1 INTRODUO

Hemostasia o processo pelo qual o corpo espontaneamente deixa de sangrar e mantm o sangue no estado fludo dentro do compartimento vascular. A hemostasia contribui para a homeostase pela tendncia do corpo em manter a coagulao e o sangramento em equilbrio. (FIGURA 1).

FIGURA 1: Hemostasia: um sistema em equilbrio

A hemostasia ocorre em trs estgios: a hemostasia primria, a hemostasia secundria e a fibrinlise. Durante a hemostasia primria, as plaquetas interagem com o subendotlio do vaso injuriado e com outras plaquetas por meio de interaes plaqueta-plaqueta. Um aglomerado de plaquetas se forma com estas interaes, e o plug hemosttico formado conhecido como plug hemosttico primrio. O plug hemosttico primrio temporariamente assegura o sangramento, mas ele frgil e facilmente se desaloja da parede do vaso sangneo. Subseqentemente, fitas insolveis de fibrina se depositam sobre o plug hemosttico primrio para torn-lo forte e estvel e para permitir o reparo da parede vascular sem posterior perda de sangue. A formao de fibrina se resulta da atividade da hemostasia secundria. A fibrina formada por uma srie de complexas reaes bioqumicas de protenas plasmticas solveis, chamadas fatores de coagulao, a medida que eles vo se associando aos vasos sangneos injuriados e s plaquetas do plug plaquetrio. O plug ou cogulo que se forma ento chamado de plug hemosttico secundrio (FIGURA 2).

FIGURA 2: O sangramento ocorre aps uma injria do vaso sangneo. O sistema hemosttico ativado para evitar a perda excessiva de sangue. A hemostasia ocorre em dois estgios. Durante a hemostasia primria as plaquetas se agregam no local da injria (plug hemosttico primrio). Durante a hemostasia secundria, a fibrina se forma em volta do plug de plaquetas para formar o plug de fibrina-plaqueta (plug hemosttico secundrio)

Aps reparo da injria vascular, componentes adicionais do sistema hemosttico atuam para romper a rede de fibrina e remover o cogulo num processo conhecido como fibrinlise.

3 Todas as fases e componentes do sistema hemosttico so controlados por inibidores bioqumicos e fisiolgicos. Entretanto, potenciais riscos esto associados com essa rpida hemostasia localizada. Por exemplo: diante de um desequilbrio poder haver um sangramento excessivo ou uma trombose. Desde que o processo da hemostasia envolve o consumo de plaquetas e fatores da coagulao, h tambm limites quanto ao grau da injria vascular que pode ser reparada. Se a rea injuriada dos vasos excede a capacidade das plaquetas e dos fatores da coagulao em promover a selagem e em impedir o sangramento, complicaes aparecem, e sem alguma forma de tratamento o equilbrio hemosttico no atingindo.

FUNO DO SISTEMA VASCULAR O sistema vascular consiste de trs tipos de vasos sangneos: artrias, veias e capilares.

Estrutura dos Vasos Sangneos: A estrutura de todos os vasos sangneos similar (FIGURA 3). Ela consiste de uma cavidade central, o lmen, atravs do qual o sangue flui. O lmen circundado por uma monocamada de clulas endoteliais que separa o sangue dos tecidos subjacente. Elas fornecem um ambiente protetor para os elementos celulares do sangue e os constituintes solveis do plasma. A superfcie luminal das clulas endoteliais possui uma fina camada composta de protenas e de substncias ricas em carboidratos (mucopolissacardeos). Esta camada chamada de glicocalix. A superfcie aluminal est ligada a uma membrana basal que consiste de uma nica forma de colgeno, o colgeno tipo IV, embebidas na matriz protica. As camadas de tecido abaixo da membrana basal variam em espessura e composio dependendo do tamanho e do tipo do vaso sangneo. Essas camadas abaixo da superfcie aluminal das clulas endoteliais formam o subendotlio. A FIGURA 3 mostra um corte transversal dos vasos. Nesta figura pode-se observar que as camadas das artrias e das veias so distintas. A camada mais interna, a tnica ntima, composta de monocamadas de clulas endoteliais, de membrana basal e de tecido conectivo que as mantm juntas e, nas artrias existe uma membrana elstica interna. A camada mdia, tnica mdia, mais espessa nas artrias do que nas veias. Nas artrias as clulas de msculo liso predominam e so circundadas por tecido conectivo frouxo consistindo primariamente de fibras de elastina, fibras de colgeno, fibras reticulares e proteoglicanas. Nas veias h somente umas poucas clulas de msculo liso, menos fibras de elastina e uma matrix similar de tecido conectivo. A tnica

4 adventcia, a camada externa, mais espessa nas veias do que nas artrias. Nessa camada h uns poucos fibroblastos embutidos no colgeno e no tecido conectivo. Os fibroblastos sintetizam e secretam as fibras e outros componentes da matriz.

Colgeno tipo1 Fibras de Elastina

FIGURA 3- Estrutura e Funo dos Vasos Sangneos: comparao entre arterolas, Vnulas e Capilares as clulas endoteliais, as clulas do msculo liso e os fibroblastos das arterolas e das vnulas sintetizam e secretam os componentes da matriz subendotelial do tecido conectivo e as protenas da membrana basal. Os capilares tm muito pouco tecido conectivo e so compostos basicamente de clulas endoteliais e membrana basal.

5 Capilares: Os capilares (FIGURA 3) compem a maior rea superficial de todos os tipos de vaso sangneos, embora, individualmente, eles so os menores. Eles tm aproximadamente 5 a 10 m de dimetro, o suficiente para passar uma nica clula sangnea. A luz (lmen) de um capilar formada de uma nica clula endotelial. O tecido abaixo da membrana basal de um capilar escasso e no contm clulas de msculo liso.

Veias: Os vasos que aproximam ou deixam os capilares vo se tornando cada vez maior em dimetro mediada que eles se aproximam do corao. As veias que imediatamente deixam os capilares so as vnulas (FIGURA 3). As vnulas possuem dimetro de aproximadamente 20 a 200m e so os principais locais da atividade hemosttica aps uma injria traumtica. As vnulas so compostas de endotlio e membrana basal circundada por uma camada de tecido conectivo extracelular com uns poucos fibroblastos e algumas clulas de msculo liso. O tecido conectivo contm fibras de colgeno tipo I. O fluxo sangneo nas veias lento comparado com o das artrias, mas as vlvulas existentes nas veias de dimetro intermedirio e maior previnem o retorno e mantm o sangue fluindo em direo ao corao.

Artrias: O sangue bombeado do corao para os tecidos atravs das artrias. O lmen das artrias torna-se progressivamente menor para formar os vasos pr-capilares, referidos como arterolas (FIGURA 3). As arterolas so tambm um dos principais locais da hemostasia, so similares s veias em relao a sua estrutura, exceto que uma membrana definitiva de tecido elstico envolve a membrana basal.

Funo dos Vasos Sangneos: Aps uma injria, os vasos lesados iniciam a hemostasia. A primeira resposta dos vasos injria a constrio para reduzir o fluxo de sangue para a rea injuriada e por conseqncia evitar o extravasamento de sangue. A vasoconstrio ocorre imediatamente e perdura por um perodo de tempo muito curto. Ela , em parte, provocada por fatores neurognicos e, em parte, por vrias molculas regulatrias que interagem com receptores presentes na superfcie das clulas dos vasos sangneos. As molculas incluem a serotonina e a tromboxana A2, ambas so

6 produtos da ativao plaquetria, e a endotelina que produzida pelas clulas endoteliais. Por outro lado, as clulas endoteliais sintetizam e secretam a prostaglandina I2 (PGI2). A PGI2 provoca vasodilatao das arterolas. A vasodilatao aumenta o fluxo sangneo na rea injuriada e causa vermelhido na pele. Tambm aps a injria, as clulas endoteliais das vnulas contraem produzindo gaps (espaos) entre elas. O fluido do plasma escapa para os tecidos e causa inchao (edema). Este fenmeno chamado de permeabilidade vascular aumentada. Fisiologicamente, a superfcie das clulas endoteliais carregada negativamente e repele as protenas circulantes e as plaquetas, que tambm so carregadas negativamente.

Bioquimicamente, uma ampla variedade das substncias que so sintetizadas e secretadas pelas clulas endoteliais contribui para um ambiente no reativo. Exemplos so o sulfato de heparana, um mucopolissacardeo do glicocalix, e a trombomodulina, uma protena de membrana da clula endotelial, ambas inibidoras da formao da trombina. A PGI2 por provocar vasodilatao dos vasos sangneos uma inibidora da ativao das plaquetas. Adicionalmente, as clulas endoteliais sintetizam o ativador do plasminognio tecidual (tPA) e um inibidor do tPA chamado de inibidor do ativador do plasminognio (PAI). As clulas endoteliais tambm produzem e processam uma glicoproteina chamada fator de von Willwbrand (vWf). O vWf produzido pelas clulas endoteliais e armazenado em estruturas chamadas corpsculos de Weible-Palade. O vWf no subendotlio liga as fibras de colgeno na matrix extracelular e fornece um suporte para a ligao das plaquetas no estgio inicial da formao do cogulo. A membrana da clula endotelial tambm contm tromboplastina, que exposta durante a injria vascular e responsvel pela ativao de uma das vias que leva a formao da fibrina durante a hemostasia secundria. Quando a injria endotelial ocorre, as plaquetas e as protenas da coagulao (fatores da cascata da coagulao), presentes no plasma, so expostos ao tecido subendotelial. As interaes entre os componentes do vaso e os componentes do plasma levam a formao do plug hemosttico.

PLAQUETAS NA HEMOSTASIA O segundo componente principal do sistema hemosttico so as plaquetas. As plaquetas apresentam uma forma discide, so clulas anucleadas e possuem um dimetro de aproximadamente 2 a 3m. A concentrao normal das plaquetas no sangue de 150 a 450x103/mm3.

7 Produo das Plaquetas: As plaquetas so produzidas na medula ssea a partir da CFU-GEMM (Stem cell formadora de colnias para granulcitos, Eritrcitos megacaricitos e moncitos). Uma

concentrao adequada de plaquetas no sangue perifrico mantida por um processo regulatrio. Dois tipos de fatores de regulao j foram descritos. Alguns atuam sobre a Stem Cell clulas progenitoras, enquanto outros exercem influncia sobre as clulas mais maduras da linhagem megacarioctica. A Interleucina-3 (IL-3) e o fator estimulante de crescimento para granulcitos e moncitos (GM-CSF) so fatores de crescimento que atuam de maneira sinrgica para estimular as Stem Cells a diferenciar em clulas progenitoras megacariocticas e tambm para induzir a proliferao das mesmas. O segundo tipo de fator de crescimento chamado de trombopoietina. A trombopoietina induz a maturao dos megacaricitos. Isso influencia diretamente o nmero de plaquetas que so produzidas e a velocidade de liberao destas clulas para o sangue perifrico.

Estgios de Desenvolvimento do Megacaricito: As Stem Cell ao serem estimuladas pela IL-3 e pelo GM-CSF se diferenciam em megacarioblastos. Os megacarioblastos seguem uma seqncia de maturao que diferente das outras linhagens celulares da medula ssea. No caso das plaquetas os megacarioblastos sofrem uma maturao nuclear antes da maturao citoplasmtica se iniciar. O processo de maturao nuclear consiste de uma srie de endomitoses ou ploidia. Em cada endomitose, o contedo de DNA da clula duplicado, mas a diviso celular no ocorre. O contedo celular, ou o nvel de ploidia, das clulas pode ser de 4N a 32N, ou at mesmo maior. O estgio 8N o primeiro estgio reconhecvel no esfregao de medula ssea e nvel de ploidia mais comum de ser encontrada. A maturao citoplasmtica pode comear no nvel de ploidia igual a 8N ou maior. Quatro estgios de desenvolvimento dos megacaricitos foram descritos de acordo com a morfologia observada nos esfregaos corados por Romanowsky (FIGURA 4). As caractersticas morfolgicas de cada estgio de maturao esto descritas abaixo: Estgio I: Os megacarioblastos tm um escasso citoplasma basoflico. Nenhum grnulo visvel. O ncleo usualmente redondo e o nuclolo pode ser visvel. Os megacarioblastos possuem um dimetro de 6 a 24m. Estgio II: Os promegacaricitos contm grnulos azurfilos visveis. O ncleo lobulado e pode aparecer endentado ou na forma de ferradura de cavalo. O nuclolo desaparece. Os

8 promegacaricitos possuem um dimetro de 14 a 30m. O sistema de membrana citoplasmtica comea a desenvolver neste estgio, mas ele pode ser visto somente com microscopia eletrnica.

FIGURA 4: Seqncia de maturao das plaquetas. A Stem Cell comissionada (CFU-meg) sob a influncia de fatores humorais (GM-CSF e IL-3) diferencia em megacarioblasto 2N. A maturao nuclear ocorre por meio de uma srie de endomitoses. A maturao citoplasmtica estimulada pela trombopoietina, ocorre nas clulas na fase de ploidia 8N ou superior.

Estgio III: Os megacaricito so caracterizados pelo seu grande tamanho, 16 a 56m de dimetro e um grande nmero de grnulos e demarcao de membranas. O ncleo tem mltiplos lobos e a quantidade de citoplasma maior em relao aos estgios II e I. Estgio IV: O ncleo compactado, mas lobulado. O citoplasma abundante. Os grnulos so organizados dentro de regies que so separadas por uma demarcao de membrana. As clulas no estgio IV possuem 20 a 60m de dimetro e so chamadas de megacaricitos maduros.

9 Liberao das Plaquetas: O mecanismo de liberao das plaquetas no completamente entendido, mas acredita-se que as plaquetas so liberadas em grupos chamados de proplaquetas. As proplaquetas so liberadas para o sinuside da medula ssea, onde elas so convertidas em plaquetas e liberadas para o sangue perifrico. O ncleo dos megacaricitos permanece na medula ssea, sendo degradados e removidos pelas clulas do sistema retculo endotelial. Aproximadamente cinco dias so requeridos para um megacarioblasto de desenvolver em plaqueta. Dois teros das plaquetas que so liberadas no sangue perifrico circula na corrente sangnea e um tero so seqestradas pelo bao. O tempo de vida mdio das plaquetas no sangue perifrico de aproximadamente 9,5 dias.

Estrutura da Plaqueta: As plaquetas no ativadas na circulao apresentam uma forma discide com a superfcie lisa. Ao contrrio das hemcias e dos leuccitos as plaquetas possuem vrias aberturas semelhantes aos furos de uma esponja. Estas aberturas so canais membranosos que estendem at o fundo do citoplasma da plaqueta. Aps uma injria, ocorrem uma srie de mudanas que afetam a morfologia e a bioqumica da plaqueta. As mudanas causam a ativao das plaquetas e somente aps esse fenmeno que as mesmas so capazes de formar o tampo hemosttico primrio. A ultraestrutura da plaqueta dividida em quatro regies ou zonas arbitrrias: a zona perifrica, a zona estrutural, a zona organelar, e os sistemas de membrana (FIGURA 5)

FIGURA 5: Diagrama das caractersticas ultra-estruturais da plaqueta no ativada

10 Zona Perifrica: A zona perifrica da plaqueta consiste de uma membrana citoplasmtica, tendo o seu lado externo coberto com uma camada felpuda e a sua poro interna revestida por uma fina regio submembranosa entre a zona perifrica e a prxima camada. A superfcie externa coberta com a camada felpuda tambm chamada de glicocalix. Ele composto de vrias glicoprotenas, protenas, e mucopolissacardeos que so provavelmente adsorvidos do plasma. Esto includos no glicocalix os fatores V, VIII e fibrinognio da cascata da coagulao. O glicocalix tambm encontrado na membrana superficial dos canais internos. Algumas das protenas da membrana superficial da plaqueta so receptores para substncias que estimulam a ativao da plaqueta. A membrana citoplasmtica da plaqueta composta de uma bicamada fosfolipdica e protenas integrais. O arranjo assimtrico dos fosfolipdeos um fator importante na funo das plaquetas ativadas. As protenas integrais apresentam em sua composio acares e por isso so chamadas de glicoprotenas. Elas so abreviadas em Gp e so numeradas em algarismos romanos de I a IX de acordo com a migrao eletrofortica de cada glicoprotena. Entre estas glicoprotenas quatro so de extrema importncia para a funo da plaqueta, as quais recebero um maior enfoque. Glicprotena Ib (FIGURA 6a) receptor para o fator de von Willebrand (vWf). Ela est complexada com a Gp IX na membrana, mas a funo da Gp IX desconhecida. A GpIb possui duas cadeias, chamadas (alfa) e (beta). A cadeia grande e contm stios de ligao para o vWf, trombina, ristocetina (usada nos testes de agregao plaquetria), e auto-anticorpos produzidos em pessoas sensveis quinidina. Cada plaqueta contm aproximadamente 25.000 molculas de GpIb. O complexo glicoproteina IIb/IIIa (FIGURA 6b) um receptor para o fibrinognio. Ele tambm liga a outras protenas adesivas, tais como o vWf, a trombospondina, a vitronectina e a fibronectina. H aproximadamente 50.0000 molculas de GpIIb/IIIa por plaqueta. A GpIIb tem duas cadeias, a cadeia (alfa) e (beta)O lado citoplasmtico das duas protenas esto associados com a actina do citoesqueleto da plaqueta. O complexo GpIIb/IIIa est oculto na plaqueta no ativada e aparecem somente quando as plaquetas so ativadas. Ele requerido para o processo de agregao plaquetria. O cido aracdnico, um cido graxo no insaturado, o principal componente da poro fosfolipdica da membrana. Ele um precursor dos muitos estimuladores que provocam agregao plaquetria e a constrio dos vasos.

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FIGURA 6: Estrutura das glicoprotenas da membrana. (A)- A glicoprotena Ib composta de uma subunidade alfa e uma beta. A subunidade alfa maior e contm os stios de ligao para a trombina, ristocetina e para o vWf. A glicoproena Ib est associada com a glicoprotena IX. (B)- As glicoprotenas Iib e IIIa se associam para formar um complexo aps a ativao das plaquetas, expondo os stios de ligao para o fibrinognio.

Zona Estrutural: A zona estrutural consiste de microtbulos e uma rede de protenas. As funes da zona estrutural so: conferir suporte membrana plasmtica para manter a plaqueta na sua forma

12 discide e para proporcionar mudana de forma quando a plaqueta ativada. Os microtbulos so compostos de uma protena chamada tubulina. Eles so importantes para manter a plaqueta em sua forma discide. A rede de protenas consiste de actina, de protena ligante de actina e de vrias outras protenas estruturais (FIGURA 7). A actina a protena mais abundante nas plaquetas e representam 15 a 20% do total de protena encontrada na plaqueta. A actina apresenta duas formas, G ou globular e F ou filamentosa. A forma F consiste de vrias molculas G polimerizadas. A protena ligante de actina est ligada poro citoplasmtica no complexo GpIb/IX e ancora a actina membrana. A actina tambm faz parte de uma rede de suporte ao longo de todo o citoplasma. No citoplasma ela est associada com a miosina e outras protenas contrteis.

FIGURA 7- Citoesqueleto e rede de citoesqueleto na plaqueta no ativada. O citoesqueleto composto de actina F e protena ligante de actina associada com as glicoprotenas integrais da bicamada fosfolipdica. A rede de citoesqueleto no citoplasma consiste primariamente de actina F e actina G, de protena ligante de actina e de miosina que esto distribudas aleatoriamente no citoplasma da plaqueta.

Zona Organelar: A zona organelar fica abaixo da camada de microtbulos e consiste de mitocrndrias, partculas de glicognio, e no mnimo trs tipos de grnulos dispersos dentro do citoplasma: corpsculos densos, grnulos alfa, e grnulos lisosomais. Os grnulos densos contm os seguintes

13 mediadores no proticos da funo plaquetria e da hemostasia: ADP, ATP, e outros nucleotdeos, ons clcio e serotonina. O ADP nos corpsculos densos conhecido como ADP no metablico ou ADP do Pool de estoque para distinguir do ADP metablico encontrado no citoplasma. O ADP metablico fornece energia para o metabolismo normal da plaqueta, enquanto que o ADP de estoque importante para as reaes de agregao plaquetria. Os grnulos alfa so os mais numerosos de todos os trs tipos de grnulos. Os grnulos alfa contm protenas hemostticas, tais como: o vWf, fator V e fibrinognio e protenas com funes variadas, incluindo fatores de crescimento e o inibidor do ativador do plasminognio (PAI-1). Os grnulos lisosomais contm vrias enzimas hidrolticas e so similares aos lisosomas encontrados nas outras clulas. As plaquetas tambm contm enzimas da via glicoltica, do ciclo de Krebs, e da sntese e degradao do fibrinognio.

Sistema de Membrana: Um tipo de membrana chamado sistema canicular aberto conectado superfcie a membrana que circunda os canais que vo da superfcie da plaqueta para o interior da plaqueta. Um segundo tipo de membrana o sistema tubular denso, que tem origem no retculo endoplasmtico rugoso. um dos locais de estoque para os ons clcio. Os canais do sistema tubular denso no conectam com a superfcie da plaqueta. Os dois sistemas de membrana, o sistema canicular aberto e o sistema tubular denso, se fundem em vrias reas do citoplasma da plaqueta.

Funo das Plaquetas: As plaquetas esto envolvidas em vrios aspectos da hemostasia, tais como: vigilncia da continuidade do vaso sangneo, formao do tampo hemosttico primrio, formao do tampo hemosttico secundrio e cicatrizao do tecido injuriado. A funo das plaquetas em manter a continuidade dos vasos sangneos parece controvrsia, mas tem sido demonstrado que estas clulas aderem nos pequenos gaps (aberturas) provocadas pela separao das clulas endoteliais. As plaquetas aderem s fibras de colgeno do subendotlio que se expe por meio dos gaps e previnem o extravasamento sangneo. Quando a injria vascular ocorre e h uma quebra na continuidade da parede dos vasos, as plaquetas reagem para formar um agregado conhecido como tampo plaquetrio primrio. O

14 sangramento pra porque as aberturas nos vasos so mecanicamente fechadas por uma massa de plaquetas. Aps a formao do tampo hemosttico primrio, os fosfolipdeos da membrana das plaquetas agregadas ativam reaes de superfcie para a formao de fibrina. A fibrina estabiliza o tampo hemosttico primrio e a rede de fibrina em conjunto com as plaquetas chamada de tampo hemosttico secundrio. As plaquetas secretam mediadores que ajudam a selar os tecidos injuriados. O fator de crescimento derivado das plaquetas, um mitognio estocado nos grnulos alfa, estimula as clulas do msculo liso e possivelmente os fibroblastos a multiplicar e substituir as clulas que foram lesadas pela injria.

PARTICIPAO DAS PLAQUETAS NA HEMOSTASIA PRIMRIA

Formao do Tampo Hemosttico Primrio: As plaquetas so discides e inertes na circulao quando o endotlio vascular est ntegro. A injria no vaso sangneo provoca uma mudana no ambiente. As plaquetas respondem mudana se tornando ativadas. O tampo hemosttico primrio o resultado da transformao das plaquetas inativas para plaquetas ativadas. O tampo hemosttico primrio se forma numa seqncia especfica de etapas que so chamadas de adeso, ativao, agregao e secreo (FIGURA 8).

FIGURA 8: Diagrama das plaquetas formando o tampo hemosttico primrio. A injria vascular estimula as plaquetas a aderir ao colgeno subendotelial. Aps a adeso as plaquetas mudam de forma, se agregam e secreta o contedo de seus grnulos. Plaquetas adicionais se tornam ativadas pelas substncias secretadas e se agregam para formar uma barreira no local da leso.

15 Adeso das Plaquetas: Quando o endotlio lesado e o sangramento ocorre, as plaquetas escapam dos vasos sangneos e atingem os tecidos subendoteliais. Elas imediatamente aderem aos componentes do subendotlio. As fibras de colgeno so componentes de extrema importncia neste processo. As superfcies subendoteliais possuem componentes que em condies normais as plaquetas no so expostas. A adeso das plaquetas ao colgeno ocorre somente com a ajuda do vWf e da GpIb da membrana da plaqueta. O vWF, que sintetizado pelas clulas endoteliais, estocado e secretado por estas clulas na rea subendotelial e no plasma. No subendotlio, o vWf adsorvido nas fibras de colgeno. O vWf tambm encontrado nos grnulos alfa das plaquetas. A FIGURA 9 mostra que a molcula do vWf uma glicoproteina grande e possui uma srie de 2 a 50 subunidades idnticas. Cada subunidade tem receptores pra o colgeno e para a GpIb. Em situaes de normalidade, o vWF das plaquetas no incorporado ao Pool plasmtico circulante. O vWF, produzido pela clula endotelial, forma no plasma um complexo no-covalente com o Fator VIII coagulante (FVIII:C).

