.

Quando surgiram os testes laboratoriais da sfilis

Linha do tempo desenvolvimento do diagnstico laboratorial da sfilis
1. 1 mtodo: reao de fixao de complemento de Wassermann, Neisser e Brck.
1907

3. Lange descobriu a reao do ouro coloidal para o diagnstico da neurossfilis.

1912

5. Obtidos os preparados de antgenos cardiolipinalecitinacolesterol quimicamente purificados.

1941

7. Deacon descreveu a reao FTA (Anticorpo Treponmico Fluorescente).

1946 1957

9A. Teste imunoenzimtico ELISA.

1965 1970

10. Testes de quimioluminescncia.

1990 2000

2. Michaells descreveu uma nova reao baseada no fenmeno da floculao.

4. Pangborn isolou o componente ativo de natureza fosfolipdica (cardiolipina) de extrato de corao bovino.

6. Tcnica de diagnstico VDRL.

8. Rathiev desenvolve a tcnica de hemaglutinao inidireta ou passiva.

9B. ELISA no Brasil.

1. O primeiro mtodo para o diagnstico laboratorial foi a reao de fixao de complemento de Wassermann, Neisser e Brck, descrita em 1907, com a qual foi detectada a taxa de 80% de positividade em 94 amostras estudadas.

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2. Ainda em 1907, Michaelis descreveu uma nova reao baseada no fenmeno da floculao utilizando os mesmos antgenos empregados na fixao do complemento. Uma srie de reaes surgiu com essa descoberta: reaes de Kahn, Kline e Meinicke. 3. Em 1912, Lange descobriu a reao do ouro coloidal para o diagnstico da neurossfilis. 4. Em 1941, Pangborn isolou o componente ativo de natureza fosfolipdica (cardiolipina) de extrato de corao bovino. A cardiolipina, quando combinada com a lecitina e o colesterol, forma antgeno sorologicamente ativo para deteco de anticorpos no treponmicos nas amostras de pacientes com sfilis. 5. Logo a seguir, foram obtidos os preparados de antgenos cardiolipina-lecitina-colesterol quimicamente purificados, que quando empregados nos testes de floculao garantiram a reprodutibilidade dos resultados obtidos. 6. Em 1946, com a padronizao desses novos antgenos purificados, foi desenvolvida a tcnica de diagnstico VDRL (Venereal Diseases Research Laboratory) que usada at hoje. O teste de imobilizao do Treponema pallidum (TPI) foi desenvolvido como resultado da descoberta de que o soro de paciente com a doena inibia a mobilidade dos treponemas. O TPI foi o primeiro teste de deteco de anticorpos antitreponema. 7. Em 1957, Deacon descreveu a reao FTA (Anticorpo Treponmico Fluorescente) baseada no princpio da imunofluorescncia. A reao foi, posteriormente, modificada pelo teste FTA-200 (diluio do soro a 1/200) visando eliminar as reaes falsopositivas. Mas s em 1964, se tornou uma reao mais especfica, com o teste FTA-abs (Anticorpo Treponmico Fluorescenteadsorvido) descrito por Hunter, Deacon e Meyer. 8. J a tcnica de hemaglutinao indireta ou passiva foi desenvolvida por Rathlev e seu trabalho foi divulgado na publicao da Organizao Mundial da Sade, em 1965. Mais tarde, a equipe de Tomizawa introduziu modificaes na tcnica para aumentar a especificidade da reao.

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9. O teste imunoenzimtico ELISA foi desenvolvido na dcada de 1970, e ELISA-Tp tornou-se disponvel no mercado brasileiro nos anos de 1990. 10. No incio da dcada de 2000 foram desenvolvidos os testes de quimioluminescncia com antgenos recombinantes de Treponema pallidum. Existem muitos estudos sobre a padronizao de um conjunto diagnstico para deteco molecular do Treponema pallidum, porm a comercializao ainda no est disponvel e os testes moleculares tm sido utilizados somente para fins de pesquisa. Recentemente, foram desenvolvidos os testes rpidos, a maioria deles baseados na tcnica de imunocromatografia ou de fluxo lateral, que permitem detectar rapidamente os anticorpos treponmicos e podem ser utilizados mesmo em locais sem infraestrutura laboratorial. Foram tambm desenvolvidos os conjuntos diagnsticos para amostras de sangue coletadas em papel-filtro. Esse tipo de amostra de fcil coleta e pode ser transportada sem refrigerao.

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A histria natural da sfilis: fases evolutivas e o surgimento de anticorpos

Captulo 2

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A histria natural da sfilis: fases evolutivas e o surgimento de anticorpos

Nesse captulo voc conhecer o agente etiolgico da sfilis Treponema pallidum a histria natural da doena com suas diferentes fases evolutivas e o aparecimento dos anticorpos em cada uma delas.

Descoberta do agente etiolgico da sfilis

Treponema pallidum, o agente etiolgico da sfilis, foi descoberto somente em 1905, pelo zoologista Fritz Schaudin e pelo dermatologista Paul Erich Hoffman. Schaudin examinou o preparado a fresco, da amostra coletada por Hoffmann de ppula existente na vulva de uma mulher com sfilis secundria. Os dois observaram ao microscpio os microrganismos espiralados, finos, que giravam em torno do seu maior comprimento e que moviam-se para frente e para trs. Denominaram-os, inicialmente, de Spirochaeta pallida e, um ano depois, mudaram o nome para Treponema pallidum.

Treponema Pallidum

Figura 1 Treponema pallidum

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Morfologicamente o Treponema pallidum uma espiral fina com espiras regulares e pontas afiladas. Possui cerca de 10 a 15 espiras e tem cerca de 8 micrmetros de comprimento, podendo apresentar variaes no comprimento e no nmero de espiras. O pouco conhecimento sobre a biologia do T. pallidum se deve impossibilidade do seu cultivo em meios artificiais. O treponema tem baixa resistncia ao meio ambiente, ressecando-se rapidamente. tambm muito sensvel ao do sabo e de outros desinfetantes, podendo sobreviver por at 10 horas em objetos midos.

A histria natural da doena

A sfilis uma doena de evoluo lenta. Quando no tratada, alterna perodos sintomticos e assintomticos, com caractersticas clnicas, imunolgicas e histopatolgicas distintas, divididas em trs fases: sfilis primria, sfilis secundria e sfilis terciria. No havendo tratamento aps a sfilis secundria, existem dois perodos de latncia: um recente, com menos de um ano, e outro de latncia tardia, com mais de um ano de doena. A infeco pelo Treponema pallidum no confere imunidade permanente, por isso, necessrio diferenciar entre a persistncia de exames reagentes (cicatriz sorolgica) e a reinfeco pelo T. pallidum.

Sfilis primria Descrio:

Aps a infeco, ocorre um perodo de incubao entre 10 e 90 dias. O primeiro sintoma o aparecimento de uma leso nica no local de entrada da bactria. A leso denominada cancro duro ou protossifiloma indolor, tem a base endurecida, contm secreo serosa e muitos treponemas. A leso primria se cura espontaneamente, num perodo aproximado de duas semanas. As leses sifilticas facilitam a entrada do vrus da imunodeficincia humana HIV. As anlises de pacientes com infeco simultnea por HIV e T. pallidum indicam alteraes tanto na resposta imune humoral G
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do paciente quanto na resposta terapia para sfilis. Alm disso, a sfilis acelera a evoluo para Aids e a infeco pelo HIV altera a histria natural de sfilis.

Diagnstico laboratorial:
Na sfilis primria, o diagnstico laboratorial pode ser feito pela pesquisa direta do Treponema pallidum por microscopia de campo escuro, pela colorao de Fontana-Tribondeau, que utiliza sais de prata, e pela imunofluorescncia direta. Os anticorpos comeam a surgir na corrente sangunea cerca de 7 a 10 dias aps o surgimento do cancro duro, por isso nessa fase os testes sorolgicos so no-reagentes. O primeiro teste a se tornar reagente em torno de 10 dias da evoluo do cancro duro o FTA-abs, seguido dos outros testes treponmicos e no treponmicos. Quanto mais precocemente a sfilis primria for tratada maior ser a possibilidade dos exames sorolgicos tornarem no-reagentes. Porm, mesmo aps a cura, os testes treponmicos podem permanecer reagentes por toda a vida.

Sfilis secundria Descrio:

Quando a sfilis no tratada na fase primria, evolui para sfilis secundria, perodo em que o treponema j invadiu todos os rgos e lquidos do corpo. Nesta fase, aparece como manifestao clnica o exantema (erupo) cutneo, rico em treponemas e se apresenta na forma de mculas, ppulas ou de grandes placas eritematosas branco-acinzentadas denominadas condiloma lata, que podem aparecer em regies midas do corpo.

Diagnstico laboratorial:
Na sfilis secundria, todos os testes sorolgicos so reagentes e os testes quantitativos tendem a apresentar ttulos altos. Aps o tratamento nessa fase, os testes treponmicos permanecem reagentes por toda
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a vida do usurio, enquanto os testes no treponmicos podem ter comportamento varivel. Em alguns indivduos ficam no reagentes e em outros permanecem indefinidamente reagentes em baixos ttulos.

Sfilis latente Descrio:

Se no houver tratamento, aps o desaparecimento dos sinais e sintomas da sfilis secundria, a infeco entra no perodo latente, considerado recente no primeiro ano e tardio aps esse perodo. A sfilis latente no apresenta qualquer manifestao clnica.

Diagnstico Laboratorial:
Nessa fase todos os testes sorolgicos permanecem reagentes e observa-se uma diminuio dos ttulos nos testes quantitativos. Para diferenciar esta fase da infeco primria deve-se pesquisar no lquor a presena de anticorpos, utilizando-se o VDRL. Evidencia-se sfilis latente quando o VDRL reagente no lquor, acompanhado de baixos ttulos no soro.

