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INFORME TCNICO DEL PROYECTO SECTORIAL SAGARPA CONACYT-2011-09-172352 DEMANDA 6.
Desarrollo de normatividad y mtodos para deteccin y medicin de organismos microbiolgicos en alimentos.
Informe tcnico de la Demanda Especfica 6. Desarrollo de normatividad y mtodos para deteccin y medicin de organismos microbiolgicos en alimentos Del proyecto sectorial SAGARPA-CONACYT 201109-172352
INFORME TCNICO DEL PROYECTO SECTORIAL SAGARPA CONACYT-2011-09-172352 DEMANDA 6. Desarrollo de normatividad y mtodos para deteccin y medicin de organismos microbiolgicos en alimentos.
NDICE
Alcance Justificacin del proyecto Discusion y gua del manual integrado de la normatividad y mtodos de deteccin y medicin de organismos microbiolgicos en alimentos como vegetales y frutas frescas, productos del mar y crnicos de animales terrestres Conclusiones de los resultados de las encuestas realizadas a laboratorios de Mxico que analizan microorganismos patgenos en alimentos Programas internacionales implementados en materia de inocuidad de los alimentos en beneficio del sector productivo de crnicos, productos de frutas y a base de vegetales Recomendaciones para establecer un programa de verificacin interno en Mxico Propuestas de mejora a la normatividad para la deteccin de Vibrio cholerae, V. vulnificus, V. parahaemolyticus de Salmonella spp de Listeria monocytogenes de E. coli O157 y productoras de shiga toxinas de Staphylococcus aureus PROPUESTA DE NORMAS
Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios. Mtodo para la cuenta e identificacin de Escherichia coli diarreognica. Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios. Mtodo para la deteccin de Vibrio cholerae enterotoxignico
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71 79 79 81 83 84 84 85 125 181 200 202
CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA
PREFACIO
El presente informe de normatividad y mtodos para la deteccin y medicin de microorganismos patgenos en alimentos fue integrado y compilado por el Centro Nacional de Metrologa con el apoyo del Proyecto Sectorial SAGARPA-CONACyT 2011-09-172352, Demanda Especfica 6. Desarrollo de normatividad y mtodos para deteccin y medicin de organismos microbiolgicos en alimentos, el cual fue realizado en colaboracin con el Centro de Investigacin en Alimentacin y Desarrollo, A.C. y tuvo aportaciones honorficas de distinguidos investigadores y usuarios de Mxico. Centro Nacional de Metrologa Responsable Tcnico: Dr. Yoshito Mitani Nakanishi Responsable Administrativo: C.P. Guillermo Salomn Villalobos Castrejn Director General del CENAM. Dr. Hctor Nava Jaimes CENAM km 4.5 Carretera a los Cus, Municipio El Marqus, Quertaro. C.P. 76246 Mxico Tel. (442) 2110500 al 04 Correo electrnico: meperez@cenam.mx Compilado y escrito por: Dra. Melina Prez Urquiza. Coordinador Cientfico. Lder de la Demanda Especfica 6 Dr. Aldo Amaro Reyes, profesor investigador de la UAQ, contratado por CENAM con fondos del proyecto. Dra. Nohelia Castro del Campo. CIAD Culiacn M.en C. Leobardo Montoya Rodrguez. CIAD Mazatln Esta publicacin ha sido revisada por: Dra. Blanca Garca Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autnoma de Quertaro Q.A. Judith Sainz Uribe Coordinador Cientfico 2013 por el Centro Nacional de Metrologa Secretara de Economa Primera Edicin consta de 500 ejemplares Reservado todos los derechos ISBN: 978-607-96162-5-0 Ninguna parte de esta publicacin puede ser reproducida, almacenada en un sistema o transmitida, en ninguna forma o en ningn medio, electrnico, mecnico, fotocopia, grabado, sin el permiso de los copropietarios. Para simplificar la informacin, se han utilizado los nombres de los productos comerciales. Este manual no pretende recomendar productos nombrados o ilustrados, como tampoco existe una crtica implcita de productos similares que no se mencionan o ilustran. 3
Agradecimientos por su contribucin en la elaboracin del presente informe tcnico
UAQ Dra. Blanca Garca Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autnoma de Quertaro
CIAD Culiacn Dr. Cristbal Chaidez Quiroz Dra. Josefina Len Flix Dr. Osvaldo Lpez Cueva Dra. Hilda Karina Ramrez Medina QFB Clida Isabel Martnez Rodrguez QFB Jess Hector Carrillo Yez Dra. Nohelia Castro del Campo
CIAD Mazatln Dr. Miguel Betancourt Lozano M.C. Leobardo Montoya Rodriguez M.C. Jesus Efren Astorga Rodriguez Dr. Bruno Gmez-Gil Rodrguez Salas Dra. Sonia Araceli Soto Rodrguez Dr. Omar Calvario Martnez Dra. Lorena Olivia Noriega Orozco Dra. Maribel Jimnez Edeza M. en C. Maria Eugenia Mnez Robles 4
CENAM Dr. Yoshito Mitani Director General de Metrologa de Materiales Q.en A. Judith Sainz Uribe Coordinador Cientfico Dra. Mariana Arce Osuna Director de Anlisis Orgnico M.C. Judith Rivera Mellado contratada por CENAM con fondos del proyecto IIA Blanca Erika Alvarez Nieves contratada por CENAM con fondos del proyecto Con el apoyo de los ayudantes de proyecto y tesistas de licenciatura: p.IBQ Marycarmen Merino Sanchez. Instituto Tecnolgico de Celaya p.IBQ Alma Liliana Villarreal Csares. Instituto Tecnolgico de Durango
ALCANCE
En este volumen se presentan: Las conclusiones y sugerencias resultado del Proyecto 1. En el estado actual, las metodologas microbiolgicas nacionales para el anlisis microbiolgico de productos crnicos, frutas, verduras y marinos, en comparacin con las internacionales, (metodologas propuestas y validadas por organismos de reconocimiento internacional ISO, AOAC, BAM) no son concordantes en el uso de tcnicas de biologa molecular, pruebas automticas y ensayos rpidos mediante kits comerciales, pero si son concordantes parcialmente concordantes, dependiendo del caso, con las metodologas tradicionales de identificacin bioqumica y medios selectivos. 2. Se expone la oferta y la demanda de proveedores de ensayos para anlisis de microorganismos patgenos de los alimentos y se proporciona el fundamento cientfico y la factibilidad tcnica en relacin a la actualizacin de la normatividad nacional y su aplicacin referente a estudios microbiolgicos en productos crnicos, frutas, verduras y marinos. 3. Se informa acerca de los programas internacionales implementados en materia de inocuidad de los alimentos, y se sugiere su adopcin en Mxico. 4. Una vez considerado que la presentacin de las normas internacionales se realiza por patgeno y que tenemos dos dos modelos a seguir, el de los Estados Unidos de Norteamrica y el de la Comunidad Europea. a) En el caso de seguir el modelo utilizado por Estados Unidos de Norteamrica, se sugiere elaborar un manual con los mtodos de determinacin de los patgenos en las diferentes matrices, al cual se podra hacer referencia en las normas, lo que facilitara y mantendra actualizados los mtodos de medicin sin la necesidad de esperar los largos periodos de tiempo que implican la actualizacin de una norma. Dicho manual como el presentado por CENAM en este informe podra contener los mtodos estandarizados por nuestros principales socios comerciales (en este caso Estados Unidos de Norte Amrica, la Comunidad Europa y Reino Unido) de tal forma que el usuario pueda elegir el adecuado para su propsito, sin restringirlo a un kit, equipo mtodo especifico, sin embargo sera un requisito el utilizar patrones de medicin Materiales de Referencia Certificados con los cuales se garantice la trazabilidad, incertidumbre y calidad del resultado de la medicin realizada. b) En el caso de seguir el modelo de la Comunidad Europea se sugiere tener una norma por patgeno para las diferentes matrices alimentarias de inters, en lugar de tener una norma por producto para los diferentes patgenos. 5. Considerando lo anterior, se presentan dos propuestas de norma para la evaluacin, validacin y aplicacin de nuevos mtodos para la deteccin de Vibrio cholerae, Vibrio paraemoliticus, Vibrio vulnificus y E. coli productora de shiga toxinas (STEC) en las diferentes matrices alimentarias, tomando como base lo expuesto en el BAM de los Estados Unidos de Norteamrica. 6. Se realiz un comparativo de normas nacionales y extranjeras de aplicacin actual y un estudio de factibilidad (en base a la consulta con las instituciones nacionales de investigacin, laboratorios de ensayo, laboratorios de gobierno federal y del sector productivo que requieren u ofrecen el servicio de evaluacin de la inocuidad de los alimentos nacionales e internacionales) para introducir modificaciones en las normas 6
nacionales sobre la deteccin y/o cuantificacin de microorganismos patgenos en alimentos en sus diferentes matrices. 7. Se sugiere que las normas nacionales sean concordantes con la correspondiente seccin del BAM y con los mtodos de anlisis reconocidos a nivel internacional para la determinacin de los patgenos de inters requeridos para los productos exportables hacia los Estados Unidos de Norteamrica y/o los distintos socios comerciales de Mxico. 8. Se sugiere la implementacin de pruebas interlaboratorio nacionales, tomando la experiencia de proveedores de ensayos de anlisis de microorganismos patgenos de los alimentos internacionales. 9. Se propone trabajar en las comparaciones del recin formado grupo de trabajo de microbiologa del CCQM con el objetivo de desarrollar materiales de referencia nacionales tomando la experiencia del proceso de desarrollo de los MRC internacionales para la determinacin de los patgenos motivo de este estudio en alimentos. Metodologa empleada: 1. Revisin de normas nacionales e internacionales sobre las metodologas microbiolgicas que involucran la deteccin de microorganismos patgenos como Salmonella spp, Escherichia coli, Listeria Monocytogenes, Vibrio spp, Staphylococcus aureus y E. coli O157:H7 y productoras de shiga toxinas. NOMs SSA: 109, 110, 112, 113, 114, 115, 143 y 242 , que para el caso de productos del mar se complementan con ms de 20 NOM NMX (NOM-001-STPS-1993, NOM002-SCFI-1993, NOM-051-SCFI-1994, NOM-030-SCFI-2006, NOM-027, 040, 092, 116, 117, 120, 128, 129, 130 y NMX-F-083, 088, 144, 254, 304, 314, 315). Normas internacionales: ISO (se revisaron 34 normas aplicables del compendio de normas UNE sobre microbiologa de los alimentos), AOAC, BAM, BS, CFIA (Agencia Canadiense de Inspeccin de Alimentos por sus siglas en ingls), y del CODEX. 2. Encuestas a 35 laboratorios de Mxico que realizan anlisis de microorganismos patgenos en alimentos 3. Revisin de programas internacionales implementados en materia de inocuidad de los alimentos en beneficio del sector productivo de crnicos, productos de frutas y a base de vegetales 4. Visita a los laboratorios de USDA, NIST, LGC y NIBSC 5. Resultados: a. Propuestas de mejora a la normatividad existente (NOM) referente a los 5 patgenos motivo de estudio y b. propuesta de dos normas de la traduccin al castellano de las establecidas en el Manual Analtico de Bacteriologa i. Mtodo para la cuenta e identificacin de Escherichia coli diarreognica ii. Mtodo para la deteccin de Vibrio cholerae enterotoxignico c. Algunas Propuestas adicionales. Ver propuestas en las pginas 76-197 Los entregables son: Un Informe tcnico que describe las actividades y los hallazgos del proyecto Desarrollo de normatividad y mtodos para deteccin y medicin de organismos microbiolgicos en alimentos, as como sugerencias y propuestas de mejora regulatoria Un Manual de Normas 7
Compendio de las normas y mtodos estandarizados en Mxico y las traducciones al castellano de las aplicables de nuestros principales socios comerciales como son las presentadas en el Manual Analtico de Bacteriologa (BAM por sus siglas en Ingles) de Estados Unidos de Norte Amrica, las guas ISO de la Comunidad Europea y las normas britnicas del Reino Unido, para los 5 patgenos motivo de estudio en este proyecto: Salmonella spp, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Vibrio spp, Staphylococcus aureus y E. coli O157:H7 y productoras de shiga toxinas.
JUSTIFICACIN DEL PROYECTO

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son un problema cada vez ms importante a nivel internacional debido al intercambio comercial y al movimiento de personas entre los diferentes pases. Se estima que tres millones de personas en los pases desarrollados y en desarrollo mueren cada ao a consecuencia de ellas y que muchos millones ms se enferman (FAO, 2012). La mayora de estas enfermedades son ocasionadas por los gneros bacterianos, considerados patgenos como Salmonella, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli O157, Listeria monocytogenes, entre otros. Con la finalidad de garantizar la inocuidad de los alimentos y proteger a los consumidores los pases han implementado sistemas nacionales de control de los alimentos con una base oficial y de carcter obligatorio. Dichos sistemas aseguran tambin que los alimentos importados cumplen con los requisitos nacionales. En Estados Unidos de Amrica, por ejemplo, la Food and Drug Administration (FDA) firm recientemente, en enero del 2012, la ley denominada Food Safety Modernization Act. Esta ley provee a la FDA de herramientas para tratar a los alimentos importados con los mismos estndares de calidad que los impuestos para los alimentos locales. El entorno mundial del comercio de productos alimenticios impulsado por las exigencias de los consumidores y el aseguramiento de la inocuidad para la prevencin de las enfermedades, impone numerosas obligaciones a los pases, en cuanto al fortalecimiento de sus sistemas de control de los alimentos que incluyen: la legislacin alimentaria, la inspeccin de los alimentos, los anlisis (laboratorios oficiales), la gestin del control de los alimentos y la informacin, educacin y comunicacin. El panorama actual en materia de inocuidad alimentaria presenta varias razones que justifican la necesidad de unificar la normatividad mexicana actual en materia de deteccin de microorganismos patgenos con las normas internacionales vigentes. Algunas de ellas son las siguientes: Los sistemas de control alimentario de los pases desarrollados presentan barreras tcnicas que dificultan el comercio internacional de productos agropecuarios mexicanos y productos derivados de la pesca. Aunado a ello, la mayora de las Normas Oficiales Mexicanas que establecen la metodologa para la determinacin de microorganismos patgenos en alimentos no han sido actualizadas desde que fueron publicadas en los aos noventa (Ver Tabla 1). A excepcin de la norma NOM-242-SSA12009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba, que fue publicada en el ao 2010. Sin embargo, debe considerarse, que aunque su revisin se realiz en 2010, esta norma hace referencia a los mtodos y procedimientos microbiolgicos propuestos en otras normas que no han sido actualizadas 8
y por lo tanto las normas actualmente utilizadas no contemplan las ventajas del uso de la tecnologa moderna, lo cual representa una serie desventaja que afecta no solo a los productores, sino tambin a los consumidores, es decir a todos los usuarios
Tabla 1. Fecha de publicacin de algunas Normas Oficiales Mexicanas para el anlisis de microorganismos patgenos en los alimentos y el tiempo en aos que las mismas llevan sin actualizarse. Normas Oficiales Mexicanas Fecha de publicacin 10 de mayo de 1995 10 de mayo de 1995 31 de octubre de 1997 10 de mayo de 1995 26 de mayo de 1994. 10 de mayo de 1995 10 de mayo de 1995 3 de noviembre de 2010 Tiempo en aos sin actualizacin hasta el 2012 17
NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. NOM-113-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. NOM-143-SSA1-1995, Bienes y servicios. Mtodo de prueba microbiolgico para alimentos. Determinacin de Listeria monocytogenes. NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NOM-109-SSA1-1994, Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NOM-114-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos. NOM-115-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba.
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Esta situacin persiste en nuestro pas, a pesar de que la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin (LFMN) establece en su Artculo 51 que: Las normas oficiales mexicanas debern ser revisadas cada 5 aos a partir de la fecha de su entrada en vigor. Otra razn que justifica la actualizacin de las normas es que la mayora de ellas no presenta concordancia con las normas internacionales, situacin que explica por qu muchos productos mexicanos no pueden ser comercializados a nivel internacional ya que no cumplen con los estndares requeridos por ellos. En la actualidad la nica norma que tiene concordancia con normas internacionales es la NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba. La LFMN en el Artculo 51-A establece que: Para la elaboracin de las normas mexicanas se realizar lo siguiente:
II. Tomar como base las normas internacionales, salvo que las mismas sean ineficaces o inadecuadas para alcanzar los objetivos deseados y ello est debidamente justificado A diferencia de las normas mexicanas, las normas internacionales han sido actualizadas ms recientemente. Por ejemplo, los procedimientos de anlisis compilados en el Bacteriologycal Analytical Manual (BAM) publicado por la Food and Drug Administration han sido revisados desde el 2001 y la revisin ms reciente es del 2011. Tabla 2. Comparacin de la fecha de revisin de las Normas para deteccin de microorganismos patgenos en alimentos Nacionales e Internacionales. Aplicacin de la Norma Norma Oficial Mexicana (NOM) Comit Europeo de NormalizacinAsociacin Espaola de Normalizacin y Certificacin (UNE/ISO) 6579:2002 Revisin 2003 11290-1:1997 Revisin 1997 11290-2:2000 Revisin 2000 Bacteriological Analytical Manual (BAM) British Standard Institution (BS)
Salmonella
Listeria monocytogenes
114-SSA11994 Revisin 1995 143-SSA11995 Revisin 1997
Staphylococcus aureus
115-SSA11994 Revisin 1995
E coli O157 Escherichia coli diarreognica
6888-1: 1999 Revisin 2000 6888-2:1999 Revisin 2000 6888-3:2003 Revisin 2003 16654:2002 Revisin 2002
Captulo 5. Salmonella. Revisin 2011 Captulo 10. Deteccin y recuento de Listeria monocytogenes en los alimentos. Revisin 2011 Protocolo: Confirmacin simultnea de especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por PCR en tiempo real. Revisin 2011 Captulo 12 Staphylococcus aureus Revisin 2001
5763:Part 7:1983 Revisin 1983
Bacterias coliformes y E. coli
112-SSA11994 113-SSA11994
16654:2002 Revisin 2002
Capitulo 4 Escherichia coli diarreognica. Revisin 2011 Captulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias coliformes. Revisin 2002
5763:Part13:1989 Revisin 1989 5763:Part 10:1993 Revisin 1993 10
Vibrio
Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras Preparacin y dilucin de muestras
Revisin 1995 NOM-242SSA1-2009 Revisin 2010 109-SSA11994 Revisin 1994
Captulo 9. Vibrio. Revisin 2004 Captulo 1: Muestreo de alimentos y preparacin de la muestra homogeneizada. Revisin 2003 Captulo 1: Muestreo de alimentos y preparacin de la muestra homogeneizada. Revisin 2003
5763:Part14:1991 Revisin 1991 5763:Part 0:1986 Revisin 1986
110-SSA11994 Revisin 1995
6887-1 Revisin 2000
5763:Part 0:1986 Revisin 1996
Las normas Mexicanas aplicables a la deteccin de microorganismos patgenos en alimentos para consumo humano proponen mtodos convencionales basados en crecimiento en medios de cultivo, aislamiento, identificacin bioqumica y en ocasiones serologa. Sin embargo, la deteccin rpida de patgenos en alimentos es crtica ya que con ella se asegura a los consumidores. En algunas normativas internacionales se ha establecido el uso de mtodos rpidos, trmino subjetivo usado para describir la variedad de pruebas que ofrecen una deteccin e identificacin ms rpidas, ms convenientes, sensibles y ms especficas, como kits bioqumicos, pruebas de anticuerpos, pruebas basadas en ADN y ensayos que son modificaciones de pruebas convencionales para acelerar los anlisis. La mayora de los kits bioqumicos miniaturizados requieren de (18 a 24) horas de incubacin, con excepcin de algunos en los que los resultados pueden leerse en 4 horas. Han sido diseados para identificar bacterias entricas, pero existen tambin los que permiten identificar a Campylobacter, Listeria, anaerobios, bacterias Gram-negativas no fermentativas y bacterias Grampositivas (BAM, 2001). La alta especificidad de la unin anticuerpo-antgeno y la versatilidad de esta reaccin, ha facilitado el diseo de una gran variedad de ensayos y formatos de anticuerpos. Son 5 los formatos de ensayos de anticuerpos ms utilizados. El ms simple es la aglutinacin ltex (LA), en la que se usan anticuerpos cubiertos de ltex coloreado o partculas doradas para una identificacin serolgica o un aislado de cultivos puros de bacterias de los alimentos. En la inmunodifusin, una muestra enriquecida es colocada en una matriz de gel con anticuerpos; si el antgeno especfico est presente, se forma una lnea de precipitacin. El ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA) es el formato de ensayo de anticuerpos ms utilizado para la deteccin de patgenos en alimentos. En este ensayo, un anticuerpo est ligado a una matriz slida y es usado para capturar al antgeno presente en un cultivo de enriquecimiento y un segundo anticuerpo conjugado a una enzima es usado para su deteccin. Las paredes de los pozos de las placas microtiter son los soportes slidos ms utilizados. (BAM,2001). En la separacin inmunomagntica (IMS) se usan anticuerpos acoplados a partculas magnticas para capturar patgenos del medio de preenriquecimiento. Esta tecnologa puede sustituir los enriquecimientos selectivos, pero en lugar de usar antibiticos o reactivos fuertes que puedan causar estrs, se usa un anticuerpo para capturar un antgeno. 11
La inmunoprecipitacin o inmunocromatografa es otro formato de anticuerpo. Es un procedimiento sndwich, como el ELISA, pero en lugar de un conjugado enzimtico, la deteccin del anticuerpo es acoplada a una cuenta de ltex coloreada a oro coloidal. Los mtodos basados en ADN y anticuerpos comenzaron a surgir en los aos ochenta cuando la investigacin bsica fue aplicada en reas como la biotecnologa. Existen varios formatos de ensayos basados en ADN, pero nicamente las sondas, el PCR y los bacterifagos han sido desarrollados comercialmente para detectar patgenos en alimentos (BAM,2001). La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un mtodo en el que fragmentos cortos de ADN (sondas) o primers son hibridizados en una secuencia especfica, la cual es amplificada enzimticamente por una enzima conocida como Taq polimerasa usando un termociclador. Tericamente el PCR puede amplificar una copia simple de ADN en un milln de copias en menos de 2 horas. Sin embargo, la presencia de inhibidores en los alimentos y en los medios de cultivos pueden disminuir la eficiencia de la amplificacin, por lo que la extrema sensibilidad del PCR se ve reducida cuando se usa en pruebas de alimentos (BAM, 2001). Los mtodos de deteccin e identificacin de patgenos microbianos, basados en el ADN y en la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) -mtodo molecular, ofrecen ventajas tanto para los productores como para los consumidores. La seguridad microbiolgica de los alimentos contina suscitando gran preocupacin entre todos los componentes de la cadena alimentaria, del campo a la mesa (EUFIC, 2000). Los mtodos moleculares necesitan de ms presupuesto, ya que parte del proceso es automatizado, sin embargo tienen mayor sensibilidad para detectar e identificar microorganismos a travs de pruebas simples y especficas y se realiza en pocas horas. En Mxico se ha limitado el uso de mtodos moleculares a la investigacin privada, porque an no se han validado como mtodos oficiales (Carrillo-Inungaray et al., 2011). Por otro lado, el uso de los mtodos moleculares ha recibido un gran impulso a travs de la creacin de PulseNet, red de subtipificacin molecular creada por el CDC (Center for Disease Control), la asociacin de los departamentos de salud estatal y la Asociacin de Laboratorios de Salud Pblica (APHL) de Estados Unidos, que se basa en la identificacin de ADN de bacterias causantes de enfermedades relacionadas con alimentos. El proyecto est siendo implementado primero para Escherichia coli 0157-H7 y luego ser extendido para incluir Salmonella typhimurium y otros patgenos relacionados con los alimentos tales como Shigella, Listeria o Campylobacter. Todos los participantes utilizarn equipos y protocolos estandarizados y se compilar una base de datos centralizada de patrones de ADN (huellas genticas del ADN) en un servidor computacional en el CDC. A travs de la participacin del Departamento de Agricultura y la Food and Drug Administration de los Estados Unidos, la base de datos incluir huellas genticas derivadas de alimentos contaminados y de aislados clnicos (Pulsenet, Consultado el 15 de mayo de 2012. http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet). Esta metodologa convenientemente estandarizada y con adecuados controles de calidad, tiene la gran ventaja de poder ser realizada en diferentes laboratorios al mismo tiempo, las fotografas de los fragmentos de ADN obtenidos pueden ser analizados en el o los laboratorios que lo generan y enviados electrnicamente a una base de datos habilitada para comparar los perfiles de las cepas aisladas en diferentes pases y regiones en tiempo real. Esta secuencia de eventos organizados en una red regional-internacional, con participacin de los sectores de salud humano, animal y de alimentos, posibilita la deteccin temprana del brote, en particular en brotes dispersos y la respuesta rpida y oportuna a las infecciones por patgenos bacterianos transmitidos por alimentos (Pulsenet, Consultado el 15 de mayo de 2012. 12
http://fos.panalimentos.org/Default.aspx?alias=fos.panalimentos.org/pulsenet). Siguiendo la tendencia de implementar metodologa molecular al anlisis de microorganismos patgenos de los alimentos, se han incorporado anlisis moleculares en algunos captulos del manual analtico bacteriolgico (Bacteriological Analytical Manual, BAM, 1998) como podemos apreciar en los siguientes ejemplos: Captulo de Vibrio (BAM, 1998). una serie de cambios sustanciales se han hecho en esta versin del captulo referente a Vibrio en donde se incluye un mayor nfasis hacia los mtodos moleculares, tales como hibridacin de ADN de colonia y PCR para la identificacin y caracterizacin de Vibrio spp patgenos. Con la adicin de estas opciones, se ha puesto menos nfasis en algunos de los mtodos ms antiguos y en algunos casos, en secciones que requieren reactivos peligrosos o difciles de obtener (es decir O/129 reactivo) han sido eliminadas estas nuevas tecnologas tienen la ventaja de una mayor deteccin e identificacin rpida y se incluyen en aquellos laboratorios con el equipo adecuado. La identificacin basada en la PCR ofrece un anlisis en un da, mientras que los procedimientos con sondas de genes, incluyendo los que se presentan en este captulo, son anlisis que tardan de uno a dos das. El procedimiento tradicional cualitativo y la tcnica del nmero ms probable (NMP) requieren de cuatro a siete das para completarse Adicionalmente en la pgina oficial de la FDA se encuentra descrito, adems de la metodologa preferida estndar, las metodologas rpidas alternativas permitidas para la deteccin y aislamiento de Listeria monocytogenes. Capitulo Listeria y pruebas alternativas. Los kits de deteccin rpida con sus respectivos medios de enriquecimiento pueden ser utilizados para detectar la presencia de contaminantes de Listeria. Las cepas aisladas presuntivamente de Listeria en agares selectivos pueden ser confirmadas por pruebas de identificacin convencionales o por una serie de pruebas de este tipo en forma de kit. Adems, los aislamientos pueden ser confirmados rpidamente como L. monocytogenes (o no) mediante el uso de kits de prueba especficos. Por otro lado, la tipificacin de aislamientos de L. monocytogenes para los aislamientos de la FDA tienen que ser tipificados serolgicamente, por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) y por ribotipificacin (BAM, 1998). Asimismo, revisando las caractersticas relevantes en la aplicacin de anlisis molecular de patgenos en los alimentos, podemos generar un anlisis de fortalezas, oportunidades, debilidades y amenazas (FODA) en donde se aprecian las caractersticas relevantes en la aplicacin de esta tecnologa (Tabla 3). Tabla 3. Anlisis de fortalezas, oportunidades, debilidades y amenazas del anlisis molecular de patgenos en los alimentos. Fortalezas Especificidad (pueden detectar solo la molcula o microorganismo de inters). Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia de un solo microorganismo). Rapidez (se puede identificar un Debilidades No distinguen entre organismos vivos y muertos. Se tiene que contar con conocimientos de secuencias de nucletidos especficas del patgeno a diagnosticar. La mayora de ensayos son cualitativos o semi 13
microorganismo en menos de 24 horas). Permiten estudiar las poblaciones microbianas sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los sesgos que pueden surgir con el cultivo de microorganismos. Ha permitido identificar nuevos microorganismos, los cuales no haba sido posible su cultivo e identificacin por tcnicas tradicionales. Permiten la deteccin de microorganismos altamente patgenos, los cuales pueden ser identificados muertos evitando as los riesgos de infeccin del analista. tiles en situaciones clnicas donde los mtodos convencionales son muy insensibles (v.g. durante la etapa asintomtica de las infecciones del VIH), muy lenta (cultivo micobacterial) o muy complicados para ser usados a gran escala (v.g. aislamiento viral). Monitoreo del surgimiento de mutaciones en el genoma, por ejemplo, la seleccin de variantes resistentes durante la terapia antiviral/antibitica. Puede detectar microorganismos muertos. En el caso de Staphylococcus aureus la bacteria muere a temperaturas que no degradan la toxina as la deteccin de la bacteria muerta es un indicativo de la presencia de toxinas en la muestra. Oportunidades El alto costo de las tcnicas moleculares tender a bajar a medida que se incremente el uso de estas tcnicas. El problema de falsos positivos y falsos negativos se puede solucionar si se incluye en cada anlisis un testigo positivo y un testigo negativo. Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnstico en un menor tiempo y reducir los costos). No requiere de condiciones anaerbicas cuidadosamente controladas en la toma de la muestra, transportacin y manipulacin. Puede ser utilizada durante el tratamiento de un antimicrobiano. Las muestras pueden ser congeladas para un anlisis posterior. El ADN puede ser transportado entre laboratorios fcilmente
cuantitativos. La mayora de ensayos slo detectan una especie o muy pocas especies a un tiempo.
Se desarrollan procedimientos con mltiples etapas, lo que incrementa la posibilidad de errores. No permite el aislamiento del microorganismo para la posterior deteccin de resistencia.
La mayora de los ensayos detectan slo las especies a que apuntan y presentan errores en detectar especies no esperadas.
Sesgos en PCR de amplio espectro debidos a procedimientos de homogenizacin, amplificacin preferencial de ADN y extraccin diferencial de ADN.
Amenazas La falta de estandarizacin de las tcnicas
La probabilidad de resultados falsos positivos por contaminacin con productos de amplificados anteriores Amplicones, hace necesario una cuidadosa evaluacin de sus resultados. La probabilidad de falsos negativos por la presencia de inhibidores o inconvenientes en los diferentes pasos de las tcnicas. Se requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo de las pruebas de identificacin. Se requiere equipo ms especfico para el diagnstico, lo cual eleva la inversin inicial.
