Paola A.

Chiquito P

Tema 1: Introduccin a la Histologa y Tcnicas Histolgicas

Objetivos: 1. Definir Histologa 2. Conocer las tcnicas histolgicas bsicas y las mas actuales 3. Enumerar ordenadamente los pasos de una preparacin histolgica bsica 4. Manejar los trminos basfilo y acidfilo 5. Reconocer estructuras basfilas y acidfilas Definir: Histologa Es el estudio de la anatoma microscpica de las clulas/tejidos de animales y plantas. El conocimiento de la histologa es esencial para el entendimiento de la fisiologa y la patologa.

La Clula Clula: Unidad estructural y funcional en personas y todos los organismos vivos Clulas y Tejidos Tejido: Cualquier grupo de clulas que realiza una funcin especifica. No necesariamente forma una capa. Ejemplos de tejidos: 1. La medula sea 2. El tejido conjuntivo que forma las fibras que soporta otros tejidos 3. El tejido linfoide que es parte del sistema inmune y nos protege de bacterias y otros agentes. Clasificacin histolgica tejidos animales Hay 4 tipos bsicos de tejidos: Tejido Epitelial Tejido Conjuntivo Tejido Muscular Tejido Nervioso

Preparacin Histolgica Bsica La mayora de los tejidos son muy gruesos y no permiten que la luz se transmita a travs de ellos. La habilidad de visualizar o identificar estructuras microscpicas se realza mediante el uso de coloraciones histolgicas.

Pasos Preparacin Histolgica Bsica 1. Fijacin

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Deshidratacin Aclarado Inclusin Seccin con un micrtomo Montaje Coloracin Cobertura

1.1 Fijacin Los fijadores previenen la descomposicin (degradacin) de los tejidos y mantienen su estructura celular y subcelular Este proceso puede daar la funcionalidad de protenas, especialmente las enzimas y puede desnaturalizarlas. Mecanismo de Accin: Los fijadores preservan clulas y tejidos mediante entrelazado irreversible de protenas

1. 2. Fijadores Comunes Microscopia de luz: solucin de formalina (formaldehdo) al 10%. Microscopia electrnica: solucin de glutaraldehido al 2.5%. Otros: tetraoxido de osmio o acetato de uranilo

1. 3. Proceso (Fijacin) Bloques de tejido de ~1cm se remueven del organismo (biopsia vs. Necropsia) y colocados en fijador un mnimo de 4 h. El tejido puede conservarse por varios aos pero resulta frgil y difcil de seccionar. Lavado: luego de fijados los tejidos, son lavados con agua de un dia para otro o cambiando el agua o buffer.

1.4. Fijacin de Secciones Congeladas (Crioseccin) Forma rpida de fijar y montar secciones histolgicas. Usada en remocin quirrgica de tumores Permite la determinacin rpida de los mrgenes (indica que el tumor fue removido completamente). Se usa un aparato de refrigeracin llamado criostato. El tejido congelado se secciona con un micrtomo, se monta en laminillas y se tie. Usada en inmunofluorescencia (inmunohistoquimica) (Estas tcnicas sern descritas posteriormente) 2. Deshidratacin Propsito: Remover agua de los tejidos para reemplazarla por un medio slido (ej. Parafina) y permitir el corte de secciones. Luego de deshidratadas, las muestras son pasadas secuencialmente a travs de baos de mayores concentraciones de alcohol (35%, 50%,

70%, 95%, y 100%) por 1-2 horas en cada concentracin para remover el agua. 3. Aclarado (Clarificacin) Propsito: Facilitar el paso posterior (inclusin en parafina) Se usa un fluido intermedio que se mezcle tanto con el alcohol (etanol) como con la parafina porque estos dos materiales no se mezclan. Los agentes de aclarado (clarificantes) mas usados en microscopia ptica son: tolueno, xylol, benceno, cloroformo y mezclas de varios aceites Microscopia Electrnica: Oxido de propyleno