Sfilis terciria Descrio:

A sfilis terciria pode levar dez, vinte ou mais anos para se manifestar. A sfilis terciria se manifesta na forma de inflamao e destruio de tecidos e ossos. caracterizada por formao de gomas sifilticas, tumoraes amolecidas vistas na pele e nas membranas mucosas, que tambm podem acometer qualquer parte do corpo, inclusive no esqueleto sseo. As manifestaes mais graves incluem a sfilis cardiovascular e a neurossfilis.

Diagnstico Laboratorial:
Nesta fase os testes sorolgicos habitualmente so reagentes e os ttulos dos testes no treponmicos tendem a ser baixos, porm podem
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ocorrer resultados no reagentes. Em usurios que apresentam sintomas neurais, o exame do lquor LCR indicado, porm nenhum teste isoladamente seguro para o diagnstico da neurossfilis. Recomendase que o diagnstico seja feito pela combinao da positividade do teste sorolgico, aumento da clulas e de protenas no LCR . Para testagem do LCR, o VDRL o exame recomendado, porm tem baixa sensibilidade (30 47% de resultados falso-negativos) e alta especificidade. A infeco pelo Treponema pallidum no confere imunidade permanente, por isso, necessrio diferenciar entre a persistncia de exames reagentes (cicatriz sorolgica) e a reinfeco pelo T. pallidum. A sfilis congnita Trata-se da infeco do feto em decorrncia da passagem do treponema pela placenta. mais grave quanto mais recente for a infeco materna. Segundo estudo realizado em 2004, estima-se que a taxa de prevalncia de mulheres portadoras de sfilis no momento do parto seja de 1,6%, o que corresponde a aproximadamente 49 mil parturientes infectadas e 12 mil nascidos vivos com sfilis, considerando-se uma taxa de transmisso de 25%, de acordo com estimativa da OMS (www.aids.gov.br). Na gestao, a sfilis congnita se manifesta com abortamento, nascimentos prematuros ou nascimentos seguidos de morte. Ao nascer, a criana com sfilis congnita pode apresentar leses bolhosas, ricas em treponemas, na palma das mos, planta dos ps, ao redor da boca e do nus. Mesmo quando no se manifesta com essas caractersticas, a infeco congnita pode permanecer latente, vindo a se expressar durante a infncia ou mesmo na vida adulta. A definio da sfilis congnita deve ser feita pelo mdico levando em considerao a comparao dos resultados dos testes no treponmicos da me e da criana, os resultados dos exames de imagem e dos sinais clnicos presentes na criana.

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Ateno
Sempre que suspeitar de sfilis congnita deve-se fazer VDRL no lquor da criana.

O diagnstico laboratorial da sfilis

O diagnstico laboratorial da sfilis depende da associao entre: a histria do usurio; os dados clnicos; e a deteco de antgenos ou anticorpos por meio de testes laboratoriais. Por isso, importante conhecer a evoluo da doena, as diferentes fases da infeco e o que cada teste laboratorial capaz de detectar para utiliz-los adequadamente.

Ateno
Quando no se pode estabelecer clinicamente a fase da sfilis deve-se fazer um teste treponmico e um no treponmico. Note ainda que o diagnstico laboratorial da sfilis por meio de exames sorolgicos sempre realizado em duas etapas: triagem e; confirmatria. Neste manual voc conhecer os procedimentos indicados para a combinao dos testes das duas etapas.

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Testes para o diagnstico laboratorial da sfilis

Captulo 3

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Testes para o diagnstico laboratorial da sfilis

Para o diagnstico laboratorial da sfilis pode-se utilizar os testes treponmicos e os no treponmicos. Neste captulo voc conhecer mais sobre cada um deles e sua importncia no diagnstico das diferentes fases de evoluo da sfilis.

Testes treponmicos
So testes que empregam como antgeno Treponema pallidum, e detectam anticorpos antitreponmicos. Esses testes so feitos apenas qualitativamente.

Testes no treponmicos
So testes que detectam anticorpos no treponmicos, anteriormente chamados de anticardiolipnicos, reagincos ou lipodicos G . Esses anticorpos no so especficos para Treponema pallidum, porm esto presentes na sfilis. Os testes no treponmicos podem ser: Qualitativos: rotineiramente so utilizados como testes de triagem para determinar se uma amostra reagente ou no. Quantitativos: so utilizados para determinar o ttulo dos anticorpos presentes nas amostras que tiveram resultado reagente no teste qualitativo e tambm para o monitoramento da resposta ao tratamento.

O ttulo no teste no treponmico

O ttulo indicado pela ltima diluio da amostra que ainda apresenta reatividade ou floculao visvel.
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O fenmeno de prozona
a ausncia de reatividade em uma amostra que, embora contenha anticorpos no treponmicos, quando testada sem diluir, ou mesmo em baixas diluies, apresenta resultado no reagente. Esse fenmeno decorre da relao desproporcional entre quantidade dos antgenos e dos anticorpos presentes na reao no treponmica, gerando resultados falso-negativos. Ocorre nas amostras de doentes com sfilis, em virtude da elevada quantidade de anticorpos presentes. Esse fenmeno no observado nos testes treponmicos. observado principalmente na sfilis secundria, fase em que h produo de grande quantidade de anticorpos.

Diferenas entre os testes no treponmicos e os treponmicos

A diferena principal que os testes no treponmicos detectam anticorpos que no so especficos contra Treponema pallidum e os testes treponmicos detectam anticorpos especficos para antgenos de T. pallidum. Resultados falso-positivos nos testes Podem ocorrer em diferentes situaes e tendem a apresentar ttulos baixos nos testes no treponmicos. Resultados falso-positivos podem ser permanentes: em portadores de lupus eritematoso sistmico; na sndrome antifosfolipdica e em outras colagenoses; na hepatite crnica; em usurios de drogas ilcitas injetveis; na hansenase; na malria.

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Resultados falso-positivos podem tambm ocorrer transitoriamente: em algumas infeces; aps vacinaes; uso concomitante de medicamentos; aps transfuses de hemoderivados; na gravidez e em idosos. Os testes no treponmicos apresentam mais resultados falsopositivos. Cerca de 1% da populao apresenta reatividade nos testes treponmicos sem ter a infeco. No exame FTA-abs, as reaes falso-positivas habitualmente apresentam os treponemas com um padro atpico de fluorescncia em forma de contas (como de rosrio). Isso ocorre, por exemplo, na borreliose de Lyme. Nesse caso, o FTA-abs reagente e o VDRL geralmente no reagente.

Tcnicas utlizadas nos testes para o diagnstico da sfilis

Nos testes no treponmicos:
Tcnica Testes VDRL (Venereal Disease Laboratory) RPR (Rapid Test Reagin) USR (Unheated Serum Reagin) TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test) Testes Rpidos TR ELISA (Enzyme linked immunossorbent assay) Testes Rpidos TR

Floculao

Aglutinao Imunoenzimticos (ELISA) Imunocromatogrficos

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Nos testes treponmicos:

Tcnica Imunofluorescncia indireta Hemaglutinao Aglutinao de partculas Imunoenzimticos e suas variaes Imunocromatografia e fluxo lateral Testes moleculares Testes FTA-abs (Fluorescent treponemal antibody absorption) MHA-TP (microhemaglutinao para Treponema pallidum) TPPA (Treponema pallidum particle agglutination assay) ELISA (Enzyme-linked immunossorbent assay), CMIA (Ensaio imunolgico quimioluminescente magntico) Testes rpidos PCR

Os exames laboratoriais para o diagnstico da sfilis primria

So de dois tipos: Exame direto realizado com amostra coletada diretamente da leso: so exames de microscopia que permitem a identificao de Treponema pallidum. A microscopia pode ser realizada para a pesquisa do treponema em campo escuro, aps a colorao pelo mtodo de Fontana-Tribondeaux ou pela imunofluorescncia direta. Exames sorolgicos: embora o tempo para o surgimento dos anticorpos possa variar em diferentes pessoas, a partir de 10 dias da evoluo do cancro duro, pode-se obter reatividade nos testes sorolgicos. O FTA-abs o primeiro teste a se tornar reagente na sfilis.

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Teste no treponmico de floculao e seus procedimentos

Captulo 4

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Teste no treponmico de floculao e seus procedimentos

Neste captulo voc vai conhecer detalhes das metodologias dos testes no treponmicos disponveis no pas, seu funcionamento, suas indicaes de uso e os cuidados que se deve ter para obter resultados precisos e confiveis.

Os testes de floculao
Princpio metodolgico dos testes de floculao
Os testes de floculao baseiam-se em uma suspenso antignica que contm cardiolipina, colesterol e lecitina. No preparo da suspenso antignica, a ligao desses componentes ocorre ao acaso e resulta na formao de estruturas arredondadas denominadas de micelas. Veja na figura abaixo.
Cardiolipina Lecitina Colesterol

Figura 2 Representao esquemtica do antgeno dos testes no treponmicos, na forma de micelas.

Os anticorpos no treponmicos presentes na amostra ligam-se s cardiolipinas das micelas. A ligao de anticorpos em vrias micelas resulta na floculao, que pode ser observada ao microscpio. Veja a seguir a figura que representa a ligao de vrias micelas, por meio dos anticorpos.
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Anticorpos no treponmicos

Cardiolipina Lecitina Colesterol

Figura 3 Representao esquemtica de uma reao de floculao na qual os anticorpos no treponmicos se ligam simultaneamente em vrias micelas.

Observao da floculao
Essa ligao vista na forma de flocos ou grumos, grandes ou pequenos, que podem ser visualizados a olho nu em alguns testes e em outros com auxlio de microscpio. Veja na Figura 4 algumas fotos da reao de VDRL feitas em microscpio ptico comum em aumento de 100 vezes.

Presena de floculao

Ausncia de floculao

Figura 4 Observao de floculao e da ausncia de floculao na reao de VDRL.