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Cocolina et al., 2011, Mandal et al., 2011, Velusamy et al., 2010, Rodrguez-Herrera et al., 2009, Rojas y Herrera 2006. Podemos apreciar que las fortalezas y oportunidades lograran enmascarar a las debilidades y amenazas en la aplicacin del anlisis molecular de patgenos en los alimentos. Casi todos los mtodos rpidos se disean para detectar un solo microorganismo blanco, lo cual lo hace ideal para utilizarlo en programas de control de calidad y analizar rpidamente un gran nmero de muestras de alimentos para la presencia de un patgeno en particular o una toxina. Un resultado positivo por un mtodo rpido sin embargo, es solo considerado como presuntivo y se debe confirmar por los mtodos estndar. Aunque la confirmacin podra tardar varios das, esto podra no ser una limitacin de imposicin, ya que la mayora de los anlisis de alimentos resultan negativos (BAM, 2001). Una de las ventajas que presentan estos mtodos es que son ms rpidos que los tradicionales, la mayora de ellos se puede hacer desde unos cuantos minutos hasta pocas horas. Sin embargo, cuando son usados en el anlisis de alimentos an carecen de suficiente sensibilidad y especificidad para una prueba directa. Por esta razn, las muestras de alimento requieren de un enriquecimiento previo antes de ser analizados. Aunque el enriquecimiento es una limitante en trminos del tiempo del ensayo, provee beneficios como la dilucin de los efectos de los inhibidores, la diferenciacin entre clulas viables y no viables y permite la reparacin del estrs celular o dao celular causados por los procesos a los que se someten los alimentos (BAM, 2001). La evaluacin de mtodos rpidos ha mostrado que algunos tienen un mejor desempeo en ciertos tipos de alimentos que otros mtodos. Esto se puede atribuir principalmente a interferencias de los componentes de la misma muestra, algunos de los cuales pueden ser especialmente complicados para las tecnologas de los mtodos rpidos. Por ejemplo, un ingrediente presente en el alimento puede inhibir la hibridizacin del ADN o la accin de la Taq polimerasa, pero este mismo ingrediente no tiene efecto en las interacciones antgeno anticuerpo o viceversa. Debido a que la eficiencia de los mtodos podra ser dependiente del alimento, se recomienda realizar estudios comparativos para asegurar que un ensayo particular ser efectivo en el anlisis de ese tipo de alimento. La especificidad de los ensayos de ADN es dirigida por sondas cortas; as, un resultado positivo basado en una sonda o cebador especfico para el gen de una toxina solo indica est presente la bacteria que contiene la secuencia de ese gen y que tiene el potencial de ser toxignico. No obstante, esto no indica que el gen est siendo expresado y que est presente la toxina.
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Smbolos, acrnimos y abreviaturas ms menos / signo de divisin C Celsius % por ciento 1/d inversa de la dilucin ATCC American Type Culture Collection beta cbp cuanto basta para CIP Culture International Production cm centmetro cm2 centmetro cuadrado g gramo h hora kg kilogramo l, L litro lb libras m micrmetro M molar ml, mL mililitro mm milmetro min minuto N normal NCTC National Culture Type Collection NMP nmero ms probable p peso p. ejem. por ejemplo pH potencial de hidrgeno 16 LGC Laboratory of Chemistry, Reino Unido BS British Standards CFIA (Agencia Canadiense de Inspeccin de Alimentos por sus siglas en ingls) ISO International Standards Organization the Government PM peso molecular RVBA agar-rojo-violeta-bilis-lactosa s segundo UFC unidades formadoras de colonias spp especies plurales v volumen x signo de multiplicacin NIBSC National Institute for Biological Standards and Control
DISCUSIN Y GUIA DEL USUARIO DEL MANUAL INTEGRADO DE LA NORMATIVIDAD Y MTODOS DE DETECCIN Y MEDICIN DE ORGANISMOS MICROBIOLGICOS EN ALIMENTOS COMO VEGETALES Y FRUTAS FRESCAS, PRODUCTOS DEL MAR Y CRNICOS DE ANIMALES TERRESTRES
NORMAS OFICIALES Y REGULACIONES NACIONALES E INTERNACIONALES RELACIONADAS CON LOS MTODOS PARA EL ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS Para la realizacin del manual se consultaron las siguientes normas oficiales y regulaciones nacionales e internacionales relacionadas con los mtodos para el anlisis microbiolgico de alimentos en productos para consumo humano incluidos productos frescos de vegetales, frutas, carne de animales terrestres y productos del mar (Ver Tablas 4 y 5). Tabla 4. Normatividad nacional e internacional que rige los procedimientos para la toma, manejo y preparacin de las muestras de alimentos revisada para la realizacin del manual. Objeto y campo de aplicacin Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras NOM 109-SSA1-1994 BAM Captulo 1: Muestreo de alimentos y preparacin de la muestra homogeneizada BS 5763: Part 0: 1986 NOM 110-SSA1-1994 UNE/ISO 6887-1 BAM Captulo 1: Muestreo de alimentos y preparacin de la muestra homogeneizada BS 5763: Part 0: 1986 Normas aplicables
Preparacin y dilucin de muestras
NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comit Europeo de Normalizacin-Asociacin Espaola de Normalizacin y Certificacin, BAM: Manual Analtico Bacteriolgico, BS: Institucin de Normas Britnicas.
Tabla 5. Normatividad nacional e internacional revisada para la realizacin del manual para determinar microorganismos patgenos en alimentos de consumo humano y animal. Objeto y campo de aplicacin Bacterias coliformes y Escherichia coli NOM 112-SSA1-1994 NOM 113-SSA1-1994 NOM-242-SSA1-2009 UNE/ISO 16654:2002 Normas aplicables
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Escherichia coli O157
BAM Captulo 4. Recuento de Escherichia coli y bacterias coliformes BS 5763: Part13: 1989 BS 5763: Part 10: 1993 BAM Capitulo 4A. Escherichia coli diarreognica NOM 143-SSA1-1995 NOM-242-SSA1-2009 UNE/ISO 11290-1:1997 UNE/ISO 11290-2:2000 BAM Captulo 10. Deteccin y recuento de Listeria monocytogenes en los alimentos; Protocolo: Confirmacin simultnea de especies aisladas de Listeria y L. monocytogenes por PCR en tiempo real. NOM 115-SSA1-1994 NOM-242-SSA1-2009 UNE/ISO 6888-1: 1999 UNE/ISO 6888-2:1999 UNE/ISO 6888-3:2003 BAM Captulo 12. Staphylococcus aureus BS 5763: Part 7: 1983 NOM 114-SSA1-1994 NOM-242-SSA1-2009 UNE/ISO 6579:2002 BAM Captulo 5. Salmonella NOM-242-SSA1-2009 BAM Captulo 9. Vibrio BS 5763:Part14:1991
Listeria spp. y L. monocytogenes
Salmonella spp.
Vibrio
NOM: Norma Oficial Mexicana, UNE/ISO: Comit Europeo de Normalizacin-Asociacin Espaola de Normalizacin y Certificacin, BAM: Manual Analtico Bacteriolgico, BS: Institucin de Normas Britnicas.
Normas oficiales y regulaciones nacionales e internacionales relacionadas con los mtodos para el anlisis microbiolgico de alimentos en productos frescos de vegetales, frutas, carne de animales terrestres y productos del mar. Ante la necesidad imperante de pases en vas de desarrollo de actualizar su tecnologa, equipos, infraestructura y mtodos de deteccin rpida y efectiva de microorganismos; utilizados para la exportacin de productos alimenticios a mercados que exigen el ingreso de alimentos inocuos para su poblacin y estableciendo en sus fronteras para lograrlo, de estrictos y rigurosos sistemas de monitoreo de embarques alimenticios va terrestre o martima.. Ante esta problemtica, en la que el exportador requiere cumplir con los criterios de aceptacin del pas que importar su producto, exige a sus gobiernos planes, programas y estrategias que le
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permitan estar a la vanguardia en mtodos para el anlisis microbiolgico del alimento a exportar y le asegure el ingreso de su producto en esos mercados. Mxico no es la excepcin, que teniendo tratados bilaterales y de libre comercio, sus productos deben cumplir con los criterios de aceptacin del mercado importador, por lo que se ve en la necesidad de apoyar a sus productores con metodologas actualizadas, rpidas y precisas; y as dar el cumplimiento a estos criterios dando paso a normas oficiales y regulaciones nacionales e internacionales en el aspecto de determinacin de microorganismos microbiolgicos. En trminos de produccin de alimentos y capacidad de adquirirlos, los pases se dividen en tres grupos: 1) Los que tienen la capacidad agrcola para ser autosuficientes en la produccin de alimentos; 2) Los que no son autosuficientes en la produccin de alimentos pero tienen otros recursos que les permiten importar suministros alimentarios adecuados; y 3) Los que no son autosuficientes en la produccin de alimentos y no poseen los recursos financieros necesarios para cubrir el dficit con importaciones. Siendo Mxico incluyente dentro del primer grupo tiene establecidas las siguientes normas con las cuales regula dentro del territorio mexicano los productos alimenticios que son generados tanto para exportacin o el consumo de los mismos dentro del pas. Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la Determinacin de Salmonella en Alimentos. Norma Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-1995, bienes y servicios. Mtodo de prueba microbiolgico para alimentos. Determinacin de Listeria monocytogenes.
Algunas tendencias en las que se conjuga no solo la bsqueda de alimentos saludables sino la posibilidad de alimentarse adecuadamente en el difcil mundo de hoy, muestran que el pblico general busca alimentos menos procesados con aspecto y calidad similares a los recin preparados. Entre estos se incluyen : alimentos frescos o mnimamente procesados, platos preparados o precocinados (refrigerados, congelados), productos semipreparados o precocidos que slo requieren calentamiento para su consumo y la comida rpida en la que se valora que sea rpida de consumir, fcil de llevar y que adems sean productos saludables. Ante esta situacin el control biolgico de estos alimentos requiere de metodologas microbiolgicas que le permitan identificar y cuantificar en forma eficiente y rpida, por la vida de anaquel tan corta que presentan estos alimentos. Los microorganismos son responsables de algunas de las ms serias intoxicaciones alimentarias y causan tambin la descomposicin de una gran variedad de alimentos. Ante esta temtica, es importante la actualizacin e incorporacin a la normatividad mexicana de nuevas guas determinativas ms adecuadas y con el alcance necesario que el productor mexicano requiera para la colocacin de sus productos alimenticios en mercados tanto nacionales como internacionales, como lo son las normas ISO y algunos mtodos rpidos del BAM (Bacteriological Analytical Manual), USDA Laboratory Guide Notebook, por mencionar algunos. Desarrollo de mtodos Desde la dcada del 70, el desarrollo y la implementacin de los mtodos rpidos para la identificacin de microorganismos evolucionaron en paralelo con los adelantos en otras reas de la investigacin cientfica, en particular con la generalizacin del uso de galeras de pruebas bioqumicas miniaturizadas.
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A partir de la dcada del 80, el avance en la produccin de anticuerpos monoclonales hizo posible el desarrollo de pruebas inmunolgicas de identificacin, como el ELISA o la inmunocromatografa. En 1990, con el advenimiento de las tcnicas de biologa molecular comenzaron a utilizarse tcnicas como la PCR, tanto para tamizaje como para la identificacin de microorganismos y sus factores de virulencia. A partir del ao 2000, comenz el desarrollo de biosensores y en menor medida de biochips y microarreglos. El crecimiento exponencial de los mtodos rpidos aplicados a la microbiologa de los alimentos puede evidenciarse en la gran cantidad de equipos comerciales que se ofrecen en la actualidad con el objetivo de tener resultados rpidos, en tiempo real, exactos y de bajo costo. Por ejemplo, como consecuencia de la automatizacin, el estudio de genotipos bacterianos pas de ser un proceso tedioso y lento a un mtodo prctico que se puede aplicar en los ensayos microbiolgicos cotidianos. Los factores que justifican la utilizacin de mtodos rpidos e impulsan su desarrollo son numerosos, entre ellos se pueden mencionar las presiones regulatorias, las modernas prcticas de produccin y la complejidad analtica. Para hacer frente a las presiones regulatorias, la industria alimentaria debe utilizar mtodos oficiales de referencia, como los recomendados por la ISO (International Standards Organization) y AOAC (International Association of Official Analytical Chemists), entre otras. Actualmente, algunos mtodos rpidos son recomendados como tcnicas de tamizaje por agencias regulatorias internacionales. En consecuencia, la oferta de mtodos rpidos es cuantiosa. Sin embargo, se debe considerar que antes de la adopcin de nuevos mtodos por parte de la industria, estos deben tener constancia del proceso de estandarizacin y validacin ante entidades internacionales, o bien en instancias inter e intralaboratorio. Algunos mtodos para la deteccin de patgenos evolucionaron desde los anlisis estndar realizados en el laboratorio, hacia anlisis efectuados en tiempo real en la lnea de produccin. Esta tendencia hacia las pruebas en tiempo real, que surgi debido a la necesidad de ofrecer informacin de utilidad durante la operacin de produccin de alimentos, se trata de un esfuerzo para superar en parte las deficiencias de los mtodos convencionales cuyos resultados no se pueden utilizar para controlar el proceso in situ. En el presente, la industria de alimentos basa la seguridad y calidad de sus productos en pruebas o medidas fuera de la lnea de produccin. Sin embargo, las nuevas tendencias hacen cada vez ms necesaria la implementacin de un sistema de medicin continua y en tiempo real, que haga posible la intervencin in-line u on-line. Las medidas de intervencin in-line son aquellas que se efectan directamente en la lnea del proceso y las medidas de intervencin on-line son aquellas que pueden efectuarse en un asa by-pass de la lnea principal del proceso y que luego de la medida se retorna a la lnea principal. Desde una perspectiva futurista, el Dr. Daniel Fung, profesor de la Universidad de Kansas y uno de los mayores expertos sobre mtodos rpidos aplicados a la microbiologa de alimentos, propuso el siguiente escenario para los prximos aos: 1) no se podr reemplazar el recuento de microorganismos viables,
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2) la supervisin de la higiene con mtodos rpidos se efectuar en tiempo real, 3) las tcnicas genotpicas sern habituales en los laboratorios de alimentos, 4) las pruebas inmunolgicas sern automatizadas, 5) los resultados ms rpidos se obtendrn con inmunocromatografa, 6) en los programas de anlisis de peligros y de puntos crticos de control o HACCP (siglas en ingls) se utilizarn biosensores, 7) los patgenos se detectarn inmediatamente de forma computarizada, 8) se realizar la separacin y la concentracin eficaz de las bacterias buscadas, 9) se utilizar un sistema de alerta microbiolgico en los envases de alimentos, 10) los consumidores tendrn dispositivos de alerta rpido para detectar patgenos en sus hogares. Como se puede deducir, el desarrollo de mtodos rpidos est dirigido hacia las empresas productoras de alimentos en primera instancia y luego a los consumidores. Sin embargo, se debe considerar que para los organismos municipales, provinciales o nacionales responsables del control de los alimentos no es habitual el uso de mtodos rpidos, sobre todo de mtodos moleculares. Esto se debe a que actualmente la tendencia internacional de los organismos de control est orientada al aseguramiento de los programas de HACCP utilizados por las empresas productoras de alimentos y no al anlisis microbiolgico del producto final. Aunque en pases como el nuestro, donde la aplicacin de este tipo de programas de control an no es de cumplimiento obligatorio, no es posible asegurar que la oferta de alimentos en la boca de expendio provenga de empresas que utilizan programas HACCP. Es entonces cuando la utilizacin de los mtodos rpidos puede agilizar y mejorar los resultados generados por los organismos de control. Sin embargo, tambin se debe considerar que para la utilizacin de los mtodos rpidos, adems de inversiones y operadores capacitados, se requieren polticas estatales de control tendientes a asegurar la calidad de los alimentos que consumimos. Caractersticas principales de los microorganismos patgenos ms relevantes considerados en la normatividad de productos de la pesca y la acuicultura, por su implicacin en salud pblica y por ser causa de detenciones y notificaciones de producto en el mbito internacional. (Representa el fundamento cientfico para considerar la conveniencia o no de la regulacin de un patgeno en un alimento). El estudio de las ETAs de origen acutico en el mbito mundial, se ha incrementado notablemente en las ltimas tres dcadas, debido a diversos factores: a) Culturales, que ha implicado mayor apertura a productos del mar que anteriormente no se consuman o estaban restringido a ciertas tradiciones o hbitos culinarios; b) Sociales, incremento de las poblaciones humanas y con ello de la demanda de protenas de calidad. Al mismo tiempo, las ETAs son motivo de ausencia al trabajo, gastos mdicos y prdidas econmicas;
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c) Comerciales, la globalizacin del comercio de alimentos permite ahora el acceso a productos de diferentes pases sin un adecuado control que garantice su condicin de inocuidad, causa detenciones y notificaciones de producto, cancelacin de ventas y en ocasiones hay desperdicio del producto. d) Deficiencias en prcticas de higiene. Falta de capacitacin y conocimiento en el manejo adecuado de estos productos en toda la cadena de produccin, procesamiento, comercializacin y consumo; e) Intensificacin de la produccin acucola y pesquera. Debido a la presin que ejerce la demanda de pescados y mariscos sobre estos sistemas de produccin, el esfuerzo pesquero y las densidades de organismos que se manejan son cada vez mayores y con ello, los riesgos de contaminacin y diseminacin de patgenos tambin se han incrementado; f) Otras actividades antropognicas han ocasionado cambios relacionados con la calidad de agua en cuerpos naturales y con ello los niveles de contaminacin microbiolgica; g) Aparicin de nuevas cepas o variantes patgenas;
Los patgenos ms relevantes que se han relacionados con las ETAs, de origen acuticos, son: Salmonella spp., E. coli, V. cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus, las enfermedades son causadas por los microorganismos y/o sus toxinas y la mayora se manifiestan como cuadros gastrointestinales, que varan en gravedad y duracin. El Centro de Control y Prevencin de Enfermedades (CDC) ha estimado 76 millones de casos, con 5 000 muertos y 325 000 hospitalizaciones relacionadas con las ETAs cada ao en EE. UU. y un gran porcentaje han estado relacionadas con pescados y mariscos. Se considera que las enfermedades causadas por Campylobacter, Salmonella, E. coli O157, y Listeria monocytogenes tienen costos de casi US$ 7 billones cada ao. En pases en desarrollo, se calcula en 2 millones de nios las mortalidades por enfermedades diarreicas causadas por alimentos y agua contaminada cada ao, siendo la causa ms comn los patgenos virales y bacterianos. En Mxico el consumo de productos pesqueros es de aproximadamente 1.3 millones de toneladas anuales, de las cuales el 5.66 % son de consumo de camarn. La contaminacin de este producto por diversos microorganismos patgenos, lo convierten en fuente importante de ETAs; de esta manera en el ao de 1999, se notificaron 163 brotes de ETAs determinndose 2 427 personas enfermas y 9 defunciones; en el 2005, se inform de 191 brotes con 4 771 enfermos y 17 decesos, este informe indic que el nmero de brotes asociados con el consumo de pescados fue del 6.3 %, lo que signific el 4 lugar entre los alimentos ms involucrados con brotes de ETAs. En relacin con los agentes etiolgicos, slo en el 56 % de los brotes se identific su naturaleza, de los cuales 12.9 % fueron de origen bacteriano (Prez et al., 2005).
Revisin y anlisis de la normatividad nacional e internacional ms importante en el campo de la microbiologa, para garantizar la inocuidad en alimentos de origen acutico. Nacional.
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El Gobierno Mexicano tiene como prioridad el establecimiento de polticas que promuevan la inocuidad de los alimentos, mediante la implementacin de sistemas de reduccin de riesgos en unidades de produccin, extraccin y procesamiento primario de alimentos de origen acucola y pesquero, tanto para disminuir la incidencia de enfermedades ocasionadas a la poblacin por la contaminacin de los mismos, como para asegurar e incrementar su comercializacin interna y de exportacin. El marco legal y normativo para garantizar la inocuidad de los alimentos de origen acutico en Mxico, es responsabilidad de SAGARPA a travs del SENASICA (Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria) y es un tema principal en la agenda dentro de las actividades primarias. Este organo tiene competencia sobre la inocuidad de los alimentos a partir del 2001 y esta respaldado en la Ley General de Pesca y Acuicultura Sustentables actualizada en el 2009. El Reglamento interior establece atribuciones especficas al SENASICA en el artculo 49, las cuales son: Establecer polticas, lineamientos, criterios, sistemas, estrategias, programas, proyectos, procedimientos y servicios que coadyuven a mejorar la inocuidad de los alimentos de origen animal, vegetal, acucola y pesquero. Proponer disposiciones generales a travs de reglamentos y normas oficiales mexicanas para garantizar la inocuidad de los alimentos y sus procesos de produccin, procesamiento, almacn, empaque, transporte y distribucin. Reconocer, autorizar y en su caso, certificar los sistemas de produccin, procesamiento, verificacin e inspeccin de alimentos con el fin de garantizar su calidad sanitaria para consumo nacional o exportacin. La Secretara de Salud en Mxico, es la encargada de regular los aspectos relacionados a la salud de las personas. La Ley General de Salud reglamenta el derecho a la proteccin de la salud que tiene toda persona en los trminos del artculo 4 de la Constitucin Poltica de los Estados Unidos Mexicanos, el cual establece que Toda persona tiene derecho a la alimentacin nutritiva, suficiente y de calidad. El estado lo garantizar (decreto publicado en el DOF del 13 de octubre de 2011). Es de aplicacin en toda la Repblica y sus disposiciones son de orden pblico e inters social. Finalmente, cuenta con reglamentos especficos sobre los productos acuticos, como el Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios (DOF mircoles 26 de enero 2011). El siguiente es un listado de la reglamentacin en materia de inocuidad y presenta las normas y otros documentos que son aplicados en Mxico como guas y directrices en relacin a las especificaciones sanitarias y de higiene, as como a mtodos y tcnicas para la deteccin de los microorganismos patgenos ms importantes y reconocidos como responsables de enfermedades transmitidos por alimentos (ETAS) de origen acuticos (pesca y acuicultura). Aplica a los procesos productivos, transporte, almacenamiento, procesamiento y venta de crustceos, moluscos y peces en diferentes presentaciones. La normativa plantea tambin la aplicacin de un sistema de anlisis de riesgos y control de puntos crticos (HACCP) en plantas procesadoras y de buenas prcticas como medidas preventivas. 1. Secretara de Salud. Mtodo de prueba para la estimacin de la densidad microbiana por la tcnica del nmero ms probable (NMP), deteccin de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. CCAYAC-M-004. Revisin No. 8. Fecha de emisin: 25 Nov. 2011. Mxico. 34p.
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2. NOM-027-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Pescados frescosrefrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. 3. NOM-028-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Pescados en conserva. Especificaciones sanitarias. 4. NOM-029-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustceos frescosrefrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. 5. NOM-030-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustceos en conserva. Especificaciones sanitarias. 6. NOM-031-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. 7. NOM-032-SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos en conserva. Especificaciones sanitarias. 8. PROY-NOM-109-SSA1-1994, bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. 9. NOM-110-SSA1-1994, bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. 10. NOM-112-SSA1-1994, bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. 11. NOM-113-SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. 12. NOM-114-SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos. 13. NOM-115-SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. 14. NOM-128-SSA1-1994, bienes y servicios. Que establece la aplicacin de un sistema de anlisis de riesgos y control de puntos crticos en la planta industrial procesadora de productos de la pesca. 15. NOM-129-SSA1-1995. Bienes y servicios. Productos de la pesca: secos salados, ahumados, moluscos cefalpodos y gasterpodos frescos-refrigerados y congelados. Disposiciones y especificaciones sanitarias. 16. NOM-143-SSA1-1995, bienes y servicios. Mtodo de prueba microbiolgico para alimentos. Determinacin de Listeria monocytogenes. 17. NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba 18. NOM-251-SSA1-2009, Prcticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios. 19. NMX-F-539-SCFI-2009 Productos de la pesca - filetes de anchoa en aceite enlatados especificaciones. 20. NOM242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesado. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba. La mayora de las normas no indican concordancia con normas internacionales, otras solo sealan equivalencia parcial, sin embargo los mtodos y tcnicas a los que hacen mencin, estn basados en procedimientos estandarizados y recomendados en el mbito internacional. En la Tabla 6 se presenta de manera resumida, informacin relevante y particular de cada norma y la manera como se complementa con otras. En particular, la NOM-242-SSA1-2009 es de reciente publicacin en el Diario Oficial de la Federacin (Febrero 2011) y est basada en informacin cientfica, reglamentos e instrumentos nacionales e internacionales de EE. UU., Canad, Australia, Unin Europea (UE) y organismos
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como FAO, OMS, OIE y OMC. Integra informacin relacionada con tcnicas y mtodos para la deteccin de los principales patgenos relacionados con ETAs de origen acutico (Salmonella spp. Staphylococcusaureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus), as como para Clostridium spp. y coliformes. Pese a lo anterior, dicha norma no toma en cuenta los adelantos cientficos y nuevas tecnologas desarrolladas en las ltimas dos dcadas en materia de anlisis microbiolgico y diagnstico, ni de adecuaciones a los mtodos analticos convencionales que pudieran ofrecer mayores beneficios a los usuarios en trminos de automatizacin, especificidad, sensibilidad, capacidad y tiempo de respuesta, disminucin de costos, discriminacin de cepas toxignicas y principalmente del nivel de seguridad en la inocuidad de los alimentos. Tabla 6.- NORMAS MEXICANAS DESTINADAS A ASEGURAR LA INOCUIDAD DE PRODUCTOS DERIVADOS DE LA PESCA Y ACUICULTURA. NOMBRE DE LA NORMA CAMPO DE APLICACIN FUNDAMENTO
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Secretara de Salud. Mtodo de prueba para la estimacin de la densidad microbiana por la tcnica del nmero ms probable (NMP), deteccin de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. CCAYAC-M-004. Revisin No. 8. Fecha de emisin: 25 Nov. 2011. Mxico. 34p. Concordancia: El documento no menciona concordancia con normas internacionales. Sin embargo la metodologa que presenta se basa en procedimientos estandarizados y recomendados en el mbito internacional.
Este mtodo es aplicable para la deteccin de coliformes totales, coliformes fecales y E. coli, especialmente en productos que se encuentran en bajas concentraciones de microorganismos (<10 UFC/g o ml). Por ejemplo: alimentos cuyas caractersticas particulares puedan interferir en la exactitud de la cuenta de unidades formadoras de colonias (UFC).
La deteccin de bacterias coliformes se usa como indicador de la calidad sanitaria de agua o como indicador de condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos. Las coliformes fecales continan siendo el indicador de eleccin para moluscos bivalvos y sus aguas de cultivo y E. coli como indicador de contaminacin fecal reciente o condiciones higinicas inadecuadas. El mtodo se basa en la fermentacin de la lactosa y el NMP es una prueba presuntiva y confirmativa. La serie de 3 tubos generalmente se utiliza para la mayora de los alimentos, la serie de 5 tubos se emplea para moluscos y para diversos tipos de aguas, las series de 3, 5, y 10 tubos dependiendo de la contaminacin esperada y del grado de exactitud deseado. Se basa en la dilucin de la muestra en tubos mltiples, de tal forma que todos los tubos de la menor dilucin sean positivos y todos los tubos de la mayor dilucin sean negativos. El resultado positivo se demuestra por la presencia de gas y/o crecimiento microbiano propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de la fermentacin de lactosa dentro de las 48 horas incubacin a 35 0.5 C (coliformes) y a 45.5 0.2 C (coliformes fecales y E. coli).
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-027SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Pescados frescosrefrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. Concordancia: Esta Norma no menciona concordancia con normas internacionales. Se
Establece las especificaciones sanitarias de los pescados frescosrefrigerados y congelados.
Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayora son de tipo infeccioso, su incidencia sigue constituyendo un grave problema de salud pblica y es una de las causas Es de observancia obligatoria principales de morbilidad que ocupan en el territorio nacional para el segundo lugar entre las las personas fsicas o enfermedades transmisibles de morales que se dedican a su notificacin obligatoria. Entre los proceso o importacin. alimentos involucrados resaltan el Presenta el mtodo de prueba pescado fresco-refrigerado y para la determinacin congelado, debido a que por su origen, microbiolgica de Vibrio es probable la contaminacin cholerae (NOM-031-SSA1- microbiolgica y qumica, entre otras y que aunado a la forma de consumo,
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complementa con: NOM-031-SSA1-1993; NOM-051-SFCI-1994; NOM-092-SSA1-1994; NOM-112-SSA1-1994; NOM-113-SSA1-1994; NOM-114-SSA1-1994; NOM 115-SSA1-1994; NOM-120-SSA1-1994; NOM-128-SSA1-1994. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-028SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Pescados en conserva. Especificaciones sanitarias.
1994). Establece el lmite mximo permisible para: Mesoflicos aerobios, Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae O1 toxignico y Salmonella spp.
pueden generar enfermedades para el consumidor. Una norma oficial Mexicana que regule a estos productos desde el punto de vista sanitario, permitir promover el consumo de los mismos y a la vez proteger la salud del consumidor.
Establece las especificaciones sanitarias de los pescados en conserva. Es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas o morales que se dedican a su proceso o importacin. Establece como requisito, la ausencia Concordancia: Esta de: norma no menciona concordancia con normas Mesoflicos aerobios, internacionales. Mesoflicos anaerobios, Termoflicos aerobios y Se complementa con: Termoflicos anaerobios. NOM-120-SSA1-1994 y NOM-128-SSA1-1994.
Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayora son de tipo infeccioso, su incidencia sigue constituyendo un grave problema de salud pblica y es una de las causas principales de morbilidad que ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificacin obligatoria. Entre los alimentos involucrados resaltan los pescados en conserva, debido a que estos productos en su origen estn sometidos a una contaminacin microbiolgica y qumica entre otras y que aunado a la forma de consumo generan enfermedades para el consumidor. Una norma oficial Mexicana que regule a estos productos desde el punto de vista sanitario, permitir promover el consumo de los mismos y a la vez proteger la salud del consumidor. Los productos con un pH superior a 4.6 deben recibir un tratamiento capaz de destruir todas las esporas de Clostridium botulinum, a menos que la proliferacin de las esporas supervivientes quede impedida en forma permanente por otras
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caractersticas distintas del pH. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-029SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustceos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. Establece las especificaciones sanitarias de los crustceos frescosrefrigerados y congelados. Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayora son de tipo infeccioso, su incidencia sigue constituyendo un grave problema de salud pblica y es una de las causas principales de morbilidad que ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificacin obligatoria. Entre los alimentos involucrados resaltan los crustceos frescos-refrigerados y congelados, debido a que estos productos en su origen estn sometidos a una contaminacin microbiolgica y qumica entre otras, que aunado a la forma de consumo generan enfermedades para el consumidor. Una norma oficial Mexicana que regule a estos productos desde el punto de vista sanitario, permitir promover el consumo de los mismos y a la vez proteger la salud del consumidor.
