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Fundamento: La tincin simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares.

La tincin puede ser uniforme o presentar algunos grnulos en su interior. Utiliza un solo colorante (violeta de genciana, azul demetileno, fuscina diluida).La tincin simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y lasestructuras celulares bsicas. En las tinciones simples se usa un nico reactivo, que preferentemente es de tipo bsico y contiene un cromgeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromgeno. Se utilizansolamente para incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas delmismo color. Por tanto, la tincin simple mejora la observacin de la clula completa. Se fija el espcimen, seaade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente (sustancia qumica utilizada par intensificar la coloracin), hay que aadirlo justo antes del colorante. Tcnica: Las tinciones simples se realizan sobre preparaciones previamente secadas. Sobre un portaobjetos con unasuspensin de microorganismos previamente secada y fijada a la llama, se vierte una solucin diluida de uncolorante y se mantiene durante uno o dos minutos; a continuacin se lava varias veces con

agua y se seca.Debido a que las clulas son muy pequeas, este tipo de preparacin suele observarse con aceite de inmersinen la lente objetivo. Colorantes: En la tincin simple se utilizan tintes como safranina, azul de metileno, cristal violeta y carbolfuesina.

Tcnicas de tincin. Fundamentos


El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que

son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depstos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente habitual es el cido tnco. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Preparacin de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teir (si es lquido) o se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra. Una vez que el

hisopo ha tocado la superficie del portaobjetos, que no est estril, ya no puede ser empleado para inocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estril para transferir una pequea cantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido en una gota de agua o solucin salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se trata de colonias muy pequeas que pueden perderse en una gota de lquido se emplea una varilla delgada de madera estril con la cual se toca la colonia obtenindose as una fraccin apreciable del desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarse con facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa varias veces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio est tan caliente que moleste al tacto pero no queme.

Examen de muestras al microscopio


Segn la manipulacin que efectuemos sobre la muestra a observar y segn los colorantes que empleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tincin.

Examen microscpico directo de las muestras clnicas Sin Tincin


No se utiliza ningn tipo de colorante. Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las muestras se extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observacin. El material que es demasiado espeso para permitir la diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de solucin salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre la superficie del material. Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de parsitos intestinales como Giardia,Entamoeba, huevos y quistes de adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc En la imagen: Candida sp en un examen en fresco. otros parsitos, larvas y gusanos

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas Tincin Simple


Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).

El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas

(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos. En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas Diferencial

Tincin

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica. Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

microfotografa: Daniel Val

Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM


La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tincin de GRAM Descripta en forma breve, la secuencia de la tincin es la siguiente: el Frotis fijado con calor se tie 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre con solucin Yodada durante 1 min y se lava de nuevo con agua, decolorar con mezcla alcohol etlico/acetona. Escurrir y

cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. Lavar y secar. Esta tincin se denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos morfologicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a

las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%90% de la pared de la clula gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gramnegativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las clulas, tanto las grampositivas como las gramnegativas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran, mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la clula se

decolora. Las clulas grampositivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas, mientras que las grampositivas permanecen azules. Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. EI proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. 3) Cultivos ms viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el complejo cristal violeta - yodo. El carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.

Morfologa ultramicroscpica de las bacterias: estructuras internas


Pared celular
Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cpsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que est en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rgida que da forma a la clula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. Constituyentes importantes de la pared celular son los aminocidos, aminoazcares, azcares y grasas. Estas sustancias (protenas, Hidratos de carbono, grasas) estn enlazadas formando el polmero complejo que forma la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gramnegativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-

positivas contienen menos aminocidos que las gram-negativas; el contenido graso es mucho ms elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicacin del mecanismo de la reaccin al gram (ver las dos imgenes juntas).

Bacteria Gram Positiva

Bacteria Gram Negativa

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del determinante antignico del organismo. exterior est hecha de protena,

fosfolpido y lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la

membrana citoplsmica y la pared celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas,

enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas de transporte.

Tambin existen diferencias en la composicin de la pared entre las clulas de las diversas especies.

Membrana Citoplsmica (citoplasmtica o protoplasmtica)


Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplsmica o protoplsmica y est formada por una bicapa de fosfolpido integral y protenas perifricas empotradas. La membrana citoplsmica tiene una significacin funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la clula y la salida de los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la divisin celular el cromosoma se une a la membrana de la clula en el sitio llamado Mesosoma.