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Testes de floculao e sua composio antignica

Teste VDRL (Venereal Disease Laboratory) Composio antignica cardiolipina (0,03%); colesterol (0,9%); e lecitina (0,21+/-0,1%). cardiolipina; colesterol; lecitina; cloreto de colina para eliminar a necessidade de inativao da amostra; EDTA para aumentar a estabilidade da suspenso antignica; e carvo para permitir a leitura da reao a olho nu. cardiolipina; colesterol; lecitina; cloreto de colina; e EDTA. cardiolipina; colesterol; lecitina; cloreto de colina; EDTA; corante vermelho de toluidina para permitir a leitura da reao a olho nu.

RPR (Rapid Plasma Reagin)

USR (Unheated Serum Reagin)

TRUST (Toluidine Red Unheated Serum Test)

Principais caractersticas dos testes de floculao

Ateno
Verifique a validade da suspenso antignica e dos outros insumos em cada conjunto diagnstico. Siga rigorosamente as instrues de cada fabricante.

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Veja no quadro abaixo as caractersticas e exigncias de cada teste.

Caractersticas Tipo de amostra que pode ser utilizada Lquor Plasma Soro O teste requer inativao da amostra Antgeno j est pronto para uso Leitura em microscpio Leitura a olho nu Teste qualitativo e quantitativo Estabilidade da suspenso VDRL Sim No Sim Sim No Sim No Sim 8 horas RPR No Sim Sim No Sim No Sim Sim Meses Testes USR No No Sim No Sim Sim No Sim Meses TRUST No Sim Sim No Sim No Sim Sim Meses

Escolha do teste de floculao para diagnstico da sfilis

A escolha do teste no treponmico vai depender das caractersticas do seu servio, tais como: O tipo de amostra a ser testada (lquor, soro ou plasma); Equipamentos disponveis (banho-maria, microscpio); e Tamanho da rotina. Outro fator a ser considerado na hora de escolher a qualidade do teste. Antes de adquirir o conjunto diagnstico para sfilis, certifique-se da qualidade do produto, solicitando ao fornecedor um kit para avaliar o desempenho. Veja no captulo 10 como fazer o controle de qualidade dos testes no treponmicos.

Ateno
O VDRL o nico teste de floculao que pode ser utilizado para pesquisa de anticorpos no treponmicos no lquor.

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A reao de VDRL com amostra de soro

Captulo 5

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A reao de VDRL com amostra de soro

O VDRL um dos testes no treponmicos muito utilizado no Brasil. Neste captulo voc conhecer em detalhes a reao do VDRL feita com a suspenso antignica preparada a partir do antgeno concentrado para o teste em amostras de soro.

Ateno
Antes de iniciar seu trabalho voc deve consultar os protocolos de Procedimentos Operacionais Padro POP. Eles descrevem detalhadamente: os procedimentos que devem ser realizados para cada conjunto diagnstico; as instrues de uso e os cuidados a serem adotados em cada equipamento que ser utilizado; O passo a passo de aes para cada atividade. Veja a seguir a sequncia de aes recomendadas para voc fazer um teste VDRL.
AO 1 Organizar os materiais necessrios AO 6 Validar a suspenso antignica AO 7 Realizar reao de VDRL qualitativa AO 2 Preparar os protocolos de trabalho AO 5 Utilizar soros controle AO 8 Realizar reao de VDRL quantitativa AO 3 Preparar a suspenso antignica

AO 4 Calibrar a agulha

AO 9 Anotar os resultados e liberar os resultados

Nos prximos tpicos, conhea o detalhamento das aes de 1 a 9:

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Ao 1 Organizao dos materiais necessrios para o teste de VDRL

Os materiais necessrios para realizao do teste so: Conjunto diagnstico (kit) para VDRL; Soluo salina (NaCl 0,9%); Soros controles: reagente com ttulo conhecido e no reagente; Seringa de vidro de 1ml ou 2ml; Agulha calibrada para gotejar 17l ou pipeta para volume de 17l; Erlenmeyer de 25ml com tampa de vidro esmerilhado; Lminas de vidro planas, demarcadas com 12 crculos com 14mm de dimetro cada (lminas de VDRL); Agitador orbital, tipo Kline, ajustado para 180 2 rpm; Microscpio ptico comum (objetiva 10X e ocular 10X); Banho-maria a 56C; Tubos de ensaio 12 X 75mm, para as diluies em tubo; Pipetas de volume ajustvel entre 50l e 200l; Ponteiras descartveis para volumes entre 50l e 200l; Pipetas de vidro de 1ml e 5ml; Pra ou macrocontrolador de pipetagem para pipetas de vidro; Recipiente para descarte de ponteiras; Recipiente de vidro para descontaminao de produtos biolgicos, contendo soluo aquosa de hipoclorito de sdio (uma parte de gua sanitria comercial mais quatro partes de gua); Recipiente com gua e sabo neutro para colocar as pipetas de vidro utilizadas; Recipiente com lcool 70% (peso a peso p/p) para colocar as lminas de VDRL utilizadas; Cronmetro; Caneta para escrever em vidro; Protocolo de trabalho.

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Ateno
Verifique sempre o nvel de gua do banho-maria e se a temperatura est em 56C.

Ao 2 Preparar os protocolos de trabalho

Modelo de Protocolo de trabalho
[Cabealho com dados do servio] Kit: Nome: Lote: Data de validade: Fabricante: Modelo da lmina e resultado encontrado
1 5 9 2 6 10 3 7 11 4 8 12

Nome do responsvel pelo teste: Data de realizao:

Posio de cada amostra ou da diluio na placa

1 5 9

2 6 10

3 7 11

4 8 12

Resultado encontrado em cada crculo R (reagente) ou NR (no reagente).

Dicas importantes: Mantenha os POP atualizados, fazendo as alteraes sempre que o fabricante fizer modificaes na bula. Observe se houve alterao dos procedimentos recomendados pelo fabricante para testes de diferentes lotes. Observe se os procedimentos variam quando o conjunto diagnstico utilizado com amostras diferentes como, por exemplo, VDRL no soro ou no lquor.
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Leia sempre as bulas e mantenha-as disponveis para consulta. Antes de iniciar seu trabalho dirio, reveja o contedo dos POP e compare se est de acordo com as bulas.

Ao 3 Preparar a suspenso antignica de VDRL

O preparo da suspenso antignica a partir do antgeno concentrado deve seguir as instrues do fabricante, que habitualmente segue as recomendaes internacionais. No quadro a seguir voc encontrar a descrio dos procedimentos, de acordo com a padronizao internacional. Instrues para preparo da suspenso antignica 1. Pipete 0,4ml da salina tamponada pH 6,0 (que acompanha o kit) no fundo do Erlenmeyer. Use uma pipeta de vidro para volume at 1ml; 2. Retire 0,5ml do frasco do antgeno com uma pipeta de vidro para volume at 1ml. Tampe o frasco para evitar evaporao; 3. Posicione a pipeta com o antgeno na poro superior do Erlenmeyer; 4. Adicione 0,5ml do antgeno, gota a gota, diretamente sobre a salina; 5. Faa movimentos circulares, contnuos e suaves com o Erlenmeyer apoiado na bancada. Para obter a velocidade ideal de rotao, voc deve, a cada segundo, dar 3 voltas com o Erlenmeyer, formando um crculo de aproximadamente 5cm de dimetro; 6. Certifique-se que, ao final de 6 segundos, todo o antgeno esteja gotejado (inclusive a ltima gota); 7. Continue fazendo movimentos circulares por mais 10 segundos; 8. Adicione ao Erlenmeyer 4,1ml da salina tamponada com uma pipeta de vidro para volume at 5ml; 9. Tampe o Erlenmeyer e homogeneze a suspenso fazendo movimentos suaves de inverso aproximadamente 30 vezes; 10. Identifique a suspenso antignica, escrevendo no Erlenmeyer: Suspenso para VDRL, a data e a hora do preparo.
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Ateno
O antgeno concentrado est dissolvido em lcool. Se o frasco ficar aberto vai ocorrer sua evaporao e mudana na concentrao do antgeno. Dicas importantes: Prepare sempre o volume de 5,0ml de suspenso antignica, seguindo o procedimento descrito no quadro INSTRUES PARA PREPARO DA SUSPENSO ANTIGNICA, mesmo que a quantidade de amostras a ser analisada seja pequena. Se houver um grande nmero de amostras na sua rotina laboratorial, prepare duas, trs ou mais suspenses antignicas com o volume total de 5ml cada. No prepare volumes superiores a 5 ml em um mesmo Erlenmeyer. Nunca altere os volumes da salina tamponada e do antgeno recomendados pelo fabricante; Jamais utilize tampas de borracha no Erlenmeyer porque ocorre a desestabilizao das micelas; Evite pipetas de plstico para a preparao da suspenso antignica porque o antgeno pode se aderir ao plstico; A qualidade da reao de VDRL depende do preparo da suspenso antignica.

Ao 4 Calibrar a agulha
Veja, a seguir, como calibrar a agulha que ser usada na seringa para adicionar a suspenso antignica na reao de VDRL: 1. Corte o bisel de uma agulha de calibre 18G (gauge), de tal maneira que a estrutura metlica da agulha no fique amassada ou inadequada para uso; 2. Faa a calibrao da agulha executando os passos descritos a seguir: a) Coloque a agulha em uma seringa de vidro de 1ml ou 2ml;
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b) Aspire a suspenso antignica at o volume acima da marca de 1ml na seringa; c) Retire o mbolo e segure a seringa como se fosse uma pipeta; d) Posicione a seringa verticalmente sobre o Erlenmeyer vazio; e) Deixe as gotas da suspenso antignica fluirem no Erlenmeyer at atingir a marca de 1ml; f ) Comece a contar cada gota; g) Pare a contagem quando a suspenso atingir a marca de 0,5ml na seringa; h) O resultado esperado de 30 (1) gotas para cada 0,5ml da suspenso antignica. Esse volume corresponde a cerca de 17l por gota.