FIGURA 9: O complexo Fator VIII/vWF composto de uma protena procoagulante que codificada por um gene localizado no cromossoma X (Fator VIII) e por um multmeros que atua na adeso plaquetria. Para uma adequada adeso plaquetria, os complexos formados pelos multmeros maiores so necessrios.

Essa ligao alm de conferir estabilidade ao FVIII:C, pelo aumento da sua sobrevida, ela tambm protege o referido fator contra a inativao proteoltica e assim potencializa a sua

16 atividade como co-fator da cascata da coagulao. A outra grande funo do vWF a de promover a adesividade plaquetria ao subendotlio. Estas funes do vWF decorrem da sua peculiar estrutura, j que ela formada por multmeros de diversos tamanhos (pequenos, intermedirios e grandes). Os multmeros de maior tamanho so os que propiciam a ligao das plaquetas ao subendotlio, enquanto que os de menor tamanho so os que, preferencialmente, se ligam ao FVIII:C. Quando a adeso da plaqueta ocorre, o vWf se liga ao colgeno e GpIb presente na membrana da plaqueta, tornando uma ponte de conexo entre a plaqueta e as fibras de colgeno. (FIGURA 10). Como as ligaes continuam as plaquetas vo formando um verdadeiro zipper pela ligao de seus receptores s vrias protenas de adeso que esto presentes na matrix do tecido conectivo. Muitas plaquetas se aderem ao subendotlio formando uma monocamada de plaquetas com a finalidade de cobrir a superfcie de colgeno.

FIGURA 10: Adeso das plaquetas ao subendotlio por intermdio do Fator de von willebrand, aps a injria do vaso sangneo. A glicoprotena IB est envolvida no processo de adeso das plaquetas ao subendotlio vascular.

Ativao das Plaquetas: A adeso das plaquetas s fibras de colgeno via o vWf desengatilha uma srie de mudanas morfolgicas e funcionais conhecidas como ativao plaquetria. A ativao um processo complicado que no totalmente entendido ainda. Sabe-se que no processo de ativao ocorre mudana no metabolismo bioqumico, na forma, nos receptores de superfcie e na

17 orientao dos fosfolipdeos da membrana. Somente as plaquetas ativadas so capazes de dar continuidade s etapas subseqentes do processo de formao do tampo hemosttico primrio. O agente que induz a ativao da plaqueta chamado de agonista. Cada agonista liga a um receptor especfico da plaqueta e causa uma srie de reaes no citoplasma da plaqueta. As mudanas bioqumicas se iniciam quando o vWf se liga ao colgeno e GpIb presente na membrana da plaqueta. Quando isso ocorre, as enzimas na membrana se tornam ativadas e clivam de maneira especfica os fosfolipdeos de membrana. Os produtos resultantes so segundos mensageiros que entram no citoplasma da plaqueta e transfere o sinal para as estruturas internas da clula. Muitas reaes so subseqentemente ativadas pelos segundos mensageiros. Os segundos mensageiros so produtos de trs enzimas de membrana: a fosfolipase C, a fosfolipase A2 e a adenil ciclase. Os produtos de todas as trs enzimas causam um rpido movimento intracelular de ons clcio dos locais de estoque, sistema tubular denso, e tambm do lado externo, plasma, para o citoplasma da plaqueta. As plaquetas no ativadas tm baixos nveis de ons clcio no citoplasma. Muitos sistemas que so lentos nas plaquetas ativadas se tornam rpidos na presena de ons clcio. O substrato para a fosfolipase C um fosfolpede derivado do fosfatidilinositol (PI), presente na poro interna da bicamada. Um ou dois grupos fosfatos podem ser enzimaticamente adicionados ao PI via ATP nas posies 4 e 5 do inositol para formar o fosfoinositol-4monofosfato e o fosfoinositol-4,5-bifosfato (PIP2), tambm chamado de difosfatidilinositol e trifosfatidilinositol, respectivamente. A fosfolipase C ao romper o PIP2 forma dois produtos, o inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) e o diacilglicerol. O IP3 estimula uma srie de reaes que resulta na liberao de ons clcio do sistema tubular denso. O diacilglicerol ativa as protenas kinase C, que ir fosforilar outras protenas. As protenas fosforiladas pela Kinase C ativa a secreo dos grnulos e o aparecimento dos receptores para o fibrinognio, a GpIIb/IIIa (FIGURA 11). A Fosfolipase A2 estimulada pelo aumento da concentrao intracitoplasmtica de ons clcio. A fosfolipase A2 atua sobre o fosfatilinositol e a fosfatidilcolina liberando o cido aracdnico. O cido aracdnico um cido graxo monoinsaturado e um precursor de uma variedade de substncias regulatrias. Na plaqueta, a tromboxana A2 sintetizada a partir do cido aracdnico pela enzima ciclo-oxigenase e tromboxana A2 sintetase (FIGURA 12). Dentro da plaqueta, a tromboxana A2 estimula a secreo dos grnulos plaquetrios. A secreo plaquetria no ocorre de maneira normal se a sntese da tromboxana A2 estiver bloqueada e conseqentemente as etapas subseqentes da funo plaquetria ficaro seriamente

18 comprometidas. A ingesto de aspirina inibe de maneira irreversvel a ciclo-oxigenase e impedem as plaquetas afetadas de sintetizarem a tromboxana A2. A tromboxana A2 tambm pode difundir para o exterior da plaqueta e aumentar a vasoconstrio. A tromboxana A2 espontaneamente convertida em sua forma inerte, tromboxana B2, em um curto perodo de tempo aps a sua sntese. Dentro da plaqueta, a enzima adenil ciclase quando ativada tem a funo de aumentar os nveis internos de ons clcio.

FIGURA 11: Um segundo mensageiro mobilizado quando as plaquetas so estimuladas por um agonista. Quando as plaquetas so estimuladas a aderirem ao subendotlio vascular, aps uma injria vascular, uma mensagem transferida da superfcie para o interior da clula. Quando a mensagem chega ao citoplasma, ocorre uma srie de mudanas na bioqumica e no metabolismo da plaqueta fazendo que elas se tornem ativadas. Os segundos mensageiros so: diacilglicerol (DG) e inositol-1,4,5-trifosfato (IP3).

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FIGURA 12: Sntese das prostaglandinas nas plaquetas e nas clulas endoteliais durante a formao do tampo de plaquetas.

A ativao continua com a mudana da forma da plaqueta quando os nveis internos de clcio atingem um limiar. A mudana de forma a transformao de uma forma discide para uma forma esfrica contendo prolongamentos, chamados pseudpodes, em sua superfcie. (FIGURA 13). Esta mudana de forma envolve as protenas da zona estrutural, incluindo as protenas do citoesqueleto, a actina e a miosina da malha citoplasmtica e os microtbulos. O resultado da mudana de forma que cada plaqueta passa a ter uma maior rea superficial de membrana para as reaes bioqumicas e uma maior chance de contato com outras plaquetas. Alm disso, a ativao das plaquetas provoca o aparecimento do receptor GpIIb/IIIa ao qual o fibrinognio se liga. Esse receptor oculto nas plaquetas no ativadas e aparece logo aps a ativao das plaquetas por algum agonista. As plaquetas so capazes de ligar ao fibrinognio somente aps o aparecimento do receptor GpIIb/IIIa. O on clcio necessrio para a ligao do fibrinognio plaqueta.

20

FIGURA 13: Mudana de forma da plaqueta aps estmulo por um agonista. Ocorre o aparecimento de pseudpodes sobre a superfcie da plaqueta e uma rede intracitoplasmtica de actina e miosina. Ocorre mudanas bioqumicas e degradao enzimtica de fosfolpedes de membrana para a formao de segundos mensageiros, exposio dos receptores glicoprotena IIb/IIIa para a ligao de fibrinognio e secreo dos grnulos.

Nas plaquetas no ativadas a glicoproteina IIb e a glicoproteina IIIa so entidades separadas. Muitos autores descrevem a natureza do aparecimento do receptor GpIIb/IIIa como uma fuso das duas glicoprotenas aps a estimulao por um agonista (FIGURA 14)

FIGURA 14: As etapas iniciais da agregao plaquetria. Aps estmulo por um agonista, os receptores glicoprotena IIb/IIIa para a ligao de fibrinognio so expostos sobre a superfcie da plaqueta. O fibrinognio forma uma ponte entre duas ou mais plaquetas.

21 Um outro aspecto da ativao uma mudana na superfcie da membrana plaquetria que permite as protenas formadoras de fibrina (fatores da cascata de coagulao) ligarem a ela. Essa funo conhecida como atividade procoagulante da plaqueta. As protenas so ligadas em complexos que permite a correta orientao das enzimas e das molculas de substrato para a formao da fibrina.

Agregao das Plaquetas: Aps as plaquetas serem ativadas, a formao do tampo hemosttico primrio continua com uma fase conhecida como agregao plaquetria. A agregao plaquetria a ligao de uma plaqueta na outra. Novas plaquetas que se aproximam ao local do sangramento se tornam ativadas pelo contato com agonistas, tais como o ADP, que so liberados pelas clulas endoteliais lesadas e pelas plaquetas previamente ativadas. Com a ativao, as novas plaquetas mudam de forma e os receptores GpIIb/IIIa se tornam expostos. As novas plaquetas ativadas ento se ligam quelas que esto aderidas s fibras de colgeno. A agregao ocorre em duas fases, primria e secundria. Durante a agregao primria as plaquetas se aderem frouxamente umas s outras e se o estmulo pelo agonista for fraco, a agregao primria se desfaz. J a agregao secundria requer um maior perodo de tempo para acontecer e comea somente quando as plaquetas iniciam a liberao do seu ADP de estoque, como tambm a liberao de outros contedos presentes em seus grnulos e a sintetizar tromboxana A2. As substncias liberadas atuam como agonistas para dar continuidade ao processo de estimulao. Se as plaquetas so incapazes de liberar ADP e/ou sintetizar tromboxana A2, a agregao secundria no ocorre e por conseqncia elas se desagregam. O fibrinognio e o clcio extracelular so necessrios para a agregao ocorrer. Ambos so constituintes plasmticos. Ambos so liberados pelas plaquetas a partir de seus grnulos internos de estocagem com o intuito de atingir altas concentraes na rea injuriada. Uma nica molcula de fibrinognio capaz de se ligar em duas plaquetas por causa da sua estrutura molecular. O fibrinognio uma molcula trinodular e composta por duas metades idnticas. A molcula possui trs pares de cadeias polipeptdicas, sendo duas cadeias alfa, duas cadeias beta, e duas cadeias gama. Estas cadeias esto unidas por trs ligaes de sulfeto, uma ligao entre as cadeias alfa e duas entre as cadeias gama (FIGURA 15). As duas metades do fibrinognio so unidas na poro amino-terminal das trs cadeias, formando um ndulo central chamado de domnio central ou domnio E. As regies carboxi-terminal das cadeias beta e gama em conjunto com uma curta seqncia da cadeia alfa formam os dois ndulos terminais, um em cada extremidade da

22 molcula. Esses ndulos so tambm referidos como domnios terminais ou domnio D. Uma molcula de fibrinognio pode ligar aos receptores GpIIb/IIIa de duas plaquetas diferentes pelos seus stios de ligao nas cadeias alfa e gama de seus domnios D (FIGURA 15). Aproximadamente 16 a 80.000 molculas de fibrinognio esto ligadas em cada plaqueta ativada. Durante um curto intervalo de tempo, a ligao do fibrinognio reversvel, mas aps cerca de 10 a 30 minutos ela se torna irreversvel. As glicoprotenas: vWf, trombospondina, fibronectina e as protenas de adeso celular tambm se ligam ao receptor GpIIb/IIIa da plaqueta.

FIGURA 15: O fibrinognio uma molcula de estrutura trinodular composta de trs pares de cadeias polipeptdicas (A, B e ) unidas entre si por ligaes de sulfeto. Os trs ndulos so denominados domnios D e E, sendo dois domnios D nas duas extremidades e o domnio E na regio central da molcula. A trombina remove os peptdeos pequenos, A e B das cadeias e para formar os monmeros de fibrina.

Secreo (liberao) pelas Plaquetas: Aps a adeso, mudana de forma e agregao primria, as plaquetas comeam a descarregar o contedo de seus grnulos na rea circundante. O processo conhecido como secreo ou liberao. A secreo dependente de energia e requer ATP. Isso ocorre gradualmente por um perodo de tempo e antes ou concomitante com a agregao secundria.

23 A secreo ocorre em dois caminhos. Por um mecanismo, o sistema canicular aberto se funde com a membrana dos grnulos. O contedo ento secretado pelo sistema canicular aberto. Por um caminho alternativo, as membranas de alguns grnulos se fundem umas com as outras e por fim com a membrana plasmtica da plaqueta para a secreo de seu contedo. Alguns das substncias secretadas so agonistas que estimulam o aparecimento dos receptores de membrana. O aparecimento dos receptores aumenta os nveis internos de ons clcio e com isso aumenta a taxa de contedo secretado.

Tampo Hemosttico Primrio: As plaquetas quando ativadas se agregam para formar uma barreira que sela a injria e previne a perda de sangue. A barreira formada chamada de tampo hemosttico primrio. O tempo para o sangramento cessar depende da extenso e da profundidade da injria, como tambm do tamanho do vaso sangneo. Injrias em que somente capilares e pequenos vasos so afetados, usualmente cessam o sangramento dentro de 10 minutos.

PLAQUETAS E A HEMOSTASIA SECUNDRIA:

O tampo hemosttico primrio relativamente instvel e facilmente desalojado. O tampo plaquetrio estabilizado e firmemente ancorado parede do vaso pelo processo da hemostasia secundria. A hemostasia secundria comea com a formao de fibrina em volta das plaquetas agregadas. Posteriormente a massa de fibrina-plaqueta se contrai para formar um cogulo mais firme e coesivo. Essa contrao chamada de retrao do cogulo. As plaquetas participam da formao da rede de fibrina e da retrao do cogulo.

Atividade Procoagulante das Plaquetas: A ativao das plaquetas resulta na exposio de stios de ligao para os fatores da cascata de coagulao envolvidos na formao de fibrina sobre a superfcie plaquetria. A ligao dos fatores da cascata de coagulao aos receptores especficos presentes na membrana da plaqueta fornece uma orientao correta da molcula para as reaes enzimticas ocorrer e para a formao de trombina. A capacidade das plaquetas estimuladas em catalisar o processo da cascata de coagulao pelo fornecimento da superfcie fosfolipdica conhecida como fator 3 da plaqueta ou atividade procoagulante da plaqueta.

24

HEMOSTASIA SECUNDRIA A hemostasia secundria ocorre quando as protenas solveis no plasma, conhecidas como fatores da coagulao, se interagem em uma srie de reaes enzimticas bastante complexas para converter o fibrinognio, uma protena solvel no plasma, em fibrina, protena insolvel. As reaes ocorrem em cascata de tal maneira que os fatores inativos da coagulao, os zimognios, so seqencialmente ativados em enzimas (FIGURA 16).

FIGURA 16: Representao esquemtica da ativao dos fatores na cascata da coagulao. Os fatores circulam como protenas inertes (zimognios) at serem ativados a uma enzima por clivagem proteoltica.

Cada zimognio serve primeiramente como um substrato e posteriormente como uma enzima. O substrato final da cascata o fibrinognio e quando atua como substrato para enzima final, a trombina, o fibrinognio convertido em fibrina. A ativao da cascata comea quando os zimognios so expostos s camadas subendoteliais dos vasos sangneos. Todas as reaes enzimticas exceto a ltima (formao de fibrina a partir do fibrinognio) requerem uma superfcie fosfolipdica fornecida pela membrana das plaquetas ativadas e dos vasos injuriados. A

25 necessidade de uma superfcie importante para que haja uma localizao das reaes e da formao de fibrina no local da injria. Todas as enzimas da cascata so serino-proteases, exceto o Fator XIII que uma transamidase. As reaes originais so amplificadas muitas vezes pela presena dos cofatores e da ativao positiva por feedback.

INTERAES E CONTROLE DA HEMOSTASIA Os monmeros de fibrina se polimerizam formando uma malha em volta do tampo hemosttico primrio semelhante a uma rede, produzindo uma barreira fsica estvel para no deixar escapar o sangue. Ambas as hemostasias primria e secundria so necessrias para a formao normal do cogulo. Deficincias na hemostasia primria usualmente produz pequenos pontos hemorrgicos por baixo da pele, chamados de petquias e sangramento nas mucosas. Por outro lado, deficincias na hemostasia secundrias produzem ecmoses, grandes hematomas e hemorragias mais srias nas juntas e nas cavidades do corpo. O processo de formao da fibrina um processo muito bem controlado, de tal forma que a formao do cogulo limitado ao vaso injuriado para evitar o espalhamento da ativao da coagulao. A atividade proteoltica dos fatores ativados limitada pelos inibidores naturais ou reguladores. O processo de formao da fibrina tambm controlado pelo feedback negativo; ou seja, a trombina em grandes quantidades destri os cofatores da cascata de coagulao de maneira limitante velocidade da sua prpria produo. Depois que o cogulo de fibrina desempenhou o seu papel de bloquear o extravasamento sangneo, o vaso injuriado comea a ser reparado e a fibrina digerida pela plasmina, uma enzima do sistema fibrinoltico. A plasmina normalmente circula como uma protena inerte, o plasminognio, e ativada pelas serina-proteases da cascata de coagulao e pelo ativador do plasminognio tecidual (tPA), um fator liberado pelo endotlio do vaso sangneo injuriado.

FATORES DA CASCATA DA COAGULAO

Os fatores da cascata da coagulao so designados por algarismos Romanos, de I a XIII, de acordo com a sua ordem de descoberta e no de acordo com a seqncia de reao em que eles atuam. Cada fator tem um ou mais nomes. O fator VI agora considerado a forma ativada do fator V. Quando um Fator se torna ativado, ele tem uma atividade enzimtica e a letra a adicionada como sufixo ao algarismo romano. Por exemplo, o Fator XII aps ativao passa a ser

26 chamado de Fator XIIa. H vrias excees desta terminologia. O Fator II (protrombina) em sua forma ativada preferencialmente conhecida como trombina e no Fator IIa, e quando o fibrinognio (Fator I) clivado pela trombina ele preferencialmente chamado de fibrina. A fibrina o produto final da casta da coagulao e no tem nenhuma atividade enzimtica. A tromboplastina tecidual e o clcio no tm nenhuma forma ativada.

Fonte e Caractersticas dos Fatores da Cascata da Coagulao: Os fatores da cascata da coagulao so sintetizados no fgado. O plasminognio, do sistema fibrinoltico, e os inibidores de protease tambm so sintetizados no fgado. Na doena heptica severa, a concentrao dessas protenas pode estar marcadamente diminuda. O Fator VIII um complexo macromolecular composto de duas protenas distintas: uma poro pequena com atividade procoagulante (VIII:C) e uma poro multimrica grande que serve para ligar as plaquetas ao colgeno (o fator de von Willebrand, vWf). A sntese do fator VIII:C ocorre no fgado e a do vWF nas clulas endoteliais e nos megacaricitos. De acordo com as propriedades fsicas, os fatores da coagulao podem ser divididos em trs grupos: gruo da protrombina, grupo do fibrinognio e o grupo dos fatores de contato (TABELA 1).

Tabela 1- Grupos dos Fatores da Cascata da Coagulao de acordo com as Caractersticas Fsicas
GRUPO DE CONTATO GRUPO DA PROTROMBINA GRUPO DO FIBRINOGNIO Caracterstica: molcula de alto peso molecular e ausente no soro (consumidos durante a coagulao).

Caracterstica: requer o contato Caracterstica: requer Vitamina com uma superfcie para K para a sntese funcional e ativao necessita de Ca2+ para ligar superfcie fosfolipdica. XII XI Precalicrena HMWK II VII IX X

I V VIII XIII

As principais caractersticas dos fatores da cascata da coagulao esto descritas na TABELA 2

27 Tabela 2- Algumas Caractersticas dos Fatores da Coagulao ATIVIDADE Fator* Nome Descritivo
Fibrinognio Protrombina Pro-acelerina Pro-convertina

Bioqumica
Glicoproteina multimrica Glicoproteina multimrica Glicoproteina multimrica Glicoproteina monomrica Glicoproteina multimrica Glicoproteina monomrica Glicoproteina multimrica Glicoproteina monomrica Glicoproteina dimrica Glicoproteina dimrica Glicoproteina monomrica Glicoproteina multimrica -globulina monomrica -globulina monomrica

Local de Sntese
Fgado Fgado (Vit.K) Fgado Fgado (Vit.K)

Meia-vida Biolgica
72-120 horas 67-106 horas 12-36 horas 4-6 horas

Soro

Adsorvido do Plasma por BaSO4

Inalterada Ausente Inalterada Ausente Inalterada Inalterada Inalterada Ausente Ausente Lig. Diminuda Inalterada Inalterada ? ?

Funo
Precursor da fibrina da via comum Pro-enzima e precursor da trombina na via comum Cofator da via comum Pro-enzima da via extrnsica Cofator da via intrnsica; atua na adeso plaquetria Cofator da via intrnsica Atua na adeso plaquetria Pro-enzima da via intrnsica Proenzima da via comum Proenzima da via intrnsica Proenzima da via intrnsica Proenzima da via comum Cofator da via intrnsica; sistema cininas Cofator da via intrnsica; sistema cininas

[] Plasma (mg/L)
2.500 3.000 70 - 150 4 - 14 0,5 7 0,1 ? 4 10 27 27 45 1 50 70-90

I II V VII VIII-vWF VIII:C VWf IX X XI XII XIII Prcalicrena HMWK

Ausente Ausente Ausente Aumentada Ausente

Anti-hemoflico

Fgado Endotlio Megacaricito Fgado (Vit.K) Fgado (Vit.K) Fgado ? Fgado Megacaricito Fgado Fgado

CTP Fator de Stuart ATP Fator Hageman FSF Prcalicrena HMWK

10-14 horas 22-40 horas 18-40 horas 24-60 horas 48-84 horas 52-60 horas 72-168 horas ? ?

Ausente Presente Aumentada Inalterada Inalterada Inalterada Diminuda Inalterada Inalterada

Observaes: Todas as informaes colocadas nesta tabela so de origem humana.

CTP: componente da tromboplastina plasmtica; ATP: antecedente da tromboplastina plasmtica; FSF: Fator estabilizante da fibrina; HMWK: cininognio de alto peso molecular.

28 Grupo da Protrombina: O grupo da protrombina inclui os Fatores II, VII, IX e X. Esses fatores tm uma massa molecular de 50.000 a 100.000 Daltons e migram na eletroforese junto com a -globulina ou com a -globulina. ons clcio so necessrios para a ligao dos fatores a uma superfcie rica em cido fosfolipdico (superfcie negativa), onde os fatores so ativados em enzima. A vitamina K tem uma funo muito importante para que estes fatores sejam sintetizados de maneira funcional. Desta forma, os fatores do grupo da protrombina so tambm conhecidos como fatores dependentes de vitamina K. A vitamina K encontrada em alguns leos vegetais e em folhosos (brcolis, couve-flor, alface,...). Ela tambm sintetizada no intestino por vrias bactrias. A vitamina K lipossolvel e por isso absorvida no trato gastrointestinal somente na presena dos sais biliares. A vitamina K necessria para a adio de um grupo carboxila (COOH) ao carbono dos resduos de cido glutmico (-carboxilao) na poro amino-terminal da cadeia polipeptdica (FIGURA 17). Essa modificao ps-traducional fornece um receptor crtico para os ons clcio, o qual proporciona a ligao do fator superfcie fosfolipdica. Assim na ausncia de vitamina K, os fatores so sintetizados no fgado e podem ser encontrados no plasma, mas eles so totalmente no funcionais porque eles no tm grupos carboxilas ( COOH) necessrios para a sua ligao superfcie fosfolipdica.

FIGURA 17: Atuao da Vitamina K na -carboxilao dos Fatores II, VII, IX e X da Cascata da Coagulao, e o mecanismo de ao dos antagonistas da Vitamina K.

