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Genetische Spurensuche in Rumnien

Untersuchung und genetische Charakterisierung humaner Populationen aus Rumnien und Sibirien mit drei polymorphen autosomalen DNS-Markern

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereichs Biologie der Universitt Hamburg

vorgelegt von Susanne Mller-Scholtz aus Hamburg

Hamburg 2003

INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung 1.1 Kurze bersicht ber Struktur und Aufbau menschlicher DNS ............................. 1 1.2 Repetitive Sequenzen im menschlichen Genom .................................................... 4 1.3 Lngenvernderung repetitiver Elemente ............................................................... 5 1.4 Mutationsraten ...................................................................................................... 7 1.5 Mikrosatelliten (Short-tandem Repeats) ................................................................ 8 1.6 Minisatelliten (Variable-Number-of-Tandem Repeats) .......................................... 9 1.7 Einsatz von Mikro- und Minisatelliten-Markern .................................................... 10 1.8 Die verwendeten autosomalen Marker .................................................................. 10 1.9 Populationsgenetik ................................................................................................ 19 1.10 Kurze bersicht zur jngeren Geschichte des modernen Menschen in Europa .......................................................................... 22 1.11 Die Rumnen....................................................................................................... 25 1.12 Die Jakuten (Sakha)............................................................................................. 40 1.13 Zielsetzung der Arbeit ......................................................................................... 42 2. Material und Methoden 2.1 Verwendetes Probenmaterial ................................................................................ 44 2.2 Molekulargenetische Methoden ............................................................................ 45 2.3 Populationsgenetische Methoden .......................................................................... 58 3. Ergebnisse 3.1 Vergleich der beiden rumnischen Populationsstichproben .................................... 76 3.2 Vergleich der jakutischen mit der (gepoolten) rumnischen Populationsstichprobe............................................................................................ 83 3.3 Genetischer Abstand der rumnischen Populationsstichprobe von anderen europischen Populationen und den Jakuten....................................... 93 3.4 Paarweiser Populationsvergleich mit SPSS ........................................................... 103 3.5 Paarweiser Populationsvergleich mit dem Mantel-Test ......................................... 106 3.6 Vergleich der Distanzmatrices mit dem Mantel-Test............................................. 106 3.7 Abschtzung der Divergenzzeit von Rumnen und Jakuten................................... 108 4. Diskussion 4.1 Populationsdifferenzierung ................................................................................... 109 4.2 Abschtzung der Divergenzzeit ............................................................................. 116

4.3 Der Stichprobenumfang ........................................................................................ 118 4.4 Genetische Distanzen ............................................................................................ 118 4.5 Die eingesetzten Marker ....................................................................................... 120 4.6 Vergleich der Rumnen mit europischen Populationen: Exakte Tests .................. 122 4.7 Vergleich der Rumnen mit europischen Populationen: Mantel-Tests ................. 123 4.8 Vergleich der Rumnen mit europischen Populationen: Abstandsanalysen .......... 123 4.9 Ausblick ............................................................................................................... 127 5. Zusammenfassung ............................................................................................................ 129 6. Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 133 7. Anhang ............................................................................................................................ 145

DANKSAGUNG An dieser Stelle mchte ich mich bei allen Menschen ganz herzlich bedanken, die mir im Verlauf dieser Arbeit zur Seite gestanden und diese Arbeit ermglicht haben. Dies waren Herr Prof. Alexander Rodewald, der fr Bereitstellung des Laborplatzes und des Themas sorgte, die Kontakte nach Rumnien herstellte und die Arbeit im Ganzen immer freundlich und mit viel Geduld betreute. Herr Prof. V. Chopra, der die Dissertation sorgfltig begutachtete. Frau Dr. Cristina Glavce, die mir die Proben aus Ploiesti zur Verfgung stellte sowie Frau Dr. Dorina Banica, die Blutproben aus Bukarest organisierte. Frau Dr. Brigitte Pakendorf stellte mir Proben der Jakuten (Sakha) zur Verfgung und ich bin ihr fr konstruktive Diskussionen dankbar. Frau Angelika Kroll und Frau Juliette Kober standen mir im Labor mit Rat und Tat zur Seite. Herr Hermann Mller, der die Analysen mit SPSS sowie die aufwndige Vorbereitung der Daten bewltigte. Frau Dr. Augustin von Institut fr Rechtsmedizin in Hamburg stellte mir eine Allelleiter fr den Marker HumVWA31A zur Verfgung. Auerdem hatte sie fr technische Fragen zur PCR und Gelelektrophorese immer ein offenes Ohr. Herr Professor B. Brinkmann der Universitt Mnster schickte mir sehr unkompliziert und schnell eine Allelleiter fr den ApoB 3 Minisatelliten. Ganz besonders bedanke ich mich bei meiner groen Familie fr ihre lange Geduld und die Untersttzung in allen Phasen der Arbeit. Insbesondere bei meiner Mutter, ohne die diese Arbeit niemals fertig geworden wre, bei Gerda Mller-Scholtz fr die unermdliche Betreuung meiner Kinder, bei Tilman und Henriette, fr die bestimmte Phasen sicher nicht leicht zu bewltigen waren und zum Schluss gilt mein Dank Jrg, der mich in allen Hhen und Tiefen dieser Arbeit immer untersttzt hat!

Verwendete Abkrzungen Apo-B bp bzw. C dH2O DNS/ DNA dNTP EDTA EtOH g h kb(p) Mb(p) min ml mm mM mRNA NaCl ng nm PCR pM rpm s SDS sog. TE TEMED l M U vWA vWD w/v Apolipoprotein B Basenpaare beziehungsweise Celsius destilliertes Wasser Desoxyribonukleinsure bzw. acid Desoxyribonukleinsure-Triphosphat Ethylendiaminotetraessigsure Ethanol Erdbeschleunigung 9,81 m/s Stunden Kilobasen(paare) (1.000 Basenpaare) Megabasen(paare) (1.000.000 Basenpaare) Minuten Milliliter Millimeter Millimol messenger (Boten) Ribonukleinsure bzw. -acid Natriumchlorid, Kochsalz Nanogramm Nanometer polymerase chain reaction, Polymerase Ketten Reaktion Pikomol rounds per minute, Umdrehungen pro Minute Sekunden Natrium- (Sodium) Dodecylsulfat sogenannte(r) Tris-EDTA N-,N-,N-,N-Tetramethylethylendiamin Mikroliter Mikromol (Units) Einheiten Von Willebrand Faktor Von Willebrand disease (Krankheit) weight per volume (Volumenprozent)

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1. Einleitung

1. EINLEITUNG 1.1 Kurze bersicht ber Struktur und Aufbau menschlicher DNS

Wirft man einen Blick auf das im Rahmen des weltweiten Human Genome Sequencing Project kartierte und zu mehr als 95 Prozent sequenzierte menschliche Genom, ist man zunchst beeindruckt durch die reine Gre von 3,2 Gigabasen (International Human Genome Sequencing Consortium 2001) oder ausgeschrieben 3.200.000.000 Basenpaaren fr das haploide Genom. Eine andere Gruppe gibt eine Gre von 2,91 Gigabasen an (Venter et al. 2001). Im Vergleich mit Organismen niedrigerer Entwicklungsstufen scheint der Umfang der menschlichen Erbsubstanz ein Grund fr die hhere Komplexitt zu sein. Bei einer vergleichenden Betrachtung der reinen Genzahl jedoch, verringert sich bereits der vorher augenscheinlich groe Abstand: Die Anzahl der Gene der Fruchtfliege erreicht 50 Prozent der Anzahl des Menschen, das Genom der Fruchtfliege macht aber nur 5 Prozent der Gre des menschlichen Genoms aus (siehe Tabelle 1.1). Anders ausgedrckt enthlt die Erbsubstanz des Homo sapiens einen erheblich greren Anteil an nicht (Eiwei-) kodierenden Bereichen, wie Introns, Spacer, regulierende Sequenzen sowie sonstige, nicht translatierte Sequenzen. Die Zahl der Protein-kodierenden Sequenzen, also der Gene, wird momentan mit ungefhr 40.000 angegeben (Venter et al. 2001), diese Zahl aber ist Gegenstand sehr heftig und kontrovers gefhrter Diskussionen und variiert je nach Autor zwischen 28.000 und 80.000 (Roest Crollius et al. 2000, Antequera & Bird 1994). Die Genzahl reprsentiert einen Anteil von nur 3 Prozent der gesamten humanen DNS (Makalowski 2001).
Tabelle 1.1: Vergleichende bersicht des Genomaufbaus (Venter et al. 2001, *Knippers 1985) (Haploides Genom) Genomgre in Mega Bp Anzahl der Gene Anzahl der Chromosomen Anteil Exons am Genom Anteil Introns am Genom Restl. sog. intergenische DNS Anteil repetitiver Sequenzen mittlere Gengre ca. 35 % 27 kbp Mensch (Homo sapiens) 3200 ca. 40.000 (70.000*) 23 ca. 1,1 % ca. 24 % ca. 75 % Fruchtfliege (Drosophila elegans) 165 ca. 20.000 4 Bckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) 17 ca. 6.200 16

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1. Einleitung

In bezug auf populationsgenetische und phylogenetische Untersuchungen werden drei Unterarten der menschlichen Erbsubstanz unterschieden, autosomale DNS, y-chromosomale und mitochondriale DNS. Der Grund hierfr liegt in den Charakteristika der jeweiligen Nukleinsureart, wie beispielsweise der verschiedenartige Vererbungsmodus, unterschiedliche Mutationsraten sowie das (Nicht-) Vorkommen von Rekombinationsereignissen (siehe Tabelle 1.2). In phylogenetischer Hinsicht trgt jede der drei DNS-Arten einen andersartigen Teil zum Puzzle der menschlichen Entwicklung bei. Mitochondriale DNS-Marker geben Aufschluss ber evolutionre Prozesse, die einen weiblichen Populationsteil betreffen, y-chromosomale Marker dagegen fr mnnliche Populationsvertreter. 1.1.1 Y-chromosomale DNS Das menschliche Y-Chromosom ist relativ klein, es hat eine Gre von 60 Millionen Basenpaaren, nur Chromosom 22 ist kleiner. Ein Anteil von etwa 2,5 Millionen Basenpaaren an den Spitzen der p- und q-Arme, die sog. pseudoautosomalen Regionen, rekombinieren mit X-chromosomalen Elementen. Diese Bereiche enthalten 9 Gene und werden wie autosomale Gene vererbt. Insgesamt umfasst das menschliche Y-Chromosom 161 Gene, z.B. das Amelogenin Gen (Lokalisation Yp11.2). Als Marker sind bislang Mikrosatelliten (z.B. DYS19, DYS385 die meisten sind Tetranukleotid-Marker), bi-allelische Marker (single-nucleotide-polymorphisms, SNPs), Y Alu-Polymorphismen (YAP) oder andere Insertions-/Deletionsvariationen (indels) sowie ein Minisatellit MSY1 (DYF155S1) bekannt geworden. Inzwischen wurden zahlreiche Studien mit y-chromosomalen Markern durchgefhrt, um Populationsbewegungen und Ursprnge nachzuweisen. Die ber die Marker gewonnenen YHaplotypen zeigen eine deutliche geografische Gliederung (Ruiz Linares et al. 1996), whrend Analysen von mitochondrialen Markern, insbesondere in Europa, einen deutlich geringeren Grad an genetischer Substrukturierung erkennen lassen (Seielstadt et al. 1998, Quintana-Murci et al. 1999). Die Grnde dafr knnten in geschlechtsspezifisch unterschiedlichem Wanderungsverhalten (Seielstad et al. 1998) liegen sowie in der unterschiedlichen Mutationsrate ychromosomaler und mitochondrialer DNS. 1.1.2 Mitochondriale DNS Die mitochondriale DNS der Sugetiere zeigt eine ringfrmige Struktur sowie einen sehr kompakten Aufbau ohne Introns, mit berlappenden Genen und fast ohne berflssige Basen. Die 2

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1. Einleitung

meisten Gene folgen direkt aufeinander, d.h. ohne dazwischen liegende Basen. Nicht translatierte Regionen, die den bei der Kern-DNS fr fast jedes Gen vorhandenen 5- bzw. 3-untranslatierten Sequenzen entsprechen wrden, kommen nicht vor. Das mitochondriale Genom kodiert fr 22 tRNS- und 2 rRNS- Molekle sowie 13 Proteine (Lewin 1988, Alberts et al. 1986, Anderson et al. 1981). Die sog. D-Schleife (D-loop) dient der Initiation der DNS-Replikation. Das mitochondriale Genom wird bei den Sugern maternal, d.h. nicht den Mendelschen Regeln folgend, vererbt. Der Grund dafr liegt in der zytoplasmatischen Lokalisation der Mitochondrien: Die Vererbung erfolgt getrennt von der Kern-DNS und in der Weise, dass bei der Verschmelzung von Ei- und Samenzelle lediglich die Eizelle ihr Zytoplasma an den Nachkommen weitergibt. Die Samenzelle steuert kein Zytoplasma, also auch kein (vterliches) Mitochondrium inklusive Erbsubstanz bei. Zur Klrung phylogenetischer Prozesse betreffend den weiblichen Populationsanteil, werden mitochondriale Marker eingesetzt. Dies sind RestriktionsFragment-Lngen Polymorphismen (RFLPs), Sequenzen der D-loop Region, Sequenzen der hypervariablen Regionen I und II sowie auch die Sequenz des gesamten Genoms.
Tabelle 1.2: Vergleich der drei DNS-Arten des Menschen

Gre Anzahl Kopien

16.500 Basenpaare, das entspricht 0,0005 % der autosomalen DNS Hohe Kopienzahl: 500 bis 1000 Kopien/Zelle Mtterliche Vererbung

Mitochondriale DNS

60 Millionen Basenpaare 1 Kopie pro Zelle Vterliche Vererbung nein 0,2 % (Heyer et al. 1997) 2 x 10 bis 2 x 10 (Weber & Wong 1993)
-4 -3

Y-chromosomale DNS

3000 Megabasenpaare 2 Kopien pro Zelle Zufllige Vererbung von beiden Eltern ja sehr variabel funktionelle Gene: 10-5 bis 10-6 pro Gen/Jahr repetitive Marker: siehe Tabelle 1.3! 85,6 % 8,8 %

Autosomale DNS

Rekombination Mutationsrate

nein 5,7 x 10-8 Substitutionen pro Jahr

Genetische Variation innerhalb von Populationen* zwischen Kontinenten* * Seielstad et al. (1998)

81,4 % 12,5 %

Hohe Mutationsraten fr Mikrosatelliten 35,5 % 52,7 %

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1. Einleitung

1.2 Repetitive Sequenzen im menschlichen Genom Die ersten multiallelischen und damit polymorphen Loci der menschlichen Erbsubstanz wurden von Wyman und White beschrieben (Wyman & White 1980). Heute existieren mehrere Datenbanken, die vielfltige Informationen ber polymorphe Sequenzelemente enthalten und ber das Internet zugnglich sind. Tabelle 1.3 gibt einen berblick. Beispielsweise enthlt die Datenbank des Centre d' Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) momentan die Genotypen von 14.404 genetischen Markern, darunter mehr als 9900 Mikrosatelliten.
Tabelle 1.3: Datenbanken im Internet zu (repetitiven) Markern des Menschen
The Genome Database Y-STR Haplotype Reference Database Microsatellite database http://nmnhgoph.si.edu/gophermenus/MicrosatelliteDatabase.html http://www.ceph.fr/cephdb

(Datenbank

http://gdbwww.gdb.org/ http://ystr.charite.de/

URL

CEPH database Version 9.0 vom September 2000 SNP database http://wwwgenome.wi.mit.edu/snp/human/

Johns Hopkins University in Baltimore, Maryland, USA Sascha Willuweit, Lutz Roewer Institute of Legal Medicine, HumboldtUniversitt Berlin Smithsonian National Institute of Natural History (USA) Centre dEtude des Polymorphismes Humaines (Frankreich) Whitehead Institute/MIT Centre for Genome Research/Cambridge, Massachusetts, USA

Autor/Betreiber/Institution

Repetitive Elemente scheinen ein Charakteristikum der Eukaryoten zu sein. Ihr wesentliches Merkmal sind die zahlreich aufeinander folgenden, gleichartigen Oligonukleotid-Wiederholungseinheiten. Repetitive Bereiche umfassen hoch-, mittel- und niedrig-repetitive Sequenzen, je nach Anzahl der Wiederholungen einer Sequenzeinheit. Dabei ist Sequenzgleichheit der Wiederholungselemente nicht zwingend. In bezug auf die Lnge ihrer Wiederholungseinheiten werden Mini- und Mikrosatelliten unterschieden. Mikrosatelliten weisen kurze, etwa 1 - 5 Basenpaare lange Wiederholungseinheiten auf, Minisatelliten dagegen lngere (6 - 24 Basenpaare umfassende) Repeats. Es gibt Mini- und Mikrosatelliten, deren Konsensussequenz stark verndert ist und zwar sowohl in der Lnge als auch hinsichtlich der Sequenz: Man findet verkrzte, verlngerte oder durch Basenaustausche strukturell vernderte Wiederholungseinheiten. Das kann insgesamt zu einer sehr komplexen, hoch polymorphen Struktur fhren. Die bislang erfassten Mutationsraten fr repetitive Elemente zeigen auerordentlich hohe Werte, die ber denen aller anderen Genombereiche liegen.

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1. Einleitung

1.3 Lngenvernderung repetitiver Elemente Im Prinzip sind bei Minisatelliten und Mikrosatelliten die gleichen Modelle zu Grunde zu legen, die als Erklrung fr die Lngenvariation dienen. Bei Minisatelliten kommen jedoch hufiger auch Punktmutationen vor, die zu feinen Unterschieden der Konsensussequenz der Wiederholungseinheit fhren. Kimura & Crow (1964) fhrten ein Modell ein, das ursprnglich fr die Entstehung von Allozymen (Proteinvarianten) gedacht war, heute aber auch fr Mini- und Mikrosatelliten eingesetzt wird: Danach entsteht durch jedes Mutationsereignis ein neues Allel, das in der Population noch nicht vorhanden ist. Das neu entstandene Allel enthlt keine Information ber sein Vorgngerallel. Ohta und Kimura (1973) beschrieben in diesem Zusammenhang das stepwise mutation Modell (SMM), nach dem die Mutationsereignisse die Allelgre um jeweils einzelne (Wiederholungs-) Einheiten erhhen oder erniedrigen. Damit enthalten die mutierten Allele Informationen ber ihr Vorgngerallel, aus dem sie entstanden sind. Brinkmann et al. (1998) beschrieben, dass es sich bei ber 90 % der Mutationen repetitiver Elemente um single-step Mutationsschritte handelt. Dagegen fanden sie sehr selten Verlngerungen bzw. Verkrzungen um mehr als zwei Einheiten, auch multi-step Mutationen genannt. Als Erweiterung des SMM postulierten Di Rienzo et al. (1994) das sogenannte Two-phaseModel, das sie fr Dinukleotid-Repeats entwickelten: Die Mehrheit der Allele entsteht durch Addition oder Subtraktion einer einzelnen Wiederholungseinheit. Einige wenige aber auch durch Einfgen bzw. Deletieren mehrerer Wiederholungseinheiten gleichzeitig. Mini- sowie Mikrosatelliten mutieren eher in Richtung lngerer Allele (Jeffreys et al. 1994, Monckton et al. 1994), wobei die Gesamtlnge der repetitiven Sequenzelemente offenbar einer Grenrestriktion unterliegt. Denn man findet uerst selten Repeatmarker mit mehr als 60 Wiederholungseinheiten. Es existiert offensichtlich ein zellulrer Mechanismus, der die unendliche Verlngerung von Mini- oder Mikrosatelliten verhindert. Es wird vermutet, dass sehr lange Repeatbereiche eine gewisse chromosomale Instabilitt aufweisen. Eine Ausnahme stellt eine Gruppe von Mikrosatelliten dar, die fr viele Gruppen zum Forschungsschwerpunkt geworden ist: Es sind krankheits-assoziierte Mikrosatelliten. Als Beispiel sei der Mikrosatellit (CGG-Repeat) im 5 nicht kodierenden Bereich des FMR1-Gens beim 5

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1. Einleitung

Fragilen X Syndrom genannt: Hier kommt es von einer Generation zur Nchsten zu einer sprunghaften Vermehrung der Repeat-Einheit von einigen (zwischen 6 und 53 beim Gesunden) Wiederholungseinheiten zu mehreren hundert (Knzler et al. 1995). Offenbar gibt es einen Mechanismus, der jenseits einer bestimmten Schwellenanzahl die weitere, scheinbar endlose Repeat-Vervielfachung nicht mehr zu hemmen vermag. Jeffreys et al. (1994) wiesen fr Mikrosatelliten einen Mechanismus nach, den sie complex gene-conversion like event nannten und der an der Generierung sehr umfangreicher Repeatverlngerungen beteiligt ist. Zur Entstehung der Lngenpolymorphismen findet man in der Literatur die folgenden mechanistischen Modelle: 1.3.1 Slipped strand mispairing Durch eine nicht korrekte Paarung der beiden DNS-Strnge im Bereich des Mini- bzw. Mikrosatelliten werden geringgradige Duplikationen der Wiederholungseinheit whrend der Replikation oder Reparatur der DNS verursacht. Der Grund ist eine im Repeatbereich offensichtlich ungenau arbeitende DNS-Polymerase. Das Verrutschen der Polymerase induziert eine Schleife in einem der DNS-Strnge und im Rahmen der nun folgenden Reparatur (entweder Exzision auf dem einen Strang oder Insertion in dem anderen Strang) erscheinen zustzliche oder deletierte Wiederholungseinheiten (Levinson & Gutman 1987). Diskutiert wird die Mglichkeit, dass bei CAG- und CGG-Tripletts eine thermodynamisch stabile Schleifenkonformation des dissoziierten DNS-Stranges in Form von Cruciform-Strukturen diesen Mechanismus begnstigt (Knzler et al. 1995). 1.3.2 Ungleicher Schwesterchromatid-Austausch (Unequal crossing over) Dieser Mechanismus verursacht dagegen erhebliche Verlngerungen (Vervielfachungen) der Wiederholungseinheit von Mikro- und Minisatelliten durch die nicht korrekte Paarung der Schwesterchromatiden whrend des Crossing-over, verbunden mit einem Bruch des einen DNSStranges und falscher bzw. verschobener Wiederanlagerung und nachfolgender Reparatur durch Auffllen. Dadurch erfhrt der eine DNS-Strang eine Deletion, der andere hingegen eine Expansion um viele Wiederholungseinheiten (Levinson & Gutman 1987).

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1. Einleitung

1.4 Mutationsraten Im Vergleich der Repeat-Marker untereinander sind die Mutationsraten von DinukleotidRepeats am hchsten, nmlich um das 1,48-2,16-fache hher, als die von TetranunkleotidRepeats. Die Mutationsraten von nicht Krankheits-gebundenen Trinunkleotid-Markern liegen um das 1,22-1,97-fache hher als die von Tetranukleotid-Mikrosatelliten. Auffallend sind die Krankheitsassoziierten Trinukleotid-Repeats mit einer 3,86 6,89-fach hheren Mutationsrate als die von Tetranukleotid-Repeats (Chakraborty et al. 1997). Die Ermittlung von Mutationsraten kann in unterschiedlicher Weise erfolgen. So untersuchten Weber und Wong (1993) Mutationsereignisse in Zelllinien von CEPH-Familien (in Di-, Tri- und Tetranukleotid-Mikrosatelliten): Sie beobachteten eine durchschnittliche Mutationsrate von 1,2 x 10-3. Brinkmann et al. (1998) erhielten Mutationsraten fr Penta- und Tetranukleotid-Mikrosatelliten im Rahmen einer Analyse von mehr als 11.000 Meiosen (Vater-Kind-Transmissionen) (siehe Tabelle 1.4). Sajantila et al. (1999) erhielten Mutationsraten durch direkte Untersuchung von Blutproben in Vater-Kind Paaren, d.h. sie wiesen Keimzellmutationen nach.
Tabelle 1.4: Mutationsraten von repetitiven Markern Marker Apo B 3` Minisatellit HumVWA31A Mikrosatellit D1S80 Minisatellit HumVWA31A Mikrosatellit Dinukleotid-Mikrosatelliten Di-, Tri und TetranukleotidMikrosatelliten Minisatelliten (Blutzellen) Minisatelliten (Keimzellen) Mutationsrate (95 % Konfidenzintervall) 0,5 x 10-3 (0,2-0,6) 1,4 x 10
-3

Autor(en) Sajantila et al. (1999) Sajantila et al. (1999) Sajantila et al. (1999) Brinkmann et al. (1998) Weber & Wong (1993) Weber & Wong (1993) Jeffreys et al. (1994) Jeffreys et al. (1994)

(0,1-2,5 )

0,5 x 10-3 (0,0-1,0) 0,199 % (von 2013 Meiosen) 5,6 x 10-4 1,2 x 10
-3

0,06 % pro hapl. Genom 0,13 0,88 %

Die groen Unterschiede in den Mutationsraten auch fr Mikrosatelliten mit gleicher Repeatlnge lassen sich bislang noch nicht erklren. Vielleicht hngen sie mit der unterschiedlichen Effizienz des Repair-Mechanismus an verschiedenen Genorten zusammen. In Krebszellen ist eine Strung des Mismatch-Reparatursystems bekannt. Hier treten Mutationen sehr viel hufiger auf, als in anderen Krperzellen (Knzler et al. 1995). 7

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1. Einleitung

1.5 Mikrosatelliten oder Short-tandem Repeats (STR) 1.5.1 Aufbau Mikrosatelliten besitzen kurze, einfache Wiederholungseinheiten mit einer Lnge zwischen 1 und 4 bis 6 Basenpaaren (Litt & Luty 1989). Die Wiederholungseinheiten sind berwiegend alternierend aus Purinen und Pyrimidinen aufgebaut. Die Gesamtlnge der Mikrosatelliten betrgt meist nicht mehr als 100 bis 200 Basenpaare. Nach Weber (1990) werden einfache und zusammengesetzte Mikrosatelliten unterschieden. Einfache Mikrosatelliten enthalten nur einen Typ von Wiederholungseinheiten, bei zusammengesetzten findet man mehr als zwei Typen, die sich in ihrer Sequenz unterscheiden. 1.5.2 Funktion ber die Funktion von Mikrosatelliten ist bislang wenig bekannt. Es wird eine Mitwirkung an der Genregulation vermutet. Hierbei spielt offensichtlich der Aufbau (alternierende Purine und Pyrimidine) der berwiegenden Zahl der Mikrosatelliten eine Rolle: Diese Struktur erlaubt die Bildung von Z-Konformationen der DNS (Brown & Rich 2001), die regulatorische Aktivitt haben soll. 1.5.3 Lokalisation Dinukleotid-Mikrosatelliten, insbesondere CA/TG-Mikrosatelliten, sind im menschlichen Genom sehr hufig anzutreffen, sie machen insgesamt mehr als 0,5 % des gesamten Genoms aus. Tri- und Tetranukleotid-Mikrosatelliten sind dagegen viel seltener vertreten. Sie sind ber das gesamte Genom verteilt, meist auerhalb kodierender Sequenzbereiche: Zum Beispiel der bei einer Form der Muskeldystrophie vorkommende CAG-Mikrosatellit in der 3-nicht-translatierten Region des Myotonin Protein-Kinase-Gens. Einige Trinukleotid-Repeats kodieren Polyaminosuren, wie Glutamin (CAG)n und Poly-Prolin (CCG)n und sind im Bereich von Transkriptionsfaktoren zu finden, wo sie die Transkriptionsaktivitt beeinflussen (Knzler et al. 1995). Ein Beispiel ist ein Poly-Glutamin kodierender Bereich, der 21 Glutaminreste umfasst, im Transkriptionsfaktor des menschlichen Androgenrezeptors (Knzler et al. 1995) oder der Genabschnitt, der fr das Krankheitsbild der Chorea Huntington verantwortlich ist: Hier kon8

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1. Einleitung

trolliert ebenfalls ein Poly-Glutaminbereich die Aktivitt des Transkriptionsfaktors (The Huntingtons Disease Collaborative Research Group 1993). Im Zusammenhang mit psychischen Krankheiten, wie der Schizophrenie, wird ebenfalls eine pathologisch wirkende CAG-Repeatvermehrung diskutiert (O' Donovan et al. 1995). 1.5.4 Anwendung Aufgrund der gleichmigen Verteilung von CA/TG-Repeats im Genom, wurde mit deren Hilfe eine menschliche Genkarte erstellt. Mikrosatelliten werden aufgrund ihrer kurzen Gesamtlnge hufiger als Minisatelliten bei der Analyse von DNS-Bruchstcken benutzt. Degradierte DNS findet man hufig in forensischen Proben und alter, aus Knochen archologischer Fundstcke isolierter DNS, sogenannter ancient DNA. Fr DNS-Fingerprints, also der Individuen-Identifizierung auf DNS-Basis, sowie den Vaterschaftsnachweis werden Kombinationen von sechs bis fnfzehn Mikrosatelliten eingesetzt. 1.6 Minisatelliten (Variable-Number-of-Tandem Repeats, VNTR) 1.6.1 Aufbau Minisatelliten (Jeffreys et al. 1985, Nakamura et al. 1987) stellen repetitive Elemente mit erheblich lngeren Wiederholungseinheiten dar, je nach Autor zwischen 5 bis 9 und 24 Basenpaaren. Ihre Gesamtlnge variiert zwischen 0,1 und 20 Kilobasen. Minisatelliten sind wesentlich komplexer aufgebaut als Mikrosatelliten: Hufig kommen durch Deletionen verkrzte oder durch Punktmutationen vernderte Wiederholungseinheiten vor. 1.6.2 Funktion ber die Funktion von Minisatelliten ist bislang wenig bekannt. Es wird eine Mitwirkung als Rekombinationssignal bei der Entstehung hypervariabler Bereiche postuliert (Jeffreys et al. 1985) 1.6.3 Lokalisation Minisatelliten werden nicht transkribiert. Sie sind nicht gleichmig ber das gesamte Genom 9

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verteilt, sondern finden sich bevorzugt in der Nhe der Zentromer- und Telomerregionen (Craig 1994). 1.7 Einsatz von Mikro- und Minisatelliten-Markern

Die praktische Anwendung der Analyse von repetitiven Elementen umfasst Fragestellungen innerhalb der genetischen Grundlagenforschung (Erstellung einer Genkarte der menschlichen Erbsubstanz), der Anthropologie und der Evolutionsforschung (z.B. Klrung von Verwandtschaftsbeziehungen menschlicher Populationen, Rekonstruktion von Phylogenien) ebenso wie die Identifizierung von Individuen im Bereich der forensischen Medizin (z.B. DNS-Fingerprinting, Vaterschaftstests, Klrung von Tter-Opfer Beziehungen) sowie medizinische Aspekte (z.B. Knochenmark-Transplantationsmonitoring, Identifizierung von Trgern genetischer Krankheiten). Durch ihre relativ hohen Heterozygotenraten, eine breite genetische Diversitt und extrem hohe Mutationsrate, sind Mikro- und Minisatelliten-Marker fr populationsgenetische Studien gut geeignet. Neben repetitiven Markern kommen heute mitochondriale und ychromosomale Marker sowie sehr hufig SNP (single nucleotide polymorphisms)-Marker zum Einsatz. 1.8 Die verwendeten autosomalen Marker 1.8.1 Der ApoB 3 Minisatellit

1.8.1.1 Apolipoprotein B Das Apolipoprotein B gehrt zur Klasse der Apoproteine, dem zusammen mit Lipiden im Krper die wichtige Rolle im Rahmen der Cholesterin- und Lipidversorgung und -verteilung zukommt. Dazu bilden die verschiedenen Apoproteine mit den Lipiden sogenannte Lipoproteinstrukturen, die man aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte, entsprechend ihres Lipidgehalts, in vier Gruppen einteilt: Chylomikronen, VLDL (very low density lipoproteins), LDL (low density lipoproteins) und HDL (high density lipoproteins). Die Chylomikronen weisen dabei die niedrigste Dichte auf; sie bestehen zu 85 - 90 % aus Triglyzeriden und enthalten nur ca. 1 % Apoprotein. Die VLDL Partikel enthalten zu 50 % Triglyzeride und der Proteingehalt beluft sich auf 8-10 %, whrend bei der nchst kleineren Lipoproteinklasse, den LDL der Proteingehalt schon bei 20 %, der Triglyzeridanteil bei nur noch 10 % und der Cholesterinanteil ca. 45 % 10

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ausmacht. Die Hauptapoproteinkomponente der LDL stellt das Apolipoprotein B dar. Im Gegensatz dazu berwiegt bei den HDL das Apolipoprotein A (Triglyzeridgehalt 2 5 %, Proteingehalt 50 %) (Brown & Goldstein 1991). Der strukturelle Aufbau der Apolipoproteine - kugelfrmige Struktur bei der die hydrophilen Enden zur Auenseite, die lipophilen Enden nach innen gerichtet sind - ist eng mit ihrer Funktion des Lipidtransports in ihrem Inneren in wssrigen Medien verknpft. Die mittels Nahrungsaufnahme und Verdauung in der Darmmukosa anfallenden Fettsuren und Cholesterine knnen nach Ankoppelung an die Apolipoproteine ber die Blutbahn in die Leber, Muskeln und Fettgewebe sowie andere periphere Organe transportiert werden, um dort zum Aufbau von energiereichen Substraten oder Strukturbestandteilen zu dienen. Sie stellen das Transportvehikel fr die verschiedenen Fette dar. Dabei erfolgt die "Entleerung" der Apolipoproteinstrukturen ber Rezeptorsysteme, fr die LDL/VLDL-Partikel zum Beispiel ber den LDL-Rezeptor. Der wichtigste Ligand des LDL-Rezeptors ist das Apolipoprotein B. 1.8.1.2 Struktur des Apolipoprotein B Gens Das Gen fr das humane Apolipoprotein B befindet sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 2 (2p23-24) (siehe Abbildung 1.1). Es hat eine Gesamtlnge von 43 Kilobasen und besteht aus 28 Introns sowie 29 Exons, von denen Exon 26 eine ungewhnliche Lnge von 7572 Basenpaaren aufweist. Das Apolipoprotein B besteht aus 4560 Aminosuren, inklusive eines 27 Aminosure langen Signalpeptids und hat ein Molekulargewicht von insgesamt 513 Kilo-Dalton (Huang & Breslow 1987).

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1. Einleitung

Abbildung 1.1: Physikalische Karte nach Giemsa-Frbung von Chromosom 2: Durch den Pfeil ist die ungefhre Position des ApoB 3 Minisatelliten angedeutet

Die in mehreren Laboratorien unabhngig voneinander durchgefhrten Sequenzierungen des gesamten Apolipoprotein B-Gens ergaben, dass viele Polymorphismen existieren: Innearity et al. (1990) berichten von 75 Nukleotidsequenz Unterschieden. Nicht alle fhren zur Vernderung der Aminosuresequenz. Bei der Mehrzahl handelt es sich um Restriktionsfragment-Lngen Polymorphismen (RFLP). Darber hinaus ist im Signalpeptid ein Insertions-/Deletions-Polymorphismus bekannt sowie eine hypervariable Region (Minisatellit) im 5' -Bereich und ein Minisatellit im 3' -Bereich (Innearity et al. 1990).

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1. Einleitung

Da man wei, dass erhhte Spiegel von Apolipoprotein B mit hohen Plasma-Cholesterinwerten einhergehen, die wiederum ein Risikofaktor fr kardiovaskulre Erkrankungen darstellen, haben viele Gruppen den Zusammenhang zwischen Polymorphismen/Mutationen des Apolipoprotein B Gens und pathologisch vernderten Plasmalipid- und -Cholesterinspiegeln untersucht. Die Ergebnisse sind widersprchlich. 1.1.8.3 Struktur des Apolipoprotein B 3 Minisatelliten Der in der vorliegenden Arbeit untersuchte Minisatellit befindet sich auerhalb des Translationsbereichs des Apolipoprotein B Gens. Er liegt 72 Basenpaare abwrts vom 2. Polyadenylierungssignal (Huang & Breslow 1987), ist auerordentlich AT-reich und besteht aus Tandemwiederholungen einer 30 Basenpaar langen Grundeinheit (siehe Abbildung 1.2). Diese gliedern sich strukturell in zwei 15 Basenpaar umfassende Untereinheiten. Man findet zwei Grundtypen von Wiederholungseinheiten x und y, deren Konsensussequenz Huang & Breslow (1987) mit [ATAATTAAATATTTT] fr die x-Wiederholungseinheit und [ATAATTAAAATATTT] fr die y- Wiederholungseinheit angeben. Die x- und y-Grundeinheiten kommen in verschiedenen Varianten vor: Zum Beispiel ist in der allgemein als x bezeichneten Variante das A an Position 7 durch ein C ersetzt, beziehungsweise in der Variante x an Position 8. y Varianten sind durch Ersatz eines A durch ein G an Position 10 (y) bzw. 12 (y) gekennzeichnet. Die Variante y weist eine Deletion an Position 3 bis 6 auf und ist dementsprechend nur 11 Basenpaare lang.
Tabelle 1.5: ApoB 3 Minisatellit Sequenz der Wiederholungseinheiten und Varianten (nach Ellsworth et al. 1995, Huang & Breslow 1987) Grundtyp Wiederholungseinheit Sequenz

_______________________________________________ x ATAATTAAATATTTT x x y y y y ATAATTCAATATTTT* ATAATTACATATTTT ATAATTAAAATATTT ATAATTAAAGTATTT ATAATTAAAATGTTT AT_ _ _ _AAAGTATTT**

* Unterstrichene Nukleotide stellen die Abweichung von der Grundsequenz dar ** _ bedeutet deletierte Nukleotide.

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1. Einleitung

Abbildung 1.2: Lokalisation und Struktur des ApoB3 Minisatelliten nach Huang & Breslow (1987)

Diese Wiederholungsgrundeinheiten und ihre Abwandlungen (x, x, y, y, y) bilden durch verschiedene Anordnungen und Anzahl die Minisatellitenvarianten. Ellsworth et al. (1995) untersuchten die Feinstruktur von 32 Minisatelliten Allelen und fanden heraus, dass Allele derselben Lnge nicht zwingend die gleiche Feinstruktur haben, d.h. am Beispiel des 37 Repeat Allels, dass fr 13 sequenzierte Allele 3 unterschiedliche Sequenzen vorlagen:
Tabelle 1.6: Struktur des 37 Repeat Allels des ApoB3 Minisatelliten nach Ellsworth et al. (1995).