Figura 5 Agulha calibrada, agulha com bisel, lima e alicate utilizados para calibrar a agulha.

Como proceder se a calibrao no corresponder ao nmero de gotas esperado 1. Se o nmero de gotas for maior que 31, a agulha fina demais e o volume de antgeno menor que o indicado para cada gota. Neste caso voc deve substitu-la. 2. Se o nmero de gotas for menor que 29, voc pode tentar ajustar a agulha, pressionando levemente sua ponta com um alicate. Em seguida, repita o teste de calibrao da agulha, at encontrar o volume indicado.
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Ao 5 Utilizar soros controle

Os soros controle so amostras que foram previamente caracterizadas como no reagentes (soros controle negativo) ou reagentes (soros controle positivo). Seu uso na rotina diria permite ao profissional assegurar-se da qualidade do antgeno e dos testes que realiza. Veja a seguir como utilizar soros controle para validar a suspenso antignica. Aprenda mais sobre este tema no captulo 7 Controle de qualidade dos testes de floculao, deste manual.

Ateno
Mantenha os soros controles congelados a -20C.

Ao 6 Validar a suspenso antignica

Inicie o seu trabalho testando a qualidade da suspenso antignica para poder valid-la. Para essa tarefa, voc dever dispor de soros controle positivos com ttulos previamente estabelecidos e negativos, selecionados das amostras da rotina de seu laboratrio.

Ateno
Jamais teste as amostras dos usurios sem ter validado a suspenso antignica. Veja a seguir o passo a passo dessa tarefa, utilizando soros controle positivo com ttulo 16 ou diluio 1/16 com a execuo das diluies diretamente na lmina de VDRL: 1. Faa seu protocolo de trabalho marcando a posio do controle negativo e das diluies do controle positivo;

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Modelo de Protocolo de trabalho

[Cabealho com dados do servio] Kit: Nome: Lote: Data de validade: Fabricante: Validao da suspenso antignica
1 5 9 2 6 10 3 7 11 4 8 12

Nome do responsvel pelo teste: Data de realizao:

Posio dos soros controle na lmina

1 Neg 5 Pos 1/8 9 2 Pos puro 6 Pos 1/16 10 3 Pos 1/2 7 Pos 1/32 11 4 Pos 1/4 8 12

Legenda: Neg = controle negativo; Pos puro = controle positivo puro

2. Descongele os soros controle e, posteriormente, faa a inativao em banho-maria a 56C por 30 minutos. 3. Utilize a suspenso antignica preparada na ao 3; 4. Faa diluies seriadas do soro controle positivo: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, diretamente na lmina, conforme apresentado a seguir. Para isso: a) Pipete 50l de soluo salina nos crculos de nmeros 3 a 7; b) Em seguida pipete no 2 crculo 50 l de soro controle positivo; c) Pipete 50l de soro controle positivo no 3 crculo, homogeneze o soro com a soluo salina e transfira 50l dessa mistura para o 4 circulo; d) Homogeneze o contedo do 4 crculo e transfira 50l dessa mistura para o 5 crculo; e) Homogeneze e transfira-o sucessivamente, at o 7 circulo; f ) Homogeneze a mistura no 7 crculo, retire 50l e despreze-a em recipiente prprio para descarte de produto biolgico;
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Negativo

Positivo puro

Despreze 50 l

Figura 6 Diluio da amostra em lmina.

5. Pipete no 1 crculo 50l do soro controle negativo; 6. Homogeneze a suspenso antignica, cuidadosamente, por inverso; 7. Aspire a suspenso antignica at encher a seringa, retire o mbolo, deixe cair algumas gotas para eliminar bolhas de ar e dispense exatamente uma gota em cada um dos crculos de 1 a 7; 8. Coloque a lmina no agitador orbital e deixe agitar por 4 minutos a 180 rpm; 9. Faa a leitura da reao em microscpio ptico com objetiva de 10X e ocular de 10X, imediatamente aps o trmino da agitao; 10. A suspenso antignica estar validada se o controle negativo no apresentar floculao e se o controle positivo apresentar o ttulo esperado, neste caso de 1/16.

Ateno
Caso a suspenso antignica no tenha produzido o resultado esperado ela no ser validada. Nesse caso, prepare outra suspenso antignica e repita o procedimento de validao com os controles positivo e negativo. No utilize suspenses que no passaram no teste de validao. Dicas importantes: No misture a suspenso antignica fazendo-a passar pela seringa e agulha, pois pode haver quebra das micelas e perda da reatividade;
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Soros controle inativados a mais de 4 horas devem ser reinativados a 56C por 10 minutos; Voc deve validar cada suspenso antignica j preparada antes de utilizla na sua rotina e todas as vezes que preparar nova suspenso; A suspenso antignica do VDRL estvel por at 8 horas; Caso voc faa RPR, USR ou THRUST valide tambm a suspenso antignica pronta para uso antes de iniciar sua rotina. Com a suspenso antignica validada voc pode testar suas amostras, iniciando com o VDRL qualitativo.

Ao 7 Realizar reao de VDRL qualitativa

Antes de iniciar a reao, faa um protocolo para definir em que crculos da lmina sero colocados os soros controle e as amostras em anlise. Nesse caso, os soros controle so usados para estabelecer o parmetro para a leitura da floculao e podem ser usados puros, uma vez que possuem reatividade conhecida. Modelo de Protocolo de trabalho
[Cabealho com dados do servio] Kit: Nome: Lote: Data de validade: Fabricante: VDRL qualitativo
1 5 9 2 6 10 3 7 11 4 8 12

Nome do responsvel pelo teste: Data de realizao: Posio dos controles e das amostras na lmina
1 Neg 2 Pos puro 3 Amostra usurio 1 pura 4 Amostra usurio 1 1/8 8 Amostra usurio 3 1/8 12

5 Amostra 6 Amostra 7 Amostra usurio 2 usurio 3 usurio 2 pura pura 1/8 9 11 10

Legenda: Neg = controle negativo; Pos puro = controle positivo puro. Usurios 1, 2 e 3 = identificao da amostra de cada usurio.
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O teste qualitativo realizado com as amostras de soro puro (1/1) e diludo a 1/8. Voc deve fazer as diluies a 1/8 em tubos antes de iniciar o teste. Para isso: 1. Identifique um tubo para cada amostra; 2. Pipete 350l de soluo salina em cada tubo previamente identificado; 3. Homogeneze a amostra e pipete 50l no tubo correspondente. Com esses volumes voc vai obter a diluio de 1/8.

50l soro 350l soluo salina

Figura 7 Tubo indicando o volume de 350l de soluo salina e 50l soro.

4. Pipete 50l do soro controle negativo no 1 crculo da lmina de VDRL; 5. Pipete 50l do soro controle positivo no 2 crculo; 6. Pipete 50l da amostra do usurio 1 pura (1/1) no 3 circulo; 7. Pipete 50l da amostra do usurio 1 diluda a 1/8 no 4 crculo; 8. Repita o procedimento pipetando 50l de cada amostra pura e diluda das amostras em anlise, tendo o cuidado de seguir a ordem que voc estabeleceu no protocolo de trabalho; 9. Homogeneze delicadamente a suspenso antignica; 10. Aspire a suspenso antignica at encher a seringa, retire o mbolo e deixe pingar, no prprio Erlenmeyer, algumas gotas para eliminar bolhas de ar; 11. Dispense exatamente uma gota em cada crculo da lmina que contenha amostra;
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12. Coloque a lmina no agitador orbital e deixe-a por 4 minutos sob agitao de 180 rpm; 13. Faa a leitura da reao em microscpio ptico, imediatamente aps o trmino da agitao. Utilize objetiva de 10X e ocular de 10X; 14. Compare o resultado do controle negativo com o resultado das amostras testadas, para determinar o padro de ausncia de reatividade: a) Se a amostra estiver igual ao controle negativo, o resultado do VDRL ser no reagente b) Caso seja observada reatividade na amostra pura e/ou diluda a 1/8, dever ser feito o VDRL quantitativo para determinar o ttulo da amostra.

Ateno
Se a amostra de soro puro no apresentar reatividade, mas a amostra diluda a 1/8 apresentar, ter ocorrido o fenmeno de prozona.

Ao 8 Realizar reao de VDRL quantitativa

Veja agora o exemplo de um VDRL quantitativo com diluies realizadas diretamente na lmina. Prepare antes seu protocolo de trabalho e defina os crculos nos quais sero pipetadas as amostras, as diluies que sero testadas e os soros controle. 1. Faa seu protocolo de trabalho marcando a posio dos controles e das diluies da amostra; 2. Faa diluies seriadas da amostra de 1/2 a 1/32. Voc pode fazer a diluio em tubo e transferir 50 l de cada diluio para a lmina, conforme previsto no protocolo ou fazer a diluio diretamente na lmina. Para isso: a) Pipete 50l de soluo salina em cada um dos crculos de nmeros 4 a 8; b) Em seguida, pipete no 3 crculo 50l da amostra 1;
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c) Pipete 50l da amostra 1 no 4 crculo, homogeneze o soro e a soluo salina e transfira 50l dessa mistura para o 5 circulo; d) Homogeneze o contedo do 5 crculo e transfira 50l dessa mistura para o 6 crculo; e) Homogeneze e transfira, sucessivamente, at o 8 crculo; f ) Homogeneze a mistura no 8 crculo, retire 50l e despreze em recipiente prprio para descarte de produto biolgico; Modelo de Protocolo de trabalho
[Cabealho com dados do servio] Kit: Nome: Lote: Data de validade: Fabricante: VDRL qualitativo
1 5 9 2 6 10 3 7 11 4 8 12

Nome do responsvel pelo teste: Data de realizao: Posio dos soros controle e das diluies da amostra
1 Neg 2 Pos puro 3 Amostra usurio 1 pura 4 Amostra usurio 1 1/2 8 Amostra usurio 1 1/32 12

6 Amostra 7 Amostra 5 Amostra usurio 1 usurio 1 usurio 1 1/8 1/4 1/16 10 9 11

Legenda: Neg = controle negativo; Pos puro = controle positivo puro. Usurios 1, 2 e 3 = identificao da amostra de cada usurio.