29 Grupo do Fibrinognio: O grupo do fibrinognio inclui os Fatores I, V, VIII e XIII. Esse grupo de fatores tambm referido como grupo consumvel porque eles so consumidos durante a formao da fibrina e por conseqncia esto ausentes no soro. Os Fatores I, V, e XIII tm massas moleculares de 300.000 a 340.000 Daltons. O Fator VIII um complexo macromolecular com uma massa molecular de aproximadamente 1.200.000 Daltons. Os fatores deste grupo migram na eletroforese junto com a -globulina ou com a -globulina.

Grupo dos Fatores de Contato: O grupo de contato inclui os Fatores XI e XII, e tambm as protenas prcalicrena e cininognio de alto peso molecular (HMWK). Esses fatores esto envolvidos na ativao inicial da via intrnsica e requerem o contato com uma superfcie carregada negativamente para se tornarem ativos. O Fator XI e o Fator XII tem uma massa molecular de 80.000 Daltons e 165.000 Daltons, respectivamente, e migram na eletroforese junto com a -globulina ou com a globulina.

COAGULAO SANGNEA: TEORIA DA CASCATA

O processo da coagulao sangnea envolve uma srie de reaes bioqumicas que transforma substncias circulantes solveis em um gel insolvel pela converso do fibrinognio solvel em fibrina. Esse processo requer protenas plasmticas (fatores da coagulao), fosfolpides e clcio. A formao da rede de fibrina durante a coagulao sangnea pode ocorrer por dois caminhos distintos: a via extrnsica e a via intrnsica. Ambas as vias levam a ativao do fator X que converge a cascata para uma via comum levando a formao de trombina, a qual ir converter o fibrinognio em fibrina. Assim, a formao do Fator Xa, da trombina e da fibrina compe a via comum. Conforme o exposto a coagulao sangnea ento dividida em trs vias: via intrnsica, via extrnsica e via comum. Esta diviso foi feita de acordo com o modo e a seqncia de ativao dos fatores da coagulao in vitro. A FIGURA 18 mostra que cada via envolve reaes entre um grupo especfico de fatores da coagulao.

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Via Intrnsica Prcalicrena HMWK Fator XII Fator XI Fator IX Fator VIII

Via Extrnsica Fator III

Fator VII

LENTO Via Comum Fator X Fator V Fator II (protrombina) Fator I (fibrinognio)

RPIDO

FIBRINA

FIGURA 18: Fatores da cascata da coagulao das vias intrnsica, extrnsica e comum.

As trs vias requerem uma ativao inicial, que leva a uma subseqente ativao de outros fatores sob a forma de uma cascata. De acordo com a teoria da cascata, cada fator da coagulao convertido em sua forma ativa por um fator precedente que tambm foi ativado por outras reaes bioqumicas. O clcio ionizado (Ca2+) participa como cofator em algumas destas reaes. Como cada reao promovida por uma reao precedente, a deficincia de algum dos fatores trar como conseqncia uma coagulao no acontecendo em velocidade normal e, portanto um tempo maior para a formao do cogulo e um maior tempo de sangramento pelo vaso sangneo que foi lesado. A via intrnsica ativada pelo contato das protenas com as superfcies negativamente carregadas. No entanto, a via extrnsica ativada pelo contato do Fator VII com o Fator tissular, tambm chamado de Fator III, Fator tecidual ou tromboplastina. As vias intrnsica e extrnsica se convergem na via comum. O termo extrnseco usado porque a ativao desse caminho requer um fator que no circula no sangue, o Fator III (tromboplastina ou Fator tecidual). O Fator tecidual uma protena integral de membrana encontrada no tecido subendotelial e se torna exposta quando o vaso sangneo lesado. O Fator tecidual possui uma poro fosfolipdica que a fonte de fosfolpides necessrios para a ativao da via extrnsica. (FIGURA 19).

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FIGURA 19: Viso geral da Cascata da Coagulao

Via Extrnsica Na via extrnsica, o Fator VII ativado a Fator VIIa na presena de ons clcio e Fator tecidual (Fator III), que se torna exposto aps a injria vascular. Esta via mais rpida porque ela requer somente a participao do Fator VIIa, do Fator IV (Ca2+) e do Fator III (tromboplastina tecidual) para ativar o Fator X, no necessitando assim da ativao dos fatores XII, XI, IX e VIII:C. As FIGURAS 19 e 20 mostram que a via extrnseca fornece um meio para uma produo muito rpida de pequenas quantidades de trombina necessria formao de fibrina. Alm disso, a trombina gerada pela via extrnseca pode acelerar a via intrnsica pelo aumento da atividade dos fatores V e VIII:C. No laboratrio, o Tempo de Protrombina (TP) o teste usado para monitorar a via extrnsica.

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FIGURA 20: Via Extrnsica da cascata da coagulao

Via Intrnsica: O Fator XII ao entrar em contato com o colgeno subendotelial, fosfolpedes ou calicrena se torna ativado (FXIIa) para iniciar a formao do cogulo pela via intrseca. O Fator XIIa somente parcialmente ativado por esse contato. A precalicrena e o cininognio de alto peso molecular (HMWK) so adicionalmente necessrios para aumentar ou amplificar os fatores de contato envolvidos nesta via. (As FIGURAS 19 e 21).

FIGURA 21: Via Intrnsica da Cascata da Coagulao

Especificamente, o Fator XIIa na presena de HMWK converte a precalicrena em calicrena. A calicrena por feedback acelera a ativao do Fator XII em Fator XIIa, aumentando a atividade da via intrnsica.

33 A ativao do Fator XII atua como um link em muitos aspectos do sistema hemosttico, incluindo o sistema fibrinoltico, o sistema cininas e o sistema complemento, conforme esquematizado na FIGURA 22.

FIGURA 22: Interrelao entre a cascata da coagulao e os sistemas fibrinoltico, cininas e complemento.

A ativao por contato ocorre na ausncia de ons clcio (Ca2+) e tambm envolve a ativao do Fator XI em Fator XIa na presena de HMWK. Uma vez formado, o Fator XIIa na presena de HMWK ativa o Fator XI. Vale ressaltar que o Fator XIIa tambm capaz de ativar o Fator XI mesmo na ausncia de HMWK, porm a ativao ocorre de maneira muito lenta. O Fator XIa uma vez presente e na presena de Ca2+ ir ativar o Fator IX em Fator IXa. O Fator IXa formar um complexo com o Fator VIII:C, Ca 2+ e fosfolipdeos para ativar o Fator X. O Fator Xa formar a trombina necessria para a formao de fibrina. O complexo consistindo do Fator IXa-Fator VIII:C-fosfolpides-Ca2+ chamado de complexo tenase porque ele ativa o Fator X. A FIGURA 23 mostra um esquema do complexo macromolecular formado pelos fatores IXa, VIII:C, X, fosfolpedes e Ca2+ organizado sobre a superfcie da plaqueta ativada durante a coagulao sangnea fornece um ambiente protetor que

34 facilita a cascata da coagulao sem a interferncia dos anticoagulantes fisiolgicos normalmente presentes no plasma.

FIGURA 23: O complexo formado pela ativao seqencial da via intrnsica (Fatores IXa, VIII, Ca2+) ativa o Fator X. O cofator, Fator VIII:C liga aos fosfolpides (PF3) na superfcie da plaqueta e serve para orientar os Fatores IXa e X a aumentar a formao do Fator Xa. Os Fatores IX e X so ligados plaqueta via interaes com os ons Ca2+.

A FIGURA 24 ilustra de maneira esquemtica a molcula do Fator VIII. Nesta figura observa-se que o Fator VIII composto de vrios componentes. A principal poro desta protena o vWf, considerada ser a protena carreadora do Fator VIII. O vWf no ativo na cascata da coagulao. A subunidade protica menor o Fator VIII responsvel pela atividade coagulante ou procoaculante e por isso chamada de Fator VIII:C. O Fator VIII:C que atua funcionalmente na cascata da coagulao. A poro vWf do complexo carreia a poro procoagulante VIII:C. Assim, a poro vWf exibe um efeito estabilizador sobre o Fator VIII:C e o protege da atividade proteoltica existente no plasma. No laboratrio, o teste usado para avaliar a atividade da via intrnsica o Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (TTPa).

FIGURA 24: A molcula do Fator VIII (VIII/vWF) um polmero com mltiplas subunidades compostas de vWF (vWF:Ag) conectadas a uma pequena unidade coagulante conhecida como VIII:C.

35 Via Comum:

A via comum se inicia com a ativao do Fator X ou pela via extrnsica ou pela via intrnsica ou por ambas as vias (FIGURAS 19 e 25). O Fator Xa, na presena do Fator V, de Ca2+ e de fosfolpides (PF3) converte a protrombina em trombina. A trombina uma vez formada ir desempenhar as seguintes atividades: ativao por feedback dos fatores V e VIII; formao dos monmeros solveis de fibrina a partir do fibrinognio; ativao do Fator XIII, que por sua vez ir estabilizar a rede de fibrina, e induo da agregao plaquetria. A via comum contm os fatores V, X, II e I, esses fatores podem ser monitorados tanto pelo Tempo de Protrombina (TP) como pelo Tempo de Tromboplastina Parcial ativado (TTPa). Pela via extrnsica o Fator VIIa na presena da tromboplastina tecidual e Ca2+ ativar o Fator X e pela via intrsica, o complexo tenase (Fator IXa, na presena do Fator VIII:C, fosfolpides e Ca2+) tambm ativar o Fator X.

FIGURA 25: Via comum da cascata da coagulao

O Fator Xa em conjunto com o Fator V, na presena de Ca2+ e fosfolpedes (PF3) converter o Fator II (protrombina) em Fator IIa (trombina). A FIGURA 26 mostra a associao dos fatores Xa, Va, Ca2+ e PF3 (fosfolpides da membrana da plaqueta). Esta associao tambm chamada de complexo protrombinase porque ele enzimaticamente converte o substrato protrombina em trombina, enzima ativa na formao dos monmeros de fibrina a partir do fibrinognio.

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FIGURA 26: O complexo protrombinase (Fatores X, Va, Ca2+ e PF3) ativa a formao de trombina a partir da protrombina. O Fator V liga aos fosfolpides (PF3) na superfcie da plaqueta e serve para orientar os Fatores Xa e a protrombina a aumentar a formao do Fator Xa. Os Fatores Xa e protrombina so ligados plaqueta via interaes com os ons Ca2+.

A trombina atua sobre o fibrinognio para formar os monmeros de fibrina. A trombina cliva uma ligao peptdica de cada cadeia alfa e de cada cadeia beta para formar os fibrinopeptdeos A e B. Aps essa clivagem o produto resultante da remoo dos fibrinopepteos A e B chamado de monmero de fibrina. No entanto, o cogulo insolvel de fibrina formado em trs etapas distintas: 1- clivagem hidroltica das ligaes arginina-glicina pela trombina liberando os fibrinopeptdeos A e B das cadeias alfa e beta, com a formao dos monmeros de fibrina. 2- formao espontnea de um polmero instvel de fibrina a partir dos monmeros de fibrina. 3- estabilizao do polmero de fibrina pelo Fator XIIIa. Com a clivagem do fibrinognio pela trombina, as cargas negativas presentes em volta do domnio E, responsveis pela repulso eletrosttica entre as molculas de fibrinognio, so eliminadas. Como resultado, a carga lquida do domnio central muda de oito cargas negativas para cinco cargas positivas. Os domnios D, entretanto, retm as suas cargas lquidas negativas. As mudanas nas foras eletrostticas desempenham uma funo muito importante na polimerizao dos monmeros de fibrina. Os domnios D carregados negativamente de um monmero espontaneamente se associam com o domnio E carregado positivamente de um outro monmero para formar um polmero de fibrina (FIGURA 27).

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FIGURA 27: A trombina cliva os peptdeos A e B do domnio E do fibrinognio para formar os monmeros de fibrina. A clivagem proporciona uma troca das cargas negativas por cargas positivas no domnio E. Isso permite o crescimento espontneo dos polmeros de fibrina a medida que as cargas positivas do domnio E se interagem com as cargas negativas dos domnios D de outros monmeros de fibrina. O polmero inicialmente formado por pontes de hidrognio e por interaes inicas.

A reao final da formao do polmero de fibrina a estabilizao do polmero de fibrina pelo Fator XIIIa. O Fator XIII ativado pela trombina. O Fator XIIIa uma transamidase dependente de clcio que responsvel pela catlise da formao de ligaes covalentes entre os resduos de glutamina e lisina presentes no polmero de fibrina. Essas ligaes covalentes produzem uma rede de fibrina de maior fora mecnica e de maior resistncia digesto proteoltica pela plasmina.

Amplificao da Cascata: A diviso da cascata da coagulao em via extrnsica e intrnsica est sendo abandonada, porque a teoria da cascata foi modificada. A literatura descreve que o Fator VIIa da via extrnsica pode diretamente ativar o Fator IX da via intrnsica. Alm disso, o Fator VII pode ser ativado

38 pelos fatores XIIa, IXa, Xa, e pela trombina. De acordo com essa teoria, o Fator VII pode ser a protena chave para iniciar a coagulao sangnea (FIGURA 19).

CONTROLE FISIOLGICO DA COAGULAO O processo dinmico de gerao de fibrina pelos fatores ativados da coagulao normalmente limitado ao local da injria vascular. Mesmo com uma intensa estimulao da coagulao sangnea, tal como ocorre em trauma massivo, a circulao permanece fluda nos vasos no envolvidos. Os mecanismos fisiolgicos que so responsveis pelo controle da coagulao so: a) Fluxo sangneo b) Remoo dos fatores ativados pelo fgado c) Inibio por feedback d) Inibidores bioqumicos (anticoagulantes fisiolgicos) e) Sistema Fibrinoltico Fluxo Sangneo: Um cogulo no se forma se no houver vasocronstrio e ativao dos fatores da cascata da coagulao. Inicialmente, a formao do cogulo aumentada pela vasoconstrio que temporariamente diminui o fluxo sangneo no local da rea injuriada. A vasoconstrio serve para forar as plaquetas e os fatores da coagulao entrar em contato com a superfcie subendotelial que se tornou exposta aps a leso vascular. Essa ativao promove a ativao da hemostasia primria e secundria. O retorno do fluxo sangneo ao normal, aps a formao da rede de fibrina, na regio da injria vascular importante para limitar a coagulao por meio de uma diluio contnua dos fatores ativados, presentes no local, e retirando-os para serem metabolizados. Remoo dos Fatores Ativados pelo Fgado: Como o sangue trs os fatores ativados da cascata da coagulao para o fgado, eles so seletivamente removidos pelos hepatcitos. A plasmina do sistema fibrinoltico (sistema que ser discutido adiante) e os produtos de degradao da fibrina tambm so removidos pelo fgado. Inibio por Feedback: Alguns fatores ativados da cascata da coagulao tm potencial para destruir outros fatores existentes na cascata. A trombina tem habilidade para temporariamente ativar os fatores V e VIII,

39 mas quando a concentrao da trombina se torna muito alta, esses fatores so enzimaticamente destrudos por ela. O Fator Xa primeiro aumenta a atividade do Fator VII e ento, por meio de uma reao com o inibidor do Fator tecidual, inibe a ativao de mais Fator X pelo complexo Fator VIIa/Fator Tecidual. A coagulao tambm controlada indiretamente pelo seu produto final, a fibrina. A fibrina tem uma afinidade muito forte pela trombina. Uma vez adsorvida ao complexo de fibrina, a trombina liberada muito lentamente, limitando a quantidade de trombina disponvel para a formao de mais fibrina. Em adio, os produtos da degradao do polmero de fibrina pela plasmina atuam inibindo a formao de mais fibrina a partir do fibrinognio e da polimerizao dos monmeros de fibrina.

Inibidores Bioqumicos: Os inibidores bioqumicos so protenas solveis no plasma que regulam as reaes enzimticas das serino-proteases por inibir a ativao e a amplificao da cascata da coagulao. Estes inibidores incluem: a anti-trombina III, o cofator II da Heparina, o inibidor da via do Fator Tecidual, a protena C e S, a 2-macroglobulina e a 1-anti-tripsina (FIGURA 28) Caractersticas dos Inibidores: Anti-trombina III (ATIII): uma Glicoprotena de massa molecular de 56kDa, produzida pelo fgado, pelas clulas endoteliais e possivelmente pelos megacaricitos. o inibidor mais importante da coagulao. Sua funo inibir todas as serino-proteases presentes na cascata da coagulao, ou seja, os fatores XIIa, XIa, IXa, Xa e IIa, como tambm a plasmina e a calicrena. A molcula de ATIII forma um complexo estequiomtrico de 1:1 com a TROMBINA. A HEPARINA, uma glicosaminaglicana, ao se ligar na ATIII promove uma mudana conformacional na molcula deste inibidor e essa mudana conformacional proporciona um aumento de cerca de 1000x na velocidade de formao do complexo ATIII-TROMBINA.

Cofator II da Heparina: uma glicoprotena de 65kDa e inibe somente a trombina. Devido ao fato da afinidade da heparina pelo Cofator II da heparina ser menor do que para a ATIII, uma alta concentrao de heparina necessria para aumentar a inibio da trombina por esse cofator.

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FIGURA 28: Interrelaes entre as clulas endoteliais, protena C, protena S, antitrombina III e o esquema da cascata da coagulao para a regulao da formao do trombo.

Inibidor da via do Fator Tecidual (TFPI): produzido no fgado, pulmes e clulas endoteliais. Este inibidor possui 3 domnios, sendo dois com capacidade inibitria: um domnio inibe o complexo Fator VIIa/TF, o outro Inibe diretamente o Fator Xa e o terceiro no apresenta funo conhecida.

Protena C e S: A Protena C um anticoagulante dependente de vitamina K. Em 1976 ela foi isolada e suas propriedades fsico-qumicas descritas. A ativao da protena C requer a presena de ons Ca+2 e trombomodulina, uma glicoprotena integral presente na membrana das clulas endoteliais (FIGURA 28). A trombomodulina aumenta a ativao da Protena C pela trombina. A trombomodulina tem uma alta afinidade pela trombina e forma um complexo de 1:1. Quando ligada trombomodulina a trombina no pode clivar o fibrinognio para formar fibrina, mas se torna um potente iniciador da anticoagulao por ativar a Protena C. A Protena C ativada rapidamente destri os fatores Va e VIIIa, providenciando um mecanismo de regulao para a

41 formao de fibrina. A Protena C ativada tambm contribui para a fibrinlise porque ela enzimaticamente inativa o Inibidor da Ativao do Plasminognio-tipo 1 (PAI-1). A atividade da Protena C ativada potencializada pela Protena S. A Protena S tambm dependente de Vitamina K para a sua sntese de maneira funcional. Somente 40% da Protena S no ligada esto ativa na hemostasia. O restante (60%) est ligado ao C4b do complemento. A Protena S por ter uma alta afinidade para os fosfolpides de membrana, promove a ligao da Protena C aos fosfolpides existentes na membrana das plaquetas e das clulas endoteliais. Com isso h uma acelerao da inativao dos fatores Va e VIIIa, que tambm esto adsorvidos na superfcie das plaquetas. A protena S pode star diminuda nas mulheres que esto em uso de contraceptivo oral. A deficincia das Protenas C e S podem estar associada com trombose. 2-Macroglobulina: - uma glicoprotena com a funo de inibir a trombina, plasmina e calicrena. A ligao da 2-macroglobulina com a trombina lenta e resulta numa clivagem proteoltica da 2macroglobulina seguida por uma reduo na atividade da trombina. A trombina ligada 2macroglobulina continua lentamente a formar fibrina a partir do fibrinognio. Isso sugere que a 2-macroglobulina pode funcionar primariamente como um mecanismo de clearance das serino-proteases, uma vez que os complexos serino-protease/2-macroglobulina so rapidamente retirados do plasma.

SISTEMA FIBRINOLTICO

O sistema fibrinoltico ativado em resposta ativao da cascata de coagulao, principalmente em resposta ativao dos fatores de contato. A ativao do sistema fibrinoltico produz uma enzima proteoltica, chamada plasmina, que capaz de digerir, por protelise a fibrina e o fibrinognio. Conforme a FIGURA 29, os principais componentes do sistema fibrinoltico so: plasminognio, ativadores do plasminognio, plasmina, fibrina, produtos de degradao da fibrina (FDP) e os inibidores da ativao do plasminognio.

Plasminognio: O plasminognio uma -globulina que possui uma massa molecular de aproximadamente 80.000 Daltons e que circula no sangue sob a forma de um zimognio. O plasminognio

42 sintetizado no fgado e grandes quantidades so adsorvidas no polmero de fibrina durante a formao do cogulo.

PLASMINOGNIO
Inibidores PAI-1 Ativadores t-PA (Extrnsico)

PAI-2 PAI-3
PCa

Streptokinase Intrnsico

PLASMINA
2-Antiplasmina 2-Macroglobulina

FIBRINA

FDP

FIGURA 29: O sistema fibrinoltico pode ser ativado pelo ativador do plasminognio tecidual (tAP), derivado das clulas endoteliais ou pelos ativadores intrnsicos e calicrena. A estreptoquinase, um ativador exgeno, pode tambm ativar o sistema. A plasmina, o produto final da ativao, controla a coagulao pela digesto do polmero de fibrina e pela inativao dos Fatores V, VIII e XII. Os inibidores da ativao do plasminognio (PAI-1 e PAI-2) e os inibidores da plasmina (2antiplasmina e 2-macroglobulina) servem para controlar o sistema fibrinoltico. A protena C ativada (PCa) inibe o PAI-1 e pode aumentar a liberao do tPA, aumentando assim a fibrinlise

A plasmina uma enzima com especificidade tripsina-like e formada a partir do plasminognio por uma srie de ativadores que enzimaticamente hidrolisam este zimognio. A plasmina pode hidrolisar os fatores V e VIII, como tambm a fibrina e o fibrinognio. Se a plasmina ficar livre no plasma ela pode causar uma degradao proteoltica de muitos fatores da coagulao, como tambm degradar componentes do sistema das cininas e do sistema complemento. Esse processo proteoltico extremamente perigoso controlado pela rpida formao do complexo plasmina/2-antiplasmina quando a plasmina se encontra livre na circulao. Os ativadores do plasminognio podem ser encontrados no sangue (ativadores intrnsecos) e em muitos tecidos (extrnsicos). Alm disso, algumas substncias que normalmente no esto

43 presentes no sangue durante a coagulao e fibrinlise (ativadores exgenos) podem ganhar acesso circulao em estados patolgicos e ativar a formao de fibrina.

Ativadores Intrnsicos: Estes ativadores esto presentes no sangue. Eles esto envolvidos com a fase de contato da via intrnsica. O Fator XIIa interage com o pro-ativador do plasminognio. Essa interao promove a converso do pro-ativador em ativador do plasminognio que subseqentemente cliva o plasminognio para formar a plasmina.

Ativadores Extrnsicos: O ativador do plasminognio tecidual (t-PA) produzido pelas clulas do endotlio vascular. O ativador do plasminognio tecidual, uma serino-protease, o ativador mais rpido do plasminognio, at mesmo do que os ativadores intrnsicos. Ele tem uma forte afinidade pela fibrina, com a qual ele forma um complexo t-PA/fibrina do tipo bimolecular. Na presena da fibrina a eficincia cataltica do t-PA para a ativao do plasminognio aumentada cerca de 1000 vezes. Por outro lado, o t-PA no ligado na fibrina tem uma afinidade muito baixa pelo plasminognio e, assim, ele no eficiente na ativao da formao de fibrina a partir do plasminognio. O fator Xa e a trombina, como tambm a bradicinina e a protena Ca podem aumentar a liberao do t-PA pelo endotlio vascular. O aumento dos nveis de t-PA pode causar uma excessiva fibrinlise e pode estar associada com uma tendncia a sangramento. Teoricamente, diante de uma extensiva injria, o t-PA liberado na circulao onde ele pode causar uma fibrinogenlise sistmica. Esse tipo de injria, entretanto, est sempre associada com a coagulao intravascular disseminada (CID) devido rpida ativao da via extrnsica pela simultnea exposio da tromboplastina. A plasmina formada sobre o cogulo de fibrina lentamente inativada pela 2antiplasmina porque a plasmina ligada fibrina tem o seu stio de ligao e o seu stio cataltico ocupados pela interao com a fibrina. A plasmina livre na circulao rapidamente inativada pela 2-antiplasmina porque ela tem o seu stio cataltico disponvel. Assim, o processo fibrinoltico parece ser desengatilhado e limitado pela fibrina. Um outro ativador extrnsico do plasminognio o ativador do plasminognio tipo uroquinase (u-PA). Este ativador est presente na urina, plasma e em muitos tipos celulares. Este tipo de ativador potencializa a ativao de formao da plasmina a partir do plasminognio ligado

44 a fibrina por cerca de 10 vezes. Quando o plasminognio se encontra livre no plasma a ativao da formao de plasmina por este ativador mais lenta.