37 Repeatallel Abfolge der Wiederholungseinheiten und ihrer Abwandlungen 37 R Typ 1 37 R Typ 2 37 R Typ 3 xyy (xy)5 (xy)2 (xy)5 xxy (xy)2 xx xyy (xy)6 (xy)2 (xy)4 xxy (xy)2 xx xyy (xy)7 xy (xy)4 xxy (xy)2 xx

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1. Einleitung

In bezug auf den ApoB 3 Minisatelliten fhrten Sequenzuntersuchungen zu der Kenntnis, dass eine spezielle Wiederholungseinheit xy am 5-Ende des Minisatelliten deutlich hufiger in ihrer Zahl verndert ist, als die anderen Wiederholungseinheiten, z.B. sind xy unverndert. Eine thermodynamische Untersuchung der dimeren Wiederholungseinheiten xy, xy, xy, xy und xy von Ellsworth et al. (1995) ergab, dass von diesen sogenannten selbst-paarende Schleifen Strukturen (self-annealing hairpins) ausgebildet werden knnen. Dabei scheint das xy-Tandemrepeat mit 9 Nukleotidpaarungen und 18 Wasserstoffbrckenbindungen die energetisch stabilste Struktur auszubilden. Alle anderen dimeren Wiederholungseinheiten weisen weniger Nukleotidpaarungen und somit weniger stabile Sekundrstrukturen auf. Diese Beobachtung erklrt aber nicht die zahlenmig hhere Variabilitt des xy-Tandems. 1.8.2 Der HumVWA31A Mikrosatellit 1.8.2.1 Von Willebrand Faktor Das Protein, genannt von Willebrand Faktor (vWF) nach seinem Entdecker Erik von Willebrand, ist ein groes, multimeres Glykoprotein, das sich im menschlichen Plasma findet. Es ist zusammengesetzt aus gleichen (Unter-)Einheiten von ungefhr 250 Kilo-Dalton Gewicht. Bis zu 100 dieser Einheiten knnen aggregiert sein. Der von Willebrand Faktor wird in Megakaryozyten und Endothelzellen der Blutgefe produziert und kann innerhalb dieser in speziellen Speicherorganellen, den Weibel-Paladekrpern aufbewahrt werden, bis er ins Plasma sezerniert wird. Der vWF ist ein verbindendes Element zwischen Plttchen und Endothelzellen mittels bestimmter Rezeptoren. Zum anderen fungiert vWF als Trger fr Faktor VIII im Plasma zu den Orten der Fibrin- und Plttchenaggregation (Nichols & Ginsburg 1997). 1.8.2.2 vWF-Gen Das Gen fr den von Willebrand-Faktor wurde von mehreren Gruppen kloniert, unter anderem von Lynch et al. (1985) und Sadler et al. (1985). Es wurde auf dem kurzen Arm von Chromosom 12 lokalisiert (12p12-pter) (Ginsburg et al. 1985). Es hat eine Lnge von 180 Kilobasen und besteht aus 52 Exons, wobei die Exongre zwischen 40 und 1.400 Basenpaaren variiert. Die mRNA, die eine Lnge von 8,5 bis 9 kbp aufweist, kodiert ein primres Translationsprodukt 15

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1. Einleitung

von 2813 Aminosuren: Dieses besteht aus einem Signalpeptid von 22 Aminosuren Lnge, einem Prpropeptid von 741 Aminosuren sowie der vWF-Untereinheit, die 2050 Aminosuren umfasst. Das Prpropeptid von 741 Aminosuren wird vor der Sezernierung des von Willebrand-Faktor ins Plasma abgespalten. Auf Chromosom 22 wurde ein Pseudogen entdeckt (22q11-q13), das die Exons 23 bis 34 des von Willebrand-Faktor Gens umfasst (Shelton-Inloes et al. 1987) und zu diesem eine Sequenzhomologie von ungefhr 97 Prozent hat. Diese relativ geringe Sequenzverschiedenheit deutet auf eine erst krzlich erfolgte Verdoppelung dieses Sequenzbereiches hin. Das Pseudogen wird nicht translatiert (Mancuso et al. 1991).

Abbildung 1.3: Physikalische Karte nach Giemsa-Frbung von Chromosom 12: Durch den Pfeil ist die ungefhre Position des HumVWA31A Mikrosatelliten angedeutet

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1. Einleitung

1.8.2.4 Polymorphismen im von Willebrand-Faktor Gen Bis 1993 waren im vWF Gen 33 DNS-Polymorphismen bekannt, die ber das gesamte Gen verteilt sind. Davon treten 16 Polymorphismen in Exons auf und etwa die Hlfte davon ndert die Aminosuresequenz. Viele Polymorphismen kommen nahe Mutationen vor, die vWD hervorrufen. Ein sehr informativer Polymorphismus ist der Tetranukleotid-Mikrosatellit im Intron 40, der aus drei Bereichen besteht (siehe Tabelle 1.7) und insgesamt ungefhr 600 Basenpaare lang ist. Die Wiederholungseinheit weist die (Konsensus-) Sequenz (TCTA) auf. Die drei Bereiche zeigen jeweils 6 bis 8 Allele.
Tabelle 1.7: Mikrosatelliten im Intron 40 des menschlichen von Willebrand Faktor-Gens Nukleotid Nr. 1640 bis ca. 1784 1880 bis 1982 2215 bis 2380 Anzahl Allele bislang 8 6 bis 8 bislang 6 Referenz Kimpton et al. (1992) Mancuso et al. (1989) Ploos van Amstel (1990)

Die Benennung der Allele ist in der Literatur leider nicht einheitlich. Einige Autoren benennen die Allele aufsteigend - angefangen bei 1 fr das krzeste Allel - mit Ziffern. Dies hat den Nachteil, dass spter entdeckte Allele mit Zustzen wie 1a oder auch mit 0 bezeichnet werden. Dieses ruft Unklarheiten zur Identitt der Allele hervor. Andere Autoren bevorzugen die Bezeichnung der Allele nach Anzahl der Wiederholungseinheiten des entsprechenden Allels, also zum Beispiel 16 fr ein Allel mit 16 Wiederholungseinheiten. Eine Vereinheitlichung der Nomenklatur ist auf jeden Fall notwendig, damit Klarheit hinsichtlich ihrer Vergleichbarkeit gewhrleistet ist. In dieser Arbeit wurde der von Kimpton et al. (1992) beschriebene Mikrosatellit im Bereich der Nukleotide 1640 bis 1750 des vWF-Gens, spter als HumVWA31A bezeichnet, amplifiziert (siehe Abbildung 1.3). Die in dieser Arbeit verwendete Nomenklatur folgt nicht der von Kimpton et al. (1992) gewhlten, sondern richtet sich nach Anzahl der Wiederholungseinheiten, wie oben beschrieben.

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1. Einleitung

Im HumVWA31A-Mikrosatelliten treten zwei Varianten von Wiederholungseinheiten auf: [TCTA] und [TCTG]. Die allgemeine Struktur aller Allele des Mikrosatelliten ist TCTA (TCTG)3-4 (TCTA)n mit Ausnahme des Allels 14*, welches eine ganz abweichende Struktur aufweist (Mller & Brinkmann (1995) (siehe Abbildung 1.4).

Abbildung 1.4: Struktur des HumVWA31A Mikrosatelliten nach Mller & Brinkmann (1995). Die Allele sind als Anzahl der Repeats wiedergegeben, die Fragmentlnge in Basenpaaren des jeweiligen PCR-Allels.

1.8.3 Der D1S80 Minisatellit (Budowle et al. 1991, Kasai et al. 1990 ) Der Lokus D1S80 liegt am distalen Ende des kurzen Arms von Chromosom 1 (1p36-35) (Pinheiro et al. 1996, Abbildung 1.5) und gehrt zu den sogenannten anonymen Markern des menschlichen Genoms, denen keine Gen- oder Transkriptionsfunktion zugeordnet ist. Kasai et al. (1990) sequenzierten den Lokus und beschrieben den Minisatelliten. Dieser ist ein in der Forensik sehr hufig verwendeter Marker. Er weist eine Wiederholungseinheit mit 16 Basenpaaren Lnge auf. Bislang wurden 29 verschiedene Allele entdeckt, die einer Anzahl von Wiederholungseinheiten zwischen 13 und 43 entsprechen. Dabei treten die Allele mit 18 und 24 Wiederholungseinheiten am hufigsten auf. Es existieren fr diesen Marker sogenannte Zwischenallele (Skowasch et al. 1992): Dabei handelt sich um Varianten, die nach ihrem Wanderungsverhalten 18

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1. Einleitung

im elektrischen Feld als anodische oder kathodische Varianten bezeichnet werden. Die Ursache fr das Auftreten dieser Varianten sind wahrscheinlich Sequenz- und/oder Grenunterschiede zu den "normalen" Allelen (Budowle et al. 1995). Die Konsensus-Sequenz der Repeat-Einheit wird wie folgt angegeben: GAGGA CCACC GGAAA G (Kasai et al. 1990).

Abbildung 1.5: Physikalische Karte nach Giemsa-Frbung von Chromosom 1: Durch den Pfeil ist die ungefhre Position des D1S80 Minisatelliten angedeutet

1.9 Populationsgenetik Die genetische Variabilitt einer Population kann ausgedrckt werden durch die Allelhufigkeiten ein oder mehrerer Loci. Das Ziel der Populationsgenetik ist die Beschreibung der Hufig19

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1. Einleitung

keiten von Allelen und Genotypen in einzelnen, gut charakterisierten Populationen. Sie beschftigt sich auerdem mit den Faktoren, die zu nderungen der Allelfrequenzen fhren und zwar sowohl in einer zeitlichen als auch einer rumlichen Dimension. Unter Population versteht man eine Gruppe von Individuen, die eine Fortpflanzungsgemeinschaft bilden. Diese haben einen gemeinsamen Genpool (Genbestand). Der Begriff der Mikroevolution umfasst die nderungen von Allelhufigkeiten in einer Population von einer Generation zur nchsten. Makroevolution dagegen stellt im zeitlichen Zusammenhang eine langfristige genetische Vernderung ber viele hundert oder tausend Generationen hinweg und beinhaltet insbesondere den Prozess der Artbildung. Die evolutionren Krfte, die Allelfrequenzen verndern (Page & Holmes 1998, S. 89 ff.) sind genetische Drift, Mutation und Selektion. 1.9.1 Genetische Drift Eine einmal aufgetretene Mutation kann sich unter dem Einfluss des Zufalls in einer Population entweder anreichern oder aus ihr verschwinden: Welche Mutationen mit ihren Keimzellen an die nachfolgende Generation weitergegeben werden, ist zufllig (bzw. ob das Individuum, das die Mutation trgt, sich berhaupt fortpflanzt, ist auch zufllig (hinsichtlich der Mutation)), wenn diese eine neutrale Mutation, also eine, die sich phnotypisch nicht ausprgt, darstellt. Diese Zufallskraft fhrt zur nderung von Allelfrequenzen in Populationen. Um quantitative Aussagen ber die nderung der Allelfrequenzen treffen zu knnen, wurden stochastische Modelle entwickelt. Sofern man neutrale Mutationen betrachtet, dauert es 4 N Generationen, bis es zur Fixierung eines Allels in einer Population kommt, obwohl die Wahrscheinlichkeit, dass dieses passiert, nur bei 1/2 N liegt. Folglich luft dieser Prozess in kleineren, finiten Populationen in krzerer Zeit ab. Bleibt man bei der Betrachtung eines einzelnen Allels, dann wrde, auf lange Zeit gesehen, genetische Drift entweder zur Anreicherung oder vlligen Eliminierung dieses Allels fhren. Auf die Gesamtheit der Allele der Population bezogen hiee das, dass es eine Tendenz zu homozygoten Genotypen gibt. Dies bedeutet letztlich, dass die genetische Vielfalt in der Population reduziert wird. Dies hat Gltigkeit, solange man die Neuentstehung von Mutationen nicht mit einbezieht, denn diese erhhen die genetische Vielfalt. Sogenannte Flaschenhals-Effekte (bottleneck effects) oder Grndereffekte (founder effects) sind Beispiele, bei denen sich genetische Drift in einer drastischen Erhhung oder Erniedrigung von 20

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1. Einleitung

Allelhufigkeiten in beiden Fllen aufgrund einer geringen Populationsgre - innerhalb sehr kurzer Zeit auswirkt. Als bottleneck bezeichnet man eine starke Reduzierung der Individuenzahl einer Population. Die Grnde dafr knnen Krankheiten, Kriege, Naturkatastrophen etc. sein. Infolgedessen wird die genetische Variabilitt dieser Population erniedrigt. Grndereffekte liegen vor, wenn wenige Individuen aus einer Population auswandern und sich entfernt (ohne Genfluss) von der ursprnglichen niederlassen. Damit entsteht ein neuer Genpool, der aber nur einen geringen Anteil der Gene der Ursprungspopulation enthlt. 1.9.2 Natrliche Selektion Soweit bislang bekannt, ist der Einfluss der Selektion auf Mini- und Mikrosatelliten, die phnotypisch nicht in Erscheinung treten, nicht relevant. 1.9.3 Mutationen Diese fhren zu Vernderungen des Genoms, an denen Selektion wirken kann. Mutationen erzeugen neue Allele in einer Population. In normalen Krperzellen von Eukaryoten treten Neumutationen sehr selten auf mit Raten von 10-5 bis 10-6 pro Gen pro Jahr (Page & Holmes 1998). Damit zeigen sich die Auswirkungen von Mutationsereignissen erst ber sehr langen Zeitrume. Zu Mutationsmechanismen und -hufigkeiten fr repetitive Elemente siehe Abschnitt 1.3 und 1.4. 1.9.4 Genfluss Als Genfluss wird die Bewegung von Genen in oder aus einem Genpool verstanden. Diese Bewegung ist an Wanderungsbewegungen von Organismen geknpft. Da die meisten Populationen nicht isoliert voneinander leben, ist Genfluss infolge von Migration ubiquitr und ein wichtiger Faktor in der Vernderung von Allelhufigkeiten. Durch Genfluss werden die Genfrequenzen von zwei Populationen - ber lngere Zeit gesehen einander hnlich. Mit zunehmender geografischer Entfernung verringert sich die Genflussrate meistens. Man kann man den Einfluss der evolutionren Krfte folgendermaen zusammenfassen: ber lngere Zeitrume gesehen, erzeugen Mutationen neue Allele in einer Population. Ebenso erhht Migration bzw. Genfluss durch Einbringung neuer Allele die genetische Variabilitt. Genetische 21

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1. Einleitung

Drift hingegen lsst Allele aus Populationen verschwinden, reduziert also die genetische Variationsbreite, whrend natrliche Selektion in beiden Richtungen wirksam werden kann. 1.10 Kurze bersicht zur jngeren Geschichte des modernen Menschen in Europa Zur Verbreitung des anatomisch modernen Menschen existieren zwei unterschiedliche Theorien, das out-of-Africa Modell (Stringer & Andrews 1988) sowie das multiregionale Modell (Wolpoff et al. 1984): Dieses besagt, dass sich der Homo erectus - aus Afrika kommend - vor ungefhr 1 Million Jahre ber den eurasiatischen Kontinent ausbreitete. Aus diesen Homo erectus-Populationen entwickelte sich durch Genfluss und natrliche Selektion an vielen Orten gleichzeitig der Homo sapiens. Das out-of-Africa Modell besagt, dass der Homo sapiens vor etwa 100.000 bis 200.000 Jahren Afrika verlie, sich ausbreitete und nachfolgend die auf dem eurasiatischen Kontinent lebenden Populationen des Homo erectus verdrngte. Somit wren alle heutigen Menschen Nachfahren der einen, aus Afrika kommenden Homo sapiens Population. Folgt man der out-of-Africa Theorie, fhrte der Weg des aus Afrika kommenden Homo sapiens vor mehr als 100.000 Jahren zunchst in die Lnder des Nahen Ostens, von wo aus er anschlieend nach Sd- bzw. Zentralasien gelangte. Dabei ist der Weg nach Osten durchaus umstritten. Cavalli-Sforza et al. (1994) postulieren eine nrdliche, nach Zentralasien fhrende Route mit einer Ankunft vor ungefhr 60.000 Jahren. Eine weiter sdlich verlaufende Wanderung fhrte den Homo sapiens schlielich nach Australien und Neu-Guinea, wo seine Ankunft auf etwa vor 40.000 Jahren datiert wird (Cavalli-Sforza et al. 1994). Ebenfalls in dieser Zeit, im Alt-Palolithikum, erreichten die Wanderer die Gebiete im stlichen und sdlichen Europa. Whrend Cavalli-Sforza diese Einwanderung von Westasien aus sehen vor ca. 35.000 bis 40.000 Jahren (Cavalli-Sforza et al. 1994), vertreten andere Autoren die Ansicht, der Homo sapiens htte eine Route vom Nahen Osten nach Europa eingeschlagen (Straus 1989). In Europa wird die Steinzeit in drei Perioden gegliedert: Altsteinzeit (Palolithikum, vor etwa 2.3 Millionen bis 15.000 Jahren), Mittelsteinzeit (Mesolithikum, vor etwa 11.000 Jahren), Jungsteinzeit (Neolithikum, vor etwa 9000 Jahren). Auf andere Kontinente ist diese Einteilung nicht generell anwendbar.

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1. Einleitung

Der Neanderthaler (Homo sapiens neanderthalensis) lebte in Europa in der Zeit des Mittleren Palolithikums (vor ca. 125.000 bis 27.500 Jahren), der berhmte Fund im Neanderthal bei Dsseldorf von 1856, der zur Namensgebung fhrte, wird auf ein Alter von ungefhr 70.000 Jahren geschtzt. Er lebte in zumindest einigen Gebieten zeitgleich mit den ersten Formen des modernen Jetztmenschen, so beispielsweise in Israel. Auf dem Hhepunkt der letzten Eiszeit in Europa vor ca. 18.000 Jahren (Mesolithikum) bedeckten ausgedehnte Gletscher weite Teile Zentraleuropas, und fhrte zur Entvlkerung dieser Gebiete. Vlkerbewegungen waren nur in dem eisfreien Gebiet zwischen Alpengletscher und den Auslufern der Gletscher Norddeutschlands mglich. In diesem Zusammenhang sprechen einige Autoren sogar von einer Spaltung der europischen Populationen in einen westlichen Teil (vom Cro-Magnon Menschen bewohnt, in Sdfrankreich und Spanien) und einen stlichen Teil (Barbujani & Bertorelle 2001). Torroni et al. (1998) sprechen ebenfalls von einem sdwesteuropischen Refugium (Mittelmeerbereich Frankreichs und Spaniens) sowie einem in der Ukraine. In eisfreien Refugien wie beispielsweise im nrdlichen Balkangebiet konnten einige der voreiszeitlichen Populationen des modernen Menschen berleben (Semino et al. 2000). Diese nomadisch lebenden Vlker erschlossen nach dem Ende der Eiszeit vor ca. 15.000 8.000 Jahren zeitgleich mit dem Rckzug der Gletscher nach Nordeuropa neue Siedelungsrume in nord- und westlicher Richtung. Die Jungsteinzeit (Neolithikum) ist gekennzeichnet durch die Entwicklung von der Jagd- und Sammlerkultur zu sesshaften, Ackerbau betreibenden Siedlungsgemeinschaften. Damit verbunden war die Aufgabe der nomadischen Lebensweise, der allmhliche bergang zur Viehzucht sowie die Entwicklung und Herstellung von immer komplexer aufgebauten Eisenwerkzeugen. Nach wissenschaftlicher bereinkunft breitete sich diese Lebensweise und die damit in Zusammenhang stehenden Techniken vom Nahen und Mittleren Osten in nrdlicher und westlicher Richtung aus. Vor ungefhr 5000 Jahren waren diese Techniken dann bis nach England, Dnemark und Spanien gelangt. Cavalli-Sforza et al. (1994) sprechen in diesem Zusammenhang von einer demischen (durch Migrationsbewegungen vermittelte) Verbreitung des Ackerbaus (demic diffusion-Modell). In den sechziger Jahren wurde eine gegenstzliche Hypothese aufgestellt: Danach verbreiteten sich lediglich Ideen und Objekte (beispielsweise Keramikarten, Werkzeuge etc.) durch Tausch und 23

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1. Einleitung

Handel (cultural diffusion), ohne zwingend mit Wanderungsbewegungen (Genfluss) assoziiert zu sein. Auch in anderen Gebieten hat sich in dieser Zeit, wie archologische Funde beweisen, Viehzucht und Ackerbau entwickelt, beispielsweise in China: Vor etwa 9000 Jahren lebten die Menschen dort bereits in neolithischen Siedlungen, wie Ausgrabungen in der Nhe der alten Hauptstadt Xian bewiesen. Deren Bewohner lebten vorwiegend vom Ackerbau (Hirse). In Sdchina berwog der Reisanbau. Vor ungefhr 5000 Jahren endete die Expansion der Neolithiker. Ackerbauern (Neolithiker) und Jger/Sammler (Mesolithiker) lebten in Europa offensichtlich ohne Konflikte nebeneinander, denn man hat keine Befestigungen der Ackerbauern-Siedlungen finden knnen.

Abbildung 1.6: Migrationsbewegungen whrend des Palolithikums (rote Pfeile) und des Neolithikums (blaue Pfeile) in Europa. Rckzugsgebiete whrend der Eiszeit sind violett dargestellt, der violette Pfeil deutet die Expansion im Mesolithikum von Spanien aus an (nach Simoni al. 2000)

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1. Einleitung

1.11 Die Rumnen Quellen: Ploetz (1976), Calafeteanu (2002), Peters (1970), Nemoianu & Raica (1995), Lichtenberger & Wagner (2002), Sowards (2002). 1.11.1 Das Land Rumnien liegt im nrdlichen Sdosteuropa und wird begrenzt von folgenden Staaten: Bulgarien (im Sden und Sdosten), vom ehemaligen Jugoslawien (im Sdwesten), Ungarn (im Westen), Moldawien (im Osten und Nordosten), der Ukraine (im Norden und Nordosten) sowie dem Schwarzen Meer (im Osten). Das Staatsgebiet erstreckt sich zwischen 4337 und 4815 nrdlicher Breite sowie 2015 und 2941 stlicher Lnge. Die Landesflche betrgt 238.391 Quadratkilometer, das entspricht der Flche aller alten Bundeslnder Deutschlands. Rumnien gliedert sich in 40 Provinzen (Judete) und einen Hauptstadtbezirk (Municipiu). Meist werden allerdings die Namen der historisch gewachsenen Provinzen wie Siebenbrgen (Transsylvanien), Banat etc. benutzt. Hauptstadt und grte Stadt ist Bukarest mit rund 2.032 Millionen Einwohnern. Ploiesti hat rund 250.000 Einwohner. Die Karpaten teilen das Land in zwei voneinander relativ getrennte Gebiete: stlich und sdlich gelegen sind die Regionen Moldawien, Walachei, sowie Dobrudscha und westlich liegen Siebenbrgen und Banat.

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1. Einleitung

Abbildung 1.7: bersichtskarte Rumniens und angrenzender Lnder

1.11.2 Geschichte Rumniens 1.11.2.1 Palolithikum Archologische Funde belegen erste menschliche Spuren im Gebiet des heutigen Rumniens im Alt-Palolithikum. 1.11.2.2 Kulturen des Neolithikums Hamangia-Kultur Um ungefhr 6500 v. Chr. beginnend entwickelte sich die Hamangia-Kultur in der Dobrudscha, also im sdstlichen Muntenien und nordstlichen Bulgarien. Zeugnisse dieser Kultur sind sowohl mit Schnitzereien verzierte Keramikgefe, die der Aufbewahrung von Getreide dienten, als auch einige anthropomorphe Statuetten aus Terrakotta (siehe Abbildung 1.8). Die Hamangia26

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1. Einleitung

Kultur verschwand um 5000 v. Chr., als neue Wanderungswellen in der Region zwischen Balkan und Karpaten eintrafen.

Abbildung 1.8: Statuette aus der Zeit der Hamangia-Kultur

Boian-Kultur Diese Kultur war zunchst im Sden der Provinz Muntenien und nrdlich der Donau verbreitet, sie koexistierte eine Zeit lang mit der Hamangia-Kultur. Spter jedoch verdrngte sie diese in der Dobrudscha und breitete sich in sdlicher Richtung bis zur gis aus. Die Keramik dieser Zeit weist Schnitzereien und geometrische Motive auf, es finden sich auerdem einige Kupferobjekte. Als Beispiel einer Statue aus dieser Zeit siehe Abbildung 1.9. Die Htten waren rechteckig und bestanden aus Holzwnden, die mit Lehm verschmiert wurden. Es wurden Tiere gehalten, Ackerbau betrieben, daneben aber auch nach wie vor gejagt und gefischt.

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1. Einleitung

Abbildung 1.9: Statuette aus der Zeit der Boian-Kultur, um 5000 v. Chr.

Gumelnita-Kultur Zu Beginn des 5. Jahrtausends v. Chr. waren die Stmme dieses Kulturkreises vom Schwarzen Meer bis nach Zentralbulgarien und vom Donaudelta bis zum griechischen Thrakien verbreitet. Neben der Kupferbearbeitung, die zur Herstellung von Kupfer Assessoires sowie kleineren Werkzeugen fhrte, tauchten erstmals Goldobjekte auf (siehe Abbildung 1.10).

Abbildung 1.10: Goldobjekt aus der Zeit der Gumelnita-Kultur

Cernavoda-Kultur Die Ankunft der ersten Cernavoda-Stmme, die um 4500 v. Chr. von den Pontischen Steppen einwanderten und sich in der Dobrudscha, im Osten Munteniens und im Nordosten Bulgariens 28

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1. Einleitung

niederlieen, markiert fr viele Wissenschaftler den Beginn der Entwicklung der Proto-Europer und damit der europischen Zivilisation. Gleichzeitig reprsentiert diese Kultur den bergang von der Stein- zur Bronzezeit. 1.11.2.3 Kulturen der Bronzezeit Cucuteni-Kultur (4500 3500 v. Chr. ) Diese war von Ost-Transsylvanien bis Moldawien und weiter stlich ber den Djnepr bis nach Kiew verbreitet. Geto-Dakische Kultur (ab ca. 2000 v. Chr. ) Zu Beginn der Bronzezeit, etwa zwischen 2200 und 1200 v.Chr. erreichten thrakische Stmme indo-europischer Herkunft, die aus dem Osten einwanderten, das Gebiet um die Karpaten. Die Geten ein Thrakerstamm siedelte nrdlich der Donau in den Ebenen, die Daker, ebenfalls ein Thrakerstamm, lieen sich berwiegend in den Bergen und den Hochebenen Transsylvaniens nieder.

Abbildung 1.11: Rumnien zur Zeit der Thraker, etwa 1000 v. Chr.

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1. Einleitung

1.11.2.4 Die Zeit der Thraker Erste Kontakte der Thraker mit den Griechen kamen zustande, als die Griechen im 7. Jahrhundert v. Chr. Handelskolonien auf der westlichen Seite des Schwarzen Meeres grndeten (zum Beispiel Tomi, das heutige Constanza) sowie im Bereich des Donaudeltas. Es entwickelte sich ein reger Handel mit den Griechen, auch wurden in diesen Gebieten griechische und mazedonische Mnzen und der Bau von Steinziegelhusern eingefhrt. Funde von sehr hochwertigen Tpferwaren und Schmuck griechischer Herkunft sind belegt. Es ist also vorstellbar, dass es hier neben wirtschaftlichen Kontakten auch zu Ehen zwischen Mitgliedern der Thrako-Geten Stmme mit Griechen kam. Neben den Griechen hatten die Geten viele andere wirtschaftliche Kontakte, ebenso wie militrische Konflikte: 513 v.Chr. durchquerte Darius der Grosse mit seiner persischen Armee das von Geten bewohnte Gebiet. Die Mazedonier unter Alexander dem Grossen fhrten 335 v. Chr. eine Expedition durch, die sie bis in die Gebiete nrdlich der Donau fhrte. Die Hellenen kamen 300 v. Chr. mit den Geten in Kontakt, zur selben Zeit gab es auch Berhrungen mit keltischen Gruppen. Im Jahr 44 v. Chr. wurden die Geten von den Rmern in die Gebiete nrdlich der Donau vertrieben. Dem Daker-Knig Burebista (82 ca. 44 v.Chr.) gelang es als Erstem, die verschiedenen Getenund Dakerstmme zu einem zur damaligen Zeit relativ mchtigen Knigreich zu vereinigen. In der Zeit des ersten Jahrhunderts v. Chr. stellte die Donau die Grenze des Rmischen Reiches zur Region, in der die Daker siedelten, dar. Knig Decebal (87 106 n. Chr.) vermochte es, die verschiedenen Frstentmer in Dakien wieder zu vereinigen. Dies stellte fr das rmische Imperium eine nicht zu unterschtzende Bedrohung dar. So wurde Dakien des fteren von den Rmern angegriffen. Nach einer wechselvollen Geschichte von Angriffen, Siegen und Niederlagen, triumphierten die Rmer unter Trajan schlielich im Jahr 105 n. Chr.: Sie unterwarfen die Daker und gelangten bis nach Zentraltranssylvanien. Damit wurde aus dem Knigreich Dakien die rmische Provinz Dacia. Sie umfasste die Gebiete nrdlich der Donau und Transsylvanien. Insgesamt fand eine systematische Kolonialisierung der neueroberten Gebiete whrend der 165 Jahre dauernden Be30

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1. Einleitung

satzungszeit statt: In die Provinz wurden von rmischer Seite her eine groe Zahl an rmischen Siedlern geschickt, keineswegs ausschlielich Soldaten, sondern auch Bauern, Hndler, Beamte und Knstler. Stdte und Kastelle wurden errichtet. Da im Handel und im administrativen Bereich die lateinische Sprache eingefhrt wurde, drngte dies die Thrakersprache stark zurck. Die rmischen Siedler brachten in die Provinz Dacia auch Teile ihrer Religion mit, die sich allerdings friedlich neben die dakischen Gottheiten stellte. Im Jahr 271 n. Chr. zogen sich die Rmer unter Aurelian aufgrund der Bedrohung durch Stmme wie Goten, Hunnen, Sarmaten (iranisch-zentralasiatische Reiterkrieger), Gepiden, Awaren und Lombarden in die Gebiete sdlich der Donau zurck.

Abbildung 1.12: Rumnien um 400 n. Chr.: Einflsse der Hunnen, Gepiden, Visigoten

1.11.2.5 Einflsse verschiedener Vlker Einfluss der Goten Aus dem sdrussischen Raum kommend, drangen die Goten um 250 n. Chr. ins Donaugebiet vor und fhrten Krieg mit den Rmern, von denen sie schlielich geschlagen und zurckgedrngt wurden (270 n. Chr. ). Im 2. Gotenkrieg von ca. 350 360 n. Chr. erfolgte eine erneute 31

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1. Einleitung

Ausbreitung der Goten in die Gebiete zwischen Wolga, Donau, Schwarzmeer, Elbe und Ostsee. Im Zuge dieser Expansion verdrngten bzw. unterwarfen sie die in den jeweiligen Gebieten ansssigen Slawen, Finnen und Germanen. Einfluss der Hunnen Die Hunnen, innerasiatische Nomaden, gelangten ab ungefhr 370 n. Chr. aus dem Gebiet des Kaspischen Meeres ins Donaugebiet und damit in das heutige Rumnien. Dort trafen sie auf die Westgoten und andere Vlker und besiegten diese. Die grte Ausdehnung hatte das Hunnenreich unter ihrem berhmten Knig Attila um 450 n. Chr., der mit seinen Heeren bis nach Gallien gezogen war und dort gegen die Rmer antrat, aber schlielich besiegt und vertrieben wurde.

Abbildung 1.13: Rumnien um 600 n. Chr.: Slawische Wanderungsbewegungen

Einfluss der Slawen Dieser geht auf die Zeit der Wanderungswellen durch das Gebiet des heutigen Rumniens in den Jahren nach Abzug der Rmer, also dem 3. 7. Jahrhundert n. Chr. zurck (siehe auch Abbil32

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1. Einleitung

dung 1.13). Um 460 n. Chr. lieen sich die Slawen im Raum zwischen Wolga und Ostsee nieder, um 500 n. Chr. eroberten sie Gebiete zwischen Elbe und Donaumndung und siedelten dort als Bauern. Sie breiteten sich weiter bis nach Byzanz (550 n. Chr.) aus. Die Slawen mischten sich mit den Daco-Rumnen und hinterlieen sowohl genetische, als auch linguistische Spuren: Die rumnische Sprache birgt viele dem slawischen Sprachgebrauch entlehnte Wrter. Einfluss der Deutschen Die deutschen Gruppen bildeten im rumnischen Gebiet eigene, fast als autonom zu bezeichnende Kolonien, beispielsweise Siebenbrgen im Nordwesten in Transsylvanien. Im 12. und 13. Jahrhundert lieen sich Sachsen im Sden und Osten Transsylvaniens nieder. In diesen Kolonien kam es kaum zu Vermischungen mit Rumnen. Eine weitere deutsche Gruppe, die Schwaben, kamen im 18. Jahrhundert. Sie siedelten im Banat und betrieben hauptschlich Ackerbau und Landwirtschaft. Zum Ende des zweiten Weltkrieges verlieen etwa 100.000 noch hier lebende Deutsche Transsylvanien. 75.000 Deutsche wurden in russische Arbeitslager gebracht. Damit halbierte sich die Zahl der in Rumnien lebenden Deutschen.

Abbildung 1.14: Rumnien im spten 9. Jahrhundert n. Chr.: Wanderung der Magyaren

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1. Einleitung

Einfluss der Ungarn Transsylvanien, das Gebiet vom nrdlichen Karpatenbogen bis zur ungarischen Grenze, macht etwa ein Drittel des gesamten rumnischen Staatsgebietes aus. In diesem Gebiet lieen sich 896 n. Chr. die Magyaren, die Vorfahren der Ungarn aus der Ukraine kommend, nieder (siehe Abbildung 1.14) und wenig spter im Sdosten Transsylvaniens die Szekler. Der Einfluss der Ungarn erhielt sich bis ins 19. Jahrhundert, vorwiegend durch die Besetzung politischer mter durch Mitglieder der ungarischen Oberschicht. Transsylvanien gehrte von 1859 bis 1918 zu Ungarn. Nach der Vereinigung von Transsylvanien mit dem rumnischen Knigreich 1918 verlie etwa ein Fnftel der Ungarn das Gebiet. Mit der Besetzung administrativer und politischer mter durch Rumnen verringerte sich ihr Einfluss auch hier drastisch. Gleichzeitig ersetzte die rumnische Sprache das bis zu diesem Zeitpunkt hier vorherrschende Ungarisch. Einfluss der Awaren Die aus Asien stammenden Awaren siedeln im Donauraum ab ungefhr 560 n. Chr. und grnden 567 n. Chr. ein eigenes Reich, nachdem sie zusammen mit den Langobarden die Gepiden und die Slawen besiegt haben. Bis zur Zerstrung des Awarenreiches durch Karl den Groen 791 n. Chr. waren die Awaren im heutigen rumnischen Gebiet prsent. In der sdlichen Donauebene herrschten ab ungefhr 676 n. Chr. die Bulgaren whrend die westlichen Gebiete nach 955 n Chr. von den Magyaren besetzt wurden. 1.11.2.6 Osmanische Herrschaft Ein erster Vorsto trkischer Kumanen vom Dnjepr nach Ungarn erfolgte 1072. Mongolische Heere unter Batu-Khan, dem Enkel Dschingis-Khans, drangen im 13. Jahrhundert bis nach Ungarn, Mhren, Polen und Schlesien vor. Sie zogen sich aber bald wieder aus Mitteleuropa zurck. Die Osmanen, die sich nach ihrem trkischen Heerfhrer und Staatsfhrer Osman I. benannten, brachten in Osteuropa ab 1389 zunchst Serbien, dann Bulgarien und anschlieend das Gebiet Bosniens unter ihre Herrschaft. Das Frstentum Moldau errang um 1359 unter Bogdan I. die Unabhngigkeit von Ungarn. 1369 wurde die Walachei als Frstentum ebenfalls unabhngig. Bereits 1389 geriet das Gebiet nach 34

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1. Einleitung

erbittertem Widerstand unter die Herrschaft des Osmanischen Reiches. Die Frstentmer Transsylvanien, Moldau und Walachei bewahrten unter der trkischen Herrschaft ihren autonomen Status, ihre eigenen politischen und administrativen Strukturen blieben erhalten. Sie zahlten zwar Tribute an die Trken, wurden aber im Gegensatz zu Serbien und Bulgarien nicht von den Trken besetzt. Transsylvanien wird 1541 ein selbstndiges Frstentum. Der Anteil der Muslime im heutigen Rumnien liegt unter 0,5 % (CIA World Factbook online 2002). Dagegen existiert in Serbien in sehr viel hherer Anteil an Muslimen als Erbe der trkischen Besetzung. In vielen von den Trken beeinflussten Gebieten wurde der bertritt zum islamischen Glauben zwar nicht mit Gewalt forciert, jedoch mit Privilegien belohnt (Encyclopedia Britannica Online, Kapitel: Balkans 2003).

Abbildung 1.15: Rumnien und Ungarn unter osmanischer Herrschaft im 16. Jahrhundert

Nach dem vergeblichen Versuch der Einnahme Wiens durch das Osmanische Reich im Jahr 1683, wurden die Trken nach Sdosten in die Balkangebiete zurckgedrngt und in der Folge expandierten die Habsburger: Transsylvanien gehrte seit 1699 zum Habsburger Reich.

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1. Einleitung

Im 18. Jahrhundert setzten die osmanischen Herrscher griechische Aristokraten - die sog. Phanarioten - als Fhrer ein, um ihren politischen Einfluss im Frstentum Moldau sowie in der Walachei zu festigen. Unter dieser Herrschaft setzte sich die Ausbeutung der Frstentmer grndlich fort. Inzwischen gelangten die Russen unter der ehrgeizigen Fhrung von Zar Peter dem Grossen (1696-1725) bis zum Dnjepr, also bis an die stliche Grenze des Frstentums Moldau. 1.11.2.7 Vertreibung der Trken Im 18. und 19. Jahrhundert fhrten sterreich und Russland eine groe Anzahl von Vertreibungskriegen gegen die Trken, viele davon auf rumnischem Boden. In der Folge verloren die Trken mehr und mehr Einfluss im sdosteuropischen Raum und waren gezwungen, Gebiete an sterreich und Russland abzutreten: Zunchst fllt der nrdliche Teil des Frstentums Moldau, die Bukowina, 1775 an sterreich. Der stliche Teil des Gebiets Moldau, spter Bessarabien genannt, wird als Folge des russisch-trkischen Kriegs (1806 bis 1812) von Russland annektiert. Ab 1829 besetzten russische Truppen auch die Frstentmer Moldau und Walachei, verschwanden jedoch 1834 wieder aus den Frstentmern.

Abbildung 1.16: Rumnien zur Zeit der Staatsgrndung im 19. Jahrhundert

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1. Einleitung

1.11.2.8 Entstehung des rumnischen Staates und weitere Geschichte 1859 wird Frst Alexander Cusa (1859-1866) zum gemeinsamen Fhrer der beiden Frstentmer Moldau und Walachei gewhlt und 1862 der einheitliche Staat Rumnien offiziell proklamiert (siehe Abbildung 1.16). Cusa initiierte wichtige Reformprogramme, welche zur Modernisierung der rumnischen Gesellschaft und Staatsstrukturen beitrugen, u. a. die Landreform von 1864. Nach Abtretung Cusas 1866 wird Prinz Karl von Hohenzollern-Sigmaringen als Carol I zum Oberhaupt Rumniens ernannt, 1881 wurde dieser zum Knig gekrnt. 1878 erkannten die wichtigsten europischen Staaten die Unabhngigkeit Rumniens an. Das im Jahre 1867 gegrndete Kaiserreich sterreich-Ungarn gliederte das vorher unter sterreichischer Herrschaft relativ autonom gebliebene Transsylvanien ein. Die dort lebenden Rumnen wurden gezwungen, die ungarische Nationalitt anzunehmen. Am Ende des 19. Jahrhundert umfasste das Volk der Rumnen etwa 12 Millionen Menschen, wovon ungefhr die Hlfte unter fremder Herrschaft lebte. Whrend sich Rumnien im ersten Balkankrieg (1912-1913) neutral verhielt, trat es im zweiten Balkankrieg der Allianz von Griechenland, Serbien, Montenegro und der Trkei gegen Bulgarien bei. Am Ende des Konfliktes gewann Rumnien die sdliche Dobrudscha zu seinem Staatsgebiet hinzu. Auch im ersten Weltkrieg blieb Rumnien zunchst neutral. Dann trat es den Alliierten im Jahr 1916 mit einer Kriegserklrung an sterreich-Ungarn bei. Ende 1916 wird Bukarest von den Mittelmchten besetzt. Als Ergebnis des ersten Weltkriegs verdoppelte sich die Flche Rumniens (jetzt 295.042 Quadratkilometer) und seine Bevlkerungszahl auf 15,5 Millionen durch die Eingliederung von Banat (Sdwesten), der Bukowina (Nordosten), Bessarabien (mit vielen Russen) und Transsylvanien (mit deutschen und ungarischen Minderheiten). Im Verlauf des zweiten Weltkrieges verlor Rumnien 1940 zunchst die Bukowina und Bessarabien an Russland, den nordstlichen Teil Transsylvaniens, der immer noch mehrheitlich von Rumnen bevlkert war, an Ungarn sowie die Sddobrudscha an Bulgarien. Der Friedensvertrag von Paris (10. Februar 1947) fhrte schlielich zum Wiederanschluss Nordost-Transsylvaniens 37

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1. Einleitung

an Rumnien. Bessarabien und die Bukowina gehrten der UdSSR. Rumnien wurde nach Abdankung von Knig Michael am 30.12.1948 eine Volksrepublik. In den 50iger und 60iger Jahren versuchte Rumnien einen eigenen politischen Kurs gegenber Moskau durchzusetzen, beispielsweise wurde der Einmarsch sowjetischer Truppen in der CSSR scharf verurteilt. Mit dem Aufbau einer rumnischen Volksarmee wurde die Integritt des Landes bewahrt sowie vor Manvern des Warschauer Paktes geschtzt. Ceausescu wird 1965 Erster Sekretr des ZK der Kommunistischen Partei Rumniens, als Nachfolger von Gheroghiu-Dej. 1974 wird er nach einer Verfassungsnderung Prsident und gewinnt damit weitreichende Vollmachten als Oberbefehlshaber der Streitkrfte sowie als Vorsitzender im Rat fr Verteidigung und im Ministerrat. Unter dem totalitren Regime von Nicolae Ceaucescu, dem schlielich die Bndelung der hchsten Partei- und Regierungsmter gelang, distanzierte sich Rumnien im Verlauf der Zeit zunehmend von der UdSSR. Whrend seiner langjhrigen Amtszeit (1965 1989) verursachte der Diktator durch massive Ausbeutung den dramatischen Niedergang der rumnischen Wirtschaft und des Lebensstandards. 1989 wurde Ceaucescu nach einem Volksaufstand gestrzt und kurz danach zusammen mit seiner Frau hingerichtet. Bei freien Wahlen im Jahr 1990 erringt die Gruppe der Reformkommunisten unter Ion Illiescu den Sieg. 1.11.3 Ethnische Gruppen in Rumnien Fasst man die oben beschriebenen Einflsse zusammen, stammen die heutigen Rumnen berwiegend von den Dakern ab, die einige hundert Jahre unter rmischer Herrschaft lebten und whrend dieser Zeit Elemente der rmischen Kultur integrierten. Das wichtigste Element war der Erwerb der rmischen Sprache. Sie entwickelte sich bis zum heutigen Rumnisch. Viele verschiedene (durch-) wandernde Vlker hinterlieen ihre Spuren, unter ihnen Hunnen, Goten, Awaren. Auch slawische Einwanderer, die im 7. Jahrhundert eintrafen und sesshaft wurden, brachten Elemente ihrer Kultur ein. Der Teil Rumniens, der am hufigsten unter Einfluss anderer Vlker geriet, ist wahrscheinlich der nordwestliche Teil: In Transsylvanien siedelten sich die Magyaren an, etwas spter kamen in groer Zahl die Szekler hinzu. Eine zahlenmig bedeutende deutsche Entitt lie sich ebenfalls in diesem Gebiet nieder. Vom 16. bis zum spten 17. Jahrhundert wurden berwiegende Teile Rumniens (Walachei, Transsylvanien und Moldau) von den Osmanen regiert. Einwanderungen von Griechen und Trken fanden im Sden 38

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1. Einleitung

statt. Heute findet man in Rumnien zu 89,5 % Rumnen, 6,6 % Ungarn, 2,5 % Roma, 0,3 % Ukrainer, 0,3 % Deutsche, 0,2 % Russen, 0,2 %Trken sowie andere zu 0,4 % (CIA Word Factbook online 2002).