Amostra do paciente Negativo Positivo puro

100 l 100 l 100 l 100 l 100 l

Soro 1/2
Despreze 50 l

1/4

1/8

1/16 1/32

Soluo salina 100 l

Figura 8a Diluio da amostra em lmina.

Figura 8b Diluio da amostra em tubos.

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3. Pipete no 2 crculo 50l do soro controle positivo; 4. Homogeneze a suspenso antignica cuidadosamente, por inverso; 5. Aspire a suspenso antignica at encher a seringa, retire o mbolo, deixe cair algumas gotas para eliminar bolhas de ar e dispense exatamente uma gota em cada um dos crculos do 1 ao 8; 6. Coloque a lmina no agitador orbital e deixe agitar por 4 minutos a 180 rpm; 7. Faa a leitura da reao em microscpio ptico, imediatamente aps o trmino da agitao. Utilize objetiva de 10X e ocular de 10X; a) Utilize o resultado do controle negativo para determinar o padro de ausncia de reatividade; b) O ttulo da amostra ser definido pela ltima diluio que apresentar reatividade.

Ao 9 Registrar e liberar os resultados do teste de VDRL

Ao finalizar a reao voc dever transferir os resultados anotados no protocolo para o laudo. As amostras reagentes devem ter o ttulo reportado no laudo. O laudo dever: ser legvel, sem rasuras na sua transcrio; ser escrito em lngua portuguesa; ser datado e assinado por profissional habilitado.

Ateno
O laudo dever estar de acordo com o disposto na Resoluo RDC n 302/ANVISA, de 13 de outubro de 2005, suas alteraes, ou outro instrumento legal que venha a substitu-la.

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A reao de VDRL em amostras de lquor

Captulo 6

54 TELELAB | Sfilis

A reao de VDRL em amostras de lquor

A realizao do VDRL em amostras de lquor uma ferramenta fundamental para o diagnstico da sfilis congnita ou da neurossfilis. Para analisar amostras de lquor o preparo do antgeno sofre algumas modificaes, conforme voc ver a seguir.

Ateno
Somente o VDRL pode ser utilizado para testar amostras de lquor. No teste amostras de lquor com conjuntos diagnsticos que no tenham sido padronizados para utilizao nesse tipo de amostra. Antes de realizar o teste, certifique-se de que o kit que voc dispe permite testar amostras de lquor. Leia as instrues do fabricante do produto antes de iniciar o teste.

Cuidados com a amostra de lquor para fazer o VDRL

A amostra de lquor deve ser centrifugada para sedimentar e remover hemcias ou contaminao bacteriana que podem estar presentes e causar interferncia no teste. A amostra de lquor no precisa ser inativada para a realizao do VDRL.

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Amostras de lquor turvas aps a centrifugao ou com hemlise no so adequadas para o teste VDRL. Nesses casos, solicite uma nova amostra. Se no for possvel obter nova amostra e, se houver concordncia do mdico que estiver assistindo o usurio, pode-se fazer um teste treponmico. No entanto, se esse teste for reagente, devese obrigatoriamente fazer o VDRL para o acompanhamento do tratamento.

Passo a passo do vdrl em amostras de lquor

1. Preparo da SUSPENSO ANTIGNICA MODIFICADA para uso em amostras de lquor Materiais necessrios:

Suspenso antignica de VDRL preparada conforme detalhado na ao 3 e validada de acordo com a ao 6, no captulo 5; Soluo de NaCl 10% (10g de NaCl em 100ml de gua destilada); Erlenmeyer de 25ml com tampa de vidro esmerilhado; Pipetas de volume ajustvel entre 1,0ml e 5,0 ml ou pipetas de vidro de 2ml; Pra ou macrocontrolador de pipetagem para pipetas de vidro; Recipiente para descarte de ponteiras ou recipiente com gua e sabo neutro para colocar as pipetas de vidro utilizadas; Cronmetro; Caneta para escrever em vidro; Protocolo de trabalho.

Como fazer
Execute os seguintes passos:

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1. Misture, em um Erlenmeyer, uma parte de soluo de NaCl 10% com uma parte da suspenso antignica do VDRL previamente preparada e validada para utilizao com amostras de soro. 2. Para testar entre 1 e 5 amostras de lquor misture 1,5ml de NaCl 10% com 1,5ml da suspenso antignica. 3. Homogeneze a soluo de NaCl 10% e a suspenso antignica por meio de suaves movimentos de rotao do Erlenmeyer. 4. Identifique o Erlenmeyer, anotando Suspenso antignica para VDRL em Lquor, o horrio e a data do preparo. 5. Deixe a mistura descansar por pelo menos 5 minutos antes do uso. 6. Utilize a suspenso antignica modificada em at 2 horas aps o preparo. Depois desse perodo descarte-a e, se houver necessidade de testar outras amostras de lquor, prepare uma nova suspenso modificada.

7. O teste de VDRL qualitativo em amostras de lquor Materiais necessrios:

Suspenso antignica modificada; Soluo salina (NaCl 0,9%); Seringa de vidro de 1ml com agulha de calibre 22 G calibrada para 50 gotas com 0,5ml da suspenso antignica ou pipeta de 10l; Lmina de vidro escavada com crculos cncavos de 14mm de dimetro e 1,75mm de profundidade (lminas de Kline); Agitador orbital, tipo Kline, ajustado para 180 2rpm; Microscpio ptico comum (objetiva 10X e ocular 10X); Pipetas de volume ajustvel entre 50l e 200l; Ponteiras descartveis para volumes entre 50l e 200l; Caixa para descarte de ponteiras;

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Recipiente de vidro para descontaminao de produtos biolgicos, contendo soluo aquosa de hipoclorito de sdio: (uma parte de gua sanitria comercial mais quatro partes de gua) ou contendo lcool 70% (peso a peso p/p); Caneta para escrever em vidro; Cronmetro; Protocolo de trabalho.

Ateno
Para calibrar a agulha utilizada para pipetar a suspenso antignica do VDRL no lquor voc deve seguir os mesmos procedimentos detalhados anteriormente na ao 4 para o VDRL, no captulo 5. Observe ainda que: O calibre da agulha de 22G. A agulha estar calibrada se voc contar 50 gotas (1) para cada 0,5ml de suspenso antignica modificada, correspondente a 10l por gota.

Como fazer
1. Organize seu protocolo de trabalho; 2. Pipete 50l do lquor em uma demarcao da lmina escavada de Kline; 3. Homogeneze cuidadosamente a suspenso antignica modificada; 4. Pipete 10l da suspenso antignica modificada na demarcao da lmina que contm o lquor; 5. Coloque a lmina no agitador orbital durante 8 minutos, com agitao de 180 rpm; 6. Faa a leitura da reao em microscpio ptico com objetiva de 10X e ocular de 10X, imediatamente aps o trmino da agitao:

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a) Se no for observada floculao na amostra, a reao negativa e o laudo pode ser emitido. b) Caso haja floculao na amostra de lquor puro, a reao positiva. necessrio fazer a reao quantitativa por meio da diluio seriada do lquor em soluo salina, para determinao do ttulo.

Reao de vdrl quantitativa no lquor

Faa diluies seriadas do lquor seguindo os mesmos procedimentos apresentados no item 2 da ao 8 deste manual. Utilize a suspenso antignica modificada para fazer o VDRL quantitativo em lquor. A reao estar finalizada quando for possvel estabelecer a ltima diluio do lquor que ainda apresentar reatividade. Essa corresponder ao ttulo que ser reportado como o resultado final do teste.

Ateno
Utilize 10l de suspenso antignica modificada; A reao dever ser agitada a 180rpm por 8 minutos.

Diferenas entre VDRL no soro e VDRL no lquor VDRL no soro Modificao da suspenso antignica Estabilidade da suspenso antignica Volume da suspenso antignica Tempo de agitao da reao Tipo de lmina No 8 horas 17l 4 minutos Plana VDRL no lquor Sim 2 horas 10l 8 minutos Escavada

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Ateno
Os testes de floculao s devem ser realizados em ambientes com temperatura ambiente entre 23C e 29C. Temperaturas fora dessa faixa desestabilizam a reao, o que pode gerar resultados falso-positivos ou falso-negativos.

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Controle de qualidade dos testes de floculao

Captulo 7

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Controle de qualidade dos testes de floculao

Como bom profissional, voc sabe que a qualidade dos resultados fundamental na prtica laboratorial. Para ter a garantia de que o seu trabalho foi executado corretamente, importante adotar medidas de controle de qualidade que permitam avaliar a execuo de cada etapa do trabalho realizado. Neste captulo voc ver procedimentos que devem ser adotados para que os resultados produzidos sejam confiveis e possam ser reproduzidos.

Soros controle
Soros controle utilizados
Voc dever utilizar soros controle produzidos no seu laboratrio ou adquiridos de fonte idnea, e no somente os soros controle dos conjuntos diagnsticos (kit), pois: Nem todos os conjuntos diagnsticos vm com controles positivos e negativos. Os controles que acompanham os kits nem sempre tm volume suficiente para voc realizar o teste quantitativo todas as vezes em que prepara a suspenso antignica e testa suas amostras. Um laboratrio dedicado s Boas Prticas sempre inclui soros controle produzidos no prprio estabelecimento. importante que voc registre, diariamente, os resultados obtidos com os seus controles. Desse modo, poder observar qualquer alterao na qualidade do reagente que est utilizando ou problemas que ocorram na reao, tendo, assim, a possibilidade de tomar as providncias cabveis para corrigir o erro.