Ativador Exgeno: A estreptoquinase uma enzima produzida pelo estreptococos -hemoltico que tambm ativa o plasminognio, por isso ela usada primariamente como um agente teraputico para a dissoluo de cogulos.

Inibidores da Ativao do Plasminognio: Os Inibidores da Ativao do Plasminognio tipo 1 (PAI-1) e tipo 2 (PAI-2) so inibidores rpidos e especficos dos ativadores extrnsicos do plasminognio. A lipoprotena A, Lp(a), tem demonstrado inibir o t-PA e o u-PA. A Lp(a) tambm compete com a plasmina para ligar fibrina. Isso desloca a plasmina para o plasma onde ela rapidamente inibida pela 2-antiplasmina. A Lp(a) tambm bloqueia a inibio do t-PA pelo PAI-1 na presena do fibrinognio e da heparina. Assim o efeito da Lp(a) sobre a fibrinlise ir depender da concentrao do PAI-1, do t-PA e da Lp(a).

Digesto da Fibrina: A plasmina responsvel por uma degradao assimtrica e progressiva da rede de fibrina ou do fibrinognio, formando fragmentos distintos de protena, feridos como produtos de degradao da fibrina ou do fibrinognio (FDP). Esses fragmentos so rapidamente retirados da circulao pelo fgado. A deteco dos fragmentos no plasma, acima dos valores de normalidade, de grande importncia na clnica para auxiliar no diagnstico de algumas desordens hemostticas. Os produtos de digesto do fibrinognio pela plasmina so: os fragmentos X, Y, D e E. O primeiro fragmento formado o fragmento X mais os pequenos peptdeos. Na prxima reao proteoltica a plasmina cliva o fragmento X formando ento os fragmentos Y e D. Posteriormente o fragmento Y digerido enzimaticamente pela plasmina dando origem aos fragmentos D e E. A degradao dos monmeros de fibrina e do polmero instvel de fibrina (polmero formado sem a atividade do Fator XIIIa) pela plasmina idntica do fibrinognio. A degradao do polmero de fibrina estabilizado pelo Fator XIIIa mais lenta e os produtos so estruturalmente diferentes por causa das ligaes intermoleculares induzidas pelo Fator XIIIa. Os stios de degradao do polmero de fibrina pela plasmina so os mesmos vistos na molcula de fibrinognio, porm

45 devido a presena das ligaes intermoleculares existentes no polmero de fibrina, os stios podem no ficar disponveis para a atividade enzimtica exercida pela plasmina. por este motivo que os produtos de degradao do polmero estvel de fibrina completamente diferentes dos produtos de degradao do fibrinognio. A FIGURA 30 mostra que os produtos de degradao do polmero de fibrina so combinaes de X, Y, D e E, por exemplo: DD/E, YD/DY, YY/DXD.

FIGURA 30: Degradao da fibrina pela plasmina. A letra P indica os locais de clivagem pela plasmina no polmero de fibrina e nos fragmentos maiores que vo sendo formados durante o processo.

46 Os fragmentos de fibrina, quando em altas concentraes no plasma, podem exercer um efeito anticoagulante sobre o sistema de formao do cogulo. O fragmento X pode ainda reagir lentamente com a trombina. Essa lenta reao com o fragmento X resulta numa menor disponibilidade da trombina para reagir com o fibrinognio. Os fragmentos Y e D inibem a polimerizao dos monmeros de fibrina, e o fragmento E inibe a trombina.

CONTROLE FISIOLGICO DA FIBRINLISE Da mesma forma que a cascata da coagulao inibida por inibidores bioqumicos, a o sistema fibrinoltico tambm sofre inibio. A plasmina e o t-PA so serino-proteases cuja ao deve ser limitada ao local da injria vascular. Os principais inibidores dessas enzimas so: a 2antiplasmina, a 2-macroglobulina, o PAI-1 e o PAI-2. 2-antiplasmina: A 2-antiplasmina uma glicoproteina monomrica, sintetizada no fgado e forma um complexo de 1:1 com a plasmina ou com o plasminognio. A formao do complexo plasmina/plasminognio bloqueia a adsoro do plasminognio na rede de fibrina. A atividade da plasmina livre tambm inibida. A inibio da plasmina ligada rede de fibrina pela 2antiplasmina muito lenta, pois os stios de inibio esto ocupados. 2-macroglobulina: 2-macroglobulina um inibidor menos eficiente da plasmina do que a 2-antiplasmina. 2-macroglobulina, ir inibir a plasmina somente quando ela encontrar em excesso e livre no plasma.

PAI-1 e PAI-2: O PAI-1 o inibidor priumrio do t-PA e do U-PA presente no plasma. Ele tambm ativa a protena C. O PAI-1 no plasma o mais ativo. O PAI-1 liberado pelos grnulos alfa das plaquetas durante a ativao plaquetria. O PAI-2 inibe o t-PA com menor eficincia do que o PAI-1. Uma sntese ou uma liberao deficiente do t-PA ou nveis muito aumentados de PAI-1 compromete a fibrinlise e est associado com trombose.

47 INTERRELAO ENTRE O SISTEMA HEMOSTTICO E OS SISTEMAS CININAS E COMPLEMENTO A FIGURA 31 mostra que os mecanismos hemostticos, o sistema complemento e o sistema das cininas se interrelacionam para bloquear o extravasamento de grandes quantidades de sangue pela rea injuriada do vaso sangneo e para impedir a invaso do organismo por patgenos ou outro antgeno qualquer.

FIGURA 31: Interrelao entre a cascata da coagulao e os sistemas fibrinoltico, cininas e complemento

Sistema Cininas: O sistema cininas, importante na inflamao, permeabilidade vascular e quimiotaxia, ativado pela cascata da coagulao e pelo sistema fibrinoltico. Nesses sistemas a precalicrena ativada a calicrena pelo Fator XIIa e pela plasmina. O sistema cinina est tambm envolvido na fase de ativao por contato da via intrnsica da cascata da coagulao. A ativao do Fator XII em Fator XIIa no ocorre de modo efetivo sem a presena de calicrena e de HMWK. A calicrena amplifica a ativao do fator XII e o HMWK um fator essencial na ativao do Fator XI em Fator XIa. O HMWK necessrio para a cascata da coagulao e para a fibrinlise. A calicrena uma enzima que atua sobre os cininognios de alto peso molecular e de baixo peso molecular para formar as cininas. As cininas geradas podem incluir a calidina e a bradicinina. A bradicinina tem a funo de: aumentar a permeabilidade vascular; contrair o

48 msculo liso; dilatar os vasos de baixo calibre; induzir a inflamao e a dor, e liberar as prostaglandinas dos tecidos.

Sistema Complemento: O sistema complemento composto de aproximadamente 22 protenas sricas que, trabalhando juntas com os anticorpos e fatores da coagulao, desempenham uma importante funo nas reaes imunes e alrgicas. A plasmina ativa o sistema complemento pela clivagem do C3 em C3a e C3b. O C3a uma anaflotoxina que causa um aumento da permeabilidade vascular via degranulao dos mastcitos para a liberao de histamina.

DESORDENS DA HEMOSTASIA

Desordens hereditrias da Funo das Plaquetas: As desordens plaquetrias funcionais esto relacionadas participao da plaqueta na formao do trombo hemosttico, tanto na hemostasia primria como na secundria (Quadro 1). A Doena de von Willebrand (vWD) foi includa porque, apesar de ser um distrbio plasmtico, altera a funo plaquetria. Entretanto, o comentrio sobre ela ser feito em Distrbios Hereditrios da Coagulao. Tambm a afibrinogenemia congnita, apesar de pertencer aos distrbios plasmticos hereditrios, foi citada nesse grupo por ser responsvel pela alterao da agregao plaquetria. Quadro 1: Desordens funcionais das plaquetas
Defeitos de Transduo de Sinais: Anormalidade da Agregao Plaquetria: - Afibrinogenemia congnita - Anormalidade da via do cido araquidnico (AA): - Trombastenia de Glanzmann (anormalidade da Gp Diminuio da liberao do AA IIb/IIIa) Deficincia da ciclo-oxigenase Deficincia de Substncias do Pool de Armazenamento: - Defeitos na interao plaqueta-agonistas: - Deficincia dos corpos densos: Defeitos dos receptores: TXA2, colgeno, Sndrome de Hermansky-Pudlak ADP, epinefrina Sndrome de Chediak-Higashi - Defeitos na ativao da protena G: Trombocitopenia com ausncia de rdio Deficincia de G (alfa)q - Deficincia dos grnulos alfa: Sndrome da plaqueta cinza - Defeitos no metabolismo de fosfoinositol: Anormalidades Relacionadas a Adesividade da Plaqueta: Deficincia de PLC-2 - Doena de von Willebrand - Defeitos na mobilizao de clcio - Pseudo von Willebrand (tipo plaquetrio semelhante - Defeitos na fosforilao de protena vWD) - Defeitos na regulao do cito-esqueleto: - Sndrome de Bernard-Soulier (anomalia ou ausncia Sndrome de Wiskott-Aldrich da GpIb)

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Esse grupo de distrbios tem como manifestao clnica hemorragias de diversas intensidades, freqentemente mucocutneas, aps cirurgias e traumas. As desordens plaquetrias congnitas no podem ser distinguidas com bases, apenas, nas manifestaes clnicas. O estudo laboratorial destaque de importncia diagnstica. Entretanto, para chegar ao esclarecimento de muitos distrbios nesse grupo, so imprescindveis exames sofisticados, por meio de instrumentos ou de exames bioqumicos que, somente, so efetuados em laboratrios de coagulao altamente especializados. O tempo de sangramento (TS) aumentado freqentemente visto nesses distrbios, e no exame do esfregao de sangue observam-se freqentemente plaquetas gigantes. O estudo da agregao plaquetria, por meio do agregmetro, com o uso de diversos agonistas (ADP, colgeno, epinefrina e ristocetina) importante para o diagnstico desse grupo de distrbios. Para compreender melhor os distrbios relacionados transduo de sinal, a FIGURA 32 mostra um desenho, esquemtico, das principais reaes desencadeadas pelos indutores fisiolgicos da agregao plaquetria.

FIGURA 32: desenho esquemtico das reaes plaquetrias que ocorrem aps o estmulo dos indutores de agregao. CO = ciclo-oxigenase, PKC = proteinaquinase, G = protenas G, MLC = cadeia leve da miosina, MLCK = MLCquinase, R = receptor, DAG = diacilglicerol, TK = tirosinoquinase, TS = tromboxane-sintetase, PAF = fator ativador de plaqueta, IP3 = trifosfato de inositol, PLA2 = fosfolipase A2, PIP2 = bifosfato de fosfatidil-inositol.

O desenho da FIGURA 32 destaca, apenas, as reaes que representam a transduo dos sinais que chegam membrana plaquetria, e que so responsveis pela induo da secreo de diversas substncias plaquetrias.

50 Como em outras clulas, a ativao plaquetria e a secreo, so reguladas pelas alteraes dos nveis de ATP, do influxo de clcio, da hidrlise dos fosfolipdios da membrana da plaqueta e da fosforilao de diversas protenas intracelulares. Como mostra a FIGURA 32, essas reaes tm incio quando o efetor se liga a um receptor especfico que, por sua vez, interage com a protena G. As protenas G constituem um grupo heterogneo de protenas, integrais de membrana, que tm a propriedade de promover a ligao dos receptores com as enzimas efetoras intracelulares. A partir da interao, especfica, do agonista com o seu receptor e a protena G, inicia-se a hidrlise do fosfolipdio da membrana plaquetria, o fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2). Com isso so gerados diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP3). O IP3 ativa o movimento de clcio no citosol plaquetrio que, por sua vez, estimula a fosfolipase A2 (PLA2). A fosfolipase A2 ativa a produo de tromboxane A2, que por sua vez promove a fosforilao da cadeia leve da miosina. A miosina, ao interagir com a actina, promove, por contrao, a compresso dos constituintes do citosol plaquetrio, inclusive dos corpos densos e dos grnulos alfa, e com isso leva secreo dos diversos tipos de substncias. A actina e a miosina tambm promovem a mudana da forma das plaquetas. A DAG ativa a protena-quinase C (PKC) que leva a fosforilao de diversos substratos, inclusive da P 47, que contribuem para a secreo plaquetria. A seguir sero apresentadas as caractersticas mais importantes para esclarecer o diagnstico dos distrbios funcionais das plaquetas.

Pseudo vW (P-vW): muito semelhante ao tipo 2B da vWD. Pode apresentar aumento do TS (tempo de sangria), do Fator VIII:C, do vWF(ag) e do vW:RCoF. A agregao plaquetria est aumentada com baixas concentraes de ristocetina (0.3-0.5mg/ml). Pode haver discreta trombocitopenia. Ao contrrio do tipo vWD 2B onde o defeito est no vWF, aqui h um defeito qualitativo no receptor plaquetrio GpIb-IX para o vWF. Esse defeito torna o referido receptor mais vido para os grandes multmeros do vWF. Como conseqncia dessa avidez, os grandes multmeros so consumidos, deixando disponvel, no plasma, somente o vWF de baixo peso molecular .

Sndrome de Bernard-Soulier (SB-S): Freqentemente autossmica recessiva e associada consanginidade. Pacientes heterozigotos apresentam 50% da quantidade normal do receptor plaquetrio GpIb-IX. H um discreto ou at mesmo ausncia de sangramento. Casos de SB-S homozigotos so rarssimos. O

51 tempo de sangramento pode estar aumentado e no esfregao de sangue so vistas plaquetas gigantes. Pode haver trombocitopenia. A anormalidade mais caracterstica est no teste de agregao plaquetria que normal para os diversos agonistas fisiolgicos (ADP, epinefrina, colgeno), mas alterado para a ristocetina. A diferena entre a vWD que a adio de plasma normal no corrige o defeito da agregao na SB-S, ao contrrio da resposta na vWD. Testes bioqumicos, tais como: eletroforese em SDS-agarose, auto-radiografia, "imunoblotting" de lisado plaquetrio com anticorpo anti-GpIb-IX, confirmam o diagnstico da deficincia da referida glicoprotena.

Afibrinogenemia congnita: Nesse distrbio, devido falta de fibrinognio para fazer a ligao entre duas plaquetas por meio de ligaes entre as GpIIb-IIIa, a curva de agregao plaquetria ter a mesma caracterstica observada na Trombastenia de Glanzmann que ser comentada a seguir.

Trombastenia de Glanzmann: A Trombastenia de Glanzmann uma doena autossmica recessiva que decorre de um distrbio funcional da GpIIb-IIIa. Esse distrbio deriva da mutao nos genes que codificam as GpIIb e IIIa, com as conseqentes alteraes quantitativa e qualitativa das referidas glicoprotenas. Manifesta-se clinicamente por sangramento muco-cutneo, particularmente epistaxe, prpura e menorragia. A alterao laboratorial, mais caracterstica, a intensa reduo ou a ausncia da agregao plaquetria, com o emprego do agregmetro, aos diversos agonistas fisiolgicos. A curva caracterstica a do tipo C mostrada na FIGURA 33 do tpico: Testes Laboratoriais. Deficincia de Substncias do Pool de Armazenamento: Em alguns distrbios desse grupo o defeito est relacionado diminuio de substncias armazenadas nos corpos densos e nos grnulos alfa (citados no Quadro 1). Na curva de agregao plaquetria, a segunda parte da curva est ausente (curva B da FIGURA 33 do tpico: Testes Laboratoriais), a qual corresponde agregao das plaquetas estimulada pelas substncias liberadas durante a ativao plaquetria. Os distrbios congnitos desse grupo foram mencionados no Quadro 1.

52 Defeitos dos Sinais de Transduo: Ao contrrio do grupo anterior, nesse grupo, a deficincia de substncias do Pool de armazenamento, decorre de um distrbio localizado no mecanismo que desencadeado quando o receptor da membrana plaquetria ativado pelo agonista. O distrbio pode acontecer em diversos setores desse mecanismo, desde o momento da interao com o receptor at a produo dos efetores responsveis pela liberao das substncias do Pool de armazenamento, bem como das substncias formadas por diversas reaes (ver FIGURA 32). O teste de agregao plaquetria mostrar ausncia da segunda curva (estmulo endgeno), o mesmo defeito verificado no grupo anterior. importante assinalar que o cido acetil saliclico tambm interfere na produo dessa segunda curva da agregao plaquetria, ao inibir a ciclo-oxigenase e diminuir a produo do tromboxane A2.

Desordem da Interao de Fatores da Coagulao com a Membrana Plaquetria: A sndrome de Scott uma desordem hemorrgica rara na qual, as plaquetas e outras clulas sangneas falham em promover a unio de fatores plasmticos (Va e Xa) com a membrana celular. O aumento da quantidade da fosfatidilserina, carregada negativamente, na superfcie externa da membrana plaquetria essencial para a formao da superfcie coagulante. Sabe-se que o defeito, na sndrome de Scott, decorre da incapacidade em mobilizar a fosfatidilserina da camada interna da membrana celular para a camada externa, em resposta elevao do Ca2+ na superfcie interna da membrana (Zhou).

TESTES LABORATORIAIS
Como em qualquer setor da medicina, aqui tambm imprescindvel lanar mo dos trs meios de coleta de dados para chegar a um diagnstico: histria da doena atual (HDA) com a histria pregressa pertinente (HP), histria familiar (HF) e exames complementares. importante ressaltar que, apesar da importncia dos dados coletados na HDA e na HF, nos distrbios hemorrgicos, os testes laboratoriais dirigidos para os componentes hemostticos, so prioritrios. A razo para isso est em que, na maioria das vezes, somente com eles possvel chegar ao diagnstico conclusivo, e eles sero importantes para o acompanhamento do paciente quando houver distrbio hemorrgico. Por estas razes, o raciocnio ser feito com base nos exames para o estudo da hemostasia e nos dados obtidos pela HDA e pela HF para nortear as investigaes. Esse tpico ser dividido em dois itens:

53 1 - Exames de rotina: o nmero mnimo necessrio de testes para descobrir anormalidade no mecanismo hemosttico, acompanhados da anamnese dirigida para distrbios hemorrgicos. 2 - Exames empregados para esclarecimento do defeito hemosttico. Os exames mais especficos para caracterizar as doenas e as sndromes hemorrgicas mais freqentes e mais raras sero citados quando estas forem abordadas.

1 - Exames de Rotina: Como pode ser visto, a FIGURA 33, considera como exames de rotina, o tempo de protrombina (TP), o tempo de cefalina, tambm conhecido como tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPa), o tempo de sangramento (TS) e a contagem de plaquetas.

FIGURA 33: Na rea azul constam os fatores cujo defeito identificado pelo tempo de tromboplastina parcial ativado. Na rea amarela esto os fatores cujo defeito identificado pelo tempo de protrombina. Observar que os fatores X, V, II e I (fibrinognio) quando alterados, prolongam os dois testes. HMWK = Cininognio de alto peso molecular. PK = Pr-calicreina. TF = Fator tecidual. Pq = Plaqueta. O FXIII est fora do alcance desses testes. Detalhes no texto.

Na FIGURA 33, os fatores que fazem parte da rea amarela, quando tm o nvel reduzido ou algum impedimento para o seu funcionamento (anticoagulante ou defeito na estrutura molecular), alteram o TP. J os defeitos dos fatores da rea azul alteram o TTPa. No entanto, quando os fatores X, V, II e fibrinognio, ou seja, os fatores que fazem parte das reas azul e amarela, apresentam defeitos, ou seus nveis esto diminudos no sangue, o TP e o TTPa estaro alterados. O FXIII no atingido pelos dois exames citados; ser, posteriormente, abordado comentrios sobre a identificao de sua alterao. Visto isso, importante considerar algumas excees:

54 I - Para cada fator da coagulao, a diminuio do nvel somente altera o exame correspondente, a partir de um determinado limite. Como pode ser visto na literatura, nveis de 15-18% de FVIII:C no alteraram o TTPa do hemoflico estudado. Tambm foi normal o TTPa de um hemoflico com FIX de 23%. Nesses casos, dados obtidos na coleta das HP e HF puderam despertar a suspeita de algum distrbio no paciente. II - Como pode ser visto na FIGURA 33, a diminuio do nvel de FXIII no leva alterao desses dois exames. Nesse caso, suspeitaremos de defeito desse fator quando houver hemorragia no momento ou nas HP e HF, particularmente quando os pais apresentarem consanginidade. III - Alm do TTPa no se alterar com a variao do nvel do FXIII, tambm no se altera com a diminuio do nvel do FVII. IV - O inverso acontece com os fatores XII, HMWK e PK. A diminuio sangnea do nvel desses fatores altera o TTPa, porm, no h qualquer possibilidade de sangramento, espontneo ou induzido por cirurgia. V - O nvel baixo de fibrinognio nem sempre altera o TP e o TTPa, entretanto, o tempo de trombina (TT) e a dosagem do fator podem chamar a ateno para o distrbio. Entretanto, importante lembrar que o TT ainda normal at o fibrinognio atingir o nvel mnimo de 1000 mg/L. Alm dos exames citados, para completar os exames de rotina, o tempo de sangramento (TS) e a contagem de plaquetas (CPq) tambm devem ser includos. O TS de maior sensibilidade aquele em que se faz uma inciso no antebrao com tamanho e profundidade uniformizados por um molde, ou por meio de um dispositivo que dispara uma lmina. Em ambos os casos, as incises so feitas com um manguito mantendo a presso em 40 mm de Hg. Dependendo do mtodo, o normal mximo vai de 7 a 10 minutos. O TS alterado serve para indicar diminuio numrica das plaquetas ou alterao funcional. Tambm aqui, temos que ter em mente que nveis de plaquetas at 50.000/L podem apresentar TS normal. O dismorfismo plaquetrio no esfregao sangneo, pode oferecer indicio de distrbio funcional plaquetrio.

Observaes sobre os Exames de Rotina: A avaliao da hemostasia in vitro realizada atravs de testes que exploram seletivamente as diferentes vias da coagulao, a saber, o Tempo de Protrombina ou TP, Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada ou TTPa, Tempo de Trombina ou TT e as dosagens dos

55 fatores isolados como o Fibrinognio, o fator VIII, o IX e assim por diante. A coleta de sangue para estudo da coagulao deve ser a menos traumtica possvel, com o mnimo de estase venosa, e ser sempre feita com material plstico, incluindo seringas e tubos. O uso de frascos contendo vcuo deve ser evitado, pois este tende a ativar a coagulao e encurtar os tempos. O anticoagulante usado, o Citrato de sdio 100 mM pH 6,5, pois este o ideal para conservao dos fatores. O Oxalato de sdio tambm pode ser usado, mas alguns fatores so menos estveis neste tipo de anticoagulante. O EDTA no deve ser usado por pode provocar a ativao das plaquetas. A Heparina no se presta como anticoagulante no estudo da coagulao. A proporo entre o volume de anticoagulante e o volume de sangue total muito importante, pois os testes so baseados no tempo que o plasma leva para coagular depois da adio do clcio que anula o efeito do citrato. A proporo padronizada de 9 partes de sangue total para 1 parte de Citrato de Sdio 100 mM pH 6,5. Esta proporo vlida para indivduos com hematcrito em torno de 45%. Nos casos de policitemia com Hematcrito maior que 55% a quantidade de anticoagulante deve ser ajustada, do contrrio os tempos sero anormalmente longos. O sangue total ento centrifugado a 3.000 rpm por 15 minutos para obteno do plasma pobre em plaquetas (PPP). O PPP pode ser transferido para um tubo plstico para realizao dos testes, e ser mantido temperatura ambiente, pois a refrigerao ativa a fase de contato da coagulao. Os testes devem ser realizados dentro de pouco tempo, ou ento o plasma deve ser congelado imediatamente para um ensaio posterior. I Tempo de Protrombina

Princpio: O tempo de protrombina ou TP, consiste na determinao do tempo de coagulao de um PPP, aps a adio de tromboplastina (Fator III) e de clcio, a 37oC. A adio de um excesso de tromboplastina promover a ativao de todo o fator VII contido na amostra de plasma. O Fator VIIa ativar o fator X, iniciando a via comum da cascata da coagulao. Desta forma, o TP mede os fatores envolvidos na Via Extrnseca e na Via Comum, sendo absolutamente independente da Via Intrnseca. A tromboplastina um reagente obtido a partir de crebro humano, de coelho, de boi ou de macaco. Ele contm o fator tissular, composto por uma parte protica e uma parte fosfolipdica que substitui o fator 3 plaquetrio (F3P) na ativao dos fatores que se ligam a fosfolipdeos de

56 membrana. O TP sensvel a reduo dos fatores: VII, X, V, II e I. O TP o teste mais sensvel para avaliao da reduo dos fatores dependentes de vitamina K (II, VII, IX e X), sendo o teste usado no controle de paciente em uso de anticoagulante orais.