Abbildung 1.17: Ethnische Zusammensetzung osteuropischer Staaten um 1990 (Quelle: CIA online 1994)

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1. Einleitung

1.11.4 Indo-Europische und Uralische Sprachfamilie Die sog. romanischen Sprachen, zu denen auch das Rumnische gehrt, sind aus dem (gesprochenen) Lateinisch hervorgegangen. Die wichtigsten romanischen Sprachen sind: Franzsisch, Italienisch, Spanisch und Portugiesisch. Romanische Sprachen werden weltweit von etwa 650 Millionen Menschen gesprochen. Weitere romanische Sprachen sind vor allem Rumnisch und Katalanisch (im Nordosten Spaniens), sowie einige Sprachen mit nur wenigen Sprechern, wie z.B. Rtoromanisch in der Schweiz und Norditalien. Innerhalb Europas gibt Ruhlen (1987) eine Klassifizierung der Populationen in Sprachfamilien wie folgt an: I. Indo-Europische Sprachfamilie 1. Germanische Gruppe: 1. Islnder, 2. Norweger, 3. Schweden, 4. Dnen, 5. Deutsche, 6. Englnder, 7. Niederlnder, 8. Friesen 2. Keltische Gruppe 3. Romanische Gruppe: 1. Portugiesen, 2. Spanier, 3. Katalanen, 4. Franzosen, 5. Provencalen, 6. Italiener, 7. Sardinier, 8. Rto-Romanen , 9. Rumnen 4. Griechische Gruppe: Griechen 5. Albanische Gruppe: Albaner 6. Slawische Gruppe: 1. Belorussen, 2. Russen, 3. Ukrainer, 4. Bulgaren, 5. Mazedonier, 6. Serbo-Kroaten, 7. Slowenen, 8. Polen, 9. Tschechen, 10. Slowaken, 11. Serben 7. Baltische Gruppe: 1. Letten, 2. Litauer II. Uralische Gruppe: Finno-Ugrischer Zweig: 1. Ugrisch: Ungarn 2. Finnisch: Esten, Finnen, Karelier, Lappen 1.12 Die Jakuten (Sakha)

Quellen: Argounova (1997), CIA World factbook online (2002), Encyclopedia Britannica Online (1999), Pakendorf (1996), Pakendorf (2001), Vasilev (1992) Eine der grten Republiken der heutigen Russischen Fderation ist die im Nordosten liegende Republik Sakha (Jakutien). Sie erstreckt sich ber eine Flche von 3.103.200 Quadratkilometern, was einem Anteil von 18,2 % der Flche der gesamten Russischen Fderation entspricht mit einer Population von 1.062.000 Einwohnern. Davon stellen mit ungefhr 46 % die Russen einen berwiegenden Anteil. Die Jakuten sind mit 39 % vertreten. Weitere in Jakutien vertretene 40

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1. Einleitung

Ethnien sind zu 5 % Ukrainer, Tataren mit 1,42 % sowie 1,44 % Evenken. Der Anteil anderer einheimischer Populationen wie der von Evenen, Jukagiren, Chukchi und Belorussen liegt jeweils unter 1 %. Die Republik gehrt zu den kltesten Regionen der Erde, es herrscht streng kontinentales Klima mit sehr kalten, trockenen Wintern (bis 70 Celsius) und kurzen, warmen Sommern (bis + 40 Celsius). Der Boden ist in der gesamten Region stndig gefroren (Permafrost) und taut nur in der kurzen Sommerperiode oberflchlich (0,4 bis 3,5 m) auf. Die Hauptflsse in Jakutien sind die Lena mit 4400 Kilometern Lnge und ihre Nebenflsse, der Viljuj und der Aldan. Die Jakuten betrieben ursprnglich Pferde- und Rinderzucht, im Gegensatz zu den Rentierzchtenden und jagenden Evenken und Jukagiren, von denen sie umgeben sind. Die eigentlich semi-nomadische Lebensweise der Jakuten wurde unter dem Einfluss der Einfhrung landwirtschaftlicher Techniken durch die Russen mehr und mehr beeinflusst, bis schlielich whrend der Zwangskollektivierung in den 30er Jahren des vorigen Jahrhunderts eine sesshafte Lebensweise erzwungen wurde. Ein weiterer, charakteristischer Bestandteil der Kultur der Jakuten ist ihr animistischer Glauben und die Existenz der Schamanen. Die ursprngliche Herkunft der Jakuten ist nach wie vor umstritten. Sie unterscheiden sich in vielerlei Hinsicht von den sie umgebenden Volksgruppen. Zum einen in der Sprache, da sie die einzige trkisch-sprachige Gruppe (des altaischen Sprachfamilie) in einer Umgebung von tungus- oder anderssprachigen Gruppen (Evenen, Evenken und Jukagiren) darstellen. Zum anderen sind die Jakuten traditionelle Rinder- und Pferdezchter. In ihrem heutigen sdlichen Siedlungsgebiet haben sie sich diese ursprngliche, semi-nomadische Lebensweise erhalten, im Norden dagegen bernahmen sie von den dort lebenden Populationen die Rentierzucht, sowie die Ernhrung durch Jagd und Fischen. Jakutische Populationen wiesen bis zur Kulturrevolution in der Sowjetunion ein hierarchisches Clansystem auf, das sie von allen anderen nrdlichen sibirischen Gruppen abhebt. Das Oberhaupt des Clans, dessen kleinste Einheit die Familien reprsentierten, war der Tojon, der auch den militrischen Fhrer dieser Einheit darstellte. Einer allgemein gltigen Herkunftstheorie zufolge stammen die Jakuten von trkisch-stmmigen Nomadenvlkern ab, die im Gebiet des Baikalsees lebten. Ungefhr in 14. Jahrhundert wurden sie aus dieser Region von den einwandernden Mongolen nordwrts vertrieben. Die Jakuten siedelten danach im Bereich der Flsse Lena und Viljuj. Sie trafen dabei auf dort ansssige Evenen, Evenken und Jukagiren, mit denen sie sich teilweise vermischten. Die am Baikalsee 41

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1. Einleitung

verbliebenen Stmme mischten sich mit den Mongolen, woraus sich schlielich die Buryaten entwickelten. Brigitte Pakendorf, die mir DNS der in dieser Arbeit verwendeten, jakutischen Populationsstichprobe zur Verfgung stellte und diese auf mitochondriale sowie y-chromosomale Marker untersuchte, fand starke Hinweise fr einen bottleneck im Verlauf der Ethnogenese der mnnlichen Jakuten (Pakendorf 2001). Auerdem wiesen ihre mitochondrialen Analysen auf eine grere genetische Nhe zu Evenken und Mongolen hin, als zu den Buryaten. Auch die y-chromosomalen Markerdaten liefern keine Hinweise darauf, dass Jakuten und Buryaten in enger genetischer Beziehung stehen. Asien stellt eine Region von groem anthropologischen und archologischen Interesse dar: Zum einen sind Zeit und Anzahl der Einwanderungswellen auf den amerikanischen Kontinent trotz intensiver Erforschung und neuer Daten von mitochondrialen und Y-chromosomalen Markern nicht eindeutig geklrt. Zum anderen sind die Wissenschaftler heute mehrheitlich davon berzeugt, dass von (Zentral-) Asien ausgehend, Rckwanderungen nach Europa stattgefunden haben. Aber auch hier sind Zeitraum und Umfang noch nicht sehr gut eingegrenzt. Auch die Entstehungsgeschichte der ostasiatischen Vlker ist, insbesondere aufgrund widersprchlicher Ergebnisse von Analysen verschiedener Markerarten, Gegenstand kontroverser Diskussionen (Ding et al. 2000, Chu et al. 1998, Su et al. 1999, Karafet et al. 2001). 1.13 Zielsetzung der Arbeit Die Rumnen haben im Verlauf ihrer Entstehung eine Vielzahl an Besatzern und Durchwanderungen von Populationen verschiedenster Herkunft erlebt. Betrachtet man nur den Ausschnitt der jngeren Geschichte seit dem Neolithikum, gab es von den verschiedensten Seiten Einflsse auf kultureller, insbesondere linguistischer Ebene sowie im genetischen Bereich. In diesem Zusammenhang soll diese Arbeit einen Beitrag leisten zur genetischen Typisierung des heutigen rumnischen Genbestands. Insbesondere soll hier untersucht werden, ob sich Einflsse anderer Populationen, die in der Geschichte der Entstehung des rumnischen Volkes eine Rolle spielten, auf genetischer Basis nachweisen lassen. Dazu soll zunchst untersucht werden, ob die Rumnen eine mit den sie umgebenden Populationen genetisch homogene Gruppe darstellen oder ob sie sich mit Hilfe der hier eingesetzten polymorphen Marker gegenber benachbarten Popula42

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1. Einleitung

tionen abgrenzen lassen. Die Untersuchungen zu den genannten Fragestellungen werden mit den im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Daten zum ApoB3 Minisatelliten, dem D1S80 Minisatelliten und dem Mikrosatelliten HumVWA31A durchgefhrt. Um die Aussagekraft der Analysen zu erhhen, werden meine Daten um solche von anderen Markern und weiteren europischen Populationen aus der Literatur ergnzt. Einen weiteren Aspekt dieser Arbeit stellt die genetische Charakterisierung der jakutischen Populationsstichprobe mit den drei autosomalen Markern (ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A Mikrosatellit) dar. Die Daten der Jakuten sollen zum einen zu internen, methodischen Vergleichszwecken erhoben werden. Zum anderen soll vergleichend mit der rumnischen Population untersucht werden, inwieweit eine eingegrenzte genetische Diversitt durch einen bottleneck-Effekt, der fr die jakutische Stichprobe nachgewiesen wurde, die Allelhufigkeiten fr die hier verwendeten Marker beeinflusst. Damit sollen gegebenenfalls Rckschlsse auf solche Effekte in der rumnischen Populationsstichprobe gezogen werden.

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2. Material und Methoden

2. MATERIAL und METHODEN 2.1 Verwendetes Probenmaterial 2.1.1 Populationsstichprobe aus Ploiesti

Die Blutproben stammen von etwas mehr als 100 jungen Frauen im Alter zwischen 19 und 25 Jahren (zur Zeit der Blutentnahme), die in Ploiesti oder in benachbarten Drfern geboren wurden und leben. Ploiesti ist die Hauptstadt des Regierungsbezirks Prahova-Vorkarpaten, der auf der Sdseite des Karpaten-Gebirges liegt bei 45 nrdlicher Breite und 26 stlicher Lnge. Diese Region umfasst 2 % der Flche Rumniens, hat 880.000 Einwohner, was ein Anteil von 3,7 % der Gesamtbevlkerung Rumniens darstellt und ist stark industrialisiert (Petrochemie, Auto- und Chemiewerke, starke Umweltverschmutzung). Die Blutproben (Vollblut mit Antikoagulans) wurden im Zusammenhang mit einer Untersuchung zum Hormonspiegel und zu konstitutionellen Faktoren gesammelt (Glavce et al. 2000). Sichergestellt wurde, dass die Frauen rumnischen Familien angehrten, die seit mehr als drei Generationen im Bezirk Prahova leben. 2.1.2 Populationsstichprobe aus Bukarest

Dieses Stichprobenmaterial, das mir freundlicherweise von Frau Dr. Dorina Banica (National Institut of Legal Medicine in Bukarest) zur Verfgung gestellt wurde, umfasste etwa 200 weibliche und mnnliche Individuen rumnischer Abstammung verschiedener Altersstufen aus der Hauptstadt Bukarest und den umliegenden Gemeinden des Donautals. Die Blutproben wurden Personen entnommen, die zu einer Kontrolluntersuchung in die Medizinische Klinik fr Lungen- und Bronchialerkrankungen in Bukarest kamen. Das Alter der Probanden lag zwischen 6 und 52 Jahren zum Zeitpunkt der Blutabnahme. Es wurde durch Befragung sichergestellt, dass die Probanden nicht miteinander verwandt sind. Die Blutproben, als Vollblutproben ohne Zusatz entnommen, wurden sofort nach der Abnahme bei 4 C gelagert und gekhlt transportiert. 2.1.3 Populationsstichprobe der Jakuten (Sibirien) Bei dem Stichprobenmaterial fr die Jakuten handelte es sich um bereits isolierte und gereinigte DNS von etwa 100 Individuen. Die DNS wurde mir netterweise von Frau Dr. Brigitte Pakendorf zur Verfgung gestellt, die umfangreiche Untersuchungen zur Klrung der ethnischen Herkunft der Jakuten durchfhrte (Pakendorf 1996, Pakendorf 2001). Die Blutproben, die der DNS-Isolierung dienten, wurden im Verlauf einer Expedition zu den Viljuj-Jakuten im Jahr 1993 von 44

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2. Material und Methoden

Frau L.A. Tarskaja gesammelt, die kologische Fragestellungen in dem Gebiet untersuchte. Es werden dort drei regional gruppierte Jakutenpopulationen unterschieden: die Amga-Lena Jakuten (sie siedeln zwischen den Flssen Lena, Niederer Aldan und Amga), die Viljuj-Jakuten (am Viljuj-Flu) und die im Norden lebenden, rentierhtenden Jakuten (Pakendorf 1996). Die hier reprsentierten Jakuten gehren der Viljuj-Population an. Es handelte sich bei den Probanden um nicht verwandte Individuen jakutischer Herkunft. 2.2 Molekulargenetische Methoden 2.2.1 Isolierung genomischer Nukleinsure aus humanem Vollblut nach Miller Die Isolierung der Zell-DNS aus den Vollblutproben wurde mit einem abgenderten Aussalzungsverfahren nach Miller (Miller et al. 1988) vorgenommen: Nach Trocknung der DNS am Ende der Isolierung wurde diese in einem fr die lngere Lagerung geeigneten Medium gelst und die Menge der isolierten DNS in der Lsung spektrofotometrisch bestimmt, um eine fr die anschlieende Amplifizierung geeignete Konzentration herzustellen. Prinzip: Als Ausgangsmaterial wurde mit EDTA antikoaguliertes Vollblut verwendet. Zuerst wurden die Erythrozyten von den kernhaltigen Leukozyten durch Zentrifugation getrennt, anschlieend die Leukozyten lysiert. Durch die Zugabe von konzentrierter Kochsalzlsung erfolgte die Denaturierung und Ausfllung der Proteine, die abzentrifugiert wurden. Die im berstand enthaltene DNS wurde mit absolutem Ethanol ausgefllt und nach Lsen in TE-Puffer oder destilliertem Wasser zur Reinigung nochmals mit Natriumacetat und absolutem Ethanol gefllt. Nach dem Waschen der DNS mit 70 %igem Ethanol wurde diese in TE-Puffer gelst. Mit dem Spektrofotometer wurde die Reinheit der DNS-Lsung berprft sowie deren DNS-Gehalt bestimmt (siehe Abschnitt 2.1.2). Eine Proteinase K-Behandlung wurde nicht durchgefhrt (Douglas et al. 1992). Lsungen: 1x Lyse Puffer: 11 % Saccharose 10 mM MgCl2 10 mM Tris-HCl pH 7,5 1 % Triton X-100

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2. Material und Methoden

10 % SDS (Natriumdodecylsulfat): 10 g SDS in 450 ml dH20 wurden erhitzt, um SDS zu lsen (nicht autoklavieren). Der pH-Wert wurde bei 7,2 eingestellt. TEN Puffer: 10 mM Tris-HCl pH 8,2 2 mM EDTA 400 mM NaCl 10 mM Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA

1x TE Puffer: 6 M Natriumchlorid

3 M Natriumacetat pH 5,2 Ethanol 70 % Ethanol 96 % Durchfhrung 1 ml Vollblut wurde mit 2 ml 1x Lyse Puffer gemischt, danach die Leukozyten durch Zentrifugation (Sigma 3K2, Schwenkrotor) fr 10 min bei 3800 rpm pelletiert. Das Zellpellet wurde mit 5 ml 1 x Lyse Puffer gewaschen und in 900 l TEN-Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 100 l 10 % SDS wurde die Lsung in einem Wasserbad bei 55 C fr 1 Stunde inkubiert, dabei das Reaktionsgef einige Male geschttelt. Dazu wurden 250 l 6 M NaCl-Lsung gegeben und 15 s lang krftig geschttelt. Die ausgefallenen Proteine wurden danach bei 3000 rpm fr 10 min abzentrifugiert. Durch Zugabe von 2 Volumina absolutem Ethanol wurde die DNS ausgefllt und mit der Pasteurpipette aufgewickelt sowie anschlieend mit 70 % igem Ethanol gewaschen und in TE-Puffer gelst (fr mindestens 2 Stunden bei 55 C). Lie sich die ausgefllte DNS nicht aufwickeln, erfolgte die Przipitierung ber Nacht bei -20 C. Abschlieend erfolgte nochmals eine Fllung mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Volumina Ethanol 96 %. Die DNS wurde mit 70 % igem Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in einem entsprechenden Volumen TE-Puffer (50 bis 300 l, je nach Ausbeute) durch einstndige Inkubation bei 55 C gelst.

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2. Material und Methoden

2.2.2 Quantifizierung von Nukleinsuren mit dem Spektrofotometer Prinzip und Durchfhrung (Sambrook et al. 1989): Mit dem Spektrofotometer wird die Extinktion einer Nukleinsure-haltigen Lsung bei verschiedenen Wellenlngen des nicht-sichtbaren Lichts gemessen. Die ermittelte Extinktion erlaubt die Berechnung des Gehalts einer Lsung an doppelstrngiger DNS, einzelstrngiger RNS oder DNS sowie an einzelstrngigen Oligonukleotiden. Die Purin-/Pyrimidinbasen der Nukleinsuren absorbieren Licht im Bereich von 260 nm, in der Lsung enthaltene, verunreinigende Proteine absorbieren bei 280 und 320 nm Wellenlnge. Der Quotient der Extinktionen von 260 und 280 nm gibt Aufschluss ber die Reinheit der Lsung: Er sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen; wird ein Quotient kleiner als 1,8 ermittelt, ist die Lsung mit Proteinen verunreinigt und Strungen von PCR oder anderen Reaktionen knnen die Folge sein. Alle Messungen mssen gegen destilliertes Wasser bzw. den jeweils verwendeten Puffer, in dem die DNS gelst ist, erfolgen. Ein Extinktionswert von 1,0 bei 260 nm entspricht einer Konzentration von 50 g/ml doppelstrngiger DNS oder 40 g/ml einzelstrngiger DNS bzw. RNS. 2.2.3 Auftrennung von Nukleinsure-Fragmenten im elektrischen Feld Prinzip [Sambrook et al. (1989; S. 6.3 ff und 6.37 f) sowie Knippers (1985; S. 351ff)] Die bei neutralem pH-Wert negativ geladenen Phosphatgruppen der DNS sind deren Hauptladungstrger. Die Wanderung der DNS im elektrischen Feld erfolgt in Abhngigkeit von deren Masse/Ladungsverhltnis sowie deren Form, i.e. Konformation und Gre. Dabei wirken die Poren der Matrix (Agarose- oder Acrylamidgele) wie Molekularsiebe: Kleinere DNS-Fragmente wandern schneller hindurch, grere langsamer. Durch Variierung der Konzentration der Matrixkomponente lassen sich DNS-Fragmente unterschiedlicher Grenklassen auftrennen: Agarosegele mit Konzentrationen zwischen 0,3 und 2 Prozent erzielen eine Auflsung von Fragmenten zwischen 100 bp und 60 kb Lnge. Die Trennschrfe von Polyacrylamidgelen ist erheblich grer, Fragmente zwischen 10 und 1000 bp knnen in Polyacrylamid-Gelen von 3 bis 20 Prozent aufgetrennt werden. Dabei ist die Trennung von Fragmenten mglich, die sich in ihrer Lnge um nur 1 Nukleotid unterscheiden.

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2. Material und Methoden

Tabelle 2.1: Trennbereiche von DNS-Moleklen im Agarosegel Agarosemenge im Gel (% [w/v]) 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0 Trennbereich linearer DNSMolekle (bp) 5000 60.000 1000 20.000 800 10.000 500 7.000 400 6.000 200 3.000 100 2.000

Es besteht eine lineare Beziehung zwischen dem Logarithmus der elektrophoretischen Mobilitt der DNS () und der Gelkonzentration (), die durch die folgende Gleichung beschrieben wird:

log = log Kr
wobei o Kr

(Formel 2.1)

der freien elektrophoretischen Mobilitt der DNS und der Retardierungskoeffizient ist, eine Konstante, die von Gelparametern und der Gre sowie der Form der wandernden Molekle abhngig ist (Sambrook et al. 1989, S. 6.4 f)
Tabelle 2.2: Trennbereiche von DNS-Moleklen im Polyacrylamidgel

Acrylamidmenge (% [w/v])
3,5 5 8 12 15 20

Trennbereich
1000 2000 80 500 60 400 40 200 25 150 6 - 100

Die Porengre von Acrylamidgelen wird nicht nur durch den Gehalt an Acrylamid bestimmt, sondern auch durch den des vernetzenden Agens, des sog. Crosslinkers. Dabei ist die Beziehung Crosslinker-Gehalt zur Porengre nicht linear. Der Einfluss der Acrylamid-Konzentration (T) und dem Crosslinker-Gehalt (C) auf die Porengrsse wird durch die folgende Gleichungen beschrieben:

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2. Material und Methoden

T [%] =

(a + b)100 V

(Formel 2.2)

C[%] =

b 100 a+b

(Formel 2.3)

wobei a = Acrylamidmasse in Gramm b = Crosslinker- (Bisacrylamid oder Piperazindiacrylamid) Masse in Gramm V = Volumen in Millilitern Wenn C konstant bleibt und T zunimmt, nimmt die Porengre ab. Die Porengre folgt einer Parabolfunktion: bei hohen und niedrigen C-Werten sind die Poren gro, das Minimum liegt bei C = 4 %. Wird C grer oder gleich 5 %, werden die Gele brchig. Zur Grenbestimmung der aufgetrennten DNS-Fragmente wird blicherweise ein Grenstandard, ein sogenannter Marker, mit auf das Gel aufgetragen. Dieser besitzt Fragmente bekannter Gre. Ein Vergleich der Wanderungsstrecke eines unbekannten Fragments mit der des Markers erlaubt eine Grenabschtzung. Abhngig von der verwendeten Gelmatrix bieten sich unterschiedliche Frbeverfahren an, entweder mit Ethidiumbromid, das bei Agarosegelen Verwendung findet, oder die Silberfrbung, die vorwiegend bei Acrylamidgelen eingesetzt wird. Die Nachweisempfindlichkeit der Silberfrbung ist wesentlich grer: Mit Ethidiumbromid gelingt der Nachweis von 0,1 ng DNS/mm oder 1-10 Nanogramm pro Bande, mit Silber knnen noch DNS-Mengen von 0,03 Nanogramm/ pro mm oder 15 Pikogramm pro Bande sichtbar gemacht werden (Allen et al. 1989, Bassam et al. 1991). 2.2.3.1 Agarose-Gelelektrophorese Zur Einschtzung des Verlaufs der Polymerase-Ketten-Reaktionen und zur groben Quantifizierung der Amplifizierungsprodukte wurden alle PCR-Reaktionen mit Hilfe von Agarosegelen analysiert (Sambrook et al. 1989; S. 6.3 f). Lsungen: 1 x TAE-Puffer: 0,04 M Tris-Acetat Eisessig 0,001 M EDTA pH 8,0 49

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2. Material und Methoden

1 x TBE-Puffer

89 mM Tris-Base 89 mM Borat 2 mM EDTA pH 8,0 der pH-Wert wurde auf 8,3 mit NaOH oder HCl eingestellt 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylencyanol FF 40 % (w/v) Saccharose in Wasser

6 x Probenauftragspuffer Typ I:

Ethidiumbromid-Lsung: 10 mg/ml (Merck) Verwendete Agarose: Ultrapure Agarose (Gibco BRL) Durchfhrung: Die Agarosekonzentration betrug 3 Prozent, der Laufpuffer war wahlweise 1 x TAE oder 1 x TBE. Die Gele hatten jeweils eine Gre von 144 mm x 138 mm x 8 mm. Zur Anfrbung der DNS-Fragmente wurde Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,5 g/ml zugegeben. Die angelegte elektrische Spannung lag bei 140 Volt, die Laufzeit betrug 90 Minuten. Als Grenstandard diente die 100 bp Leiter (Gibco, BRL). Diese zeigt Banden alle 100 Basenpaare zwischen 100 und 2000 bp. Es wurde jeweils 3,5 l (bei 25 l PCR Gesamtvolumen) oder 5 l (bei 50 l PCR Gesamtvolumen) der PCR-Anstze aufgetragen. Die Gele wurden nach dem Lauf auf dem UV-Tisch (312 nm) fotografiert. Es wurde eine Leica M mit Spezialstativ eingesetzt. Der Film (Ilford HP5) wurde mit Blende 8 und 0,5 - 5 s Verschluzeit und einem Orangefilter (Wratten 25A) belichtet. 2.2.3.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese Fr die Auftrennung der Fragmente des Apolipoprotein B 3' Minisatelliten, des D1S80-Minisatelliten sowie des HumVWA31A Mikrosatelliten wurden Polyacrylamidgele mit konstanter Pufferkonzentration (Sambrook et al. 1989; S. 6.37f.) eingesetzt. Die amplifizierten Fragmente des von-Willebrand Faktor Mikrosatelliten liegen in einem Bereich zwischen 120 und 180 Basenpaaren. Deswegen wurden Polyacrylamidgele mit einer Konzentration von 8 % Acrylamid und 5 % Crosslinker (Piperazindiacrylamid) verwendet. Fr die Apolipoprotein B- und D1S8050

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2. Material und Methoden

Minisatelliten, deren amplifizierte Fragmente im Grenbereich zwischen 350 und ber 1000 bp liegen, kamen Polyacrylamidgele mit einer Konzentration von 6 % Acrylamid und 1,5 % Piperazindiacrylamid zum Einsatz. Lsungen 60 mM Tris-Formiat Puffer pH 8,65: 90 mM Tris-Boratpuffer pH 9,0: 30 % Acrylamid-Stammlsung 0,9 % Piperazindiacrylamid (BioRad Lab.) 10 % Ammoniumpersulfat (frisch angesetzt) TEMED (N-,N-,N-,N-Tetramethylethylendiamin) 6 x Probenauftragspuffer Typ I: 0,25 % Bromphenolblau 0,25 % Xylencyanol FF 40 % (w/v) Saccharose in Wasser 0,6 M Tris-Base 1,88 ml Ameisensure auf 100 ml 0,5 M Tris-Base 0,28 M Borsure

Filterpapier-Streifen Sehr dickes Whatman-Papier wurde in 4-5 cm breite Streifen geschnitten, die Lnge entsprach dabei der Breite des Polyacrylamid-Gels; diese Streifen wurden im Tris-Borat-Puffer getrnkt. Je 2 - 3 Streifen wurden bereinandergelegt und an den Enden direkt auf dem Gel platziert. Auf diesen Filterpapierstreifen kommen nach dem Zusammenbau der Kammer die Elektroden zu liegen, wodurch ein Einbrennen der Elektroden ins Gel verhindert wird.

Durchfhrung Die Glasplatten (200 mm x 260 mm x 4 mm) wurden grndlich gesubert und getrocknet. Die Glasplatte mit den aufgeklebten Abstandshaltern (Dymoband, Dicke 2 x 0,25 mm = 0,5 mm) und Auftragstaschenformern (Dymoband, B 5 x H 7 mm) wurde unter dem Abzug mit RepelSilane (Pharmacia Biotech) behandelt. Auf die andere Platte wurde Gel-Fix Folie (Serva, Heidelberg) gelegt. Dann wurden die Platten zusammengebaut und mit starken Klammern fixiert.

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2. Material und Methoden

Die Gelmischungen wurde wie folgt hergestellt: HumVWA31A Mikrosatellit: 7,9 ml 9,3 ml 3,0 ml 2,2 ml 7,6 ml der 30 %igen Acrylamidlsung, der 0,9 %igen Piperazindiacrylamidlsung, 90 mM Tris-Formiatpuffer, Glycerin sowie destilliertes Wasser

(Gesamtvolumen 30 ml) wurden gemischt. Die Lsung wurde entgast, danach 200 l 10 % iges frisches Ammoniumpersulfat sowie 18 l TEMED dazugegeben, gut gerhrt und das Gel sofort gegossen. Die Polymerisationszeit betrug etwa eine Stunde. Apolipoprotein B 3- und D1S80 Minisatellit: 6,1 ml 3,0 ml 3,0 ml 2,2 ml 15,7 ml der 30 %igen Acrylamidlsung, der 0,9 %igen Piperazindiacrylamidlsung, 90 mM Tris-Formiatpuffer, Glycerin sowie destilliertes Wasser

(Gesamtvolumen 30 ml) wurden gemischt. Die Lsung wurde entgast, danach 200 l 10 %iges frisches Ammoniumpersulfat sowie 18 l TEMED dazugegeben, gut gerhrt und das Gel sofort gegossen. Die Polymerisationszeit betrug etwa eine Stunde. Das Probenauftragsvolumen variierte zwischen 1 und 15 l, abhngig von der im Agarosegel beobachteten Menge des Amplifizierungsproduktes. Die Proben wurden zur Auftrags- und Laufkontrolle mit je 1 l Probenauftragspuffer Typ I gemischt. Nach jeweils 3 bis 4 Proben wurde die entsprechende Allelleiter aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte in einer horizontalen Gelkammer (Multiphor II, Pharmacia Biotech) bei anfnglich 570 V fr 10 Minuten, anschlieend bei konstant 670 Volt, 12 60 Milliampre und 8 - 30 Watt. Das Gel wurde whrend des Laufs auf 5 10 C gekhlt. Die Laufstrecke betrug 20 cm. Das entsprach einer Laufzeit von ungefhr 3 h (HumVWA31A) bzw. 3:30 h (ApoB3 Minisatellit und D1S80). Anschlieend erfolgte eine Silberfrbung (siehe Abschnitt 52

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2. Material und Methoden

2.1.4). Als Grenstandard wurde die 100 bp Leiter (Gibco, BRL) eingesetzt. Diese zeigt Banden alle 100 Basenpaare zwischen 100 und 2000 bp. 2.2.4 Silberfrbung von Polyacrylamidgelen Prinzip Mit Hilfe der Silberfrbung knnen auch sehr geringe DNS Mengen, die im Pikogrammbereich liegen, sichtbar gemacht und nachgewiesen werden (siehe Abschnitt 2.1.3). Lsungen 10 % Ethanol 1 % HNO3 0,2 % AgNO3-Lsung Reducer: 29,6 g Na2CO3 + 540 l 37 % Formalin/Formaldehyd in 1000 ml dH2O (wurde immer frisch angesetzt) 10 % Essigsure 5 % Glyzerin Durchfhrung Das auf der Folie (GelFix) befindliche Gel wurde zunchst fr 5 min in 10 % Ethanol fixiert, danach 3 min in 1 % HNO3 gelegt, zweimal kurz mit destilliertem Wasser gesplt und anschlieend fr 20 min in AgNO3-Lsung. Es folgten zwei erneute kurze Splungen mit destilliertem Wasser und dann die Entwicklung durch Zugabe der Reducer-Lsung. Das Entwickeln dauerte einige Minuten und bei Erscheinen der Banden wurde die Reducer-Lsung gegen frische vertauscht, um die Hintergrundfrbung zu reduzieren. Der Entwicklungsprozess wurde durch Zugabe von 10 % Essigsure (2 min) gestoppt. Danach wurde zweimal gesplt (destilliertes Wasser). Anschlieend wurde das Gel, um es geschmeidig zu machen, fr 10 min in 5 %iges Glycerin gelegt. Abschlieend wurde noch zweimal mit destilliertem Wasser gesplt. Das Gel trocknete ber Nacht und konnte am nchsten Tag auf Cellophan gezogen werden.

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2. Material und Methoden

2.2.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (Mullis et al. 1986, Mullis et al. 1987, Saiki et al. 1985) Prinzip Gegeben ist eine DNS-Zielsequenz bestimmter Lnge. Auerhalb dieser whlt man zwei Oligonukleotide zwischen 18 und ca. 30 Basenpaaren Lnge und in ihrer Sequenz komplementr zur Sequenz der gegenberliegenden, die Primer, aus. Die Ziel-DNS wird durch Hitze in ihre Einzelstrnge geschmolzen (Denaturierungsschritt), dann abgekhlt in Anwesenheit eines berschusses an beiden Primern, freien Desoxyribonukleosid-Triphosphaten und der hitzestabilen Taq-Polymerase (von thermus aquaticus, abgeleitet vom Namen des Herkunfts-Organismus). Die Temperatur, auf die in diesem Schritt, dem sogenannten Annealingschritt, abgekhlt wird, hngt von der Basenzusammensetzung der Primer ab. Die Primer binden an die komplementren Sequenzen der Ziel-DNS und an ihren 3'-Enden werden sie verlngert durch die Taq-Polymerase, und zwar komplementr zur Sequenz der Ziel-DNS (Extensionschritt). So entstehen zwei neue DNS-Strnge, Kopien der Ziel-DNS, die in ihrer Lnge durch die Primerpositionen begrenzt sind. Ein erneuter Denaturierungsschritt, gefolgt vom Annealing- sowie Extensionschritt schliet sich an. Der Zyklus aus Denaturierung, Annealing und Extension wird bis zu 35 Mal wiederholt, wobei die Ziel-DNS vervielfacht wird und schlielich in 235 oder 1x109 Kopien vorliegt (theoretischer Wert, ausgehend von optimalen Amplifizierungsbedingungen). Die tatschliche Vervielfltigungsrate wird begrenzt durch die Stabilitt der Taq-Polymerase, deren Halbwertszeit bei 95 C bei 40 min liegt sowie durch die Verschiebung der Konzentrationsverhltnisse zwischen Primer und Ziel-DNS (Newton & Graham 1994; S. 31; Ivinson 1991). 2.2.5.1 Polymerase-Ketten-Reaktion des Apolipoprotein B 3 Minisatelliten (Boerwinkle

et al. 1989) Lsungen: 10 x PCR Puffer mit 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl und 1,5 mM MgCl2 (Gibco, BRL) 2-Desoxyribonukleosid-5-Triphosphat Lsung: 10 mM (Gibco, BRL). Jedes Desoxyribonukleosid-Triphosphat liegt in der Lsung in einer Konzentration von jeweils 10 mM vor Taq-Polymerase: 5 Units pro Mikroliter (Gibco, BRL)

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2. Material und Methoden

Primer 1: Primer 2:

5'- ATG GAA ACG GAG AAA TTA TG - 3' (20 Nukleotide lang) 5'- CCT TCT CAC TTG GCA AAT AC - 3' (20 Nukleotide lang)

Durchfhrung: Die PCR zur Amplifizierung des Minisatelliten 3' vom Apolipoprotein B Gen wurde nach den Angaben von Boerwinkle et al. (1989) durchgefhrt. In einem Gesamtvolumen von 50 l (spter 25 l) befanden sich: 1x PCR Puffer und 150 M (75 M) dNTPs. Dazugefgt wurden je 20 pM (10 pM) von beiden Primern, und 2,5 U (1,25 U) Taq-Polymerase (Gibco BRL) sowie zum Schluss ungefhr 50 bis 300 ng genomischer DNS. Die Amplifizierung wurde mit 6 Minuten bei 94 C erffnet, danach folgten 30 Zyklen mit der Denaturierung fr 1 Minute bei 94 C, dem Annealing und Extension zusammen bei 58 C fr 3 Minuten. Abschlieend erfolgte ein langer Extensionsschritt bei 58 C fr 10 Minuten. Der Verlauf der PCR sowie die Menge des Amplifizierungsproduktes in jedem Ansatz wurde durch Auftrennung der amplifizierten Fragmente im Agarosegel (3 %, 1x TBE oder TAE, Ethidiumbromidfrbung) bei 140 V fr 30 min kontrolliert. Als Marker wurde die 100 BasenpaarLeiter von Gibco, BRL eingesetzt. Die Identifizierung der Allele erfolgte im nativen Polyacrylamidgel mit anschlieender Silberfrbung (siehe Abschnitt 2.1.4) unter Einsatz einer spezifischen Allelleiter. Allelleiter fr den Apolipoprotein B 3 Minisatelliten Von Herrn Professor B. Brinkmann, Institut fr Rechtsmedizin der Universitt Mnster, wurden mir freundlicherweise isolierte und gereinigte DNS-Lsungen verschiedener Personen mit bekannten ApoB3-Allelen, zur Verfgung gestellt. Aus diesen DNS-Lsungen (Konzentration: jeweils 100 ng/ l) konnten die Allele 33, 35, 37, 47 und 49 amplifiziert sowie anschlieend zu einem Allelgemisch (nachfolgend als Allelleiter bezeichnet) vermengt werden. Von dieser Allelleiter wurde pro Bahn im Polyacrylamidgel 9,5 l aufgetragen. Im Verlauf der Amplifizierungen ergnzte ich diese Allelleiter durch Zugabe weiterer Allele von Individuen aus den rumnischen Populationen, und zwar um die Allele 25, 27, 29, 43 und 51.