Es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas o morales que se dedican a su proceso o importacin. Presenta el mtodo de prueba Concordancia: para la determinacin Esta Norma no menciona microbiolgica de Vibrio concordancia con normas cholerae (NOM-031-SSA1internacionales. 1994). Se complementa con: NOM-027-SSA1-1993; NOM-031-SSA1-1993; NOM-092-SSA1-1994 NOM-110-SSA1-1994 NOM-112-SSA1-1994 NOM-113-SSA1-1994 NOM-114-SSA1-1994 NOM-115-SSA1-1994 NOM-120-SSA1-1994 NOM-128-SSA1-1994 NORMA Oficial Mexicana NOM-030SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Crustceos en conserva. Especificaciones sanitarias. Establece las especificaciones sanitarias de los crustceos en conserva. Es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas o morales que se dedican a su proceso o importacin. Establece el lmite mximo permisible para: Mesoflicos aerobios, Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae O1 toxignico y Salmonella spp.
Concordancia:
Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayora son de tipo infeccioso, su incidencia sigue constituyendo un grave problema de salud pblica y es una de las causas principales de morbilidad que ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificacin obligatoria. Entre los Establece como requisito, la alimentos involucrados resaltan los ausencia de: crustceos en conserva, debido a que estos productos en su origen estn Mesoflicos aerobios, sometidos a una contaminacin
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Esta norma no tiene Mesoflicos concordancia con normas Termoflicos internacionales. Termoflicos Se complementa con: NOM-120-SSA1-1994 NOM-128-SSA1-1994
anaerobios, microbiolgica y qumica entre otras, aerobios y que aunado a la forma de consumo enfermedades para el anaerobios. generan consumidor. Una norma oficial Mexicana que regule a estos productos desde el punto de vista sanitario, permitir promover el consumo de los mismos y a la vez proteger la salud del consumidor.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-031SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos frescosrefrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias.
Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayora son de tipo infeccioso, su incidencia sigue constituyendo un grave problema de salud pblica y es una de las causas principales de morbilidad que ocupan Es de observancia obligatoria el segundo lugar entre las en el territorio nacional para enfermedades transmisibles de las personas fsicas o notificacin obligatoria. Entre los morales que se dedican a su alimentos involucrados resaltan los proceso o importacin. moluscos frescos-refrigerados y Concordancia: congelados, debido a que estos Establece el lmite mximo productos en su origen estn sometidos Esta norma no tiene permisible para a una contaminacin microbiolgica y concordancia con normas microrganismos qumica entre otras, que aunado a la internacionales. forma de consumo generan Mesoflicos aerobios, enfermedades para el consumidor. Se complementa con: Bacterias coliformes fecales, Debido a lo anterior y a la fisiologa de Salmonella spp. y Vibrio los moluscos, se hace necesaria la NOM-092-SSA1-1994 cholerae 01 toxignico, en regulacin y clasificacin de las reas carne y liquido intervalvar. NOM-110-SSA1-1994 De igual manera en reas de de produccin. produccin clasificadas NOM-112-SSA1-1994 Una norma oficial Mexicana que regule como: rea aprobada, rea a estos productos desde el punto de aprobada condicionalmente, NOM-114-SSA1-1994 vista sanitario, permitir promover el rea restringida y rea consumo de los mismos y a la vez NOM-120-SSA1-1994 prohibida. proteger la salud del consumidor. NOM-128-SSA1-1994 Describe la tcnica y procedimientos para la investigacin de Vibrio cholerae en moluscos bivalvos y el procedimiento para la diferenciacin de V. cholerae O1, V.cholerae No 01 y otras especies de Vibrios. Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayora son de tipo
Establece las especificaciones sanitarias de los moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados.
NORMA Mexicana
Oficial Establece las NOM-032- especificaciones sanitarias de
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SSA1-1993, bienes y servicios. Productos de la pesca. Moluscos bivalvos en conserva. Especificaciones sanitarias.
infeccioso, su incidencia sigue constituyendo un grave problema de salud pblica y es una de las causas Es de observancia obligatoria principales de morbilidad que ocupan en el territorio nacional para el segundo lugar entre las las personas fsicas o enfermedades transmisibles de morales que se dedican a su notificacin obligatoria. Entre los proceso o importacin. Concordancia: alimentos involucrados resaltan los moluscos bivalvos en conserva, Esta norma no tiene Establece como requisito, la debido a que estos productos en su concordancia con normas ausencia de: origen estn sometidos a una internacionales. contaminacin microbiolgica y Mesoflicos aerobios, qumica entre otras, que aunado a la Se complementa con: Mesoflicos anaerobios, forma de consumo generan Termoflicos aerobios y enfermedades para el consumidor. NOM-120-SSA1-1994 Termoflicos anaerobios. Debido a lo anterior y a la fisiologa de NOM-128-SSA1-1994 los moluscos, se hace necesaria la regulacin y clasificacin de las reas de produccin. Una norma oficial Mexicana que regule a estos productos desde el punto de vista sanitario, permitir promover el consumo de los mismos y a la vez proteger la salud del consumidor. PROYECTO de Norma Oficial Mexicana NOM109-SSA1-1994, bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Concordancia: Establece los procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas o morales que requieren efectuar este procedimiento para el anlisis microbiolgico de alimentos nacionales y de importacin. Destaca la importancia del muestreo, la adecuada seleccin y toma de muestra, los medios de conservacin, su transporte al laboratorio, ya que son factores determinantes para la obtencin de resultados significativos y confiables.
los moluscos bivalvos en conserva.
Esta norma no tiene concordancia con normas No hace distincin para internacionales. algn alimento en particular, pero es de vital Se complementa con: importancia en alimentos perecederos. NOM-008-SCFI-1993 Norma Oficial Mexicana. Sistema General de Unidades de Medida. Secretara de Comercio y
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Fomento Industrial. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-110SSA1-1994, bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Concordancia: Esta norma es tcnicamente equivalente a la norma ISO 68871983 (E) microbiology general guidance for the preparation of dilutions for microbiological examination. international organization for standardization. Se complementa con: NOM-109-SSA1-1994. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112SSA1-1994, bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. Concordancia: Establece el mtodo microbiolgico para estimar el nmero de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del clculo del nmero ms probable (NMP). Puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados trmicamente, as como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prcticas sanitarias en la industria alimentaria. El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 1C durante (24 a 48) horas, resultando una produccin de cidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentacin. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como mnimo de una bacteria en 10 ml de producto lquido o una bacteria por gramo de alimento slido. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por mililitro o gramo de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el mtodo en placa. Establece el procedimiento para la preparacin de diluciones para el anlisis microbiolgico de productos alimenticios. Es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas o morales que se dedican a efectuar este mtodo en alimentos nacionales o de importacin, para fines oficiales. Se basa en la preparacin de diluciones primarias, para obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos presentes en la porcin de muestra.
El documento no menciona concordancia con normas internacionales. Sin embargo la metodologa que presenta se basa en procedimientos estandarizados y Es de observancia obligatoria recomendados en el en el territorio nacional para mbito internacional. las personas fsicas o morales que requieran Se complementa con: efectuar este mtodo en productos nacionales o de NOM-109-SSA1-1994 importacin, para fines
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NOM-110-SSA1-1994 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-113SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
oficiales. Establece el mtodo microbiolgico para determinar el nmero de microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por medio de la tcnica de cuenta en placa. El mtodo permite determinar el nmero de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35 C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la produccin de gas y cidos orgnicos, los cuales viran el indicador Es de observancia obligatoria de pH y precipitan las sales biliares. en el territorio nacional para las personas fsicas o morales que requieran efectuar este mtodo en productos nacionales o de importacin, para fines oficiales.
Concordancia:. El documento no menciona concordancia con normas internacionales. Sin embargo la metodologa que presenta se basa en procedimientos estandarizados y recomendados en el mbito internacional. Se complementa con: NOM-109-SSA1-1994 NOM-110-SSA1-1994 NOM-092-SSA1-1994 NOM-112-SSA1-1994 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos.
Establece un mtodo general para la determinacin de Salmonella en alimentos.
El mtodo describe de manera general 5 pasos bsicos para la deteccin de Salmonella.: a) Preenriquecimiento, permite la restauracin de las clulas de Salmonella daadas a una condicin fisiolgica estable. b) Enriquecimiento para incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra. c) Crecimiento en medios slidos selectivos, con el fin restringir el
Es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas y morales que requieran efectuar este mtodo en Concordancia: productos nacionales y de El documento no importacin para fines menciona concordancia oficiales. con normas internacionales. Sin embargo la metodologa que presenta se basa en
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procedimientos estandarizados recomendados en mbito internacional. Se complementa con: NOM-109-SSA1-1994
y el
crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y permitir el reconocimiento visual de colonias sospechosas. d) Identificacin bioqumica, para la determinacin genrica de Salmonella. e) Serotipificacin, para la identificacin especfica de la cepa en cultivo.
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. Concordancia: El documento no menciona concordancia con normas internacionales. Sin embargo la metodologa que presenta se basa en procedimientos estandarizados y recomendados en el mbito internacional. Se complementa con: NOM-109-SSA1-1994 NOM-110-SSA1-1994 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-128SSA1-1994, bienes y servicios. Que establece la aplicacin de un sistema de anlisis de riesgos y control de puntos crticos en la planta industrial procesadora de productos de la pesca.
Establece el mtodo microbiolgico para determinar la cuenta de S. aureus presente en alimentos de cualquier tipo (nacionales o de importacin), que puedan estar potencialmente contaminados con este patgeno. Es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas o morales que requieran demostrar, para fines oficiales, la ausencia de microorganismos en sus productos.
El mtodo permite hacer una estimacin del contenido de S. aureus en alimentos. Se efecta directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial y confirmacin mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa. El mtodo es adecuado para el anlisis de alimentos en los cuales se esperen ms de 100 clulas de S. aureus por g.
Establece la aplicacin de un sistema de anlisis de riesgos y control de puntos crticos en la planta industrial procesadora de productos de la pesca.
Disposiciones sanitarias para moluscos bivalvos crudos.
Aquella planta industrial o importador que se dediquen al manejo de los moluscos bivalvos deben incluir en su Programa de Anlisis de Riesgos y Se aplica a las personas Control de Puntos Crticos (HACCP) fsicas o morales que se la manera por medio de la cual estn dedican a su proceso y controlando el origen de los mismos. comercializacin. En la planta industrial slo deben No se aplica a las personas procesarse moluscos bivalvos que
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Concordancia: -Fish Inspection Act, R.S.C., 1070, c.F.-12, Canadian Fish Inspections Regulations. -Fish Inspection Regulations, p.C. 1978, c.802, as amended, Canada. - Food And Drugs Act and Regulations, Department Of National Health and Welfare, Canada. -Diario Oficial de la Comunidad Europea, L 268, 34o. ao, 24 de septiembre de 1991. -Diario Oficial de la Comunidad Europea, L 268, 34o. ao, 24 de septiembre de 1991. -Diario Oficial de la Comunidad Europea, VI/3202/93-EN-Rev.7 (PVET/EN/2016). NOM-129-SSA1-1995. Bienes y servicios. Productos de la pesca: secos salados, ahumados, moluscos cefalpodos y gasterpodos frescosrefrigerados y congelados. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Concordancia:
fsicas o morales que slo cosechan y transportan alimentos de origen marino, es decir que no estn involucradas en el proceso del producto ni a las operaciones que se efectan en los establecimientos de venta al detalle.
cumplan con la Norma Mexicana correspondiente.
Oficial
Los procesadores o importadores deben guardar y mantener actualizados los registros de cada lote recibido y procesado.
Esta Norma Oficial Mexicana establece especificaciones sanitarias para productos de la pesca en diferentes presentaciones. Para productos frescos, refrigerados y congelados considera a: Mesoflicos aerobios, Coliformes fecales, Salmonella spp. y Vibrio cholerae O1 toxignico.
Para productos secos Esta Norma es salados: Staphylococcus parcialmente equivalente aureus y Salmonella spp. a la siguiente norma y Para ahumados:
Las enfermedades transmitidas por alimentos, en su mayora son de tipo infeccioso, su incidencia sigue constituyendo un grave problema de salud pblica y es una de las causas principales de morbilidad que ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificacin obligatoria. Entre los alimentos involucrados resaltan los productos de la pesca: secos salados, ahumados, moluscos cefalpodos y gasterpodos frescos-refrigerados y congelados. Debido a que estos productos en su origen estn sometidos a una contaminacin microbiolgica y qumica entre otras, que aunado a la forma de consumo generan
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cdigos. -FAO/OMS. Norma Codex para Pescado seco - salado (Klippfish) de la familia de los Gadidae. Codex Stan 167-1989.
-FAO/OMS. Cdigo Internacional recomendado de prcticas para el Pescado seco- Esta Norma Oficial salado. CAC/RCP 26- Mexicana es de observancia 1979. obligatoria en el territorio nacional para las personas -FAO/OMS. Cdigo fsicas o morales que se Internacional dedican a su proceso o recomendado de prcticas importacin. para el Pescado ahumado. CAC/RCP 25-1979. -FAO/OMS. Cdigo Internacional recomendado de prcticas para Cefalpodos. CAC/RCP 37-1989.
Mesoflicos aerobios, Salmonella spp., Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum y Vibrio cholerae O1 toxignico.
enfermedades para el consumidor. Una Norma Oficial Mexicana que regule a estos productos desde el punto de vista sanitario, permitir promover el consumo de los mismos y a la vez proteger la salud del consumidor.
Se complementa con: NOM-028-SSA1-1993 NOM-030-SSA1-1993 NOM-031-SSA1-1993 NOM-051-SCFI-1993 NOM-092-SSA1-1994 NOM-110-SSA1-1994 NOM-112-SSA1-1994 NOM-113-SSA1-1994 NOM-114-SSA1-1994 NOM-115-SSA1-1994 NOM-120-SSA1-1994
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NOM-122-SSA1-1994 NOM-128-SSA1-1994 NOM-143-SSA1-1994 NOM-143-SSA1-1995, bienes y servicios. Mtodo de prueba microbiolgico para alimentos. Determinacin de Listeria monocytogenes. Concordancia: El documento no menciona concordancia con Normas Internacionales. Sin embargo la metodologa que presenta se basa en procedimientos estandarizados y recomendados en el mbito internacional. Se complementa con: NOM-110-SSA1-1994 NORMA Oficial Mexicana NOM-242SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba. Establece los requisitos sanitarios para: las reas de captura de moluscos bivalvos; los establecimientos que procesan productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados, incluyendo las embarcaciones de pesca y recoleccin, as como las Concordancia: especificaciones sanitarias que deben cumplir dichos Esta norma es productos. parcialmente equivalente con las siguientes normas Es de observancia obligatoria internacionales: en el Territorio Nacional para las personas fsicas o -Codex Alimentarius. morales que se dediquen a la ALINORM 01/18. captura, extraccin, Incluye las diferentes tcnicas y metodologas convencionales y aceptadas para la deteccin y cuantificacin de diferentes patgenos (Salmonella spp, Coliformes fecales y/o E. coli, Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum, Vibrio cholerae O:1 y no O:1, Vibrio parahemolitycus y Staphylococcus aureus) y otros contaminantes, en alimentos derivados de la pesca y acuicultura, en sus diferentes presentaciones. Establece el mtodo microbiolgico para determinar la presencia de Listeria en alimentos. El mtodo se basa en el aislamiento y la diferenciacin de especies de Listeria spp., principalmente por la fermentacin de carbohidratos y la actividad hemoltica de los miembros Es de observancia obligatoria de este gnero. en el Territorio Nacional para las personas fsicas o morales que requieran efectuar este mtodo en productos nacionales y de importacin, para fines oficiales.
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Apndice V.
procesamiento, conservacin, -Codex Alimentarius. almacenamiento, ALINORM 01/18. distribucin, transporte, Apndice III.. venta o importacin de productos de la pesca. -Codex Alimentarius. ALINORM 01/18. Apndice VI. -Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice VII. -Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice IX. -Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice X. -Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XI. -Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XII. -Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XIII. -Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XIV. -Codex Alimentarius. ALINORM 95/18. Apndice XV. Se complementa con: NOM-051-SCFI/SSA12010 NOM-084-SCFI-1994 NOM-051-SSA1-2009 NOM-127-SSA1-1994
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NOM-128-SSA1-1994 NOM-130-SSA1-1995 NOM-201-SSA1-2002 NOM-251-SSA1-2009, Prcticas de higiene para el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios. Concordancia: -Cdigo Internacional Recomendado de Prcticas. Principios Generales de Higiene de los Alimentos. CAC/RCP-1 (1969), Rev. 4 (2003). Se complementa con: NOM-127-SSA1-1994 Establece los requisitos mnimos de buenas prcticas de higiene que deben observarse en el proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios y sus materias primas a fin de evitar su contaminacin a lo largo de su proceso. Es de observancia obligatoria para las personas fsicas o morales que se dedican al proceso de alimentos, bebidas o suplementos alimenticios, destinados a los consumidores en territorio nacional. Hace nfasis en la conveniencia de la aplicacin de un sistema de anlisis de peligros y de puntos crticos de control (HACCP) y directrices para su aplicacin. La presente norma mexicana se aplica nicamente a los filetes de anchoa en aceite enlatados que se comercializan en territorio nacional. Esta Norma Oficial Mexicana se fundamenta en la verificacin de las especificaciones fsicas que se establecen en esta norma, que se deben aplicar las normas mexicanas que se indican en el captulo de referencias y el mtodo de prueba que La determinacin de se indica a continuacin, as como los microorganismos se efecta mtodos establecidos por la Secretara de acuerdo con las normas de Salud. mexicanas NMX-F-0881964, NMX-F-358-S-1981, NMX-F-359-S1980 y NMXF-361-S-1981. Las buenas prcticas de higiene representan un requisito indispensable que deben ser implementado, desde los sitios de produccin hasta la distribucin y venta de los productos, pasando por la cosecha, procesamiento. Cada una de las partes y el personal que esta en contacto con los productos debe cumplir con dichas prcticas. Los establecimientos deben contar con instalaciones que eviten la contaminacin de las materias primas, alimentos, bebidas o suplementos alimenticios.
NMX-F-539-SCFI-2009 Productos de la pesca filetes de anchoa en aceite enlatados especificaciones. Concordancia: Esta norma mexicana no es equivalente a ninguna norma internacional por no existir referencia alguna al momento de su elaboracin Se complementa con: NOM-001-STPS-1993
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NOM-002-SCFI-1993 NOM-027-SSA1-1993 NOM-030-SCFI-2006 NOM-040-SSA1-1993 NOM-051-SCFI-1994 NOM-092-SSA1-1994 NOM-109-SSA1-1994 NOM-110-SSA1-1994 NOM-111-SSA1-1994 NOM-112-SSA1-1994 NOM-113-SSA1-1994 NOM-114-SSA1-1994 NOM-115-SSA1-1994. NOM-116-SSA1-1994 NOM-117-SSA1-1994 NOM-120-SSA1-1994 NOM-128-SSA1-1994 NOM-129-SSA1-1995 NOM-130-SSA1-1995 NMX-F-083-1986 NMX-F-088-1964 NMX-F-144-1978 NMX-F-254-1977 NMX-F-304-1977 NMX-F-314-1977 NMX-F-315-1978 NMX-F-317-S-1978
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NMX-F-358-S-1981 NMX-F-359-S-1980 NMX-F-360-1981 NMX-F-361-S-1981. NMX-FF-539-SCFI-2009 NMX-Z-012/1-1987 NMX-Z-012/2-1987 NMX-Z-012/3-1987 Esta norma
Europea. Normas AENORUNE-ISO. El objetivo de la poltica de seguridad alimentaria de la UE es proteger la salud y los intereses de los consumidores y garantizar el buen funcionamiento del mercado interior entre los 27 pases que la conforman. Para lograr este objetivo, la UE establece y vela por el cumplimiento de normas de control en materia de higiene de los productos alimenticios, de salud y bienestar de los animales, de fitosanidad y de prevencin de los riesgos de contaminacin por sustancias externas adems de establecer normas para el adecuado etiquetado de los productos. Esta poltica fue reformada a principios del ao 2000, de acuerdo con el enfoque de la granja a la mesa. La Comisin de la Comunidad Europea (CCE), ha hecho de la inocuidad alimentaria una de sus prioridades principales, por lo que elabor el Libro Blanco sobre seguridad alimentaria en el que se estableci una poltica alimentaria nueva y dinmica, la SE moderniz la legislacin fijando un conjunto coherente y transparente de normas, se reforzaron los controles desde la explotacin hasta la mesa del consumidor y se aument la eficiencia del sistema de asesoramiento cientfico para garantizar un elevado nivel de salud y proteccin de los consumidores (CCE, 2000). Las prioridades estratgicas para la CCE son: Crear una autoridad Europea de inocuidad alimentaria. Implantar slidamente el enfoque de la granja a la mesa en la normativa alimentaria. Establecer el principio segn el cual, las empresas productoras de alimentos para consumo humano, son las primeras responsables de la inocuidad alimentaria y los gobiernos de los estados miembros deben realizar la supervisin y control. La CCE evala la eficiencia de las capacidades y aptitudes de los estados miembros para realizar ese control por medio de auditorias e inspecciones.
Para el 2002, el consejo y el parlamento europeo crearon, la European Food Safety Authority (EFSA) como un organismo independiente con tareas esenciales, que abarcan la formulacin de dictmenes cientficos, la gestin de los sistemas de alerta rpida, la comunicacin y el dilogo con los consumidores sobre las cuestiones sanitarias y de seguridad alimentaria, as como la creacin de
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redes con las agencias nacionales y los organismos cientficos; convirtindose, la EFSA, en la piedra angular de las evaluaciones de riesgo de la UE concerniente a la seguridad alimentaria (para humanos y piensos animales), colaborando estrechamente con los estados miembros, organismos europeos y organizaciones internacionales y de terceros pases para compartir informacin, datos y mejores prcticas, identificar los riesgos emergentes y desarrollar comunicaciones coherentes de los riesgos de la cadena alimentaria. Los riesgos microbiolgicos de los productos alimenticios de origen acutico, constituyen una prioridad debido a que es de las principales fuentes de ETAs. De acuerdo al reglamento (CE) n 2073/2005 y a otros, los alimentos no deben contener microorganismos ni sus toxinas o metabolitos en cantidades que supongan un riesgo para la salud humana al mismo tiempo prioriza un enfoque estructurado de prevencin, con el buen diseo de procesos y materias primas y la aplicacin de buenas prcticas de higiene, as como los principios HACCP. En relacin al uso de mtodos analticos alternativos, se autoriza su aplicacin siempre que existan procedimientos de validacin con respecto al mtodo de referencia, conforme a la norma EN/ISO 16140 u otros protocolos similares internacionalmente aceptados y su uso deber ser autorizado por la autoridad competente como la Asociacin Espaola de Normalizacin y Certificacin (AENOR). Dicha asociacin es una entidad privada, independiente, sin fines de lucro, reconocida en los mbitos nacional, comunitario e internacional, contribuye, mediante el desarrollo de las actividades de normalizacin y certificacin, a mejorar la calidad en las empresas, sus productos y servicios, as como a proteger el medio ambiente y, con ello, el bienestar de la sociedad. Se constituy en 1986, coincidiendo con la incorporacin de Espaa a la UE. Un ao ms tarde, AENOR asumi la representacin de Espaa ante el Comit Europeo de Normalizacin (CEN) y ante la ISO. Actualmente, son ms de 200 los comits tcnicos de normalizacin en los que participan cerca de 6.000 expertos, de tal manera que dichas normas sirven de referencia para las normas europeas e internacionales. Las Normas UNE-EN-ISO son las que rigen especficamente lo relativo a la microbiologa de los alimentos en la Unin Europea. Su contenido proporciona informacin para el desarrollo e implementacin de mtodos normalizados en los laboratorios, garantizando los resultados, la calidad y la seguridad de los alimentos sometidos a control. Contienen, entre otras especificaciones: Preparacin de medios de cultivo en laboratorios Preparacin de muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico Protocolos de validacin de mtodos alternativos Aplicacin de la PCR para determinacin de patgenos.
Deteccin de los siguientes patgenos: Salmonella typhi, S. paratyphi, Salmonella spp., Escherichia coli O157, Shigella spp., Yersinia enterocoltica y Listeria monocytogenes, otros patgenos contemplados son: Staphylococcus aureus coagulasa positivos, Bacillus cereus y Clostridium perfingens. No se especifican lmites mximos permitidos en los alimentos (pescados, crustceos o moluscos) ni la matriz que se utiliza. Sin embargo en los reglamentos de la CE, relativo a los criterios microbiolgicos aplicables a los productos de origen acutico, si se establecen requerimientos en trminos cuantitativos, dependiendo de las diferentes presentaciones (REGLAMENTO (CE) no 2073/2005 DE LA COMISIN de 15 de noviembre de 2005). Todas estas normas tienen concordancia con normas ISO, que estn aprobadas por el CEN y estn sujetas a revisiones peridicas para asegurar su actualizacin y concordancia con los progresos de la
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industria y de la sociedad. En la Tabla 7, se presentan las Normas UNE-CEN-ISO mas recientes relacionadas con la microbiologa de alimentos de origen acutico. Tabla 7. Normas UNE-CEN ISO ms recientes que se relacionan con la microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. 1 UNE-CEN ISO/TS 111331:2009 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. 2 UNE-EN ISO 11290-1:1997 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y para animales. 3 E-EN ISO 112901:1997/A1:2005 (ISO 11290-1:1996/AM1:2004 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y para animales). 4 UNE-EN ISO 11290-2:2000 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y para animales 5 UNE-EN ISO 16140:2003 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal 6 UNE-EN ISO 16654:2002 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. 7 UNE-EN ISO 20838:2007 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal 8 UNE-EN ISO 6579:2003 Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la deteccin de patgenos en los alimentos. Requisitos para la amplificacin y la deteccin para los mtodos cualitativos. (ISO 20838:2006). Mtodo horizontal para la deteccin de Salmonela spp. Mtodo horizontal para la deteccin de Escherichia coli O157. (ISO 16654:2001) Gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Parte 1: Directrices generales para el aseguramiento de la calidad para la preparacin de medios de cultivo en el laboratorio. (ISO/TS 111331:2009). Mtodo horizontal para la deteccin y el recuento de Listeria monocytogenes. Parte 1: Mtodo de deteccin. (ISO 11290-1:1996).
Mtodo horizontal para la deteccin y el recuento de Listeria monocytogenes. Parte 1: Mtodo de deteccin. Modificacin 1: Modificacin del medio de aislamiento y de la prueba de la hemlisis e inclusin de los datos de precisin
Mtodo horizontal para la deteccin y recuento de Listeria monocytogenes. Parte 2: Mtodo de recuento. (ISO 11290-2:1998).
Protocolo de validacin de mtodos alternativos (ISO 16140:2003).
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Microbiologa de los alimentos para consumo humano y alimentacin animal. 9 UNE-EN ISO 6887-3:2004 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal. 10 UNE-EN ISO 6888-1/A1:2004 Microbiologa de los alimentos para consumo humano y animal.
(ISO 6579:2002)
Preparacin de las muestras de ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para examen microbiolgico. Parte 3: Reglas especficas para la preparacin de pescados y productos de la pesca. (ISO 6887-3:2003) Mtodo horizontal para el recuento de estafilococos coagulasa-positivos (Staphylococcus aureus y otras especies). Parte 1: Tcnica que utiliza el medio agar de Baird-Parker. Modificacin 1: Incorporacin de los datos de precisin.(ISO 6888-1:1999/Amd 1:2003).
Estados Unidos (EE. UU.) Al igual que en otros pases la responsabilidad del aseguramiento de la inocuidad de los productos para consumo humano, est a cargo de instancias gubernamentales y se basa en reportes, investigaciones y programas. Los principales actores en el rea de prevencin de las ETAs, son: a) The Food and Drug Administration (FDA)
Es una de las agencias responsables de la proteccin de la salud pblica, procurando que solamente productos inocuos lleguen al mercado, sus actividades incluyen: o o o Ayudar y orientar a productores y consumidores de alimentos para que conozcan cules son los riesgos a la salud que pueden derivarse de los mismos. Promover la aplicacin de buenas prcticas de manejo sanitario de los alimentos por parte de los consumidores y productores. Promover la deteccin, seguimiento y prevencin de enfermedades relacionadas con el consumo de alimentos.