Procedimentos: A tromboplastina a ser usada pode ser com ou sem clcio, dependendo do fabricante. Ela pode ser apresentada na forma liofilizada, devendo ser reconstituda de acordo com a orientao do fabricante, obedecendo sempre a condio e o tempo de conservao. No caso da tromboplastina sem clcio a realizao do teste obedece ao seguinte esquema:

Tcnica 1: Obteno de Plasma Pobre em Plaquetas: Centrifugar o sangue total a 3.000 rpm por 15 minutos para obteno do plasma pobre em plaquetas (PPP). O PPP pode ser transferido para um tubo plstico para realizao dos testes, e ser mantido temperatura ambiente, pois a refrigerao ativa a fase de contato da coagulao. Os testes devem ser realizados dentro de pouco tempo, ou ento o plasma deve ser congelado imediatamente para um ensaio posterior. Em um tubo de ensaio pr-aquecido a 37oC: Adicionar 100 l de Tromboplastina Incubar a 37o C por 2 minutos Adicionar 100 l de plasma pobre em plaquetas citratado Incubar a 37o C por 2 minutos Adicionar 100 l de CaCl2 0,025 M Disparar o cronmetro e anotar o tempo que gasto para formar o cogulo. Para as tromboplastinas que j contm clcio, o seguinte esquema deve ser obedecido (tcnica 2):

Tcnica 2: Obteno de Plasma Pobre em Plaquetas: Centrifugar o sangue total a 3.000 rpm por 15 minutos para obteno do plasma pobre em plaquetas (PPP). O PPP pode ser transferido para um tubo plstico para realizao dos testes, e ser mantido temperatura ambiente, pois a refrigerao ativa a fase de contato da coagulao. Os

57 testes devem ser realizados dentro de pouco tempo, ou ento o plasma deve ser congelado imediatamente para um ensaio posterior. Em um tubo de ensaio pr-aquecido a 37oC: Adicionar 100 l de plasma pobre em plaquetas citratado Incubar a 37o C por 2 minutos Adicionar 200l de Tromboplastina pr-aquecida a 37oC Disparar o cronmetro e anotar o tempo que gasto para formar o cogulo.

Expresso dos Resultados: Os resultados podem ser expressos em segundos, mas esta forma traz o inconveniente da variao diria do teste. Assim, sempre necessrio realizar o TP de um Pool de plasma normal e comparar o resultado do paciente com o resultado do indivduo normal, fazendo-se a relao dos TP paciente sobre o normal. Exemplo: TP PACIENTE= 28 segundos TP NORMAL= 14 segundos R= 2,0

Ento R= [ TP paciente/TP normal]; R=[28 segundos/14 segundos];

O TP pode ainda ser expresso em Atividade de Protombina ou AP. Esta forma de expressar o TP deriva de uma curva realizada com um Pool de plasma normal diludo em diferentes concentraes com salina. Assim, o plasma puro representa 100% de AP, o plasma diludo ao meio representa 50% de AP, assim por diante. O TP realizado da maneira habitual para todas as diluies do plasma e uma curva construda com os valores obtidos, tal como no exemplo abaixo: Exemplo do Clculo da Atividade Protrombina: Diluio da amostra (Pool de Plasma Normal) para determinar o TP Diluio Plasma Puro Diluio 1:2 Diluio 1:4 Diluio 1:8 Diluio 1:16 Atividade 100% 50% 25% 12,5% 6,25% Tempo 14,6 segundos 19,2 segundos 26,0 segundos 37,9 segundos 60,4 segundos

Uma curva ento construda em papel logartmo, onde se colocam os TP em segundos na ordenada e os AP em % na abscissa. Pelos pontos pode-se traar uma reta. Para se ter o AP do

58 paciente, basta interpolar na reta o valor encontrado para o TP, e o resultado pode ser expresso em atividade de protrombina. Alguns laboratrios fornecem, como resultado, apenas o TP do paciente, ou apenas a relao TP paciente/TP normal ou apenas a atividade e fazem referncia aos valores normais do mtodo. Esse modo de informar deixa muito a desejar, e poder acarretar srios problemas para o acompanhamento de pacientes que esto recebendo anticoagulantes orais. A razo para isso que os resultados do TP variam muito com a tromboplastina que est sendo empregada no referido teste. O TP o tempo obtido aps a adio de clcio mistura de tromboplastina com o plasma a ser estudado. Acontece que a atividade da tromboplastina varia de fabricante para fabricante e, quando do mesmo fabricante, a atividade varia de partida para partida. Em outras palavras, a determinao do TP de um plasma dar resultados diferentes se usarmos tromboplastinas de diferentes origens, ou de diferentes partidas. Desse modo, com a finalidade de uniformizar os resultados do teste, a Organizao Mundial de Sade apresenta uma tromboplastina que serve de referncia para a padronizao das tromboplastinas empregadas no TP. Assim, com essa tromboplastina padro, os fabricantes de tromboplastina podem calcular o ndice de sensibilidade internacional (ISI: international sensitivity index). Os melhores ndices so aqueles mais prximos de 1. Com ISI mais afastado do padro internacional, haver maiores diferenas nos tempos de protrombina. O ISI vem referido no frasco. Para dar maior sensibilidade ao mtodo, emprega-se a relao entre o tempo de protrombina do paciente e o tempo de protrombina de uma mistura de plasmas normais (5 ou mais plasmas). A esse resultado denominamos relao tempo de protrombina do paciente com o tempo dos plasmas normais. Adicionando-se o ISI a essa relao, teremos o RNI (international normalized ratio). Desse modo, empregamos a seguinte frmula para determinar o INR que tem o ISI como expoente:

RNI = (TP DO PACIENTE/ TP DA MISTURA DE PLASMAS NORMAIS)ISI

Os valores normais do RNI variam entre 0.9 e 1.2.

59 II- Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado Princpio: O TTPA consiste na determinao do tempo de coagulao do PPP citratado, aps a adio de um ativador da fase de contato da coagulao (por isso dito ativado), e de um reagente, a cefalina, que substitui o fosfolipdeo da membrana plaquetria ou FP3, uma vez que se trabalha com o PPP. O ltimo reagente a ser adicionado o clcio, que reverte a ao do citrato. O ativador da fase de contato pode ser o caolim, o cido elgico, a celite ou ainda o dextram. Este ativador quando colocado em excesso vai ativar o Fator XII, na presena de precalicrena e cininognio de alto peso molecular. O Fator XIIa vai converter o Fator XI em XIa. O Fator XIa ativa o fator IX em IXa, e este junto com o fator VIII:C, que atua como cofator, e Ca2+ vai ativar o Fator X. Esta a chamada Via Intrnseca da coagulao. O Fator Xa inicia ento a Via Comum, ativando o Fator II na presena de Fator V e do FP3, que no TTPA representado pela cefalina. O Fator IIa ou trombina, atua sobre o fibrinognio, transformando-o em fibrina. A cefalina um fosfolipdeo extrado de crebro de maneira semelhante tromboplastina, mas com a diferena que a cefalina no possui atividade de fator tissular, isto , no capaz de ativar o fator VII (por isso ela chamada tromboplastina parcial), mas capaz de atuar como uma superfcie de fosfolipdeo, substituindo aquela representado fisiologicamente pela membrana plaquetria. Assim o TTPa sensvel ao nvel dos fatores da Via Instrnseca e da Via Comum: XII, PK, cininognio de alto peso molecular, XI, VIII-C, X, V, II e fibrinognio. Ele bastante sensvel presena de heparina, sendo o teste de escolha para monitor a heparinoterapia.

Procedimento: A cefalina de diferentes procedncias geralmente contm o ativador. No caso do celite ou caolim, o ativador particulado, o que impede a leitura do TTPa em coagulmetro. O reagente contendo cido elgico homogneo e permite o uso do coagulmetro. O procedimento do teste obedece ao seguinte esquema:

Tcnica: Obteno de Plasma Pobre em Plaquetas: Centrifugar o sangue total a 3.000 rpm por 15 minutos para obteno do plasma pobre em plaquetas (PPP). O PPP pode ser transferido para um tubo plstico para realizao dos testes, e ser mantido temperatura ambiente, pois a refrigerao ativa a fase de contato da coagulao. Os

60 testes devem ser realizados dentro de pouco tempo, ou ento o plasma deve ser congelado imediatamente para um ensaio posterior. Em um tubo de ensaio pr-aquecido a 37oC: Adicionar 100 l de PPP citratado Adicionar 100 l de cefalina Incubar a 37o C por 3 a 5 minutos Adicionar 100 l de CaCl2 0,025 M Disparar o cronmetro e anotar o tempo

Expresso dos Resultados: O resultado deve ser expresso pela relao entre o tempo obtido para o paciente e o tempo do Pool de plasma normal do dia. considerado normal uma relao TTPa paciente/TTPa Pool normal de at 1,25, o que significa dizer que o TTPa do paciente no deve estar alm de 25% acima do TTPa do plasma normal. Os valores em segundos variam com o ativador e a cefalina utilizados, de modo que a expresso dos resultados em segundos no recomendada.

III- Tempo de Trombina

Princpio: O TT consiste no tempo de coagulao do PPP aps a adio de baixa concentrao de trombina bovina, que vai transformar diretamente o fibrinognio em fibrina. O TT vai ento depender da concentrao de fibrinognio e da presena de inibidores da formao de fibrina como o caso da ao da heparina e dos produtos de degradao da fibrina (PDF).

Procedimento: A trombina bovina a ser utilizada deve ter 5U/ml, de modo a fornecer um TT em plasma normal de 15 a 20 segundos. A soluo da trombina deve ser mantida em banho de gelo, pois essa enzima muito instvel temperatura ambiente. O procedimento obedece ao seguinte esquema:

61 Tcnica: Obteno de Plasma Pobre em Plaquetas: Centrifugar o sangue total a 3.000 rpm por 15 minutos para obteno do plasma pobre em plaquetas (PPP). O PPP pode ser transferido para um tubo plstico para realizao dos testes, e ser mantido temperatura ambiente, pois a refrigerao ativa a fase de contato da coagulao. Os testes devem ser realizados dentro de pouco tempo, ou ento o plasma deve ser congelado imediatamente para um ensaio posterior. Em um tubo de ensaio pr-aquecido a 37oC: Adicionar 200 l de PPP citratado Incubar a 37oC por 2 minutos Adicionar 100 l Trombina 5U/ml pr-aquecida a 37oC por 2 minutos Disparar o cronmetro e anotar o tempo

Expresso dos resultados: Os resultados so expressos como a relao entre o TT do paciente e o TT Pool de plasma normal do dia. O valor normal no deve ultrapassar 1,20.

IV- Dosagem do Fibrinognio

Princpio: A dosagem do fibrinognio pelo mtodo de Clauss baseia-se na coagulao do PPP muito diludo por uma alta concentrao de trombina bovina. Nestas condies, o tempo de coagulao proporcional concentrao de fibrinognio, no sofrendo influncia da heparina e variando pouco com a presena de PDF. Como o plasma diludo, a visualizao do cogulo muito difcil, sendo necessrio o uso de coagulmetro.

Procedimento: A trombina bovina preparada dissolvendo-se o contedo do frasco com salina para obter uma concentrao de 500U/ml (Soluo Estoque). Esta deve ser aliquotada e congelada a - 70o C ou conservada a 20o C por pouco tempo. A soluo de trabalho preparada no momento do uso pela diluio da soluo estoque para uma concentrao final de 70 U/ml em tampo Veronal. A soluo de trabalho deve ser conservada em banho de gelo, no devendo ser recongelada. A realizao do teste obedece ao seguinte esquema:

62

Tcnica: Obteno de Plasma Pobre em Plaquetas: Centrifugar o sangue total a 3.000 rpm por 15 minutos para obteno do plasma pobre em plaquetas (PPP). O PPP pode ser transferido para um tubo plstico para realizao dos testes, e ser mantido temperatura ambiente, pois a refrigerao ativa a fase de contato da coagulao. Os testes devem ser realizados dentro de pouco tempo, ou ento o plasma deve ser congelado imediatamente para um ensaio posterior. Em um tubo de ensaio pr-aquecido a 37oC: Adicionar 200 l do PPP previamente diludo Incubar a 37oC por 2 minutos Adicionar 100l de Trombina 70 U/ml Disparar o cronmetro e anotar o tempo Um plasma padro, com uma concentrao conhecida de fibrinognio deve ser utilizado para construir uma curva padro. A diluio 1:10 corresponde a 100% ou concentrao real do fibrinognio do plasma padro. Por exemplo, ao utilizar o plasma padro de 22,2g/l de fibrinognio, a diluio 1:10 deste plasma corresponde a 2.2 g/l. Assim pode se construir a curva padro da seguinte maneira:

Tcnica: Diluio do plasma padro para a realizao da curva padro: Diluio Diluio 1:10 Diluio 1:15 Diluio 1:20 Diluio 1:25 [Fibrinognio] g/l de plasma 2,22 1,48 1,11 0,89 Tampo Veronal 900l 1.400l 1.900l 2.400l Plasma Padro 100l 100l 100l 100l

Os tempos obtidos para cada ponto so colocados em um papel logartmo e a curva traada. Pelo menos trs pontos devem estar alinhados. Nas concentraes altas ou baixas, a curva perde a linearidade, desta forma o tempo gasto para a formao do cogulo deve estar contido na zona de linearidade. O plasma do paciente deve ser diludo 1:10, e se o tempo obtido estiver na zona de linearidade a leitura da concentrao do fibrinognio pode ser feita. Se o tempo obtido estiver a

63 baixo o plasma deve ser diludo 1:15 ou 1:20 at que o tempo esteja dentro da zona de linearidade, e o resultado deve ser multiplicado pelo fator de diluio.

Composio do Tampo veronal: Dietil Barbiturato de sdio NaCl gua destilada 11,75 g 14,67 g 1000 ml

Acertar o pH para 7,4 com HCl 1 N e acertar o volume com gua destilada para 2.000ml.

V- Tempo de Sangramento (TS) Para a determinao do TS, emprega-se um dispositivo descartvel que, ao disparar uma lmina, produzir uma inciso com 6 mm de extenso por 1 mm de profundidade. O local da inciso a poro ventral do antebrao, longe de qualquer vaso sangneo. Esse teste efetuado mantendo-se um manguito no brao com presso de 40 mm Hg. O tempo de sangramento normal no deve ultrapassar de 7 a 10 minutos. No entanto, o tempo de sangria que realizado na maioria dos laboratrios se baseia na realizao de uma pequena inciso na polpa digital, com uma lanceta estril, de cerca de 3mm de profundidade e deixar o sangue fluir espontaneamente. Acionar o cronmetro no momento em que aparecer a primeira gota de sangue e com um papel de filtro, absorver a cada 15 segundos a gota de sangue formada, sem pressionar a inciso. Quando cessar o fluxo de sangue, parar o cronmetro. O intervalo decorrido entre o aparecimento da primeira gota e a ltima gota representa o tempo de sangria do paciente. Normalmente, no se obtm mais sangue ao fim de um a trs minutos, ou seja, observam-se no papel de filtro cerca de 4 a 12 gotas, que vo diminuindo gradativamente de tamanho. Quando o tempo de sangria se encontra prolongado, o sangue continua fluir alm do tempo normal, formando-se gotas durante um certo tempo. O valor de referncia de 1 a 3 minutos. Para uma verdadeira reflexo da funo das plaquetas "in vivo", o paciente deve evitar o uso de aspirina ou drogas aspirina-like durante 7 dias antes da realizao do tempo de sangria, pois a aspirina e muitas droga aspirina-like prolongam o tempo de sangria. Igualmente, uma contagem de plaquetas deve ser executada antes de realizar o tempo de sangria, pois uma contagem de plaquetas inferior a 100 x 109/L resultar em um tempo de sangria prolongado. Se condies acima forem conhecidas, um tempo de sangria prolongado indicar deficincia orgnica das plaquetas. Possveis causas de deficincia orgnica das plaquetas incluem:

64 deficincias orgnicas hereditrias e adquiridas, Doena de von Willebrand, afibrinogenemia, hipofibrinogenemia severa, e algumas desordens vasculares.

VI- Plaquetometria A contagem de plaquetas efetuada em contador automtico de clulas ou em cmara de Neubauer. Os valores normais variam entre 150.000 - 400.000 /mm3 Diante de algumas situaes as seguintes providncias devem der tomadas: I - Havendo alterao de um dos exames de rotina, tem que prosseguir com os testes de esclarecimento, mesmo que no se identifique hemorragia anormal na HDA, na HP e na HF. II - Se apenas na HDA, na HP ou na HF houver evidncia de sangramento anormal, o estudo para esclarecimento dever ser efetuado, mesmo que os exames de rotina estejam normais.

2 - Exames para Esclarecimento do Defeito Hemosttico Sempre que houver alterao em um ou nos dois exames de rotina (TP e TTPa), deve-se pensar na possibilidade de decrscimo do nvel de um ou de vrios fatores. Para esclarecer, devese efetuar a dosagem dos fatores. Os fatores a serem dosados so aqueles que esto relacionados ao exame alterado, conforme referidos no item anterior. Em continuao ao esclarecimento do defeito hemosttico, caso haja alterao do TP e do TTPa, e as dosagens dos fatores da via intrnseca e extrnseca, como tambm dos fatores X, V e II, estejam normais, deve-se realizar o TT que, alterado, poder indicar nvel baixo de fibrinognio. A dosagem desse fator confirmar, ou no, a suspeita. Caso os exames de rotina, e os de esclarecimento estejam normais, deve-se suspeitar de anormalidade do FXIII. Para esclarecer importante efetuar um teste simples de solubilidade do cogulo de plasma em soluo de uria. Se o nvel de FXIII estiver baixo, a ligao covalente entre os monmeros de fibrina no se far e, conseqentemente, a fibrina gerada ser solvel na soluo de uria. A dosagem do fator confirmar o diagnstico. Alm de se pensar em nvel baixo de fator quando o exame de rotina estiver alterado, imprescindvel que se afaste a possibilidade da presena de um anticoagulante circulante. Para tal, importante efetuar o tempo de recalcificao da mistura do plasma do paciente com plasma normal, em partes iguais. Caso o tempo da mistura no for maior que 4 segundos do tempo do plasma normal, pode-se dizer que houve correo e, nesse caso, estar afastada a

65 possibilidade de anticoagulante. Como h anticoagulante com ao tempo-dependente, deve-se realizar o exame aps uma hora da mistura. Tambm pode realizar, no lugar do tempo de recalcificao da mistura dos plasmas, o TP ou o TTPa, escolhendo o alterado ou o mais alterado no exame de rotina. Prosseguindo o raciocnio, caso os exames de rotina, para coagulao, estejam normais, mas o TS apresenta-se aumentado, a plaquetometria confirmar, ou no, a trombocitopenia. Na ausncia de trombocitopenia, ou quando o nvel da trombocitopenia no justificar a alterao do TS, deve pesquisar a existncia de defeito funcional plaquetrio e Doena de von Willebrand. Para esses esclarecimentos deve-se contar com exames que somente so realizados em laboratrios especializados no estudo da hemostasia. Vrios deles utilizam aparelhos mais avanados e tcnicas bioqumicas, que na maior parte das vezes somente so efetuadas em laboratrios que se dedicam pesquisa. A seguir sero fornecidos maiores detalhes sobre os aparelhos e as tcnicas de diagnstico usadas mais freqentemente no diagnstico dos distrbios funcionais plaquetrios, incluindo a doena de von Willebrand. Um novo teste, prtico, est sendo empregado para o diagnstico da vWD - o tempo de ocluso. Para tal, empregado um aparelho, o PFA-100 (Platelet Function Analyzer, Dade International, Massy, France) para pesquisar defeito de adesividade e agregao plaquetrias, particularmente na vWD. O sangue total citratado aspirado, sob alto "shear rate" (5000-6000 dyn/cm2), atravs de um tubo capilar constitudo de uma membrana revestida com colgeno e com agonistas plaquetrios (epinefrina e ADP) e com uma abertura central de 150 m de dimetro. O tempo requerido para obter ocluso da abertura, por um trombo plaquetrio, denominado tempo de ocluso (TO) ["closure time"]. O analizador bem adaptado para testes de rotina, tendo as vantagens da simplicidade, da fcil execuo, do emprego de variado "shear rate/stress", reproduo do ambiente "in vivo", e demonstrou grande sensibilidade e especificidade. Outro exame importante o estudo da agregao plaquetria por meio do agregmetro. Nesse exame, pela transmisso de luz, obtm-se um registro da agregao plaquetria com o emprego de indutores fisiolgicos como: colgeno, epinefrina, ADP, trombina, e no fisiolgicos como a ristocetina. A FIGURA 34 mostra a curva de agregao plaquetria produzida pelas referidas substncias.

66 Na FIGURA 34 a curva A normal e do tipo bifsica produzida por indutores fisiolgicos como a epinefrina ou o ADP. As concentraes das substncias, usadas no teste, podem variar na dependncia da finalidade do estudo. A primeira parte da curva gerada pela ao direta da substncia empregada; j a segunda parte decorre da ao de substncias excretadas pelo sistema canalicular aberto, e derivadas dos corpsculos densos (reao de liberao) no momento em que a plaqueta ativada. Fica fcil entender que se houver deficincia de substncias do Pool de armazenamento, ou defeito das reaes decorrentes da ao do indutor sobre seu receptor na membrana plaquetria, a segunda parte da curva estar ausente j que no sero liberadas as substncias responsveis pela agregao endgena. A curva caracterstica desse tipo de resposta a curva B. Esse tipo de curva visto nas deficincias de substncias do Pool de armazenamento e nos distrbios da transduo de sinais.

FIGURA 34: Registros da agregao plaquetria obtidos com diversos agonistas. A = curva normal bifsica. B = curva anormal demonstrando ausncia da agregao pelo indutor endgeno. C = curva anormal demonstrando ausncia de resposta aos indutores exgeno e endgeno. Detalhes no texto.

Na curva C, a curva plana em virtude da ausncia de resposta aos indutores externos e internos. Esse tipo de resposta encontrado na Trombastenia de Glanzmann com o emprego dos indutores fisiolgicos e na doena de von Willebrand com o emprego da ristocetina. Outros testes, mais especficos para determinados distrbios, sero comentados no tpico correspondente.

67 DISTRBIOS HEREDITRIOS DA COAGULAO

Doena de von Willebrand (vWD):

uma das mais freqentes desordens hemorrgicas hereditrias, com uma prevalncia de 0.9-1.3% na populao em todo o mundo e de pouco menos de 3% nos Estados Unidos. De grande destaque na vWD a grande discrepncia existente na histria das hemorragias entre os familiares e, at mesmo, no paciente em diferentes perodos. Tambm no existe relao precisa entre a intensidade dos fenmenos hemorrgicos e os dados laboratoriais. No estudo de BIRON e colaboradores, apenas 8 de 30 pacientes, com o tipo 1 da vWD, com reduo significante do nvel de vWF(ag), apresentavam hemorragia na HDA ou na HF. Os distrbios hemostticos referentes vWD esto relacionados s alteraes surgidas na sntese do vWF e na conseqente anormalidade funcional. Outro ponto importante que precisa ser ressaltado para entender os testes diagnsticos dessa doena o do "shear rate/stress" que ser discutido nesta seo devido a sua importncia para a compreenso do assunto. "Shear rate" corresponde interface do sangue circulante com a parede vascular. Em outras palavras, a velocidade de deslocamento da lmina de sangue circulante, mais prxima parede do vaso. As plaquetas dessa camada de sangue so, justamente, aquelas que entraro em contato com o subendotlio exposto aps a leso do endotlio. "Shear stress" representa a fora de coliso das plaquetas entre si e da plaqueta com uma superfcie, por exemplo, a fibrila de colgeno. No fenmeno de "shear rate" as plaquetas so arrastadas em uma superfcie; j no "shear stress" elas se chocam com a superfcie. A importncia disso est em que a atividade de ligao do vWF aumenta com o aumento do "shear rate/stress". Um novo teste, prtico, est sendo empregado para o diagnstico da vWD - o tempo de ocluso. Para tal, empregado um aparelho, o PFA-100 (Platelet Function Analyzer, Dade International, Massy, France) para pesquisar defeito de adesividade e agregao plaquetrias, particularmente na vWD. A explicao sobre este teste j foi dada na seo Exames para Esclarecimento do Defeito Hemosttico. Com o que j foi exposto at agora, possvel interpretar os testes, os quais esto apresentados no Quadro 2, para o esclarecimento diagnstico da vWD. Suspeita-se de vWD quando, alm de hemorragia apresentada pelo paciente, particularmente, em cirurgia e pela mucosa, houver relato de sangramento em familiares e aumento do tempo de sangramento com plaquetometria normal.