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2. Material und Methoden

2.2.5.2

Polymerase-Ketten-Reaktion des D1S80 Minisatelliten (Budowle et al. 1991)

Lsungen 10 x PCR Puffer mit 20 mM Tris-HCl, 50 mM KCl und 1,5 mM MgCl2 (Gibco, BRL) 2-Desoxyribonukleosid-5-Triphosphat Lsung: 10 mM (Gibco, BRL). Taq-Polymerase: 5 Units pro Mikroliter (Gibco, BRL) 50 % DMSO Betain 10 M (Sigma) Primer 1: 5' - GAA ACT GGC CTC CAA ACA CTG CCC GCC G - 3' (28 Nukleotide lang) Primer 2: 5' - GTC TTG TTG GAG ATG CAC GTG CCC CTT GC - 3' (29 Nukleotide lang) Durchfhrung: Die PCR zur Amplifizierung des Minisatelliten D1S80 wurde mit folgenden, geringfgigen Modifikationen nach den Angaben von Budowle et al. (1991) durchgefhrt: 1. Weglassen des 1. PCR-Zyklus mit 3 min bei 94 C, 2. Zugabe von DMSO und Betain. In einem Gesamtvolumen von 25 l befanden sich: 1 x PCR Puffer und 75 M dNTPs. Dazugefgt wurden je 10 pM von beiden Primern, 5 % DMSO, 1 M Betain und 1,25 U Taq-Polymerase (Gibco, BRL) sowie zum Schluss ungefhr 20 bis 200 ng genomische DNS. Amplifizierungsbedingungen: 30 Zyklen mit der Denaturierung fr 1 Minute bei 94 C, Annealing bei 65 C fr 1 Minute und Extension bei 72 C fr 1 Minute. Der Verlauf der PCR sowie die Menge an Amplifizierungsprodukt in jedem Ansatz wurde durch Auftrennung der amplifizierten Fragmente im Agarosegel (3 %, 1x TBE oder TAE, Ethidiumbromidfrbung) bei 140 V fr 30 min kontrolliert. Als Marker wurde die 100 Basenpaar-Leiter von Gibco, BRL eingesetzt. Die Identifizierung der Allele erfolgte im nativen Polyacrylamidgel mit anschlieender Silberfrbung unter Einsatz einer spezifischen Allelleiter (AmpliFLP D1S80 Allelic ladder von Perkin-Elmer, Auftrag 4 l pro Bahn).

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2. Material und Methoden

2.2.5.3 Polymerase-Ketten-Reaktion des HumVWA31A Mikrosatelliten (Kimpton et al. 1992, Promega Technical Manual 5/98) Mit dieser PCR wird die 3. TCTA-Region zwischen den Nukleotiden Nrn. 1640 und 1750 in Intron 40 des humanen vWF-Gens amplifiziert. Fr die Amplifizierung wurde das Gene Print STR System vWA Kit der Firma Promega verwendet. Lsungen (Bestandteile des Gene Print STR Systems vWA) 10 x STR-Puffer mit 100 mM Tris-HCl pH 9, 0,2 mM von jedem dNTP, 1 % Triton X-100, 15 mM MgCl2 2,5 x vWA STR-Primer-Mix: enthielt Primer 1 und 2 zu gleichen Teilen (die genaue Konzentration war im Promega-Beschreibung nicht angegeben) 10 mg/ml BSA (Rinderserum-Albumin)(Merck KGA): 100 mg BSA wurden in 9,5 ml dH2O aufgelst, auf 10 ml aufgefllt und bei 20 C gelagert Primer 1: 5' - CCC TAG TGG ATG ATA AGA ATA ATC - 3' (24 Nukleotide lang)

Primer 2: 5' - GGA CAG ATG ATA AAT ACA TAG GAT GGA TGG - 3' (30 Nukleotide) Durchfhrung Die PCR mit dem kommerziell erhltlichen Paket mit Fertiglsungen (Gene PrintTm STR System von Promega) nach den Angaben im Protokoll des Herstellers durchgefhrt. In einem Gesamtvolumen von 25 l befanden sich: 1 x STR Puffer, 1 x STR-Primer Mischung, 60 g/ l BSA und 0,25 U Taq-Polymerase (Gibco BRL). Zum Schluss wurden jeweils ungefhr 5 bis 20 ng genomische DNS zugegeben. Amplifizierungsbedingungen 1. 96 C - 2 min 2. 10 Zyklen: ramp 50 s auf 94 C - 1 min halten ramp 34 s auf 60 C - 1 min halten ramp 25 s auf 70 C - 1,5 min halten ramp 45 s auf 90 C - 1 min halten ramp 30 s auf 60 C - 1 min halten ramp 25 s auf 70 C - 1,5 min halten

3. 20 Zyklen:

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2. Material und Methoden

Dabei bezeichnen ramp und die nachfolgende Zeitangabe den Zeitraum, in dem das PCRGert auf die danach angegebene Temperatur aufheizen soll. Der Verlauf der PCR sowie die Menge an Amplifizierungsprodukt in jedem Ansatz wurde durch Auftrennung der amplifizierten Fragmente im Agarosegel (3 %, 1x TBE oder TAE, Ethidiumbromidfrbung) bei 140 V fr 30 min kontrolliert. Als Marker wurde die 100 Basenpaar-Leiter von Gibco BRL eingesetzt. Die Identifizierung der Allele erfolgte im nativen Polyacrylamidgel (6 % T, 3 % C) mit anschlieender Silberfrbung unter Einsatz einer spezifischen Allelleiter. Allelleiter fr den Mikrosatelliten im Intron 40 des von-Willebrand-Faktor Gens Von Frau Dr. Augustin vom Institut fr Rechtsmedizin der Universitt Hamburg wurde mir freundlicherweise ein allelischer Cocktail bestehend aus bereits vermischter DNS verschiedener Personen mit bekannten Allelen des HumVWA31A-Mikrosatelliten zur Verfgung gestellt. Diese DNS wurde direkt fr eine Polymerase-Ketten-Reaktion unter den im Abschnitt 2.1.5.3 angegebenen Bedingungen eingesetzt und diente danach unverdnnt als Allelleiter. Pro Bahn wurden im Polyacrylamidgel 4,5 l dieser Allelleiter eingesetzt. Als Allele waren enthalten: 14, 16, 17, 18, 19 und 20. 2.3 Populationsgenetische Methoden bersicht ber die durchgefhrten Analysen Zuerst wurden die Allelfrequenzen sowie die Genotypenhufigkeiten der drei in dieser Arbeit untersuchten Marker ApoB3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A in jeder Populationsstichprobe ermittelt. Diese Hufigkeiten dienten zunchst als Grundlage fr den Vergleich der beiden rumnischen Subpopulationen untereinander hinsichtlich ihrer allelischen und genotypischen Differenzierung bzw. Vergleichbarkeit. Es war beabsichtigt, die rumnischen Subpopulationen bei Vorliegen von Gleichheit zu einer Stichprobe zusammen zu fassen. Anschlieend erfolgte der Vergleich dieser neuen Stichprobe mit der jakutischen Gruppe, ebenfalls basierend auf den Allel- und Genotyphufigkeiten der drei Marker (ApoB, D1S80, HumVWA31A) auf allelische und genotypische Gleich- bzw. Ungleichheit.

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2. Material und Methoden

Als Grundlage fr weitere Tests wurden dann die drei DNS-Marker auf unabhngige Vererbung (linkage equilibrium) untersucht. Danach wurden die erwarteten und beobachteten Heterozygotenraten fr jeden Locus einzeln ermittelt sowie auf das Vorliegen von Hardy-Weinberg Proportionen in den beiden Populationsstichproben getestet. Mit F-Tests wurde analysiert, ob es Hinweise darauf gab, dass in der rumnischen oder der sibirischen Gruppe eine Substrukturierung vorliegt. Zur Ausweitung der Untersuchung der genetischen Beziehung der rumnischen Gruppe im europischen Kontext wurden im nchsten Schritt extern erhobene Daten hinzugezogen: Es waren Allelhufigkeiten aus Rumnien geografisch nahe liegenden Lndern fr die drei Marker (ApoB 3 Minisatellit, D1S80, HumVWA31A). Es konnten Daten von Populationen aus Griechenland, Italien, Ungarn, Deutschland, Kroatien, der Slowakei sowie von Afrikanern eingesetzt werden. Diese dienten der Ermittlung genetischer Distanzen zur rumnischen Stichprobe sowie der Aufstellung von Phylogenien zur Darstellung von Verwandtschaftsverhltnissen. Weiterhin wurden aus der Literatur Allelhufigkeiten von zwei polymorphen DNS-Markern (TH01 und D21S11) sowie vier Blutgruppen-Markersysteme (Antigene: ABO, Rhesus, MNS und Plasmaprotein HP) zur Abstandsanalyse mit den Rumnen herangezogen. Es standen Daten von Italienern, Griechen, Ungarn und Deutschen zur Verfgung. Aus dem Distanzma Delta mu (Goldstein et al. 1995a) wurde auf Basis der drei Marker ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A fr die drei Populationen aus Rumnien und Jakutien der Versuch unternommen, eine Annherung an den Zeitraum der Populationstrennung, die sogenannte Divergenzzeit, zu erhalten. Vorbereitung der erhobenen Daten Zunchst wurde eine Rohdatenliste fr jeden der drei Marker und fr jede Populationsstichprobe angelegt. Ausgehend von diesen Aufstellungen erfolgten die Modifikationen beziehungsweise der Export der Daten in die verschiedenen Programme (siehe Tabelle 2.3). Die Mglichkeiten der meisten Programme zum Import von erhobenen Daten sind durch nicht einheitliche Formate leider bislang nur sehr eingeschrnkt vorhanden. Eine Einigung auf ein

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2. Material und Methoden

Standarddatenformat ist aufgrund der groen Vielfalt der inzwischen existierenden Software und der rasanten Entwicklung neuer Programme in nchster Zeit nicht zu erwarten. Software Die in dieser Arbeit verwendete Software war in allen Fllen (Ausnahme SPSS) ber das Internet und dort kostenfrei zu bekommen, ebenso die dazu gehrigen Anleitungen zur Installation und Benutzung. Tabelle 2.3 gibt einen berblick ber Name, Autor, Fundort sowie verwendete Analysemethode.
Tabelle 2.3: bersicht ber die in dieser Arbeit verwendete populationsgenetische Software
Software, Version - Autor PowerSSR 1.2 Jack Liu TFPGA 1.32 (2/2000) M.P. Miller GENEPOP 3.2.a (5/2000) Raymond & Rousset (1995b) TREEVIEW 1.6.6 Roderic DM Page (2001) PHYLIP 3.5.c J. Felsenstein Fstat for Windows 2.9.3.2 (Febr. 2002) Jerome Goudet SplitsTree 3.2 (Okt. 2002) D.H. Huson SPSS 11.5.1 (Windows) Internet-URL http://www.stat.ncsu.edu/~panzea/powerssr http://bioweb.usu.edu/mpmbio/tfpga.htm Durchgefhrte Analyse Distanz nach Goldstein Heterozygotenraten Mantel-Tests Allelische Differenzierung Genotypische Differenzierung Test auf HW-Gleichgewicht F-Statistiken Darstellung von Phylogenien

http://www.cefe.cnrs-mop.fr/

http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html

http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html Berechnung genetischer Distanzen, Bootstrapping, Cluster-Analyse http:// www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html Allelfrequenzen, http://www-ab.informatik.unituebingen.de/software/splits/welcome_en.html Darstellung von Split-Graphen Exakte Tests

2.3.1 Ermittlung der Allel- und Genotyphufigkeiten Als Allelfrequenz bezeichnet man den relativen Anteil eines Allels in einer Population. Die Genotypenhufigkeit ergibt sich aus der Anzahl der Individuen mit einem bestimmten Genotyp in Relation zur Gesamtanzahl der Individuen in dieser Population.

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2. Material und Methoden

Die Allelhufigkeiten in jeder der drei Populationsstichproben wurde fr jeden Marker einzeln mit dem Programm FSTAT bestimmt. Die Darstellung einer Matrix der ermittelten Genotypen erfolgte mit dem Programm GENEPOP. 2.3.2 Untersuchungen zur Populationsdifferenzierung Zum Vergleich empirisch ermittelter Allel- und Genotypverteilungen verschiedener Populationen, bietet sich ein exakter Test nach Fisher an (Fisher 1954). Dabei werden auf der Basis von R x C Kontingenztafeln (dies sind Tabellen mit R fr row - Populationen und C fr column Allelen) paarweise Vergleiche durchgefhrt. Der Vorteil gegenber dem klassischen Chi-Quadrat Test ist, dass der Fisher-Test auch das Vorkommen geringer Hufigkeiten (< 5) pro Zelle zulsst. Der Vergleich der Allelhufigkeitsverteilungen erfolgte zum einen mit der Software GENEPOP, die einen exakten Fisher-Test nach Raymond und Rousset (1995a) und der Markov-KettenMethode zur Permutierung der Datenstze durchfhrt. Zum anderen wurde zur vergleichenden Analyse der Allelhufigkeiten das Statistikprogramm SPSS, mit einem exakten Test nach Fisher unter Anwendung der konventionellen Monte-Carlo-Methode zur Erzeugung multipler Datenstze, eingesetzt. Der Test auf bereinstimmung der Genotypverteilung in den drei untersuchten Populationen war ein log-likelihood (G-) Exakter Test mit Markov-Ketten-Algorithmus (Goudet et al. 1996). Hierfr wurden Kontingenztabellen gebildet und es erfolgte eine p-Wert Abschtzung mit dem Programm GENEPOP. Die Tests wurden in der folgenden Reihenfolge durchgefhrt: Als erstes wurde berprft, ob die beiden rumnischen Populationsstichproben in ihrer Allelhufigkeits- und Genotypenverteilung bereinstimmen. Bei signifikanter Homogenitt der Allel- und Genotypenverteilungen fr jeden Genort wurden diese zusammengefasst (gepoolt) zu einer einzigen Stichprobe. Anschlieend sollte diese Stichprobe mit der jakutischen Populationsstichprobe verglichen werden und zwar ebenfalls nach dem obigen Schema (Exakter Test nach Fisher ber Kontingenztafeln zum Vergleich der Allelfrequenzen und Genotypenhufigkeiten mit SPSS und GENEPOP).

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2. Material und Methoden

2.3.3 berprfung auf Kopplungsungleichgewicht (linkage-disequilibrium) der Marker Die berprfung auf Vorliegen eines Kopplungsungleichgewichtes in Bezug auf bestimmte Genotypen-Kombinationen ist sinnvoll um sicher zu stellen, dass die untersuchten Genorte unabhngig voneinander vererbt werden. Treten bestimmte Genotypen-Kombinationen berzufllig hufig auf, dann ist eine physikalischer Nhe und eine damit verbundene gekoppelte Vererbung dieser Marker wahrscheinlich. Da die in dieser Untersuchung verwendeten DNS-Marker auf verschiedenen Chromosomen liegen, war eine Kopplung nicht anzunehmen. Das Programm GENEPOP fhrte diesen Test auf der Basis des exakten Fisher Tests, mit Bildung von Kontingenztafeln und dem Markov-Ketten Algorithmus, durch. 2.3.4 Erwartete und beobachtete Heterozygotenraten Der Heterozygotenanteil ist die Summe der Hufigkeiten der heterozygoten Individuen fr jeden einzelnen Genort innerhalb einer Population. Es wird unterschieden zwischen dem in einer Studie beobachteten (Hobs, von observed) und dem erwarteten (Hexp von expected) Heterozygotenanteil. Der erwartete ist der unter Annahme von Hardy-Weinberg Hufigkeiten berechnete - also der theoretische Anteil.
k i= j

H exp = 1

pi

(Formel 2.4)

Beide Werte werden miteinander verglichen. Bei Abweichung des beobachteten vom theoretischen Wert kann dies auf Strungen des Hardy-Weinberg-Gleichgewichtes aufgrund von Inzuchtprozessen, eingeschrnkter Partnerwahl etc. hinweisen. Stimmt die beobachtete mit der erwarteten Hufigkeit berein, dann befindet sich die Population im Hardy-Weinberg Gleichgewicht: es handelt sich um eine vollstndig panmiktische Population. Ist Hobs > Hexp, beobachtet man also mehr Heterozygote, als erwartet, deutet das auf sogenanntes outbreeding, also eine Paarung zwischen berwiegend nicht-verwandten Individuen weiter entfernt liegender Populationen hin. Hobs< Hexp (weniger heterozygote Individuen, als erwartet) kann ein Inzuchtverhalten (inbreeding) oder eine eingeschrnkte Partnerwahl (assortive mating) nachweisen. 62

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2. Material und Methoden

Fr die rumnische Population werden im Prinzip keine Strungen des Hardy-Weinberg Gleichgewichtes erwartet, fr die Jakuten liegen Hinweise auf solche Strungen vor (siehe Abschnitt 1.12), die mit den folgenden Untersuchungen (F-Tests, Heterozygotenraten, Test auf Vorliegen von Hardy-Weinberg Proportionen) berprft werden sollten. Die beobachteten und die erwarteten Heterozygotenraten fr jeden Marker und jede Population einzeln berechnete die Software TFPGA. 2.3.5 Hardy-Weinberg Gesetz Die Grundlage der Populationsgenetik bildet das Hardy-Weinberg Gesetz, das fast zeitgleich, aber doch unabhngig von dem Englnder G. H. Hardy und dem deutschen Arzt W. Weinberg (Weinberg 1909, Hardy 1908) entwickelt wurde: Es besagt, dass die Hufigkeit von homo- und heterozygoten Genotypen in einer Population ber Generationen hinweg konstant bleiben, wenn die folgenden Bedingungen erfllt sind: * Der Organismus ist diploid und vermehrt sich sexuell; * er gibt keine Selektion bestimmter Allele; * es kommt kein Genaustausch durch Migration vor; * Mutationen finden nicht statt; * weiterhin handelt es sich um eine unendlich groe Population mit freier Partnerwahl (random mating). Die mathematische Beschreibung dieser Gesetzmigkeit kann zur Berechnung der Frequenz der drei Genotypen AA, Aa und aa nach bereits einer Generation dienen und hat die folgende Formel: p + 2pq + q = 1 (Formel 2.5) wobei die Frequenz des Genotyps AA = p, des Genotyps Aa = 2pg sowie von aa = q Werden in einer Population Abweichungen von den (vorausgesagten) Genotypfrequenzen beobachtet, kann die auf eine nderung der idealisierten Bedingungen des Hardy-Weinberg Ge-

63

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2. Material und Methoden

setztes (siehe oben) zurckgefhrt werden. Das kann durch Einflsse wie z.B. Drift, Vorkommen von Mutationen etc. hervorgerufen werden. Die Anwendung der goodness-of-fit- Tests, wie der Chi-Quadrat- oder G-Test, zur berprfung auf Vorliegen der Hardy-Weinberg Frequenzen haben den Nachteil, dass bei niedrigen Genotyphufigkeiten ein sogenanntes Poolen dieser Genotypen stattfinden muss. Dieses Verfahren fhrt zu Informationsverlusten, weswegen die Anwendung exakter Tests fr kleine Stichprobengren vorgezogen wird. In dieser Arbeit wurde die Untersuchung auf signifikante Abweichungen der fr jeden Marker beobachteten Genotypenhufigkeiten von den nach dem Hardy-Weinberg Gesetz erwarteten Hufigkeiten fr jede Population einzeln mittels eines Exakten Tests - basierend auf dem von Haldane (1954) entwickelten - mit dem Programm GENEPOP durchgefhrt. Dabei wurden multiple Datenstze mit der im Programm implementierten Markov-Ketten-Methode erzeugt (Guo & Thompson 1992). 2.3.6 F-Statistiken Genauere Aussagen ber die Prozesse, die zu Strungen des Hardy-Weinberg Gleichgewichtes in einer Population fhren, sind durch die Ermittlung der sogenannten F- (Fixations-) Indizes (Wright 1951, Nei 1987, Weir & Cockerham 1984) mglich. Diese Indizes geben einen Eindruck ber den Verlust von Heterozygoten, also an genetischer Variation. Im Falle der Unterteilung einer Population in Subpopulationen fhrt dies zu einer geringeren Individuenzahl fhrt und hier wirkt sich genetische Drift strker aus. Die Basis fr die Berechnung der verschiedenen F-Indizes sind die Heterozygotenraten (siehe Abschnitt 2.3.4). Es wird jeweils ermittelt, ob es in der untersuchten Population bzw. den Subpopulationen einen berschuss oder ein Defizit an heterozygoten Individuen gibt. Inzucht fhrt zu einem Anstieg des Anteils an homozygoten Individuen in einer Population und damit zu einem positiven F-Wert. Selektives Paarungsverhalten (assortive mating) fhrt ebenfalls zu Strungen des Hardy-Weinberg Gleichgewichtes und hat einen hnlichen Effekt wie Inzuchtverhalten: Der Homozygotenanteil steigt und man erhlt positive F-Werte. Selektive 64

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2. Material und Methoden

Paarung liegt vor, wenn aufgrund phnotypischer Eigenschaften, wie beispielsweise der Krpergre, bestimmte Partner in der Paarung vorgezogen werden. Ist eine Population (breeding population) in Subpopulationen aufgeteilt, in denen jeweils die Genotypen in Hardy-Weinberg Proportionen vorliegen, liegt insgesamt gesehen der Homozygoten-Anteil hher, als die Hardy-Weinberg Anteile es erwarten lassen. Diese Eigenschaft erkannte und beschrieb Wahlund (1928), sie heit Wahlunds Prinzip. Wright fhrte drei F-Indizes ein, FIS, FIT und FST ein, die die Korrelationen der Allele auf verschiedenen Ebenen einer Population darstellen und zusammengenommen die Quantifizierung genetischer Substrukturierung in Populationen erlauben (Wright 1951). Nei (1987) konnte zeigen, dass alle drei F-Indizes durch das Verhltnis der beobachteten und erwarteten Heterozygotenraten definiert werden knnen. Man betrachtet dabei eine Population, die in s Subpopulationen unterteilt ist. Die Berechnung der F-Indizes nach Nei (1987) stellt sich wie folgt dar: FIS =

HS HI HS HT HS HT HT HI HT

(Formel 2.6)

FST =

(Formel 2.7)

FIT =

(Formel 2.8)

wobei HI = mittlere beobachtete Heterozygotenrate der Individuen HS = erwartete Heterozygotenrate (auch gene diversity genannt) der Subpopulation HT = erwartetete Heterozygotenrate der Gesamtpopulation (total population) FIS wird auch als inbreeding-Koeffizient bezeichnet. Dieser erfasst die genetische Variation in Individuen, relativ zur Variation in (ihrer) Subpopulation. Die nach der Formel 2.6 berechneten Werte von FIS liegen zwischen +1 und 1. Ein negativer FIS-Wert steht fr hhere Werte der beobachteten Heterozygotenraten, verglichen mit Hardy-Weinberg Proportionen. Das deutet auf outbreeding-Verhalten (Paarung mit Individuen aus einer anderen Population) hin. Positive FIS65

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2. Material und Methoden

Werte, die einen Heterozygotendefizit anzeigen, erhlt man aufgrund von Inzuchtverhalten (inbreeding). FST ist der wahrscheinlich wichtigste Index zur Ermittlung der Substrukturierung von Populationen. Dieser ermittelt die genetische Variation in Subpopulationen im Verhltnis zur genetischen Variation der Gesamtpopulation. Der nach der Formel 2.7 errechnete Wert fr FST kann nicht negativ sein, sondern liegt zwischen 0 und 1. Werte nahe 0 bedeuten, dass alle Subpopulationen dieselben Genotypenfrequenzen haben (es findet also relativ uneingeschrnkter Genflu statt). Ein FST-Wert von Null reprsentiert demnach eine praktisch vollstndig panmiktische Population ohne Substrukturierung. Dahingegen bedeutet ein FST-Wert von 1 eine vollstndige Unterteilung der untersuchten Population in Subpopulationen, zwischen denen kein Genfluss stattfindet. FST-Werte zwischen 0 und 0,05 bedeuten eine geringe, 0,05 bis 0,15 eine moderate, 0,15 bis 0,25 eine groe und FST-Werte > 0,25 eine sehr groe genetische Differenzierung der untersuchten Population (Hartl & Clark 1997). FST-Werte werden auch als genetische Distanz eingesetzt. Der Index FIT bestimmt die genetische Variation der Individuen relativ zur genetischen Variation in der Gesamtpopulation. Er wird selten benutzt. In dieser Arbeit wurden die Werte fr FIS und FST mit dem Programm GENEPOP errechnet. 2.3.7 Abstandsanalysen der rumnischen Populationsstichprobe zu europischen und der sibirischen Population anhand der Marker ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A Zunchst wurden die im Rahmen dieser Arbeit erhobenen Allelfrequenzen der drei Marker eingesetzt, um Vergleiche mit anderen europischen Populationen ziehen zu knnen. Dafr wurden die den Rumnen geografisch benachbarten Populationen ausgewhlt sowie Daten von Afrikanern, als eine sehr weit entfernt liegende Population. In der Literatur fanden sich zu den in der Tabelle 2.4 aufgelisteten Populationen Daten fr alle drei Markersysteme. Diese sind mit ihrer Literaturfundstelle und dem Umfang der Populationsstichprobe angegeben.

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2. Material und Methoden

Tabelle 2.4: Populationen, die aus der Literatur zur Berechnung der genetischen Distanzmae herangezogen wurden (Marker: ApoB 3, D1S80, HumVWA31A), ihre Populationsgre (Anzahl der Individuen) sowie ihre Fundstellen. Population Griechen Marker HumVWA31A D1S80 Minisat. ApoB 3 Minisat. Italiener HumVWA31A D1S80 Minisat. ApoB 3 Minisat. Ungarn HumVWA31A D1S80 Minisat. ApoB 3 Minisat. Deutsche HumVWA31A D1S80 Minisat. ApoB 3 Minisat. Kroaten HumVWA31A D1S80 Minisat. ApoB 3 Minisat. Slowaken HumVWA31A D1S80 Minisat. ApoB 3 Minisat. Afrikaner HumVWA31A D1S80 Minisat. ApoB 3 Minisat. Populationsgre Referenz (Individuen) 482 Kondopolou et al. (1999) 490 100 118 103 158 244 189 222 130 378 505 196 100 100 107 100 100 100 101 93 Kondopolou et al. (1999) De Benedictis et al. (1994) Piccinini et al. (1997) Falcone et al. (1995) De Benedictis et al. (1997) Furedi et al. (1995) Budowle et al. (1996) Woller et al. (1995) Hantschel et al. (1999) Huckenbeck et al. (1996) Pltl et al. (1996) Martinovic et al. (2001) Drmic et al. (1998) Drmic et al. (1998) Hou et al. (1998) Kadasi et al. (1994) Kadasi et al. (1994) Brinkmann et al. (1996) Wolfarth et al. (2000) Destro-Bisol et al. (1994)

2.3.8 Abstandanalysen der rumnischen Populationsstichprobe zu europischen und der sibirischen Population anhand weiterer polymorpher autosomaler Marker Um die Aussagekraft ber die osteuropischen Populationsbeziehungen zu erhhen, wurden weitere genetische Marker aus der Literatur fr die Abstandsanalysen eingesetzt. Dabei war die Verfgbarkeit von Daten fr alle Arten von genetischen Markersystemen, insbesondere fr osteuropische Gruppen, sehr begrenzt. So konnten fr die in den weiteren Unter67

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2. Material und Methoden

suchungen - die verwendeten Gruppen und Markersysteme sind in Tabelle 2.5 aufgefhrt nur Populationen aus insgesamt fnf europischen Staaten verwendet werden. Es wurden die Allelfrequenzen von zwei Mikrosatelliten D2S11 sowie TH01 sowie von vier BlutgruppenMarkern (ABO-System, Rhesus-System, MNS- und Haptoglobin-System) zur Ermittlung der genetischen Distanzen nach Nei (1972), Cavalli-Sforza & Edwards (1967) und nach Reynolds et al. (1983) mit der Software PHYLIP eingesetzt. Aus diesen Distanzmatrices wurden mit der UPGMA-Methode (PHYLIP) phylogenetische Baumdarstellungen (TREEVIEW) sowie Splitgraphen (SPLITSTREE) dargestellt. Zustzlich wurden die Populationen paarweise und fr jeden Marker einzeln ber Kontingenztafeln mit dem exakten Fisher-Test verglichen unter Anwendung der konventionellen Monte-Carlo-Simulation zur Erzeugung multipler Datenstze (SPSS). Tabelle 2.5: Populationen, die aus der Literatur zur Berechnung genetischer Distanzen herangezogen wurden (weitere Marker), ihre Populationsgre (Anzahl der Individuen) sowie Fundstellen.
Markersystem Population Populationsgre Referenz
Deutsche Griechen TH01 Ungarn Italiener Rumnen Deutsche Griechen D21S11 Ungarn Italiener Rumnen Deutsche Griechen ABO Ungarn Italiener Rumnen Deutsche Griechen Rhesus Ungarn Italiener Rumnen 7373 585 1040 4900 272 210 109 350 3115 272 148.801 5961 9412 39.991 10691 41.449 8420 7733 27.005 935 Walter & Danker-Hopfe (1993) Huckenbeck & Scheil: DNA-PCR Polymorphismen Datenbank (1998-2003) zugnglich ber das Internet

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2. Material und Methoden

Markersystem Population Populationsgre Referenz


Deutsche Griechen MNS Ungarn Italiener Rumnen Deutsche Haptoglobin (HP) Griechen Ungarn Italiener Rumnen 35.560 8420 2702 20.142 34 81.397 8967 19.926 16.956 10.690 Walter & Danker-Hopfe (1993)

2.3.8.1 Genetische Abstandsmae In der Untersuchung der Beziehungen zwischen Populationen spielen genetische Abstandsmae eine wichtige Rolle: Sie quantifizieren mit einem einzigen Wert den Abstand, der sich aus der Verrechnung empirisch ermittelter Daten ergibt und beziehen dabei je nach Abstandsma evolutionre Krfte mit, z.B. Drift, Mutationen. Die Merkmale, die eine Population charakterisieren, knnen sehr verschiedenartig sein. Ende der sechziger Jahre wurden berwiegend Proteinvarianten ermittelt. Mit der Entwicklung neuer molekulargenetischer Techniken wendete sich das Interesse mehr und mehr anderen molekulargenetischen Markern zu: Zum Beispiel den Restriktions-Fragment-Lngen Polymorphismen (RFLPs), den Mini- und Mikrosatelliten, Sequenzdaten und den sogenannten Single-nuclear-polymorphisms (SNPs). Fr einige der Markersysteme wurden spezifische Distanzmae entwickelt, die den Besonderheiten des jeweiligen Markersystems Rechnung tragen: Beispielsweise werden fr die Auswertung von Sequenzdaten andere genetische Modelle zugrunde gelegt, als fr Daten von Minisatelliten, da die evolutive Entwicklung anderen Gesetzen gehorcht. Zustzlich wurden mathematische Modelle aufgestellt, die den Einflssen der verschiedenartigen evolutionren Krften gerecht werden. Als besonders schwierig erweist sich die Behandlung von Mini- und Mikrosatelliten-Daten, da der Mutationsmechanismus, der zur Lngenvernderung fhrt, bis heute nicht eindeutig geklrt ist und wahrscheinlich auch zwischen den verschiedenen Arten von Markersystemen deutlich variiert. Zustzlich erschweren Punktmutationen in den Wiederholungseinheiten die Erklrung und mathematische Erfassung der Variation durch einfache Modelle.

69

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2. Material und Methoden

Es gibt rein geometrische Distanzmae, denen kein biologisches Modell zugrunde liegt, wie z.B. Cavalli-Sforzas Distanz (Cavalli-Sforza & Edwards 1967) oder Rogers Distanz (Wright 1978). Fr andere genetische Abstandsmae gelten spezielle Mutationsmechanismen fr Mikrosatelliten. Zum Beispiel wurde delta mu (Goldstein et al. 1995a) auf der Grundlage des stepwisemutation Modell entwickelt. Ein pragmatischer Engpass in der Auswahl der zu verwendenden genetischen Distanz ergibt sich aus der Tatsache, dass die zur Verfgung stehende Software je nach Autor nur bestimmte Distanzberechnungen zulsst. Erschwerend kommt hinzu, dass in dieser Arbeit die Bestimmung genetischer Distanzen auch fr solche Populationen beabsichtigt ist, fr die die Daten nicht selbst erhoben wurden. Da bei der berwiegenden Anzahl der Programme die Eingabe der individuellen Genotypen erwartet wird, waren viele der Programme nicht zu verwenden, denn es werden berwiegend Allelfrequenzen publiziert. Es kam zur vergleichenden Analyse von nicht selbst erhobenen Daten, genauer gesagt von Allelfrequenzen, nur das Programmpaket PHYLIP infrage. Dieses berechnet die genetischen Abstnde nach Nei (1972), Cavalli-Sforza und Edwards (1967) sowie Reynolds et al. (1983). Zustzlich wurde fr die Daten der rumnischen und der sibirischen Populationsstichprobe die genetische Distanz nach Goldstein et al. (1995a) mit der Software POWERSSR ermittelt. Diese erlaubt die Berechnung von Divergenzzeitpunkten. Fr die folgenden Distanzmae gilt in den Populationen X und Y , in denen Xu und Yu die Frequenzen des u-ten Allels in der ersten bzw. zweiten Population darstellen:

Nei' s genetische Distanz (Nei 1972):

Da = ln(

Jxy ) JxJy

(Formel 2.9)

Cavalli-Sforza & Edwards' Distanz (1967):

Dch =

2(1

XuYu )

(Formel 2.10) 70

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2. Material und Methoden

Reynolds Distanz (Reynolds et al. 1983):

w =

( Xu Yu ) 2 e (1 u XuYu )
e u

(Formel 2.11)

Distanz nach Goldstein et al. (1995a)

( ) = ( x y )
2.3.8.2 Verfahren der Clusterbildung

(Formel 2.12)

Der Begriff cluster kommt aus dem Englischen und bedeutet Gruppe. Es handelt sich bei der Clusterbildung um Verfahren, die aus einer Anzahl ungeordneter Objekte oder Individuen (operational taxonomic units, OTU) Gruppen bilden. Diese setzen sich aus hnlichen Individuen zusammen. Die Klassifizierung nach hnlichkeit wird mit mathematischen Algorithmen berechnet, die die zu untersuchende Eigenschaft (z.B. genetische Distanzen auf der Basis von Sequenzdaten oder gemeinsamen Genotypen) fr zwei Individuen paarweise auf hnlichkeit beurteilt. Anschlieend wird bei groer hnlichkeit aus beiden Individuen (OTUs) eine Gruppe gebildet. Fr dieses Cluster wird nun eine mittlere hnlichkeit berechnet und anschlieend mit der des nchsten Individuums/Objektes verglichen. Dabei ist die hnlichkeit innerhalb der Gruppen immer grer als zwischen den Gruppen. hnliche Individuen haben also einen geringeren Abstand, als weniger hnliche. Die grafische Darstellung des Ergebnisses einer Clusteranalyse in eindimensionaler Form sind phylogenetische Bume oder Cladogramme. Unterformen davon sind sog. Additive Bume und Ultrametrische Bume (oder Dendrogramme). In additiven Bumen ist durch die Astlnge Information ber den genetischen Abstand der OTUs gegeben. Ultrametrische Bume zeichnen sich dadurch aus, dass alle Spitzen von der Wurzel des Baumes gleich weit entfernt sind. Ein weiteres wichtiges Merkmal ist, ob ein Baum mit Wurzel (rooted tree) oder ohne Wurzel (unrooted tree) dargestellt wird. Im ersten Fall eines rooted tree enthlt der Baum Informationen ber den gemeinsamen Vorgnger aller abzweigenden ste und eine evolutionre Richtung. 71

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2. Material und Methoden

Weiter von der Wurzel entfernt liegendere Knoten entsprechen zeitlich jngeren Trennungsereignissen. Ungewurzelten Bumen hingegen sind keinerlei Aussagen ber zeitliche Relationen zu entnehmen. Um von paarweisen Distanzwerten zu evolutionren Baumdarstellungen zu gelangen, existieren eine Reihe von Methoden: Unter Anwendung der UPGMA-Methode (Sneath & Sokal 1973; unweighted pair-group method using an arithmetic average) wird zunchst das Cluster mit dem kleinsten/geringsten Abstand zueinander gesucht. Es wird dann ein neues Cluster erstellt und der mittlere Abstand zwischen den zwei Clustern, ber das Mittel aller paarweisen Distanzen der in dem Cluster enthaltenen Individuen, bestimmt. Die UPGMA-Methode setzt voraus, dass sich alle Sequenzen oder Gene der untersuchten Gruppe mit der gleichen Evolutionsrate entwickeln. Damit entsteht schlielich ein gewurzelter evolutiver Baum (rooted tree). Diese Methode ist sehr anfllig fr ungleiche Evolutionsraten, d.h. wenn einer oder mehrere OTUs mehr Mutationen pro Zeiteinheit anhufen, als andere in der Analyse vertretene OTUs, kann das zu einem Baum mit einer ganz falschen Topologie fhren. Das sogenannte Neighbor-Joining Verfahren (Saitou & Nei 1987) entwickelt einen phylogenetischen Baum auf Basis einer Distanzmatrix mit der grundlegenden Idee, dass hier die Individuen eines Clusters nicht nur einander sehr nah sind, sondern auch von den anderen sehr weit entfernt liegen. Dies fhrt zu einem wurzellosen Baum (unrooted tree), der also keine Angaben ber phylogenetisch ltere und jngere OTUs macht. Fr die in dieser Arbeit erhobenen Distanzdaten wurde die Clusteranalyse nach der UPGMAMethode mit dem Programmpaket PHYLIP in Kombination mit dem bootstrap-Verfahren (siehe Abschnitt 2.3.8.4) durchgefhrt. 2.3.8.3 Grafische Darstellung von Phylogenien Fr die anschauliche Prsentation der Ergebnisse einer Clusteranalyse bieten sich verschiedene Darstellungsformen an. Eine hufig benutzte Art der Darstellung sind phylogenetische Bume oder Dendrogramme. Diese geben die genetischen Distanzen zwischen den untersuchten Taxa eindimensional wieder. Die Darstellung sogenannter Netzwerke oder Split-Graphen beruhen auf der Methode der Splitzerlegung (split decomposition: Bandelt & Dress 1992). Es sind zwei72

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2. Material und Methoden

dimensionale Abbildungen, die gegenber Dendrogrammen den Vorteil haben, dass sie mehr Information darzustellen vermgen. Dies ist wichtig, wenn durch die Darstellung der nur dichotomen Verzweigungen eines Baumdiagramms wichtige zustzliche Informationen zur Beziehung der Taxa untereinander verloren gehen. Das Verfahren der Splitzerlegung eignet sich insbesondere zur Einbeziehung inkompatibler Merkmalsausprgungen. Die Netzwerkdarstellung macht Konfliktpunkte zwischen den OTUs dadurch deutlich, dass keine die OTUs nicht durch direkte Linien miteinander verbunden sind. Hier wurden die Programme SPLITSTREE (Huson 1998), das Splitgraphen darzustellen vermag und TREEVIEW zur Baumdarstellung der UPGMA-Analyse eingesetzt. 2.3.8.4 Das Bootstrap-Verfahren Dieses Verfahren (Felsenstein 1985) - ebenso wie das sogenannte jackknifing - dient dazu, aus einer Populationsstichprobe neue Stichproben zu erzeugen. Die Alternative einer erneuten echten Probensammlung mit dem Zweck der Erhhung der Anzahl der Beobachtungen und somit der Validitt der Aussage ist in den meisten Fllen aus pragmatischen und pekunren Grnden nicht durchfhrbar. Bei der bootstrap-Methode dagegen wird, ausgehend von der vorhandenen Stichprobe eine Pseudostichprobe durch zuflliges Herausziehen und Zurcklegen erzeugt; ein Prozess, der vielfach - meist durch Computerprogramme wiederholt wird. Auch die jackknife-Methode (Eliminierungsmethode), bildet aus dem originalen Datensatz zufllige Replikate, diese aber unter Auslassung einer oder mehrerer Beobachtungen. Die Anwendung der jackknife-Methode macht dann Sinn, wenn sehr umfangreiche Datenstze analysiert werden sollen, da diese beim bootstrapping zu sehr langen Rechenzeiten des Computers fhren. Unter Einsatz des bootstrap-Verfahrens bei der Konstruktion von phylogenetischen Bumen werden aus der dem Baum zugrunde liegenden Distanzmatrix multiple Matrizen erzeugt. In der (grafischen) Baumdarstellung findet sich an den Verzweigungen (Knoten) die bootstrap-Werte wieder, also die Hufigkeit, mit der genau diese Topologie/Verzweigung in allen bootstrapBumen erscheint. Diese Werte spiegeln also die Robustheit des bootstrap-Baumes wieder, sind aber kein Indiz fr dessen Korrektheit.