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Quando no h soros controle no kit

Nesses casos voc dever utilizar os soros controle preparados no prprio laboratrio ou adquiridos de fonte idnea. Se voc estiver iniciando o diagnstico da sfilis em seu laboratrio e ainda no dispuser desse tipo de amostra, solicite a algum laboratrio tecnicamente reconhecido que os envie. Prepare seus prprios controles

Os soros controle positivos que voc deve utilizar em sua rotina devem ter pelo menos trs ttulos distintos: um baixo (at 1/4), um mdio (1/8 a 1/16) e outro alto (acima de 1/32). Armazene amostras reagentes obtidas da sua rotina; Para confirmar o ttulo das amostras da sua rotina teste-as em paralelo a amostras com ttulos conhecidos. Se os soros com reatividade conhecida reproduzirem o ttulo esperado, os ttulos das suas amostras sero considerados verdadeiros e elas podero ser utilizadas como soros controle. Prepare alquotas desses soros com ttulos conhecidos sem dilu-los, tendo o cuidado de identific-los com: data, ttulo e o nmero de alquotas armazenadas. Utilize uma planilha prpria para registrar e controlar a utilizao e o estoque desses soros. Faa tambm alquotas de amostras no reagentes. Lembre-se de preparar alquotas dos controles em volume suficiente para apenas uma reao. Estoque-as em freezer a menos 20C. Descongele diariamente apenas a alquota necessria, que no dever ser novamente congelada. Ao descongelar os controles no esquea de homogeneiz-los antes de fazer a inativao ou a reinativao; No misture amostras de soros positivos.

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Ateno
O procedimento de congelar e descongelar vrias vezes um soro faz com que o ttulo diminua.

Cuidados com os soros controle

1. Determine o ttulo do soro controle positivo antes de iniciar uma rotina com testes de floculao
A obteno do ttulo esperado para o soro controle o que garante que: a suspenso antignica foi corretamente preparada; os equipamentos e os insumos utilizados apresentam a qualidade desejada. Nos casos das suspenses antignicas prontas para uso, a titulao garante que esto estveis e adequadas para uso.

2. Quando o ttulo dos soros controle no corresponde ao esperado

Se voc no obtiver os ttulos previamente definidos para os controles, e j tiver descartado a possibilidade de que o problema seja na qualidade da suspenso antignica, verifique se: a velocidade de agitao da reao estava em 180 2 rpm; o tempo de agitao da reao foi o preconizado pelo fabricante do kit; a calibrao da agulha ou da pipeta utilizada para dispensar a suspenso antignica estava correta; a leitura foi feita imediatamente aps o trmino da agitao; os procedimentos de lavagem do material empregado para fazer a reao foram adequados, pois resduos de sabes e detergentes podem alterar os resultados da reao.

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3. Teste do controle negativo em cada rotina com testes de floculao

Ao testar o soro controle negativo certifique-se de que a suspenso antignica no apresenta flocos (grumos) grosseiros, que podem ser confundidos com reatividade da amostra no teste. Observe primeiro o controle negativo para estabelecer o parmetro de negatividade da reao antes de fazer a leitura dos resultados das amostras da sua rotina.

Instrues para lavagem dos materiais utilizados nos testes no treponmicos como o VDRL
Aps a leitura do teste de VDRL, as lminas devem ser colocadas em soluo de lcool a 70% (p/p) ou hipoclorito de sdio a 1/5 (uma parte de hipoclorito de sdio comercial e quatro partes de gua), para descontaminao. Lembre-se que a suspenso antignica composta por lipdeos (cardiolipina, colesterol e lecitina), por isso a lavagem das lminas do VDRL, da seringa calibrada e do Erlenmeyer deve seguir os procedimentos descritos a seguir: Procedimentos para lavar materiais:

Lave as vidrarias com gua e sabo neutro, utilizando uma escova; Enxgue pelo menos 10X com gua corrente; Enxgue de 5 a 10X com gua destilada; Enxgue 1X com lcool absoluto; e Enxgue 1X com acetona; Deixe secar at que no haja qualquer resduo de acetona; Guarde o material em local adequado para evitar poeira e arranhaduras nas lminas de vidro.

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Recomendaes para o teste rpr

A padronizao deste teste DETERMINA que este seja realizado em cartes descartveis, de uso nico, com crculos de 18cm de dimetro. Infelizmente, existem fabricantes que no incluem esses cartes em quantidade suficiente para realizao dos testes qualitativos e quantitativos e, por isso, alguns laboratrios os reutilizam. Esse procedimento inadequado e contraria as Boas Prticas laboratoriais. Materiais descartveis devem ser descartados. Assim sendo, exija que o fornecedor do kit entregue ao seu laboratrio os cartes em quantidade suficiente para fazer o nmero de testes que foram adquiridos pelo seu laboratrio. Se houver recusa, denuncie o fornecedor Vigilncia Sanitria do seu estado.

Ateno
As recomendaes acima valem tambm para o teste TRUST.

Outras dicas para garantir a qualidade dos testes:

No use reagentes fora do prazo de validade estabelecido pelo fabricante; No use testes sem registro na ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria; Faa o protocolo de trabalho com ateno; Anote a data e a hora dos ensaios; Siga rigorosamente as instrues do fabricante e nunca altere os volumes estabelecidos; Use sempre soros controle positivos e negativos; Monitore diariamente a temperatura ambiente e registre-a em formulrio prprio; Monitore diariamente a temperatura do banho-maria e registre-a em formulrio prprio;

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Providencie as manutenes preventivas e corretivas dos seus equipamentos. Aprenda mais sobre esse tema fazendo o Curso: Equipamentos utilizao e monitoramento em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica da srie TELELAB; Participe de um programa de Avaliao Externa da Qualidade, conforme estabelecido na RDC N 302, de 13 de outubro de 2005.

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Testes treponmicos

Captulo 8

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Testes treponmicos
Neste capitulo voc conhecer os testes treponmicos mais utilizados, suas indicaes de uso e as limitaes dessas metodologias. Os testes treponmicos FTA-abs, MHA-TP/TPHA/TPPA e ELISA foram desenvolvidos inicialmente para confirmar resultados positivos obtidos previamente com testes no treponmicos. Atualmente, os ELISA e suas variaes, por permitirem automao, tambm so utilizados como testes de triagem em laboratrios ou em hemocentros que possuem grande rotina.

Caractersticas gerais dos testes treponmicos

Como dificilmente esses testes treponmicos tornam-se no reagentes, necessrio que o mdico investigue a histria clnica do usurio e associe o resultado do teste treponmico com o resultado do teste no treponmico. So testes qualitativos. Sua reatividade indica que o usurio teve contato com Treponema pallidum em alguma poca de sua vida e desenvolveu anticorpos especficos. So indicados para confirmao do diagnstico, quando a triagem feita com um teste no treponmico.

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Testes treponmicos mais utilizados no Brasil

Teste treponmico Porque utilizado considerado o teste de referncia ou padro ouro dentre os testes treponmicos. Pode ser feito com amostras de soro ou plasma. FTA-abs (Fluorescent treponemal antibody absorption) o primeiro teste a se tornar reagente aps a infeco, tendo bom desempenho no diagnstico da sfilis primria em usurios que apresentam o cancro duro com mais de 10 dias de evoluo. importante tambm para o esclarecimento do diagnstico de usurios com evidncia clnica de sfilis que apresentaram resultados no reagentes nos testes no treponmicos, situao que pode ocorrer em amostras de pacientes com sfilis primria, latente recente ou tardia. So de execuo simples. Podem ser feitos em amostras de soro ou plasma. No necessitam equipamentos para sua realizao ou para a leitura dos resultados. So ensaios que podem ser automatizados e empregados em laboratrios que tm grande rotina. Podem ser feitos em amostras de soro ou plasma. Existem, ainda, kits padronizados para testar amostras de sangue seco em papel-filtro. A leitura dos resultados feita por espectrofotometria G ou outros mtodos automatizados. No necessitam de estrutura laboratorial para serem executados. Podem ser feitos em amostras de sangue total, soro ou plasma. Entre a coleta da amostra e a emisso do resultado decorrem cerca de 30 minutos.

Testes de hemaglutinao ou aglutinao indireta ou passiva

Imunoenzimticos ELISA, incluindo os quimioluminescentes

Testes Rpidos TR

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TESTE FTA-abs (Fluorescent treponemal antibody absorption)

Princpio Metodolgico da Reao de FTA-abs
A reao de FTA-abs uma tcnica de imunofluorescncia indireta (IFI). Utiliza Treponema pallidum fixado em reas demarcadas de lminas de vidro em que so feitas as reaes. Veja na Figura 9 a representao do seu princpio metodolgico.

Anticorpo treponmico da amostra

Conjugado Fluorescente

Figura 9 Representao esquemtica de uma reao de imunofluorescncia indireta.

A reao de FTA-abs
1. No FTA-abs, o antgeno utilizado Treponema pallidum subsp pallidum (cepa Nichols), que fixado nas demarcaes de uma lmina de vidro. 2. A amostra de soro utilizada deve ser inativada a 56C por 30 minutos.
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3. As diluies so feitas em tubo, (a amostra diluda a 1/5 misturando-se 1 parte de soro e 4 partes de soluo absorvente ou sorbent extrato de cultura de treponema Reiter no patognico). Essa diluio feita para remover anticorpos treponmicos comuns maioria dos treponemas no patognicos que podem estar presentes no soro. 4. A amostra diluda colocada sobre a demarcao da lmina. Se a amostra contiver anticorpos antitreponema pallidum, esses se ligaro aos treponemas fixados na lmina. 5. Aps a incubao da reao e lavagem da lmina para remover anticorpos e outros componentes da amostra que no se ligaram reao, adicionado o conjugado fluorescente (soro anti-imunoglobulina humana conjugado ao isotiocianato de fluorescena); 6. Se houver anticorpos na amostra ligados aos treponemas fixados na lmina, o conjugado se ligar aos anticorpos, tornando os treponemas fluorescentes. Esses podero, ento, ser vistos em microscopia de fluorescncia, emitindo luz verde ma.