68 Se ao efetuar os exames apresentados no Quadro 2, observar diminuio do nvel de FVIII:C, diminuio proporcional do nvel de vWF(ag), alterao da curva de agregao com ristocetina e baixo percentual da atividade da ristocetina como cofator h uma confirmar do diagnstico da doena de von Willebrand. A realizao do teste de avaliao do tempo de ocluso, realizado no analizador PFA-100, mostrar um tempo de ocluso (TO) ampliado, o que colabora para a confirmao do diagnstico. Confirmado o diagnstico, deve-se partir para a determinao do tipo da vWD por meio do estudo dos multmeros do vWF usando a eletroforese em SDS-agarose.

Quadro 2: Testes laboratoriais para diagnstico da doena de von Willebrand Dosagem do FVIII:C: a dosagem do FVIII:C que se encontra acoplado ao vWF Avaliao do vWF(ag): Trata-se da frao antignica da molcula que avaliada pela imunoeletroforese quantitativa usando-se anticorpo especfico (tcnica de Laurel). Normal = 50-150%. Recentemente, tm sido empregados testes de maior sensibilidade como o de ELISA e o de citometria de fluxo. Avaliao do vW:R CoF: a avaliao da atividade da ristocetina como cofator. Verifica-se a agregao de plaquetas normais, fixadas em formol, pela ristocetina e plasma do paciente. A ristocetina empregada em concentrao padro e o plasma do paciente em quantidades diversas. Compara-se com a aglutinao usando-se quantidades diversas de plasma normal. Se houver defeito relativo ao vWF do paciente, a agregao com a ristocetina ser anormal. Normal = 60-150% RIPA: RIPA (aggregation of platelet-rich plasma with ristocetin). o registro, no agregmetro, da agregao plaquetria usando-se plasma do paciente rico em plaquetas, com adio de ristocetina em quantidade de 1.2 mg/ml De acordo com a pesquisa, quantidades diversas podem ser empregadas Estudo dos multmeros do vWF: Determinao dos multmeros por meio da eletroforese de SDS-agarose (sulfato de dodecyl sdico-agarose) Estudo dos multmeros do vWF: Determinao dos multmeros por meio da eletroforese de SDS-agarose (sulfato de dodecyl sdico-agarose) Tempo de ocluso: Tempo de ocluso determinado pelo analizador PFA-100, conforme discutido anteriormente.

69 Com a eletroforese, pode-se determinar as caractersticas dos multmeros, podendo ento caracterizar a vWD nos tipos apresentados no Quadro 3.

Quadro 3: Tipos da doena de von Willebrand

Tipos da vWD Doena Tipo I Principais caractersticas

Autossmica dominante. Cerca de 70-80% dos pacientes esto nesse grupo. Diminuio discreta ou moderada do vWF no plasma, porm, estruturalmente normal. H diminuio paralela do vWF(ag), FVIII-C e da Atividade Ristocetina-cofator Cerca de 15-20% dos pacientes esto nesse grupo. Alterao qualitativa da molcula de vWF com nveis normais ou pouco diminuidos do referido fator: 2A: Autossmica dominante. Decrscimo quantitativo, parcial, dos multmeros da molcula de vWF, de grande e intermedirio tamanhos. H diminuio da interao com as plaquetas. A quantidade do vWF(ag) e do FVIII-C esto normais ou prximos do normal. A atividade da ristocetina como cofator est bastante reduzida. 2B: Autossmica dominante. H diminuio da proporo dos grandes multmeros e aumento da proporo dos pequenos multmeros. Nesse tipo, a interao do vWF com a plaqueta est aumentada levando agregao intravascular. As plaquetas agregadas so afastadas rapidamente da circulao o que leva trombocitopenia intermitente. Os nveis do FVIII-C e do vWF so variveis. A agregao das plaquetas pela ristocetina est aumentada, mesmo em baixas doses dessa substncia. 2C: Autossmica recessiva. Decrscimo da proporo dos grandes multmeros, porm qualitativamente anormais. Aumento dos pequenos multmeros. A atividade da ristocetina como cofator est diminuida e em despropor o com a reduo do vWF. 2M: Tem alterao laboratorial semelhante a do tipo 2A. Os grandes multmeros no esto diminuidos, mas o vWF interage pouco com as plaquetas. H diminuio da atividade do vWF, mas esto normais o vWF(ag) e do FVIII-C. 2N: Autossmica recessiva. A principal caracterstica desse tipo intensa diminuio da afinidade do vWF pelo FVIII-C. Conseqentemente, o FVIII-C no fica mais protegido da rpida protelise, o que resulta na diminuio de cerca de 5% do nvel desse fator em relao ao nvel normal. O vWF(ag) e o vWR-CoF esto freqentemente normais.

Doena Tipo II Subtipos: 2A, 2B, 2C, 2M, 2N

Doena Tipo III

Autossmica recessiva. Total deficincia do vWF, porm, sem alterao estrutural da molcula. Esse tipo apresenta uma incidncia de 1 em 1 milho de pessoas. Caracteriza-se pela ausncia da agregao plaquetria pela ristocetina (RIPA), intenso decrscimo do nvel do vWF(ag), indetectvel atividade da ristocetina como cofator e nvel de FVIII-C muito baixo.

70 Diante do que foi exposto pode-se dizer que a doena de von Willebrand se constitui em uma verdadeira armadilha para o mdico, j que as observaes que apresentamos a seguir podem afastar a hiptese de uma ditese hemorrgica na avaliao pr-operatria: 1- Seus principais sintomas so hemorragias vistas, freqentemente, em outras patologias ou sem causa determinada, como epistaxe recorrente, menorragia, ps-extrao dentria, ps amidalectomia, alguns dias aps o parto. 2- O paciente pode no apresentar qualquer histria pregressa de sangramento. 3- Pode no haver histria de hemorragia nos membros consangneos da famlia. 4- Os exames pr-operatrios para pesquisa de distrbio hemosttico podem ser normais. Verifica-se tambm a existncia de discrepncia muito grande nos dados dos diversos autores sobre a prevalncia da doena. fcil deduzir que essa discrepncia decorre da dificuldade em se pensar na doena pelas razes expostas nos itens anteriores, e pela indisponibilidade de maiores recursos diagnsticos laboratoriais em muitos paises.

Adendo: Sndrome de von Willebrand Adquirida (vWS) Apesar de ser um distrbio adquirido, importante coment-lo nesse item, em virtude da semelhana, clnica e laboratorial, com a vWD que um distrbio hereditrio. A vWS, como na vWD, decorre de alteraes quantitativas e/ou qualitativas da molcula do vWF. um distrbio muito raro, o que torna mais difcil sua diferenciao com o correspondente hereditrio que, como dissemos, chega a 1% da populao mundial e a pouco menos de 3% da populao dos Estados Unidos. A vWS reproduz vrias alteraes laboratoriais vistas na vWD, tais como prolongamento do tempo de sangramento, diminuio do FVIII:C, da ristocetina como cofator (vWF:R CoF), do vWF(ag) e da aglutinao plaquetria induzida pela ristocetina (RIPA). J que o estudo laboratorial no suficente para fazer a diferenciao entre a vWD e a vWS, importante constatar a inexistncia de histria pregressa de hemorragia no paciente, e de alteraes dos exames caractersticos da vWD nos familiares. A vWS tem sido descrita em associao com: gamopatias monoclonais, linfomas, tumor de Wilms, mieloma, doena cardaca congnita, lupus eritematoso sistmico, angiodisplasia, desordens convulsivas tratadas pelo cido valprico e hipotireoidismo. Cerca de um tero dos casos publicados esto associados gamopatia monoclonal, mas na maioria dos casos o mecanismo responsvel pela vWS no est claramente definido. Segundo alguns autores, o vWF removido rapidamente do sangue por mecanismos diversos: 1- auto-anticorpos especficos que inativam o vWF, 2- anticorpos inespecficos que formam imuno-complexos circulantes com o

71 vWF o que favorece seu afastamento pelos macrfagos, 3- absoro do vWF por clulas malgnas e 4- por degradao proteoltica do vWF. Ser adicionado um 5 mecanismo, o da absoro seletiva de multmeros, de alto e intermedirio peso molecular, em pacientes com doena cardaca, particularmente com defeito do septo ventricular ou da vlvula. Nesse ltimo caso, havendo deficincia dos referidos multmeros, o distrbio assemelha-se ao tipo hereditrio vWD 2B.

Deficincia de outros fatores da coagulao: Como foi exposto anteriormente, a partir dos testes de rotina para o estudo da hemostasia, podemos desconfiar da reduo do nvel de um ou de vrios fatores da coagulao. Para esclarecimento, partiremos para a dosagem do fator com base no teste de rotina alterado. A dosagem do fator da coagulao de fcil execuo, estando ao alcance de qualquer laboratrio. Em funo da gravidade da deficincia dos fatores VIII e IX da cascata da coagulao, sero enfatizadas as conseqncias que o paciente poder apresentar na deficincia destes fatores, como tambm a abordagem teraputica.

Deficincia do Fator VIII: A deficincia do Fator VIII caracteriza uma patologia conhecida como Hemofilia A. A hemofilia A a desordem hereditria mais comum da cascata da coagulao sangnea. uma desordem de sangramento ligada ao sexo e que tem sido documentada h muitos sculos atrs. O gene que expressa o Fator VIII est localizado no cromossoma X, assim os filhos sero hemoflicos e as filhas sero obrigatoriamente portadoras do trao hemoflico. As mulheres que apresentam um gene anormal geralmente no exibem sangramento, pois elas possuem dois cromossomas X e um nico gene normal capaz de produzir quantidades suficientes de Fator VIII:C funcional. A severidade das manifestaes clnicas est diretamente relacionada com o grau de deficincia do Fator. a) Doena Leve: Os nveis do Fator VIII:C esto acima de 0,05U/ml (valor normal: 1U/ml), geralmente estes pacientes so assintomticos. Corre risco quando submetidos a um trauma cirrgico muito extenso.

72 b) Doena Moderada: Os nveis do Fator VIII:C esto entre 0,02-0,05U/ml. Neste caso os pacientes so freqentemente assintomticos, mas ocasionalmente sangramentos podem ocorrer sem nenhuma causa definida. c) Doena Severa: Os nveis do Fator VIII:C esto abaixo de 0,01U/ml. Neste caso o paciente apresenta doena hemorrgica grave, com sangramentos espontneos, que requer uma terapia constante. O Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (TTPa) ser anormal, ou seja, prolongado e o Tempo de sangramento mais o Tempo de Protrombina (TP) sero normais. Para uma anlise especfica deve ser feita a dosagem do Fator VIII:C. Nveis < 0,01U/ml (<1% do normal) so encontrados nos pacientes com doena severa. Aproximadamente 10% a 15 %dos pacientes com hemofilia A desenvolvem anticorpos anti-Fator VIII:C. Esses anticorpos so do tipo IgG e por isso so capazes de neutralizar o Fator VIII:C a 37oC. Atualmente, existem muitas formas de tratamento para a hemofilia A. Dentre elas algumas merecem destaque: 1- Concentrados de plasma humano so amplamente utilizados. 2- Um grande nmero de hemoflicos tratado com concentrados de Fator VIII altamente purificados e liofilizado. O crioprecipitado uma rica fonte de Fator VIII, mas no o produto de escolha devido ao risco de transmisso de doenas, principalmente a Hepatite C e a AIDS. Atualmente, com as tcnicas de biologia molecular est sendo possvel a clonagem do Fator VIII e com isso reduzir incidncia da transmisso das doenas virais. 3- Pacientes que tem desenvolvido anticorpos anti-Fator VIII so tratados com concentrados de Fator VIII de origem suna. 4- Anlogos da Vasopresina estimula a liberao de Fator VIII dos grnulos densos, aumentando efetivamente os nveis deste fator por cerca de 3 a 4 vezes. Porm em pacientes com nveis < 0,05U/ml este procedimento pode no ser eficiente. Um nvel de 30% da atividade normal o nvel teraputico ideal para manter a hemostasia. A presena de anticorpos anti-Fator VIII pode ser diagnosticada quando estudos de mistura com plasma normal no corrige o TTPa prolongado.

Deficincia do Fator IX: A deficincia de Fator IX conhecida como hemofilia B e uma desordem de sangramento recessiva ligada ao sexo. Mulheres com a deficincia so completamente raras, mas elas podem

73 ser transportadoras. Embora os sintomas clnicos so completamente similares, o sangue de um paciente com hemofilia A no normaliza o tempo de coagulao do sangue de um paciente com hemofilia B. Os nveis da atividade do Fator IX que determina a severidade da doena, com as deficincias mais severas tendo menos de 1% da atividade, e as deficincias moderadas com 5% a 25% da atividade. Na hemofilia B severa, h uma total ausncia do Fator IX, demonstrada pela ausncia da atividade coagulante e antignica. Alguns pacientes com Hemofilia B sintetizam uma variante no funcional da molcula do Fator IX, enquanto outros no possuem atividade antignica identificada no plasma e conseqentemente possuem uma ausncia verdadeira da sntese da molcula. Deficincia adquirida de Fator IX pode ser vista nos pacientes com doena heptica ou com deficincia de vitamina K e nos pacientes que esto em uso de anticoagulante oral. O tratamento dos pacientes com deficincia severa a moderada de Fator IX consiste de infuses regulares de plasma fresco congelado, concentrados do complexo protrombina que contem os Fatores II, VII, IX e X ou concentrados de Fator IX. A complicao mais sria nos pacientes com hemofilia B o desenvolvimento de anticorpos anti-fator IX. Esses so extremamente difceis de tratar e ocorre em aproximadamente 10% dos pacientes com esta deficincia. 3- Dosagem de Fatores da Cascata da Coagulao: A dosagem de fatores pode ser feita individualmente, utilizando-se um plasma deficiente no fator que ser quer determinar. O princpio do mtodo o seguinte: um plasma completamente deficiente em fator VIII, por exemplo, o plasma de um hemoflico A, tem um TTPa muito prolongado. Entretanto, ele contm nveis normais dos demais fatores, de modo que a adio de um plasma normal vai encurtar o TTPa proporcionalmente concentrao de fator VIII presente neste plasma normal. Desta forma, pode-se construir um curva relacionando o valor do TTPa em segundos, com a concentrao do fator em porcentagem. A dosagem de qualquer fator individualmente baseia-se nesse princpio, o plasma deficiente no fator em questo pode ser obtido de individuo congenitamente deficiente, como o caso dos hemoflicos, ou pode ser obtido artificialmente. O melhor mtodo para obteno de plasma artificialmente deficiente em um fator a imunoadsoro, que consiste na passagem do plasma por uma coluna onde esteja fixado um anticorpo especfico contra o fator que se quer retirar. O

74 plasma eludo da coluna contm todos os fatores com exceo do fator que ficou retido na coluna pelo anticorpo. Princpio: Consiste em usar um plasma imunoadsorvido, deficiente apenas em fator VIII ou em fator IX ou ainda em fator XI, e verificar a capacidade de diferentes diluies de um Pool de plasma normais em corrigir o TTPa desta mistura, construindo-se ento uma curva. Reagentes: 1 Pool de plasmas normais, colhidos em citrato de sdio. O plasma pode ser fresco de preferncia, mas pode tambm ter sido congelado. Lembrar que congelamento a 20oC no suficiente para prevenir a perda de atividade do fator VIII no decorrer do tempo. interessante que o plasma normal para a curva tenha o mesmo tratamento que o plasma a ser testado. Se utilizar plasma congelado, verificar se ele est totalmente descongelado 37oC, por um tempo no inferior a 10 minutos. 2 Plasma deficiente em fator VIII por imunoadsoro (Lab. Dade). Reconstituir o contedo do frasco com 1 ml de gua destilada (esterilizada). Deixar sob agitao lenta (agitador magntico) pelo menos por 15 minutos para que o contedo fique bem dissolvido. Fazer um Pool, se vrios frascos de plasmas deficientes forem usados, misturando o contedo de todos os frascos em um s. Manter em geladeira ou em banho de gelo, e nestas condies o reagente estvel por 8 horas. 3 Tampo de Owren, pH 7,35, guardado a 4oC. 4 Reagente para realizao do TTPa: Cefalina: podendo ser usada a ativada com cido elgico (Cefamat-Biolab), para permitir a leitura em coagulmetro. Cloreto de Clcio 0.025 M. Os reagentes 3 e 4 devem permanecer 37oC. Procedimento: 1 Preparao da curva padro: O Pool de plasmas normais diludo em tampo de Owren e so mantidas em banho de gelo.

75 Diluio do Pool de Plasma normal para construo da curva padro Tubo 1 2 3 4 5 6 7 Atividade 100% 50% 25% 12,5 6,25% 3,125% 1,56% Diluio 1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 PPP 400l 1000l do tubo 1 1000l do tubo 2 1000l do tubo 3 1000l do tubo 4 1000l do tubo 5 1000l do tubo 6 Tampo 1.600l 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l 1000l

2 Colocar nos tubos de ensaio, no coagulmetro, nesta ordem: 100l do plasma deficiente; 100l do Cefamat; 100l da diluio a ser testada; Incubar exatamente por 5 minutos, ao fim dos quais pipetar: 100l de CaCl2 0,025M. Anotar o tempo de coagulao. 3 Os plasmas dos pacientes a serem testados so diludos como para 100% de atividade, ou seja, uma diluio de 1:5. Caso o tempo seja muito curto, o diluio pode ser maior, para que o tempo caia dentro da curva. 4 As determinaes devem ser feitas em duplicata ou triplicata, registrando-se a mdia dos valores obtidos. 5 Os resultados so colocados em papel di-log. A curva traada, e o valor para os pacientes lido na curva. 6 No deixar o plasma deficiente com o Cefamat por muito tempo, no mais do que meia hora. Muito cuidado com as pipetagens, para no contaminar os reagentes.

76 Dosagem do Fator V:

Princpio: A dosagem do fator V obedece ao mesmo princpio. O plasma deficiente em fator V pode ser obtido por imunoadsoro (Lab. Dade), ou ser preparado no laboratrio, atravs do envelhecimento do plasma normal. E ento verificada a capacidade de um plasma corrigir o TP de um plasma deficiente em fator V.

Reagentes: 1 Pool de plasmas normais, colhidos em citrato de sdio. O plasma pode ser congelado ou fresco. O fator V perde atividade com o tempo, quando congelado a 20o C. 2 Tampo de Owren, como usado para dosagem do fator VIII. 3 O plasma deficiente em Fator V obtido da seguinte maneira: a) colher sangue total em oxalato de sdio, 1.34%, na proporo de 1 volume de anticoagulante para 9 volumes de sangue. O Fator V menos estvel em oxalato do que em citrato de sdio. Centrifugar o sangue para obter o PPP. Verificar o TP e o TTPa de cada plasma. b) fazer um Pool dos plasmas normais e colocar em tubo plstico e absolutamente limpo, em banho-maria 37o C. c) incubar durante 24 h e verificar o TP. Que deve estar entre 60 e 80 segundos. d) aliquotar este plasma em alquotas de 1ml e este ser o plasma deficiente em fator V. e) se o TP em 24 h for menor do que 60 segundos, incubar ainda algumas horas. Se for maior do que 80 segundos, desprezar o plasma. 4 Reagente para realizao do TP:

Tromboplastina: Usar o reagente comercial (Replastin). Reconstituir o frasco com 1 ml de gua destilada e esperar 5 minutos para estabilizao. Esta preparao estvel por 21 dias 4oC. Fazer um Pool se vrios frascos forem utilizados. CaCl2 0,025M.

Procedimento: 1 Preparao da curva padro:

77 Um Pool de plasma normais, colhidos em citrato de sdio, diludo em tampo de Owren e as diluies so mantidas em banho de gelo. Diluio do Pool de Plasma Normal: Tubo 1 2 3 4 5 Atividade 100% 50% 25% 12,5 6,25% Diluio 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 PPP 200l 1000l do tubo 1 1000l do tubo 2 1000l do tubo 3 1000l do tubo 4 Tampo 1.800l 1000l 1000l 1000l 1000l

2 O plasma a testar diludo 1:10, como para o tubo 1 da curva padro. 3 Pipetar no tubo de ensaio, no coagulmetro, na seguinte seqncia: 100l do plasma deficiente; 100l da Tromboplatina; 100l da diluio previamente aquecida 37oC; Incubar por 30 segundos; 100l de CaCl2; Anotar o TP 4 Construir a curva em papel di-log, interpolar os resultados dos plasmas a serem testados. Pesquisa de Anticoagulante Circulante:

O anticoagulante circulante ou inibidor da coagulao, representado por um anticorpo, geralmente da classe IgG, que interfere no processo da coagulao, podendo ser detectado nos testes in vitro. A natureza deste inibidor varivel, podendo aparecer em pacientes p ortadores de deficincias congnitas de alguns fatores, como a hemofilia A, por exemplo, onde a presena do anticorpo secundria exposio do indivduo a uma protena que ele no produz. O inibidor pode ser tambm de natureza auto-imune, como o caso do anticorpo antifosfolipdeo, tambm conhecido como anticoagulante lpico. Este anticorpo dirigido contra fosfolipdeos, o que faz com que ele interfira com o reagente utilizado nos teste in vitro como a

78 Cefalina e a Tromboplastina, prolongando os tempos de coagulao, embora no haja inibio da coagulao in vivo. A deteco destes inibidores obedece ao mesmo princpio geral. Existe o prolongamento do tempo de coagulao pela presena do inibidor, o que no corrigido pela adio de plasma normal. Isso serve para diferenciar um prolongamento do tempo de coagulao por causa da deficincia de um determinado fator, pois neste caso, o tempo seria plenamente corrigido pela adio de um plasma normal. Os inibidores contra os fatores da Via Intrnseca ou Comum so melhores avaliados pelo TTPa. A pesquisa deve ser feita sempre que houver prolongamento do TTPa, isto , quando a relao Plasma Doente/Plasma Normal for maior que 1,25. Faz se ento uma mistura em partes iguais do plasma do doente com o plasma normal, repetindo-se o TTPa. No caso de deficincia de fator, o TTPa da mistura deve ser totalmente corrigido, caindo para um valor menor do que 1,25. No caso da presena de um inibidor o TTPa da mistura permanecer maior do que 1,25. Existem alguns inibidores, como o caso do inibidor do fator VIII que ocorre aps imunizao em hemoflicos ou como em um autoanticorpo em algumas doenas auto-imunes, que tem uma ao lenta e progressiva. Nestes casos, pode ocorrer a correo imediata do TTPa a despeito da presena do inibidor. Por este motivo importante a realizao do TTPa imediatamente aps se fazer a mistura do plasma do doente com o plasma normal em parte iguais (M1) e tambm aps a incubao desta mistura por 1 ou 2 horas 37oC (M2), o que permitir que a ao inibidora seja evidenciada. Exemplo do Resultado de uma Pesquisa de Deficincia de fator Anticoagulante circulante: TTPa Doente/TTPa normal: 1.76, 1.79 e 1.81 TTPa M1 (Plasma Doente + Plasma Normal sem incubao)/TTPa Normal: 1,12; 1,65 e 1.23 TTPa M2 (Plasma Doente + Plasma Normal incubado/2 horas a 37 oC)/TTPa Normal: 1,24; 1,68 e 1,70

MONITORAMENTO DA ANTICOAGULOTERAPIA

O tratamento anticoagulante pode ser feito com a administrao de heparina em dose alta por via intravenosa, na fase inicial, seguida da administrao profiltica de drogas anticoagulantes orais, os anti-vitamina K (AVK), por tempo prolongado. Qualquer um desses tratamentos deve ser adequadamente monitorizado por meio de testes laboratoriais destinados a avaliao da heparinemia e ao controle do tratamento com anti-vitamina K.