Opera un programa de seguridad de manera obligatoria para el sector acucola y pesquero bajo las disposiciones de la Ley de Servicios a la Salud Pblica y Reglamentos Relacionados (FD&C Act.), fundamentado en la investigacin, inspeccin, desarrollo, difusin, cumplimiento y ejecucin de normas. El Manual de Anlisis Bacteriolgicos (BAM), elaborado por la FDA, es un compilado de procedimientos de laboratorio que sirve de gua para el anlisis microbiolgico de alimentos y cosmticos, es una recopilacin de informacin cientfica actualizada y de la poltica relacionada a los riesgos potenciales en la produccin y consumo de productos de la pesca y los controles eficaces para prevenir su ocurrencia. El BAM representa la piedra angular del programa. Dichas guas y documentos son actualizados y reconocidos a nivel mundial. Explican los lineamientos a seguir en lo relacionado con los planes HACCP y orienta a los usuarios para la identificacin de los principales peligros microbiolgicos como: Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus, as como Clostridium perfringes, Bacillus cereus, Campillobacter jejuni y coliformes en productos alimentarios de origen acutico como: peces (en general), crustceos (camarn, cangrejo,
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langosta) y moluscos (ostin, almeja, mejilln, caracol), en diferentes presentaciones (frescos, congelados, pre cocidos, cocinados, enteros y enlatados) ver Tabla 8. Recientemente se form la Red de Evaluacin y Respuesta Coordinada a Brotes (CORE, por sus siglas en ingls), integrada por equipos multidisciplinarios con personal de tiempo completo para preparar, coordinar y mejorar el tiempo de respuesta a brotes ocasionados por alimentos. Al tener un sistema centralizado aplica las experiencias en la elaboracin de polticas eficaces y prcticas preventivas de seguridad alimentaria para evitar incidentes en el futuro. Otra publicacin de referencia, es el BAD BUG BOOK, publicado por el Centro para la Seguridad Alimentaria y la Nutricin Aplicada de la FDA, Departamento de Salud y Servicios Humanos. b) Center of Disease Control and Prevention (CDC)
Estos centros van a la cabeza de los esfuerzos federales para recopilar informacin sobre las ETAs, su objetivo es investigar dichas enfermedades, los brotes y supervisar la efectividad de los esfuerzos de prevencin y control realizados para disminuir esos sucesos, tambin desempean un papel fundamental en el desarrollo de la capacidad epidemiolgica de laboratorio y de salud ambiental en el departamento de salud estatal y local a fin de respaldar la vigilancia de las ETAs y la respuesta ante los brotes. Investigan los brotes de enfermedades que surgen en relacin con alimentos y se encargan de realizar estudios sobre problemas de salud o producidos por determinados ambientes. Igualmente, gestionan programas de mbito nacional para la prevencin y control de dichas enfermedades. Cuando un brote es identificado, los CDC colaboran con la FDA, la USDA, o la Agencia de Proteccin Ambiental (EPA), para rastrear el alimento desde sus orgenes, evaluar las medidas de inocuidad alimentaria de los restaurantes y las procesadoras, haciendo una investigacin desde la granja de produccin, hasta retirar el producto del mercado. Tabla 8. Mtodos y Referencias en ISO y en BAM para la deteccin de los principales patgenos reconocidos en alimentos acuticos
Internacional Mtodo
b
EUA (BAM) Mtodo

c
Referencia EN-ISO 16654: 2002 ISO 7251: 2005
Referencia Feng et al., 2002

h
Convencional Escherichia coli Convencional

c
Convencional Inmunolgico Conv-Molec

i c
Feng et al., 2002 Feng et al., 2011 Hitchins y Jinneman, 2002 Hitchins y Jinneman, 2011
Listeria monocytogenes
Convencional
ISO (EN-ISO) 11290-1: 2005
Convencional
j
Conv-Molec
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k
Kits AOAC
d
Hitchins y Jinneman, 2011 Andrews et al., 2011
Salmonella spp
Convencional
e
ISO (EN-ISO) 6579: 2002 EN ISO 68881: 2000 EN ISO 68882: 2000 EN ISO 68883: 2003 ISO 21872-1: 2007
Convencional
e,l
Convencional Staphylococcus aureus

e
Convencional
g,l
Bennett y Lancette, 2001 Bennett y Lancette, 2001
Convencional
f,
Convencional
Convencional Convencional Vibrio cholerae
g a
a,
Convencional Molecular
m o
Kaysner y DePaola, 2004 Kaysner y DePaola, 2004 Kaysner y DePaola, 2004 Kaysner y DePaola, 2004 Kaysner y DePaola, 2004 Kaysner y DePaola, 2004
Vibrio parahaemolyticu s
Convencional
ISO 21872-1: 2007
c,
n o
Convencional Vibrio vulnificus
ISO 21872-2: 2007
c,
n o
El procedimiento general en el met. de Cultivo son; dos enriquecimientos, aislamiento y confirmacin La expresin de resultados es presencia o ausencia en x gr ml de muestra. El procedimiento general en el met. de cultivo son; enriquecimiento, separacin, concentracin, aislamiento y confirmacin La expresin de resultados es presencia o ausencia en X gr ml de muestra. El procedimiento general en el met. de cultivo son; Enriquecimiento, separacin, concentracin, aislamiento y confirmacin. La expresin de resultados es nmero ms probable en X gr ml de muestra. El procedimiento general en el met. de cultivo son; Pre-enriquecimiento, enriquecimiento, cultivo y confirmacin. La expresin de resultados es presencia o ausencia en X gr ml de muestra. El procedimiento general en el met. de cultivo son; Inoculacin, incubacin y confirmacin. La expresin de resultados es N# de Estafilococos coagulasa-positivos por gr ml de muestra.
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f
El procedimiento general en el met. de cultivo son; Enriquecimiento, subcultivo y confirmacin. La expresin de resultados es presencia o ausencia en X gr ml de muestra. El procedimiento general en el met. de cultivo son; Cultivo, incubacin, subcultivo y confirmacin. La expresin de resultados es N# de Estafilococos coagulasa-positivos ms probable por gr ml de muestra. Ensayo LST-MUG es exclusivo para moluscos bivalvos fros o congelados. Deteccin de E. coli O157:H7 Se realiza un previo enriquecimiento y se lleva a PCR en Tiempo Real, donde adems estn configurados para las plataformas SmartCycler II o LightCycler 2.0. Es especfico para los Genes stx1 y stx2. Y las muestras que den positivas en PCR se confirman por cultivo. Son recomendaciones de confirmacin por mtodos moleculares (PCR en tiempo real y campos pulsados -PGDE-) para la deteccin se utiliza comnmente el Gen hly y 16s rARN Enzyme Linked Immunofluorescent Assay (ELFA) VIDAS LIS Assay; Colorimetric monoclonal enzyme-linked immunosorbent assay method; TECRA Listeria Visual Immunoassay [TLVIA] La expresin de resultados para e es S. aureus/g de muestra y para g es S. aureus (NMP/g) El reporte final debe incluir identificacin bioqumica y serolgica del aislado y resultados de enterotoxicidad Membrana filtrante hidrofbica cuadriculada (HGMF), similar al convencional por el tiempo de incubacin Se enriquece y para confirmacin con PCR se utiliza para V. cholerae el Gen ctxAB, para V. vulnificus es el gen vvhA y para V. parahaemolyticus (PCR Multiplex) los genes tlh, trh y tdh
h i
l m
Canad La Agencia Canadiense de Inspeccin de Alimentos (CFIA por sus siglas en ingls), desarrolla y verifica el cumplimiento de las normas de procesos que contribuyen a la obtencin de productos apropiados y con una calidad aceptable, garantiza la seguridad e identidad de pescados y mariscos que son procesados en establecimientos federales o importados en Canad. Sus actividades incluyen: o o o o o Registro federal de productos de la pesca que procesan los establecimientos, Inspeccin del pescado importado y productos de la pesca, Desarrollo y mantenimiento de disposiciones con pases con sistemas aprobados de inspeccin, Inspeccin y ejecucin de regulaciones, incluyendo la aplicacin de normas de etiquetado, Pruebas para deteccin de residuos.
Parte del alcance de las inspecciones incluye actividades de: limpieza, fileteado, glaseado, embalaje, enlatado, congelacin y presentaciones como: ahumado, salado, cocinado, en escabeche, seco o
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cualquier otra. Se encarga de examinar patgenos de alto riesgo en los alimentos como: E. coli, L. monocytogenes, S. aureus, Salmonella y Shigella. El Compendium of Analytical Methods (Vol. 2 y 3), proporciona la descripcin de las tcnicas recomendadas para la deteccin de los patgenos (Tabla 9). Dentro de los programas que maneja la CFIA se encuentran: el de importacin/exportacin de peces y mariscos, inspeccin de los planes de accin de seguridad alimentaria (qumicos y microbiolgicos) y planes HACCP, entre otros. a) El CFSP (Canadian Fish and Seafood Program) basa las inspecciones a peces y mariscos procesados, en el documento Fish Inspection Regulations considera los siguientes productos y presentaciones: o o o o o o o o Productos enlatados (almejas, mejilln, ostin, coctel y pasta de langostino, salmn, atn y sardina), Frescos y congelados (empanizados, carne de langosta, ostiones, salmn, coctel de camarn, vieira (escallopos), eperlanos y pescado blanco), Adems en escabeche, condimentados, marinados, salados, secos y ahumados. Para que la importacin se lleve a cabo, es necesario que los lotes de inters, sean sujetos a una inspeccin rigurosa y a muestreos aleatorios para los siguientes anlisis: Fsicos (calidad del empacado, etiqueta, etc.), Qumicos (mercurio, metales pesados, plaguicidas, etc.), Fisicoqumicos (sensoriales, pH, ndice de calidad, etc.), Microbiolgicos (E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp., S. aureus, Vibrio spp., etc.).
b) El Canadian Shellfish Sanitation Program (CSSP) es un programa federal dirigido y administrado conjuntamente por la CFIA, el departamento del medio ambiente (EC) y el de Pesca y el Ocano (DFO). El objetivo principal es proteger a los canadienses de los riesgos a la salud asociados con el consumo de moluscos bivalvos contaminados (p.ej. mejillones, ostiones y almejas), a partir de l, el gobierno canadiense implement controles para verificar que solo los mariscos que cumplan con los estndares de calidad e inocuidad alimentaria lleguen al mercado nacional e internacional. Incluye tanto a la industria como al consumidor. c) El Programa de Inspeccin de Peces (FIP), se encarga de la calidad e inocuidad alimentaria, basada en resultados analticos. Dentro de l se cre una poltica para que terceros laboratorios pudieran hacer las pruebas de los productos derivados de la pesca (Policy on the Use of Third Party Laboratories for Testing Fish and Fish Products), a travs del reglamento de inspeccin de peces (FIR), el cual establece las condiciones de aceptacin de los resultados de dichos laboratorios y aplica solo dentro del programa de gestin de calidad para importadores (QMPI). Sin embargo, hay otras situaciones donde pruebas analticas, por terceros laboratorios, son mayormente requeridas, por lo que es necesaria una poltica clara sobre las condiciones de trabajo de laboratorios acreditados o no, para diferentes actividades dentro de la FIP. d) Programa de monitoreo microbiolgico, es una de las actividades que realiza la CFIA, la cual consiste en un muestreo aleatorio y anlisis de muestras para una amplia variedad de productos nacionales e importados. Los anlisis se realizan cada ao para evaluar la contaminacin microbiolgica en el suministro de alimentos, hacindose pruebas para patgenos de alto riesgo, incluyendo E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Shigella. e) El Plan de accin de seguridad alimentaria (FSAP) es apoyado por la CFIA para construir el sistema de seguridad alimentaria actual. Esta iniciativa permite responder rpida y eficazmente a
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problemas de seguridad alimentaria e identificacin de los riesgos potenciales de manera temprana. Con este plan se examinan los alimentos que se consideran con gran potencial de riesgo a la salud debido a la variedad de patgenos. Las muestras son analizadas bajo los estndares de seguridad alimentaria que han sido establecidos por Health Canada y varias organizaciones internacionales, tales como la comisin del Codex Alimentarius. Cuando la CFIA encuentra un alimento o un ingrediente que viola esos estndares, toma alguna de las siguientes acciones correctivas: o o o o Realizar mas inspecciones, Ms muestreos, Emitir anuncios pblicos y Retirar los productos del mercado que poseen un riesgo a la salud.
f) Los planes de muestreo para anlisis microbiolgicos y qumicos fueron adoptados de la International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Sin embargo, la Health Canada prepar un manual que provee de mtodos de referencia listos para aplicarse y es utilizado por la Health Products and Food Branch (HPFB) en los siguientes casos: o o o Para determinar si la industria alimentaria cumple con la regulacin y guas en relacin a materiales extraos y microbiolgicos en alimentos, Para evaluar la calidad de los alimentos en general con respecto a su contenido microbiolgico o material extrao, Para fungir como apoyo en la investigacin de las ETAs.
g) Health Canada. Para esta institucin, es esencial tener una base cientfica para prevenir y responder apropiadamente cuestiones de inocuidad y salud, donde las investigaciones y las mismas actividades cientficas juegan un papel importante en muchos procesos de toma de decisiones. Este conocimiento contribuye al desarrollo de polticas y programas, regulaciones, servicios, informacin y evaluacin de riesgo, mismos que incluyen el estudio de: o o o o 1.5 Productos qumicos potencialmente peligrosos en alimentos y sus efectos sobre la salud humana, Aspectos nutricionales y metablicos de los alimentos, incluyendo las relaciones de determinados aspectos de la dieta a las condiciones de la enfermedad, Consumo de alimentos y los patrones de ingesta de nutrientes de los canadienses, Organismos infecciosos y toxignicos, (p.ej., E coli, Salmonella, Listeria monocytogenes) y medidas de control para la seguridad alimentaria. Japn. Ley Bsica de Seguridad Alimentaria.
En 2002, el Director Food and Environmental Hygiene (DFEH) estableci directrices en relacin a los lmites de seguridad de nueve agentes patgenos, principales, transmitidos por los alimentos. El 01 de julio de 2003, entr en vigor la Ley Bsica de Seguridad Alimentaria (FSBL) con el propsito de promover integralmente las polticas para garantizar la seguridad alimentaria mediante el establecimiento de principios bsicos, entre los que se encuentra, el Reconocer que la proteccin a la salud de los ciudadanos japoneses es prioritaria y que la gua bsica incluye: o o o Promocin de evaluar el riesgo (evaluando el efecto de los alimentos en la salud), Gestionar el riesgo (formulando polticas que se basen en la evaluacin del riesgo) y Comunicar el riesgo (donde se comparte informacin y opiniones entre las partes interesadas).
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Debido a las grandes cantidades de productos importados por Japn provenientes de China, se crearon reglamentos para conocer y monitorear los productos comestibles que son importados al pas, incluyendo lcteos, crnicos, en diferentes presentaciones, y en particular la Guide to Import Marine Products into Hong Kong. Se elaboraron directrices microbiolgicas para alimentos listos para comer (RTE), las cuales establecen los lmites de seguridad de 9 de los principales patgenos transmitidos por los alimentos: Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli O157, V. cholerae, V. parahaemolyticus, S. aureus, Campylobacter spp., Clostridium perfringens y B. cereus. Tambin proporciona una clasificacin de calidad microbiolgica de esos alimentos que refleja el estado higinico de los mismos. Los comerciantes de los alimentos involucrados deben obtener asistencia del personal DFEH, para tomar muestra del alimento en cuestin para su anlisis, u otro examen bacteriolgico o de otra ndole. Los productos acuticos concernientes pueden ser: peces, crustceos, moluscos, anfibios o cualquier otra forma de vida acutica como mamferos o reptiles. La venta de alimentos de origen acutico como ostras, pescados y mariscos en general, crudos y/o vivos est restringida a personas y establecimientos que cuenten con el permiso especfico emitido por DFEH. La comisin de seguridad alimentaria (Food Safety Commission of Japan (FSCJ), fue establecida para la realizacin de evaluaciones de riesgo de manera neutral e imparcial, sobre la base de conocimiento cientfico y conjuntamente con la creacin de la ley (FSBL), atienden las situaciones que englobaban la seguridad alimentaria de Japn ya que las importaciones de productos comestibles que hace este pas se han incrementado drsticamente en las ltimas dcadas.
Tabla 9. Listados de tcnicas para deteccin y aislamiento de microorganismos patgenos causantes de ETAs (CAM, Canad).
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Mtodo
Numero de indentificacion del metodo y apendices

MFHPB-07
Titulo
The isolation of Listeria monocytogenes and other Listeria spp. from foods and environmental samples using Palcam broth Isolation of Listeria monocytogene s and other Listeria spp. from foods and environmental samples Enumeration of Listeria spp. in environmental samples using 3MJ PetrifilmJ Environmental Listeria Plates Enumeration of Listeria monocytogenes in Food Detection of Listeria spp. in Foods and Environmental Samples by the VIDAS Listeria Method Detection of Listeria monocytogenes in Foods and Environmental Samples by the VIDAS LMO 2 Method Detection of Listeria spp. in Foods and Environmental Samples by the VIP Method Detection of Listeria spp. in foods and environmental samples using the Oxoid Listeria Rapid Test (The Clearview Kit) Detection of Listeria spp. in food products and environmental samples by the VIDAS Listeria species Xpress (LSX) method The Genequence Listeria spp. assay for the detection of Listeria spp. in foods and environmental surfaces The Genequence Listeria monocytogenes assay for the detection of Listeria monocytogenes in foods The detection of Listeria species from environmental surfaces using the Dupont Qualicon BAX System method and direct plating The Qualicon BAX SYSTEM Method for the detection of Listeria monocytogenes in a variety of food Identification of Listeria monocytogenes using the Adiafood Rapid Pathogen Detection System, a Real-Time PCR Technique Detection of Listeria spp. from environmental surfaces using iQ-CheckTM Listeria spp. Real-Time PCR Test Kit Identification of presumptive positive Listeria monocytogenes from foods and environmental samples by the Polymerase Chain Reaction Identification of Listeria monocytogenes by Accuprobe
Aislamiento e Identificacin MFHPB-30 MFLP-11 Enumeracin MFLP-74 MFHPB-29 MFLP-33 Inmunolgicos MFLP- 34 MFLP-71 MFLP-77 MFLP-13 MFLP-14 MFLP-15 MFLP-28 MFLP-31 MFLP-39 MFLP-78 MFLP-88
Genticos
50
Mtodo

MFHPB-21
Titulo
Enumeration of Staphylococcus aureus in foods Determination of Staphylococcus aureus Thermostable Nuclease in foods. Enumeration of Staphylococcus aureus in foods and environmental samples using 3MJ PetrifilmJ Staph Express Count (STX) Plates (Supplement to MFLP-21) Detection of Staphylococcal enterotoxins in food products using the VIDAS Staph Enterotoxin II (SET2), an ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay) Determination of enterotoxin production by Staphylococcus aureus in foods and broth media (The Reverse Passive Latex Agglutination (RPLA) Method) Detection of enterotoxins produced by Staphylococcus aureus in foods (The Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) using the TECRA Kit) Detection of enterotoxins produced by Staphylococcus aureus in foods (Ridascreen SET A, B, C, D, E Enzyme Immunoassay)
Enumeracin e Identificacin
MFHPB-28
MFLP-21
MFLP-65
MFLP-67 Enterotoxin Immunological MFLP-68
MFLP-69
Mtodo

MFLP-72 MFLP-73 MFLP-23 MFLP-37
Titulo
Aislamiento e Identificacin
The Isolation and Identification of Vibrio cholerae 01 and non-01 from Foods The Isolation and Enumeration of Vibrio vulnificus from Fish and Seafoods Specific detection of Vibrio parahaemolyticus strains using a multiplex polymerase chain reaction (pcr) based on the r72h taxonomic marker and the hemolysin genes tdh and trh Detection of Halophilic Vibrio Species in Seafood
Genticos
51
MFHPB-20 Aislamiento e Identificacin MFHPB-20A MFLP- 75 MFHPB-24 MFLP-18 MFLP- 35 Inmunolgicos MFLP-70 MFLP- 84 MFLP- 96 MFLP-97 MFLP-20 MFLP-29 Genticos MFLP-32 MFLP-36
Mtodo
Titulo
Methods for the Isolation and Identification of Salmonella from Foods Amendment to MFHPB-20 for the analysis of seed used to manufacture sprouts Procedure for the Isolation of Salmonella species by the Modified Semi-Solid Rappaport Vassiliadis (MSRV) Method Detection of Salmonella spp. in Foods by the VIDAS SLMJ Method The 48h DupontTM Lateral Flow SystemTM Method for the detection of Salmonella species in raw and processed meats Detection of Salmonella by the Tecra Salmonella Visual ImmunoassayJ (VIA) Method Detection of Salmonella in foods by the Modified 1-2 Test Identification of Salmonella spp. by DynabeadsJ anti-Salmonella The Reveal Test Kit for detecting Salmonella The Alert Test Kit for detecting Salmonella The Genequence Salmonella Microwell Assay for the detection of Salmonella in a variety of foods The Qualicon Bax System Method for the detection of Salmonella in a variety of food and environmental samples Identification of Salmonella species using the Adiafood rapid pathogen detection system, a real-time PCR technique Detection of Salmonella in foods and environmental surfaces - Assurance GDS for Salmonella Gene Detection System
in foods and environm
feeds, raw foods, fece
foods and in agricultu
in raw (ground chicke
foods, food ingredien
animal feed, chicken,
foods, animal feed an feeds, raw foods and
artificially contamina
in a wide variety of fo
has been validated fo
foods and other samp
in a variety of foods a
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Mtodo
Aislamiento e Identificacin

MFLP- 80 MFLP- 90 MFLP-19 MFLP-81 MFLP-82 MFLP-87
Titulo
Isolation of E. coli O157:H7 or NM in foods Identification of E. coli O157 by DynaBeadsTM anti-E. coli O157
The method has been produce satisfactory re in food
The DupontJ Lateral Flow SystemJ Method for detecting E. coli O157 in raw in raw ground beef and ground and raw boneless beef (Supplement to MFLP-19) boneless beef Detection of Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) in Food Products and Food food products and foo ingredients Ingredients by the Assurance EHEC Enzyme Immunoassay (EIA) Method Detection of E. coli O157 by the Merck Singlepath7 E. coli O157 Kit
raw ground beef and pasteurised whole mil
Detection of Enterohemorrhagic E. col i (EHEC) in food products and food food products, food in ingredients by the VIP for EHEC Method and environmental sam
Inmunolgicos
MFLP-91 MFLP-92 MFLP-94 MFLP-95 MFLP-98
Detection of E. coli O157 by the TecraTM E. coli O157 Visual Immunoassay food products, food in (VIA) Method and TecraTM E. coli O157 Immunocapture and environmental sam a variety of foods, incl MFLP-92 Detection of Escherichia coli O157 in foods by Polymixinbased ground beef, processe Enzyme-linked Immunosorbent Assay fruits and vegetables
The Eight Hour Reveal Method for detecting Escherichia coli O157:H7 In raw raw beef cubes, raw gr beef and environmental samples. beef, and environmen The 20 Hour Reveal Method for detecting Escherichia coli O157:H7 from foods with artificially contam foods and naturally and environmental samples. use in raw processed m Detection of E. coli O157:H7 in food products by the VIDAS UP E. coli O157 raw unprocessed meat (including H7) method leafy greens.
MFLP-12
MFLP-16 MFLP-24 Genticos MFLP-30
Identification of Escherichia coli O157:H7 and Verotoxin producing Escherichia coli O157:NM by the ADIAFOOD Rapid Pathogen Detection System, a RealTime Polymerase Chain Reaction System raw ground beef in raw ground beef, be Detection of Escherichia coli O157:H7 in Foods - Assurance GDSJ for E. coli orange juice, apple jui O157:H7 Gene Detection System vegetables and sprout Identification of Escherichia coli O157 by the Warnex Real Time Polymerase foods and food ingred Chain Reaction System The Dupont Qualicon Bax7 System Method for the detection of E. coli O157:H7 in raw beef and fruit juice (Supplement to MFLP-30) raw ground beef and f Supplement 2 to MFLP-30 The use of the Bax E. coli O157:H7 MP assay
MFLP-76 MFLP-86 Pruebas para Verotoxinas MFLP-83 MFLP-93
The DuPont Qualicon BAX System real-time method for the detection of E. raw ground beef and b coli O157:H7 in raw beef trim and raw ground beef Identification of presumptive positive Verocytoxigenic Escherichia coli by the from foods and other s Polymerase Chain Reaction foods to determine co Detection of Verotoxins VT 1 and VT 2 by the Merck Duopath7 Verotoxin Kit with the requirements in food or food ingredi Identification of Escherichia coli Verotoxins by the Meridian Premier EHEC determine compliance KitTM requirements of Sectio
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Chile. Agencia Chilena para la Inocuidad Alimentaria (ACHIPIA) Dicha Agencia implement un moderno, eficiente y transparente sistema nacional de inocuidad de los alimentos. Cuenta con un sistema integrado de laboratorios que realizan anlisis de alimentos relacionados con la inocuidad, los cuales utilizan mtodos acreditados conforme a la norma ISO/IEC17025 segn recomendacin del Comisin del Codex Alimentarius. En general, la metodologa est basada en mtodos de referencia internacional o validados a nivel nacional: AOAC, FDA-BAM, AFNOR, USDA-FSIS, ICMSF, ISO, normas chilenas, FAO/OMS Codex Alimentarius, manual de mtodos de anlisis fsico-qumicos de alimentos, agua y suelos del ISP, entre otros. El servicio nacional de pesca (SERNAPESCA), que depende del Ministerio de Economa, estableci dentro de la poltica de la inocuidad de los alimentos el reglamento sanitario de los alimentos, DTO. N 977/96, del cual se desprenden algunos apartados especficos para el anlisis microbiolgico de productos de origen acutico. Toma como base la clasificacin, los parmetros de control y los planes de muestreo de la ICMSF (International Commission on Microbiological Specification For Foods), en la cual se definen 18 grupos de alimentos segn su origen y/o tecnologa aplicada en su elaboracin. El grupo N#11 Pescados y Productos de la Pesca muestra las especificaciones microbiolgicas para dichos productos (Tabla 10). En el artculo 173 del reglamento, se presenta una lista de las bacterias potencialmente presentes en dichos productos, con la cual, la autoridad sanitaria puede considerar el alimento como contaminado, conforme a la evaluacin de los riesgos que de su anlisis se deriven. Tabla 9. Grupos bacterianos considerados para determinar la inocuidad en pescados y productos de la pesca, segn presentacin, de acuerdo a la poltica de la inocuidad de los alimentos en Chile. Moluscos frescos: bivalvos Pescados y mariscos Pescados y mariscos crudos congelados precocidos o cocidos congelados; Recuento Aerobios Recuento Aerobios Recuento Aerobios Mesfilos, Coliformes Mesfilos, E. coli, S. Mesfilos, E. coli, S. fecales en 100 g. y aureus aureus, Salmonella en Salmonella en 25 g. 25 g. Artculo 174.- En los alimentos listos para el consumo (LPC) tambin se monocytogenes Pescados y mariscos ahumados Recuento Aerobios Mesfilos, E. coli, S. aureus. hace anlisis de Listeria
Fuente: Reglamento sanitario de alimentos. Chile. Artculo 173, DTO. N 977/96. En esta perspectiva, Chile ha ido actualizando el reglamento sanitario de los alimentos, fortaleciendo los programas de higiene y control, perfeccionando los procesos de inspeccin y certificacin de las exportaciones, ampliando los mecanismos de participacin de los distintos actores, desarrollando los mecanismos de aseguramiento de la calidad y los sistemas de trazabilidad, fortaleciendo las capacidades analticas de los laboratorios, e incorporando crecientemente el enfoque integrado de las cadenas de produccin sustentado en el anlisis de riesgo. Muchos de estos mejoramientos, que han significado avances, han contado con la valiosa cooperacin internacional, especialmente de Japn, Unin Europea, Estados Unidos y Canad.
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AOAC Official Method. La Asociacin de comunidades analticas, "AOAC INTERNATIONAL tiene como fin el ser un proveedor proactivo, mundial y facilitador en el desarrollo, empleo y la armonizacin de mtodos validados, analticos y programas de garanta de calidad de laboratorio y servicios. Las directrices del comit de mtodos para la validacin de mtodos microbiolgicos para los alimentos y anlisis ambientales (Methods Committee Guidelines for Validation of Microbiological Methods for Food and Environmental Surfaces) es una gua que incluye trminos y definiciones asociadas con los programas oficiales de mtodos de anlisis estandarizados y mtodos estandarizados de pruebas de rendimiento y los requisitos para la validacin de metodologas de identificacin confirmatoria, cuantitativa y cualitativa mas actualizadas. La edicin ms reciente es de febrero del 2012. El propsito de este documento es proporcionar directrices tcnicas comprensibles para llevar a cabo estudios de validacin microbiolgica de los alimentos y de los mtodos de anlisis ambientales. Los mtodos validados que contiene para los productos de la pesca y acuicultura engloban: productos frescos y congelados, secos, salados, cocidos, en conserva y semiconservas en vinagre, anchoas en aceite y productos ahumados. Los patgenos que son considerados en este tipo de alimentos son: Salmonella, Listeria, Coliformes, E. coli, Legionella, Bacillus y Staphylococus aureus. Comisin del Codex Alimentarius. El CODEX fue creado en 1963 para desarrollar estndares, guas y cdigos de buenas prcticas, destinadas a proteger la salud de los consumidores y garantizar prcticas justas y leales en el comercio de alimentos bajo la supervisin del Programa de Estndares de Alimentos, de la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO) y de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Asimismo promueve la coordinacin de todos los trabajos sobre normas alimentarias ejercidas por organizaciones internacionales gubernamentales y no gubernamentales. Para esta comisin, es tarea de cada pas desarrollar el marco normativo adecuado siguiendo las guas establecidas por el CODEX e informar y realizar programas de educacin para lograr la inocuidad alimentaria en la produccin de alimentos para el consumo humano. En 1983, un comit de expertos en inocuidad alimentaria fue convocado por la OMS y FAO (organizaciones internacionales que tienen asignaciones especficas en la materia), para discutir temas relacionados con la inocuidad alimentaria. La conclusin del comit, fue que las ETAs, posiblemente sea el problema de salud ms importante a nivel mundial y una de las principales causas que contribuyen a reducir la productividad econmica (OMS, 1999). Existen varias comisiones dentro del Codex que estn preparando los cdigos de prcticas para los diversos aspectos relacionados con la inocuidad de diferentes productos: o o o o o o o Comit del Codex en peces y productos de la pesca. Comit del Codex en higiene de alimentos. Comisin intergubernamental de investigacin Ad-Hoc en alimentacin animal. Comit del Codex en aditivos y contaminantes en alimentos. Comit del Codex en residuos de medicamentos veterinarios en alimentos. Comisin intergubernamental de investigacin Ad-Hoc en alimentos derivados de la biotecnologa. Comit del Codex en sistemas de inspeccin y certificacin de alimentos importados y exportados.
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El Comit del CODEX sobre pescados y productos pesqueros establece normas mundiales para pescado, crustceos y moluscos bivalvos frescos y congelados o elaborados de cualquier otra forma, la mayor parte de las evaluaciones son sensoriales (organolpticas). En el cdigo de prcticas para el pescado y los productos pesqueros se le incorporaron las buenas prcticas de fabricacin (BPF) y el HACCP. En el cdigo, se hace mencin de Salmonella, Shigella, E. coli, Vibrio cholerae, Vibrio, parahaemolyticus y Vibrio, vulnificus como posibles peligros biolgicos que pueden encontrarse contaminando los productos acuticos, antes de su cosecha; e incluye a Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum y Staphylococcus aureus como aquellos que pueden ser introducidos durante el procesamiento de los productos. En otros casos se puede presentar contaminacin de origen fecal, cuando las instalaciones se encuentran cerca de la la influencia de poblados o actividades productivas que puedan contaminar con residuos de medicamentos veterinarios en exceso y de otras sustancias qumicas. Seala tambin los posibles peligros para el pescado vivo almacenado y transportado a bajas temperaturas, como son: contaminacin microbiolgica, biotoxinas, contaminacin qumica (p. ej., aceite, agentes de limpieza y desinfeccin (Codex, 2012). En relacin a los moluscos, como son organismos filtrantes, los contaminantes se concentran en niveles mayores que las aguas marinas que los circundan, por consiguiente, la contaminacin por bacterias y virus en la zona de cra es de importancia crtica para la especificacin del producto final y determina los requisitos del proceso de elaboracin ulterior. La contaminacin por aguas de escurrimiento agrcola o aguas negras pueden transmitir patgenos bacterianos y/o virales (Norwalk, virus de la hepatitis). A efectos de controlar los peligros, es muy importante la identificacin y vigilancia de las zonas de cra para la inocuidad de los moluscos bivalvos. Organizacin Mundial del Comercio (OMC). Es el nico organismo internacional que se ocupa de las normas que rigen el comercio entre los pases. Su principal propsito es asegurar que las corrientes comerciales circulen con la mxima facilidad, previsibilidad y libertad posible. La OMC ha implementado dos acuerdos relacionados con plantas y animales de la acuacultura: el Acuerdo de Aplicacin de Medidas Sanitarias y Fitosanitarias (SPS, por sus siglas en ingls) y el Acuerdo sobre Barreras Comerciales para el Comercio (TBT, por sus siglas en ingls). El primero proporciona las reglas bsicas para inocuidad alimentaria, conjuntamente con estndares de salud para animales y plantas, mientras que el segundo cubre todos los requerimientos tcnicos, estndares y consideraciones regionales que no estn cubiertas por el SPS. El resultado es la certidumbre. Los consumidores y los productores saben que pueden contar con un suministro seguro y con una mayor variedad en lo que se refiere a los productos acabados, los componentes, las materias primas y los servicios que utilizan, mientras que los productores y los exportadores tienen la certeza de que los mercados exteriores permanecern abiertos a sus actividades. Otra consecuencia es que el entorno econmico mundial se vuelve ms prspero, tranquilo y fiable. (WTO, 2012).