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2. Material und Methoden

Es wurden mit dem Programm SEQBOOT (PHYLIP) zunchst 1000 Replikatdatenstze der Allelfrequenzen mit der Methode des bootstrapping erstellt. Anschlieend wurden ber das Programm GENDIST (PHYLIP) jeweils 1000 Distanzmatrices generiert, aus der die Programmroutine NEIGHBOR (PHYLIP) eine entsprechende Anzahl phylogenetischer Bume nach dem UPGMA-Algorithmus erstellte. Ein resultierender Konsensus-Baum wurde ber CONSENSE (PHYLIP) unter Anwendung der 50 % Mehrheitsregel (50 % majority rule) ermittelt. Das Programm SPLITSTREE fhrte ebenfalls ein bootstrapping durch. 2.3.9 Paarweiser Populationsvergleich mit Exakten Tests (SPSS) Die Allelfrequenzen der Rumnen der Marker ApoB3 Minisatellit, D1S80, HumVWA31A, FGA, TH01, D2S11 sowie der 4 Blutgruppenmarkersysteme wurden ber einen exakten FisherTest mit SPSS paarweise mit anderen Populationen verglichen. Es handelt sich bei den zum Vergleich eingesetzten Populationen um die in den Tabellen 2.4 und 2.5 aufgefhrten. Es wurden vom Programm multiple Datenstze mit der Monte-Carlo Methode erstellt (je 10.000 Replikatdatenstze). 2.3.10 Paarweiser Populationsvergleich der Allelfrequenzverteilungen mit Mantel-Tests Der Test nach Mantel (1967) dient dem Vergleich zweier Matrices und untersucht, ob ein signifikanter Zusammenhang zwischen ihnen besteht. Das Mantel-Testverfahren kann zum Vergleich von Allelfrequenzen eingesetzt werden. Man erhlt damit eine Vorstellung ber die Korrelation der Verteilung der Allelhufigkeiten. Der Mantel-Test wurde hier mit dem Programm TFPGA, das eine vielfache Permutation des ursprnglichen Datensatzes einsetzte (999 Permutationen), durchgefhrt. Die Voraussetzung war, dass die Allelfrequenzen in die Form einer fr das Programm TFPGA akzeptablen Matrix gebracht wurden. Das wurde durch die paarweise Anordnung der Allelfrequenzen (nach Populationen) erreicht. Das Programm TFPGA fhrte den Mantel-Test

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2. Material und Methoden

2.3.11 Der Mantel-Test zum Vergleich der Eignung der verwendeten genetischen Distanzmae Das Mantel-Testverfahren mit der Software TFPGA wurde auerdem eingesetzt, um die Korrelation der auf verschiedenen Abstandsmaen beruhenden Distanzmatrices zu ermitteln. 2.3.12 Abschtzung der Divergenzzeit zwischen Populationen mithilfe genetischer Distanzen Goldstein et al. (1995a) entwickelten eine auf dem stepwise-mutation Modell beruhende genetische Distanz, die im bestimmten Rahmen einen linearen Zeitbezug aufweist. Darber lsst sich eine grobe Zeitabschtzung zu Populationsauftrennungen unter der Prmisse durchfhren, dass die betrachteten Populationen voneinander seit langer Zeit isoliert sind

( ) = 2t
wobei

(Formel 2.13)

die Mutationsrate fr den jeweiligen Marker und t die Anzahl der Generationen seit der Populationsdivergenz ist.

t kann nach der Formel

t=
berechnet werden.

( ) 2

(Formel 2.14)

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3. Ergebnisse

3.

ERGEBNISSE

3.1 Vergleich der beiden rumnischen Populationsstichproben Zunchst sollten die beiden rumnischen Stichproben daraufhin verglichen werden, ob sich zwischen beiden Gruppen signifikante Unterschiede fr die drei untersuchten Marker zeigen. Dieser Vergleich wurde auf der Basis der Allelhufigkeiten sowie der Hufigkeiten der detektierten Genotypen fr jeden Marker einzeln durchgefhrt. 3.1.1 Ermittlung der Allelhufigkeiten Die fr beide rumnischen Populationsstichproben errechneten Allelhufigkeiten sowie die entsprechende Allelanzahlen fr alle drei Marker sind in den Tabellen 3.1 bis 3.3 wiedergegeben. Als Histogramme dargestellt finden sich diese Werte vergleichend fr beide Gruppen in den Abbildungen 3.1 bis 3.3 wieder.
Tabelle 3.1: Allelfrequenzen des ApoB 3 Minisatelliten in den rumnischen Populationen aus Bukarest und Ploiesti (FSTAT) Rumnen Rumnen ApoB 3' Ploiesti Minisatellit Bukarest Allel* Allelanzahl rel. Hufigkeit Allelanzahl rel. Hufigkeit 21 2 0,006 0 0,000 25 5 0,015 3 0,014 27 18 0,053 12 0,058 29 9 0,027 7 0,034 31 6 0,018 2 0,010 33 8 0,024 11 0,053 35 85 0,254 64 0,308 36 1 0,003 0 0,000 37 132 0,394 66 0,317 39 20 0,059 5 0,024 41 7 0,021 5 0,024 43 1 0,003 0 0,000 45 2 0,006 4 0,019 47 10 0,030 6 0,029 48 0 0,000 1 0,005 49 22 0,065 14 0,067 51 6 0,018 4 0,019 53 2 0,006 3 0,014 55 0 0,000 1 0,005 Summe 336 1,002 208 1,000 * Allele sind als Anzahl der Wiederholungseinheiten angegeben

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3. Ergebnisse

Allel 37 stellt in beiden Populationen das am hufigsten auftretende Allele mit 39,4 % (Bukarest) respektive 31,7 % (Ploiesti) dar. Am zweithufigsten findet sich in beiden Gruppen Allel 35. Allel 49 erreichte mehr als 6 % in beiden Gruppen (6,5 Bukarest bzw. 6,7 % Ploiesti), Allel 27 ist ebenfalls relativ hufig vertreten mit 5,3 % (Bukarest) und 5,8 % (Ploiesti). Die Hufigkeit aller brigen Allele liegt in beiden Populationsstichproben unter 5 %, mit Ausnahme des Allels 39, das bei den Bukarester Rumnen eine Hufigkeit von 5,9 % erreicht (gegenber nur 2,4 % in der Gruppe aus Ploiesti).

ApoB 3' Minisatellit


0,4 0,35 0,3 rel. Hufigkeit 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
21 27 31 35 37 41 45 48 51 55

Rum. Bukarest Rum. Ploiesti

Allel (Repeatanzahl)

Abbildung 3.1 : Histogramm zur Darstellung der Allelhufigkeiten des ApoB 3 Minisatelliten in den rumnischen Populationen aus Bukarest und Ploiesti

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3. Ergebnisse

Tabelle 3.2: Allelfrequenzen des D1S80 Minisatelliten in den rumnischen Populationen aus Bukarest
und Ploiesti (FSTAT). D1S80 Rumnen Rumnen Minisatellit Bukarest Ploiesti Allel* Allelanzahl rel. Hufigkeit Allelanzahl rel. Hufigkeit 14 0 0,000 1 0,005 15 1 0,003 0 0,000 17 3 0,010 2 0,010 18 75 0,252 37 0,178 19 2 0,007 4 0,019 20 7 0,024 4 0,019 21 6 0,020 7 0,034 22 6 0,020 9 0,043 23 4 0,013 7 0,034 24 121 0,406 89 0,428 25 15 0,050 9 0,043 26 8 0,027 0 0,000 27 1 0,003 3 0,014 28 17 0,057 10 0,048 29 17 0,057 7 0,034 30 4 0,013 4 0,019 31 6 0,020 12 0,058 32 0 0,000 1 0,005 33 2 0,007 0 0,000 35 1 0,003 0 0,000 37 1 0,003 2 0,010 40 1 0,003 0 0,000 Summe 298 0,998 208 1,001 * Allele sind als Anzahl der Wiederholungseinheiten angegeben

In beiden Subpopulationen sind die Allele 18 und 24 am hufigsten vertreten. Allel 24 macht in beiden Subpopulationen mehr als 40 % aller Allele aus (40,6 % in der Bukarester Gruppe, 42,8 % in der Ploiestipopulation). Das am zweithufigsten vorkommende Allel ist das 18 Repeatallel (25,2 % Bukarest versus 17,8 % Ploiesti). Die brigen Allele erreichen in beiden Populationen nicht mehr als 6 Prozent.

78

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3. Ergebnisse

D1S80 Minisatellit
0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 rel. Hufigkeit 0,2 0,15 0,1 0,05 0
15 18 20 22 24 26 28 31 30 33 40 37

Rum. Bukarest Rum. Ploiesti

Allel (Repeatanzahl)

Abbildung 3.2: Histogramm zur Darstellung der Allelhufigkeiten des D1S80 Minisatelliten in den rumnischen Populationen aus Bukarest und Ploiesti Tabelle 3.3: Allelfrequenzen des HumVWA31A Mikrosatelliten in den rumnischen Populationen aus Bukarest und Ploiesti (FSTAT) HumVWA31A Rumnen Rumnen Mikrosatellit Bukarest Ploiesti AllelAllelanzahl rel. Hufigkeit anzahl rel. Hufigkeit Allel* 13 0 0,000 1 0,005 14 27 0,074 22 0,105 15 28 0,077 32 0,152 16 77 0,213 41 0,195 17 114 0,315 55 0,262 18 72 0,199 45 0,214 19 35 0,097 13 0,062 20 8 0,022 1 0,005 21 1 0,003 0 0,000 Summe 362 1,000 210 1,000 * Allele sind als Anzahl der Wiederholungseinheiten angegeben

Die Allele 14, 15, 17 und 19 zeigen Unterschiede in ihren Hufigkeiten zwischen beiden Populationsstichproben: Allel 14 und 15 findet sich bei den Bukarester Rumnen gegenber den Ploiesti-Rumnen weniger hufig (Unterschied ca. 3 %). Fr Alle 19 gilt dies umgekehrt (weniger hufig bei der Gruppe aus Ploiesti). Allel 17 zeigt eine Differenz von ungefhr 5 Prozent 79

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3. Ergebnisse

zwischen beiden Gruppen. Insgesamt zeigen beide Subpopulationen eine unimodale (eingipfelige) Hufigkeitsverteilung.

HumVWA31A Mikrosatellit
0,35 0,3 0,25 0,2 rel. Hufigkeit 0,15 0,1 0,05 0 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Rum. Bukarest Rum. Ploiesti

Allel (Repeatanzahl)

Abbildung 3.3: Histogramm zur Darstellung der Allelhufigkeiten des HumVWA31A Mikrosatelliten
in den rumnischen Populationen aus Bukarest und Ploiesti

Zu allen drei Markern finden sich die entsprechenden Genotypen-Matrices im Anhang. 3.1.2 Genetische Differenzierung der beiden rumnischen Populationsstichproben Es sollte nun anhand verschiedener Tests geprft werden, ob sich die beiden rumnischen Populationsstichproben auf der Basis der erhobenen Daten zu den drei DNS-Markern voneinander signifikant unterscheiden. Es erfolgte eine Untersuchung auf sog. allelische Differenzierung, die auf dem Vergleich der Allelhufigkeiten ber Kontingenztafeln und einen Exakten Test nach Fisher beruht. Der Test wurde fr jeden Genort einzeln durchgefhrt, zum einen mit dem Programm GENEPOP unter Anwendung des Markov-Ketten-Algorithmus sowie zum anderen mit dem Programm SPSS mit konventioneller Monte-Carlo-Simulation. Die Tabellen 3.4 und 3.5 geben die erhaltenen Wahrscheinlichkeitswerte und die Testbedingungen wieder.

80

____________________________________________________________________________________________

3. Ergebnisse

3.1.2.1 Test auf allelische Differenzierung der beiden rumnischen Populationsstichproben mit GENEPOP
Tabelle 3.4: p-Werte fr den Test auf signifikante Unterschiede in der Allelverteilung der 3 Loci (Apo B 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) zwischen den beiden rumnischen Populationen (Bukarest und Ploiesti). Markov-Ketten-Parameter: 1000 Batches mit 10.000 Iterationen pro Batch (GENEPOP).

Lokus

p-Wert* Standardfehler 0,00188 0,00057 0,00046

ApoB3 Minisatellit 0,33034 D1S80 Minisatellit 0,02996 HumVWA31A


* Signifikanzniveau p

0,02408
0,05

Hier zeigten sich schwach signifikante Unterschiede bei den Markern D1S80 und HumVWA31A. Fr den Minisatelliten ApoB3 lag kein signifikanter Unterschied zwischen der Stichprobe aus Ploiesti und der aus Bukarest vor. 3.1.2.2 Test auf allelische Differenzierung der beiden rumnischen Populationsstich proben mit SPSS
Tabelle 3.5: Test zur Populationsdifferenzierung auf signifikante Unterschiede in der Allelfrequenzverteilung der 3 Loci (ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) zwischen den beiden rumnischen Populationen (Bukarest und Ploiesti). Basierend auf 10.000 Stichprobentabellen (SPSS).

Lokus ApoB3 Minis. D1S80 Minis. HumVWA31A

p-Wert* Konfidenzintervall (99%) 0,319 0,029 0,025


0,05

0,307 0,331 0,025 0,033 0,021 0,029

* Signifikanzniveau p

Auch mit diesem Test ergaben sich signifikante Unterschiede der beiden rumnischen Gruppen fr den Mikrosatelliten HumVWA31A sowie den Minisatelliten D1S80. Statistische bereinstimmung der Allelhufigkeiten lag fr den ApoB3 Minisatelliten vor.

81

____________________________________________________________________________________________

3. Ergebnisse

3.1.2.3 Test auf genotypische Differenzierung der beiden rumnischen Populationsstich proben mit GENEPOP Es wurde untersucht, inwieweit sich die beiden rumnischen Populationsstichproben in den Genotypenhufigkeiten der drei Marker voneinander erheblich unterscheiden. Der Test auf genotypische Differenzierung basiert auf dem Vergleich der Hufigkeiten der gefundenen Genotypen ber Kontingenztafeln und einen log-likelihood (G-) Exakten Test. Der Test wurde fr jeden Marker einzeln mit dem Programm GENEPOP unter Anwendung des Markov-KettenAlgorithmus durchgefhrt.
Tabelle 3.6: Test zur Populationsdifferenzierung auf signifikante Unterschiede in der Genotypverteilung der 3 Loci (ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) zwischen den beiden rumnischen Populationen (Bukarest und Ploiesti). Markov-Ketten-Parameter: 1000 Batches mit 10.000 Iterationen pro Batch (GENEPOP).

Lokus ApoB3 Minis. D1S80 Minis. HumVWA31A

p-Wert* Standardfehler 0,4385 0,0396 0,0327


0,05

0,0016 0,0006 0,0004

* Signifikanzniveau p

Es besttigen sich die Ergebnisse der Tests auf allelische Unterschiede: Fr die Marker D1S80 und HumVWA31A sind beide rumnischen Gruppen schwach signifikant verschieden, bezglich des ApoB3Minisatelliten nicht. Insgesamt belegen alle Testverfahren (allelische Differenzierung mit GENEPOP und SPSS sowie genotypische Differenzierung mit GENEPOP) fr den ApoB 3 Minisatelliten, dass sich beide Rumnengruppen statistisch nicht voneinander unterscheiden. Die Wahrscheinlichkeitswerte fr den D1S80-Minisatelliten und den HumVWA31A-Marker liegen in allen drei Tests sehr nahe der Signifikanzgrenze. Das bedeutet, dass geringfgige statistische Unterschiede zwischen beiden Populationen vorliegen. Trotz dieses Ergebnisses werden fr die folgenden Analysen die Daten der beiden rumnischen Gruppen zu einer einzigen Populationsstichprobe zusammengefasst.

82

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3. Ergebnisse

3.2 Vergleich der jakutischen mit der (gepoolten) rumnischen Populationsstichprobe 3.2.1 Ermittlung der Allelhufigkeiten Mit dem Programm FSTAT wurden die Allelhufigkeiten der sibirischen Populationsstichprobe (Jakuten) errechnet. Diese sowie die Daten der aus den beiden Subpopulationen Bukarest und Ploeisti zusammengefassten rumnischen Population sind in den Tabellen 3.7 bis 3.9 aufgefhrt. Vergleichend sind die Allelfrequenzen zustzlich in den Abbildungen 3.4 bis 3.6 als Histogramme dargestellt. Eine Aufstellung der ermittelten Genotypen dieser beiden Populationen findet sich im Anhang. Tabelle 3.7: Allelfrequenzen des ApoB 3 Minisatelliten in der rumnischen und der jakutischen
Population (FSTAT) ApoB 3 Minisatellit Allel* Rumnen Jakuten (gepoolt) Allelrel. Allelrel. anzahl Hufigkeit anzahl Hufigkeit 21 2 0,0037 0 0,0000 25 8 0,0147 0 0,0000 27 30 0,0551 2 0,0096 29 16 0,0294 1 0,0048 31 8 0,0147 3 0,0144 33 19 0,0349 11 0,0529 34 0 0,0000 3 0,0144 35 149 0,2739 94 0,4519 36 1 0,0018 4 0,0192 37 198 0,3640 38 0,1827 39 25 0,0460 10 0,0481 41 12 0,0221 18 0,0865 43 1 0,0018 9 0,0433 45 6 0,0110 2 0,0096 46 0 0,0000 1 0,0048 47 16 0,0294 5 0,0240 48 1 0,0018 0 0,0000 49 36 0,0662 3 0,0144 51 10 0,0184 3 0,0144 53 5 0,0092 1 0,0048 55 1 0,0018 0 0,0000 Summe 554 0,9999 208 0,9998 * Allele sind als Anzahl der Wiederholungseinheiten angegeben

83

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3. Ergebnisse

Man erkennt man in der grafischen Darstellung der Allelhufigkeiten deutliche Unterschiede: Allel 37 berwiegt in der rumnischen Gruppe deutlich (0,364). Bei den Jakuten kommt es nur halb so oft vor (0,183). Dagegen liegt Allel 35 in der sibirischen Populationen am hufigsten vor (0,452), bei den Rumnen ist es mit einer wesentlich geringeren Hufigkeit vertreten (0,274). Die Allele 21 und 25 sowie 55 kommen bei den Jakuten berhaupt nicht vor. Ein relativ hufig auftretendes Allel bei den Jakuten ist das Allel 41 mit 9 % (gegenber 2,2 % bei den Rumnen).

ApoB3' Minisatellit
0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 rel. 0,25 Hufigkeit 0,2 0,15 0,1 0,05 0
55 53 51 49 48 47 46 45 43 41 39 37 36 35 34 33 31 29 27 25 21

Rumnen Jakuten

Allele (Repeatanzahl)
Abbildung 3.4: Histogramm zur vergleichenden Darstellung der Allelhufigkeiten des ApoB 3 Minisatelliten in der rumnischen und der jakutischen Populationsstichprobe

84

____________________________________________________________________________________________

3. Ergebnisse

Tabelle 3.8: Allelfrequenzen des D1S80-Minisatelliten in der rumnischen und der jakutischen Population (FSTAT) D1S80 Rumnen Jakuten Minisatellit (gepoolt) Allel* Allelrel. Allelrel. anzahl Hufigkeit anzahl Hufigkeit 14 1 0,0020 0 0,0000 15 1 0,0020 0 0,0000 16 0 0,0000 20 0,1370 17 5 0,0099 5 0,0342 18 112 0,2213 54 0,3699 19 6 0,0119 11 0,0753 20 11 0,0217 2 0,0137 21 13 0,0257 4 0,0274 22 15 0,0296 0 0,0000 23 11 0,0217 0 0,0000 24 210 0,4150 23 0,1575 25 24 0,0474 4 0,0274 26 8 0,0158 0 0,0000 27 4 0,0079 2 0,0137 28 27 0,0534 4 0,0274 29 24 0,0474 5 0,0342 30 8 0,0158 2 0,0137 31 18 0,0356 3 0,0205 32 1 0,0020 2 0,0137 33 2 0,0040 1 0,0068 35 1 0,0020 3 0,0205 36 0 0,0000 1 0,0068 37 3 0,0059 0 0,0000 40 1 0,0020 0 0,0000 Summe 506 1,0000 146 0,9997 * Allele sind als Anzahl der Wiederholungseinheiten angegeben

Die Unterschiede zwischen den Rumnen und den Jakuten sind auffllig. Das Allel 16 kommt, trotz groer Individuenzahl, bei den Rumnen berhaupt nicht vor, bei den Jakuten aber mit einer Hufigkeit von fast 14 %. Allel 18 ist in der jakutischen Stichprobe zu 37 % enthalten, bei den Rumnen dagegen nur zu 22 %. Sehr gro ist der Unterschied bei Allel 24: die Jakuten zeigen eine vergleichsweise geringe Anzahl (relative Hufigkeit von 0,1575), whrend das Allel bei den Rumnen fast 40 % aller gefundenen Allele ausmacht. Relativ hufig ist in der sibirischen Populationengruppe das Allel 19 mit 7,5 %. Das gleiche Allel liegt bei den Rumnen nur zu 1,2 % vor.

85

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3. Ergebnisse

0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 rel. Hufigkeit 0,2 0,15 0,1 0,05 0 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 35 37

Rumnen Jakuten

Allele (Repeatanzahl)

Abbildung 3.5: Histogramm zur vergleichenden Darstellung der Allelhufigkeiten des D1S80Minisatelliten in der rumnischen und der jakutischen Populationsstichprobe Tabelle 3.9: Allelfrequenzen des HumVWA31A-Mikrosatelliten in der rumnischen und der jakutischen Population (FSTAT) HumVWA31A Rumnen Jakuten Mikrosatellit (gepoolt) Allel* Allelrel. Allelrel. anzahl Hufigkeit anzahl Hufigkeit 13 1 0,0017 0 0,0000 14 49 0,0857 29 0,1747 15 60 0,1049 2 0,0120 16 118 0,2063 41 0,2470 17 169 0,2955 27 0,1627 18 117 0,2045 44 0,2651 19 48 0,0839 19 0,1145 20 9 0,0157 4 0,0241 21 1 0,0017 0 0,0000 Summe 572 0,9999 166 1,0001 * Allele sind als Anzahl der Wiederholungseinheiten angegeben Allel 17 des HumVWA31A-Markers zeigt sehr deutliche Hufigkeitsunterschiede mit einem Vorkommen von fast 30% in der rumnischen Gruppe und gegenber 16 % bei den Jakuten. Auch Allel 15 weist

86

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3. Ergebnisse

eine auffallende Differenz auf (10,5 % bei den Rumnen, nur 1,2 % bei den Jakuten). Fr die Jakuten ist im Gegensatz zu den Rumnen - keine unimodale Hufigkeitsverteilung fr den HumVWA31A-Marker erkennbar.

0,3 0,25 0,2 rel. 0,15 Hufigkeit 0,1 0,05 0

Rumnen Jakuten

13

14

15

16

17

18

19

20

21

Allele (Repeatanzahl)

Abbildung 3.6: Histogramm zur vergleichenden Darstellung der Allelhufigkeiten des HumVWA31A Mikrosatelliten in der rumnischen und der jakutischen Populationsstichprobe

Zwischen den Jakuten und den Rumnen wurden groe Unterschiede fr alle drei Marker deutlich. Mit den folgenden Tests wurde die statistische Signifikanz der Unterschiede berprft. 3.2.2 Untersuchungen zur Populationsdifferenzierung der gepoolten rumnischen und der jakutischen Populationsstichprobe Die Reihenfolge der Vergleiche der rumnischen und sibirischen Gruppe auf der Grundlage der Allel- und Genotyphufigkeiten ist der in Abschnitt 3.1.2 (Vergleich der beiden rumnischen Subpopulationen) hnlich. Es wurden fr jeden Genort exakte Tests nach Fischer durchgefhrt und die Allelhufigkeiten sowie anschlieend die Genotypenfrequenzen der beiden Gruppen miteinander verglichen. 3.2.2.1 Test auf allelische Differenzierung mit GENEPOP Der Test auf signifikante Unterschiede in der Allelverteilung fr jeden Marker einzeln wurde mit der Software GENEPOP als Exakter Test nach Fisher mit dem Markov-Ketten-Algorithmus 87

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3. Ergebnisse

zur Permutierung des ursprnglichen Datensatzes durchgefhrt. Die Null-Hypothese fr den Test lautete: "Die Allelverteilung der beiden Populationen ist identisch".
Tabelle 3.10: p-Werte fr den Test auf signifikante Unterschiede in der Allelverteilung der 3 Loci (Apo B 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) zwischen der gepoolten rumnischen und der jakutischen Populationsstichprobe. Markov-Ketten-Parameter: 1000 Batches mit 1000 Iterationen pro batch (GENEPOP). Locus ApoB 3 Minisatellit D1S80 Minisatellit HUMVWA31A 0,000001 0,00000 * Signifikanzniveau p 0,05 0,000001 0,00000 p-Wert* Standardfehler 0,000001 0,00000

Es ergab sich, dass die p-Werte aller drei Markersysteme in den beiden Vergleichsgruppen deutlich unterhalb des Signifikanzniveaus von 0,05 liegen. Das heit, dass sich die Allelhufigkeitsverteilungen fr jeden Marker zwischen der Rumnengruppe und der sibirischen Gruppe hoch signifikant voneinander unterscheiden. 3.2.2.2 Test auf allelische Differenzierung mit SPSS Fr den Allelfrequenzvergleich wurden mit dem Programm SPSS die p-Werte fr Fishers exakten Test berechnet unter Einsatz der konventionellen Monte-Carlo-Methode zur Herstellung von Replikatdatenstzen. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 3.11.
Tabelle 3.11: Test auf signifikante Unterschiede in der Allelfrequenzverteilung der 3 Loci (ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) der gepoolten rumnischen und der jakutischen Populationsstichprobe. Basierend auf 10.000 Stichprobentabellen (SPSS).

Lokus

p-Wert* Konfidenzintervall (99%) 0,00000 0,00000 0,00000

ApoB3 Minis. 0,000001 D1S80 Minis. 0,000001 HumVWA31A 0,000001


* Signifikanzniveau p 0,05

88

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3. Ergebnisse

Die p-Werte weisen auf hoch signifikante Unterschiede der Allelhufigkeiten der Jakuten und Rumnen fr jeden der drei Marker hin. 3.2.2.3 Test auf genotypische Differenzierung mit GENEPOP Unter Anwendung des log-likelihood (G-) Exakten Tests mit Markov-Ketten-Methode zur Erzeugung multipler Datenstze wurde getestet, ob sich die Rumnen und die Jakuten in ihrer Genotypenverteilung voneinander signifikant unterscheiden (p-Werte in Tabelle 3.12).
Tabelle 3.12: Test auf signifikante Unterschiede in der Genotypverteilung der 3 Loci (Apo B 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) zwischen der gepoolten rumnischen und der jakutischen Populationsstichprobe. Markov-Ketten-Parameter: 1000 Batches mit 10.000 Iterationen pro batch (GENEPOP). Locus ApoB 3 Minisatellit D1S80 Minisatellit HUMVWA31A 0,000001 0,00000 0,05 * Signifikanzniveau p 0,000001 0,00000 p-Wert* Standardfehler 0,000001 0,00000

Auch hier zeigten sich extreme Unterschiede anhand von hoch signifikanten p-Werten im Vergleich der rumnischen und sibirischen Populationsstichprobe. 3.2.3 Untersuchung auf gekoppelte Vererbung der Loci (Linkage disequilibrium) In Tabelle 3.13 sind die p-Werte, die auf Fishers Exaktem Test beruhen, aufgefhrt. Die NullHypothese fr diesen Test lautete: Die Genotypen eines Locus sind unabhngig von den Genotypen des/der anderen Locus/Loci.

89

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3. Ergebnisse

Tabelle 3.13: p-Werte fr den Test auf Kopplungsungleichgewicht der 3 Loci fr jede Population einzeln. Markov-Ketten-Parameter: 100 Batches mit 1000 Iterationen pro batch (GENEPOP). Populationen Jakuten Lokus 1 ApoB 3 Minis. ApoB 3 Minis. D1S80 Rumnen (gepoolt) ApoB 3 Minis. ApoB 3 Minis. D1S80 *Signifikanzniveau p 0,05 Lokus 2 D1S80 HumVWA31A HumVWA31A D1S80 HumVWA31A HumVWA31A p-Wert* 0,92680 0,20751 0,66254 0,99882 0,08801 0,59191 Standardfehler 0,02332 0,03292 0,04451 0,00084 0,02652 0,04530

Fr alle Marker-Paare konnte in beiden untersuchten Populationsstichproben gezeigt werden, dass keine Hinweise auf eine gekoppelte Vererbung existieren. 3.2.4 Berechnung der erwarteten und beobachteten Heterozygotenraten Die in einer Population beobachteten Heterozygotenraten (Hobs) knnen Hinweise auf Prozesse bzw. Populationsfaktoren geben, die zu Abweichungen von den nach dem Hardy-Weinberg Gesetz erwarteten Heterozygotenanteile (Hexp) fhren. Die mit Hilfe des Programms TFPGA berechneten Werte fr die beobachteten und erwarteten Heterozygotenanteile sind in der nachfolgenden Tabelle 3.14 wiedergegeben.
Tabelle 3.14: Erwartete (Hexp) und beobachtete (Hobs) Heterozygotenraten der 3 Loci (Apo B 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) fr die rumnische und die jakutische Populationsstichprobe. Die Anzahl der jeweils untersuchten Individuen ist in der 3. Spalte angegeben (TFPGA). Lokus Population Anzahl Hexp Hobs Individuen ApoB 3' Minisat. Rumnen (gepoolt) 272 0,7785 0,7353 Jakuten D1S80 HumVWA31A Rumnen (gepoolt) Jakuten Rumnen (gepoolt) Jakuten 104 253 73 286 83 0,7459 0,7668 0,8077 0,8027 0,7979 0,6442 0,7549 0,4932 0,7622 0,7952

Aus Tabelle 3.14 kann man ersehen, dass innerhalb der jakutischen Populationsstichprobe fr 90

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3. Ergebnisse

D1S80 die beobachtete Heterozygotenrate von 0,4932 eine starke Abweichung von dem Erwartungswert 0,8077 zeigte. Fr den ApoB3 Minisatelliten lag eine leichte Abweichung vor. Fr die brigen untersuchten Markersysteme liegen in beiden Populationen die Werte der beobachteten relativ nahe den erwarteten Heterozygotenraten. 3.2.5 berprfung auf Vorliegen des Hardy-Weinberg-Gleichgewichtes Die Ergebnisse des Exakten Tests, der mit dem Programm GENEPOP durchgefhrt wurde, sind in Tabelle 3.15 als p-Werte und deren Standardfehler aufgefhrt. Die Nullhypothese fr diesen Test lautete: Die Genotypen eines Lokus befinden sich im HW-Gleichgewicht.
Tabelle 3.15: p-Werte der berprfung auf Vorliegen des Hardy-Weinberg-Gleichgewichtes fr die Loci Apo B 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A in der rumnischen und der jakutischen Populationsstichprobe. Markov-Ketten-Parameter: 1000 Batches mit 1000 Iterationen pro Batch (GENEPOP). Lokus ApoB 3 Minisatellit Standardfehler 0,0019 0,0055 D1S80 Minisatellit p-Wert* 0,5130 0,00001 Standardfehler 0,0136 0,0000 HumVWA31A p-Wert* 0,0669 0,9595 Standardfehler 0,0038 0,0011

Population p-Wert* Rumnen (gepoolt) Jakuten 0,0070 0,0527

* Signifikanzniveau p 0,05

Es fllt auf, dass fr den ApoB 3 Minisatelliten bei den Rumnen sowie fr den Marker D1S80 bei den Jakuten das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht nicht vorliegt bzw. gestrt ist. Bei allen brigen Markern liegen in beiden untersuchten Populationen fr die gefundenen Genotyphufigkeiten Hardy-Weinberg Proportionen vor. 3.2.6 F-Statistiken/Test auf Substrukturierung der Populationen Mit der Ermittlung der sogenannten F-Indices kann eine Abschtzung der Ursachen fr eine Abweichung der Heterozygotenwerte von den Hardy-Weinberg Proportionen vorgenommen werden. Im folgenden werden die rumnischen Populationsstichproben auf eventuell vorliegende Substrukturierungen durch Ermittlung der Werte fr Fis und Fst mit dem Programm GENEPOP untersucht. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 3.16.

91

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3. Ergebnisse

Tabelle 3.16: F-Werte nach Weir & Cockerham (1984) fr die rumnischen Subpopulationen

(GENEPOP).

Locus
ApoB 3 Minisatellit D1S80 Minisatellit HumVWA31A Mikrosat. Alle

Fwc (is) Fwc (st)


0,0560 0,0162 0,0507 0,0412 0,0031 0,0026 0,0032 0,0030

Die Fst-Werte der rumnischen Population liegen fr alle Marker einzeln und auch ber alle Marker nahe Null. Damit kann fr diese Population davon ausgegangen werden kann, dass keine Substrukturierung vorliegt. Das bedeutet, dass es sich bei der rumnischen Populationsstichprobe insgesamt um eine vollstndig panmiktische Population handelt, in der keine Paarungsschranken vorhanden sind. Der Fis-Index zeigt fr die Rumnen fr alle Marker positive Werte, die aber nicht auffllig von Null abweichen und somit ist Inzucht in dieser Populationsstichprobe auszuschlieen. Da fr die Jakuten eine sehr deutliche Heterozygotenreduzierung fr die Marker ApoB 3 Minisatellit und D1S80 (siehe Abschnitt 3.2.4) auffiel sowie ein nicht vorliegendes Hardy-Weinberg Gleichgewicht fr D1S80 (Jakuten), sollte hier untersucht werden, auf welche Effekte in der Population dies ein Hinweis sein knnte. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 3.17 aufgefhrt, die Analyse erfolgte mit GENEPOP.
Tabelle 3.17: Fis-Werte nach Weir & Cockerham (1984) fr die jakutische Populationsstichprobe (GENEPOP).

Locus

Fwc (is)
0,1410 0,3952 0,0095 0,1840

ApoB 3 Minisatellit D1S80 Minisatellit HumVWA31A Mikrosat. Alle

Die sibirische Population weist positive Fis-Werte auf fr alle drei Marker auf. Die Werte fr den D1S80-Minisatelliten und den ApoB 3-Marker liegen relativ deutlich ber Null, womit ein Hinweis auf Inzucht-Verhalten in dieser Populationsstichprobe gegeben ist.

92

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3. Ergebnisse

3.3 Genetischer Abstand der rumnischen Populationsstichprobe von anderen europischen Populationen und den Jakuten 3.3.1 Genetische Distanzen unter Einbeziehung von 3 Markern (ApoB 3 Minisatellit, D1S80, HumVWA31A) sowie Clusteranalyse und grafische Darstellung der Ergebnisse Die Allelfrequenzen der hier untersuchten Marker (ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) fr die in Tabelle 2.4 (Abschnitt 2.2.8) aufgefhrten Populationen dienten der Ermittlung der genetischen Abstandsmae nach Nei (1972) (Tabelle 3.18), Cavalli-Sforza & Edwards (1967) (Tabelle 3.19), sowie nach Reynolds et al. (1983) (Tabelle 3.20). Die grafische Darstellung der Abstandsanalysen (Konsensus-Baumdiagramm mit bootstrap-Werten) findet sich in Abbildung 3.7 (Neis Distanz) und 3.9 (Cavalli-Sforza & Edwards Distanz). Die Baumdarstellung nach Reynolds Distanz erfolgte nicht, da diese mit der Baumdarstellung nach Nei bereinstimmt. Es unterschieden sich lediglich die bootstrap-Werte einer Verzweigung. Die Netzwerke finden sich in den Abbildungen 3.8 und 3.10.
Tabelle 3.18: Genetische Distanzen nach Nei (1972) ber alle 3 Loci (ApoB 3 Minisatellit, D1S80, HumVWA31A) in 9 Populationen (GENDIST/PHYLIP)
Afrikaner Griechen Deutsche Ungarn Italiener Kroaten Slowaken Rumnen 0,1330 0,1516 0,1423 0,1542 0,0943 0,1145 0,1698 0,3180 0,0038 0,0111 0,0194 0,0632 0,0086 0,0331 0,2688 0,0050 0,0112 0,0641 0,0107 0,0302 0,2312 0,0056 0,0501 0,0150 0,0338 0,1896 0,0610 0,0245 0,0529 0,2243 0,0544 0,0663 0,1583 0,0421 0,2479 0,1609 Griechen Deutsche Ungarn Italiener Kroaten Slowaken Rumnen Jakuten

Tabelle 3.20: Genetische Distanzen nach Reynolds et al. (1983) ber alle 3 Loci (ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) in 9 Populationen (GENDIST/PHYLIP)
Afrikaner Griechen Deutsche Ungarn Italiener Kroaten Slowaken Rumnen 0,0338 0,0361 0,0340 0,0338 0,0198 0,0252 0,0378 0,0687 0,0011 0,0032 0,0055 0,0169 0,0029 0,0093 0,0698 0,0014 0,0032 0,0168 0,0033 0,0084 0,0613 0,0016 0,0132 0,0043 0,0093 0,0516 0,0150 0,0063 0,0140 0,0583 0,0127 0,0168 0,0423 0,0111 0,0620 0,0446 Griechen Deutsche Ungarn Italiener Kroaten Slowaken Rumnen Jakuten

93

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3. Ergebnisse

Afrikaner

Jakuten

Kroaten 1000

Slowaken

1000

347 Ungarn

486

Deutsche 607

Italiener

635 Rumnen

393

Griechen 100

Abbildung 3.7: Konsensus Baumdiagramm, Distanz nach Nei (1972) erstellt nach der UPGMA-Methode ber die Marker ApoB3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A und 9 Populationen (CONSENSE/Phylip, Darstellung mit TREEVIEW). Die Zahlen an den Verzweigungen geben die bootstrap-Werte an (1000 Datenstze).

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3. Ergebnisse

Abbildung 3.8: Netzwerkdarstellung, Distanz nach Nei (1972), basierend auf 3 Markern (ApoB3 Minisatellit, D1S80, HumVWA31A) und 9 Populationen. Darstellung mit SPLITSTREE. Tabelle 3.19: Genetische Distanzen nach Cavalli-Sforza & Edwards (1967) ber alle 3 Loci (ApoB 3 Minisatellit, D1S80, HumVWA31A) in 9 Populationen (GENDIST/PHYLIP)
Afrikaner Griechen Deutsche Ungarn Italiener Kroaten Slowaken Rumnen 0,0221 0,0248 0,0246 0,0253 0,0184 0,0212 0,0230 0,0223 0,0018 0,0025 0,0030 0,0159 0,0016 0,0122 0,0228 0,0010 0,0026 0,0150 0,0020 0,0117 0,0197 0,0026 0,0151 0,0024 0,0147 0,0186 0,0132 0,0041 0,0152 0,0239 0,0149 0,0196 0,0183 0,0135 0,0218 0,0168 Griechen Deutsche Ungarn Italiener Kroaten Slowaken Rumnen Jakuten

95

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3. Ergebnisse

Afrikaner

Jakuten

1000

Kroaten

1000

Rumnen

712

Slowaken

607

Italiener

463

Griechen

463 Ungarn

608

Deutsche 100

Abbildung 3.9: Konsensus Baumdiagramm, Distanz nach Cavalli-Sforza & Edwards (1967) erstellt nach der UPGMA-Methode ber die Marker ApoB3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A und 9 Populationen (CONSENSE-Programm/Phylip, Darstellung mit TREEVIEW). Die Zahlen an den Verzweigungen geben die bootstrap-Werte an (1000 Datenstze).

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3. Ergebnisse

Abbildung 3.10: Netzwerkdarstellung, Distanz nach Cavalli-Sforza & Edwards (1967), basierend auf 3 Markern (ApoB3 Minis. D1S80, HumVWA31A) und 9 Populationen. Darstellung mit SPLITSTREE.

bereinstimmend finden sich in den Distanzanalysen nach Nei, Cavalli-Sforza und Reynolds die Jakuten und die Afrikaner deutlich abgesetzt von den brigen, europischen Populationen. Die Kroaten zeigen sich in allen phylogenetischen Bumen fr alle Distanzen abgesetzt vom europischen Cluster. Die Verzweigung ist in allen Fllen sehr robust (in 100 % von 1000 Bumen). Die slowakische Population hingegen ist, wenn auch nicht durch robuste bootstrap-Werte untersttzt, mit Ungarn und Deutschen gruppiert.