79 Monitoramento da heparinemia: A heparina um mucopolissacarde formado pela polimerizao de vrias unidades de cido urnico e glicosamina, com PM variando de 3.000 a 40.000 D. A ao anticoagulante da heparina se faz atravs da sua interao com a antitrombina III (ATIII), um inibidor natural que bloqueia fatores da coagulao ativados, especialmente a Trombina e o fator Xa. A ATIII um inibidor de ao lenta e progressiva, entretanto, quando ela est ligado heparina, a velocidade de inibio enormemente aumentada e o efeito anticoagulante imediato. O uso da heparina como tratamento anticoagulante feito pela sua administrao intravenosa, em altas doses, o que capaz de alterar testes laboratoriais usados para monitorizao do efeito de uma determinada dose. O uso profilctico em dose baixa por via subcutnea, no leva a nveis plasmticos capazes de alterar testes de laboratrio, de modo que a monitorizao da dose no pode ser feita pelos testes convencionais. O monitoramento da dose da heparina pode ser feito por vrios testes: Os Testes globais, os que avaliam a ao da heparina na cascata da coagulao como um todo: (a) Tempo de Coagulao ou TC. um teste sensvel quando realizado de forma adequada, 37oC e de forma padronizada; (b) Tempo de Coagulao Ativado TCA. realizado com sangue total na presena de Celite, sendo mais sensvel que o TC, especialmente em altas concentraes de heparina; (c) Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada ou TTPa. o teste que melhor se correlaciona com a heparinemia. realizado com o plasma pobre em plaquetas, sendo o teste de escolha para monitorar a heparinemia; (d) Tempo de Trombina ou TT. um teste sensvel, mas no mantm uma correlao to linear, especialmente em concentraes mais altas de heparina; e (e) Testes Especficos: so testes que avaliam a ao da heparina diretamente sobre as enzimas que ela inibe, atravs de substratos cromognicos. Eles podem estimar a atividade antitrombina ou anti-IIa e a atividade antiXa da heparina. A utilizao do TTPa para monitorar a heparina deve ser padronizado para cada reagente, e em cada laboratrio. Esta padronizao baseia-se na construo de uma curva de heparinemia in vitro, a partir de um Pool de plasmas normais, no intuito de se avaliar a sensibilidade do reagente a um determinado nvel de heparina no plasma. A escolha da heparinemia para garantir uma boa anticoagulao baseada em dados empricos, e est em torno de 0,3 a 0,4 unidades de heparina por ml de plasma. A construo da curva permite saber, para um dado reagente, o quanto se deve prolongar o TTPa do paciente em relao ao normal, para que a heparinemia eficiente seja atingida. A curva de heparinemia construda avaliando-se o TTPa de um Pool de plasmas normais ao qual foram adicionadas concentraes fixas de heparina. So feitas as seguintes

80 concentraes finais de heparina: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5 U/ml. Para tanto, a soluo estoque de heparina ser adicionada ao Pool de plasmas, na proporo de 100l da soluo para 900l de plasma. As solues estoque de heparina so preparadas a partir de uma soluo me contendo 5000 U/ml de heparina. O TTPa realizado para cada diluio e para o Pool de plasma normal sem h eparina, usando-se o reagente escolhido para a rotina do laboratrio. Os resultados so expressos como a relao entre o TTPa do Pool de Plasma normal contendo heparina e o TTPa do Pool de plasma normal sem heparina. Os resultados so expressos para cada nvel de heparinemia e so colocados em um papel log-log, para traar a curva. A faixa teraputica para cada reagente definida como o prolongamento do TTPa que corresponde a uma heparinemia entre 0,3 e 0,4 U/ml. Os dados abaixo, exemplificando o que foi exposto com dados reais obtidos com dois reagentes em um dado laboratrio. Heparinemia 0 U/ml 0,1 U/ml 0,2 U/ml 0,3 U/ml 0,4 U/ml 0,5 U/ml Relao TTPa (Reagente 1) 1,0 1,10 1,60 2,14 2,87 3,94 Relao TTPa (Reagente 2) 1,00 1,08 1,29 1,95 2,43 2,84

Pela curva obtida, pode-se concluir que a heparinemia adequada corresponde a um TTPA entre 2.,14 e 2,87 para o reagente I e entre 1,95 e 2,43 para o reagente II. Monitoramento do Tratamento AVK: O monitoramento laboratorial da anticoagulao oral com drogas AVK o Tempo de Protrombina ou TP, que o teste mais sensvel deficincia dos fatores dependentes de vitamina K. O TP pode ser expresso em segundos, em relao TP plasma Doente/TP plasma Normal, ou, como mais usual em porcentagem de Atividade de Protombina ou AP. Foi baseado no valor da AP, que os ingleses definiram a zona de anticoagulao adequada para paciente em uso de AVK, como profilaxia de trombose venosa. Esta zona foi definida como sendo em torno de 30 %, e este valor foi adotado mundialmente. Entretanto, os ingleses utilizavam como reagente para

81 determinao do TP, uma Tromboplastina preparada com o crebro humano, que bastante sensvel deficincia dos fatores dependentes de Vitamina K. Os autores americanos utilizavam uma Tromboplastina derivada de crebro de coelho, que menos sensvel, o que faz com que as zonas teraputicas sejam diferentes para cada reagente considerado. Isto ficou evidente quando os resultados foram comparados, pois os americanos, adotando a zona teraputica de 30%, administravam doses maiores de AVK e tinham mais complicaes hemorrgicas. Na verdade, a AP de 30% obtida com a Tromboplastina de crebro humano corresponde a uma AP de cerca de 45% com a Tromboplastina de crebro de coelho. Esta constatao demonstrou a necessidade de ser padronizar os resultados obtidos com reagentes de origens diferentes, de modo a se estabelecer um modo de expresso comum e utilizvel por todo mundo. Esta padronizao feita atravs da determinao do Indice de Sensibilidade Internacional ou ISI de cada reagente. O seu clculo feito para cada lote, realizando-se o TP de plasmas de pacientes em tratamento AVK estvel, usando a Tromboplastina a testar e a Tromboplastina de referncia, que a Tromboplastina inglesa. Isto permite a construo de uma curva e o clculo do ISI feito usandose a inclinao desta reta. Na prtica o fabricante da Tromboplastina quem realiza esta padronizao e o ISI, calculado para cada lote, fornecido na bula do reagente. Uma vez conhecido o ISI, pode-se calcular o chamado RNI ndice Normatizado Internacional. Este valor corresponde relao entre o TP do plasma doente e o TP do plasma normal, caso houvesse utilizado a Tromboplastina de referncia. Assim, qualquer que seja a sensibilidade do reagente utilizado, o nvel de anticoagulao, avaliado pelo RNI sempre o mesmo. O Clculo do INR feito pela seguinte frmula: RNI = (TP DO PACIENTE/ TP DO POOL DE PLASMAS NORMAIS)ISI

Por exemplo: Se o TP do doente foi de 23,4 segundos, e o TP do normal foi de 14,6 segundos, e se o ISI do lote da Tromboplastina for de 1,53, o RNI ser igual a 2,0. Este valor significa que o TP do doente duas vezes maior o TP do normal, caso se tivesse utilizado a Tromboplastina de referncia. A expresso do resultado em RNI cabe ao laboratrio que realiza o teste. Atualmente, os reagentes disponveis no mercado so padronizados em relao Tromboplastina de referncia, e o ISI est impresso em cada lote. Com esta padronizao pode-se definir um nvel de anticoagulao desejada para cada situao clnica, e o ajuste da dose de anticoagulante oral, deve ser feito baseado nisso. O nvel adequado foi determinado atravs de estudos clnicos e pode ser resumido na seguinte tabela 3.

82 Tabela 3: O nvel adequado de RNI de acordo com cada condio Clnica. Alvo Preveno de trombose venosa Preveno de trombose venosa recorrente Preveno de tromboembolismo arterial Faixa 2,52 a 3,0 3,02 a 4,0 3,53 a 4,5

O RNI acima de 5,0 est associado a um risco muito grande de sangramento. importante se Ter em mente que a expresso dos resultados em INR s tem sentido quando se trata de pacientes em uso de drogas AVK. A expresso dos resultados do TP em outras situaes clnicas deve ser feita pelo AP ou pela relao TP doente/TP normal. Isto porque a padronizao feita baseada na diferena de sensibilidade dos reagentes deficincia especfica dos fatores vitamina K dependentes.

DISTRBIO HEMOSTTICO POR VENENO DE SERPENTE Coagulao intravascular disseminada e fibrinlise em pacientes picados por serpentes venenosas. Os venenos de serpente mostram atividades fisiopatolgicas do tipo coagulante, proteoltica, hemoltica e neurotxica. Somente as atividades relacionadas ao dos venenos no mecanismo hemosttico que sero comentadas e para facilitar a exposio ser apresentada uma subdiviso, de forma bastante resumida na FIGURA 35. As aes do veneno podem estar relacionadas com: a) Relacionado com o mecanismo da coagulao: - Atuao direta sobre o FX - Atuao direta sobre a protrombina (gerando trombina) - Atuao direta sobre o fibrinognio (produzindo fibrina) b) Relacionado com a plaqueta: - Consumo de plaquetas pela ativao da coagulao - Atuao direta sobre as plaquetas c) Relacionado com o mecanismo fibrinoltico: - Secundria formao da fibrina (fibrinlise de trombo) - Ativao direta do mecanismo fibrinoltico (fibrinlise primria)

83 d) Relacionado com o vaso: - Leso da parede vascular (protelise das protenas da membrana basal)

FIGURA 35: Diferentes modos de ao dos venenos de serpente no mecanismo hemosttico. A = ativando o FX, B = ativando o FII, C = atuando diretamente sobre o fibrinognio, D = agregando as plaquetas, E = ativando diretamente o mecanismo fibrinoltico, F = lesando o vaso sangneo (protelise)

Um mesmo veneno pode agir em pontos diversos do mecanismo hemosttico e com intensidade varivel, dependendo da caracterstica do tipo do veneno e da sua dose. Existia muita contradio acerca do modo de ao do veneno, isso se deve ao fato de que diferentes concentraes foram usadas nas pesquisas in vitro e in vivo. O melhor modo para se entender a ao dos venenos de serpente analisar o tpico veneno coagulante e proteoltico, o veneno da Bothrops jararaca. O veneno botrpico ao infundir lentamente na circulao desfibrina o sangue, tanto pela gerao de trombina como pela ao direta sobre o fibrinognio. Se a infuso rpida e a dose total pequena, essa desfibrinao precedida de hipercoagulabilidade que perdura por alguns minutos. Se a dose elevada, e se for via venosa, h morte rpida por coagulao intravascular macia dentro de minutos, seguida de liquefao do sangue pela fibrinlise posterior. Se a dose injetada for superior a 0.4 mg/kg de peso corporal, ocorre coagulao imediata e macia, produzindo morte em poucos minutos. Assim, se compreende que o encontro de sangue incoagulvel em indivduo picado por serpente, indcio de que penetrou na circulao uma dose razovel de veneno (igual ou superior a 0.1 mg/kg).

84 Importante trabalho foi desenvolvido por Nahas e cols. com os venenos das seguintes serpentes: Echis colorata, Bothrops atrox, Bothrops jararaca, Crotalus terrificus, Akistrodon rhodostoma, Trimeresurus purpureomaculata, Bitis gabonica e Vipera russelli. Os resultados permitiram definir a intensidade e os diversos pontos de ao no mecanismo da coagulao conforme demonstra o Quadro 4. Esses autores evidenciaram, ao usar o veneno de E. colorata, uma ao fibrinogenoltica rpida e potente, ou seja, ativao direta do mecanismo fibrinoltico. Posteriormente, foi isolado uma frao fibrinoltica desse veneno.

Quadro 4: Ao dos venenos de alguns tipos de serpentes segundo Nahas e cols. (10). (*) = Ativao do mecanismo fibrinoltico TIPO DE SERPENTE
V. russelli B. atrox B. jararaca E. colorata A. rhodostoma C. terrificus T. purpureomaculata B. gabonica

ATIVAO DO FATOR X ++++ +++ ++ ++ + 0 0 0

ATIVAO DO FATOR II 0 0 0 ++++ 0 0 0 0

AO DIRETA SOBRE O FATOR I 0 +* ++ * 0* ++++ * + +* 0

Pacientes picados por E. carinatus apresentam trombocitopenia (mnimo de 24.000/mm de sangue), fibrinognio em 5 mg/100ml, prolongamento do tempo de protrombina, anemia (volume globular mnimo de 23%), hemcias fragmentadas, presena de monmeros de fibrina e queda dos fatores V e FVIII. Nestes pacientes a resposta da heparina foi rpida com bloqueio da coagulao e da agregao plaquetria. Desta forma, pode-se concluir que a agregao plaquetria dependeu da ao da trombina e que as alteraes sangneas foram conseqncia da ao direta do veneno sobre a protrombina. Estudos mostram que a incoagulabilidade do sangue produzida pela A. rhodostoma, devese, principalmente, ao direta do veneno sobre o fibrinognio com liberao apenas do fibrinopeptdio A. Estudos verificaram que a frao polipeptdica desse veneno proporciona, inicialmente, a queda do fibrinognio no plasma com formao de fibrina e sua posterior lise. Fato idntico parece ocorrer com os venenos da C. adamanteus e da E. colorata.

85 Estudos sobre a ao do veneno da E. colorata em cobaias mostraram que a desfibrinao se d por dois modos: ativao direta do mecanismo fibrinoltico na circulao (fibrinlise primria) e desencadeamento da fibrinlise no trombo de fibrina (fibrinlise secundria). Se pequena quantidade de veneno injetada, esse ltimo mecanismo o mais importante para a desfibrinao e, por ser a hipercoagulabilidade de pouca intensidade, nenhum trombo encontrado. Desta forma, pode-se observar que a leso da parede vascular produzida pelo veneno de importncia primria e que os distrbios da coagulao contribuem para agravar a hemorragia. As serpentes venenosas existentes no Brasil pertencem a 4 gneros: Crotalus (cascavel), Bothrops (jararaca), Micrurus (corais venenosas) e Lachesis (surucucu). Por ordem de freqncia as causadoras de acidentes so: B. jararaca, C. durissus terrificus, B. jararacussu, B. alternata, B. neuwiedi e B. atrox. As picadas de corais venenosas so muito raras. No Hospital Vital Brasil, do Instituto Butantan, em So Paulo, cerca de 90% dos atendimentos por picadas de serpentes venenosas referem-se ao gnero Bothrops. A mortalidade dos indivduos picados por este tipo de serpente, quando no recebem antiveneno, de cerca de 8% caindo para 0.768% com a soroterapia. A percentagem das picadas por cascavel de 8.59% com 72% de mortalidade para os no tratados com antiveneno e 11.49% para os que receberam esse tratamento.

Tratamento: 1 - Afastamento da causa Consiste na neutralizao da ao do veneno e na tentativa de diminuir a quantidade do mesmo, atravs de suco no local da picada nos primeiros minutos. a) Casos com sintomatologia discreta: 50 unidades por via sub-cutnea. b) Casos com sintomatologia intensa: 50 unidades por via sub-cutnea e 50 unidades por via venosa. c) Casos de mxima gravidade: 150 a 300 unidades como dose total, sendo 70 unidades por via sub-cutnea e o restante por via venosa. Existem dois graus extremos de sintomatologia que servem para avaliar a gravidade do caso e orientar a teraputica com antiveneno: A) Benigno: depois de duas horas, sangue coagulvel. Pequena reao local. No h risco de vida nem de necrose. B) Grave: sangue incoagulvel. Reao local moderada ou intensa. Possibilidade de necrose local. Risco de vida por choque com colapso perifrico dentro dos primeiros trs dias e,

86 tambm, por hemorragia renal intensa, ou derrame no sistema nervoso, ou acidente vascular cerebral.

2 - Reposio dos fatores e das plaquetas Aps teraputica com antiveneno, a regenerao do fibrinognio ocorre em poucas horas, tanto no homem como nos animais de experincia. Se houver necessidade de elevar os fatores da coagulao e das plaquetas, seguir as mediadas apresentada no tratamento geral da coagulao intravascular disseminada.

3 - Anticoagulao e antifibrinlise Como mostrado anteriormente, os venenos de serpentes podem formar trombina e/ou atuar diretamente sobre o fibrinognio levando formao de uma fibrina que difere daquela formada pela trombina. Pela ao do veneno, d-se a liberao apenas do fibrinopeptdio A. Esse tipo de monmero sofre somente polimerizao longitudinal e mais suscetvel ao ltica da plasmina. fato conhecido que a heparina no tem capacidade de bloquear a ao direta do veneno sobre o fibrinognio (11). Quando o veneno gera trombina, a heparinizao pode ser seguida da elevao dos fatores e das plaquetas no sangue. H estudos que mostram a incapacidade de bloquear in vivo, por meio da heparina, a sndrome de desfibrinao produzida pelo veneno da B. jararaca que alm de atuar diretamente sobre o fibrinognio, gera trombina aps ativar o Fator X. Assim, a heparinoterapia no deve ser usada na picada de serpente. Como conseqncias da ao direta do veneno sobre o fibrinognio temos a desfibrinogenao e a circulao de produtos de degradao devido lise da fibrina formada. Pode-se considerar ambas alteraes como antagnicas hipercoagulabilidade o que acarretam certa proteo ao organismo. Por outro lado, a severidade do quadro clnico no est relacionada alterao sangnea e sim a outros efeitos do veneno que so prontamente neutralizados pelo antiveneno.

DISTRBIO HEMOSTTICO NAS SEPSES

Introduo Ainda no existe consenso sobre a definio de sepse. Entretanto, em 1991, as sociedades

87 SCCM/ESICM ao definirem as diferentes fases da sepse, conseguiram oferecer uma padronizao que, apesar de no ser perfeita, usada at hoje pela maior parte dos mdicos. Sero citadas algumas das definies, na tabela 5, que propiciam a identificao das fases da sepse, e que sero empregadas aqui: Tabela 5. Principais definies empregadas nesse tema.
a resposta inflamatria, sistmica, a uma ampla variedade de agresses clnicas severas, manifestada por duas, ou mais, das seguintes (SIRS) = systemic inflammatory response syndrome condies: 1) temperatura retal >38o C ou <36o C; 2) freqncia cardaca >90 batimentos/minuto; 3) freqncia respiratria >20 incurses/minuto ou PaCO2 <32mm Hg; 4) leucometria >12.000/mm e <4.000/mm, ou >10% de neutrfilos imaturos (bastes). 1) alterao aguda do estado mental; (IF/PO) Inadequadas funo/perfuso de rgo 2) hipoxemia - PaO2 <72mm Hg para FiO2 (frao de oxignio inspirado); sem doena pulmonar como causa; 3) elevao do nvel de lactato plasmtico; 4) oligria (diurese <30mL ou 0.5mL/kg por, no mnimo, 1 hora em paciente sondado.) Presso sistlica <90 mm Hg ou reduo de >40 mm Hg em relao Distrbio cardiovascular (MODS) = multiple organ dysfunction sydrome (CARS) = compensatory presso basal. Essas alteraes esto presentes apesar do tratamento de reposio lquida. Alterao da funo dos rgos em um paciente, severamente doente, e com impossibilidade de manter a homeostasia sem interveno. a reao anti-inflamatria desencadeada pelo organismo em resposta

anti-inflammatory reaction rao inflamatria.

A tabela 6 mostra as diversas fases da sepse, com os parmetros que as caracterizam, elaboradas por um painel realizado por SCCM/ESICM em 1991:

Tabela 6. Etapas clnicas desencadeadas pelos processos infecciosos

SEPSE Infeco com as reaes da SIRS; Mortalidade de 20% SEPSE SEVERA Reaes da SIRS combinadas com disfuno de rgos; Mortalidade de 40% CHOQUE SPTICO Reaes da SIRS, disfuno de rgos e distrbio cardiovascular; Mortalidade de 60%

88 Fisiopatologia: At os meados da dcada de oitenta, aceitava-se que as alteraes que acompanham a sepse eram produzidas, diretamente, por substncias liberadas pelas bactrias. Em 1985, alguns autores sugeriram que essas alteraes decorriam das reaes inflamatrias produzidas pelo organismo, quando agredido pelas substncias liberadas pelas bactrias. Em 1997, alguns pesquisadores passaram a defender uma nova teoria, mostrando que as mltiplas alteraes apresentadas pelas diversas fases da sepse eram conseqncia, no s da reao de defesa do organismo, como tambm da ao de substncias que medeiam essas defesas, e da combinao de ambas. Na tabela 7, est apresentada a lista parcial de molculas com atividade pr-inflamatrias e anti-inflamatrias. Tabela 7: Molculas pr e anti-inflamatrias
MCP = Protena quimiotractante de moncito; PAI = Inibidor do ativador do plasminognio. Molculas pr-inflamatrias Molculas anti-inflamatrias

TNF-alfa IL-1 beta IL-2 IL-6 IL-8 IL-15 Neutrofilo elastase IFN-gama Proteinoquinase MCP-1 MCP-2 Fator inibidor da leucemia (Fator-D)

Tromboxane Fator ativador das plaquetas Molculas solveis de adeso Neuropeptdios vasoativos Fosfolipase A2 Tirosinoquinase PAI-1 Gerao de radicais livres Neopterin CD14 Prostaciclina Prostaglandina

IL-1 ra IL-4 IL-10 IL-13 Receptor de IL-1 TipoII Fator de transformao de crescimento-beta Epinefrina Receptores TNF-alfa solveis Receptor antagonismoLeucotriene B1 CD14 recombinte soluvel Lipopolissacardio ligado protena

Para organizar o nosso comentrio sobre fisiopatologia, apresentamos na FIGURA 36 a seqncia das diversas etapas a partir da eliminao de substncias pelas bactrias, at atingir a disfuno de rgos e, por fim, a falncia total. Como mostra a FIGURA 36, na etapa 1 esto as principais substncias, liberadas pelas bactrias, e que vo atuar nas clulas (etapa 2) responsveis pela produo dos mediadores pr e anti-inflamatrios (etapa 3). So esses mediadores, citados na Tabela 7, que vo levar a uma srie de reaes (etapa 4), comentada anteriormente. Como pode ser visto na etapa 4, a hipercoagulabilidade e a inibio da fibrinlise, vieram juntar-se s reaes pr e antiinflamatrias.

89

FIGURA 36: As diversas etapas que se seguem aps a ao das bactrias sobre os tecidos, terminando com a disfuno e/ou falncia dos rgos.

A partir da segunda metade da dcada de noventa, tem sido dada maior importncia aos distrbios da coagulao e da fibrinlise, como os responsveis pela disfuno e falncia dos rgos nas sepses. Em seqncia, na etapa 5, tem como resultante: trombo vascular, reao tecidual, aumento da permeabilidade vascular, quimiotaxia e ativao celulares. Na etapa 6 pode-se observar o resultado final dos distrbios mencionados anteriormente, a disfuno de rgos at a falncia total.

Distrbio da coagulao e da fibrinlise nas sepses. Como foram mostrados no tpico sobre Hemostasia, os mecanismos da coagulao, anticoagulao, fibrinlise e antifibrinlise, so mantidos em equilbrio nos estados de normalidade. Para facilitar o entendimento da interao desses mecanismos, mostramos na FIGURA 37 os fatores da coagulao que fazem parte da via extrnseca e os seus inibidores.

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FIGURA 37. Em azul os fatores da coagulao e em vermelho os anticoagulantes; SH = Sulfato de heparam; TFPI = Inibidor da via do fator tecidual; TF = Fator tecidual; ATIII= Antitrombina III; TM= Trombomodulina; PC= Protena C; PS= Protena S e IIa= Trombina.