Organizacin Mundial de la Salud (OMS) Este organismo internacional entr en vigor el 7 de abril de 1948, siendo la autoridad directiva y coordinadora de la accin sanitaria en el sistema de las Naciones Unidas. Es responsable de desempear una funcin de liderazgo en los asuntos sanitarios mundiales, configurar la agenda de
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las investigaciones en salud, establecer normas, articular opciones de poltica basadas en la evidencia, prestar apoyo tcnico a los pases y vigilar las tendencias sanitarias mundiales. Un instrumento decisivo en la lucha contra la propagacin mundial de las enfermedades infecciosas es el Reglamento Sanitario Internacional (RSI), negociado por los estados miembros de la OMS, establece las normas que deben aplicar los pases para identificar los brotes epidmicos y detener su propagacin. Es un instrumento jurdico de carcter vinculante para 194 pases, entre ellos todos los estados miembros de la OMS. Su objetivo es ayudar a la comunidad internacional a prevenir y afrontar riesgos agudos de salud pblica susceptibles de atravesar fronteras y amenazar a poblaciones de todo el mundo. El RSI, que entr en vigor el 15 de junio de 2007, obliga a los pases a comunicar a la OMS los brotes de ciertas enfermedades y determinados eventos de salud pblica (WHO, 2006). a) Estrategia global para la inocuidad (WHO Global Strategy for Food Safety). En mayo del 2010 la OMS aprob esta nueva resolucin sobre seguridad alimentaria. Se trata de un esfuerzo global para la vigilancia de lasETAs. Las organizaciones internacionales reconocen que un sistema global de inocuidad alimentaria compete a todos; desde autoridades gubernamentales hasta consumidores y que la elaboracin de sistemas eficaces de inocuidad de los alimentos se basa en gran medida en la coordinacin, colaboracin y comunicacin entre todas las actividades. Para lo anterior el anlisis de riesgos es una herramienta muy til que debe ser realizado en colaboracin con agencias internacionales utilizando las herramientas cientficas existentes para riesgos microbiolgicos. Los problemas ms preocupantes relacionados con la inocuidad de los alimentos son: o o o la propagacin de los riesgos microbiolgicos los contaminantes qumicos de los alimentos, la evaluacin de nuevas tecnologas alimentarias, como los alimentos genticamente modificados y la creacin de sistemas slidos que velen por la inocuidad de los alimentos y garanticen la seguridad de la cadena alimentaria mundial. (WHO, 2002).
La OMS trata de generar estrtegias para prevenir brotes de enfermedades y minimizar los riesgos para la salud en toda la cadena, desde el productor hasta el consumidor y ha elaborado documentos de divulgacin que sirven como herramienta o gua educativa, as como material de consulta, para la comunidad educativa para que aprendan como mantener los alimentos seguros y evitar la contaminacin de los mismos. Cabe sealar que esta organizacin trabaja junto con la OMC y FAO en estos aspectos. b) International Food Safety Authorities Network (INFOSAN). Es una iniciativa entre la OMS y FAO. Las autoridades en materia de inocuidad de los alimentos incluyen autoridades nacionales involucradas en la legislacin alimentaria, la evaluacin del riesgo, el control y la gestin de alimentos; la inspeccin de alimentos; los laboratorios de control y vigilancia, y los materiales de informacin, educacin y comunicacin sobre inocuidad de los alimentos, en todo el proceso que va desde la produccin hasta el consumo (de la granja a la mesa). Por lo tanto, es posible que los centros de enlace de INFOSAN estn en diferentes ministerios, como los de salud, comercio y agricultura. Dado que la informacin que se intercambia puede ser delicada, la comunicacin dentro la red es confidencial y los puntos de contacto de INFOSAN Emergencias son oficialmente designados por los pases. INFOSAN emergencias funciona las 24 horas del da, los siete das de la semana y la red est estrechamente vinculada con otros sistemas de vigilancia y respuesta de la OMS (FAO-WHO, 2010).
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Conclusiones de los resultados de la encuestas a los laboratorios que realizar la determinacin de microorganismos patgenos en alimentos La participacin de los Estados de la Repblica Mexicana a la encuesta fue del 56 %. El 58 % de los laboratorios o instituciones encuestados pertenecen al sector privado y el 42 % pertenece al sector pblico. El equipo comn para realizar el anlisis de MPA entre las empresas o instituciones es algn tipo de microscopio (contraste de fases, campo oscuro, entre otros). El segundo equipo que se utiliza en el anlisis de MPA son relacionados con tcnicas moleculares (termocicladores para realizar PCR punto final y PCR en tiempo real) siendo similar el uso de tcnicas de ensayos por inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA). El 61 % de las 35 empresas o instituciones encuestadas cuentan con instalaciones para la capacitacin del personal encargado del anlisis de MPA y el 31 % no cuenta con instalaciones destinadas a la capacitacin. El 86 % de los entrevistados afirma que cuenta con un programa de capacitacin anual para su personal. Los anlisis ms frecuentes de MPA se centran en primer lugar los dedicados a Salmonella spp., en segundo lugar Coliformes totales y en tercer lugar Coliformes fecales. La mayora de los anlisis que se solicitan son para matrices complejas o que no se definan como crnicos, frutas, verduras o marinos. Los anlisis de Coliformes totales y fecales para frutas y verduras son ms frecuentes que los anlisis para estos microorganismos en crnicos y marinos. Para crnicos y marinos son ms frecuentes los anlisis para Salmonella spp que en frutas y verduras. Los anlisis para Vibrio cholerae son ms frecuentes en marinos que en crnicos, frutas y verduras. Las especies de Campilobacter jejuni, Shigella, Yersinia enterocolitica, Yersinia spp. y Bacillus no son microorganismos sujetos a anlisis de MPA por parte de los encuestados. Las matrices de alimentos no definidas como crnicos, frutas, verduras y/o marinos, indican que se utilizan en una misma proporcin los procedimientos tanto manuales como automticos, independientemente del microorganismo a analizar. Las tcnicas de anlisis de MPA ms utilizadas son las de medios selectivos. Para Coliformes totales y fecales el uso de la tcnica del nmero ms probable sigue siendo la tcnica de anlisis de mayor uso, sin importar la matriz a analizar. Para el anlisis de E. coli O157:H7 y STEC se prefiere el uso de tcnicas moleculares basadas en PCR punto final, PCR tiempo real y tambin en tcnicas de separacin inmunomagntica. No hay variacin en la matriz a analizar. Para el anlisis de Salmonella spp. se utilizan mtodos tales como PCR punto final, PCR tiempo real, pruebas inmunolgicas, pruebas bioqumicas, medios selectivos, sistemas miniaturizados para identificar MPA, separacin inmunomagntica. Este comportamiento descrito se aplica a todas las matrices de alimentos descritas en la encuesta.
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Para el anlisis de Listeria monocytogenes se utilizan mtodos tales como PCR punto final, PCR tiempo real, pruebas inmunolgicas, pruebas bioqumicas, medios selectivos, ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas, sistemas miniaturizados para identificar MPA, separacin inmunomagntica. Este comportamiento descrito se aplica a todas las matrices de alimentos descritas en la encuesta. Para el anlisis de especies de Vibrio se aprecia que adems del uso de medios selectivos tambin se prefiere su anlisis por medio de sistemas miniaturizados de identificacin. Este comportamiento descrito se aplica a todas las matrices de alimentos descritas en la encuesta. De los laboratorios o instituciones encuestados, 91 % tienen un sistema de calidad implantado. El 80 % de las respuestas brindadas por los laboratorios encuestados indican que adoptaron un sistema de calidad basado en la norma ISO/IEC 17025:2004 en sus diferentes versiones hasta la versin 2006; el 18 % restante de los laboratorios encuestados adopt las normas ISO 9000 y sus actualizaciones hasta la ISO 9001:2008. La norma NMX-EC-17025-IMNC-2006 es la ms adoptada para acreditar un sistema de calidad, en segundo lugar se encuentra una versin anterior de esta norma (ISO/IEC 17025:2005). Para analizar Coliformes totales se usan las normas CCAYAC M-04, NOM-112-SSA1-1994 y NOM-113-SSA1-1994. Para analizar Coliformes fecales se usan en mayor medida la norma CCAYAC M-04. Para el anlisis de E. coli O157:H7 destacan el uso de las normas AOAC, CCAYAC M-04 y BAM. Para el anlisis de E. coli STEC se repiten en uso las normas descritas por CCAYAC M-04, AOAC, NOM de la SSA y BAX. Las normas con las que se realizan los anlisis para determinar especies de Vibrio cholerae, parahaemolyticus y vulnificus se realiza siguiendo las NOM-242-SSA1-2009 y NOM-031-SSA11993, en menor frecuencia se siguen las normas descritas en el BAM. Los anlisis para Salmonella spp, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus se realizan siguiendo las normas NOM-114-SSA1-SSA1-1994, NOM-143-SSA1-1995 y NOM-115-SSA11994, respectivamente. Para analizar Campylobacter jejuni se utiliza la norma OIE y las NOM de la SSA. El 69 % de los 35 laboratorios o instituciones encuestados ha participado en pruebas interlaboratorio para anlisis de MPA. Las pruebas interlaboratorio ms mencionadas por los laboratorios encuestados son LGC Standars (internacional) Salmonella en cocoa (2012), Staphylococcus aureus (LGC Standard-Reino Unido), Coliformes fecales, Coliformes totales, E. coli, Salmonella, FEPAS, M0795, 2010 (Salmonella especies), S. aureus, Listeria spp. y Listeria monocytogenes. Las pruebas interlaboratorio que fueron mencionadas una sola vez por los laboratorios encuestados son: ALAC CONFORME; CENAPA-SENASICA E. coli y Salmonella en jamn (2010); CENAPA-SENASICA E. coli y Salmonella en embutido de cerdo (2009); FEPAS E. coli en carne (2009); Mesofilos aerobios (LGC Standard-Reino Unido); Coliformes (LGC Standard-Reino Unido); E. coli (LGC Standard-Reino Unido); Hongos y levaduras (LGC Standard-Reino Unido); Vibrio cholerae (LGC Standard-Reino Unido); API; WS-183 Coliformes totales (NMP) Agua
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potable ERA, FAPAS; QMS, raund 186, 2011 (Vibrio especies y V. parahaemolyticus); QMAS, round 186, 2011 (Salmonella especies);, QMAS, round 186, 2011 (Listeria monocytogenes); QUALITY IBN MICROBIOLOGY SCHEME; FEPAS Coliformes totales, indicadores mesofilicos aerobios, Coliformes totales, E. coli; LGC STANDARDS ROUND 166 MARZO 2010; LGC STANDARDS ROUND 186 NOVIEMBRE 2011; LGC Standards Proficiency Testing; Determinacin de BMA; LGC Standards. Satisfactorio-presencia/ausencia L. monocytogenes; LGC Standards. Satisfactorio-presencia/ausencia Salmonella; LGC Standards-- en proceso Presencia/Ausencia L. monocytogenes; 078QR SourceWatRTM para CT, CF y E. coli; SUERO SHIGATOXIN STEC; CARNE STEC; Campylobacter en leche; UC Davis/reptiles and anphibians. Las pruebas interlaboratorio en las que los laboratorios encuestados han participado en orden de ascendente de nmero de mencin son: Salmonella con 28 %, E. coli con 17 %, Coliformes totales con 15 % y Listeria con 10 %. El 97 % de los 35 laboratorios encuestados expresaron que debe actualizarse la normatividad mexicana existente respecto a la normatividad internacional. Las normas en orden de prioridad en que los 35 laboratorios encuestados sugieren que se actualicen las normas son: NOM-114-SSA1-1994, NOM-115-SSA1-1994, NOM-113-SSA1-1994, NOM-143SSA1-1995, NOM-092-SSA1-1994, NOM-110-SSA1-1994, NOM-111-SSA1-1994, NOM-112SSA1-1994, NOM-031-SSA1-1993, NOM-242-SSA1-2009. El 84 % de los 35 laboratorios encuestados contestoafirmativamente en la disposicin para invertir para actualizar sus tcnicas de medicin de MPA.
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Lista de empresas o instituciones entrevistadas 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Laboratorio de Microbiologa y mtodos moleculares de USAM de CIATEJ Laboratorio Central Regional de Monterrey Analtica del Noroeste SA de CV Instituto Nacional de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos Laboratorio Estatal de Salud Pblica de Chiapas Alimentos y Biotecnologa UNAM Laboratorios Becar, S.A. de C.V. Laboratorio Microbiolgico ANDA Biofleming Laboratorios Laboratorios de Especialidades Inmunolgicas, S.A. de C.V. Analysis & Research Lab., S.A. de C.V. Laboratorio de Microbiologa en Inocuidad del CESAVESIN Laboratorio de Anlisis Qumico, Centro de Investigacin y Desarrollo Tecnolgico en Electroqumica, S.C. Laboratorio Qumico Industrial y Agrcola S.A. de C.V. Laboratorio Estatal de Salud Pblica de Aguascalientes Laboratorio Estatal de Salud Pblica de Durango Laboratorios Valds S.A. de C.V. Laboratorio Microanaltico de Control S.A. de C.V. Ecolaboratorios, S.A. de C.V. Laboratorio Regional de Salud Pblica Servicios de Salud Chihuahua Bufete Qumico S.A. de C.V. Intertek Testing Services Kimpen, S.A. de C.V. Laura Tobilla Lalo. Consultora en Inocuidad y Microbiologa de Alimentos Nestle Quality Assurance Center (NQAC) Toluca Laboratorio Estatal de Salud Pblica de Michoacn Cierto y Seguro S.A. de C.V. Laboratorio Central Regional de Mrida, Yucatn Primus Laboratorios de Mxico, S. de R.L. de C.V. Laboratorio Fermi, S.A. de C.V. Zbok Laboratorio SA de CV Laclicsa Laboratorios Difaza, Laboratorio de Control Industrial S.A. de C.V. Laboratorio de Diagnstico para la Deteccin de Organismos Patgenos Centro de Investigacin en Alimentacin y Desarrollo A.C.
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PROGRAMAS INTERNACIONALES IMPLEMENTADOS EN MATERIA DE INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS EN BENEFICIO DEL SECTOR PRODUCTIVO DE CRNICOS, PRODUCTOS DE FRUTAS Y A BASE DE VEGETALES
I.1. PROGRAMAS INTERNACIONALES IMPLEMENTADOS EN MATERIA DE INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS I.1.1. Poltica de Inocuidad, CHILE 2009-2015. Unidad de Diseo FUCOA, Ministerio de Agricultura. Su objetivo es velar por la inocuidad de los alimentos producidos, elaborados y comercializados en el pas con el fin de resguardar la proteccin de la salud de las personas y de los derechos de los consumidores, adems de favorecer el desarrollo competitivo y exportador de la industria de los alimentos. Esto, a travs de un moderno, integrado, eficiente y transparente sistema de inocuidad de los alimentos. Como objetivos especficos se planea: 1. Perfeccionar el marco regulatorio a. Contar con un marco regulatorio armonizado o equivalente con las normas internacionales del Codex Alimentarius. i. Mantener actualizadas las normativas de inocuidad con respecto al Codex Alimentarius en los casos que corresponda. ii. Revisar una legislacin nacional a fin de analizar si se estn detectando los fraudes alimentarios. b. Fortalecer la presencia de Chile en instancias internacionales. i. Dar mayor relevancia al trabajo del Comit Nacional del Codex Alimentarius. ii. Robustecer la participacin Chilena en el Codex Alimentarius. 2. Fortalecer las capacidades cientficas y tecnolgicas a. Aumentar y mejorar la capacidad de los recursos humanos.
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i. Desarrollar programas permanentes de capacitacin. ii. Apoyar la formacin de post-ttulos y post-grados. b. Robustecer la investigacin e innovacin. i. Definir agenda de investigacin e innovacin. ii. Favorecer la incorporacin de los temas de inocuidad de las agencias que financian investigacin. iii. Desarrollo e innovacin. iv. Fomentar la constitucin de consorcios tecnolgicos c. Fortalecer la capacidad analtica de la red de laboratorios. i. Articular el sistema nacional de referencia. ii. Impulsar la implementacin de metodologas analticas en mbitos emergentes. 3. Modificar los sistemas de control y vigilancia de los alimentos a. Ampliar y consolidar las prcticas y mecanismo de autocontrol de los peligros alimenticios. i. Apoyar la implementacin de sistemas de aseguramiento de la calidad en las empresas de alimentos. ii. Actualizar las modalidades de inspeccin de las empresas de alimentos. iii. Redisear programas de fiscalizacin de la cadena alimentaria. b. Mejorar programas de control e higiene de los alimentos. i. Coordinar los programas de control de residuos de alimentos pecuarios e hidrobiolgicos. ii. Coordinar los programas de control de residuos de plaguicidas en productos vegetales. iii. Integrar los programas de control de toxinas marinas. iv. Implementar programas conjuntos de control de patgenos transmitidos por alimentos. c. Desarrollar un sistema de informacin de inocuidad integrado consistente y eficaz. i. Compatibilizar los sistemas de informacin institucionales. d. Modernizar la gestin de alertas alimentarias. i. Desarrollar un sistema integrado de gestin de alertas alimentarias. Perfeccionar el sistema de manejo de alertas vinculado a la exportacin de alimentos a la Unin Europea. 4. Favorecer el comercio internacional perfeccionando procesos de control y certificacin de exportaciones. a. Mejorar los procedimientos de autorizacin de importacin de los alimentos. b. Perfeccionar los procesos de control y certificacin de la inocuidad de los productos alimenticios de exportacin. i. Definir un estndar mnimo de inocuidad de exportacin.
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ii. Evaluar la alternativa de hacer obligatoria la certificacin de las exportaciones de alimentos. iii. Precisar las competencias institucionales para el control, inspeccin y certificacin de la inocuidad de los alimentos de exportacin. iv. Avanzar en la implementacin de la certificacin electrnica de las exportaciones. 5. Promover la industria alimentaria en todos sus eslabones a. Propiciar la ampliacin de las capacidades tcnicas y operativas de las empresas en mbitos de inocuidad. i. Difundir e impulsar la aplicacin de la Resolucin Exenta no. 187, de 2008, del Ministerio de Salud, referida a los sistemas de control preventivo. ii. Intensificar el uso de los instrumentos del SENCE. b. Perfeccionar y ampliar los instrumentos de fomento para las pequeas y medianas empresas. i. Ampliar los programas de fomento relacionados con el aseguramiento de la calidad ii. Disear e implementar un programa de buenas prcticas de distribucin en las principales ferias mayoristas de alimentos. 6. Desarrollar un marco institucional que facilite y promueva la coordinacin y complementacin de las entidades pblicas. a. Modernizar la institucionalidad pblica relacionada con la inocuidad alimentaria. i. Creacin por Ley de la Agencia Chilena de Inocuidad de los Alimentos. ii. Constituir un Comit Cientfico de Evaluacin de Riesgos de los Alimentos. iii. Reforzar la modernizacin del MINSAL, SAG y SERNAPESCA. iv. Integrar a la agencia el trabajo del Comit Nacional del Codex Alimentarius. b. Ampliar y mejorar los mecanismos de participacin y de comunicacin de los riesgos. i. Crear el Consejo Consultivo de la Agencia ii. Institucionalizar las consultas pblicas y la rendicin de cuentas. iii. Intensificar las campaas de informacin sobre los riesgos alimentarios. iv. Fortalecer a las organizaciones de consumidores y su accin en el mbito de la inocuidad y calidad nutricional de los alimentos. c. Modernizar la institucionalidad pblica relacionada con la inocuidad alimentaria. I.1.2. Food and Drug Administration Food Safety Program, Estados Unidos de Amrica La unin americana cuenta con tres agencias en las cuales se regula la inocuidad de los alimentos: el United States Department of Agriculture (USDA), la Food and Drug Administration (FDA) y la Food Safety and Inspection Service (FSIS).
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Como parte de su programa se cuenta con un registro de reportes de alimentos, el cual consiste en un portal para la industria donde puede reportar si hay una probabilidad razonable que el artculo puede causar consecuencias de salud serias. Se incluyen tambin planes de accin especficos como: 1. El plan de accin para la produccin inocua 2. El plan de accin para la inocuidad en huevo 3. El plan de accin de acrilamida El plan de proteccin de la FDA de 2007 establece una estrategia global e integrada de prevencin, intervencin y la respuesta. Para acceso de informacin al pblico en general est disponible el portal Food Safety.gov en el cual se proporciona informacin sobre el manejo seguro de los alimentos, informacin bsica de patgenos, higiene, campaas, alertas, entre otros. En esta pgina se pueden reportar los casos por intoxicacin, as como se puede tener acceso a un experto a travs de un chat. El portal est disponible en ingls y espaol. El documento principal que engloba la inocuidad de los alimentos est definido como el Food Safety Modernization Act (FSMA) donde se incluyen ttulos como: 1. Mejorar la capacidad para evitar problemas de seguridad alimentaria, donde se incluyen temas como la inspeccin de los registros, el registro de instalaciones alimenticias, el anlisis de riesgos y peligros basados en los controles preventivos, normas de desempeo, normas para la inocuidad de los productos, proteccin contra la adulteracin intencional, la colecta de honorarios por la autoridad, la estrategia para la agricultura nacional y la defensa de los alimentos, consejos de coordinacin para la alimentacin y la agricultura, creacin de capacidad nacional, el transporte sanitario de los alimentos, manejo de alergia a los alimentos y la anafilaxia, nuevos ingredientes de la dieta, requerimiento para la gua para el procesamiento de la cosecha de ostras crudas, compra en el puerto e instalaciones relacionadas con el alcohol. 2. Mejorar la capacidad para detectar y responder a los problemas de inocuidad en alimentos donde se incluye la focalizacin de los recursos de inspeccin de las instalaciones nacionales, las instalaciones extranjeras y puertos de entrada; informe anual, la acreditacin de laboratorios para el anlisis de los alimentos, consorcio integrado por redes de laboratorio, mejorar el seguimiento y el rastreo de los alimentos y el mantenimiento de registros, vigilancia, autoridad de retiro obligatorio, la detencin administrativa de los alimentos, planes y normas para la descontaminacin y desecho, mejorar la capacitacin de funcionarios en la inocuidad alimentos estatales, locales, territoriales y tribales, mejorar la inocuidad de los alimentos, mejorar el registro de incidentes sanitarios. 3. Mejorar la seguridad de la comida importada que incluye el programa de verificacin de proveedores extranjeros, el programa del importador voluntario calificado, autoridad para requerir certificaciones de importacin de alimentos, notificacin previa de embarques de alimentos importados, fortalecimiento de la infraestructura de los gobiernos extranjeros con respecto a la inocuidad de los alimentos, inspeccin de las instalaciones de preparacin de alimentos extranjeras, acreditacin de los auditores externos, oficinas de relaciones exteriores de la FDA y el contrabando de alimentos.
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4. Otras disposiciones, que incluye la financiacin de la inocuidad alimentaria, la proteccin de los empleados, jurisdiccin, autoridades, el cumplimiento de los acuerdos internacionales determinacin de los efectos presupuestarios. Entre otros programas se incluyen: 1. El programa de la USDA y FSIS, FY 2008-2013, Strategic plan que tiene 6 objetivos principales tales como: a. Reforzar la inspeccin, los sistemas de ejecucin y las operaciones para proteger la salud pblica. b. Mejorar el uso del anlisis de riesgos y la vulnerabilidad con el enfoque del FSIS para proteger la salud pblica. c. Mejorar el desarrollo de la ciencia y las polticas basadas en el riesgo y los sistemas. d. Mejorar el desarrollo y el mantenimiento de la coleccin de datos y sistemas de anlisis para verificar la eficacia y eficiencia de la agencia de programas. e. Mejorar el desarrollo y mantenimiento de una infraestructura innovadora que soporta la misin de la agencia y sus programas. f. Mejorar la eficacia de la agencia en divulgacin y comunicaciones para alcanzar las metas de salud pblica. 2. El programa de FSIS FY 2011-2016, Strategic Plan que contiene tres temas estratgicos: a. Prevencin de enfermedades producidas por alimentos: asegurar de que la inspeccin de seguridad alimentaria se alinea con los riesgos existentes y emergentes, maximizar el cumplimiento nacional e internacional con las polticas de inocuidad de los alimentos, mejorar la educacin pblica y divulgacin para mejorar la manipulacin de los alimentos, fortalecer la colaboracin entre las partes interesadas internas y externas a prevenir las enfermedades transmitidas por los alimentos. b. Comprender e influir en la cadena del campo a la mesa: utilizar con eficacia la ciencia para entender las enfermedades transmitidas por los alimentos y las tendencias emergentes e implementar polticas efectivas para responder a los riesgos existentes y emergentes. c. Fortalecer la capacitacin de las personas e infraestructura: Facultar a los empleados con la formacin, recursos y herramientas para facilitar el xitoen la proteccin de la salud pblica, en base de las necesidades definidas de la agencia, desarrollar, mantener y utilizar metodologas innovadoras, procesos y herramientas, incluyendo PHIS, para proteger la salud pblica eficiente y eficazmente y apoyar las necesidades y metas definidas por la salud pblica.
I.1.3. European Commission DG Health and consumers, SANCO Esta comisin tiene como objetivos capacitar a los consumidores, proteger y mejorar la salud pblica, garantizar que los alimentos en Europa (Unidad Europea, UE) sean seguros y saludables, proteger la salud y el bienestar de los
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animales de granja y proteger la salud de los cultivos y los bosques. Parte de sus estrategias es a travs de tres puntos bsicos: 1. Vigilancia: una vez que la UE ha aprobado leyes sobre la alimentacin y la seguridad de los productos, los derechos del consumidor o la salud pblica, corresponde a los gobiernos nacionales, regionales y locales el aplicar las leyes para asegurar que los comerciantes, los fabricantes y los productores de alimentos se adhieran a las reglas. Parte del trabajo de la comisin es comprobar que sto est sucediendo realmente. 2. Escuchando: para ser eficaz, sus polticas tienen en cuenta las polticas relacionadas con la UE, por ejemplo sobre el comercio, la competitividad y el medio ambiente y las preocupaciones de nuestros grupos de inters. A travs de una amplia consulta se enfocan en conocer la opinin de todas las partes interesadas. 3. Actuar: donde se necesita la accin de la UE, realiza propuestas que utilizan una mezcla de leyes, el apoyo a proyectos y otras medidas. Tambin apoya a las autoridades nacionales o regionales. Europa cuenta con la European Food Safety Authority (EFSA) que es considerada la piedra angular de la Unin Europea (UE) en materia de evaluacin de riesgos e inocuidad de los alimentos. Colabora estrechamente con las autoridades nacionales y proporciona asesoramiento cientfico independiente y clara comunicacin sobre los riesgos existentes y emergentes. El objetivo central de la poltica de la Comisin Europea sobre inocuidad alimenticia es asegurar un alto nivel de proteccin de la salud humana y los intereses de los consumidores en relacin con los alimentos, teniendo en cuenta la diversidad, incluidos los productos tradicionales, al tiempo que garantiza el funcionamiento eficaz del mercado interior. La Comisin Europea tiene un portal como un sistema de alertas conocido como RASFF (Rapid Alert System for Food and Feeds) donde se encuentra informacin general, notificaciones e informes, alertas entre otros. Adems, la Comisin Europea y el RASFF colaboran con el sistema de alerta de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), llamada Red de Autoridades en materia de Inocuidad de los Alimentos (INFOSAN). Esta red est formada por puntos de contacto o centros de enlace nacionales en ms de 160 pases miembro que reciben informacin de la OMS en forma de notas de INFOSAN en materia de seguridad alimentaria y la difunden a todos los ministerios competentes en sus respectivos pases. El RASFF colabora con INFOSAN y los dos sistemas comparten informacin caso por caso. La principal gua de la comisin es el Libro Blanco sobre seguridad slimentaria, que consiste en aplicar un enfoque integrado del campo a la mesa involucrando a todos los sectores de la cadena alimentaria, incluyendo la produccin de piensos, produccin primaria, procesamiento de alimentos, almacenamiento, transporte y venta al por menor. En este libro se presentan propuestas que transformarn la poltica alimentaria de la UE en un instrumento anticipador, dinmico, coherente y global con el propsito de velar por un nivel
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elevado de salud de las personas y de proteccin de los consumidores a travs de un planeamiento global e integrado. Considera que la recopilacin y el anlisis de informacin son elementos esenciales de la poltica de seguridad alimentaria, y resultan de especial importancia para la deteccin de peligros potenciales en la alimentacin animal y humana. Esto incluye una apropiada supervisin y vigilancia, sistemas de alerta, investigacin, cooperacin cientfica, apoyo analtico, sistemas actuales de asesoramiento cientfico, consulta obligatoria de comits, necesidades de redes cientficas, entre otros. Propone la necesidad de un nuevo marco jurdico para la seguridad alimentaria que est formado por un conjunto de normas coherentes y transparentes en materia de seguridad alimentaria. Regulacin de los alimentos para animales, de nuevos productos, aditivos, plaguicidas, ionizacin en alimentos, residuos y disposicin, alimentos modificados genticamente, alimentos dietticos, proceso de comunicacin de riesgos, etiquetado y publicidad, medidas de emergencia, toma de decisiones, entre otros.