97

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3. Ergebnisse

Fr die Rumnen wurde nach Abstandsanalysen nach Nei und Reynolds eine Gruppierung mit den Griechen deutlich, allerdings ist diese nicht sehr valide mit nur 39,3 %. In nchster Nachbarschaft erscheinen die Italiener mit hheren bootstrap-Werten von 64 (Nei) bzw. 59 % (Reynolds). Es gab dann im europischen Cluster eine Aufspaltung zwischen den Slowaken, Ungarn und Deutschen einerseits sowie den Italienern, Griechen und Rumnen andererseits. Diese Gliederung erscheint in 60,7 % der Datenstzen und unterstreicht die nheren Verwandtschaftsbeziehungen zwischen Ungarn und Deutschen sowie Slowaken gegenber Italienern Griechen und Rumnen auf der Basis von 3 Markern (ApoB3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A). Das Netzwerk nach Splitzerlegung (Abbildung 3.8) zeigt dass das Cluster von Griechen, Deutschen, Ungarn, Italienern und Slowaken nicht aufgelst werden kann. Lediglich die Kroaten und die Rumnen erscheinen von diesem abgesetzt (sowie die Afrikaner und Jakuten). Die hier eingesetzten Markern reichen also fr eine genauere Differenzierung der europischen Populationen nicht aus, oder sie liefern einander widersprchliche Ergebnisse. Die Distanzanalyse nach Cavalli-Sforza ergibt ein anderes Bild. Hier zeigt sich eine Einordnung der Rumnen zwischen Kroaten und Slowaken. Die Netzwerkdarstellung macht auch fr diese Distanz deutlich, dass die innereuropischen Beziehungen basierend auf den drei Markern (ApoB3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) nicht ausreichend erklrt werden knnen. Das Netzwerk zeigt ein Geflecht von Relationen ohne klare Zuordnungen. 3.3.2 Genetische Distanzen mit weiteren Markern sowie Clusteranalyse und grafische Darstellung der Distanzanalysen Um das in den Splitgraphen fr die Distanzen nach Nei, Cavalli-Sforza und Reynolds bereinstimmend vorkommende Cluster aus Griechen, Deutschen, Ungarn, Italienern und Slowaken besser aufzulsen, wurden weitere Marker in die Analyse einbezogen. Es handelte sich hierbei um die Mikrosatelliten D2S11 (30 Allele) und TH01 (10 Allele) sowie vier Blutgruppen-Marker (AB0, Rhesus, MNS und Haptoglobin, mit je 4, 4, 7 und 2 Allelen).Die genetischen Distanzen nach Nei (1972), Cavalli-Sforza & Edwards (1967) und Reynolds et al. (1983) wurden mit PHYLIP bzw. diversen Teilprogrammen berechnet. Dabei erfolgte im Rahmen der Erstellung der Baumdiagramme ein bootstrapping mit 1000 Datenstzen. Die Abfolge der Programmschritte ist die gleiche, wie in Abschnitt 3.3.1 beschrieben. Die Tabellen 3.21 bis 3.23 98

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3. Ergebnisse

geben die genetischen Distanzen in Matrixform wieder, die Abbildung 3.11 zeigt das Baumdiagramm der Abstandsanalyse nach Nei (1972). Die UPGMA-Bume der Distanzen nach Cavalli-Sforza und Reynolds sind aufgrund gleicher Topologie mit dem Baum nach Nei nicht abgebildet. Die Splitgraphen finden sich in Abbildung 3.12 (Nei bzw. Reynolds) und 3.13 (Cavalli-Sforza).
Tabelle 3.21: Genetische Distanzen nach Nei (1972) fr 9 Marker (D2S11, TH01, 4 Blutgruppenmarker, ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) und 5 Populationen (GENDIST/Phylip)
Deutsche Griechen Ungarn Italiener Griechen Ungarn Italiener Rumnen 0,0388 0,0064 0,0110 0,0131 0,0394 0,0328 0,0254 0,0111 0,0097 0,0122

Deutsche

Ungarn

1000 Italiener

682

Griechen

460

Rumnen 100

Abbildung 3.11: Konsensus Baumdiagramm, Distanz nach Nei (1972), erstellt nach der UPGMA-Me thode basierend auf 9 Markern (ApoB3 Minis. D1S80, HumVWA31A, D2S11, TH01 sowie 4 Blutgruppenmarkern) und 5 Populationen (CONSENSE/Phylip, Darstellung mit TREEVIEW). Bootstrap-Werte sind angegeben (1000 Datenstze)

99

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3. Ergebnisse

Die Baumdarstellungen der Distanzanalysen nach Cavalli-Sforza und Reynolds ergaben die gleiche Topologie, wie die der Distanzanalyse nach Nei wiedergibt. Es unterscheiden sich lediglich die bootstrap-Werte fr die Verzweigungen des Clusters (Italiener) sowie (Griechen, Rumnen) mit 78,3 % (Cavalli-Sforzas Distanz) bzw. 66,1 % (Reynolds Distanz) und fr die Verzweigung Griechen und Rumnen mit 55,3 % bzw. 45,4 %.

Abbildung 3.12: Split Graph/Netzwerkdarstellung, Distanz nach Nei (1972), basierend auf 9 Markern (ApoB3 Minis. D1S80, HumVWA31A, D2S11, TH01 sowie 4 Blutgruppenmarkern) und 5 Populationen. Darstellung mit SPLITSTREE.

Das Netzwerk, das sich aus der Abstandsanalyse mit der Distanz nach Reynolds ergibt, weist die gleiche Topologie wie das der Distanz nach Nei auf. Insofern ist es hier nicht abgebildet.

100

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3. Ergebnisse

Tabelle 3.22: Genetische Distanzen nach Cavalli-Sforza & Edwards (1967) fr 9 Marker (D2S11, TH01, 4 Blutgruppenmarker sowie ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) und 5 Populationen (GENDIST/Phylip). Deutsche Griechen Ungarn Italiener Griechen Ungarn Italiener Rumnen 0,0055 0,0020 0,0036 0,0043 0,0059 0,0062 0,0062 0,0035 0,0051 0,0058

Abbildung 3.13: Netzwerkdarstellung, Distanz nach Cavalli-Sforza & Edwards (1967), basierend auf 9 Markern (ApoB3 Minis. D1S80, HumVWA31A, D2S11, TH01 sowie 4 Blutgruppenmarkern) und 5 Populationen. Darstellung mit SPLITSTREE.

101

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3. Ergebnisse

Tabelle 3.23: Genetische Distanzen nach Reynolds et al. (1983) fr 9 Marker (D2S11, TH01, 4 Blutgruppenmarker sowie ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) und 5 Populationen (GENDIST/Phylip). Deutsche Griechen Ungarn Italiener Griechen Ungarn Italiener Rumnen 0,0166 0,0026 0,0045 0,0054 0,0167 0,0141 0,0111 0,0046 0,0040 0,0050

Um die genetische Nhe der Rumnen zu europischen Populationen noch differenzierter darstellen zu knnen, wurden die Distanzanalysen um weitere Marker ergnzt. Gleichzeitig reduzierte sich aber die Populationszahl aber von 9 auf 5, da Markerdaten nur fr diese 5 Populationen (Griechen, Italiener, Ungarn, Deutsche und Rumnen) vorlagen. Betrachtet man die Bume, die auf der Basis von 9 Markern entstanden sind, knnen die fnf Populationen besser gegeneinander differenziert werden: bereinstimmend befinden sich die Rumnen in den Abstandsanalysen nach Nei, Cavalli-Sforza und Reynolds in einer Gruppe mit den Griechen. Dabei zeigen lediglich die bootstrap-Werte geringfgige Unterschiede. Fr alle Distanzen liegen diese aber unter 55 % und belegen, dass dies keine eindeutige Gruppierung darstellt. Das kommt auch in den Netzwerkdarstellungen der Distanzanalysen nach Nei und Reynolds zum Ausdruck. Zum einen zeigen die Griechen einen groen Abstand von den brigen Populationen. Zum anderen ist die genaue phylogenetische Beziehung der Gruppe Rumnen/Griechen/Italiener offen, da hier keine direkten Linien zu erkennen sind. Dies wird noch deutlicher in der Betrachtung des Netzwerkes basierend auf Cavalli-Sforzas Distanz: Die Beziehungen zwischen den einzelnen Populationen sind auch hier nicht durch direkte Verbindungen aufgelst. Der Grund knnen die insgesamt sehr geringen Differenzen der Distanzen nach Cavalli-Sforza sein. Offenbar erlauben diese eine feinere Differenzierung der Gruppen nicht. Zumindestens nicht mit den hier verwendeten Markern. Die italienische Population befindet sich benachbart der Gruppe aus Rumnen und Griechen und zwar bereinstimmend in allen drei Distanzanalysen. Die Robustheit dieser Verzweigung liegt hher (mit bootstrap-Werten von 66 bis 78 %), als fr die Rumnen-Griechen-Gruppierung. Das unterstreicht die Nhe der Italiener zu beiden Populationen. Klar abgesetzt von diesem Cluster aus Griechen, Italienern und Rumnen zeigen sich die Ungarn, mit einer zu 100 Prozent in allen Distanzanalysen und Datenstzen vorkommenden Ab102

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3. Ergebnisse

zweigung. Das gilt auch fr die Position und den Abstand der Deutschen von den restlichen Populationen. Die deutsche Gruppe zeigt sich in allen Abstandsanalysen mit hoher Robustheit in allen Baumdarstellungen (100 %) separat von Ungarn, Italienern, Griechen und Rumnen. Die Distanz der Deutschen und der Ungarn von der Gruppe der Italiener, Griechen und Rumnen ist wie aus den Netzwerkdarstellungen bereinstimmend hervorgeht nicht sehr gro, aber in ihrer Gliederung eindeutig. Damit ist durch Hinzunahme von mehr Markern eine verbesserte Auflsung der Beziehungen dieser Gruppen erreicht worden. Allerdings konnten Verwandtschaften mit slawischen Gruppen hier nicht weiter untersucht werden, da Markerdaten dafr fehlten. Insgesamt gesehen liegt nach diesen Analysen eine engere Relation der Rumnen mit Griechen und Italienern vor, als mit Deutschen und Ungarn. Eine Ausnahme hiervon bildet die Abstandsanalyse nach Cavalli-Sforza fr 3 Marker und 9 Populationen, in der die Rumnen zwei slawischen Gruppen nahe stehen. 3.4 Paarweiser Populationsvergleich mit SPSS Zustzlich zu den in Abschnitt 3.3 dargestellten Abstandsanalysen ber genetische Distanzen erfolgte ein paarweiser Populationsvergleich ber Exakte Tests nach Fisher unter Anwendung der konventionellen Monte-Carlo Methode zur Erzeugung von 10.000 Replikatdatenstzen mit dem Programmpaket SPSS. Die p-Werte dieser Analysen sowie die entsprechenden Konfidenzintervalle sind Tabelle 3.24 wiedergegeben. Besttigt sind durch die Populationsvergleiche die hoch signifikanten Unterschiede der Rumnen mit den Afrikanern und der jakutischen Population, obwohl der Vergleich nur auf 3 Markern basierte. Das Ergebnis des Vergleichs der Rumnen mit den Serbokroaten lsst bei einem von 3 Markern (MNS-System) hnlichkeit, bei den brigen hoch signifikante Unterschiede erkennen (fr ABO nur schwach signifikant). Die kroatische Population (5 Vergleichsmarker) zeigt weder eindeutige bereinstimmung noch Differenz zu den Rumnen, da fr 2 Marker (D1S80 und HumVWA31A) keine signifikanten Unterschiede, fr 2 andere (ApoB 3 Minsatellit und FGA) hoch signifikante Unterschiede festzustellen waren. Der p-Wert fr den Mikrosatelliten TH01 lag kurz unterhalb der Signifikanzgrenze. Es fllt auf, dass beim Vergleich Kroaten Rumnen 103

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3. Ergebnisse

die Marker, die auch fr alle brigen Populationen zur hoch signifikanten Differenzierung beitragen, auch hier keine hnlichkeiten aufweisen. Der Vergleich der Rumnen mit Gruppe der Slowenen zeigt fr 2 (TH01 und D2S11) von 3 untersuchten Markern eine deutliche hnlichkeit, fr FGA hingegen hoch signifikante Unterschiede. Fr weitere Vergleich lagen leider keine Daten vor, so dass die Aussagekraft hinsichtlich genetischer Nhe zu den Rumnen nicht sehr hoch ist. Fr eine weitere slawische Populationsgruppe, die Slowaken, basiert der Vergleich auf Daten von 8 Markern: Dieser zeigt wieder fr ApoB sowie ABO, Rhesus und HP hoch signifikant unterschiedliche Allelhufigkeiten, fr drei andere Marker (HumVWA31A, TH01 und MNS) starke hnlichkeiten sowie fr D1S80 Unterschiede nur wenig unterhalb der Signifikanzgrenze (p = 0,01). Im Vergleich der Rumnen mit den Ungarn fallen 4 Marker auf, die sehr hnliche Allelfrequenzen haben (D1S80, HumVWA31A, D2S11 sowie MNS). Fr TH01 liegt der p-Wert kurz unterhalb der Signifikanzgrenze (p = 0,043), beim Rhesus-System deutlich unter 0,005 (p = 0,003). Hoch signifikante p-Werte lieferten die Marker ApoB 3 Minisatellit, FGA, ABO und HP. Der Vergleich der Rumnen mit den Italienern sowie mit den Griechen erbrachte einander hnliche Ergebnisse: Nimmt man die offensichtlich nicht informativen Marker ApoB3 Minisatellit und FGA aus, zeigen beide Populationen fr 4 (von 8 Markern) eine groe hnlichkeit mit der rumnischen Gruppe (D1S80, HumVWA31A, TH01 sowie MNS). Fr 3 der Marker wiesen die Griechen resp. die Italiener keine bereinstimmungen der Allelhufigkeiten auf (HP, ABO und Rhesus), whrend fr D2S11 die Italiener mit einem p-Wert kurz oberhalb der Signifikanzgrenze (p = 0,071) eine grere Nhe zeigen, als die Griechen (p-Wert hoch signifikant). Fr die deutsche Gruppe konnten signifikante Unterschiede zur rumnischen Stichprobe fr die Marker ApoB3 Minisatellit, FGA, TH01, ABO, Rhesus und HP (6 von 10) nachgewiesen werden. Fr 4 Marker lagen hnliche Allelverteilungen vor (D1S80, HumVWA31A, D2S11 sowie MNS). Der Minisatellit ApoB3 und der FGA-Marker ergaben in keinem Populationsvergleich hnlichkeiten in der Allelverteilung. Diese Systeme sind offensichtlich insbesondere fr intrakontinentale Gruppenvergleiche ungeeignet.

104

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3. Ergebnisse

Tabelle 3.24: p-Werte des paarweisen Vergleichs der rumnischen Populationsstichprobe mit europischen Populationen. Exakter Test nach Fisher mit konventioneller Monte-Carlo Simulation, jeweils 10.000 Stichprobentabellen. Zahlen in Klammern geben das 95% Konfidenzintervall an (SPSS).
ApoB 3 Minisat. D1S80 HumVWA 31A FGA TH01 D2S11 ABO Rhesus (0,008-0,013) HP MNS (0,475-0,500) (0,993-0,996) (0,700-0,724) (0,880-0,897) (0,885-0,901)

Rumnen / Deutsche Rumnen / Griechen Rumnen / Italiener Rumnen / Ungarn Rumnen / Slowaken Rumnen / Slowenen Rumnen / Kroaten Rumnen / Serbokroaten Rumnen / Jakuten Rumnen / Afrikaner

0,000001 0,000001 0,000001 0,000001 0,000001 kD 0,000001 kD 0,000001 0,000001

(0,680-0,704) (0,813-0,833) (0,246-0,269)

0,692 0,258 0,391 0,552 0,010 kD

0,823 0,971 0,983 0,917 0,616 kD

0,000001 0,000001 0,000001 0,000001 kD 0,000001 0,000001 kD kD kD

(0,009-0,014) (0,685-0,709) (0,208-0,230)

0,012 0,219 0,447 0,043 0,719 0,604 0,031 kD kD kD

0,697

0,000001 0,000001 0,000001 0,000001 0,000001 kD kD


(0,006-0,011)

0,011

0,000001 0,036 0,000001 0,000001 0,000001 kD kD 0,000001 kD kD

0,488 0,995 0,712 0,889 0,893 kD kD

(0,967-0975)

0,000001 0,071 0,229 kD 0,162 kD kD kD kD

0,000001
(0,000-0,002) (0,002-0,005)

(0,378-0,403) (0,980-0,987) (0,539-0,565) (0,910-0,924) (0,008-0,013) (0,603-0,628)

(0,434-0,460) (0,065-0,078) (0,038-0,048) (0,218-0,240) (0,707-0,730)

0,001 0,003

0,000001 kD kD 0,000001 kD kD

(0,591-0,616) (0,152-0,171) (0,026-0,035)

(0,500-0,526)

0,513 kD

(0,460-0486)

0,473 kD

0,009 kD kD

(0,341-0,365)

0,353 kD kD

0,000001 0,000001

0,000001 0,000001

Signifikanzniveau p 0,05. Zellen mit p-Werten ber der Signifikanzgrenze sind farblich unterlegt. kD = es lagen keine Markerdaten zum Vergleich vor

105

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3. Ergebnisse

3.5 Paarweiser Populationsvergleich mit dem Mantel-Test Die Allelfrequenzverteilungen der Rumnen fr die in Tabelle 3.24 angegebenen Marker wurden paarweise ber einen Mantel-Test mit denen anderer europischer Populationen verglichen. Das Programm TFPGA fhrte diesen Vergleich nach Permutierung der Datenstze durch. Tabelle 3.25: Korrelationskoeffizienten des Mantel-Tests auf paarweisen Vergleich der rumnischen

Populationsstichprobe mit europischen Populationen. Ergebnis nach 999 Permutationen (TFPGA) Korrelationskoeffizient 0,9879 0,9870 0,9745 0,9904 0,9879 0,9810 0,9832 Marker 9 Marker: ABO, Rhesus, MNS, HP, D2S11, Th01 ApoB, D1S80, HumVWA31A 9 Marker: ABO, Rhesus, MNS, HP, D2S11, Th01 ApoB, D1S80, HumVWA31A 9 Marker: ABO, Rhesus, MNS, HP, D2S11, Th01 ApoB, D1S80, HumVWA31A 9 Marker: ABO, Rhesus, MNS, HP, D2S11, Th01 ApoB, D1S80, HumVWA31A 8 Marker: ABO, Rhesus, MNS, HP, Th01 ApoB, D1S80, HumVWA31A 8 Marker: ABO, Rhesus, MNS, HP, Th01 ApoB, D1S80, HumVWA31A 2 Marker: D2S11, Th01

Populationspaar Rumnen vs. Italiener Rumnen vs. Deutsche Rumnen vs. Griechen Rumnen vs. Ungarn Rumnen vs. Slowaken Rumnen vs. Kroaten Rumnen vs. Slowenen

Die errechneten Korrelationswerte liegen alle sehr hoch, es zeigen sich erst ab der dritten Nachkommastelle Differenzen zwischen den Populationspaaren. Die Allelfrequenzen der Rumnen und der Ungarn zeigen die hchste Korrelation, die geringste hnlichkeit hatten die Griechen mit den Rumnen. Mittlere Korrelations-Werte zeigen die Vergleiche der Allelhufigkeitsverteilungen der Rumnen mit denen der Deutschen, Italienern und Slowaken.

3.6 Vergleich der Distanzmatrices mit dem Mantel-Test Die folgenden Tabellen zeigen die Ergebnisse eines Mantel-Tests zum Vergleich der Distanzmatrices nach Nei, Cavalli und Reynolds zum einen ber 3 Marker (ApoB3 Minisatellit D1S80, HumVWA31A) und 9 Populationen (Tabelle 3.24) sowie zum anderen ber 9 Marker ApoB3 Minisatellit, D1S80, HumVWA31A, D2S11, TH01, 4 Blutgruppenmarker) und 5 Populationen (Tabelle 3.25). 106

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3. Ergebnisse

Tabelle 3.26: Matrix der Korrelationskoeffizienten zum Vergleich der verwendeten Distanzmae fr 3 Marker (ApoB3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) und 9 Populationen. DNei steht fr die Distanz nach Nei (1972), DChord fr die Distanz nach Cavalli-Sforza & Edwards (1967) und DRey fr die Distanz nach Reynolds et al. (1983) (TFPGA).

D Chord D Rey D Nei D Chord 0,7987 0,9919 0,7825

Tabelle 3.27: Matrix der Korrelationskoeffizienten zum Vergleich der verwendeten Distanzmae fr 9 Marker (ApoB3 Minisatellit, D1S80, HumVWA31A, D2S11, TH01 sowie 4 Blutgruppenmarker) und 5 Populationen. DNei steht fr die Distanz nach Nei (1972), DChord fr die Distanz nach Cavalli-Sforza & Edwards (1967) und DRey fr die Distanz nach Reynolds et al. (1983) (TFPGA).

D Chord D Rey D Nei D Chord 0,6931 0,9997 0,6964

Die bereinstimmung der Distanzwerte nach Nei und Reynolds ist aus den hohen Korrelationskoeffizienten von 0,9919 bzw. 0,9997 ersichtlich. Die sehr hnliche Topologie der phylogenetischen Bume (Nei: Abbildung 3.7 bzw. 3.11, Baum fr Reynolds Distanz nicht gezeigt) sowie der Netzwerke (Abbildung 3.8 bzw. 3.12, Baum fr Reynolds Distanz nicht abgebildet) unterstreicht dieses Ergebnis. Dagegen weisen die Vergleiche der Distanzanalysen nach Nei versus Cavalli-Sforza bzw. nach Cavalli-Sforza versus Reynolds deutliche Unterschiede auf, gekennzeichnet durch relativ niedrige Korrelationskoeffizienten und sehr unterschiedliche Baumstrukturen bzw. Netzwerke. Die bereinstimmung Nei versus Cavalli-Sforza und Cavalli-Sforza versus Reynolds war bei Verwendung von hnlichen Markersystemen (Mini- und Mikrosatelliten) grer (siehe Tabelle 3.24), als bei Einsatz unterschiedlicher Systeme (Mini- und Mikrosatelliten sowie Blutgruppenmarker). Darauf weisen die hheren Korrelationswerte (0,7987 versus 0,6931 sowie 0,7825 versus 0,6964) hin.

107

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3. Ergebnisse

3.7 Abschtzung der Divergenzzeit von Rumnen und Jakuten

Mit den Distanzwerten nach Goldstein et al. (1995a) (ermittelt mit POWERSSR) sowie der Gleichung aus Abschnitt 2.3.12 (Formel 2.14) errechnen sich mit einer angenommenen Generationszeit von 25 Jahren die in Tabelle 3.28 aufgefhrten Divergenzzeiten der Rumnen und der Jakuten. Verwendet wurden Mutationsraten nach Sajantila et al. (1999). Damit ergibt sich eine ber alle Marker gemittelte Trennung der Rumnen von den Jakuten vor ungefhr 30.074 bis 36.641 Jahren. Die Schwankungsbreite der Zeitabschtzung ist sehr hoch.
Tabelle 3.28: Genetische Distanz nach Goldstein et al. (1995a) sowie Divergenzzeitschtzung fr drei Loci (ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) und die rumnischen sowie die sibirische Populationsstichprobe. Bootstrapping mit 1000 Datenstzen (POWERSSR)
Marker ApoB3 Minisat. Populationspaar Bukarest/ Jakuten Ploiesti/ Jakuten Bukarest/ Jakuten Ploiesti/ Jakuten Bukarest/ Jakuten Ploiesti/ Jakuten Bukarest/ Jakuten Ploiesti/ Jakuten Mutationsrate (Konfidenzintervall) 0,5 x 10-3 (0,2-0,6) 0,5 x 10-3 (0,0-1,0) 1,4 x 10-3 (0,1-2,5) 0,8 x 10-3 (Delta mu) 0,0237391 0,000208025 4,86191 6,58735 0,011528 0,0635225 1,63239 2,21703 Standardabweichung 1,67 x 10-16 2,36 x 10-18 4,88 x 10-14 9,86 x 10-14 1,39 x 10-16 1,54 x 10-15 1,35045 1,76736 Divergenzzeit [Jahre] 593 5 121.548 164.684 103 567 30.074 36.641

D1S80 Minisat.

HumVWA31A

ber alle 3 Marker

108

_____________________________________________________________________________ 4. DISKUSSION 4.1 Populationsdifferenzierung 4.1.1 Vergleich der rumnischen Stichproben aus Bukarest und Ploiesti

4. Diskussion

Die untersuchten rumnischen Populationsstichproben stammen aus verschiedenen, aber geografisch nahe beieinander liegenden Stdten: Zum einen aus der Landeshauptstadt Bukarest, zum anderen aus der Provinzhauptstadt Ploiesti. Beide Stdte sind etwa einhundert Kilometer voneinander entfernt. Die Stichprobe aus Ploiesti reprsentiert einen rein weiblichen und jungen Populationsanteil, von dem Blutproben im Rahmen einer Hormonstudie (Glavce et al. 2000) gesammelt wurde. Die Individuen der Bukarester Population dagegen setzen sich aus Rumnen beiderlei Geschlechts verschiedener Altersstufen zusammen. 4.1.1.1 Vergleich der Allel- und Genotyphufigkeiten Die Tests auf signifikante Unterschiede in der allelischen bzw. Genotyp-Verteilung zwischen den beiden rumnischen Stichproben zeigte nicht ganz eindeutige Ergebnisse: Fr den ApoB 3 Minisatelliten war eine Gleichheit der Allel- und Genotyphufigkeiten beider Gruppen gegeben. Fr D1S80 und HumVWA31A lagen die Wahrscheinlichkeitswerte fr eine Gleichheit der Allel- und Genotypverteilungen an der Signifikanzgrenze von 0,05. Warum unterscheiden sich die beiden rumnischen Populationen hinsichtlich der Marker D1S80 und HumVWA31A wenn auch nur in sehr geringem Mae - voneinander? Die Herkunft der Stichproben, also die geografischen Lage der Stichprobenorte drfte kein wesentlicher Grund fr die Verschiedenheit sein, denn Bukarest und Ploiesti liegen weniger als 100 Kilometer von einander entfernt und sind infrastrukturell eng verbunden: Es existieren eine gut ausgebaute Regionalstrasse und eine Bahnlinie. Ein weiterer Erklrungsansatz ist die unterschiedliche Zusammensetzung der Stichproben (siehe Abschnitt 2.1.1 und 2.1.2), also hinsichtlich Alter und Geschlecht. In dieser Untersuchung wurden allerdings keine geschlechtsspezifischen Marker eingesetzt, die zu Verzerrungen fhren.

109

_____________________________________________________________________________

4. Diskussion

Vergleichsdaten einer rumnischen Population fr den Marker HumVWA31A (Huckenbeck et al. 2000) zeigten hinsichtlich der Allelfrequenzen keine aufflligen Unterschiede zu den Stichproben aus Bukarest und Ploiesti (Daten nicht gezeigt). Es kommen als Ursache die unterschiedlich groen Stichprobenumfnge (106 Individuen aus Ploiesti und 182 Individuen aus Bukarest) in Frage. Relativ geringe Stichprobenumfnge in der Untersuchung von sehr polymorphen Markern, wie dem D1S80 Minisatelliten, knnen zur Unterreprsentierung bzw. dem Nichtauftreten von seltenen Allelen fhren. Fr das D1S80-System sind inzwischen 29 Allele beschrieben. Bei einer Stichprobengre von 100 Individuen ist die Wahrscheinlichkeit fr das Auffinden selten vorkommender Allele, wie dem 39 Repeat-Allel sehr gering: Dieses Allel kam bei den hier zum Vergleich eingesetzten neun europischen Populationen mit Stichprobenumfngen zwischen 73 (Jakuten) und 490 (Griechen) beispielsweise in keiner Gruppe vor. In der Stichprobe aus Ploiesti (n = 104) waren 5 Allele des D1S80Systems im Vergleich zur Bukarester Gruppe nicht vertreten. Dagegen traten in der BukarestStichprobe (n = 149) 2 Allele nicht auf. Im diesem Zusammenhang wren auch Genotypen, die sich aus seltenen Allelen zusammensetzen, unterreprsentiert bzw. liegen nicht vor. Fr das Vorliegen einer solchen Strgre bei den Markern D1S80 und HumVWA31A spricht, dass der Vergleich der Genotypenhufigkeiten gleichfalls p-Werte nahe der Signifikanzgrenze lieferte. Die Analyse der Werte fr FIS und FST, die Hinweise auf eine Substrukturierung der rumnischen Population geben knnten, zeigten, dass es sich um eine vollstndig panmiktische Population ohne Einschrnkung der freien Paarung handelt. Auch Inzucht konnte nicht nachgewiesen werden. Da ein Ziel dieser Arbeit Vergleiche der rumnischen Population mit weiteren, berwiegend europischen Ethnien war, wurden fr die weiteren Analysen die Daten der beiden rumnischen Populationsstichproben trotz der ermittelten statistisch geringfgigen Differenzen zu einer Gesamtstichprobe zusammengefasst.

110

_____________________________________________________________________________ 4.1.2 Vergleich der sibirischen mit der gepoolten rumnischen Populationsstichprobe 4.1.2.1 Vergleich der Allel- und Genotyphufigkeiten ApoB 3 Minisatellit

4. Diskussion

Sowohl der Test auf allelische als auch auf genotypische Differenzierung zeigte hochsignifikant voneinander unterschiedliche Hufigkeitsverteilungen zwischen beiden Gruppen. Die Form der Allelverteilung ist in der sibirischen Populationsstichprobe zweigipfelig, betreffend die Allele 35 und 37, jedoch mit vertauschten Hufigkeiten gegenber den Rumnen. Eine solche Hufigkeitsumkehr zwischen Allel 35 und 37 konnte auch fr Chinesen nachgewiesen werden (Allel 35 mit ca. 60 %, Allel 37 mit 15 %; Evans et al. 1993). Destro-Bisol et al. (2000) verglichen Daten zum ApoB 3 Minisatelliten von 36 Populationen weltweit. Sie konnten nachweisen, dass sich die Allelhufigkeiten bei Afrikanern unimodal verteilen. Dagegen zeigten die Europer sowie die Ostasiaten eine bimodale Allelhufigkeitsverteilung mit Gipfeln im Bereich der Allele 35/37 und 45 bis 49. Die Varianz der Europer war sehr viel geringerer, als die der Afrikaner. Diese Unterschiede erklrten Destro-Bisol et al. (2000) mit einem bottleneck, der die aus Afrika auswandernde Gruppe betraf und in der folgenden Zeit durch genetische Drift die Allelfrequenzverteilung fr den ApoB 3-Minisatelliten stark vernderte. D1S80 Minisatellit Auch hier zeigte der Allelfrequenzvergleich sowie der Genotypenhufigkeitsvergleich einen hoch signifikanten Unterschied beider Populationsstichproben. Auffallend in diesem Zusammenhang war Allel 16, das in der rumnischen Stichprobe von 253 Individuen in keinem Fall detektiert werden konnte, wogegen es bei 16 % der Jakuten vorkam. Dies kann als Zeichen von Inzucht oder genetischer Drift bewertet werden, denn Vergleichsdaten von anderen asiatischen Gruppen zeigen Hufigkeiten dieses Allels von 1,4 % bei Japanern, (Huckenbeck & Scheil 2003) sowie 3,4 % bei Chinesen (Huckenbeck & Scheil 2003). In einer russischen Population von 120 Individuen trat das Allel berhaupt nicht auf (Ovchinnikov et al. 1995). Die Allelhufigkeiten von Allel 18 und 24 unterschieden sich in beiden Gruppen ebenfalls auffallend und statistisch signifikant: Allel 24 ist bei den Rumnen zu 40 % vertreten, die jakuti111

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4. Diskussion

sche Population weist, wie andere asiatische Populationen, einen wesentlich geringeren Anteil von 15 % auf (Japaner 20,5 %, Chinesen 23,4 %, Russen dagegen 30 %, Huckenbeck & Scheil 2003). HumVWA31A Ebenso wie bei den vorher besprochenen Markern gab es fr den HumVWA31A Mikrosatelliten statistisch hoch signifikante Unterschiede in Bezug auf die Hufigkeiten der Allele und Genotypen zwischen Rumnen und Jakuten. Unterschiede zwischen zwei Populationen knnen auch aufgrund des Auftretens sog. privater Allele deutlich werden. Es handelt sich bei privaten Allelen um solche Allele, die nur in einer Population vorkommen. Das Vorkommen privater Allele in einer Population hngt sehr eng mit der Stichprobengre zusammen. berwiegend werden Stichproben von Populationen untersucht und nicht die Gesamtpopulation. Daher kann man bei Nichtvorliegen eines Allels nicht davon ausgehen, dass es in dieser Population nicht vorhanden ist, da eventuell die geringe Stichprobengre der Grund ist. Prinzipiell sollte man Populationsstichproben mit gleicher Individuenzahl untersuchen und vergleichen, daher wurden im Rahmen dieser Untersuchung Aussagen zu privaten Allelen nicht getroffen. Die fr alle drei Marker bereinstimmend gefundenen signifikanten Unterschied zwischen beiden Populationen berraschen nicht. Diese waren aufgrund der groen geografischen Distanz zueinander zu erwarten, da beide Populationen dadurch praktisch voneinander isoliert sind (isolation by distance). Diese Entfernung stellte vor allem in frheren Zeiten ein absolutes Migrationshindernis dar, so dass relevanter Genfluss zwischen beiden Populationen nicht stattfinden konnte. ber lngere Zeit gesehen sind dadurch signifikante Unterschiede der Allelhufigkeiten fr die drei hier untersuchten Marker aufgrund von genetischer Drift entstanden. Auerdem wurde im Verlauf der Ethnogenese der Jakuten einer drastischen Reduzierung der Populationsgre durch einen bottleneck oder aufgrund eines founder-Effektes nachgewiesen (Pakendorf 2001). Dadurch erfuhren die Allelhufigkeiten aller Genorte dieser Gruppe eine starke Vernderung aufgrund von genetischer Drift (siehe auch Abschnitte 4.1.3 und 4.2.5). Dies konnte mit den vorliegenden Markerdaten besttigt werden.

112

_____________________________________________________________________________ 4.1.3 Heterozygotenraten

4. Diskussion

Eine starke Abweichung des beobachteten gegenber dem erwarteten Heterozygotenanteils fr den D1S80-Marker (beobachtet: 0,4932 gegenber erwartet: 0,8077) fiel bei den Jakuten auf. Ein indirekter Grund hierfr knnte in technischen Schwierigkeiten bei der Amplifizierung dieses Markers liegen. Die PCR gelang in dieser Population fr nur 73 Individuen (fr ApoB konnten 104 Individuen typisiert werden, fr HumVWA31A 83). Die nderung verschiedener Amplifikationsbedingungen (Zusatz von DMSO, Amplifizierungstemperaturen und -zeiten, der Taq-Polymerase etc.) ergaben keine Verbesserung (Daten nicht gezeigt). Daher kme als Ursache dieser technischen Probleme noch das Vorliegen eines Hemmstoffes in der DNS-Lsung infrage. Da aber die Amplifikationen der beiden anderen Systeme (ApoB 3 Minisatellit und HumVWA31A) unproblematisch waren, kann dies nicht der Grund sein. Durch die methodischen Schwierigkeiten bei der Amplifizierung innerhalb dieser Populationen erniedrigte sich die effektive Populationsgre auf nur noch 73 Individuen. Fr die Marker ApoB konnten in 104 Fllen Allele amplifiziert werden, fr HumVWA31A fr 83 Individuen. Die geringe Individuenanzahl bei D1S80 und eine damit verbundene (zufllige) deutliche Unterreprsentierung von bestimmten Heterozygoten mag also der Grund fr das Abweichen dieser Werte (Heterozygotenraten, HW-Gleichgewicht) darstellen. Diese Annahme lsst sich dadurch sttzen, dass die beiden anderen Marker in der jakutischen Gruppe keine derartigen Abweichungen zeigten. Wre aber die erniedrigte Heterozygotenrate ein Ergebnis von populationsgenetischen Prozessen, wie Inzuchtverhalten oder anderem, selektiven Paarungsverhalten, msste diese Beobachtung auch fr den ApoB 3 Minisatelliten und HumVWA31A gelten. Da dies nicht der Fall ist, wird der geringe Stichprobenumfang im Falle von D1S80 aufgrund methodischer Schwierigkeiten die Erklrung sein. Nullallele knnen ebenfalls ein Grund fr erniedrigte Heterozygotenwerte darstellen: Diese treten auf, wenn eine Mutation im Primer-Bindungsbereich des Markers stattfindet und dadurch die Effizienz der Amplifizierung beeinflusst wird. Entweder wird das Allel stark vermindert amplifiziert oder gar nicht (Nullallel). Dies fhrt dazu, dass eigentlich heterozygote Individuen als Homozygote typisiert werden und damit der Anteil an Heterozygoten nicht korrekt erfasst wird. Verbessert werden kann die Situation durch den Einsatz neuer Primer mit anderer Bin113

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4. Diskussion

dungsstelle. Das Problem der Nullallele wird eher in Abstammungsuntersuchungen evident, als in phylogenetischen Analysen, denn hier fallen Nullallele nur dann auf, wenn man kein PCRProdukt erhlt. Die Existenz von Nullallelen fr den Marker D1S80 ist nicht auszuschlieen, wurde im Rahmen dieser Untersuchung aber nicht berprft. Die Wahrscheinlichkeit fr das Auftreten von Nullallelen fr D1S80 war hier nicht sehr gro, denn in der rumnischen Population konnten keine abweichenden Heterozygotenraten beobachtet werden. Abweichungen der beobachteten von den erwarteten Heterozygotenwerten knnen auch zustande kommen, wenn Strukturvarianten elektrophoretisch nicht auffllig werden. Dann nmlich existieren tatschlich mehr Heterozygote, die als solche aber nicht erkannt werden, was zu einer Unterschtzung der beobachteten Heterozygotenrate fhrt. Beispielsweise gibt es fr das HumVWA31A Allel 16 eine Strukturvariante 16. Beide sind elektrophoretisch nicht zu unterscheiden (Brinkmann et al. 1996). Das trifft auch fr den ApoB 3 Minisatelliten zu, da hier viele Strukturvarianten von Allelen bekannt sind, die sich ohne Sequenzierung nicht unterscheiden lassen (Buresi et al. 1996). Einen weltweiten Vergleich von Heterozygotenraten des Minisatelliten ApoB 3 publizierten Destro-Bisol et al. (2000). Die afrikanischen Gruppen zeigten sehr hohe Heterozygotenwerte zwischen 85 und 90 % (mit Ausnahme einer Population mit etwas ber 80 %). Fr 6 europische Populationen lagen die Werte um 80 %, dagegen fielen die Werte fr ostasiatische Populationen auf ungefhr 58 % (Chinesen) und 61 % (Japaner). Die Heterozygotieraten fr die rumnische Populationsstichprobe liegen fr alle drei Marker im Rahmen der europischen Vergleichswerte (siehe Tabelle 4.1). Leicht erniedrigt erscheint der Wert des von-Willebrand Mikrosatelliten HumVWA31A.

114

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4. Diskussion

Tabelle 4.1: Heterozygotenwerte im Vergleich. Die Referenzen sind in Klammern angegeben und unter halb der Tabelle aufgefhrt.