4.1. Inclusin Se realiza usando un material liquido (agar, gelatina o cera), nitrocelulosa o resinas epxicas. La parafina es el material mas barato y mas usado. Recientemente, se han usado plsticos porque permite secciones mas delgadas Luego que los tejidos han sido aclarados se pone en moldes, se realiza la inclusin con parafina y se dejan endurecer

4.2. Inclusin Endurecimiento (fraguado):enfriando el liquido o mediante el curado de la resina (calor, luz ultravioleta o catlisis qumica). Los tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina pueden ser guardados indefinidamente a temperatura ambiente. El ADN y ARN puede ser recobrado. Para tejidos pre-congelados se llenan moldes con un medio basado en agua (ej. Glycol)

4.3 Inclusin Resinas Plsticas Ventajas: Permite obtener secciones ultra delgadas. Se coloca la muestra deshidratada en 1 mm3 de plstico liquido el cual polimeriza para formar un bloque duro para luego ser seccionado. Para microscopia de luz rutinaria, pueden usarse plsticos mas suaves Preparacin de Muestras Microscopio de Luz y Electrnico Luz Tamao muestra Fijador 1 cm3 Formaldehydo Electrnico 1 mm3 Glutaradehydo

Post-Fijacin Deshidratacin Agente clarificante Material Inclusin Grosor seccin Tincin 5.1.Seccin

Ninguno Alcohol graduado Xylol/Tolueno Parafina 5-10 Colorantes

Tetraoxido de Osmio Alcohol o Acetona Oxido de Propyleno Varios Plsticos 60-90 nm Metales Pesados

Para microscopia de luz, se monta una hojilla de vidrio en un micrtomo y se corta una seccin de 5-10 (micras) de espesor Para microscopio electrnico: secciones de 50-90 nanometros con Ultra microtomo Para electro microscopio de transmisin: ultra micrtomo con hojilla de diamante secciones 50-90 nm que son montadas en una rejilla de cobre de 3 mm de dimetro. Los tejidos congelado se embeben en un medio refrigerante y se corta en el micrtomo en un criostato.

5.2. Seccin Microtomo para secciones de parafina Consiste en una hojilla estacionaria y un mantenedor de muestra el cual avanza con intervalos pre- seleccionados con cada rotacin. 5.3. Seccin Ultamicrotomo: Similar al anterior pero avanza en nanometros en lugar de en micrones. Requiere un microscopio de diseccin montado sobre la hojilla de diamante. 5.4.Seccin Micrtomo montado sobre un congelador (criostato) Indicaciones: 1. muestras congeladas para estudio de molculas sensibles a temperatura o lipo-solubles. 2. cuando se desean resultados rpidos (biopsia durante intervencin quirrgica). Ventaja: rapidez y mantenimiento de funciones enzimticas e inmunolgicas. Desventaja: artefactos 6.1. Montaje Montaje: Para fijar las secciones a un portaobjetos para observarlas en microscopio ptico

El mtodo usado con mayor frecuencia es el bao termostatizado

6.2.Montaje Bao termostatizado: Al seccionar, obtenemos una tira con los cortes. Esta flota sobre la solucin de montaje: gelatina 1% a 38C (adhesivo) o agua. El corte se estira para eliminar arrugas. Luego, con un portaobjetos se toman las muestras 7. Coloracin Los tejidos biolgicos no tienen contraste. Las coloraciones se usan para dar contraste y para resaltar alguna caracterstica de inters. Cuando se conoce el mecanismo de accin qumico de las coloraciones se habla de histoqumica. Antes de colorear, la parafina de las muestras debe eliminarse para que los colorantes solubles en agua puedan penetrar con: xilol alcohol agua

Basofilia, Acidofilia y Metacromasia El termino basofilo indica que tiene atraccin por o interacta con colorantes bsicos (cationicos). Incluye hematoxilina, carmina, y Hematoxilina de hierro. El termino acidofilo indica que tiene atraccin por o interacta con colorantes cidos (aninicos).Incluye eosina, orange G, azafran, etc. Metacromasia: Alteracin del color (espectro de absorcin) de un colorante al tener interaccin con celula o tejido. Un colorante azul (ej. Azul de Tolouidina) colorea los mastoicitos de color rosado.