I.1.4. Ley Bsica de Inocuidad en Alimentos, Food Safety Commission, JAPON (2003, amd. 2006) En consideracin a la importancia vital de las respuestas precisas para el desarrollo de la ciencia y la tecnologa, as como al avance de la internacionalizacin y otros cambios que rodean el entorno de los hbitos alimenticios de Japn, se propone esta Ley para promover ampliamente las polticas para garantizar la inocuidad alimenticia mediante el establecimiento de principios bsicos, al aclarar las responsabilidades de los gobiernos estatales, locales y de la industria de los alimentos y el papel de los consumidores. As como el establecimiento de una direccin bsica para la formulacin de polticas, con el fin de garantizar la inocuidad alimenticia. Esta ley est compuesta por tres captulos principales: 1. Captulo I. Disposiciones generales (Artculos 1-10), que contempla el propsito, definiciones, reconocimiento bsico para tomar medidas que aseguren la inocuidad de los alimentos, medidas apropiadas en cada etapa del proceso del suministro de alimentos, prevencin de efectos adversos en la salud de los ciudadanos, responsabilidades del estado, responsabilidades de gobiernos estatales, responsabilidad de las empresas relacionadas con la alimentacin, el papel del consumidor y medidas legislativas. 2. Captulo II. Direccin bsica para la formulacin de polticas(artculos11-21): La aplicacin de la evaluacin del efecto de los alimentos en la salud, formulacin de polticas sobre la base de los resultados de la evaluacin del efecto de los alimentos sobre la salud en consideracin de las condiciones de los hbitos dietticos de los ciudadanos y otras circunstancias, promocin de intercambio de informacin y opiniones, establecimiento de un sistema para hacer frente a emergencia y otras situaciones, cooperacin cercana y mutua entre cuerpos administrativos relacionados, establecimiento de investigacin y otros sistemas, coleccin, organizacin y utilizacin de informacin interna y externa, asegurar el etiquetado apropiado, educacin y
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aprendizaje referente a la inocuidad de los alimentos, consideracin de los efectos en el ambiente y la determinacin y publicacin de los asuntos bsicos relativos a la aplicacin de las medidas. 3. Captulo III. Comisin de seguridad alimentaria (artculos22-38): establecimiento, obligaciones oficiales bajo la jurisdiccin de la comisin, opinin de la comisin, requerimiento de materiales, misin de la investigacin, requerimientos en emergencias, organizacin, nombramiento de los miembros de la comisin, plazo, despido, servicio, salario de un miembro de la comisin, presidente, reuniones, miembro experto de la comisin, secretario y la delegacin de orden ministerial. I.1.5. Programa Nacional de Inocuidad de los Alimentos, Ministerio de Salud Pblica, Viceministerio de Higiene y Epidemiologa, Direccin Nacional de Salud Ambiental, Cuba 2001 Este programa se basa en el principio de integrar todos los factores tanto dentro del sector salud como extrasectorialmente en funcin de la inocuidad de los alimentos para garantizar una mejor salud para los consumidores y facilitar el comercio y exportacin. Como objetivos contempla: 1. Actualizar las actividades de vigilancia de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) integrando otros factores intra y extrasectorialmente. 2. Desarrollar la inspeccin sanitaria en coordinacin con los organismos rectores vinculados, productores y de servicio para la aplicacin de medidas efectivas y coherentes para la eliminacin de los factores de riesgo detectados. 3. Desarrollar e impulsar la capacitacin para la prevencin de las ETA, entre el personal de salud, los organismos productores, comercializadores y de servicio, asi como a la poblacin. 4. Desarrollar la comunicacin de riesgos y la participacin comunitaria para la prevencin de los ETA. 5. Establecer una red de laboratorios para profundizar en el estudio de las ETA y el control de los alimentos en general. 6. Establecer las normas y procedimientos que correspondan para el desarrollo del sistema, mediante la normalizacin y el control de calidad. 7. Coordinar y desarrollar las investigaciones necesarias entre los organismos involucrados de investigacin y docentes paraobtener informacin necesaria para el control, as como la tecnologa que conlleva a la reduccin de ETA. Este trabajo est orientado a atender y evaluar los riesgos que se presenten en agua, carne y productos crnicos (mataderos y fbricas de embutidos), alimentacin colectiva, alimentacin en el hogar, distribucin y conservacin de alimentos y produccin primaria (leche, frutas y vegetales, otros). I.1.6. Canadian Food Inspection Agency. Food Safety Enhancement Program Manual. Canad. El Gobierno de Canad basa sus estrategias en materia de inocuidad alimentaria en el Manual del Programa de Mejoramiento de la Seguridad Alimentaria (FSEP), el cual a travs de la Agencia Canadiense de Inspeccin Alimenticia (CFIA)
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especifica los requisitos mnimos necesarios para una gestin de un sistema efectivo en seguridad alimentaria. El FSEP proporciona un mecanismo para que los operadores de los establecimientos demuestren su capacidad para controlar los riesgos para mantener la inocuidad alimentaria con el fin de asegurar que los alimentos sean inocuos para el consumidor. Adems, ayuda a mejorar las habilidades de produccin de los establecimientos para alcanzar y mantener el cumplimiento de las disposiciones reglamentarias. El FSEP se basa en los principios del sistema de anlisis de peligros y puntos crticos de control (Hazard Analysis and Critical Control Point (HACCP)) desarrollado por la Comisin del Codex Alimentarius. HACCP es un sistema de reconocimiento internacional, basado en la ciencia de los alimentos y su seguridad, diseado para prevenir, reducir o eliminar las posibles amenazas biolgicas, qumicas o fsicas para alcanzar la inocuidad en los alimentos. El sistema de HACCP es responsabilidad de los establecimientos. El fabricante de los alimentos tiene el control mximo sobre el producto y de este modo puede tener el mayor impacto en la seguridad de los alimentos producidos. El FSEP especifica los requisitos para un sistema de HACCP eficaz que combina la siguiente clave de elementos para garantizar la produccin de alimentos seguros: Programas de requisitos previos Planes HACCP (puede incluir controles de procesos vinculados a un punto crtico de control) Validacin de los puntos crticos de control Mantenimiento y reevaluacin de procedimientos Aunque la adopcin de sistemas de HACCP en todo el mundo se debe principalmente a la seguridad alimentaria y a la proteccin de los consumidores, existen otros beneficios para la industria de alimentos que se pueden realizar mediante la implementacin del sistema exitoso de HACCP. El sistema de HACCP formalmente incorpora los principios de inocuidad de los alimentos como medidas integrales de los procesos de produccin. La implementacin y el mantenimiento de medidas de control desempean un papel fundamental en la sensibilizacin de la gestin frente a la lnea de produccin y el personal. Los establecimientos que han implementado un sistema HACCP ofrecen a los consumidores un mayor grado de confianza debido a que demuestra que el objetivo de la empresa es producir un producto alimenticio seguro. El mercado sigue impulsando la aplicacin del HACCP en la industria alimentaria. En muchos de los casos, las exigencias del comprador y los gobiernos extranjeros requieren la aplicacin del HACCP para mantenerse en el mercado y/o acceder a los mercados antes inaccesibles. Como los sistemas de HACCP son aceptados en todo el mundo, el FSEP ayuda a la industria Canadiense a mantener y ampliar sus mercados internacionales.
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RECOMENDACIONES PARA ESTABLECER UN PROGRAMA DE VERIFICACIN INTERNO EN MXICO

I. JUSTIFICACIN DE POSIBLE IMPLEMENTACIN EN MXICO En materia de inocuidad de los alimentos, Mxico actualmente basa sus estrategias en el Programa Nacional de Desarrollo 2007-2012, Objetivo 8. Abastecer el mercado interno con alimentos de calidad, sanos y accesibles provenientes de nuestros campos y mares, Estrategia 8.1., que contempla proteger al pas de plagas y enfermedades, mejorar la situacin sanitaria, garantizar la aplicacin de la normatividad vigente en materia de sanidad e inocuidad alimentaria y mantener el reconocimiento y estatus sanitario en los mercados globales. La Secretara de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacin (SAGARPA) a travs del Servicio Nacional de Sanidad Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA) realiza actividades siguiendo los lineamientos del Programa Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (2007-2012) que incluye estrategias para la regulacin, la proteccin, la difusin y la capacitacin en materia de inocuidad con el objetivo de beneficiar a los consumidores y a los productores de la industria agroalimentaria que permite la exportacin de diversos productos a otros pases.
Como lo seala el Programa de Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria se requieren mejores herramientas para lograr un refuerzo continuo en el rea de notificacin de plagas y enfermedades, la capacitacin de grupos de vigilancia y el aumento de laboratorios de diagnstico pblicos y privados. Con el objetivo de mejorar la difusin de alertas al pblico consumidor en el pas, en noviembre de 2010, el Gobierno Federal apoyado por la European Commission lanz el portal de internet: Red de Alerta Rpida (RAR, www.alertas.gob.mx) RAR es considerado el medio oficial de comunicacin de alertas para los consumidores en el cual se emiten alertas de las diferentes dependencias del Gobierno Federal en materia de salud, proteccin al consumidor, sanidad, inocuidad y calidad agroalimentaria. El alcance de esta herramienta es fortalecer los derechos de los consumidores como camino para elevar el bienestar de los mexicanos y aumentar la eficiencia en los mercados. En este sitio se encuentran alertas de: la Comisin Federal de Proteccin contra Riesgos Sanitarios (COFEPRIS), de la Procuradura Federal del Consumidor (PROFECO) y
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del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA).
La seccin de Informacin al Consumidor de RAR est conformada por noticias de COFEPRIS, PROFECO, SENASICA, Administracin General de Aduanas, Noticias internacionales y CPSC. Desafortunadamente, la seccin de denuncias y contacto no estn disponibles por el momento, as como la asesora a proveedores y preguntas frecuentes. Este sitio web tambin ofrece la notificacin de alertas va correo electrnico y se encuentra disponible en Facebook y twitter. Se recomienda realizar una campaa ms ambiciosa para dar a conocer RAR y sus aplicaciones, esto a travs de los diferentes medios de comunicacin con la finalidad de invitar a los consumidores a apoyarse en esta herramienta oficial. Un mejor soporte tcnico y la incorporacin de un chat en lnea que pueda resolver dudas en tiempo real enriqueceran este portal. Es importante que la poblacin conozca RAR para que evite confiar en alertas con informacin confusa o errnea a travs de medios de comunicacin no oficiales. Sera de gran relevancia que RAR publicara el seguimiento a las denuncias presentadas por los ciudadanos especialmente en materia de intoxicacin por alimentos en mal estado y su recurrencia. El bajo impacto de difusin entre la poblacin fue demostrado en el anlisis de la campaa de promocin de cultura sanitaria agroalimentaria de SENASICA en 2010. En este documento se destaca que aunque gran parte de la poblacin asegura tener conocimientos sobre la sanidad e inocuidad de los alimentos, tienen poco o escaso conocimiento sobre el SENASICA. Entre las recomendaciones de los entrevistados se inclua que era indispensable una mayor difusin de la dependencia y sus programas a travs de la radio, internet y algunos medios impresos de circulacin nacional o local. Esto brinda una excelente oportunidad a este rgano desconcentrado para difundirse como autoridad e normativa en la materia a travs de la oferta de informacin oportuna, veraz y clara para la poblacin. En materia de vigilancia, el Gobierno Federal a partir de 2011 implement la Red de Alerta Rpida Interna (RARI-SENASICA) que funciona como una herramienta tecnolgica que permite obtener y analizar informacin de manera rpida y en tiempo real, para detectar oportunamente amenazas que pudieran poner en riesgo el patrimonio agroalimentario del pas. La RARI-SENASICA conjunta la informacin que emiten las diferentes reas tcnicas de este rgano desconcentrado de la SAGARPA: Sanidad vegetal, salud animal, inocuidad agroalimentaria e inspeccin fito-zoosanitaria. En
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tiempo real se concentra informacin a la RARI-SENASICA de los 232 laboratorios que integran la red de laboratorios del SENASICA; los 322 puntos de verificacin e inspeccin interna del territorio nacional y de la red de vigilancia interna y externa a nivel federal que consta de 36 puntos de verificacin en inspecciones federales, 19 cruces fronterizas, 15 puertos martimos y 29 aeropuertos. Es por ello que en caso de que se presentara alguna emergencia sanitaria relacionada con el sector agroalimentario de nuestro pas, esta infraestructura ofrece la posibilidad de actuar eficaz y oportunamente en su contencin, pues permitira al grupo multidisciplinario de expertos del SENASICA analizar a detalle y en forma inmediata, la informacin para medir el riesgo y de esta manera implementar rpidamente las medidas y operativos pertinentes. Esta plataforma promueve la utilizacin de medidas sanitarias y de procedimientos de evaluacin acordes con la Organizacin Mundial de Comercio (OMC). Fue diseada con base en los estndares establecidos por otros organismos internacionales como la Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la Agricultura (FAO), la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), la Organizacin Norteamericana de Proteccin a las Plantas (NAPPO) y la Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE). RARI es compatible con la Red de Alerta Rpida Nacional (RAR) y con las principales redes de la Unin Europea en materia de proteccin al consumidor: European Rapid Alert System for non-food consumer products (RAPEX), que funciona para productos inseguros no alimenticios; y Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF), para alimentos y forrajes e insumos para la produccin agropecuaria, considerados potencialmente peligrosos. Se recomienda que RARI incorpore a un nmero mayor de instituciones de investigacin y acadmicas, as como laboratorios de servicios con el objetivo de incrementar la probabilidad de detectar un hallazgo. Es importante que el sitio web contenga informacin sobre los requisitos necesarios para ser incorporado a esta red. Un adecuado soporte tcnico es la base para el funcionamiento eficaz de este sitio. En general, para el control en materia de inocuidad alimentaria se debe reforzar constantemente los recursos de inspeccin en las instalaciones nacionales, incrementar el nmero de laboratorios acreditados, hacer ms eficiente la rastreabilidad, mejorar la capacitacin a niveles estatales y locales y optimizar el registro de incidentes sanitarios. Es importante, aumentar la seguridad de la comida importada, la detencin administrativa de alimentos y el retiro obligatorio. Para dar soporte a todos estos controles es indispensable la actualizacin de las normas oficiales mexicanas. Un punto de gran relevancia para la mejora continua en materia de inocuidad en alimentos es el papel de la investigacin y la transferencia de tecnologa. El Programa Sectorial de Desarrollo Agropecuario y Pesquero SAGARPA 2007-2012, punto 1.1.4. Investigacin, transferencia de tecnologa e innovacin seala que existe un fuerte rezago en el gasto interno en investigacin y desarrollo experimental (GIDE), pues solo se aplica un 0.44 % del PIB promedio en todas las reas y 0.17 % en el sector agropecuario, lo cual incide en la baja competitividad de los sistemas de producto. En el sector agropecuario se cuenta con 0.6 investigadores por cada 10 mil habitantes, lo cual est muy por debajo de los estndares internacionales.
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A esto es necesario agregar la edad promedio de los investigadores que es de alrededor de 50 aos con 25 aos de servicio, por lo que es urgente establecer programas de formacin e incorporacin de investigadores jvenes. La mayora de las instituciones de investigacin y educacin superior, presentan un fuerte rezago en infraestructura, equipo, renovacin y formacin de recursos humanos en temas de vanguardia. No existen esquemas de capital de riesgo que estimulen la innovacin tecnolgica en el sector rural. El Sistema Nacional de Investigacin y Transferencia Tecnolgica para el Desarrollo Rural Sustentable (SNITT) ha organizado instrumentos importantes de trabajo, pero no ha alcanzado la fortaleza y estructura necesaria para cumplir a cabalidad las funciones que considera la Ley de Desarrollo Rural Sustentable. La agenda de transferencia tecnolgica del campo mexicano, se lleva a cabo a travs del modelo de las fundaciones Produce, del cual han resultado algunas innovaciones relevantes, que es necesario replicar, para lograr mayores impactos en el medio rural. Actualmente las instituciones de investigacin y educacin superior mantienen una dbil vinculacin con la Secretara de Agricultura, Ganadera Desarrollo Rural, Pesca y Alimentacin (SAGARPA), con la Asociacin Mexicana de Secretarios de Desarrollo Agropecuario (AMSDA) y con el sector productivo y empresarial del sector agropecuario, lo que provoca una falta de alineamiento de la comunidad cientfica con los requerimientos actuales del pas. Los sistemas de administracin de las instituciones de investigacin y educacin superior presentan problemas burocrticos que limitan su capacidad de respuesta. Es necesario redoblar los esfuerzos de transferencia de tecnologa para hacer llegar a los productores los resultados de la investigacin. Se recomienda implementar un programa nacional de ensayos de aptitud, y la disposicin de materiales de referencia certificados nacionales, para la medicin de los organismos microbiolgicos causantes de ETAs que coadyuven en la validacin de metodologa y al aseguramiento de la calidad del resultado de una medicin. Proveedores de ensayos de aptitud acreditados Se presenta a continuacin un listado con los datos generales y de contacto de proveedores de ensayos de aptitud acreditados para laboratorios de ensayo de metodologas de deteccin de microorganismos patgenos en alimentos, con el propsito de reforzar las recomenadaciones y brindar opciones a los laboratorios de anlisis y deteccin de microorganismos patgenos de los alimentos para que pueden establecer un programa de verificacin interno. Estas recomendaciones atraern clientes a dichos laboratorios certificados para usar sus servicios de anlisis y deteccin y asu vez, los clientes tendrn la certeza de que los resultados de los anlisis son confiables.
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Proveedores de Ensayos de aptitud acreditados para laboratorios de ensayo de metodologas de deteccin de microorganismos patgenos en alimentos Proveed or del Organismo Patgeno Prueba Matriz ensayo Localizacin Pgina Web que los de acredita aptitud Escherichia Enumera coli cin Presenci E.coli O157 a/ ausencia Enumera Coliformes cin Staphyloco ccus Enumera LGC Carne y coagulasa cin Standard pescado positivo s Presenci Salmonella a/ spp. ausencia Presenci Vibrio spp. a/ ausencia Presenci Listeria a/ spp. ausencia Listeria Presenci monocytoge a/ nes ausencia Listeria Detecci monocytoge n nes Coliformes y Enumera Escherichia cin coli Staphyloco ccus Enumera coagulasa cin positivo Salmonella Detecci Pollo
Chamberhall Business Park, Chamberhall Green, Bury Lancashire, BL9 0AP, UK
Acreditado por el UKAS (United http://www.lgcpt. Kingdom com/productview Accreditation narrow.aspx?Sch Service). No emeID=72 de proveedor de ensayo de aptitud: 0001
Res
Res
Res Pollo
Food and Environ ment Acreditado por Research el UKAS Agency. The Food and (United FEPAS http://www.fapas. Environment Kingdom Food com/proficiencyResearch Agency. Accreditation Examina testingSand Hutton, Service). No. tion schemes/fepas/ York, YO41 1LZ de proveedor Proficien de ensayo de cy aptitud: 0009 Assessm ent Scheme
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n Vibrio Detecci parahaemol Pescado n yticus Anlisis Escherichia cuantitati coli vo Cuenta de Anlisis coliformes cuantitati (30C y vo 37C) LIVSME Anlisis National Food cuantitati Aliment DELSV Acreditado por Listeria ERKET Agency, vo os (no https://www2.slv. Swedac monocytoge Microbiology Anlisis especifi National se/absint/index.as (Swedish nes Food Division, Box cualitativ can en px?selected=start accreditation Agency 622, SE-751 26 o cuales) body) in Uppsala, Sweden Anlisis Escherichia Sweden cualitativ coli O157 o Anlisis Salmonella cualitativ o Anlisis Vibrio cualitativ patognico o
Salmonella Detecci spp. n http://www.biose Acreditado por nate.com/downlo el UKAS Unit 12b ads-pdf(United Britannia House format/senateKingdom Cobden Street m1-meat-andAccreditation Bury, Lancashire seafoodService). No BL9 6AW proficiencyde proveedor United Kingdom testingde ensayo de scheme.htm aptitud: 4335
Detecci n Detecci Listeria n monocytoge Enumera nes cin Escherichia coli Detecci O157:H7 n (VTve) Staphyloco ccus Enumera coagulasa cin positivo
Listeria spp.
Carne
bioSenat e
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Vibrio cholerae (Non 01) Vibrio spp./ V. parahaemol yticus Staphyloco ccus coagulasa positivo Listeria spp.
Detecci n Detecci n Marisco s
Enumera cin
Detecci n Detecci Listeria n monocytoge Enumera nes cin
Centro Nacional de Servicios de Constata cin en Determi Carretera Product Salud nacin Cuernavaca a os y Animal. por Cuautla No 8534 subprod Servicio mtodo Col. Progreso, uctos Nacional FSIS Jiutepec crnico de Salmonella (FSIS Morelos, C.P. s Sanidad, spp. MLG, 62550 Inocuida 2008, dy Ch. 4.04, Calidad rev. 4 Agroali 04 mentaria /02/08) (SENAS Aislamie ICA) nto e identific Listeria acin monocytoge por nes mtodo FSIS (FSIS
Determi nacin Escherichia por coli mtodo genrica y petrifilm coliformes (AOAC 17th 998.08)
Reconocido http://www.ema.o por la ema rg.mx/descargas/e (entidad nsayos_aptitud/pr mexicana de oveedores/PEA_ acreditacin, Reconocidos_ene a. c.). No. de _ILACG13_2007 reconocimient .pdf o: PEA-ENS03
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MLG, 2009, Ch. 8.07, rev. 7 03 /08/09) Determi nacin por el mtodo Escherichia Reveal coli (BAM 0157:H7 1998 / AOAC 17th, 2000.13)
DRRR( Servicio de referenci a alemn Bodmanstrae 4, de 87435 Kempten, anlisis Geremany Listeria Ensayo Carne de monocytoge cuantitati molida alimento nes vo sy compete ncia en Ensayo materiale Salmonella cuantitati s de vo referenci a) Ensayo Staphyloco cuantitati ccus vo
E. coli
Prueba cuantitati va
Acreditado por la DAKKS ( Agencia Alemana de http://www.drrr.d Acreditacin). e/ No. de reconocimient o: D-EP17063-01-00
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PROPUESTAS DE MEJORA A LA NORMATIVIDAD

Observaciones y propuestas de modificacin a la normativa Nacional de productos del mar Los resultados del anlisis de la normativa nacional e internacional sobre las metodologas empleadas en la actualidad, para la deteccin de microorganismos patgenos responsables de las enfermedades de transmisin por alimentos (ETAs) de origen acutico, las investigaciones sobre los mecanismos de virulencia de los principales patgenos relacionados con las ETAs de este tipo de alimentos, as como el conocimiento y experiencia que se tiene sobre las prcticas que se llevan a cabo en los diferentes eslabones desde la cadena productiva o de captura hasta el consumidor, nos permite plantear las siguientes consideraciones y recomendaciones a la Normatividad en Mxico relacionada con el aseguramiento de la inocuidad de productos derivados de la pesca y la acuicultura: Observaciones: a) Se requiere una revisin de los criterios microbiolgicos concertados en la NOM-242SSA1-2009 ya que no considera en algunos casos, el efecto del procesamiento del alimento, sobre los microorganismos potencialmente presentes. Lo anterior puede ser considerado como una posible sobrerregulacin. b) Debera aplicarse el mismo criterio microbiolgico de Coliformes fecales y E. coli para pescados, crustceos y moluscos en la presentacin de frescos, refrigerados y congelados. c) Algunos aspectos biolgicos de los patgenos, conjuntamente con la presentacin de los productos (ahumados, enlatados, envasados al vaco, frescos, congelados etc.) y los hbitos alimenticios son considerados de manera muy superficial y posiblemente implique modificacin de los criterios, considerando principalmente la actual situacin de la acuicultura y las prcticas de pesca. d) La normativa nacional debe estar acorde con los avances en la implantacin de buenas prcticas de pesca y produccin acucola, para poder ser homologadas con las de los pases de primer mundo en cuanto a los criterios microbiolgicos. e) La norma debera establecer de manera clara y sin ambigedades el esquema de muestreo para los diferentes productos, con base en un criterio cientfico (tamao de muestra, aleatoriedad, procedimiento, etc.,). f) La bsqueda de la toxina botulnica y la enterotoxina estafilocccica solo est considerada para emergencias sanitarias y no estn consideradas otras toxinas termoestables. Deberan realizarse estudios epidemiolgicos para sustentar lo anterior para los productos derivados de la pesca (continental, riberea y altamar) y acuicultura. g) No se hace diferenciacin de los criterios microbiolgicos en productos ahumados en frio o en calor, ni considera la importancia del empaque. h) Se debera considerar el anlisis de ausencia de toxina botulnica en productos salados y seco-salados as como de Pseudomonas. i) Debera existir una definicin clara para las diferentes presentaciones de los alimentos (crudos, semipreparados, listos para comer y diferentes combinaciones).
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Propuestas 1. Incorporacin de mtodos alternos para la deteccin de genes relacionados con entero toxinas en alimentos acuticos contaminados. Por ejemplo; el gen stx1 (para Shiga toxinas), el hlyA (para hemolisina de V. cholerae), el tdh-1 (hemolisina termoestable de V. parahaemolyticus, el hly (para hemolisina de Listeria monocytogenes), el nuc (para nucleasa termoestable de Staphylococcus aureus), entre otros. La determinacin especfica puede estar ligada a la deteccin primaria del patgeno con mtodos normalizados. Importante que no represente una sobrerregulacin pero si un incremento en el nivel de seguridad para el consumidor. La generacin de la capacidad diagnstica de las cepas toxignicas debe o puede ser realizada por laboratorios de investigacin con procedimientos de validacin estrictos y aplicarse en un estudio epidemiolgico y en casos de emergencias sanitarias. 2. Generar mecanismos que de manera rpida y transparente, sin la tramitologa que implica actualmente la modificacin de normas, permitan incluir nuevos patgenos o variantes microbiolgicas a los programas de vigilancia epidemiolgica en productos acuticos. 3. Diseo y ejecucin de un programa anual (o bianual) de pruebas de desempeo y ensayos interlaboratorios, considerando: 1) muestras de referencia, 2) mtodos convencionales (normados) y mtodos alternos, 3) participacin de laboratorios de ensayos que demuestren contar con sistema de calidad implementado y que cuenten con las tcnicas estandarizadas y validadas para deteccin de patgenos en productos derivados de la pesca y acuicultura, 4) los alcances especficos de cada uno de los laboratorios involucrados y 5) participacin de las autoridades correspondientes. 4. Desarrollo e implementacin de un programa de prevencin de ETAs, mediante la aplicacin y supervisin de leyes y normas relacionadas con la aplicacin de buenas prcticas en la produccin y/o captura de organismos acuticos. Debe contemplar la capacitacin del personal involucrado y las certificaciones correspondientes. 5. Promover y exigir sistema de trazabilidad en la produccin, distribucin y venta de alimentos de origen acutico. 6. Aseguramiento de la calidad e inocuidad de los productos, mediante la supervisin efectiva a plantas de procesamiento, transporte y venta al pblico (incluyendo pequeos establecimientos). Lo anterior bajo el esquema de certificacin y autorizacin de las autoridades correspondientes. 7. Solicitar una revisin de la norma para evaluar vigencia de los criterios microbiolgicos y la conveniencia de incluir la identificacin especifica del patgeno y/o Enterotoxina. 8. Evaluar la conveniencia de incrementar el nivel de seguridad en productos pasteurizados con respecto a Salmonella (ausente/100g). 9. Considerando los hbitos alimenticios de un importante nmero de personas y los problemas de contaminacin en diferentes cuerpos de agua, donde se realizan actividades de pesca y acuicultura, debera incluirse V. cholerae en los anlisis obligatorios para peces y crustceos (ya que solo se consideran bajo emergencia sanitaria) y no solo para moluscos bivalvos. 10. Debido a los cada vez mas brotes detectados de V. parahaemolyticus en camarn de cultivo y relacionado con ETAs, que este patgeno debera ser considerado para su incorporacin como anlisis obligatorio. 11. Analizar la conveniencia de crear una RED de laboratorios cuyo papel principal sea estar a la vanguardia en las metodologas de deteccin de cepas patognicas emergentes en diferentes matrices. Dicha RED participara, de manera obligatoria, en el programa de evaluacin de desempeo y ejercicios interlaboratorios.
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CRNICOS Propuesta para la Deteccin de Vibrio cholerae, V. vulnificus y V. parahaemolyticus. Existen documentos internacionales validados para el monitoreo de las especies de Vibrio patgenas al humano en alimentos en general y en Mxico solo es aplicable para alimentos de crnicos de origen marino, que es donde la literatura refleja la mayor importancia de monitorearlos. La revisin realizada respecto a la necesidad de monitorear especies de Vibrio patgenas al humano, refleja que sta es indispensable para productos crnicos de origen marino. En el resto de los alimentos, la contaminacin con especies de Vibrio patgenas al humano es menos frecuente y se da por contaminacin cruzada con agua o alimentos de origen marino. Por tanto, no hay evidencia contundente que conduzca a sugerir la necesidade implementar el monitoreo de estos microorganismos en productos crnicos diferentes al los de origen marino. Propuesta para la deteccin de Salmonella spp Con base a las validaciones y certificaciones internacionales (AOAC) de las plataformas y los sistemas de deteccin comercial existentes para diagnstico y en el hecho que son ampliamente utilizados en la industria alimentaria para monitoreo interno de las plantas procesadoras de carne y en que estn siendo utilizadas por Estados Unidos y la Unin Europea como pruebas rpidas de deteccin de microorganismos, que les permite hacer detenciones para posterior confirmacin con mtodos de referencia oficial del pas, se sugiere el uso de las siguientes plataformas comerciales para la deteccin de Salmonella en productos crnicos: 1) Sistema de deteccin gentica (GDS, siglas en ingls). Biocontrol. Este sistema acopla la deteccin de los microorganismos basados en anticuerpos y en la tcnica de PCR en tiempo real. 2) Sistema Bax. Dupont. Este sistema de deteccin se basa en PCR en tiempo real. 3) ICycler. BioRad. Basado en PCR en tiempo real 4) Pathatrix pooling for Salmonella testing
FRUTAS Y HORTALIZAS Propuesta para la deteccin de Salmonella spp Es necesario hacer actualizaciones de la norma y que tenga concordancia con al menos uno de los mtodos establecidos por normas extranjeras o tcnicas validadas por organismos internacionales. Recientemente, algunas normas extranjeras hicieron actualizaciones en su esquema de anlisis microbiolgicos en los medios de cultivo empleados y disponibles, as como en los mtodos de confirmacin, ya que se incluyen algunos medios de cultivo (a continuacin se enunciarn) y mtodos rpidos como reacciones bioqumicas rpidas (kits), mtodos moleculares (principalmente las que se basan en hibridacin del ADN, incluyendo PCR) y reacciones inmunolgicas (ELISA, RIA y Aglutinacin en ltex), entre otras modalidades de dichos mtodos. No obstante, la NOM en cuestin no ha considerado el uso de dichos medios de cultivos nuevos (ms selectivos y sensibles)
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y los mtodos rpidos de confirmacin. Es importante considerar al menos uno de estos medios de cultivo alternativos y mtodos para la confirmacin de Salmonella. En el caso de los medios de cultivo, uno de los cambios recientes en la metodologa del BAM/DFA es el uso de caldo RV para la deteccin de Salmonella en alimentos con altos y bajos niveles de microbiota competente. El medio Rappaport-Vassiliadis (RV) reemplaza al medio Selenito Cistina (SC) en todos los alimentos, excepto para goma Guar. Adems, el medio RV reemplaza al caldo Lauril Triptosa (LT) para ser utilizado cuando hay levaduras activas en el alimento. El caldo Tetrationato (TT) sigue siendo de seleccin como un segundo medio selectivo; sin embargo, el TT se deber incubar a 43 C cuando se sospeche que la carga microbiana sea alta y a 35 C cuando la carga microbiana sea baja, incluyendo goma Guar. Tambin se ha sugerido el uso del medio selectivo Rambach (Rambarch agar, CHROMAGARTM) como alternativa a los descritos en la norma. El segundo cambio es la posibilidad refrigerar el medio de preenriquecimiento o los medios (caldos) selectivos por 72 h como mximo. Este punto es importante tomarlo en cuenta, ya que por ejemplo, si una muestra se comienza a analizar en fin de semana, permite hacer una pausa y retomar la identificacin de Salmonella al inicio de la siguiente semana (FDA/BAM, 2011). En el caso de los mtodos de confirmacin, particularmente se recomienda el uso de PCR acoplado a reacciones de serotipificacin (sta recomendacin se justifica en base a que el PCR es un mtodo ampliamente utilizado, rpido, sensible, especfico, relativamente barato cuando se cuenta con el equipo y en la actualidad muchos laboratorios de prueba ya cuentan con la tecnologa). En la NOM-114-SSA1-1994 se establecen una diversidad de alimentos que pueden ser analizados; sin embargo, para frutas y hortalizas aunque estn considerados, no se especifican algunos aspectos como el que por ser la superficie de stos la que se contamina se debe analizar de manera diferente que la mayora de los alimentos (Tal y como se describe en BAM/FDA, actualizacin al 2011, y en APHA, 2001). Particularmente en este aspecto, se recomienda realizar el anlisis por medio de lavado del(os) fruto(s) en una cantidad de solucin diluyente (Agua peptonada tamponada al 0.1 %) igual al peso de la muestra a analizar, tal como se describe en FDA/BAM, 2011. Adems, FDA/BAM, 2011 recomienda la bsqueda de Salmonella en frutas y hortalizas en las que recientemente se ha encontrado incidencia de la bacteria y ha sido causa de brotes epidemiolgicos. Tal es el caso de alimentos como coco (rallado), jugo de naranja, cidra y jugo de manzana, as como el anlisis de frutas y hortalizas enteras, tales como meln, mango y tomate. Es importante considerar adems a las frutas y hortalizas frescas cortadas o mnimamente procesadas y a los vegetales de hoja verde, incluyendo especias. Es importante tambin tomar en cuenta los mtodos rpidos que se ofrecen en pruebas bioqumicas como alternativas en la identificacin bioqumica de Salmonella. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios para la determinacin de Salmonella en alimentos Es necesario hacer actualizaciones de la norma y que tenga concordancia con al menos uno de los mtodos establecidos por normas extranjeras o tcnicas validadas por organismos internacionales. 1. Es necesario que en la norma nacional se incluyan las frutas y hortalizas, pero que se especifiquen aspectos como: a) b) Como evaluar frutas y hortalizas enteras. Como evaluar frutas y hortalizas frescas cortadas o mnimamente procesadas.