ApoB3 D1S80 HumVWA31A Minisatellit _____________________________________________________________________________ Deutsche 77,1 (1) 75,6 (4) kA Ungarn Italiener Griechen Kroaten Slowaken Afrikaner Russen Trken Rumnen Jakuten 78,8 (8) 79 % (2) kA 74
(9)

82,1 (8) 79 (2) 66 (5) 75 kA kA kA


(13) (9)

81,6 (7) 79,6 (10) kA kA kA 87,0 (12) 81,8 - 93,7 (6) 84,1 (12) 76,22 (13) 79,52 (13)

80,9 (11) 92 (3) kA kA 73,53 64,42 (13)

78,3 (11)

75,49 (13) 49,32 (13)

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Referenzen: 1. Deka et al. 1992 , 2. Novelli 1992 3. Destro-Bisol et al. 1994, 4. Huckenbeck et al. 1996, 5. Falcone et al. 1995, 6. Sajantila et al. 1994, 7. Furedi et al. 1995 , 8. Woller et al. 1995, 9. Drmic et al. 1998, 10. Piccinini et al. 1997, 11. Kadasi et al. 1994, 12. Brinkmann et al. 1996, 13. diese Arbeit, kA = keine Angaben

4.1.4 Hardy-Weinberg Gleichgewicht Eine unabhngige Vererbung (linkage equilibrium) als Voraussetzung fr die Analyse auf Vorliegen der Hardy-Weinberg Proportionen wurde fr alle drei Marker nachgewiesen. Bei der berprfung des Hardy-Weinberg (HW) Gleichgewichtes ergab sich fr den ApoB3 Minisatelliten in der gepoolten Stichprobe der Rumnen eine Strung. Fr die rumnische Gruppe lagen keine Abweichungen der beobachteten und erwarteten Heterozygotenraten fr diesen Marker vor. Wenn man die Hufigkeiten der beobachteten und erwarteten Genotypen einzeln betrachtet, werden geringe Unterschiede deutlich. Welche davon aber zur Abweichung der Hardy-Weinberg Proportionen fhrten, ist aufgrund der Vielzahl der mglichen Genotypen, nicht festzumachen. Fr die rumnische Stichprobe ergaben die Tests auf Substrukturierung (F115

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4. Diskussion

Test) keine Anhaltspunkte, die weitere Erklrungen fr das Abweichen vom HW-Gleichgewicht darstellen. Bei den Jakuten wichen fr den Marker D1S80 die erhaltenen Allelhufigkeiten von den HardyWeinberg Proportionen ab. In dieser Populationsstichprobe war fr den Marker bereits eine starke Abweichung des Heterozygotenanteils festgestellt worden (siehe Abschnitt 3.2.4). Das Vorhandensein der Hardy-Weinberg Proportionen fr den Lokus D1S80 war in der jakutischen Population aufgrund dieses Ergebnisses nicht zu erwarten. Die Grnde dafr knnten in einer Substrukturierung dieser Population liegen und wurde mit dem F-Test berprft (Abschnitt 3.2.6). 4.1.5 Substrukturierung der jakutischen Populationsstichprobe? Die ermittelten Fis-Werte fr die Jakuten liegen fr alle drei untersuchten Marker im positiven Bereich und sind von Null deutlich verschieden. Dies wird durch Heterozygotendefizite verursacht und ist ein Hinweis fr Inzuchtverhalten in dieser Population. Das wre zu erklren wenn man, wie von Pakendorf (2001) fr die Jakuten nachgewiesen, einen bottleneck oder founder effect im Verlauf der jngeren Geschichte annimmt: Wenn nur wenige (mnnliche) Individuen nach einer Wanderung gen Norden die heutige Populationen begrndet haben, wie Pakendorf (2001) ausfhrt, knnte Inzucht in dieser Populationen die natrliche Folge gewesen sein. Denkbar wre auch, dass Inzuchtverhalten nur in den beiden Drfern (Namcy und Dalyr) der Probennahme vorkommt: Es handelt sich um sehr kleine Dorfgemeinschaften und Jakutien ist generell sehr dnn besiedelt (Pakendorf 1996). Fr einige Blutmarker konnte Pakendorf (1996) allerdings im Vergleich der beiden Dorfpopulationen keine signifikanten Unterschiede nachweisen. 4.2 Abschtzung der Divergenzzeit Zur Berechnung der Divergenzzeit nach der Methode von Goldstein et al. (1995a) wurde eine allgemein akzeptierte Generationszeit von 25 Jahren und fr jeden Marker die jeweilige spezifische Mutationsrate nach Sajantila et al. (1999) herangezogen. Die ber alle drei Marker (ApoB 3 Minisatellit, D1S80 und HumVWA31A) gemittelten Zeiten zeigen eine Trennung von Ru116

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4. Diskussion

mnen und Jakuten vor 30.074 bis 36.641 Jahren. Dies wrde einer Trennung nach Ankunft des modernen Menschen in Asien entsprechen. Allerdings zeigen die Zeitschtzungen fr die von mir verwendeten Marker eine groe Schwankungsbreite von einigen Jahren (5 Jahre) bis 164.000 Jahre, so dass die hier vorgenommene Abschtzung nicht valide ist. Zu einer Einschtzung, die diesem Ergebnis nahe kommt, kamen Cavalli-Sforza et al. (1994): Er postulierte eine erste Besiedelung Europas mit dem modernen Menschen von Westasien aus vor ungefhr 35.000 bis 40.000 Jahren. Zur Erhhung der Genauigkeit der Zeitabschtzung ist die Einbeziehung von zustzlichen Markersystemen erforderlich. Seielstad et al. (2002) erreichten mit 10 y-chromosomalen Markern eine nur sehr ungenaue Einschtzung der Auftrennung von Afrikanern und nicht-afrikanischen Populationen. Goldstein et al. (1995a) kamen mit 30 autosomalen Mikrosatelliten zu guten Ergebnisse in der Abschtzung von Populationsdivergenzen. In der praktischen Umsetzung scheiterte die Einbeziehung von mehr Markerdaten in dieser Arbeit daran, dass Programme, die die Distanz nach Goldstein et al. (1995a) berechnen, die Eingabe extern erhobener Allelfrequenzdaten nicht tolerieren. Es ist wie in Abschnitt 2.3 ausgefhrt die Eingabe originr erhobener Daten in Form von individuellen Genotypen erforderlich. Diese waren jedoch in der Mehrzahl der Publikationen zu rumnischen und sibirischen Populationenstichproben nicht angegeben. Die Distanz Delta mu verhlt sich linear zur vergangenen Zeit, unabhngig von der Populationsgre, wenn die betrachteten Populationen ein Mutations-Drift Gleichgewicht erreicht haben (Goldstein et al. 1995a). Fr die Population der Jakuten kann dieses Gleichgewicht nicht sicher angenommen werden, auch aus diesem Grund kann die Zeitabschtzung ungenau sein. Ein weiterer Grund fr eine nicht genaue Zeitabschtzung kann darin liegen, dass eingesetzte Marker Abweichungen vom stepwise-mutation Modell zeigen, das Goldstein et al. (1995a) zur Grundlage von Delta mu machen. Fr den ApoB 3 Minisatelliten ist eine solche Abweichung denkbar. Einen weiteren wesentlichen Faktor fr die Zeitabschtzung stellen die verwendeten Mutationsraten dar. Aus Tabelle 3.28 wird deutlich, dass die Variationsbreite der Schtzung fr jeden Marker einzeln sehr gro ist: Sie liegt im Bereich von einigen zehntausend Jahren. Die hier eingesetzten Mutationsraten nach Sajantila et al. (1999) weisen per se relativ breite Konfidenzintervalle auf, was zu groen Streuungen bei der Abschtzung fhrt. 117

_____________________________________________________________________________ Zustzlich variieren die Mutationsraten je nach Autor erheblich (siehe Tabelle 1.3): 4.3 Der Stichprobenumfang

4. Diskussion

Der in der rumnischen Gruppe erreichte Stichprobenumfang von insgesamt ca. 280 Individuen sollte ausreichend sein, um auch seltene Allele sehr polymorpher Systeme, wie beim ApoB 3 Minisatelliten, detektieren zu knnen. So wurden in dieser Arbeit fr die rumnische Gruppe insgesamt 21 verschiedene Allele nachgewiesen. Dem gegenber steht eine Anzahl von bislang 25 bekannten Allelen (Latorra et al. 1994). In der sibirischen Gruppe wurden dagegen nur 17 Allele detektiert. Man kann daher davon ausgehen, dass die hier nachgewiesene genetische Variabilitt fr alle drei untersuchten Marker fr die rumnische Populationsstichprobe reprsentativ ist. Fr die jakutische Stichprobe kann man dies fr den Marker HumVWA31A annehmen. Fr den ApoB 3 Minisatelliten ist das Vorliegen reprsentativer Werte nicht wahrscheinlich, aber das Gegenteil wurde unter anderem mit der berprfung des Hardy-Weinberg Gleichgewichtes hier nicht nachgewiesen. 4.4 Genetische Distanzen Die hier betrachteten Zeitrume, die sich mit der ethnischen Entstehung des rumnischen Volkes beschftigen, stellen nur kurze Momente von einigen hundert bis mehrere tausend Jahre dar, verglichen mit der Entwicklung des modernen Menschen. In diesen kurzen Zeitrumen spielt die Allelentstehung durch Mutation eine eher untergeordnete Rolle, trotz hoher Mutationsraten repetitiver Marker. Viel eher kommen Effekte genetischer Drift zum Tragen, besonders in kleinen Populationen, wie sie durch Isolierung, bottlenecks oder founder-Effekte verursacht werden. Die Distanz nach Reynolds et al. (1993) kam in den hier durchgefhrten Abstandsanalysen zu guten Ergebnissen. Es wurde eine Auftrennung der Populationen in dichotomen Verzweigungen erreicht, wobei die Auftrennung der kontinentalen Gruppen keine Probleme zeigte. Auch innerhalb der Europer lste die Distanz die Gruppen befriedigend auf. Die bootstrap-Werte lagen fr einige Aufspaltungen allerdings unter 50 %, so dass diese nicht ausreichend verlsslich sind. Dies wies dann auch die Netzwerkdarstellung nach, welche die innereuropische Gruppe nur unzureichend aufgelst zeigte.

118

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4. Diskussion

Auch Destro-Bisol et al. (2000) konnten zeigen, dass sich nach einer Abstandsuntersuchung an 11 Populationen mit sechs Tetranukleotid-Markern, basierend auf der Distanz nach Reynolds et al. (1983) sowie der Distanz Dsw (Shriver et al. 1995) Baumtopologien ergaben, die eine gute Auftrennung der Populationen nach Kontinenten zeigten. Zustzlich war die Distanz nach Reynolds in der Lage, zu einer Substrukturierung innerhalb der kontinentalen Gruppierungen beizutragen, was den brigen Distanzmaen nur sehr unzureichend gelang. Das genetische Abstandsma nach Nei (1972) ergab nach Clusteranalyse und bootstrapping eine Baumstruktur, die der nach Reynolds in allen Verzweigungen glich. Beide Baumdarstellungen unterschieden sich lediglich in einem bootstrap-Wert. Ebenso glich das Netzwerk dem der Distanzanalyse nach Reynolds. Die Distanz nach Nei (1972) bercksichtigt Mutationen, bezieht Migrationseinflsse (Genfluss) aber nicht mit ein. Das knnte die Ursache fr die relativ ungenaue Auflsung der Beziehungen der innereuropischen Populationen sein, denn die fr die hier untersuchten europischen Gruppen, einschlielich der Population der Rumnen bzw. ihrer Vorgnger, sind in den letzten zwei- bis dreitausend Jahren in groem Umfang Wanderungswellen belegt. Fr die unzureichende Differenzierung der europischen Gruppen kmen auch Markereffekte in Betracht, da die Distanzanalysen Nei (1972) und nach Reynolds et al. (1983) bereinstimmende Baumstrukturen und Netzwerke ergaben. Die ber die Cavalli-Sforza Distanz erhaltenen Baumtopologien waren in Bezug auf die Einordnung der Rumnen bei den Europern abweichend von denen nach Nei und Reynolds. Die Rumnen wurden nach Cavalli-Sforza mit den slawischen Populationen (Kroaten und Slowaken) gruppiert, der Abstand zu Griechen und Italienern war im Gegensatz zur Distanzanalyse nach Nei und Reynolds deutlich grer. Cavalli-Sforzas Distanz beruht auf dem Produkt der gemeinsamen Allelfrequenzen zweier Populationen. Damit erscheint dieses Abstandsma geeignet fr Populationen, von denen zu erwarten ist, dass sie noch eine grere Anzahl gemeinsamer Allele aufweisen. Dies trifft fr erst krzlich voneinander getrennte Gruppen zu, wie die in dieser Studie untersuchten europischen Gruppen. Da der Distanz nach Cavalli-Sforza kein spezifisches Mutationsmodell zugrunde liegt, erscheint diese Distanz auf der anderen Seite fr Minibzw. Mikrosatelliten nicht gut geeignet.

119

_____________________________________________________________________________ 4.5 Die eingesetzten Marker

4. Diskussion

Die im Rahmen dieser Untersuchung verwendeten DNS-Marker liegen auf drei verschiedenen autosomalen Chromosomen. Das bedeutet, dass sie nicht zusammenhngend vererbt werden (no linkage). Mit dem Test auf Kopplungsungleichgewicht konnte eine unabhngige Vererbung aller drei Marker besttigt werden (siehe Abschnitt 3.2.3). Alle Marker liegen auerhalb von (Eiwei-) kodierenden Sequenzen, weshalb sie nicht der Selektion unterliegen. In dieser Arbeit wurde der ApoB 3 Minisatellit auf seine Variation hinsichtlich der Repeatanzahl untersucht. Es ist bekannt, dass der ApoB3 Minisatellit eine sehr komplexe Struktur aufweist mit 2 verschiedenen Repeattypen. Diese zeigen zustzlich Vernderungen ihrer Konsensussequenz durch Punktmutationen und Deletionen (siehe Abschnitt 1.1.8.3). Eine Analyse der Allele auf diese Punktmutationen erfolgte in dieser Arbeit nicht, liee aber interessante Rckschlsse auf die Entstehung des jeweiligen Allels zu. Insofern wre eine Sequenzierung als Aufschluss ber den Aufbau der gefundenen Allele eine sinnvolle und wichtige Ergnzung. Hierdurch werden die Strukturvarianten und die in diesen enthaltene genetische Information des ApoB3-Markers erst in vollem Umfang erfasst. Fr den ApoB3 Minisatelliten ist nicht zuletzt auf Grund seiner komplizierten Struktur der Mutationsmechanismus nicht ganz klar: Ein simples Modell wie das stepwise-mutation Modell (SMM), wird der Vielfalt der fr diesen Marker beobachteten Varianten nicht gerecht. Buresi et al. (1996) untersuchten per Sequenzierung Strukturvarianten des ApoB3-Markersystems und schlugen ein komplexes Modell zur Entstehung der Subtypen vor (mit Punktmutationen, Expansionen, Kontraktionen und Konversionsereignissen). Mini- und Mikrosatelliten sind auf Grund ihrer hohen Diversitt und der hohen Mutationsraten geeignet, phylogenetische Studien beim Menschen im Bereich von mehreren tausend Generationen durchzufhren (Calabrese et al. 2001). Generell sind Mutationsmodelle fr Mikrosatelliten besser geeignet, die nicht das reine stepwise-mutation Modell zugrunde legen, sondern Modelle, die auch die Entstehung von Punktmutationen miteinbeziehen (Calabrese et al. 2001). Shriver et al. (1995) untersuchten drei Arten von Mikro- und Minisatelliten, nmlich Mikrosatelliten mit 1-2 Basenpaare langen und 3-5 Basenpaare langen Wiederholungseinheiten sowie Minisatelliten mit Wiederholungseinheiten von 15-70 Basenpaaren Lnge. Sie verglichen die 120

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4. Diskussion

beobachteten Allelfrequenzmuster mit dem aufgrund des infinite-alleles Modell (IAM) und SMM jeweils erwarteten Musters. Dabei konnten sie feststellen, dass die Allelverteilungen der Mikrosatelliten grtenteils, die der Minisatelliten jedoch nur zu einem geringen Teil mit den nach dem stepwise-mutation Modell erwarteten Werten bereinstimmten. Sie postulierten, dass sich die Mutationsmodelle fr Mikro- und Minisatelliten unterscheiden: Minisatelliten mutieren eher nach dem IAM, Mikrosatelliten dagegen eher nach dem SMM. Zum gleichen Ergebnis kommt Murray (1996), der fr die Evolution von Mikrosatelliten mit 5-6 Basenpaaren das SMM sieht, fr Dinukleotid-Mikrosatelliten dagegen einen Prozess, der eher nach dem two-phase Modell abluft. Daher empfiehlt er, die Ergebnisse von verschiedenen Arten repetitiver Marker keinesfalls zu einem Datensatz zusammen zu fassen, sondern diese getrennt zu verarbeiten und zu interpretieren. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Markerarten eingesetzt (ein Mikrosatellit und zwei Minisatelliten). Die Daten wurden nicht getrennt nach Markertypen ausgewertet, da die Ergebnisse einer so geringen Markeranzahl keine signifikanten Schlussfolgerungen erwarten lassen. Aus dem gleichen Grund wurden fr beide Markertypen die gleichen Distanzanalyseverfahren gewhlt. Denn es kommt fr den ApoB 3 Minisatelliten ein anderes Mutationsmodell, das two-phase oder das infinite alleles Modell, infrage, als fr den HumVWA31A Mikrosatelliten. In den paarweisen Populationsvergleichen basierend auf den Allelfrequenzen (Abschnitt 3.4) zeigte sich der ApoB 3 Minisatellit als nicht ausreichend informativ: In acht Populationsvergleichen konnten in keinem Falle hnlichkeiten der Rumnen mit anderen europischen Populationen detektiert werden, obwohl dies mit anderen Markern fr mglich war. Auch Populationen, die aufgrund von bereinstimmungen mit mehreren Markern den Rumnen hnlich erschienen, unterschieden sich fr diesen komplex aufgebauten Minisatelliten. D1S80 hingegen konnte gut zwischen den Rumnen hnlichen und genetisch weiter entfernt stehenden Populationen differenzieren: Mit Ausnahme der Slowenen und Serbokroaten, fr die keine D1S80Daten vorlagen, zeigten die Allelhufigkeiten fr alle hier untersuchten europischen Populationen hnlichkeiten. Dagegen lagen fr die Jakuten und die afrikanische Stichprobe hoch signifikante Unterschiede fr D1S80 vor. Im Vergleich mit dem ApoB3-Marker knnen also nicht allein die hohe Zahl an verschiedenen Allelen fr die unterschiedliche Diskriminanz verantwortlich sein. . 121

_____________________________________________________________________________ 4. 6 Vergleich der Rumnen mit europischen Populationen: Exakte Tests

4. Diskussion

Die Marker ApoB3 Minisatellit und FGA wiesen in dieser Arbeit im paarweisen Populationsvergleich in allen Fllen auf hoch signifikante Unterschiede zwischen den ethnischen Gruppen hin. Dass eine Diskriminierung nach Kontinenten erfolgte, erstaunte nicht. Allerdings zeigten beide Marker auch fr die nher verwandten europischen Gruppen keine hnlichkeiten, sondern ebenfalls hoch signifikante Unterschiede in der Allelverteilung. Diese Marker mssen also fr diese Untersuchung als nicht informativ gelten. Chikchi et al. (1998) untersuchten 7 hypervariable nuklere DNS-Marker (darunter auch HumVWA31A, D1S80 und ApoB 3 Minisatelliten) mit der Methode des spatial autocorrelation (also mit geografischem Bezug) fr europische Populationen. Fr den ApoB3-Marker ergab sich (mit Ausnahme eines einzigen Allels) eine eher zufllige Allelvariation innerhalb Europas. Alle anderen Marker, so auch D1S80 und HumVWA31A, zeigten einen substantiellen Grad geografischer Clusterbildung (Zitat Chikchi et al. 1998). Dies besttigt die Beobachtung zum ApoB 3-Marker in dieser Arbeit Auch das ABO-Antigenmarkersystem erbrachte hier fr keine der europischen Populationspaare hnlichkeiten. Die Ursache knnte darin liegen, dass es sich beim ABO-System um ein relativ altes Markersystem handelt, fr dessen Allele sich Unterschiede schon seit langer Zeit ausprgen konnten. Nimmt man diese drei Systeme vom Vergleich der Rumnen mit anderen europischen Gruppen aus, ergab sich eine groe genetische Nhe zu den Italienern, Griechen, Ungarn sowie Deutschen mit bereinstimmungen in der Allelverteilung fr jeweils 4 Marker. hnlichkeit in 3 Markersystemen zeigten die Slowaken, wobei hier allerdings Daten zu D2S11 fehlten. Die Ergebnisse des paarweisen Populationsvergleichs der Rumnen mit den Kroaten lieferten hnliche Allelverteilungen fr 2 von 5 untersuchten Markern. In Bezug auf die Ergebnisse der Abstandsanalysen kann man festhalten, dass die paarweisen Populationsvergleiche die Rumnen ebenfalls in eine engere genetische Beziehung zu den Griechen, Italienern, Ungarn und Deutschen setzen, als zu den slawischen Gruppen. Die Aussagen zu den Slowenen und Serbokroaten lassen allerdings wegen der ungnstigen Datenlage in nur sehr begrenztem Umfang Schlussfolgerungen zu.

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4. Diskussion

4.7 Vergleich der Rumnen mit europischen Populationen: Mantel-Tests Die Ergebnisse des Mantel-Tests (paarweiser Populationsvergleich basierend auf Allelfrequenzen von 8 bzw. 9 Markern) allerdings zeigen dem sich aus den Abstandsanalysen ergebenden Resultat (enge Relation der Rumnen mit Griechen und Italienern) widersprechende Ergebnisse. Hier liegen sehr hohe Korrelationen der Rumnen mit den Ungarn vor, die geringsten dahingegen mit den Griechen. Eine hohe Korrelation findet sich auch mit den Italienern und Slowaken, eine eher geringe mit den Kroaten. Die Unterschiede in den Korrelationskoeffizienten sind insgesamt gesehen allerdings sehr gering, so dass die Aussagekraft dieser Analyse als geringer als die der Abstandsuntersuchungen einzuordnen ist. 4.8 Vergleich der Rumnen mit europischen Populationen: Abstandsanalysen Insgesamt deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine genetische Nhe der Rumnen zu den Griechen hin. Ein etwas grerer genetischer Abstand liegt zu den Italienern vor. Diese Einflsse knnten im Falle der Griechen mit den intensiven Handelsbeziehungen zwischen Griechen, Thrakern und dakischen Stmmen sowie der schon sehr frhen Prsenz griechischer Kolonien im Gebiet des heutigen Rumniens erklrt werden. Die Nhe zur italienischen Bevlkerung kann als Folge der ber einen lngeren Zeitraum hinweg bestehenden rmischen Besatzung gesehen werden. In dieser Zeit kamen nicht nur rmische Soldaten in die Provinz, sondern auch viele Siedler mit zivilen Berufen. Einen weiteren, sehr augenflligen Beleg fr den historischen rmischen Einfluss stellt die Zugehrigkeit der rumnischen Sprache zum romanischen Zweig der indo-europischen Sprachfamilie dar, die deren Grammatik und einen groen Anteil des Wortschatzes geprgt hat. Betrachtet man eine linguistische Gruppierung der Europer [Klassifizierung der indo-europischen Sprachfamilie nach Ruhlen (1987) (siehe Abschnitt 1.11.3)], fallen die Rumnen in die Romanische Gruppe, zusammen mit den Italienern. Alle brigen, mit den Rumnen in dieser Arbeit verglichenen Populationen gehren anderen, vom rumnischen Zweig verschiedenen Gruppen an. Das betrifft die Deutschen und die Griechen, sowie die slawische Gruppe, die Slowaken, Slowenen und die Serbokroaten umfasst. Die Ungarn dagegen gehren zur uralischen Sprachfamilie, und hier zur Finno-ugrischen Gruppe. Sie stellen gegenber den anderen Populationen im sdstlichen Europa ein linguistisches Isolat dar. Auch Reed et al. (1992) konnten eine grere genetische Nhe der Rumnen zu den Italienern basierend auf Da123

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4. Diskussion

ten zu HLA- Klasse I und II-Genen belegen. Neben Italienern analysierten sie Deutsche, Ungarn, Jugoslawen u.a. Der rumnische Stichprobenumfang war gering, er betrug 83 Individuen. Eine von der Stichprobengre her sehr umfangreiche Studie von Walter & Danker-Hopfe (1993) unterstreicht ebenfalls die Nhe der Rumnen zu Griechen und Italienern. Sie untersuchten die bereinstimmung von sprachlichen und genetischen Gruppierungen in Europa auf der Basis von 7 polymorphen Blutgruppen- und Serumprotein-Systemen. (Teile dieser Daten wurden in dieser Arbeit ebenfalls zu Abstandsanalysen herangezogen). Es ergab sich eine genetische Gruppenbildung, die berwiegend groe hnlichkeit mit der linguistischen Differenzierung der indo-europischen Populationen zeigte. In der Stammbaumanalyse zeigte sich die rumnische Population - als Teil der romanischen bergruppe - in einem Cluster mit den Griechen. Ein nahes Cluster umfasste die slawischen, ungarischen, baltischen und finnischen Populationen. Davon abgesetzt waren in einem Cluster die germanischen und keltischen Gruppen sowie die Basken. Fr Daten von mitochondrialen und y-chromosomalen Markern ist eine Assoziation mit der sprachlichen Klassifizierung bislang nicht belegt: Eine Untersuchung zur bereinstimmung von mitochondrialen DNS-Daten (Sequenzen) und y-chromosomalen Variationsdaten (Mikrosatelliten) mit linguistischen Gruppierungen bei Europern (Belledi et al. 2000) ergab, dass die mitochondrialen und y-Chromosomen Variationen nicht bereinstimmten mit der linguistischen Differenzierung. Dies fhren die Autoren auf einen substantiellen Genfluss zwischen den europischen Populationen zurck. Dadurch wurden die frher bestehenden Assoziationen zwischen Sprach- und Genfamilien verwischt. Haupteintrittswege in die rumnischen Gebiete waren fr einwandernde Gruppen die Kstengebiete des Schwarzen Meeres sowie die Routen entlang der Donau und ihrer Nebenflsse (Boroneant 1999). Als Migrationsbarriere sind die Karpaten zu sehen. Dies belegt eine Untersuchung von Stefan et al. (2001), die Daten zu 9 single-nuclear polymorphism Markern des Y-Chromosoms in 219 rumnischen Mnnern aus allen Regionen Rumniens mit 70 Mnnern aus der Republik Moldawien verglichen. Sie stellten fest, dass die Karpaten eine Barriere in genetischer Hinsicht darstellen, da sich die Gruppen stlich und westlich der Karpaten voneinander in ihrer Haplogruppen-Verteilung signifikant unterschieden. Drfen die in dieser Arbeit herausgearbeiteten Einflsse von griechischer und italienischer Seite als reprsentativ fr die gesamte rumnische Bevlkerungsgruppe gelten? Die Gebiete, aus de124

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4. Diskussion

nen die hier untersuchten Populationsstichproben stammen, liegen sdlich der Karpaten. In Bukarest als Hauptstadt sind alle Bevlkerungsanteile Rumniens vertreten. Daher sollte die Bukarester Stichprobe reprsentative Ergebnisse liefern, da sie eine ausreichend groe Individuenanzahl (ber 150) umfasste. Die Stichprobe aus Ploiesti war mit ungefhr 100 weiblichen Individuen vom Umfang her kleiner. Ein Vergleich beider Stichproben zeigte, dass eine vllige Gleichheit nur fr den Minisatelliten ApoB3 gegeben war. Fr D1S80 und HumVWA31A zeigten sich grenzgradig statistische Differenzen. In der weiteren Analyse ergaben sich keine Anzeichen fr eine Abweichung der Allelfrequenzen von Hardy-Weinberg Proportionen. Es gab auch keine Hinweise auf Substrukturierung der gepoolten rumnischen Stichprobe. Das bedeutet, dass weder Inzucht, Paarungsschranken oder Effekte starker genetischer Drift aufgrund von bottlenecks vorliegen. Die Abstandsanalysen zeigten zu slawischen Gruppen keine eindeutige Beziehung. Die Slowaken zeigten sich den Rumnen nher als die Kroaten, die sich in allen Abstandsanalysen auch von allen brigen europischen Populationen abgrenzten. Slawische Gruppen durchwanderten vielfach das rumnische Gebiet und hinterlieen dabei dort eine Anzahl an Siedlern. Die rumnische Sprache ist mit einer Vielzahl an Vokabeln slawischen Ursprungs ein Beweis fr den Einfluss dieser Ethnie. Erstaunlicherweise scheint sich dies nicht im Genpool der heutigen Rumnen wiederzuspiegeln. In ihrer Dissertation untersuchte Ceacareanu (2001) die Verteilung der Allelhufigkeiten des D1S80 Markers in 193 Individuen aus allen Regionen Rumniens. Es wurden Abstandsanalysen mit Populationen aus ganz Europa durchgefhrt. Daraus ergab sich ein phylogenetischer Baum, der eine groe Nhe der Rumnen zu einem Cluster aus Ost-Slowenen, Russen und Belorussen zeigte. Die Italiener und die Griechen lagen in einem Cluster zusammen, das allerdings von den Rumnen weit entfernt lag. Es war gruppiert mit Populationen des Nahen Ostens (Kuwaiti, Jordaniern etc.). Als klare Einschrnkung der Aussagekraft sollte man fr diese Studie im Auge behalten, dass hier lediglich ein Markersystem die Grundlage fr die Abstandsanalyse bildete. Eine Studie von Huckenbeck et al. (2000) untersuchte 2 Mikrosatelliten-Systeme (TH01 und HumVWA31A) in Populationen von Aromunen, Albanern und Rumnen auf ihre genetischen hnlichkeiten mit anderen, vorwiegend sdosteuropischen Gruppen (Slowaken, Slowenen, Ungarn, sterreicher, Deutsche). Die Rumnen bildeten ein Cluster mit den Slowenen und Slo-

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4. Diskussion

waken, die Deutschen mit den sterreichern und den Ungarn, die Albaner mit den Aromunen aus Albanien. Griechen und Italiener waren in diese Untersuchung allerdings nicht einbezogen. Schmidt & Scheil (2000) untersuchten die Blutgruppensysteme ABO, MN, Rhesus und HP in zwei regionalen rumnischen Gruppen (aus Constanza und Ploiesti) und errechneten daraus genetische Distanzen. Danach wiesen die rumnischen Gruppen untereinander eine groe (genetische) hnlichkeit auf. Vergleiche mit anderen Populationen zeigten hohe genetische hnlichkeiten vor allem mit Bulgaren, Moldawiern und Ungarn, whrend die Rumnen zu Griechen und Albanern grere genetische Abstnde hatten. Genetische hnlichkeiten mit slawischen Gruppen sollten noch intensiver untersucht werden, da diese in den zweiten Teil der hier durchgefhrten Abstandsanalyse aufgrund fehlender Markerdaten nicht einbezogen werden konnten. Zu Deutschen und Ungarn ergab sich in den Abstandsanalysen berwiegend ein grerer Abstand, als zu allen anderen untersuchten europischen Populationen, sieht man von den Kroaten ab. Die Ergebnisse der paarweisen Populationsvergleiche sind hingegen nicht eindeutig. Sie zeigen eine grere bereinstimmung der Ungarn und Italiener mit den Rumnen, als mit den Griechen bzw. Deutschen. Ungarische Gruppen sind stetig und seit langer Zeit in Rumnien vertreten, beginnend mit den Magyaren, die seit dem 9. Jahrhundert in Rumnien siedeln. Die in Rumnien auch heute noch in relativ hoher Zahl lebenden Ungarn stellen einen Anteil von 6,6 % der Bevlkerung Rumniens (CIA Word Factbook online 2002). Der ungarische Einfluss macht sich vor allem in den an Ungarn grenzenden Gebieten bemerkbar, im Nordwesten Rumniens, in Transsylvanien. Dort sowie im Banat im Sdwesten Rumniens leben bis heute auch deutsche Populationen, deren Bevlkerungszahlen sich allerdings im Verlauf des zweiten Weltkrieges drastisch reduziert haben: Die Deutschen reprsentieren einen Anteil von 0,3 % der rumnischen Bevlkerung (CIA Word Factbook online 2002). Dass deutsche und ungarische Anteile im Genbestand der Rumnen in dieser Arbeit nur in geringem Mae nachgewiesen werden konnten, knnte zwei Ursachen haben: 1. Die Bevlkerungsstichproben dieser Arbeit stammen aus dem Sden Rumniens, sie knnten also in Bezug auf genetische Einflsse im Norden des Landes doch nicht reprsentativ sein. 2. Es ist bekannt, dass es mit der rumnischen Bevlkerung nur in begrenztem Mae zu Vermischungen mit deutschen und ungarischen Einwanderern kam.

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4. Diskussion

Die im Gebiet des heutigen Rumniens siedelnden Populationen wurden durch die zahlreichen, verschiedenen Eroberer, Besatzer sowie Durch- und Einwanderer sowohl in genetischer und kultureller Hinsicht beeinflusst. Ereignisse aber, die eine zahlenmig starke Dezimierung der im damaligen Rumnien siedelnden Stmme bzw. der rumnischen Bevlkerung nach sich zogen, also sogenannte bottlenecks oder founder Effekte sind bislang nicht direkt nachgewiesen worden. Lediglich fr eine kleine Gruppe, die Aromunen: Diese gelten als eine sehr ursprngliche rumnische Gruppe, die whrend der Zeit der Auseinandersetzungen mit den Trken sdwrts wanderten. Sie finden sich heute verstreut in den Hhenzgen von Mazedonien, dem sdlichen Albanien, Bulgarien und Griechenland (Schmidt et al. 2000). Dort leben sie in kleinen, sehr isolierten Gemeinschaften, in denen founder-Effekte nachzuweisen sind (Schmidt et al. 2000, Huckenbeck et al. 2000) Es wird in diesem Zusammenhang immer wieder darauf hingewiesen, dass sich whrend der Zeit der rmischen Besatzung ein Teil der ursprnglichen, rumnischen (Geten-) Stmme in die Gebiete nrdlich der Donau sowie in die schwer zugnglichen Hhenzge der Karpaten zurckzog. Nach Abzug der Rmer und Rckkehr dieser Rest-Populationen knnten sich in begrenztem Umfang bottleneck-Effekte manifestiert haben. In dieser Arbeit konnten Ergebnisse solcher Ereignisse in den hier untersuchten Markersystemen fr die rumnische Populationsstichprobe nicht nachgewiesen werden. 4.9 Ausblick Weitere Einblicke in die genetischen Beziehungen der rumnischen Bevlkerung mit ihren europischen Nachbarn knnten Analysen mitochondrialer und y-chromosomaler Daten bringen. Damit wre es mglich nachzuweisen, ob und in welchem Ausma patri- oder matrilineare Verhaltensmuster zur genetischen Prgung beigetragen haben. Fr weitergehende, genauere Analysen wre neben der Einbeziehung anderer Markertypen eine Erhhung der Anzahl der Marker sehr wichtig. Damit liee sich die Aussagekraft von Vergleichen erhhen. Durch eine reine Erhhung der Stichprobengre ist die Aussagegenauigkeit weniger gut zu verbessern. Interessant wren zustzliche Untersuchungen mit Daten slawischer Populationen, insbesondere aus den Nachbarstaaten Rumniens. Die Beziehung zu slawischen

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4. Diskussion

Gruppen war in dieser Arbeit aufgrund mangelnder Daten zu polymorphen Markern nicht ausreichend genau zu bestimmen. Durch die Untersuchung struktureller Mini- und Mikrosatelliten-Variationen mittels Sequenzierungen knnten Einblicke in die Feinstruktur und damit in den zugrunde liegenden Mutationsmechanismus gewonnen werden. Die Sequenzanalyse wrde gleichzeitig den Informationsgewinn zum jeweiligen Marker erheblich vergrern. Beispielsweise konnte in einer Untersuchung struktureller Variationen des HumVWA31-Mikrosatelliten (Brinkmann et al 1996) nachgewiesen werden, dass das Vorkommen von zwei bestimmten Allelen 15 und 16 auf die afrikanische Populationenstichprobe beschrnkt war. Fr komplexe Marker, wie insbesondere den ApoB3 Minisatelliten, wre das eine sehr sinnvolle Ergnzung.

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5. Zusammenfassung ____________________________________________________________________________________

5. ZUSAMMENFASSUNG Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei rumnische Populationsstichproben sowie eine sibirische Populationsstichprobe aus der Republik Jakutien mit Hilfe von drei polymorphen DNS-Markern untersucht. Die Geschichte Rumniens und seiner Bevlkerung ist kompliziert und wird auerordentlich kontrovers beurteilt. Das rumnische Gebiet stellte fr Jahrhunderte eine Region der durchziehenden sowie siedelnden Vlker dar. Wanderungsbewegungen sind zu allen Zeiten, beginnend in der Steinzeit, nachweisbar. Vor allem in der Periode nach der letzten Eiszeit, im Meso- und Neolithikum, kam es zu verstrkten Immigrationen in das Gebiet des heutigen Rumniens als auch zu Durchwanderungen verschiedener Volksstmme. Dabei zogen diese zunchst, dem Rckzug der Gletscher folgend, nach Norden. Spter waren Zuwanderungen aus allen Richtungen zu verzeichnen. In diesen Zeiten stellten die schwer zugnglichen Gebiete der Karpaten fr die Einwohner Rumniens Zufluchtsttten vor eindringenden Vlkern dar. Wissenschaftliche Daten ber rumnische Populationen in der angelschsischen (oder allgemeiner: der westlichen) Literatur sind auch einige Jahre nach der ffnung des Eisernen Vorhangs und der Liberalisierung der Kommunikation, immer noch nicht sehr zahlreich. Es kommt hinzu, dass nationale rumnische Verffentlichungen meist in der Landessprache abgefasst sind. Die entsprechenden Zeitschriften sind hier berwiegend nicht erhltlich und auerdem stellen sich der inhaltlichen Verwertung meist sprachliche Hindernisse entgegen. In diesem Kontext sollten im Rahmen dieser Arbeit genetische Daten zur rumnischen Population gesammelt werden. Ein weiteres Ziel war, genetische Einflsse europischer Nachbarpopulationen nachzuweisen, um Einblicke in die Entstehung des rezenten rumnischen Genbestands zu erhalten. Diese Fragestellungen wurde durch die molekulare Analyse von drei sehr polymorphen, autosomalen DNS-Markern untersucht. Polymorphe DNS-Marker sind fr phylogenetische und populationsgenetische Untersuchungen aufgrund ihrer hohen Mutationsraten und der Vielzahl von Allelen geeignet. Insbesondere knnen mit diesen Markern weit in der Populationsgeschichte zurck liegende Ereignisse indirekt untersucht werden. Denn im Gegensatz zu mitochondrialen und y-chromosomalen Markern liegt fr autosomale Marker eine hhere effektive Populationsgre vor. Diese lsst Evolutionsfaktoren wie z.B. genetische Drift langsamer 129

5. Zusammenfassung ____________________________________________________________________________________

wirken, als fr mt-DNS und y-chromosomale Marker, deren effektive Populationsgre um einiges geringer ist. Die Daten dieser Arbeit wurden fr genetische Abstandsanalysen der rumnischen Stichprobe um Daten aus der Literatur zu weiteren Markern und Populationen ergnzt. Es lagen als Ausgangsmaterial Blutproben von zwei rumnischen Populationen (aus Bukarest und Ploiesti) vor. Der statistische Vergleich der Allel- und Genotypenhufigkeiten ergab fr den ApoB 3 Minisatelliten eine signifikante Gleichheit beider Gruppen. Fr die Marker D1S80 und HumVWA31A lagen die p-Werte fr die Tests auf Unterschiede an der Signifikanzgrenze. Die Ursache knnte ein fr beide Gruppen zu geringer Stichprobenumfang sein. Die Markerdaten beider Stichproben wurden fr die weiteren Analysen trotz dieser geringfgigen Verschiedenheiten zusammengefasst. Zustzlich zur Untersuchung der Rumnen erfolgte eine genetische Charakterisierung der Populationsstichprobe aus Jakutien mit den autosomalen Markern. Diese Population stellt ebenfalls eine bislang nur in geringem Ausma mit genetischen Daten beschriebene Gruppe dar, insbesondere sind Daten zu autosomalen Markern nur in sehr begrenztem Umfang vorhanden. Die jakutische Gruppe, fr die auf der Basis von y-chromosomalen Markeranalysen eine eingeschrnkte genetische Diversitt nachgewiesen wurde, sollte darauf untersucht werden, ob fr die autosomalen Marker hnliche Effekte nachgewiesen werden knnen. Die Daten der rumnischen Populationsstichprobe wurden diesen zur vergleichenden Beurteilung gegenbergestellt. Fr alle drei Marker konnten statistisch hoch signifikante Unterschiede der Jakuten zu den Rumnen nachgewiesen werden. Fr die Gesamtstichprobe der Rumnen gab es keine Hinweise auf Inzucht oder durch sog. Populationssubstrukturierung vernderte Allel- bzw. Genotypfrequenzen. Allerdings zeigte sich fr den Marker ApoB 3 Minisatellit ein gestrtes Hardy-Weinberg Gleichgewicht. Fr die jakutische Populationsstichprobe konnten dagegen deutliche Anzeichen fr eine eingeschrnkte genetische Diversitt nachgewiesen werden. Es lagen fr die Marker D1S80 und ApoB3 Minisatellit statistisch signifikante Abweichungen von den HardyWeinberg Proportionen vor. Zustzlich konnte fr D1S80 ein deutliches Heterozygotendefizit nachgewiesen werden. Der F-Tests besttigte diese Ergebnisse dadurch, dass sich mit diesem

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5. Zusammenfassung ____________________________________________________________________________________

Test starke Hinweise fr Inzuchtverhalten innerhalb der jakutischen Populationsstichprobe ergaben. Ein Versuch der Abschtzung des Zeitraumes der Populationstrennung von Rumnen, als Reprsentant osteuropischer Populationen und den Sibiriern (Jakuten) lieferte Werte, die mit einer sehr groen Schwankungsbreite behaftet waren: Es wurde eine ber alle drei Marker gemittelte Divergenzzeit von ungefhr 33.000 Jahren errechnet. Zur genaueren Einschtzung sollte eine erheblich grere Anzahl von Markern einbezogen werden. Die genetischen Abstandsanalysen ergaben eine enge genetische Beziehung der Rumnen zu den Griechen. Ein etwas grerer genetischer Abstand fand sich zu den Italienern. Die Italiener waren den Rumnen dagegen im paarweisen Populationsvergleich nher, als die Griechen. Historisch lassen sich die griechischen Einflsse aus stetigen und langjhrigen Kontakten beider Ethnien ableiten sowie aus genetischen Vermischungen, die aus der Zeit der griechischen Kolonien (etwa 700 bis 500 v. Chr.) stammen. Genetische Einflsse der Italiener knnen auf die Zeit der rmischen Besatzung (etwa 100 bis 270 n. Chr.) zurckgefhrt werden. Es kam whrend der rmischen Herrschaft im heutigen rumnischen Gebiet zu Vermischungen, da sich in groer Zahl rmische Siedler niederlieen. Ein deutliches Zeichen fr den rmischen Einfluss ist die Einbringung der rmischen Sprache in die rumnische Kultur. Ungarn und Deutsche zeigten in den Distanzanalysen eine mittlere genetische Nhe zu den Rumnen. Sie ordneten sich zwischen den slawischen Gruppen mit einem hheren Abstand und den Italienern bzw. Griechen mit einem geringen genetischen Abstand ein. Die paarweisen Vergleiche der Populationen zeigen eine grere bereinstimmung der Ungarn mit den Rumnen, als die Deutschen. Mit den im rumnischen Gebiet lebenden Deutschen, die hauptschlich zwischen dem 12. und dem 18. Jahrhundert einwanderten, haben Vermischungen offensichtlich in etwas geringerem Mae stattgefunden, als ungarischen bzw. magyarischen Populationen. Bedeutende genetische ungarische Einflsse, die diese Ergebnisse belegen, bestanden ungefhr seit 900 n. Chr., als das im Nordosten gelegene Transsylvanien von Magyaren besiedelt wurde. Seit dieser Zeit ist in Transsylvanien ein hoher ungarischer Bevlkerungsanteil vertreten, der aufgrund der geografischen Nhe den hier nachgewiesenen genetischen Einfluss durch stndigen Genfluss ausmacht.