A ATIII ao formar complexos com vrios fatores da coagulao, particularmente com os fatores II, IX, X e XI, os inativa. Essa inativao potencializada pela heparina e pelo sulfato de heparam (molcula semelhante heparina que est presente na superfcie da clula endotelial). A PC torna-se uma protease ativa ao formar um complexo com a TM (protena presente na superfcie da clula endotelial) e o FIIa (trombina), sendo auxiliada pelo co-fator PS. A PCa promove a protelise dos fatores V e VIII inibindo, desse modo, a gerao de trombina. O TFPI forma um complexo com o TF e o FVII que inibe o FX. Entretanto, nas sepses, esse equilbrio quebrado com a exacerbao da hipercoagulabilidade e a conseqente formao de trombos na microcirculao. As alteraes responsveis por esse desequilbrio so constitudas por: a) Ativao do mecanismo de coagulao: observaes clnicas tm demonstrado que, nas sepses, o mecanismo de coagulao ativado pelo caminho extrnseco e no pelo intrnseco. Desse modo, a ao de citocinas procoagulantes, citadas anteriormente, promovem a exposio do fator tecidual (TF) pela clula endotelial. A exposio do TF aps a injria dos tecidos, tem incio a exacerbao da coagulao at a gerao da trombina que a responsvel pela formao do trombo de fibrina. b) Hipoativao dos mecanismos de anticoagulao: h indcios de que a anticoagulao est diminuda nas sepses, colaborando desse modo para o incremento da hipercoagulabilidade. Esmon e Esmon mostram que o complexo formado pela trombomodulina, protena C e protena S

91 torna-se hipoativo quando o endotlio vascular sofre injria. Por outro lado, a antitrombina III tem seus nveis reduzidos em muitos pacientes com sepse. H suspeitas de que o TFPI esteja reduzido nos estados spticos, o que colaboraria para a instalao da hipercoagulabilidade. c) Supresso da fibrinlise: decorrente da ao de citocinas, a atividade do PAI-1 est aumentada, acarretando a diminuio do ativador do plasminognio tecidual (tPA). A diminuio da atividade fibrinoltica associada diminuio da anticoagulao concorreriam para a facilitao da instalao de trombos de fibrina. importante ressaltar que h uma relao direta entre as diversas fases da sepse e a intensidade da formao dos trombos e da reao tecidual. A fase mais avanada est relacionada intensa trombose dos vasos de pequeno calibre e, conseqentemente, maior disfuno de rgos ou falncia total. Diagnstico Laboratorial dos Distrbio da Hemostasia nas Sepses Logicamente, de se esperar que as alteraes laboratoriais dependam do estgio em que se encontra a sepse. Com freqncia, na fase inicial da sepse, comum no encontrarmos alteraes nos testes para estudo da hemostasia. Entretanto, o D-dmero, teste que acusa lise de fibrina, j pode ser positivo nas fases iniciais, sem contudo haver alterao dos demais testes para a hemostasia. Esse teste de grande sensibilidade, porm, no especfico para acusar presena de trombo na microcirculao, j que a lise de fibrina extravascular, decorrente do derrame hemorrgico, torna o teste positivo. A quase totalidade dos pacientes com sepse avanada apresenta elevao do nvel do D-dmero. O teste da lise de euglobulina, para estudo da atividade fibrinoltica na circulao sangnea, com freqncia, normal ou est ampliado (hipoatividade fibrinoltica sistmica). Os nveis de Protena C, Protena S e de Antitrombina III podem cair no incio da instalao da sepse e suas alteraes esto relacionadas severidade da infeco, servindo, inclusive, como marcadores de mal prognstico. na fase de choque sptico, quando a coagulao intravascular disseminada pode estar presente, e os microtrombos esto disseminados, que vamos encontrar grandes alteraes nos testes para estudo da hemostasia. Alm dos j mencionados, h aumento do PT, PTT, monmero de fibrina, e esto reduzidos os nveis do fibrinognio plasmtico e das plaquetas.

Teraputica dos distrbios hemostticos. A teraputica do choque no pertinente a este tema. Ser comentado, exclusivamente, sobre o tratamento dos distrbios da hemostasia no paciente com sepse. Entretanto, fica ressaltado que o combate ao microorganismo causador da

92 infeco e aos demais distrbios por ele causado, bem como a rapidez no incio do tratamento, so imprescindveis para se obter sucessos. A ativao do mecanismo da coagulao, com falha dos mecanismos de anticoagulao e de fibrinlise e a conseqente formao de microtrombose, sendo as principais alteraes nas sepses, tm levado os pesquisadores a tentar a correo desses distrbios. Mas, como veremos, essa conduta no tem trazido resultados animadores e os poucos trabalhos que mostram algum benefcio, ainda requerem comprovao. Mesmo assim sero apresentados alguns comentrios sobre as opes de tratamento nas sepses: 1) O emprego da forma recombinante do inibidor da via do fator tecidual (TFPI), parece reduzir a mortalidade, particularmente, dos pacientes com sepse severa. Os estudos com esse produto esto em andamento. 2) A Anti-trombina III (AT-III), que tem a propriedade de inibir a trombina, pode influenciar diretamente a permeabilidade capilar atravs da induo de prostaciclina (PGI2). O emprego teraputico da AT-III tem mostrado resultados promissores, embora um estudo com mais de 2300 pacientes no confirmaram bons resultados. O emprego da Proteina C (PC), que ajuda a interromper o ciclo da coagulao e da inflamao, tambm tem sido um meio teraputico promissor. 3) A Proteina C ativada (PCa), que inativa os fatores da coagulao Va e VIIIa, bloqueia a gerao de trombina, neutraliza o PAI-1 e aumenta o tPA, e tem tambm ao anti-inflamatria, tem sido intensamente pesquisada na sua forma recombinante. Tambm com esse produto os resultados tm sido animadores. Em suma, at agora no h qualquer tratamento, comprovadamente efetivo, dirigido para os distrbios hemostticos nas sepses.

COAGULAO INTRAVASCULAR DISSEMINADA: Introduo: No captulo sobre hemostasia, foi demonstrado que o mecanismo hemosttico constitudo da interao dos sistemas de coagulao, de fibrinlise, de anticoagulao e de atividades relacionadas parede dos vasos sangneos. A quebra do equilbrio dinmico entre esses componentes leva s diteses hemorrgicas. fcil entender o mecanismo fisiopatolgico de alguns distrbios hemorrgicos em virtude da simplicidade da alterao que os causam. Por exemplo, nas hemofilias A e B, a razo para o distrbio est na deficincia dos fatores VIII e IX, respectivamente. Na prpura trombocitopnica, a diminuio do nmero das plaquetas no sangue explica o transtorno.

93 Entretanto, na coagulao intravascular disseminada (CID) as alteraes fisiopatolgicas no so to simples assim. Desta forma, uma explicao mais detalhada ser dada: Na CID os quatro componentes citados apresentam-se alterados, porm, com variao do distrbio em cada componente, na dependncia da etiologia de cada caso. importante assinalar que a CID manifesta-se clinicamente de dois modos distintos: com microtrombose em diversos rgos e a conseqente hipofuno ou falncia total dos mesmos e, com hemorragias em diversas partes do corpo e a conseqente hipovolemia, podendo chegar ao choque. Na primeira circunstncia, as alteraes decorrem do predomnio da ativao do mecanismo da coagulao sobre o da fibrinlise, e na segunda, o predomnio do mecanismo fibrinoltico o responsvel pelo distrbio. importante salientar que a CID no uma doena e sim uma sndrome, j que os distrbios citados so secundrios a diferentes causas, apesar de que em raros casos, no se consegue identificar qualquer etiologia, particularmente na fibrinlise isolada (fibrinlise primria idioptica).

Fisiopatologia: Na quase totalidade das vezes, a manifestao clnica, decorrente da microtrombose generalizada, conseqncia da ativao do mecanismo da coagulao que tem inicio pelo caminho extrnseco, s custas do fator tecidual (FT). Esse fator fica exposto quando a clula endotelial ativada pela trombina, ou por outras substncias; ou quando os constituintes da parede vascular e/ou o tecido perivascular entram em contato com o sangue aps leso do endotlio. Por outro lado, o nvel de FT pode ficar elevado na circulao ao ser liberado por diversos tipos de clulas malignas, como as da leucemia promieloctica. As clulas malignas, tambm, podem liberar outros tipos de substncias com atividade tromboplstica. Nas infeces, o nvel de FT, no sangue, pode estar elevado devido ao de: endotoxina, fator de necrose tumoral (TNF), interleucina-1 e de outras substncias, geradas nos processos inflamatrios, sobre a clula endotelial. O FT fica livre no sangue circulante quando a sua concentrao ultrapassa o nvel de seu inibidor especfico, o inibidor da via do fator tecidual (TFPI = tissue factor pathway inhibitor). Como foi mostrado no captulo Hemostasia, a ativao da coagulao pelo FT conduzir gerao de trombina, que o agente principal da formao dos microtrombos de fibrina.

94 claro que em casos patolgicos a trombina gerada em quantidade superior do estado fisiolgico, o que impossibilita sua neutralizao pelos inibidores. Por outro lado, a insuficincia do mecanismo fibrinoltico defensivo, contribui para a falta de remoo da fibrina na microcirculao. Tambm colabora para a deposio de fibrina na microcirculao, o aumento do principal inibidor da fibrinlise, o inibidor do ativador do plasminognio tipo 1 (PAI-1). Em algumas situaes, o incio da ativao da coagulao pode se dar pelo caminho intrnseco. O FXII pode ser ativado pela endotoxina, complexo antgeno-anticorpo, mbolos de gordura e queimaduras. A manifestao clinica por hemorragia decorre, principalmente, quando a ativao do mecanismo fibrinoltico supera a da coagulao. O mecanismo fibrinoltico ativado, fisiologicamente, sempre que a coagulao ativada. Esse tipo de ativao denominado de fibrinlise defensiva. Ela defensiva porque promove a lise da fibrina formada indevidamente, ou do trombo hemosttico quando sua funo estiver completada. Entretanto, em casos patolgicos, a fibrinlise pode ser ativada excessivamente, na circulao, ao invs de se fazer, apenas, nos locais onde se forma o trombo hemosttico. Nesse caso, a fibrinlise, ao invs de trazer beneficio para o organismo, promover alteraes patolgicas provenientes do excesso de plasmina circulante. Como conseqncia da exacerbao do excesso de plasmina na circulao teremos a diminuio do nvel de diversas protenas que tomam parte na coagulao e na fibrinlise. Os mais atingidos, quando o processo agudo, so: FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXIII, fibrinognio (FI), antitrombina III (AT-III), protena C (PC), alfa2-antiplasmina (alfa2-AP) e plasminognio, porm, somente nos processos agudos. Alm da queda do nvel dos fatores mencionados, outra razo para a hemorragia a destruio, pela plasmina, do trombo hemosttico no momento de sua formao. Tambm causa transtorno, para a formao do trombo hemosttico, a produo de produtos de degradao do fibrinognio e da fibrina pela plasmina (PDFs). Os PDFs comprometem a agregao plaquetria. importante destacar que, ao contrrio do que se pensa, a maior razo para a queda do nvel de algumas das protenas, citadas anteriormente, que tomam parte no mecanismo hemosttico, no decorre da ao da trombina, e sim da lise pela plasmina. Por outro lado, nos processos agudos, devido ao da trombina sobre as plaquetas, a trombocitopenia um achado freqente. A exacerbao do mecanismo fibrinoltico no responsvel por essa alterao. Todas as referncias, acima, relacionam-se CID de intensidades moderada e intensa (CID aguda). Entretanto, quando o processo de pouca intensidade e de

95 evoluo lenta, e com poucas complicaes, a CID dita crnica. Nesse caso, como o consumo (ou lise) dos fatores e de plaquetas pouco intenso, a exacerbao, compensatria, da produo dos elementos atingidos, promove a elevao de seus nveis. Esse fenmeno conhecido como rebote. Enquanto nas CIDs de evoluo aguda a hemorragia um sintoma freqente, nas de evoluo crnica destacam-se os fenmenos microtrombticos. No Quadro 5 apresentamos as diversas causas que freqentemente esto associadas s CIDs aguda e crnica.

Diagnstico laboratorial: Fazem parte do diagnstico laboratorial de CID dois grupos de exames: os exames que podem levar suspeita do distrbio e os que confirmam o diagnstico.

Exames que, quando alterados, levam suspeio de CID: Plaquetometria, tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPa) e dosagem do fibrinognio. Desse modo, quando houver alterao desses exames, e estiver presente uma das doenas referidas no Quadro 5, deve-se pensar em CID e, para esclarecimento, deve-se realizar os exames, que sero mencionados a seguir.

Exames que, quando alterados, levam confirmao de CID: Dosagem dos fatores da coagulao V, VII, VIII, IX, X, XIII e protena C: A queda do nvel sangneo de alguns desses fatores observada nas CIDs agudas e nas crnicas, verifica-se, mais freqentemente, elevao devido ao fenmeno de rebote. Dosagem da Antitrombina III (AT-III): O nvel da AT-III decresce devido sua ao neutralizadora sobre a grande quantidade de trombina gerada. Dosagem dos produtos de degradao da fibrina e do fibrinognio (FDP): um teste simples que mede a aglutinao de partculas de ltex. Apesar da baixa especificidade, de alta sensibilidade, estando elevado em 85-100% dos pacientes com ativao dos mecanismos de coagulao e de fibrinlise. Teste do D-dmero: Enquanto o teste dos FDP, quando positivo, indica que tanto a fibrina quanto o fibrinognio foram degradados, o teste do D-dmero especfico para indicao de que, apenas, a fibrina foi degradada enzimaticamente.

96 Quadro 5: Causas relacionadas s CIDs crnica e aguda.

AGUDAS:
- Infeco (bactria, virus, fungo, etc) - Doena maligna (leucemia, metstase no hematolgica, etc.) Obsttrica (descolamento prematuro de placenta, embolia de lquido amnitico, degenerao gordurosa aguda da gravidez, eclampsia) - Trauma - Queimadura - Veneno de serpente - Transfuso de sangue incompatvel - Falncia heptica aguda

CRNICAS:
- Maligna (leucemias, tumores slidos) - Obsttrica (feto morto retido) - Hematolgica (sndromes mieloproliferativas, hemoglobinria paroxstica noturna, sndrome hemoltica urmica) - Vascular (artrite reumatide, doena de Raynaud) - Inflamatria (colite ulcerativa, doena de Crohn, sarcoidose) - Aneurisma artico - Hemangioma gigante (sndrome de Kasabach-Merritt) - Rejeio aguda de transplante renal

No teste D-dmero empregado um anticorpo anti-domnio D-D do monmero de fibrina. , justamente, nesse domnio que se d a unio entre dois monmeros de fibrina, o que o torna especfico para acusar a presena de trombina. Apesar da alta especificidade para a presena da trombina, sua sensibilidade inferior a do teste dos FDP. Pesquisa de monmeros de fibrina: Em estado de normalidade o monmero de fibrina sofre polimerizao e forma o polmero de fibrina no trombo hemosttico. Quando produzido monmero de fibrina na circulao, ele forma complexos com fibrinognio e/ou com produtos de degradao da fibrina e do fibrinognio (PDF). Ao identificamos esses complexos, conclumos que h coagulao exacerbada em alguma parte do organismo, o que implica em dizer que pode depender da coagulao intravascular disseminada ou da localizada (trombo), ou de coagulao extravascular. O teste para identificao da presena dos monmeros de fibrina, na circulao, realizado adicionando-se protamina, ou etanol, ao plasma do paciente. Aps a adio dessas substncias, o

97 monmero de fibrina liberado do complexo e se une a outros monmeros (polimerizao). Com isso, forma-se uma tnue rede de fibrina. O teste de protamina, que mais fiel, acusa de 20-50 g/ml de monmero, e de 50-100 g/ml de PDF de grande tamanho. Esse teste simples e de grande sensibilidade. Dosagem de fibrinopeptdio A (FPA). Pode ser empregado o mtodo de ELISA ou de radioimunoensaio. Quando a trombina atua sobre o monmero de fibrina, libera fibrinopeptdios. Desse modo, o nvel elevado de FPA sinal de ativao do mecanismo da coagulao. Dosagem dos fragmentos 1+2 da protrombina (PF 1+2). Altos nveis desses fragmentos, medidos pelo mtodo ELISA, indicam que o FXa atuou sobre a protrombina. O nvel desses fragmentos est elevado em mais de 90% dos pacientes com CID. Ressaltamos que um nico exame no diagnstico de CID mas, dentro das possibilidade de cada laboratrio, o emprego de alguns dos testes mencionados anteriormente, podero nos conduzir ao diagnstico desse distrbio. O "Scientific and Standardization Committee" da "International Society on Thrombosis and Haemostasis" elaborou um algoritmo com escores, para a classificao da CID, o qual est reproduzido no Quadro 6. Quadro 6: Escores para a classificao da CID do risco: O paciente apresenta uma desordem que seja reconhecida como associada 1 Avaliao com a CID? Caso negativo - no usar esse algoritmo. Caso positivo - prosseguir: os testes globais de coagulao: plaquetometria, tempo de protrombina (TP), 2 Solicitar fibrinognio, monmeros solveis de fibrina ou produtos de degradao d0 polmero de fibrina
(PDF/D-dmero)

3 Escore global dos resultados dos testes de coagulao: Plaquetometria................................................................................ .. ( > 100 = 0, < 100 = 1; < 50 = 2 ) Marcadores relativos fibrina (PDF/D-dmero)............................. (ausncia de aumento: 0; aumento moderado: 2; aumento intenso: 3) Tempo de protrombina prolongado.................................................. (< 3 segundos = 0; >3 seg. e <6 seg. = 1; > 6 seg. = 2) Nvel de fibrinognio........................................................................... (>1.0 g/l = 0; < 1.0 g/l = 1) 4 Clculo do escore total.........................................................................
(Soma dos escores do item 3)

do escore total do item 4: 5 Interpretao Se maior ou menor do que 5, compatvel com CID. Repetir o escore diariamente.
Se menor do que 5, sugestivo (no afirmativo) de CID declarada. Repetir o escore a cada 1 ou 2 dias.

98 Tratamento: Destacamos quatro pontos importantes no tratamento da CID: 1- Combate causa, 2 - preveno e/ou tratamento do choque, 3 - reposio dos componentes sangneos e 4- combate da hipercoagulabilidade e da hiperfibrinlise. fcil entender que as medidas a serem adotadas em cada item dependero de cada tipo de processo e de seu grau de intensidade. Sero abordados os detalhes, de alguns desses itens, quando for discutir os principais distrbios. Isso tambm pode ser visto no tema "Distrbio Hemosttico por Veneno de Serpente". 1- Combate causa: Como foi visto, a CID, salvo raras excees, tem sempre uma causa identificvel (ver Quadro 5). Est comprovado que sem combater a causa, praticamente impossvel o sucesso teraputico, mesmo com as medidas de amparo ao paciente que sero comentadas nos itens seguintes.

Combatida a causa, o distrbio desaparecer. O tempo de recuperao varia de acordo com o tipo do responsvel pelo processo. Assim, quando a CID tiver sido provocada pelo descolamento prematuro de placenta, a normalizao levar algumas horas aps o esvaziamento do tero. J no caso de septicemia, ser de alguns dias j que a resposta ao tratamento da infeco mais demorada.

2 - Preveno e/ou tratamento do choque. O desenvolvimento desse item no pertinente ao tema. Para detalhes sobre esse assunto, consultar os textos de medicina intensiva. Entretanto, bvio que sem a preveno e/ou tratamento do choque, bem como os cuidados para impedir ou tratar a falncia dos diversos rgos, o resultado estar fadado ao insucesso.

3- Reposio dos componentes sangneos. A reposio dos glbulos vermelhos deve ser feita por meio de concentrado de hemcias sempre que o hematcrito cair a nveis crticos. Cada unidade de concentrado eleva o hematcrito em cerca de 3%. Caso se lance mo do sangue total estocado, deve-se ter em mente que ser infundindo um material pobre em alguns fatores da coagulao (principalmente FV e FVIII) e em

99 plaquetas. Por esse motivo, deve-se orientar na reposio desses elementos que apresentarem nveis baixos no sangue, sempre baseados nos estudos laboratoriais. Considerar, tambm, que a reposio desses elementos no se far com a mesma facilidade observada nas patologias por deficincia de sntese, j que esto sendo consumidos ou hidrolisados, apesar de que quando circulando, recebem proteo dos inibidores fisiolgicos. Por outro lado, no esquecer que o sangramento no depende, somente, dos nveis baixos dos fatores e das plaquetas; a plasmina em excesso, pela sua ao ltica, dificulta ou impede a formao do trombo hemosttico e os produtos de degradao do fibrinognio e da fibrina interferem na funo plaquetria. Desse modo, lanar mo dos concentrados de plaqueta, do crioprecipitado que rico em FVIII, fibrinognio e Antitrombina III (AT-III), do concentrado de AT-III e do plasma fresco congelado que fornecer diversos fatores da coagulao. O concentrado de plaquetas deve ser infundido, apenas, quando o paciente estiver sangrando, ou seja, quando as plaquetas estiverem abaixo de 50.000/l de sangue, ou quando houver indicao de algum procedimento invasivo. A quantidade a ser infundida de uma bolsa de concentrado, obtida de cada doador, para cada 10 kg de peso. Cada bolsa infundida eleva as plaquetas no sangue em 10.000-12.000/mm3. No caso de plaquetoferese, 1 bolsa de concentrado de plaquetas corresponde quantidade de 6 bolsas de doadores diversos. J os concentrados de fatores da coagulao tm sido pouco indicados; por um lado porque repem apenas alguns fatores e, por outro lado, porque podem conter traos de substncias com ao tromboplstica, o que incrementaria a hipecoagulabilidade. Para repor diversos fatores devemos lanar mo do plasma fresco (6 unidades em 24 horas). O plasma fresco congelado tambm pode ser infundido na quantidade de 16 ml/kg de peso corporal, via intravenosa, para o adulto, quando a relao do TTPa (TTPa do doente/TTPa normal) for >1,5. Para a criana a dose de 10-15 ml/kg de peso corporal. Essas quantidades aumentam os fatores da coagulao no sangue em cerca de 10-20%, e devem ser repetidas a cada 8 horas. O crioprecipitado que contm 80-100 U de FVIII, 100-300 mg de fibrinognio, de fibronectina e de fator von Willebrand mais indicado para reposio de fibrinognio. O que mais preocupa no seu emprego a impossibilidade da inativao do HIV. Como o fibrinognio um fator estvel, ele facilmente encontrado no plasma e no sangue total, mesmo quando estocados em condies adequadas de conservao. A diminuio do nvel do fibrinognio no sangue s preocupa quando ele fica inferior a 100 mg/dl. O concentrado de AT-III tem sido empregado, mas faltam estudos cientficos que comprovem sua utilidade. Teoricamente, como o nvel de AT-III cai, freqentemente, na CID,

100 seu emprego seria til para bloquear a hipercoagulabilidade, pela sua ao anticoagulante, direta, no mecanismo de coagulao e como cofator para a ao da heparina. A dose indicada de 100U/kg de peso corporal via intravenosa durante 3 horas, seguida de infuso contnua de 100U/kg de peso corporal/dia.

4 - Combate da hipercoagulabilidade e da hiperfibrinlise. O emprego de substncias antifibrinolticas deve ser feito com muito cuidado e em casos especficos. Isso porque, havendo deposio de fibrina nos vasos de pequeno calibre, o bloqueio da fibrinlise impedir sua remoo; ainda mais que em determinados casos, como por exemplo, nas septicemias, a atividade fibrinoltica est diminuda. Alguns trabalhos tm mostrado sua utilidade quando esse distrbio produzido pela leucemia promieloctica e pelas doenas malignas no hematolgicas disseminadas. O cido aminocaprico um antifibrinoltico muito usado e a dose recomendada de 510g, lentamente por via intravenosa, seguida por 2-4 g/hora via intravenosa, sem exceder a 30 g/dia. O cido tranexmico um potente antiplasmnico no indicado nos trabalhos americanos. Temos usado esse produto na dose de 250-500 mg, lentamente na veia, a cada 6 horas. Resumindo o exposto, o mecanismo fibrinoltico constitui uma defesa do organismo contra a hipecoagulabilidade e seu bloqueio pode trazer srias conseqncias. Deve-se, pois, us-lo com precauo e certos de sua indicao quando sua exaltao estiver trazendo srias conseqncias para o paciente. A heparina o medicamento mais usado para tentar bloquear a hipercoagulabilidade, entretanto, seu uso tem sido motivo de controvrsias por vrias razes: os trabalhos no tm comprovado bons resultados nas CIDs agudas como acontece nas crnicas e, a dose ideal no foi determinada como nos processos trombticos. Na realidade, o xito do tratamento, na maioria dos casos, devido, principalmente, ao combate causa e ao suporte ao doente do que propriamente ao uso do anticoagulante. Por outro lado, devido aos diversos graus de intensidade na ativao do mecanismo da coagulao pelas substncias tromboplsticas, com a conseqente gerao de quantidades variveis de trombina, a padronizao da dose de heparina fica muito difcil de ser realizada.

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