Antagonismo Microbiano 2013

INTRODUCCION

Muchas bacterias producen pptidos que inhiben el crecimiento o matan a otras especies estrechamente relacionadas o incluso a otras estirpes de la misma especie, estos pptidos se denominan bacteriocinas. El Antagonismo microbiano o exclusin competitiva incluye la competencia entre microbios. Una consecuencia de esta competencia es que la microflora normal protege al husped contra la colonizacin por posibles microbios patgenos porque compite por los nutrientes, produce sustancias nocivas para los microbios invasores, y afecta condiciones como el pH y la disponibilidad de oxgeno. En este practica se explicara el efecto antagnico de Streptomyces spp. frente al hongo Fusarium verticillioides causante de la pudricin del maz. Los actinomicetos son microorganismos muy ubicuos, que se encuentran en la gran mayora de sustratos naturales, ampliamente distribuidos en variedades de hbitats diferentes: suelo, agua marina, agua dulce, estircol, lagos, fangos de ros. Estos son saprofitos y algunas especies producen enfermedades en plantas, animales domsticos incluso al hombre. Se encuentran en casi todos los tipos de suelos y bajo condiciones extremas disminuyen levemente su concentracin de su poblacin. Su nmero vara en gran proporcin segn el caso, pero es comn encontrarlos en suelos frtiles en una concentracin de 106 ufc g-1 de suelo seco. (Balakrishna et al.,2012). Los actinomicetos como Streptomyces spp. son cualitativamente importantes en la rizosfera y pueden colonizar las races en presencia de microbiota nativa. Algunos Streptomyces son asilados de semillas, hojas, tubrculos e inclusive existen estreptomicetos endofticos, que colonizan en nichos ecolgicos similares a los fitopatgenos. Estos microorganismos que se establecen y multiplican en las races son ideales por su antagonismo como agentes de biocontrol de hongos y bacterias causantes de enfermedades de plantas. Estos presentan mecanismo de antibiosis, degradacin de fitotoxinas, sntesis de protenas extracelulares como quitinasas y glucanasas, que degradan el constituyente mayoritario de las paredes celulares de las plantas, propiedades asociadas a su capacidad para controlar fitopatgenos como Fusarium verticillioides. El cultivo del Maz Zea mays, es el segundo cereal ms sembrado en el mundo para la alimentacin humana y animal, debido a su valor histrico, econmico y gran capacidad de adaptabilidad a diferentes climas y suelos. En el Per, el maz es el cuarto cultivo ms importante de actividad agrcola, generando 3600 jornales al ao. En la costa se cultiva maz amarillo duro y semiduro, destinado a la elaboracin de alimentos balanceados y obtencin de derivados. A su vez, en la sierra se cultiva maces blancos amilceos, en su mayora para la alimentacin humana. No obstante, el cultivo y rendimiento del maz se ven afectados por diversos factores limitantes, como la baja fertilidad del suelo, asi como el ataque de fitopatgenos e insectos plagas, requirindose de mayores costos de inversin, con disminucin de la rentabilidad del cultivo.

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1. Objetivos Determinar la actividad antagnica del Streptomyces spp. frente al hongo del genero Fusarium. Establecer la relacin de entre el hongo y la bacteria promotora del antagonismo por medio de la inhibicin del crecimiento de Fusarium en placa. 2. Materiales Material biolgico: Mazorca de maz nativa - Cepa de Azotobacter spp. Medios de Cultivo: Agar papa dextrosa (PDA) + Antibitico Placas petri Tubos dilucin Beakers Papel secante Ansas bacteriolgicas Sacabocado Solucin de Hipoclorito de Sodio al 10% Agua destilada estril 3. Fundamento Terico 3.1.Aislamiento e Identificacin de Fusarium verticillioides En campos comerciales de maz donde se observe sntomas de pudricin de tallo y de la mazorca colectar cinco tallos y aleatoriamente 200 granos de maz, procedentes de diez mazorcas desgranadas y recin cosechadas en el campo. Para el aislamiento de hongos segn Ros & Zuiga (2012), lavar los tallos para eliminar el exceso de suelo adherente. Despus, en asepsia cortar en fragmentos aproximados de 1 cm, que sern depositados en un vaso de precipitacin, donde se adicionaran 40 mL. de hipoclorito de sodio comercial al 10% (v/v) y se homogenizara el contenido con movimientos rotatorios durante 2 minutos. A continuacin, eliminar el sobrenadante y vertir 50 mL. de agua destilada estril. A su vez, seleccionar 60 granos de maz aleatoriamente y segn Garca & Martnez (2010) desinfectarlos superficialmente con Hipoclorito de sodio comercial al 1% (v/v) durante un minuto. Finalizada la desinfeccin, los fragmentos de tejido vegetal y semillas de maz sern depositados sobre papel filtro estril, para eliminar el exceso de humedad y luego sern llevados en nmero de seis, dispuestos radialmente sobre placas de petri con agar papa dextrosa (PDA) ms cloranfenicol. Despus de la incubacin a 30C, hasta por siete das, fragmentos delos micelios desarrollados se cultivaran en viales con PDA, se incubaran a 30C, por cuatro das y constituirn los cultivos puros de hongos, que sern guardados en refrigeracin. La identificacin de los