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2. Es necesario que se actualicen los medios de cultivo empleados en la norma nacional, ya que al menos en BAM/FDA y APHA se han incluido nuevos medios de cultivo, ya que se ha demostrado que ofrecen resultados confiables y ms reproducibles. 3. Es importante tambin tomar en cuenta los mtodos rpidos que se ofrecen en pruebas bioqumicas como alternativas en la identificacin bioqumica de Salmonella. 4. Se sugiere tambin considerar el uso de mtodos moleculares para la confirmacin de Salmonella, incluyen pruebas de hibridacin del ADN como PCR, pruebas inmunolgicas (ELISA, RIA, AL, entre otros), ya que stos han demostrado mayor especificidad, selectividad, lmite de deteccin y dems atributos necesarios para considerarlos aptos para su uso. Tomando en cuenta lo que se expone en BAM/FDA, en el que una reaccin que resulta negativa se acepta como tal; si sta resulta positiva se deber confirmar por el mtodo de referencia oficial. No obstante, para los laboratorios de prueba (internos y externos) es importante reducir los tiempos de anlisis y considerando que la presencia de patgenos como Salmonella en alimentos es baja, comparado con el nmero de muestras que se analizan podran aportar apoyo en trminos de reduccin en los tiempos de anlisis. Propuesta para la Deteccin de Listeria monocytogenes La deteccin de Listeria monocytogenes en frutas y hortalizas no est firmemente sustentada debido a que la presencia de este patgeno no ha sido ampliamente reportado, esto puede ser debido a las altas poblaciones de microbiota del alimento las cuales constituyen una barrera bitica para el establecimiento y desarrollo de microorganismos patgenos. Sin embargo, se recomienda que Listeria monocytogenes sea detectada en este tipo de alimentos cuando su consumo vaya a ser efectuado por personas con enfermedades crnicas o inmunosupresivas, ya que este estrato de la poblacin es ms susceptible a la adquisicin de enfermedades y por consecuencias ms drsticas. Con la informacin disponible y consultada hasta este momento, se puede argumentar que en base a la Norma Oficial Mexicana que actualmente se encuentra, la cual describe la deteccin de Listeria monocytogenes en alimentos, para lo que se especifica en queso y leche pasteurizados y en base a la literatura consultada, Listeria ha sido altamente asociada a otros alimentos como lo son la carne, pollo y embutidos, lo cual ya es considerado y tomado en cuenta por algunos mtodos de referencia como lo son el de la USDA-FSIS. Por lo que la recomendacin emitida es ampliar la gama de alimentos, como los anteriormente mencionados, en los que se busque la presencia de Listeria monocytogenes. Los mtodos basados en determinaciones moleculares como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) constituyen una herramienta til, sensible, y de relativamente fcil uso para la deteccin de Listeria monocytogenes. En este sentido, se propone este mtodo como mtodo alternativo de confirmacin con la utilizacin de primers especficos para la especie monocytogenes y de esta manera tener la certeza que se est detectando la especie de inters que es la que tiene un impacto directo para la salud del humano. Es posible proponer este mtodo como un mtodo confirmatorio de las muestras presuntivas que han sido procesadas a travs de los mtodos convencionales, ya que estos dos mtodos en conjunto se complementaran para de una manera tener un resultado en menor tiempo y al mismo tiempo asegurar que el microorganismo detectado se encuentra viable. Finalmente, otra recomendacin como mtodo alternativo de confirmacin seria el Qualicon (Wilmington, DE) que ha desarrollado dos sistemas de identificacin de Listeria basados en el ADN, uno que es un sistema de caracterizacin microbiana de ribotipificacin automatizado, el cual identifica todos los cultivos puros de Listeria a nivel especie basado en el anlisis de ribotipo.
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Propuesta para la Deteccin de E. coli O157 y productoras de shiga toxinas En la deteccin de este gnero, de manera general, se ha propuesto a travs del tiempo la deteccin de E. coli. Posteriormente, E. coli O157:H7 se present como uno de los serotipos principales causando gastroenteritis transmitida por alimentos como frutas y hortalizas. Sin embargo, no nicamente este serotipo tiene la capacidad de causar dao ya que existen otros serotipos diferentes a ste que contienen en su genoma los genes que codifican para las shiga toxinas, las cuales son las responsables de la severidad en los cuadros gastroentricos. Es por tanto, que se propone la introduccin de este grupo de Escherichia. Por lo que la propuesta seria la complementacin de los mtodos de cultivo que involucran el uso de medios selectivos como el agar Rainbow acoplado a la deteccin de genes de shiga toxina a travs de la utilizacin de la tcnica de PCR. Estos genes no nicamente pueden involucrar los genes stx1 y stx2 si no tambin el gen de intimina que es otro factor de virulencia importante dentro de las STEC, de esta manera se ampliara el espectro de cepas de E. coli STEC a ser detectadas mediante esta tcnica. Propuesta para la Deteccin de Staphylococcus aureus NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en Alimentos Se considera necesario hacer algunas consideraciones para modificacin de la NOM en cuestin. 1. Es necesario considerar el empleo de los tres mtodos para la identificacin de Staphylococcus en alimentos descritas en las normas UNE-EN ISO 6888-1:1999, ISO 6888-2:1999, ISO 6888-3: 2003/AC, que incluye diluciones y siembra directa en el medio de cultivo BairdParker, siembra en el medio de agar de plasma de conejo y fibringeno y por el mtodo de NMP. 2. Se debe considerar adems la inclusin de las especies de Staphylococcus intermedius y Staphylococcus hyicus, ya que son tambin potencialmente patgenos al igual que Staphylococcus aureus. 3. En todas las normas y mtodos internacionales validados se descarta el anlisis de Staphylococcus en frutas y hortalizas ya que se considera que su presencia es ocasional y en bajas concentraciones. La presencia de dicha bacteria en frutas y hortalizas se debe a la contaminacin por contacto con las manos de trabajadores o por contaminacin cruzada con alimentos en los que la presencia de Staphylococcus es comn y en concentraciones mayores a 100 clulas por gramo de muestra. Sin embargo, las frutas y hortalizas frescas cortadas y mnimamente procesadas llevan un proceso de manipulacin, en el que se exponen ms a la posible contaminacin por Staphylococcus en las tres especies descritas. Por lo tanto, se debe considerar la inclusin de estos alimentos en las normas nacionales para la deteccin de las especies de Staphylococcus de inters. 4. Tambin se deben considerar los mtodos moleculares como alternativas para la identificacin o confirmacin, ya que se reducen los tiempos de anlisis y rpida liberacin de lotes del alimento cuando se determina la ausencia de la bacteria.
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PROPUESTA DE NORMAS
A continuacin se compara la normatividad nacional con lo descrito por el Manual Analtico Bacteriolgico publicado por la FDA. Se sugiere que debido a la similitud entre el objetivo, fundamento, procedimiento, reactivos y medios de cultivo, aparatos e instrumentos, preparacin de la muestra, expresin de resultados, e informe de la prueba se emitir la concordancia de la normatividad nacional con lo descrito en el Manual Analtico Bacteriolgico reconocido internacionalmente.
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Microorgan ismo
Apartado
BAM Chapter 5
NOM-114-SSA1-1994
Objetivo Salmonella Fundamento
Identificacin de Salmonella en alimentos.
Establecer un mtodo general para determinacin de Salmonella en alimentos.
la
Basada en 5 pasos bsicos: preenriquecimiento, Preparacin de la muestra, aislamiento de cepas con enriquecimiento selectivo, seleccin en medios medios selectivos, identificacin de cepas con slidos, identificacin bioqumica y pruebas bioqumicas y serolgicas. serotipificacin.
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Procedimiento
Aislamiento de la muestra: Mezclar suavemente la dilucin con muestra, inocular en medio selectivo RV, TT o SC por 24 h a 35 C, 42 C o 43 C dependiendo de la muestra. A partir del inculo anterior, sembrar en agar BS, XLD y HE e incubar 24 h 2 h a 35 C. Examinar morfologa tpica y atpica. Inocular colonias presuntivas en agar selectivo TSI y LIA e incubar a 24 h 2 h a 35 C. A los cultivos que viren alcalino el medio ensayar las pruebas bioqumicas. 2. Identificacin de Salmonella: Para mezcla de cultivos (inocular en agar MacConkey, agar HE, o agar XLD, incubar las cajas durante 24 h 2 h a 35C. Cultivos puros (prueba de ureasa convencional o rpida). Prueba serolgica olivalente flagelar. Prueba serolgica Spicer-Edwards. Prueba para muestras ureasa negativa (caldo lisina decarboxilasa, caldo fenol rojo dulcitol o caldo base prpura con 0.5 % dulcitol. Caldo triptona (caldo cianida de potasio, caldo malonato, prueba de indol, prueba serolgica flagelar (H) para Salmonella). Prueba serolgica somtica (O) para Salmonella (prueba somtica polivalente O, prueba de grupo somtica O). Pruebas bioqumicas adicionales caldo lactosa rojo fenol lactosa o caldo prpura lactosa. Caldo rojo fenol sacarosa o caldo prpura sacarosa, caldo MRVP. Agar citrato de Simons. Clasificacin de cultivos. Identificacin genrica presuntiva de Salmonella (kits de pruebas bioqumicas miniaturizadas). Tratamiento de cultivos negativos a la prueba flagelar (H). Envo de cultivos para serotipificacin a las oficinas de la FDA.
1. Preparacin de la muestra (incluye la incubacin. 2. Aislamiento de Salmonella: Transferir 1 ml del cultivo de preenriquecimiento a un tubo con 10 ml de caldo de tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina (Se puede usar el medio VR para sustituir el caldo de tetrationato). Incubar 18 h -24 h a 35C o para alimentos altamente contaminados 42 C. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en XLD, VB y en un medio selectivo adicional ( Hektoen, agar sulfito de bismuto o agar SS). Efectuar lo mismo para el caldo tetrationato. Incubar las placas por 24 h + 2 h a 35C. Examinar las placas investigando la presencia de Salmonella de acuerdo a caractersticas especficas. 3. Identificacin bioqumica: Seleccionar al menos 2 colonias de cada medio selectivo, inocular tubos, uno con TSI y otro con LIA por estra en superficie inclinada y puncin en el fondo, incubar por 24 h + 2 h a 35C. Considerar positivas las que dan reacciones especficas . Realizar la prueba de ureasa. 4. Identificacin serolgica por medio del ensayo de los antgenos somticos de Salmonella (Antisuero polivalente O) y cuando la aglutinacin es positiva en el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos. Practicar si se requiere el ensayo de antgenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H). 5. Pruebas bioqumicas complementarias:Agar citrato Simmons, medio SIM, caldo RM-VP, prueba de Voges-Proskauer, prueba de rojo de metilo, caldo malonato, caldo manitol.
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Reactivos y medios de cultivo
Caldo lactosa (M74), leche en polvo descremada (reconstituida) (M111), caldo selenito cistina (SC) (M134), caldo tetrationato (TT) (M145), medio Rappaport-Vassiliadis (RV) (M132). NOTA: Medio RV debe ser preparado de ingredientes individuales. Formulaciones comerciales no son aceptables., agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) (M179), agar Hektoen entrico (HE) (M61), agar sulfato de bismuto (BS) (M19), agar triple azcar hierro (TSI) (M149), caldo triptona (triptofano) (M164), caldo tripticasa de soya (M154), caldo tripticasa de soya con sulfato de hierro (M186), caldo tripticasa triptosa de soya (M160), caldo MR-VP (M104), agar citrato de Simmons (M138), caldo urea (M171), caldo urea (rpido) (M172), caldo malonato (M92), agar lisina hierro (LIA) (M89), caldo lisina decarboxilasa (M87), prueba en medio de movilidad (semislido) (M103), caldo cianidina de potasio (KCN) (M126), caldo fenol rojo carbohidrato (M121), caldo prpura carbohidrato (M130), agar MacConkey (M91), caldo nutriente (M114), caldo infusin cerebro corazn (BHI) (M24), solucin de papaina 5 % (M56a), solucin de celulasa 1 % (M187), agar base triptosa sangre (M166), caldo universal de preenriquecimiento (M188), caldo universal de preenriquecimiento (sin citrato amnico de hierro) (M188a), agua peptonada amortiguada (M192), caldo Dey-Engley (M193), sulfito de potasio anhdrido, solucin de cloro, 200 ppm, conteniendo 0.1 % dodecil sulfato de sodio (R12a), etanol, 70 % (R23), reactivo de Kovacs (R38), reactivo de prueba VogesProskauer (VP) (R89), cristales de fosfato de creatina, solucin de hidrxido de potasio, 40 % (R65), solucin hidrxido de sodio (R73), cido clorhdrico 1 N (R36), solucin de tincin verde brillante, 1 % (R8), solucin de tincin prpura de bromocresol, 0.2 % (R9),
Medios de pre-enriquecimiento: Agua de peptona tamponada y caldo lactosado. Caldos de enriquecimiento: Caldo selenito-cistina, caldo tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, caldo de soya tripticasa, leche descremada reconstituida, caldo soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio. Medios de aislamiento: Agar verde brillante (VB), agar con sulfito de bismuto, agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar para Salmonella y Shigella (SS), agar entrico Hektoen. Medios para pruebas bioqumicas: Agar de tres azcares y hierro (TSI), agar de hierro y lisina (LIA), agar nutritivo, medio de SIM (para sulfuro, indol y movilidad), agar citrato de Simmons, caldo MR-VP, caldo manitol, caldo malonato, caldo urea, caldo de urea rpido, caldo infusin cerebro corazn. Soluciones: verde brillante al 0.1 %, yodo-yoduro, salina al 0.85 %, salina formalizada, reactivo de Kovac, alfa-naftol al 5 %, rojo de metilo, hidrxido de potasio al 40 %, gelatinasa al 5 %. Antisueros: Antisuero polivalente somtico (O), antisuero polivalente flagelar (H), antisuero Vi.
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indicador rojo de metilo (R44), agua destilada estril, tergitol aninico 7 (R78), triton X-100 (R86), solucin salina fisiolgica, 0.85 % (R63), solucin salina fisiolgica formalinizada (R27), antisuero Salmonella (O) somtico polivalente, antisuero Salmonella (H) flagelar polivalente, antisuero Salmonella grupo somtico (O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G, H, I, Vi, y otros grupos apropiados, antisuero Salmonella Spicer-Edwards flagelar (H). Horno (180 C), incubadora con termostato, autoclave con termmetro, bao mara con termostato, bao mara con termostato y termmetro, balanza granataria, licuadora, mechero Bunsen o Fisher, potencimetro, matraces Erlenmeyer (500 ml), cucharas, bistures, cuchillos y pinzas, tubos de ensaye, tubos para serologa, pipetas, asa de platino o nicromel, papel pH, ngulos de vidrio, recipientes de boca ancha. Pesar aspticamente 25 g (relacin 1:9 muestracaldo) de la muestra en un vaso estril de licuadora o en bolsa estril para trabajar en homogeneizador peristltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estril (generalmente caldo lactosado) y licuar si es necesario durante un min. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6.8 0.2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N estriles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. Incubar 24 h 2 h a 35 C. Se especifica el procedimiento para los siguientes productos: huevo en polvo,
Aparatos e instrumentos
Hornos, autoclaves, incubadoras, licuadora, microscopio, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas vidrio, pH metro.
Preparacin de la muestra
Los siguientes mtodos se basan en el anlisis de una unidad analtica de 25 g en relacin 1:9 muestra: caldo. Dependiendo de la composicin, aadir caldo suficiente para mantener esta relacin 1:9 a menos que se indique lo contrario. Para las muestras analizadas en una base de peso no exacto, por ejemplo, ancas de rana, seguir las instrucciones particulares. stas existen para los siguientes productos: Yema de huevo, clara de huevo secos, huevos enteros secos, leche lquida (leche descremada, 2 % de grasa de leche, leche entera y suero de leche), mezclas preparadas en polvo (pasteles, galletas, donas, galletas y pan), leche maternizada y alimentacin por va oral o un tubo que contiene huevo. Huevos en diferentes presentaciones. Leche en polvo. Leche entera en polvo. Casena. Harina de soya. Productos que
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Expresin de resultados Informe de la prueba Concordancia con normas internacionales
contienen huevo (fideos, rollos de huevo, macarrones, espaguetis), queso, pasta, ensaladas preparadas (jamn, huevo, pollo, atn, pavo), frutas y verduras frescas, congeladas o secas, carnes de frutos secos, crustceos (camarones, cangrejo, cigalas, langostinos, langosta), y pescado. Levadura seca (levadura activa e inactiva). Coberturas para helado. Especias. Revestimiento de dulces y golosinas (incluido el chocolate). Coco. Colorantes de los alimentos y sustancias alimenticias para colorear. Gelatina. Carnes, sustitutos de carne, subproductos de la carne, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne, hueso). Las ancas de rana. Esqueleto o carcasas de conejo. Goma guar. Jugo de naranja (pasteurizado y no pasteurizado), sidra de manzana (pasteurizada y no pasteurizada), jugo de manzana (pasteurizada). Orejas de cerdo y otros tipos de alimento para perro. Melones. Mangos. Tomates. Ensayos ambientales. Semillas de alfalfa y frijol. Pulpa de mamey. Vegetales de hojas verdes y hierbas (espinaca, lechuga romana, cilantro, perejil rizado, perejil italiano, culantro, repollo y albahaca). Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de producto. No especifca.
claras de huevo en polvo, yema de huevo en polvo, huevos lquidos pasteurizados y congelados, frmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo (harinas para hotcakes, galletas, donas, bisquets y pan). Productos no pasteurizados congelados de huevo. Leche en polvo entera, semidescremada o descremada. Queso. Casena. Coco. Levadura seca. Carnes, sustitutos de carnes, derivados crnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso). Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate). Especias. Gelatina.
No especifca.
Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml dela muestra. Informar presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de la muestra. Esta norma no tiene concordancia con normas internacionales. Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia con el captulo 5 del BAM.
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Apartado
BAM Captulo 4 bacterias Coliformes y Escherichia coli
NOM-112-SSA1-1994 Determinacin bacterias Coliformes tcnica nmero ms probable
NOM-113-SSA1-1994 Mtodo para la cuenta de microorganismos Coliformes totales en placa
Objetivo
Establecer el mtodo microbiolgico para estimar el Enumeracin de nmero de coliformes presentes en productos Escherichia coli y alimenticios, por medio del clculo del nmero ms bacterias Coliformes. probable (NMP) despus de la incubacin a 35 C de la muestra diluida en un medio lquido.
Establecer el mtodo microbiolgico para determinar el nmero de microorganismos coliformes totales presentes en productos alimenticios por medio de la tcnica de cuenta en placa.
Fundamento
Basado en el uso de un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se Fermentacin de Se basa en que las bacterias coliformes, fermentan desarrollan bacterias a 35 C en lactosa y clculo de la lactosa incubadas a 35 c 1 C durante 24 h a aproximadamente 24 h, dando como nmero ms probable 48 h, resultando una produccin de cidos y gas el resultado la produccin de gas y cidos NMP. cual se manifiesta en las campanas de fermentacin. orgnicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares.
91
Procedimien to
General: Dilucin, NMP (inoculacin e incubacin, aislamiento en placa, seleccin de colonias y confirmacin), conteo en placa (inoculacin e incubacin, conteo y seleccin de colonias), confirmacin (subcultivo, confirmacin bioqumica). confirmacin en medio slido y filtracin por membrana.
1. Prueba presuntiva: Inoculacin (tomar tres tubos de concentracin sencilla del medio selectivo de enriquecimiento, usar una pipeta estril para transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra si es lquida o 1 ml de la dilucin primaria en el caso de otros productos. Para las diluciones subsecuentes, continuar usando una pipeta diferente para cada dilucin. Mezclar suavemente el inculo con el medio). Incubacin (incubar los tubos a 35 C + 0.5 C por 24 h + 2 h y observar si hay formacin de gas, en caso contrario prolongar la incubacin hasta 48 h +2 h. 2. Prueba confirmativa: De cada tubo que muestre formacin de gas, tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin. Incubar a 35 C + 0.5 C por 24 h + 2 h o si la formacin de gas no se observa en este tiempo, prologar la incubacin por 48 h +2 h.
1. Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml de la muestra lquida directa o de la dilucin primaria, utilizando para tal propsito una pipeta estril. 2. Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera, sembrar, utilizando una pipeta estril diferente para cada dilucin. 3. Vertir de 15 ml a 20 ml del medio RVBA fundido y manteniendo a 45 C + 1 C en bao de agua. 4. Mezclar el inculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en sentido de las manecillas del reloj, seis al contrario de las manecillas del reloj, seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada y dejar que solidifique. 5. Preparar una cajas control con 15 ml de medio para verificar la esterilidad. 6. Una vez solidificado el medio verter 4 ml del medio RVBA a 45 C + 1 C en la superficie del medio inoculado, dejar que solidifique. 7. Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35C durante 24 h +2 h. 8. Contar las colonias con el contador de colonias. 9. Seleccionar las placas que contengan entre 15 colonias y 150 colonias. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, rodeadas por un halo de precipitacin debido a las sales biliares, color rojo claro o rosa. Soluciones diluyentes: solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada), agua peptonada. Medios de cultivo: agar-rojovioleta-bilis-lactosa (RVBA).
Caldo verde brillante bilis lactosa (BGLB) (M25), caldo lauril triptosa (LST)(M76), caldo EC (M49), azul Levin de metileno-
Soluciones diluyentes: solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada), agua peptonada. Medios de cultivo: caldo lactosado, caldo lauril sulfato triptosa, caldo lactosa bilis verde brillante.
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eosina (L-EMB), agar (M80), caldo triptona (triptofano) (M164), caldo MR-VP (M104), caldo citrato de Koser (M72), agar para cuenta en placa mtodo estndar (PCA) (M124), agua Butterfield de tampon de fosfatos (R11) o diluyente equivalente (excepto para crustceos), reactivo de Kovacs (R38), reactivo VogesProskauer (VP) (R89), reactivos para tincin de Gram (R32), indicador rojo de metilo (R44), agar bilis rojo violeta (VRBA) (M174), agar VRBA-MUG (M175), medio EC-MUG (M50), caldo lauril triptosa MUG (LSTMUG) (M77), diluyente de peptona, 0.1 % (R56).
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Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, Aparatos e varillas vidrio, asas, instrumentos pHmetro, contador de colonias, licuadora, frascos de dilucin, lmpara UV.
Materiales: pipetas microbiolgicas, frascos de vidrio con tapn de rosca (250 ml), utensilios esterilizables (cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas, tubos de cultivo, campanas de fermentacin (tubos de Durham), pipetas bacteriolgicas, gradillas, asa de platino. Aparatos: horno para esterilizar, incubador con termostato, termmetro, autoclave, potencimetro.
Materiales: pipetas bacteriolgicas, frascos de vidrio, tubos, utensilios esterilizables para la obtencin de muestras (cuchillos,pinzas, tijeras, cucharas, esptulas, etc), cajas Petri. Aparatos e instrumentos: horno para esterilizar, autoclave con termmetro y manmetro, bao de agua con control de temperatura, licuadora, un vaso para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estriles para homogeneizador peristltico, incubadora con termostato, contador de colonias de campo oscuro, registrador mecnico o electrnico, microcopio ptico, potencimetro. La preparacin de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110SSA1-1994 "Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico".
Preparacin de la Diluciones decimales. muestra
Las muestras deben prepararse y diluirse de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico.
Tabla del Nmero Ms Probable (NMP), Expresin de nmero de Expresar en NMP/g o ml para alimentos resultados Enterobacteriaceae x gramo o por mililitro.
Coliformes/g o coliformes /ml
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Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35 C durante 24 h 2 h. En caso de emplear diluciones y no observar Informar "Nmero ms probable (NMP) de crecimiento, informar utilizando como referencia la dilucin ms baja utilizada, por Coliformes por gramo o mililitro de muestra" ejemplo dilucin 10-1. En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de Coliformes por ml". Concordanci a con normas No especifca. internacional es Esta norma no tiene concordancia con normas internacionales. Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia con el captulo 4 del BAM. Esta norma no tiene concordancia con normas internacionales. Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia con el captulo 4 del BAM.
Informe de No especifca. la prueba
Microorganis mo
Apartado
BAM Chapter 12
NOM-115-SSA1-1994
Objetivo
Estimar el contenido de Staphylococcus aureus en alimentos.
Establecer el mtodo microbiolgico para determinar la cuenta de Staphylococcus aureus presente en alimentos nacionales o de importacin.
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Fundamento
Deteccin de Satphylococcus spp. por el mtodo del nmero ms probable (NMP) en muestras con un nmero bajo esperado de Staphylococcus y contenido de especies competitivas. Identificacin y confirmacin por medio de pruebas bioqumicas.
Estimacin del contenido de Staphylococcus aureus en alimentos, se efecta directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmacin mediante las pruebas de coagulasa y termonucleasa.
Procedimiento
Determinacin del NMP. Dilucin, inoculacin en medio selectivo lquido, medio selectivo slido, aislar en medio selectivo slido, transferir a medio selectivo lquido para recuento, identificacin y confirmacin de S. aureus por prueba de coagulasa, prueba de catalasa, utilizacin anaerbica de glucosa, utilizacin anaerbica de manitol, sensibilidad a lisostafina, produccin de nucleasa termoestable, identificacin de alguna caracterstica tpica de 2 cepas de S. aureus, S. epidermidis, y micrococci. Reportar de acuerdo a tablas de NMP. Reactivos y Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya medios de cultivo (TSA) (M152), caldo infusin cerebro corazn (M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA toluidina azul-ADN (M148), agar lisostafina triptona extracto de levadura (M165), aceite de parafina, tampn salino de fosfato 0.02 M (R61) conteniendo 1 % NaCl, prueba de catalasa (R12), caldo tripticasa de soya (TSB) conteniendo 10 % NaCl y 1 % piruvato de sodio (M154a).
1. Incubacin de 0.1 ml de cada dilucin sobre la superficie del agar Baird-Parker a 35 C de 45 h a 48 h. 2. Seleccionar las placas que tienen entre 15 colonias y 150 colonias tpicas de S. aureus. 3. Sembrar las colonias en tubos con 0.5 ml de caldo de infusin cerebro-corazn. Incubar a 35 C durante 24 h. 4. Prueba de coagulasa. 5. Prueba de termonucleasa.
Soluciones diluyentes : solucin reguladora de fosfatos, agua peptonada. Medios de cultivo: Medio de Baird-Parker, caldo de infusin de cerebro-corazn (BHI), cido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera. Reactivo biolgico: plasma de conejo.
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Aparatos instrumentos
e Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Materiales: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, Petri, pipetas, varillas vidrio. esptulas, separador de huevo, tubos de cultivo, cajas Petri, pipetas bacteriolgicas 1ml y 10 ml, pipetas Pasteur, probetas, varillas de vidrio de 3.5 mm de dimetro aprox. y 20 cm de largo, matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio, cmara hmeda. Aparatos: horno para esterilizar, autoclave con termmetro, bao de agua con regulador de temperatura, balanza 2500 g, incubadora 35 C + 1 C. Conforme a lo establecido en la NOM-110SSA1-1994 "Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico". En UFC/g o UFC/g valor estimado. Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar como: 0 UFC/g en muestras directas, 10 UFC/g en muestras de dilucin 1:10 y 100 UFC/g en muestras de dilucin 1:100. No especifca. Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia con el captulo 12 del BAM en las pruebas bioqumicas de identificacin del microorganismo.
Preparacin de la Dependiente de la muestra. muestra
Expresin resultados Informe de prueba
de NMP x gramo o por mL la No especifca
Concordancia con normas internacionales
AOAC 987.09.
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Microorg anismo
Apartado BAM Chapter 9
Norma NOM-242-SSA1-2009 Establecer los requisitos sanitarios para las instalaciones de toda la cadena productiva de productos marinos y las especificaciones sanitarias de dichos productos y mtodos de prueba. Enriquecimiento, crecimiento en medio selectivo, aislamiento, diferenciacin, identificacin y confirmacin mediante pruebas bioqumicas y serolgicas.
