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TRANSFORMACIN GENTICA DE GUSANO DE SEDA Bombyx mori L. MEDIANTE USO DEL TRANSPOSN piggyBac
Universidad Tecnolgica de Pereira. Centro de Biologa Molecular y Biotecnologa (CENBIOTEP) Instituto Colombiano para el Desarrollo de la Ciencia y Tecnologia Francisco Jos de CaldasCOLCIENCIAS Centro de Desarrollo Tecnolgico de la Sericultura (CDTS)
1. 2. 3. 4. 5.
Compone casi la mitad de las protenas sricas. Es una protena expresada en hgado en donde compone el 10% de la expresin.
Cromosoma 4 q11-22
Regin q11-13 Gene se distribuye en 16.961pb 15 exones
Necesidad anual se encuentra en el rango de las 500 toneladas (1.5 billones de dlares).
Caractersticas Biolgicas
Tiempo de generacin:
50 das (No-diapausa) 6 meses (Diapausa)
Crecimiento de la larva desde eclosin hasta secrecin de seda: 10.000 veces Tamao larval: 8cm El stock gentico del gusano de seda lo componen:
Razas geogrficas
China Japonesa Europea Tropical
Posee celulas especializadas en la glndula posterior 85% de su produccin de protenas para seda (fibrona) Debido a proceso endomitoticos el genoma haploide de estas celulas puede llegar a ser hasta 400.000X 1000 celulas producen 300mg = 80g protena/clula/da
Mejor sistema celulas de mamfero produce 50pg protena/clula/da
ASPECTOS EN BIOSEGURIDAD
Salud humana
Toxicidad Alergenicidad Patogenicidad Resistencia a antibiticos
Produccin agropecuaria
Aparicin resistencia o tolerancia Aparicin nueva plagas o superplagas Reduccin de otras variedades de lepidpteros
Biodiversidad
Competitividad Dao a otros organismos Flujo de genes Ventajas selectivas en el ambiente
Ambiental
Persistencia Dispersin Manejo adecuado de desechos
Tejidos Medios de cultivo Organismos modificados genticamente
piggyBac (IFP2)
Elemento transponible de tipo II, especifico para elementos repetitivos cortos de TTAA Descubierto en cultivos celulares de Trichoplusia ni (Lepidoptero) infectadas con baculovirus Presenta tamao de 2,4kpb y repeticiones invertidas perfectas de 13pb Codifica para una transposasa
Lepidopteros
Trichoplusia ni. Bombyx mori Gelechiidae sp
METODOLOGIA
Sntesis cADN Albmina mARN 5 AAAAA 3 Sntesis de primera cadena con el uso de retrotranscriptasa 5 3 3 AAAAA 3 5 Amplificacin de las molculas correspondientes al gene particular (albmina) 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3
5 5 3 5 3 5 3 5 3 3
3 5 3 5 3 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 5
Clonacin
Transformacin
Seleccin
Secuenciacin
Transformacin
Plasmido ayudador
Vector no autnomo, no posee la regin correspondiente a ITR 5 (Repeticiones Terminales Invertidas) Encargado de llevar la funciones que deben ser suministradas en Trans (Transposasa) ITR 3 del transposon
Vector integrativo
Presenta secuencias de piggyBac correspondientes a ITR 5y 3 Secuencias correspondientes a genes reporteros Secuencias a los promotores especficos de tejido Secuencias correspondiente al transgene
Plasmido ayudador
pA3LacZ pA3GFP
Ava I
Sitio de policlonage pUC Secuencia gene actina A3 Iniciador primeros codones de piggyBac
pEGFP-N1
pA3GFP p3E1.2
Bgl II Gene piggyBac incompleto Ava I Sitio de policlonage pUC Secuencia gene actina A3 Iniciador primeros codones de piggyBac
PCR
Ava I
Bgl II
Ava I
Bgl II
p3E1.2
pHA3PIG
VECTOR INTEGRATIVO
PCR Cadena L fibrona Regin 3 poliA Cadena L fibrona PCR pBac(3xP3-DsRed) Cadena L fibrona Regin 5 EGFP
pLE
5 ITR piggyBac 3xP3 DsRed L Fibrona 5 L Fibrona EGFP L Fibrona 3 3 ITR piggyBac
pP - ALB
MICROINYECCIN
Micromanipulador El plsmido ayudador (pHA3PIG) y vector integrativo (pP-ALB) son disueltos a una concentracin de 0.2g/l Inyeccin de 15-20nl en embriones de 2-8 horas despus de oviposicin
Cruce y obtencin de lneas homocigoticas para el transgene Identificacin recombinantes (Expresin de PFV y PFR)
Corporacin mixta sin nimo de lucro Sede obtenida por partes iguales entre Ministerio de agricultura y Gobernacin Departamento de Risaralda Ubicacin geogrfica
Granja El Plamo Vereda La Honda Municipio de Pereira Departamento de Risaralda
Funciones
Investigacin bsica y aplicada Mantenimiento bancos de germoplasma gusano de seda y morera Transferencia de tecnologas Promocin de la actividad
Capacitacin Produccin comercial de gusanos de seda y semilla de morera Establecimiento y mantenimiento banco germoplasma en Morera y Gusano de seda Cra lneas puras gusano de seda Produccin de hbridos Produccin de huevos Investigacin bsica gusano de seda
IMPACTOS
Brindar estrategias de valor agregado a la industria de la sericultura. Entrenamiento de personal
Investigadores de otros centros Estudiantes de Maestra y Doctorado
Grupo de Investigacin
Investigador principal
Enrique Aguilar Fernandez
Coinvestigadores
Duverney Gaviria Arias Alvaro Hernn Alegra Soto
Estudiantes de Postgrado
Walter Ricardo Lpez ngela Maria Damelines Florez