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hongos fitopatgenos se realizara segn las claves de Barnett y Hunter (1999). 3.2.Prueba de antagonismo Para la prueba de antagonismo utilizar la tcnica de enfrentamiento en cultivo dual descrita por Fernndez & Vega (2001), segn la cual cada bacteria nativa se siembra masivamente en un extremo de la placa petri con PDA, ocupando aproximadamente un cuarto del rea de la placa y se incuba a 30C/72 hrs. A continuacin, un fragmento del hongo fitopatogeno se deposita en el extremo dela placa opuesto al de la bacteria y se incuba a 30C., hasta que el patgeno detenga su crecimiento. Despus de cinco das de medir el radio de la colonia del hongo fitopatogeno y comparar con una placa testigo para determinar si el crecimiento fngico es afectado por Streptomyces spp. Los resultados se expresan con porcentaje de inhibicin del crecimiento respecto al testigo. 4. Procedimiento 4.1. En primer lugar obtenemos la mazorca entera (con apariencia enferma), ser luego desgranada y los granos de maz (15 gr. Aprox.) sern tratados con lavados de Hipoclorito de Sodio al 10%.

4.2. Despus lavar con agua destilada, realizar este procedimiento dos veces; luego de esto los granos de maz sern puestos en un papel secante o absorbente, previamente estril, esto evitara que el maz tenga un exceso de humedad.

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4.3. Una vez seca las semillas, se procede a sembrar en la placa con el medio de PDA ms antibitico, los granos sern predispuestos en un crculo y un grano en el centro (en total siete granos). Este estar en incubacin hasta por siete das a una temperatura de 30C. Despus del tiempo de incubacin se observara un micelio caracterstico del hongo fitopatogeno (color salmn); se escoger el grano con las caractersticas mencionadas, para su posterior trabajo.

4.4. Los mejores granos que produjeron el fitopatogeno sern sembrandos en un tubo con medio PDA para obtener un cultivo del hongo. Una vez crecido el hongo en el medio se replicara en placa con medio PDA, para tener el hongo puro; esta vez sin el grano de maz.

4.5. Antes de demostrar la prueba de antagonismo, se debi tener una placa con PDA en la cual se sembr la bacteria Azotobacter spp. (centro de la placa con un 1cm de grosor) inhibidora de crecimiento (efecto antagnico), esta ser incubada a 30C/ 24 hrs.

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4.6. Una vez la placa de PDA con la bacteria ya crecida se procede a realizar la prueba de antagonismo, para ello es necesario obtener una pequea rea del hongo fitopatogeno, esto se logra con un sacabocado estril que corta crculos del hongo ms el medio. Estos sern depositados en los extremos de la placa (2 bocados), para ello ser necesario que se tenga un placa control para ver el crecimiento y comparar el porcentaje de antagonismo con la del control.

5. Resultados La bacteria sembrada en la prueba de antagonismo, inhibi el crecimiento del hongo fitopatgeno, para ello se midi el dimetro de crecimiento en centmetros del hongo en un periodo de 3 das, con el promedio de desarrollo de los halos se pudo obtener el porcentaje de inhibicin por cada da; esto fue comparado con la placa testigo para comparar los resultados y que estos sean de una manera fiables. Tabla 1. Porcentaje de Inhibicin de Azotobacter spp. Bacteria promotora de antagonismo Tiempo (horas) 72 96 120 Dimetro (cm) Bacteria Testigo 2.3 -2 2.4-2.5 2.9-2.6 3.1-3.2 3.2-3.4 3.9-4.1 Inhibicin (%) 12.24% 12.69% 17.5%

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6. Conclusiones La prctica cumpli con los objetivos propuestos, pues se demostr concretamente la prueba de antagonismo microbiano, por parte del microorganismo Azotobacter spp. en contra del hongo fitopatogeno Fusarium spp. lo cual fue observado en placa, indicando que el la bacteria es capaz de producir sustancias inhibitorias (clulas, quitinasas, proteasas, etc) que no permiten el crecimiento del hongo en presencia de estos factores. El porcentaje de inhibicin demostr cuantitativamente como el hongo es inhibido por la bacteria, por medicin de sus dimetros se pudo obtener estos datos casi exactos, adems la presencia de un testigo es importante para realizar clculos y obtener datos ms fiables, todo este proceso de antagonismo microbiano se realiz enfrentando la bacteria al hongo en un periodo de 3 das, aunque la teora indica que se debera realizar con ms tiempo, para obtener resultados ms precisos.

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