Estructuras histolgicas basofilas y acidofilas Nucleos: basfilos (azul oscuro/morado) Citoplasma, Generalmente acidofilo (Rosado) Algunos constituyentes citoplasmaticos pueden acidofilicos o neutrofilicos Fibras del Tejido Conjuntivo: rosadas o incoloras Clulas Musculares: Rosado

ser

basofilicos,

Coloraciones Comunes Hematoxilina y Eosina: Uso general Hematoxilina: tie los ncleos de azul

Eosina: tie el citoplasma, proteinas extra- o intra-celulares, las fibras -colgenas, elsticas y reticulares y los eritrocitos de color rosado, naranja o rojo

Hematoxilina y Eosina Este mtodo consiste en la aplicacin de hemalum (complejo formado por sales de aluminio y hematoxilina oxidada). Este colorea de azul los ncleos de las clulas y unos pocos componentes celulares La tincin del ncleo es seguida por la tincin con solucin acuosa o alcohlica de eosina, los cuales colorean otras estructuras eosinofilicas en varios tonos de rojo, rosado o naranja. La coloracin del ncleo por hemalum no requiere la presencia de ADN (acido nucleico)y probablemente es debida a la unin del complejo colorante-metal a nucleoproteinas bsicas ricas en arginina, como las histonas Las tinciones con colorantes bsicos o cationicos como el azul de toluidina requieren la presencia de cidos nucleicos. La extraccin qumica o enzimtica de los cidos nucleicos no permite la tincin con colorantes bsicos Las estructuras no tienen que ser acidicos o bsicos para ser llamados basofilicos o acidofilicos. La terminologa es basada en la afinidad a los colorantes.

Tricromica de Masson: Uso Frecuente para Tejido Conjuntivo. Permite diferenciar colgeno de otras fibras (msculo liso y elastina). Ncleos: negro, Citoplasma: rosado/rojo Fibras colgenas y cartlago: azul/verde Fibras musculares: rojo Coloracin de Plata: Especifica para fibras reticulares y nerviosas Periodic acid-Schiff (PAS) Membrana Basal, localiza carbohidratos Nucleo: azul Fibras colagenas: rosado Van Gieson: Fibras colgenas: rosado a rojo, musculo: amarillo 8. Cobertura Una vez colorada la seccin debe ser cubierta con una cubierta plstica o de vidrio delgada Automatizacin

En laboratorios con grandes volmenes de muestras los procesos son automatizados Un instrumento mueve los tejidos alrededor de las sustancias con una duracin determinada. El procesador de tejido "technicon" es uno de los mas comunes (esta discontinuado). Los procesadores mas modernos son computarizados.

Procesadores de Tejido 1. Procesador de Tejido 2. Procesador de Tejido Automatizado Otras Tcnicas Histolgicas Histoqumica: se refiere al uso de reacciones qumicas entre qumicos de laboratorio y componentes dentro del tejido. Historadiografia: Las muestras son examinadas mediante tcnicas radioactivas. Con frecuencia, son tratadas histoquimicamente y radiografiadas. Tcnicas Histolgicas Especiales: Inmunohistoquimica Tcnica que se usa para identificar molculas especficas en diferentes tejidos. El tejido se trata con anticuerpos que se unen con la molcula especfica (protenas, carbohidratos y lpidos) Estos se pueden ver bajo un microscopio cuando se utiliza una reaccin colorante, un radioistopo, oro coloidal o un colorante fluorescente. Si el colorante es una molcula fluorescente se denomina inmunofluorescencia. Se usa para ayudar a diagnosticar enfermedades como el cncer y para detectar la presencia de microorganismos. Tambin se usa en la investigacin bsica para entender el crecimiento y diferencin clular