Citoplasma

El material celular contenido dentro de la membrana citoplsmica puede dividirse en tres partes, regin citoplsmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, regin nuclear o cromatnica, que es rica en DNA, y la parte lquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA, combinado con protenas, forma partculas o corpsculos macromoleculares, de unos 200 A de dimetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partculas de RNA-protena se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partculas que se encuentran en las clulas animales y vegetales.

Estructuras Citoplasmticas
Nucleoide (cuerpo cromatnico) Las clulas bacterianas no contienen el ncleo caracterstico de las clulas de las plantas y animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear, el ADN de la clula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es nico y circular, doble hlice sin protenas. Como no se trata de un ncleo discreto, se ha sugerido que se d a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatnico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el mtodo de tincin de Feulgen, especfico para el DNA, y por microscopia electrnica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante. Ribosomas Tienen estrecha relacin con la sntesis de protenas (30S y 50S para formar un complejo 70S). Plsmidos Lazos extracromosmicos de ADN, algn cdigo para la resistencia a drogas, toxinas y otros factores. Endosporas Algunas bacterias pueden transformarse en pequeos ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los gneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. Tambin tienen esta propiedad otros gneros de bacterias verdaderas, pero slo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de clulas vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto perodo del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la sntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.

Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana

Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin "taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas. En lo relativo a la coloracin, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y de Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado. Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM:

Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao

forma esfri ca: se llama Coco

Divisin a lo largo del mismo plano, formando cadenas cortas 2 cocos juntos: Diplococos Divisin a lo largo de 2 planos 4 - 20 en cadenas: Estreptococos diferentes: Ttradas

Divisin a lo largo de 3 planos

regularmente: Sarcinas

irregularmente: Estafilococos

Bacilos
grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Forma de vara: se llaman Bacilos

Dos bacilos juntos: Diplobacilos

Cadenas de bacilos: Estreptobacilos

Empalizadas, Bacilos lado con lado o en figuras en X, V o Y

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Forma espiral rgida se llama: Espirilo

Si la espiral es flexible y ondulada se llama: Espiroqueta

Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en una misma especie.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Positivas

Cocos Gram-positivos
Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae,Streptococcus grupo B

Tetradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos
Gruesos: forma tpica de Clostridium sp,

como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma tpica de Listeria sp

Ramificados:

forma

tpica

de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

grficos obtenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocos Gram-negativos
Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis Tambin Moraxella sp y Acinetobacter

sp aparecen con morfologa de diplococos. Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y, a menudo, Gram-variable.

Bacilos Gram-negativos
Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, yCampylobacter sp, como C. jejuni

Forma

de

aguja

fina:

forma

usual

de Fusobacterium sp

grficos obytenidos de: http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm

Otras tinciones de uso habitual

RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes. Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin morfolgica.

NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin. El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tincin de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de hemocultivos positivos.

ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los actinomiceos (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes).Nocardia spp son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles. El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH concentrado. Lavar y teir durante 3060 seg con Azul de Metileno (color de contraste). Lavar y secar

BLANCO DE CALCOFLOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratoros ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa que se utilice.

TINCIN DE ESPORAS (WIRTZ-CONKLIN)


Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endosporas. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. Algunas de las bacterias

productoras de endosporas son patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme inters.

FUNDAMENTO Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras refringentes y de difcil tincin. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante.

REALIZACIN Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y para poder obtener unos resultados satisfactorios hay que seguir cuidadosamente las instrucciones. 1. Preparar los frotis bacterianos indicados. 2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min. Nota: evitar que la muestra hierva. Aadir ms colorante si ste se evapora; es importante que la muestra no se seque. 3. Lavar abundante agua colorante. 4. Teir safranina 1 min. 5. Lavar abundante agua colorante. 6. Secar la preparacin. 7. Observar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y la morfologa de las tres especies del gnero Bacillus. el con exceso de con el con exceso de

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS La posicin y la morfologa de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero.

Las

tres

bacterias y

empleadas de las

en

esta

prctica

difieren

en

la una

disposicin

morfologa

endosporas. B.

sphaericusposee

endospora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula vegetativa, por lo que suele ser denominada "en palillo de tambor". B. thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico denominado "en huso". B. subtilis forma una espora cilndrica

subterminal no deformante.