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5. Zusammenfassung ____________________________________________________________________________________

Die slawischen Populationen zeigten zur rumnischen Gruppe einen greren genetischen Abstand als Griechen, Italiener, Deutsche und Ungarn. Dieser Befund ist deswegen bemerkenswert, da in der rumnischen Sprache bis heute ein bedeutender Anteil slawischer Elemente nachzuweisen ist, und viele slawische Stmme durch das Gebiet des heutigen Rumniens zogen und auch dort siedelten. Fr die paarweisen Populationsvergleiche lagen nur in sehr eingeschrnktem Mae Daten vor. Hier wren weitergehende Untersuchungen sinnvoll. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zu den genetischen Verwandtschaftsbeziehungen der Rumnen beruhen auf zwar auf einer relativ geringen Zahl an genetischen Markern und Vergleichspopulationen. Trotzdem stellen sie eine Annherung fr die Einschtzung der Einflsse auf den heutigen Genbestand der Rumnen im europischen Kontext dar.

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144

7. Anhang _____________________________________________________________________________ 7. ANHANG 7.1 Daten der rumnischen Populationsstichprobe aus Ploiesti 7.1.1 Allelhufigkeiten und Genotypen
Tabelle 7.1: Liste der Allele des ApoB 3- und D1S80- Minisatelliten sowie des HumVWA31AMikrosatelliten der rumnischen Population aus Ploiesti Apolipoprotein B 3' Minisatellit Allel 1 Allel 2 35 37 37 37 31 37 37 37 35 35 35 37 37 41 35 37 37 39 37 47 37 39 31 37 35 35 33 37 35 37 27 35 35 37 33 37 37 49 35 37 41 51 33 33 29 37 35 37 37 47 27 37 35 37 33 37 35 39 33 45 35 37 35 51 37 41 33 37 35 49 35 35 D1S80 Minisatellit Allel 1 Allel 2 24 24 24 31 28 29 28 32 18 31 18 24 22 22 24 29 24 24 24 24 23 24 24 30 18 18 18 22 18 24 20 24 22 24 24 24 24 25 23 28 29 37 21 24 24 24 18 24 24 30 24 31 24 25 24 24 18 18 18 24 28 30 24 37 24 24 25 31 18 27 20 22 HumVWA31A Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 17 17 18 18 18 18 16 18 16 17 16 17 16 17 16 17 16 17 15 17 17 20 15 17 14 17 17 18 15 16 16 16 14 16 14 18 15 18 17 17 14 18 14 18 18 18 15 19 14 19 17 17 16 16 15 17 17 17 17 19 14 15 16 17 15 15 15 16 16 17 16 18

Proband R 1 R 3 R 4 R 5 R6 R 7 R 8 R 9 R 11 R 12 R 13 R 14 R 15 R 17 R 18 R 20 R 22 R 23 R 24 R 26 R 27 R 28 R 29 R 30 R 31 R 32 R 33 R 34 R 35 R 36 R 39 R 40 R 41 R 42 R 43 R 44

145

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Apolipoprotein B 3' Minisatellit Allel 1 Allel 2 35 35 27 35 27 37 37 47 35 39 37 37 37 47 35 45 35 53 45 53 35 37 35 49 35 49 0 0 25 37 37 37 27 37 35 49 37 51 27 35 37 37 35 35 35 49 35 49 35 37 37 49 49 49 27 35 33 45 29 35 25 35 35 37 35 37 35 35 47 48 35 49 37 49 35 37 35 49 37 55 29 37 27 33 25 37 35 37 33 37 35 37 D1S80 Minisatellit Allel 1 Allel 2 24 25 24 24 18 28 24 28 18 25 0 0 24 30 24 31 24 24 24 25 18 18 14 28 18 24 18 24 18 24 24 29 24 28 24 27 24 29 19 24 22 24 17 18 18 25 18 24 24 25 18 21 20 24 19 24 18 31 21 24 18 21 18 24 20 28 18 25 18 24 18 23 24 28 23 29 24 31 19 24 24 24 24 31 23 24 24 31 18 24 22 24 HumVWA31A Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 16 17 14 16 15 17 17 18 16 19 0 0 16 16 14 17 17 19 17 17 16 17 15 17 19 19 17 17 18 19 14 17 17 18 16 19 16 17 16 18 16 18 19 19 16 17 17 17 15 17 14 17 18 18 17 18 18 19 15 19 16 17 18 18 14 16 17 18 16 17 14 18 15 17 14 16 15 15 15 15 17 17 18 18 17 18 16 16 15 18 14 16

Proband R 45 R 46 R 47 R 49 R 50 R 52 R 53 R 60 R 64 R 72 R 75 R 78 R 80 R 81 R 82 R 88 R 89 R 90 R 91 R 92 R 95 R 98 R 101 R 102 R 110 R 111 R 112 R 120 R 121 R 122 R 123 R 124 R 127 R 181 R 200 R 201 R 202 R 203 R 204 R 205 R 206 R 207 R 210 R 211 R 220 R 221

146

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Apolipoprotein B D1S80 3' Minisatellit Minisatellit Proband Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 R 300 35 41 21 24 R 301 35 35 17 24 R 303 35 41 21 24 R 304 35 53 23 24 R 305 29 29 24 31 R 306 27 37 22 24 R 307 27 35 18 24 R 321 0 0 0 0 R 322 37 37 18 24 R 323 37 47 18 22 R 324 37 51 24 24 R 325 37 37 24 27 R 326 35 37 24 24 R 327 35 37 24 31 R 328 27 37 18 29 R 329 35 35 24 24 R 330 29 49 24 24 R 331 35 37 18 31 R 332 27 35 18 21 R 333 35 35 23 24 R 334 35 35 18 24 R 335 37 37 19 24 R 336 33 39 18 24 R 337 29 35 24 24 0 = Allel konnte nicht bestimmt werden HumVWA31A Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 16 18 16 18 16 18 14 17 13 15 18 18 14 17 18 18 18 18 15 18 16 17 14 15 15 15 14 18 14 15 15 18 15 16 17 18 14 15 15 16 15 17 15 17 18 18 14 16

Tabelle 7.2: Matrix der Genotypen des ApoB 3 Minisatelliten in der rumnischen Populationsstichprobe aus Ploiesti (GENEPOP) Allele 25 27 29 31 33 35 37 39 41 45 47 48 49 51 53 55 0 25 0 0 27 0 0 1 29 0 0 0 0 31 0 1 0 0 1 33 1 6 2 0 0 10 35 2 5 2 2 5 19 8 37 0 0 0 0 1 2 2 0 39 0 0 0 0 0 2 2 0 0 41 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 45 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 47 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 48 0 0 1 0 0 8 3 0 0 0 0 0 1 49 0 0 0 0 0 1 2 0 1 0 0 0 0 0 51 0 0 0 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 53 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 55

147

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.3: Matrix der Genotypen des D1S80 Minisatelliten in der rumnischen Populationsstichprobe aus Ploiesti (GENEPOP)

Allele 14 17 18 19 20 21 22 23 24 25 27 28 29 30 31 32 37
14 17 18 19 20 21 22 23 24 25 27 28 29 30 31 32 37 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 3 2 1 15 3 1 1 1 0 3 0 0

0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 1 0 2 0 0 1 0 0 0 0 0

0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0

0 4 0 0 1 1 0 0 0 0

15 5 2 3 3 3 8 0 1

0 0 0 0 0 1 0 0

0 0 0 0 0 0 0

0 1 1 0 1 0

0 0 0 0 1

0 0 0 0

0 0 0

0 0

Tabelle 7.4: Matrix der Genotypen des HumVWA31A Mikrosatelliten in der rumnischen Populations stichprobe aus Ploiesti (GENEPOP)

Allele 13 14 15 16 17 18 19 20
13 14 15 16 17 18 19 20 0 0 1 0 0 0 0 0 0 4 6 6 5 1 0 4 4 9 4 2 0

4 14 7 2 0

8 7 2 1

10 2 2 0 0

148

7. Anhang _____________________________________________________________________________ 7.2. Daten der rumnischen Populationsstichprobe aus Bukarest 7.2.1 Allelhufigkeiten und Genotypen
Tabelle 7.5: Liste der Allele des ApoB 3- und D1S80- Minisatelliten sowie des HumVWA31AMikrosatelliten der rumnischen Population aus Bukarest Apolipoprotein B 3' Minisatellit Proband Allel 1 Allel 2 N1 35 49 N2 37 37 N3 35 47 N4 37 37 N5 39 51 N6 35 39 N7 35 37 N8 29 49 N9 27 37 N 10 47 49 N 11 35 35 N 12 51 53 N 13 37 37 N 14 27 37 N 15 37 37 N 16 35 37 N 17 35 39 N 18 35 37 N 19 35 37 N 20 35 41 N 21 37 45 N 22 37 49 N 23 37 47 N 24 37 37 N 25 37 37 N 26 29 35 N 27 0 0 N 28 27 37 N 29 35 37 N 30 35 53 N 31 27 35 N 32 33 37 N 33 35 51 N 34 35 49 N 35 27 37 D1S80 HumVWA31A Minisatellit Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 23 24 16 17 21 24 17 19 18 24 16 17 24 24 16 18 24 25 15 17 24 28 17 17 24 28 15 16 26 28 17 19 24 28 16 17 18 18 14 18 24 35 17 18 24 24 16 17 18 29 17 19 24 25 16 16 18 24 14 17 25 29 16 18 24 33 17 17 22 24 16 18 0 0 18 19 24 25 17 18 18 24 14 16 0 0 16 18 23 24 18 18 20 31 16 18 17 18 14 16 18 18 17 18 0 0 15 17 25 29 17 19 18 25 17 17 18 24 15 17 18 24 18 18 24 24 15 20 24 31 17 17 24 25 17 17 22 23 17 17

149

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Apolipoprotein B 3' Minisatellit Proband Allel 1 Allel 2 N 36 35 49 N 37 21 25 N 38 37 45 N 39 35 35 N 40 21 37 N 41 37 37 N 42 29 39 N 43 35 47 N 44 35 35 N 45 29 31 N 47 37 37 N 48 37 47 N 49 33 33 N 51 49 49 N 52 35 37 N 53 37 37 N 54 37 37 N 55 35 37 N 56 0 0 N 57 0 0 N 58 33 43 N 59 0 0 N 60 37 39 N 61 25 35 N 62 29 37 N 64 35 49 N 65 35 37 N 66 35 37 N 67 37 49 N 68 29 49 N 69 35 47 N 70 37 37 N 71 37 49 N 72 27 37 N 73 0 0 N 74 35 35 N 75 0 0 N 76 0 0 N 77 0 0 N 78 33 37 N 79 35 37 N 80 35 37 D1S80 HumVWA31A Minisatellit Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 24 37 16 17 18 18 16 17 18 25 17 18 24 24 17 17 18 25 17 19 18 18 18 18 18 25 16 17 18 29 16 17 18 24 0 0 0 0 17 18 18 24 16 16 24 31 14 14 18 31 14 14 18 25 17 18 28 29 14 16 24 24 14 15 26 40 16 18 18 24 16 19 0 0 16 18 0 0 17 19 18 18 15 19 0 0 18 19 28 33 14 17 18 18 16 19 18 24 17 17 22 24 14 17 24 24 18 19 24 24 15 18 21 24 16 16 24 25 15 15 24 29 17 17 18 24 15 17 17 18 15 18 24 24 17 18 0 0 16 19 24 24 15 17 0 0 15 18 18 20 17 17 0 0 16 17 15 28 17 18 24 28 17 18 18 24 16 17

150

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Apolipoprotein B 3' Minisatellit Allel 1 Allel 2 29 33 27 37 37 41 35 41 37 37 37 37 31 37 0 0 27 35 35 37 35 37 35 37 37 49 37 37 27 37 27 37 37 49 39 39 37 37 35 35 0 0 27 37 35 47 29 37 37 37 37 47 0 0 35 51 35 49 0 0 35 37 27 35 37 37 35 37 31 31 37 51 37 37 35 37 35 37 37 37 37 37 D1S80 Minisatellit Allel 1 Allel 2 18 24 24 24 24 26 18 18 18 24 24 26 0 0 0 0 0 0 0 0 24 29 18 24 18 24 22 24 18 24 18 18 18 24 24 24 24 29 20 24 0 0 28 28 24 25 0 0 24 29 24 27 0 0 21 29 0 0 0 0 18 24 24 24 18 30 18 24 18 18 18 18 24 24 19 28 18 25 0 0 18 28 HumVWA31A Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 15 19 15 17 16 17 16 18 16 17 16 18 16 17 16 19 17 20 14 16 16 17 16 18 16 16 14 17 14 16 17 18 14 16 17 17 17 17 16 17 17 17 17 19 16 19 16 17 18 19 17 17 17 19 17 19 16 17 16 18 17 18 15 17 16 19 17 18 16 18 17 17 16 18 16 18 17 19 15 18 14 19

Proband N 81 N 82 N 83 N 84 N 85 N 86 N 87 N 88 N 89 N 90 N 91 N 92 N 93 N 94 N 95 N 97 N 98 N 99 N 100 N 101 N 102 N 103 N 104 N 105 N 106 N 107 N 108 N 109 N 110 N 111 N 112 N 113 N 114 N 115 N 116 N 117 N 118 N 119 N 120 N 122 N 123

151

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Apolipoprotein B 3' Minisatellit Proband Allel 1 Allel 2 N 124 25 49 N 125 49 49 N 126 35 37 N 127 25 25 N 128 37 37 N 129 31 35 N 130 0 0 N 132 35 37 N 135 37 49 N 136 37 37 N 137 37 39 N 138 35 35 N 139 35 36 N 140 37 37 N 143 31 37 N 144 35 41 N 145 39 39 N 146 37 41 N 147 39 39 N 148 35 35 N 149 35 37 N 150 47 49 N 151 27 39 N 153 37 37 N 155 37 49 N 156 35 37 N 157 27 35 N 158 35 35 N 159 35 35 N 160 27 35 N 161 37 37 N 162 29 37 N 163 39 39 N 165 35 41 N 166 35 35 N 167 35 37 N 168 35 37 N 169 37 39 N 170 35 37 N 171 33 37 N 172 35 37 N 173 37 39 N 174 0 0 N 175 37 37 D1S80 HumVWA31A Minisatellit Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 0 0 15 16 24 29 20 21 18 24 17 17 0 0 16 16 24 24 16 20 24 24 17 18 0 0 14 18 0 0 16 18 18 20 15 19 22 24 15 19 18 24 20 20 24 24 17 18 18 18 17 17 24 24 15 17 24 24 14 17 23 30 16 17 18 18 17 18 24 29 17 17 19 24 19 20 21 21 14 15 24 24 16 17 25 29 19 19 24 31 14 17 24 24 17 18 0 0 16 17 0 0 17 17 24 24 16 19 0 0 17 19 24 24 15 19 24 24 18 18 18 18 17 17 18 24 16 19 20 29 18 18 0 0 16 18 0 0 16 18 0 0 17 18 24 24 14 18 0 0 16 18 0 0 16 17 18 18 16 16 18 18 16 16 24 26 17 18 0 0 16 18 24 26 16 18

152

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Apolipoprotein B D1S80 HumVWA31A 3' Minisatellit Minisatellit Mikrosatellit Proband Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 N 176 35 37 24 28 17 17 N 180 35 35 17 24 16 18 N 181 33 35 24 28 14 15 N 182 37 49 18 24 15 18 N 184 37 51 18 24 17 18 N 185 27 35 21 30 14 18 N 186 35 47 24 28 16 17 N 187 37 41 18 24 18 19 N 188 27 37 24 29 15 16 N 189 35 37 20 20 18 18 N 190 39 39 18 24 17 18 N 191 35 37 28 29 17 18 N 192 37 37 22 24 19 20 N 193 27 35 24 30 15 17 N 194 37 37 18 24 16 17 N 195 35 39 18 18 18 19 N 196 37 37 29 31 17 18 N 197 37 37 24 26 16 18 N 198 35 37 26 28 14 18 N 199 35 37 18 24 14 14 0 = Allel konnte nicht bestimmt werden

Tabelle 7.6: Matrix der Genotypen des ApoB 3 Minisatelliten in der rumnischen Populationsstich probe aus Bukarest (GENEPOP)

Allel 21 25 27 29 31 33 35 36 37 39 41 43 45 47 49 51 53
21 25 27 29 31 33 35 36 37 39 41 43 45 47 49 51 53 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 7 0 10 1 0 0 0 0 0 0 0

0 1 1 1 0 3 1 0 0 0 0 2 0 0

1 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0

1 1 0 3 0 0 1 0 0 0 0 0

11 1 31 3 4 0 0 5 5 2 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

30 4 3 0 2 3 8 2 0

5 0 0 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 2 0 0

2 0 0

0 1

153

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.7: Matrix der Genotypen des D1S80 Minisatelliten in der rumnischen Populationsstichprobe aus Bukarest (GENEPOP)

Allel 15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 33 35 37 40
15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 33 35 37 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 16 0 2 0 0 0 28 6 0 0 1 2 1 1 0 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0

1 0 0 2 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

0 1 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

24 6 5 1 7 7 1 3 1 1 1 0

0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0

0 0 2 0 0 0 0 0 0 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 2 0 0 1 0 0 0

0 0 1 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0

0 0

Tabelle 7.8: Matrix der Genotypen des HumVWA31A Mikrosatelliten in der rumnischen Populationsstichprobe aus Bukarest (GENEPOP)

Allel 14 15 16 17 18 19 20 21
14 15 16 17 18 19 20 21 3 3 6 6 5 1 0 0 1 3 9 5 5 1 0 7 23 22 8 1 0

21 22 11 1 0

6 6 0 0

1 2 0

1 1

154

7. Anhang _____________________________________________________________________________ 7.3 Daten der Populationsstichprobe aus Jakutien 7.3.1 Allelhufigkeiten und Genotypen
Tabelle 7.9: Liste der Allele des ApoB 3- und D1S80- Minisatelliten sowie des HumVWA31AMikrosatelliten in einer Populationsstichprobe von Jakuten aus Sibirien Apolipoprotein B 3' Minisatellit Proband Allel 1 Allel 2 J7 41 43 J9 35 37 J 10 35 35 J 11 37 37 J 12 35 39 J 13 35 43 J 14 37 37 J 16 33 37 J 17 35 41 J 18 37 43 J 19 35 37 J 20 35 35 J 22 33 35 J 23 51 51 J 24 35 35 J 25 31 35 J 28 0 0 J 34 35 37 J 36 37 37 J 37 27 37 J 38 35 35 J 39 31 45 J 41 35 35 J 43 35 37 J 45 43 47 J 47 35 35 J 48 35 37 J 50 35 35 J 51 0 0 J 52 35 37 J 53 37 47 J 56 35 43 J 57 29 35 J 60 33 33 J 64 35 35 J 67 35 35 D1S80 HumVWA31A Minisatellit Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 0 0 14 17 0 0 0 0 16 24 0 0 0 0 0 0 0 0 16 17 27 28 16 18 16 16 14 17 0 0 0 0 16 19 16 18 16 19 16 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 18 18 16 16 30 32 0 0 17 29 16 19 19 24 17 20 29 29 14 20 18 25 16 19 18 18 18 20 18 28 14 14 0 0 0 0 0 0 16 18 18 18 0 0 18 18 0 0 0 0 0 0 17 17 15 19 19 19 17 18 21 21 16 17 18 18 0 0 0 0 0 0 18 24 14 16 18 18 0 0 0 0 0 0 19 21 14 14 18 24 17 18

155

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Apolipoprotein B 3' Minisatellit Proband Allel 1 Allel 2 J 68 37 41 J 69 41 47 J 77 0 0 J 78 33 35 J 79 35 35 J 83 37 37 J 86 35 35 J 87 35 35 J 89 35 35 J 90 35 43 J 91 35 37 J 93 35 35 J 95 35 41 J 100 35 46 J 103 34 39 J 104 0 0 J 105 27 37 J 106 35 49 J 107 39 49 J 112 35 41 J 115 37 43 J 117 35 35 J 118 35 41 J 119 35 35 J 121 35 47 J 122 35 35 J 124 0 0 J 125 39 41 J 128 37 41 J 131 0 0 J 132 35 47 J 133 35 43 J 136 34 35 J 138 41 41 J 139 0 0 J 140 35 49 J 142 37 37 J 143 35 39 J 144 31 37 J 145 35 41 J 146 35 43 J 147 35 35 D1S80 HumVWA31A Minisatellit Mikrosatellit Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 0 0 0 0 18 18 17 19 0 0 16 17 18 31 18 18 16 36 16 18 19 19 16 19 18 18 18 18 16 18 17 18 17 27 16 17 18 18 18 19 18 31 14 14 0 0 0 0 0 0 0 0 24 24 15 16 18 18 16 18 25 25 16 16 18 18 17 18 18 18 0 0 18 18 14 18 0 0 16 17 0 0 18 18 0 0 0 0 33 35 16 16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 14 19 0 0 14 16 0 0 0 0 16 18 14 18 0 0 17 18 24 32 0 0 16 19 18 19 18 18 14 17 0 0 18 19 0 0 17 19 0 0 17 17 24 24 17 19 18 18 14 18 0 0 0 0 0 0 18 18 16 16 16 18 0 0 0 0

156

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Apolipoprotein B D1S80 HumVWA31A 3' Minisatellit Minisatellit Mikrosatellit Proband Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 Allel 1 Allel 2 J 149 35 35 24 24 0 0 J 151 34 35 0 0 18 18 J 152 35 37 18 18 14 19 J 153 35 37 18 24 14 17 J 154 35 37 28 29 14 18 J 155 33 35 0 0 0 0 J 156 35 35 0 0 14 18 J 157 35 37 0 0 0 0 J 158 35 35 19 19 16 18 J 159 35 41 24 24 14 18 J 160 33 35 16 16 16 18 J 162 35 35 24 25 0 0 J 163 33 35 18 24 14 16 J 165 36 36 0 0 0 0 J 166 35 39 18 18 14 16 J 167 0 0 24 29 16 18 J 171 35 39 0 0 0 0 J 174 0 0 16 16 16 18 J 176 35 37 18 24 17 18 J 178 35 41 16 30 16 18 J 179 33 41 0 0 0 0 J 180 0 0 0 0 18 18 J 182 37 45 16 16 16 16 J 183 36 36 0 0 16 16 J 184 41 41 18 18 18 20 J 185 0 0 0 0 16 17 J 186 35 37 18 18 16 19 J 187 35 35 0 0 14 17 J 193 37 37 20 20 16 17 J 194 0 0 24 35 14 18 J 199 0 0 18 24 16 19 J 200 41 53 16 16 19 19 J 201 35 39 18 24 14 19 J 202 33 35 17 18 14 19 J 212 0 0 18 24 14 17 J 218 33 37 18 24 16 16 J 220 35 35 0 0 0 0 J 221 37 51 0 0 18 19 J 224 35 37 35 31 17 18 J 227 39 39 21 28 14 18 0 = Allel konnte nicht bestimmt werden

157

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.10: Matrix der Genotypen des ApoB 3 Minisatelliten in der jakutischen Populationsstichprobe (GENEPOP)

Allel 27 29 31 33 34 35 36 37 39 41 43 45 46 47 49 51 53

27 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0

29 31 33 34 35 36 37 39 41 43 45 46 47 49 51 53 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0

1 0 6 0 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0

0 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

24 0 14 5 7 5 0 1 2 2 0 0

2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

6 0 2 2 1 0 1 0 1 0

1 1 0 0 0 0 1 0 0

2 1 0 0 1 0 0 1

0 0 0 1 0 0 0

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0

1 0

Tabelle 7.11: Matrix der Genotypen des D1S80 Minisatelliten in der jakutischen Populationsstichprobe (GENEPOP)

Allel 16 17 18 19 20 21 24 25 27 28 29 30 31 32 33 35 36

16 6 0 2 3 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1

17 18 19 20 21 24 25 27 28 29 30 31 32 33 35 36 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 19 0 0 0 9 1 0 1 0 0 2 0 0 0 0

3 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

4 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0

1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 1 0 0 0 0 0 0 0

0 1 0 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

0 0 1 0 0 0

0 0 0 1 0

0 0 0 0

0 1 0

0 0

158

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.12: Matrix der Genotypen des HumVWA31A Mikrosatelliten in der jakutischen Populationsstichprobe (GENEPOP) Allel 14 15 16 17 18 19 20 14 3 0 4 6 8 4 1 15 16 17 18 19 20 0 1 0 0 1 0 6 8 11 5 0

1 7 3 1

6 4 2

1 0

7.4 Genotypenmatrices der gepoolten rumnischen Populationsstichprobe

Tabelle 7.13: Matrix der Genotypen des ApoB 3 Minisatelliten in der rumnischen Populationsstich probe (GENEPOP)

Allel 21 25 27 29 31 33 35 36 37 39 41 43 45 47 48 49 51 53 55

21 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

25 27 29 31 33 35 36 37 39 41 43 45 47 48 49 51 53 55 1 0 0 0 0 2 0 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 13 0 15 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1 3 0 5 1 0 0 0 0 0 3 0 0 0

1 0 1 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

2 1 0 8 1 0 1 2 0 0 0 0 0 0

21 1 50 5 6 0 1 5 0 13 3 3 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

38 6 5 0 2 8 0 11 4 0 1

5 0 0 0 0 0 0 1 0 0

0 0 0 0 0 0 1 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 1 0

0 1 2 0 0 0

0 0 0 0 0

3 0 0 0

0 1 0

0 0

159

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.14: Matrix der Genotypen des D1S80 Minisatelliten in der rumnischen Populationsstichprobe (GENEPOP)

Allel 14 15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 35 37 40

14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

15 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 35 37 40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

19 0 2 3 2 1 43 9 0 1 2 3 1 4 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

1 0 1 0 3 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0

1 0 0 6 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0

1 1 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 6 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0

39 11 5 3 10 10 4 11 0 1 1 2 0

0 0 0 0 3 0 1 0 0 0 0 0

0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 3 1 0 1 1 0 0 0

0 0 1 0 0 0 1 0

0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0

0 0

Tabelle 7.15: Matrix der Genotypen des HumVWA31A Mikrosatelliten in der rumnischen Populationsstichprobe (GENEPOP) Allel 13 14 15 16 17 18 19 20 21 13 0 0 1 0 0 0 0 0 0 14 15 16 17 18 19 20 21 3 7 12 12 10 2 0 0 5 7 18 9 7 1 0

11 37 29 10 1 0

29 29 13 2 0

16 8 3 0 2 0 0

1 1

160

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.16: Allelfrequenzen des ApoB 3 Minisatelliten in verschiedenen Populationen Allele 21 23 25 27 29 30 31 33 35 36 37 39 40 41 43 45 46 47 48 49 51 53 55 57 59 Afrikaner 0,0000 0,0110 0,0110 0,0110 0,0430 0,0000 0,0753 0,0806 0,1344 0,0000 0,2366 0,1290 0,0110 0,0914 0,0591 0,0591 0,0000 0,0269 0,0000 0,0054 0,0110 0,0000 0,0000 0,0054 0,0000 Griechen 0,0000 0,0060 0,0000 0,0000 0,0060 0,0000 0,0720 0,0670 0,2220 0,0000 0,3940 0,0560 0,0000 0,0110 0,0000 0,0110 0,0000 0,0610 0,0000 0,0720 0,0220 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Deutsche 0,0000 0,0000 0,0010 0,0000 0,0010 0,0000 0,0820 0,0690 0,2440 0,0040 0,3740 0,0370 0,0000 0,0100 0,0020 0,0100 0,0000 0,0620 0,0000 0,0870 0,0150 0,0020 0,0000 0,0000 0,0000 Ungarn 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1010 0,0630 0,2660 0,0045 0,3540 0,0450 0,0000 0,0135 0,0020 0,0068 0,0000 0,0698 0,0000 0,0586 0,0135 0,0000 0,0020 0,0000 0,0000 Italiener 0,0000 0,0030 0,0000 0,0000 0,0060 0,0000 0,1390 0,0540 0,2500 0,0000 0,3420 0,0380 0,0000 0,0030 0,0030 0,0060 0,0000 0,0570 0,0000 0,0700 0,0160 0,0060 0,0060 0,0000 0,0000 Kroaten 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0050 0,0000 0,0750 0,0900 0,2600 0,0000 0,2950 0,1150 0,0000 0,0150 0,0200 0,0250 0,0000 0,0050 0,0000 0,0050 0,0200 0,0600 0,0050 0,0000 0,0050 Slowaken 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0022 0,0000 0,0696 0,0696 0,2196 0,0000 0,3457 0,0957 0,0000 0,0087 0,0022 0,0152 0,0000 0,0739 0,0000 0,0870 0,0109 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Rumnen 0,0030 0,0000 0,0147 0,0557 0,0303 0,0000 0,0138 0,0384 0,2804 0,0015 0,3551 0,0418 0,0000 0,0224 0,0015 0,0126 0,0000 0,0293 0,0024 0,0664 0,0186 0,0102 0,0000 0,0000 0,0000 Jakuten 0,0000 0,0000 0,0000 0,0096 0,0048 0,0000 0,0144 0,0529 0,4519 0,0192 0,1827 0,0481 0,0000 0,0865 0,0433 0,0096 0,0000 0,0240 0,0000 0,0144 0,0144 0,0048 0,0000 0,0000 0,0000

161

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.17: Allelfrequenzen des D1S80 Minisatelliten verschiedenen Populationen Allele Afrikaner Griechen Deutsche Ungarn Italiener 14 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 15 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 16 0,0050 0,0010 0,0030 0,0030 0,0000 17 0,0150 0,0010 0,0050 0,0030 0,0050 18 0,0250 0,1720 0,2530 0,2650 0,1550 19 0,0000 0,0100 0,0130 0,0000 0,0000 20 0,0050 0,0110 0,0240 0,0210 0,0150 21 0,1430 0,0190 0,0290 0,0290 0,0290 22 0,1290 0,0600 0,0330 0,0370 0,0530 23 0,0300 0,0180 0,0170 0,0130 0,0190 24 0,1290 0,4130 0,3430 0,3670 0,4370 25 0,0590 0,0500 0,0460 0,0450 0,0290 26 0,0000 0,0240 0,0120 0,0130 0,0290 27 0,0300 0,0130 0,0050 0,0080 0,0050 28 0,1190 0,0340 0,0420 0,0580 0,1070 29 0,0200 0,0740 0,0810 0,0500 0,0490 30 0,0150 0,0060 0,0120 0,0050 0,0100 31 0,0690 0,0490 0,0570 0,0560 0,0440 32 0,0150 0,0070 0,0070 0,0030 0,0000 33 0,0000 0,0004 0,0050 0,0000 0,0050 34 0,1630 0,0040 0,0050 0,0030 0,0100 35 0,0000 0,0020 0,0000 0,0000 0,0000 36 0,0000 0,0030 0,0010 0,0110 0,0000 37 0,0000 0,0100 0,0070 0,0080 0,0000 38 0,0000 0,0020 0,0000 0,0000 0,0000 39 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 40 0,0300 0,0020 0,0000 0,0000 0,0000 41 0,0000 0,0010 0,0000 0,0000 0,0000 42 0,0000 0,0000 0,0000 0,0030 0,0000 Kroaten 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,2600 0,0050 0,0050 0,0100 0,0150 0,0300 0,3650 0,0800 0,0200 0,0050 0,0650 0,0500 0,0050 0,0450 0,0050 0,0050 0,0050 0,0000 0,0000 0,0200 0,0050 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Slowaken 0,0000 0,0000 0,0050 0,0030 0,2920 0,0100 0,0050 0,0050 0,0230 0,0000 0,3770 0,0440 0,0390 0,0030 0,0590 0,0130 0,0330 0,0490 0,0180 0,0000 0,0000 0,0080 0,0150 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Rumnen 0,0024 0,0018 0,0000 0,0099 0,2148 0,0130 0,0214 0,0317 0,0317 0,0236 0,4170 0,0468 0,0134 0,0089 0,0526 0,0454 0,0163 0,0389 0,0024 0,0034 0,0000 0,0017 0,0000 0,0065 0,0000 0,0000 0,0017 0,0000 0,0000 Jakuten 0,0000 0,0000 0,1370 0,0342 0,3699 0,0753 0,0137 0,0274 0,0000 0,0000 0,1575 0,0274 0,0000 0,0137 0,0274 0,0342 0,0137 0,0205 0,0137 0,0068 0,0000 0,0205 0,0068 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

162

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.18: Allelfrequenzen des HumVWA31A Mikrosatelliten in verschiedenen Populationen Allele 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Afrikaner 0,0550 0,0000 0,0350 0,0650 0,2000 0,2250 0,1950 0,1150 0,0850 0,0250 0,0000 0,0000 Griechen 0,0000 0,0010 0,0030 0,0870 0,1140 0,1980 0,3140 0,1780 0,0880 0,0160 0,0000 0,0000 Deutsche 0,0000 0,0040 0,0040 0,0540 0,1120 0,1960 0,2920 0,2350 0,0920 0,0120 0,0000 0,0000 Ungarn 0,0000 0,0000 0,0000 0,1150 0,1250 0,1950 0,2770 0,1860 0,0860 0,0140 0,0020 0,0000 Italiener 0,0000 0,0000 0,0000 0,0970 0,1230 0,2250 0,2670 0,1820 0,0890 0,0170 0,0000 0,0000 Kroaten 0,0000 0,0000 0,0000 0,1174 0,1278 0,1787 0,2754 0,1683 0,1123 0,0202 0,0000 0,0000 Slowaken 0,0000 0,0000 0,0000 0,1402 0,1449 0,1963 0,2523 0,1916 0,0654 0,0093 0,0000 0,0000 Rumnen 0,0000 0,0000 0,0024 0,0897 0,1149 0,2040 0,2884 0,2066 0,0793 0,0135 0,0014 0,0000 Jakuten 0,0000 0,0000 0,0000 0,1747 0,0120 0,2470 0,1627 0,2651 0,1145 0,0241 0,0000 0,0000

Tabelle 7.19: Allelfrequenzen des TH01- Mikrosatelliten in verschiedenen europischen Populationen Allele 4 5 6 7 8 9 9,3 10 11 > 11 Deutsche 0,0000 0,0027 0,2234 0,1604 0,1131 0,1655 0,3174 0,0172 0,0003 0,0000 Griechen 0,0000 0,0000 0,2992 0,1461 0,1238 0,2223 0,2060 0,0025 0,0000 0,0000 Ungarn 0,0000 0,0039 0,2193 0,1549 0,1112 0,1964 0,3056 0,0097 0,0000 0,0000 Italiener 0,0001 0,0016 0,2529 0,1581 0,1308 0,1950 0,2394 0,0205 0,0006 0,0000 Rumnen 0,0000 0,0018 0,3033 0,1177 0,1214 0,2004 0,2445 0,0110 0,0000 0,0000

163

7. Anhang _____________________________________________________________________________

Tabelle 7.20: Allelfrequenzen des D21S11 Locus in verschiedenen europischen Populationen Allele 24 24.2 25 25.2 26 26.2 27 27.2 28 28.2 29 29.2 29.3 30 30.2 30.3 31 31.2 32 32.2 33 33.1 33.2 34 34.2 35 35.2 36 36.2 38 Deutsche 0,0000 0,0000 0,0000 0,0050 0,0020 0,0000 0,0390 0,0000 0,1650 0,0000 0,2230 0,0020 0,0000 0,2260 0,0320 0,0000 0,0780 0,1020 0,0170 0,0830 0,0020 0,0000 0,0190 0,0000 0,0050 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Griechen 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0183 0,0000 0,0826 0,0000 0,5550 0,0046 0,0000 0,1193 0,0138 0,0000 0,0229 0,0505 0,0092 0,0963 0,0000 0,0000 0,0274 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Ungarn 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0013 0,0000 0,0439 0,0000 0,1674 0,0000 0,2055 0,0013 0,0000 0,2239 0,0483 0,0000 0,0717 0,0996 0,0114 0,0785 0,0000 0,0000 0,0313 0,0087 0,0059 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Italiener 0,0000 0,0002 0,0019 0,0002 0,0026 0,0000 0,0345 0,0000 0,1238 0,0152 0,2045 0,0157 0,0000 0,2214 0,0364 0,0000 0,0647 0,0913 0,0315 0,0944 0,0193 0,0000 0,0377 0,0034 0,0002 0,0005 0,0000 0,0003 0,0000 0,0003 Rumnen 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0055 0,0000 0,0331 0,0000 0,1563 0,0000 0,2647 0,0055 0,0000 0,1856 0,0367 0,0000 0,0533 0,0993 0,0092 0,1140 0,0019 0,0000 0,0349 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000

164

7. Anhang _____________________________________________________________________________
Tabelle 7.21: Allelfrequenzen von 4 Blutgruppen-Systemen in verschiedenen europischen Populationen System ABO Allele A1 A2 B O MS Ms NS Ns CDE CDe Cde cDE cDe cdE cde HP*1 HP*2 Deutsche 0,2060 0,0665 0,0836 0,6439 0,2484 0,2959 0,0712 0,3845 0,0028 0,4204 0,0133 0,1370 0,0208 0,0071 0,3986 0,3956 0,6044 Griechen 0,2090 0,0595 0,0952 0,6363 0,2716 0,2919 0,1227 0,3138 0,0207 0,4972 0,0230 0,1264 0,0429 0,0125 0,2773 0,3484 0,6516 Ungarn 0,2305 0,0674 0,1421 0,5600 0,2439 0,3307 0,1072 0,3182 0,0023 0,4222 0,0158 0,1442 0,0261 0,0055 0,3839 0,3623 0,6377 Italiener 0,2036 0,0445 0,0758 0,6761 0,2412 0,3117 0,0895 0,3576 0,0050 0,4605 0,0212 0,1181 0,0342 0,0066 0,3544 0,3627 0,6373 Rumnen 0,2406 0,0514 0,1182 0,5898 0,3000 0,2890 0,1040 0,3070 0,0000 0,4475 0,0169 0,1239 0,0216 0,0165 0,3736 0,3362 0,6638

MNS

Rhesus

HP

165