Ateno
Utilize sempre um controle positivo e um controle negativo em toda a lmina de FTA-abs.

Leitura e Interpretao da Reao de FTA-abs

Os resultados possveis so: REAGENTE: quando os treponemas ficam fluorescentes (emitem cor de ma verde) sob microscopia de imunofluorescncia; NO-REAGENTE: quando os treponemas apresentam uma colorao avermelhada ou cor verde plida, sem sinal de fluorescncia; INCONCLUSIVA: quando h presena de treponemas com baixa intensidade de fluorescncia, quando so observadas reaes com pontos de fluorescncia nos treponemas, ou ainda quando se observam, no mesmo campo, treponemas fracamente fluorescentes e treponemas com colorao avermelhada.
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Dicas para resolver o problema dos resultados inconclusivos

1. Se os padres de reatividade dos controles no estiverem de acordo com os esperados, recomenda-se verificar: O tempo e a temperatura utilizados para inativar a amostra. Nesses casos teste novamente a amostra aps a correo do problema; Se a amostra foi congelada e descongelada vrias vezes, o que pode ter causado diminuio ou perda de reatividade. Nesse caso, solicite uma nova amostra. 2. Se os padres de reatividade dos controles no estiverem de acordo com os esperados, recomenda-se verificar se: O antgeno contm muitos restos celulares e/ou outros contaminantes biolgicos; Os conjugados fluorescentes podem ter perdido a marcao com a fluorescena ou apresenta contaminao bacteriana ou fngica. Nesses dois casos se observa intensa fluorescncia inespecfica; O tempo e a temperatura de incubao da reao foram os recomendados pelo fabricante; As condies do microscpio e da lmpada de fluorescncia; O pH da salina tamponada com fosfato utilizada para a lavagem das amostras est em 7,20,2.

Ateno
Se houver constatao de que h problemas com o antgeno de T. pallidum ou com o conjugado fluorescente: Primeiro, descarte os problemas de m conservao e de prazo de validade vencido dos reagentes. Caso tudo esteja correto, entre em contato com o fornecedor e solicite a troca do reagente problema. Se aps a adoo dessas medidas o resultado permanecer inconclusivo, sugere-se o uso de outra metodologia e, se possvel, a coleta de uma nova amostra.
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Reagentes e insumos para o FTA-abs Atualmente, os testes so apresentados na forma de conjuntos diagnsticos (kits), que geralmente incluem: lminas contendo os antgenos j fixados, embaladas individualmente; conjugado fluorescente com o ttulo pr-determinado; soluo adsorvente G ou sorbent; os soros controle positivos e negativos; e soluo concentrada de salina tamponada com fosfato (PBS) para a lavagem das lminas. Esses reagentes e insumos podem ser adquiridos separadamente. Nesse caso, se o antgeno for liofilizado, esse deve ser reconstitudo e fixado nas lminas. O conjugado adquirido deve ser titulado para determinar a diluio ideal e a soluo salina tamponada deve ser preparada no laboratrio. Lembre-se que voc deve produzir soros controle a partir das amostras da sua rotina e utiliz-los em todas as lminas ao fazer o teste das amostras dos usurios.

Ateno
Utilize ponteiras estreis na preparao do conjugado para evitar sua contaminao.

Testes MHA-TP (Micro-hemaglutinao para Treponema pallidum) e da aglutinao indireta

Princpio metodolgico da reao de MHA-TP
O teste de hemaglutinao indireta ou passiva baseia-se na ligao dos anticorpos treponmicos presentes no soro com hemcias que contm, na sua superfcie, antgenos de Treponema pallidum (cepa Nichols).

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Os anticorpos presentes no soro ligam-se aos antgenos que esto na superfcie das hemcias, resultando na hemaglutinao. Na reao de aglutinao indireta, os antgenos de Treponema pallidum so adsorvidos superfcie de partculas de gelatina. Os anticorpos presentes no soro ligam-se aos antgenos de vrias partculas de gelatina, resultando na aglutinao.

Dicas: Antes de iniciar a reao, leia atentamente as recomendaes do fabricante do kit quanto necessidade de: inativar o soro; diluir a amostra com soluo adsorvente ou sorbent; utilizar 2 mercaptoetanol para adsorver fator reumatide ou outros interferentes da reao; utilizar controles com hemcias ou partculas de gelatina sem antgenos na sua superfcie. Alm disso: retire a eletricidade esttica da placa de reao, passando uma gaze mida embaixo desta antes de iniciar a incubao, para evitar resultados falso-positivos; incube a reao em local onde no haja vibrao, para evitar que ligao dos anticorpos s hemcias ou s partculas de gelatina seja desfeita, o que causa resultados falsonegativos.

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Ateno
Lembre-se que voc no pode reutilizar as placas de microtitulao para fazer esta reao. Placas usadas devem ser descartadas.

Leitura e interpretao da reao de hemaglutinao ou de aglutinao

Os resultados possveis so: REAGENTE: quando h hemaglutinao (ou aglutinao) se forma uma rede ou tapete de hemcias (ou de partculas de gelatina) unidas aos anticorpos e que se espalha por toda a superfcie do poo da placa em que foi realizada a reao.

Figura 10 Hemaglutinao reagente.

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Rea

gen te

NO REAGENTE: quando no h hemaglutinao, as hemcias (ou as partculas de gelatina) se depositam e formam um boto compacto, no fundo do poo da placa em que foi realizada a reao.

Figura 11 Hemaglutinao no reagente.

INCONCLUSIVO: neste caso, no h formao completa da hemaglutinao, nem do boto, por isso se observa um misto dos dois, no sendo possvel definir se a amostra reagente ou no reagente. Quando isso ocorre o teste deve ser repetido.

Figura 12 Hemaglutinao inconclusiva.

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nclu s

ivo

No

reag ente

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Teste treponmico imunoenzimtico ELISA ou de quimioluminescncia

Os testes imunoenzimticos e suas variaes como, por exemplo, o mtodo de quimioluminescncia, so testes treponmicos que utilizam antgenos recombinantes G de Treponema pallidum fixados em uma fase slida. A esses antgenos se ligaro os anticorpos presentes na amostra do usurio. As reaes devem ser feitas sempre de acordo com as instrues dos fabricantes porque existem variaes na forma de revelar os anticorpos das amostras que se ligaram aos antgenos fixados. Essas reaes so semi ou totalmente automatizadas e necessitam de equipamentos especficos.

Saiba mais
Para conhecer o princpio metodolgico dos testes ELISA e de Quimioluminescncia faa o curso da Srie TELELAB HIV Estratgias para diagnstico no Brasil.

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Testes rpidos para sfilis

Captulo 9

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Testes rpidos para sfilis

Pela simplicidade de execuo, facilidade e rapidez na leitura, os TR para sfilis fazem parte das estratgias do Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais para ampliar a cobertura diagnstica da sfilis.

Testes rpidos so todos os testes cuja execuo, leitura e interpretao do resultado so feitas em, no mximo, 30 minutos, sem a necessidade de estrutura laboratorial. A leitura dos resultados feita a olho nu. Dependendo do fabricante, os testes rpidos para diagnstico da sfilis podem ser feitos com amostras de sangue total, soro ou plasma. Recentemente, os testes rpidos treponmicos tornaram-se disponveis no mercado brasileiro e apresentam valores de sensibilidade e de especificidade adequados para o diagnstico laboratorial da sfilis. Por serem de fcil execuo podem ser utilizados para ampliar o acesso ao diagnstico em: populaes que residem em locais de difcil acesso. localidades nas quais os servios de sade no possuem adequada estrutura laboratorial. situaes emergenciais como, por exemplo, em maternidades, no atendimento de parturientes que no fizeram o seguimento pr-natal. Nos Centros de Testagem e Aconselhamento (CTAs) a utilizao de TR para o diagnstico da sfilis possibilita a liberao do resultado do teste logo aps a coleta da amostra, permitindo que as orientaes e o tratamento especfico sejam instaurados imediatamente.

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Saiba mais
Acompanhe no site do Departamento de DST, Aids e Hepatites virais www.aids.gov.br a legislao vigente para a utilizao dos testes rpidos.

Princpios metodolgicos dos testes rpidos TR para diagnstico da sfilis

Os testes rpidos comercializados no Brasil e registrados na ANVISA utilizam o princpio metodolgico de imunocromatografia ou fluxo lateral, para a deteco de anticorpos treponmicos. Dentro do mesmo princpio metodolgico pode haver variaes, e os resultados podem ser visualizados na forma de um ponto ou de uma linha. Veja a seguir um exemplo de um teste, com o resultado em linha: 1. A fase slida uma tira de nitrocelulose. 2. A tira contm: Um local para colocar a amostra e a soluo tampo, chamada de rea A; Uma rea intermediria contendo conjugado composto de antgenos recombinantes de Treponema pallidum ligados ao corante selenium coloidal; Uma outra rea que contm antgenos de treponema imobilizados, para leitura do resultado chamada de rea T; Uma terceira rea que contm um conjugado de anti-imunoglobulina (IgG) e ouro coloidal ou de antiprotena A recombinante e ouro coloidal para controle da reao e para validao do testes, chamada de rea C.
Controle rea C

Teste rea T Amostra rea A

Figura 13 Dispositivo para TR por imunocromatografia ou fluxo lateral.

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3. A amostra colocada na rea A e, em seguida, adicionada a soluo tampo; 4. Os anticorpos da amostra fluem lateralmente pela fita de teste e ligam-se ao conjugado. Os anticorpos ligados ao conjugado continuam fluindo pela fita at a rea T e ligam-se nos antgenos imobilizados, resultando no aparecimento de uma linha colorida; 5. O fluxo continua e fraes do conjugado que no se ligaram na rea T vo ser revelados na rea C, produzindo uma linha vermelha. Essa linha o controle da reao, sempre deve estar presente e indica que houve perfeita migrao da amostra na tira de reao.

Leitura do teste rpido para sfilis

Faa a leitura do seguinte modo: 1. Observe se houve a formao de uma linha colorida na rea C. A presena desta linha valida o teste e indica que no houve problema com a reao. 2. Em seguida, faa a leitura do resultado da amostra observando se houve ou no a formao de uma linha colorida na rea T. Os resultados possveis so:

REAGENTE: quando h formao de uma linha colorida na rea T e outra na rea C. Um resultado positivo indica que h anticorpos antitreponema detectveis na amostra do indivduo.

Figura 14a Exemplo de TR Reagente para Sfilis.

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NO REAGENTE: quando h formao de linha colorida apenas na rea C. Um resultado negativo indica que no h anticorpos antitreponema detectveis na amostra do indivduo.

Figura 14b Exemplo de TR No Reagente para Sfilis.

Ateno
Se no houver formao de linha colorida na rea C o teste INVLIDO, independentemente do resultado obtido na rea T. Nesse caso o teste deve ser repetido.

Como proceder se o resultado do teste for invlido:

Repita o teste. Caso o resultado continue invlido, faa o teste com um kit de outro lote ou de outra marca; ou Considere que: a) amostras coaguladas ou lipmicas podem interferir nos resultados; b) que os volumes da amostra e do tampo estavam incorretos; c) que os tempos de todas as etapas no foram rigorosamente respeitados. Faa um teste treponmico como o FTA-abs, hemaglutinao ou imunoenzimtico; Verifique as condies de estocagem do kit e o prazo de validade; Informe prontamente ao fornecedor caso haja persistncia de resultados invlidos, pois esses sugerem problemas no kit.

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Ateno
No utilize kits com prazo de validade vencido. Lembre-se que os componentes do kit podem ter prazos de validade diferentes. Todos os itens devem ser verificados antes de sua utilizao. No misture componentes provenientes de kits ou caixas de lotes diferentes. Utilize os volumes corretos da amostra e dos outros reagentes.

A escolha do teste rpido

Antes de decidir, faa contato com vrios fabricantes de testes que estejam registrados na ANVISA e solicite a bula de cada produto. Estes testes esto disponveis comercialmente em variados formatos para analisar amostras de sangue total, de plasma e de soro. Verifique quais os tipos de amostras definidas pelo fabricante do conjunto diagnstico que voc pretende utilizar antes de fazer sua escolha.

Saiba mais
Para saber quais kits esto registrados: acesse o site www.anvisa.gov.br. Clique em PRODUTOS PARA SADE. Alm disso, para a escolha considere tambm: Qual amostra pode ser utilizada no teste e se a sua estrutura de coleta adequada; A quantidade diria de testes que voc ir realizar; Condies para estocar as amostras coletadas por puno venosa, caso voc pretenda utilizar este tipo de amostra;

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Local adequado e pessoal treinado para coletar a amostra.

Ateno
As amostras obtidas por puno digital podem ser colhidas em qualquer local, desde que respeitadas as normas de biossegurana: uso de EPI, antissepsia das mos e do local da puno, entre outros.

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Interpretao dos resultados dos testes de sfilis

Captulo 10

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Interpretao dos resultados dos testes de sfilis

Os testes laboratoriais para o diagnstico da sfilis devem ser feitos em duas etapas, uma de triagem e outra confirmatria. Independentemente da sistemtica de trabalho adotada em seu servio para a triagem das amostras fundamental que toda amostra reagente seja submetida a um teste no treponmico quantitativo e a um teste treponmico.

Como deve ser a interpretao dos resultados

Embora os resultados dos testes laboratoriais sejam interpretados pelo mdico, em associao com os dados da histria clnica do usurio e com os dados epidemiolgicos, importante saber: Teste no treponmico reagente e teste treponmico reagente podem significar sfilis ativa, sfilis latente ou sfilis tratada. O QUE FAZER: para esclarecer o caso, deve-se analisar a histria do usurio (dados clnicos e epidemiolgicos); Teste no treponmico reagente (geralmente em ttulos baixos) e Teste treponmico no reagente Improvvel que seja sfilis. O QUE FAZER: neste caso se deve investigar doenas autoimunes, crnicas ou outras doenas infecciosas agudas e ainda outras situaes fisiolgicas e biolgicas que o mdico considerar pertinentes para explicar a positividade do teste no treponmico; Teste no treponmico no reagente e Teste treponmico reagente pode significar sfilis primria (com possvel presena do cancro) ou sfilis tratada. O QUE FAZER: o mdico deve examinar o usurio buscando a leso primria e verificar a histria clnica e epidemiolgica. Teste no treponmicos e teste treponmico no reagentes provavelmente o usurio no tem sfilis ou a infeco muito
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recente e os anticorpos ainda no so detectveis pelos testes utilizados. O QUE FAZER: caso persista a suspeita clnica os testes devem ser repetidos aps cerca de 20 a 30 dias.

Cicatriz sorolgica e baixos ttulos

Cicatriz sorolgica o termo utilizado para as situaes nas quais o usurio, comprovadamente tratado, ainda apresenta reatividade nos testes. Nestes casos, os testes treponmicos so geralmente reagentes e os testes no treponmicos quantitativos apresentam baixos ttulos. um erro considerar ttulos baixos apenas como cicatriz sorolgica ou como reao falsamente positiva. S possvel determinar que se trata de cicatriz sorolgica quando for comprovado que o usurio teve sfilis e realizou tratamento adequado.

Ateno
Ttulos baixos tambm so encontrados: na sfilis primria, quando os anticorpos esto circulando em baixas concentraes. na sfilis latente no tratada.

Como avaliar a resposta ao tratamento da sfilis

Somente os testes no treponmicos quantitativos so indicados para avaliar a eficcia do tratamento da sfilis. Recomenda-se sua realizao a cada seis meses, at o final do segundo ano aps o tratamento.

Negativao dos testes no treponmicos

Quanto mais precoce for o tratamento aps a infeco, mais rapidamente haver desaparecimento dos anticorpos circulantes, com a consequente negativao dos testes no treponmicos ou ainda sua estabilizao em ttulos baixos.

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Para a maioria dos usurios tratados, espera-se que haja reverso dos resultados, e que os testes tornem-se no reagentes entre 6 e 30 meses aps o tratamento. Entretanto, na sfilis tratada tardiamente os testes podem nunca se negativar, persistindo a deteco de anticorpos em ttulos baixos. A sorologia quando se apresenta repetidamente reagente em ttulos baixos em usurios corretamente tratados no tem significado clnico. Segundo a literatura, os ttulos diminuem cerca de quatro vezes aps trs meses e oito vezes aos seis meses aps o tratamento. Outros autores relataram que o teste permaneceu reagente nas seguintes percentagens, de acordo com o tempo de tratamento:
Percentual de reatividade nos testes no treponmicos no monitoramento do tratamento da sfilis. Tempo Pacientes tratados com sfilis primria Pacientes tratados com sfilis secundria 6 meses 16,5% 27,6% 12 meses 11,4% 17,0% 30 meses 6,6% 8,4%

Durante o monitoramento do tratamento, o aumento de dois ou mais ttulos no teste sugere reinfeco ou tratamento inadequado.

Ateno
A infeco pelo Treponema pallidum no confere imunidade, por isso um indivduo pode contrair sfilis tantas vezes quantas for exposto ao agente etiolgico.

Limitaes dos testes treponmicos

No podem ser utilizados no monitoramento de tratamento. Cerca de 85% de amostras de indivduos adequadamente tratados permanecem positivas nos testes treponmicos durante muitos anos e, em alguns casos, durante toda a vida. Aproximadamente 1% da populao em geral apresenta reaes falsamente positivas nos testes treponmicos.

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Outros cuidados necessrios

Lembre-se sempre da sua segurana. Utilize os equipamentos de proteo individual quando for colher amostras de sangue ou realizar os testes: Avental ou jaleco de comprimento abaixo dos joelhos, com mangas longas, sistema de fechamento nos punhos por elstico ou sanfona e fechamento at a altura do pescoo; Protetor facial ou culos de proteo e mscara; Luvas descartveis; Sapatos fechados; Calas compridas. Para que voc possa trabalhar observando todos os cuidados de biossegurana faa o curso do Sistema TELELAB: Biossegurana e aprenda mais sobre este tema.

Ateno
No descuide de sua prpria segurana. Lembre-se que voc vai lidar com material potencialmente infectante.

Figura 15 Equipamentos de proteo individual.

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Glossrio

Adsorvente: fixao de molculas a uma superfcie slida. Antgenos recombinantes: so produtos antignicos obtidos por meio de tecnologia de DNA recombinante. Cardiolipinas: um lipdio encontrado em baixas concentraes em tecidos de mamferos. A cardiolipina sdica obtida de corao de boi utilizada no preparo do antgeno VDRL. Conjugado: um reagente formado por duas molculas ligadas, como por exemplo, o fluorocromo isotiocianato de fluorescena ligado molcula de imunoglobulina utilizada na reao de FTAabs. Espectrofotometria: um mtodo ptico de leitura de reaes que utiliza diferentes filtros para determinar a presena e/ou a quantidade de um analito. O equipamento utilizado o espectrofotmetro. Inativao: o procedimento de aquecer as amostras biolgicas (por ex. soro) a 56 C durante 30 minutos para destruir ou tornar inativo os componentes termossensveis do sistema complemento, para que este constituinte presente no sangue no interfira no desempenho da reao antgeno-anticorpo in vitro (nos testes sorolgicos). Liofilizao: um processo de desidratao usado para preservar alimentos perecveis, princpios ativos, bactrias etc. So congelados e a gua retirada por sublimao, sem que passem pelo estado lquido. Resposta imune humoral: refere-se produo de anticorpos pelo sistema imune em resposta a um antgeno.

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Referncias
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