Objetivo
Determinacin de V. cholerae en alimentos
Fundamento
Vibrio cholerae
Procedimiento
Basado en las siguientes tcnicas: crecimiento en medio selectivo salino, pruebas bioqumicas, kit de diagnstico rpido API 20E, identificacin por medio de sondas de ADN, identificacin por medio de PCR. Enriquecimiento y siembra, deteccin y confirmacin, pruebas bioqumicas, diferenciacin de biotipos el Tor y clsico, determinacin de enterotoxigenicidad, deteccin genotpica del gen de la toxina del clera mediante la reaccin en cadena de la polimerasa.
Preparacin de la muestra, incubacin, resiembra y aislamiento, diferenciacin e identificacin, confirmacin.
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Agua peptonada alcalina (APW) (M10), Medio AKI (M7), placas de arginina glucosa (AGS) (M16), agar sangre (M20), caldo de extracto de levadura casaminocidos (CAYE) (M34), agar modificado celobiosa polimixina colistina (mCPC) (M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189), medio de prueba de movilidad-1 % NaCl (M103), reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametilp-fenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente peptona-Tween-sal (PTS) (90), tampn salino de fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50 U Difco o equivalente) (R64), solucin salina 0.85 % en dH2O (R63), solucin NaCl al 2 % (R71), desoxicolato de sodio - 0.5% en dH2O (R91), agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS) (M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o 3 % NaCl respectivamente) (M163), Caldo T1N0, T1N3, T1N6, T1N8, T1N10 (M161), agar tripti soya sulfato de magnesio 3 % NaCl (TSAMS) (32), caldo y agar tripticasa de soya (TSB) (TSA) (M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24 % glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), anti suero V. cholerae polivalente O1 y O139, kit de deteccin de enterotoxina VET-RPLA TD920A (Oxoid, Inc.), agar sacarosa Vibrio parahaemolyticus (VPSA) (M191), agar Vibrio vulnificus (VVA) (M190), reactivos y tiras reactivas de diagnstico API 20E (BioMerieux).
Agua peptonada alcalina, agar tiosulfato citrato sales biliares y sacarosa (TCBS), agar modificado con celobiosa polimixina B y colistina (mCPC), solucin stock de colorantes 1000 X, agar T1N1 (Agar triptona y sal), agar gelatina, agar gelatina con sal (GS), caldo glucosa de Hugh-Leifson, medio base de descarboxilasa (Arginina, lisina y ornitina), caldo triptona y caldos triptona sal T1N0, T1N1, T1N3, T1N6, T1N8, T1N10, agar soya tripticasa (TSA), agar de hierro Kligler (KIA), agar arginina glucosa inclinado (AGS), agar triple azcar y hierro (TSI), agar de hierro y lisina (LIA), caldo rojo de metilo y Vogues Proskauer (RM-VP), medio para prueba de movilidad (Semislida), prueba de rojo de metilo, prueba de Vogues-Proskauer, prueba de oxidasa, reactivo de Kovac.
99
Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas vidrio, asa, microscopio, pHmetro, microondas, incubadoras con agitacin, filtros, membranas de naylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones extraccin de protenas y cidos nucleicos, agentes bloqueadores, reactivos para inmunoensayos.
La muestra debe ser enfriada inmediatamente despus de ser colectada (alrededor de 7 C a 10 C), las muestras deben ser analizadas tan pronto como sea posible. Se debe evitar el contacto directo con el hielo para maximizar la supervivencia y la recuperacin de los vibrios. Los vibrios pueden ser daados por el enfriamiento rpido, pero crecen rpidamente en productos del mar a temperatura ambiente. De ser necesario, se recomienda congelar las muestras a una temperatura de -80 C.
Licuadora, frascos de vidrio boca ancha tipo tarro 500 ml, varilla vidrio 3 mm y 20 cm largo, balanza granatria 2000g, balanza analtica 120 g, incubadoras 39-40C, bao de agua 42+ 0.2C y 35-37C, cucharas estriles, cajas Petri estriles 15x100 mm de plstico, pipetas estriles 1, 5 y 10 ml (0.1 ml) 5 , asas bacteriolgicas 3 mm dimetro, tubos ensayo 16x150 mm y 20x150 mm, tubos ensaye 10x75 mm o 13x100 mm, tijeras y pinzas estriles, lmpara, mecheros, papel pH, potencimetro, bolsas polietileno 28x37, aparato de filtracin membranas 0.45 micras. Pescado ahumado: Incubacin de las muestras a 35 C -37 C: De cada submuestra tomar 25 g, cortar piezas pequeas y colocarlo en vaso de licuadora de 500 ml de capacidad y que contenga 225 ml de agua peptonada alcalina, homogenizar 2 min a velocidad mxima, hacer 2 diluciones e incubarlas a 35 C -37 C. Incubacin 35 C 37C y 42C: homogenizar 50 g en 450 ml de agua peptonada alcalina, verter 250 ml a un recipiente estril. Preparar dos series de diluciones 1:100 y 1:1000. Incubar una serie a 35 C -37C y otra a 42 C. Moluscos bivalvos: Desconchar 10 piezas-12 piezas, incluir el lquido. Verter 50 g en 450 ml de agua peptonada alcalina, licuar para homogenizar durante 2 min a alta velocidad (Dilucin 1:10). Colocar 250 g de esta dilucin en un segundo recipiente estril, preparar diluciones 1:100 y 1:1000. Incubar una serie a 35 C -37C y la otra a 42C.
100
Expresin de resultados Resultado positivo o negativo.
No especifca
Informe de la prueba
El informe final para V. cholerae debe incluir la identificacin bioqumica y serolgica de la cepa y No especifca los resultados de enterotoxicidad. No especifca. Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia con el captulo 9 del BAM.
No especifca
Microorg Apartado anismo
BAM Captulo 28
NOM-242-SSA1-2009
Objetivo
Detectar Vibrio cholerae enterotoxignico por PCR Basado en la reaccin en cadena de la polimerasa. Enriquecimiento en agua peptonada alcalina, procedimiento PCR. Agua peptonada alcalina (APW), primers de la toxina de clera, Taq ADN polimerasa, 2'Desoxinuclesido-5'-trifosfatos, 10X buffer PCR, aceite mineral ligero, agua deionizada estril, 10X TBE, agarosa, solucin de bromuro de etidio, 6X buffer de carga de muestras, marcadores de ADN de peso molecular. No se incluye la deteccin de V. cholerae por medio de PCR.
Vibrio cholerae enterotoxignico
Fundamento
Procedimiento
101
Termociclador programable automtico, aparato de electroforesis en gel horizontal, fuente de poder de voltage para electroforesis, parrilla de calientamiento, tubos de microcentrifuas, micropipetas digitales, pipetas, microcentrfuga, transluminador UV, cmara polaroide, film polaroide. Pesar 25 g de la muestra en un recipiente tarado (de capacidad aproximada de 500 ml). Los productos tales como marinos o verduras puede ser licuado o cortado en pequeas porciones utilizando tijeras estriles. La muestra debe ser enfriada inmediatamente despus de ser colectada (alrededor de 7 C a 10 C), las muestras deben ser analizadas tan pronto como sea posible. Se debe evitar el contacto directo con el hielo para maximizar la supervivencia y la recuperacin de los vibrios. Los vibrios pueden ser daados por el enfriamiento rpido, pero crecen rpidamente en productos del mar a temperatura ambiente. De ser necesario, se recomienda congelar las muestras a una temperatura de -80 C.
Expresin de resultados Positivo o negativo.
Informe de la prueba
No especifca.
No especifca.
102
BAM Captulo 9
NOM-242-SSA1-2009
Objetivo Crecimiento en medio selectivo salino, pruebas bioqumicas, kit de diagnstico rpido API 20E, identificacin por medio de sondas de ADN, identificacin por medio de PCR. 1. Enriquecimiento, aislamiento y enumeracin, 2. Deteccin y confirmacin (identificacin bioqumica de los aislados, procedimiento de cuenta por filtracin en membrana hidrofbica (HGMF), tipificacin serolgica), 3. Determinacin de patogenicidad (deteccin genotpica de los genes de hemolisina de V. parahaemolyticus).
Fundamento Vibrio parahaemolyticus
No se incluye en esta norma
Procedimiento
103
Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio AKI (M7), placas de arginina glucosa (AGS) (M16), agar sangre (M20), caldo de extracto de levadura casaminocidos (CAYE) (M34), agar modificado celobiosa polimixina colistina (mCPC) (M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189), medio de prueba de movilidad-1 % NaCl (M103), reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-pfenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente peptona-Tween-sal (PTS) (90), tampn salino de fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50 U Difco o equivalente) (R64), solucin salina 0.85 % en dH2O (R63), solucin NaCl al 2 % (R71), desoxicolato de sodo - 0.5 % en dH2O (R91), agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS) (M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o 3 % NaCl respectivamente) (M163), caldo T1N0, T1N3, T1N6, T1N8, T1N10 (M161), agar tripti soya sulfato de magnesio 3 % NaCl (TSAMS) (32), caldo y agar tripticasa de soya (TSB) (TSA) (M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24 % glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), Anti suero V. cholerae polivalente O1 y O139, kit de deteccin de enterotoxina VET-RPLA TD920A (Oxoid, Inc.), agar sacarosa Vibrio parahaemolyticus (VPSA) (M191), agar Vibrio vulnificus (VVA) (M190), reactivos y tiras reactivas de diagnstico API 20E (BioMerieux). Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas vidrio, asa, microscopio, pHmetro, microondas, incubadoras con agitacin, filtros, membranas de naylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones extraccin de protenas y cidos nucleicos, agentes bloqueadores,
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reactivos para inmunoensayos.. La muestra debe ser enfriada inmediatamente despus de ser colectada (alrededor de 7 C a 10 C), las muestras deben ser analizadas tan pronto como sea posible. Se debe evitar el contacto directo con el hielo para maximizar la supervivencia y la recuperacin de los vibrios. Los vibrios pueden ser daados por el enfriamiento rpido, pero crecen rpidamente en productos del mar a temperatura ambiente. De ser necesario, se recomienda congelar las muestras a una temperatura de -80 C.
Expresin de resultados Resultado positivo o negativo.
Informe de la prueba Concordancia con normas internacionales
No especifca.
No especifca.
Microor ganismo
Apartado
BAM Captulo 9
NOM-242-SSA1-2009
Vibrio vulnificus
Objetivo
Productos para consumo humano de origen marino. Crecimiento en medio selectivo salino, pruebas bioqumicas, kit de diagnstico rpido API 20E, identificacin por medio de sondas de ADN, identificacin por medio de PCR. No se incluye en esta norma
Fundamento
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Procedimiento
Mtodo de identificacin y recuento: 1. Enriquecimiento, aislamiento y cuenta, 2. Identificacin bioqumica de los aislados, 3. Identificacin del gen especfico de especies especficas del gen citolisina vvhA por medio de sonda de ADN, 4. Recuento de V. vulnificus por sondas de ADN, 5. Confirmacin de V. vulnificus por reaccin en cadena de polimerasa. Agua peptonada alcalina (APW) (M10), medio AKI (M7), placas de arginina glucosa (AGS) (M16), agar sangre (M20), caldo de extracto de levadura casaminocidos (CAYE) (M34), agar modificado celobiosa polimixina colistina (mCPC) (M98), agar celobiosa colistina (CC) (M189), medio de prueba de movilidad-1 % NaCl (M103), reactivo de oxidasa (N,N,N,N'-tetrametil-pfenilenediamina-HCl en dH2O) (R54), diluyente peptona-Tween-sal (PTS) (90), tampn salino de fosfatos (PBS) (R59), discos de polimixina B (50 U Difco o equivalente) (R64), solucin salina 0.85 % en dH2O (R63), solucin NaCl al 2 % (R71), desoxicolato de sodo - 0.5 % en dH2O (R91), agar tiosulfato citrato sales biliares sacarosa (TCBS) (M147), agar T1N1 y T1N3 (1 % triptona y 1 % o 3 % NaCl respectivamente) (M163), caldo T1N0, T1N3, T1N6, T1N8, T1N10 (M161), agar tripti soya sulfato de magnesio 3 % NaCl (TSAMS) (32), caldo y agar tripticasa de soya (TSB) (TSA) (M152) (con NaCl, 2 %), TSB-1 % NaCl-24 % glicerol, caldo urea (M171) o agar urea Christensen (M40) con NaCl (2 %) (R71), anti suero V. cholerae polivalente O1 y O139, kit de deteccin de enterotoxina VET-RPLA TD920A (Oxoid, Inc.), agar sacarosa Vibrio parahaemolyticus (VPSA) (M191), agar Vibrio
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vulnificus (VVA) (M190), reactivos y tiras reactivas de diagnstico API 20E (BioMerieux). Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas vidrio, asa, microscopio, pHmetro, microondas, incubadoras con agitacin, filtros, membranas de naylon, pantallas de malla de fibra de vidrio, palillos, soluciones para extraccin de protenas y cidos nucleicos, agentes bloqueadores, reactivos para inmunoensayos. La muestra debe ser enfriada inmediatamente despus de ser colectada (7 a 10) C, las muestras deben ser analizadas tan pronto como sea posible. Se debe evitar el contacto directo con el hielo para maximizar la supervivencia y la recuperacin de los vibrios. Los vibrios pueden ser daados por el enfriamiento rpido, pero crecen rpidamente en productos del mar a temperatura ambiente. De ser necesario, se recomienda congelar las muestras a una temperatura de -80 C.
Expresin de resultados Resultado positivo o negativo. Informe de la prueba Concordancia con normas internacionales No especifca.
No especifca.
MicroorApartado ganismo
BAM Captulo 12
NOM-242-SSA1-2009
107
Objetivo
Estimar el contenido de Staphylococcus aureus en alimentos. Deteccin de Satphylococcus spp. por el Mtodo del nmero ms probable (NMP) en muestras con un nmero bajo esperado de Staphylococcus y contenido de especies competitivas. Identificacin y confirmacin por medio de pruebas bioqumicas. Determinacin del NMP. Dilucin, inoculacin en medio selectivo lquido, medio selectivo slido, aislar en medio selectivo slido, transferir a medio selectivo lquido para recuento, identificacin y confirmacin de S. aureus por prueba de coagulasa, prueba de catalasa, utilizacin anaerbica de glucosa, utilizacin anaerbica de manitol, sensibilidad a lisostafina, produccin de nucleasa termoestable, identificacin de alguna caracterstica tpica de 2 cepas de S. aureus, S. epidermidis, y micrococci. Reportar de acuerdo a tablas de NMP. Medio Baird-Parker (M17), agar tripticasa soya (TSA) (M152), caldo infusin cerebro corazn (M24), agar plasma (conejo) coagulasa con EDTA toluidina azul-ADN (M148), agar lisostafina triptona extracto de levadura (M165), aceite de parafina, tampn salino de fosfato 0.02 M (R61) conteniendo 1 % NaCl, prueba de catalasa (R12), caldo tripticasa de soya (TSB) conteniendo 10 % NaCl y 1 % piruvato de sodio (M154a).
Establecer los requisitos sanitarios para las instalaciones de toda la cadena productiva de productos marinos y establecer las especificaciones sanitarias de dichos productos y mtodos de prueba. Crecimiento en medio de cultivo selectivo y diferencial y confirmacin con pruebas de coagulasa y termonucleasa.
Fundamento
Procedimiento
Incubacin en agar Baird-Parker, seleccin de colonias y siembra en caldo de infusin cerebro corazn, incubacin, prueba de coagulasa y termonucleasa.
Soluciones diluyentes : solucin reguladora de fosfatos, agua peptonada. Medios de cultivo: Medio de Baird-Parker, medio base de BairdParker, caldo de infusin de cerebro-corazn (BHI), cido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera.
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Materiales: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, esptulas, separador de huevo, tubos de cultivo, cajas Petri, pipetas bacteriolgicas 1ml y 10 ml, pipetas Pasteur, probetas, varillas de vidrio de 3.5 Aparatos e Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, mm de dimetro aprox. y 20 cm de largo, matraz instrumentos pipetas, varillas vidrio. Erlenmeyer con perlas de vidrio, cmara hmeda. Aparatos: horno para esterilizar, autoclave con termmetro, bao de agua con regulador de temperatura, balanza 2500 g, incubadora 35 C + 1 C. De acuerdo a lo establecido en el mtodo de Preparacin de la Dependiente de la muestra. preparacin y dilucin de muestras de alimentos muestra para su anlisis microbiolgico. En UFC/g. Si las pruebas confirmativas resultan negativas en todas las colonias probadas, informar Expresin de resultados NMP x gramo o por mL como: 0 UFC/g en muestras directas, 10 UFC/g en muestras de dilucin 1:10 y 100 UFC/g en muestras de dilucin 1:100. Informe de la prueba No especifica No especifca No especifca Puede sugerirse: Esta norma tiene concordancia con el captulo 12 del BAM en Concordancia con AOAC 987.09. las pruebas bioqumicas de identificacin del normas internacionales microorganismo. Tambin puede sugerirse que se refiera a la NOM-115-SSA1-1994. Microorg Apartado anismo Listeria monocytogen es BAM Captulo 10 NOM-242-SSA1-2009
Objetivo
Establecer los requisitos sanitarios para las instalaciones de toda la cadena productiva de Detectar y enumerar L. monocytogenes en productos marinos y establecer las alimentos especificaciones sanitarias de dichos productos y mtodos de prueba.
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Fundamento
Procedimiento
Procedimientos de muestreo y de enriquecimiento, procedimiento de aislamiento, procedimiento de identificacin (PCR tiempo real, kits), subtipificacin de aislados de L. monocytogenes, prueba de patogenicidad del ratn inmunodeficiente, interpretacin de los datos de las pruebas, recuento. 1. Procedimientos de muestreo y de enriquecimiento: Tratamiento de la muestra, preenriquecimiento y enriquecimiento, enriquecimiento con conteo, mtodos alternativos prescritos para el cribado de las muestras enriquecidas. 2. Procedimiento de aislamiento: medios selectivos. 3. Procedimiento de identificacin: Morfologa, tincin de Gram, prueba de catalasa, fermentacin de carbohidratos, medio selectivo, prueba de reduccin de nitrato, pruebas de movilidad, pruebas con kits, PCR en tiempo real, mtodos rpidos alternativos, prueba de CAMP. 4. Subtipificacin de aislados de L. monocytogenes (obligatorio): serolgica y genticamente. 5. Prueba de patogenicidad del ratn inmunodeficiente (opcional). 6. Interpretacin de los datos de las pruebas. 7. Recuento (requerido).
Basada en el aislamiento y la diferenciacin de especies de Listeria spp., principalmente por la fermentacin de carbohidratos y la actividad hemoltica de los miembros de este gnero.
Enriquecimiento, aislamiento, identificacin, prueba de movilidad en fresco, prueba de catalasa, tincin de Gram, prueba de hemlisis, prueba de reduccin de nitratos, prueba de movilidad en agar, prueba de utilizacin de carbohidratos, prueba de Cristie-AtkinsMunch-Peterson (CAMP) y serologa.
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cido actico 5 N, monohidroclorido de acriflavina, agar, N-(1-naftil) etilen diamina (R48), reactivo -Naftol (R48), agar base sangre No. 2, cicloheximida, natamicina, sangre de cordero defibrinado, etanol absoluto, tampn de anticuerpo fluorescente, glicina anhidra, kit de tincin de Gram, solucin de perxido de hidrogeno 3 % para prueba de catalasa (R12), solucin de KOH 40 % (R65), juego sera Listeria-typing, agar cloruro de litio feniletanol moxalactam (LPM) (M81) con esculina y hierro (M82), cido nalidxico (sal de sodio), medio de reduccin de nitrato (M108) y reactivo de deteccin de nitrato (R48), caldo nutritivo (M114), solucin salina fisiolgica 0.85 % (R63), caldo base fermentacin carbohidrato prpura (M130) conteniendo soluciones 0.5 % de dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol, y xilosa, medio SIM (M137) o medio de prueba de movilidad (M103), reactivo de cido sulfanilico (R48), agar tripticasa de soya con 0.6 % de extracto de levadura (TSAye) (M153), caldo tripticasa de soya con 0.6 % extracto de levadura (TSBye) (M157), medio Oxford (OXA) (M118), caldo de enriquecimiento amortiguado para Listeria (BLEB) (M52), agar PALCAM (M118a), carragenina, agar BCM (M17a), agar MOX (M103a), agar ALOA (M10a), agar Listeria cromognico (M40b), Rapid L'mono (M131a), CHROMagar Listeria (M40a), agar y caldo triptosa (M167).
Tincin de Gram (Alcohol-acetona, cristal violeta, solucin de yodo, solucin de safranina), reactivos para la determinacin de nitritos (Reactivo A, reactivo B, reactivo C, solucin de sulfato de cadmio al 20 %). Medios de cultivo: Caldo soya tripticasena con 0.6 % de extracto de levadura (CSTEL), caldo de enriquecimiento (EB) pH 7.3, medio de cloruro de litio feniletanol-moxolactam (LMP), medio Oxford, agar soya tripticasena con 0.6 % de extracto de levadura (ASTEL), agar sangre de carnero, caldo nitratos, medio para la prueba de movilidad (Medio de SIM, medio MTM), caldo prpura para fermentacin de carbohidratos.
Cajas Petri, asas bacteriolgicas, aceite de Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, inmersin, cubreobjetos, matraces Erlenmeyer pipetas, varillas vidrio, microscopio de contraste de 500 ml, lmpara de luz blanca, lpiz graso, lupa fases, licuadora o mezcladora peristltica. de bajo aumento, pipetas volumtricas, portaobjetos escabado, porta asas, tubos, sistemas
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de filtracin miscroscopio.
de
membranas,
incubadoras,
Refrigerar la muestra a 4C. Muestras compuesta. Una muestra de un lote de alimento debe constar de 10 sub-muestras, porciones de 50 g o ml de cada sub-muestra se utilizan para hacer dos muestras compuestas (250 g cada una) con Seguir lo mencionado en el mtodo preparacin y Preparacin de la mezcladoras peristlticas y medio de dilucin de muestras de alimentos para su anlisis muestra enriquecimiento sin agentes selectivos. Muestras microbiolgico. no compuestas. Si no se requieren muestras compuestas porciones analticas simples de 25 g se mezclan con 225 ml de medio basal de preenriquecimiento/enriquecimiento BLEB en una licuadora o mezcladora peristltica. De acuerdo a las caractersticas bioqumicas se puede determinar el gnero y especie de las cepas Expresin de resultados UFC por gramo o por mL. aisladas. La correspondencia de resultados con dichas caractersticas indica el gnero Listeria. Cuando los resultados son positivos informar presencia en 25 g o 25 ml de muestra. Si son Informe de la prueba No especifca. negativos informar ausencia en 25 g o 25 ml de muestra. AOAC 992.18. 2000, AOAC 992.19. 2000, AOAC No especifca 993.09. 2000, AOAC 993.12. 2000, AOAC Puede sugerirse: Esta norma tiene Concordancia con 994.03. 2000, AOAC 995.22. 2000, AOAC concordancia con el captulo 10 del BAM en normas internacionales 996.14. 2000, AOAC 997.03. 2000, AOAC las pruebas de medios selectivos y bioqumicas 999.06. 2000, AOAC 2003.12. 2005. de identificacin del microorganismo. Microorg Apartado anismo BAM Captulo 10 NOM-242-SSA1-2009
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Objetivo
Identificacin de Salmonella en alimentos.
Establecer los requisitos sanitarios para las instalaciones de toda la cadena productiva de productos marinos y establecer las especificaciones sanitarias de dichos productos y mtodos de prueba.
Fundamento
Basada en 5 pasos bsicos: preenriquecimiento, Preparacin de la muestra, aislamiento de cepas enriquecimiento selectivo, seleccin en medios con medios selectivos, identificacin de cepas con slidos, identificacin bioqumica y pruebas bioqumicas y serolgicas. serotipificacin. 1. Aislamiento de la muestra: Mezclar suavemente la dilucin con muestra, inocular en medio selectivo RV, TT o SC por 24 h a 35 C, 42 C o 43 C dependiendo de la muestra. A partir del inculo anterior,sembrar en agar BS, XLD y HE e incubar 24 h 2 h a 35 C. Examinar morfologa tpica y atpica. Inocular colonias presuntivas en agar selectivo TSI y LIA e incubar a 24 h 2 h a 35 C. A los cultivos que viren alcalino el medio ensayar las pruebas bioqumicas. 2. Identificacin de Salmonella: Para mezcla de cultivos (inocular en agar MacConkey, agar HE, o agar XLD, Incubar las cajas durante 24 h 2 h a 35 C. Cultivos puros (prueba de ureasa convencional o rpida). Prueba serolgica polivalente flagelar. Prueba serolgica Spicer-Edwards. Prueba para muestras ureasa negativa (caldo lisina decarboxilasa, caldo fenol rojo dulcitol o caldo base prpura con 0.5 % dulcitol. Caldo triptona (caldo cianida de potasio, caldo malonato, prueba de indol, prueba serolgica flagelar (H) para Salmonella). Prueba serolgica somtica (O) para Salmonella (prueba somtica polivalente O, prueba de grupo somtica O). Pruebas bioqumicas adicionales. Caldo lactosa rojo fenol lactosa o
Procedimiento
Preparacin de la muestra, aislamiento, identificacin bioqumica, identificacin serolgica, pruebas bioqumicas complementarias.
Salmonella
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caldo prpura lactosa. Caldo rojo fenol sacarosa o caldo prpura sacarosa, caldo MR-VP. Agar citrato de Simons. Clasificacin de cultivos. Identificacin genrica presuntiva de Salmonella (kits de pruebas bioqumicas miniaturizadas). Tratamiento de cultivos negativos a la prueba flagelar (H). Envo de cultivos para serotipificacin a las oficinas de la FDA.
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Caldo lactosa (M74), leche en polvo descremada (reconstituida) (M111), caldo selenito cistina (SC) (M134), caldo tetrationato (TT) (M145), medio Rappaport-Vassiliadis (RV) (M132). NOTA: Medio RV debe ser preparado de ingredientes individuales. Formulaciones comerciales no son aceptables, agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) (M179), agar Hektoen entrico (HE) (M61), agar sulfato de bismuto (BS) (M19), agar triple azcar hierro (TSI) (M149), caldo triptona (triptofano) (M164), caldo tripticasa de soya (M154), caldo tripticasa de soya con sulfato de hierro (M186), caldo tripticasa triptosa de soya (M160), caldo MR-VP (M104), agar citrato de Simmons (M138), caldo urea (M171), caldo urea (rpido) (M172), caldo malonato (M92), agar lisina hierro (LIA) (M89), caldo lisina decarboxilasa (M87), prueba en medio de movilidad (semislido) (M103), caldo cianidina de potasio (KCN) (M126), caldo fenol rojo carbohidrato (M121), caldo prpura carbohidrato (M130), agar MacConkey (M91), caldo nutriente (M114), caldo infusin cerebro corazn (BHI) (M24), solucin de papaina 5 % (M56a), solucin de celulasa 1 % (M187), agar base triptosa sangre (M166), caldo universal de preenriquecimiento (M188), caldo universal de preenriquecimiento (sin citrato amnico de hierro) (M188a), agua peptonada amortiguada (M192), Caldo Dey-Engley (M193), sulfito de potasio anhdrido, solucin de cloro, 200 ppm, conteniendo 0.1 % dodecil sulfato de sodio (R12a), etanol, 70 % (R23), reactivo de Kovacs (R38), reactivo de prueba Voges-Proskauer (VP) (R89), cristales de fosfato de creatina, solucin de hidrxido de potasio, 40 % (R65), solucin
Medios de pre-enriquecimiento: Agua de peptona tamponada y caldo lactosado. Caldos de enriquecimiento: Caldo selenito-cistina, caldo tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, caldo de soya tripticasa, leche descremada reconstituida, caldo soya tripticasa estril adicionado con sulfito de potasio. Medios de aislamiento: Agar verde brillante (VB), agar con sulfito de bismuto, agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar para Salmonella y Shigella (SS), agar entrico Hektoen. Medios para pruebas bioqumicas: Agar de tres azcares y hierro (TSI), agar de hierro y lisina (LIA), agar nutritivo, medio de SIM (para sulfuro, indol y movilidad), agar citrato de Simmons, caldo MR-VP, caldo manitol, caldo malonato, caldo urea, caldo de urea rpido, caldo infusin cerebro corazn. Soluciones: verde brillante al 0.1 %, yodo-yoduro, salina al 0.,85%, salina formalizada, reactivo de Kovac, alfa-naftol al 5 %, rojo de metilo, hidrxido de potasio al 40 %, gelatinasa al 5 %. Antisueros: Antisuero polivalente somtico (O), antisuero polivalente flagelar (H), Antisuero Vi.
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hidrxido de sodio (R73), cido clorhdrico 1 N (R36), solucin de tincin verde brillante, 1 % (R8), solucin de tincin prpura de bromocresol, 0.2 % (R9), indicador rojo de metilo (R44), agua destilada estril, tergitol aninico 7 (R78), triton X-100 (R86), solucin salina fisiolgica, 0.85 % (R63), solucin salina fisiolgica formalinizada (R27), antisuero Salmonella (O) somtico polivalente, antisuero Salmonella (H) flagelar polivalente, antisuero Salmonella grupo somtico (O): A, B, C1, C2, C3, D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G, H, I, Vi, y otros grupos apropiados, antisuero Salmonella Spicer-Edwards flagelar (H). Horno (180 C), incubadora con termostato, autoclave con termmetro, bao mara con termostatoao mara con termostato y termmetro, balanza granataria, licuadora, mechero Bunsen o Fisher, potencimetro, matraces Erlenmeyer (500 ml), cucharas, bistures, cuchillos y pinzas, tubos de ensayo, tubos para serologa, pipetas, asa de platino o nicromel, papel pH, ngulos de vidrio, recipientes de boca ancha. Pesar 25 g de muestra en vaso estril de licuadora/bolsa stomacher y agregar 225 ml del medio de preenriquecimiento. Licuar durante 1 min. Transferir a un recipiente con rosca, dejar reposar 60 min y ajustar a pH 6.8 con NaOH 1 N o HCl 1 N. Incubar a 24 h a 35C. Productos con huevo, frutas, crustceos y pescado: no descongelar la muestra, usar caldo lactosado y licuar 2 min. Carnes y derivados crnicos secos y procesados trmicamente: si la muestra est en polvo el licuado puede omitirse; para emulsionar
Hornos, autoclaves, incubadoras, licuadora, microscopio, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas vidrio, pH metro.
Los siguientes mtodos se basan en el anlisis de una unidad analtica de 25 g en relacin 1:9 muestra: caldo. Dependiendo de la composicin, aadir caldo suficiente para mantener esta relacin 1:9 a menos que se indique lo contrario. Para las muestras analizadas en una base de peso no exacto, por ejemplo, ancas de rana, seguir las instrucciones particulares. stas existen para los siguientes productos: Yema de huevo, clara de huevo seca, huevos enteros secos, leche lquida (leche descremada, 2 % de grasa de leche, leche entera y
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suero de leche), mezclas preparadas en polvo (pasteles, galletas, donas, galletas y pan), leche maternizada y alimentacin por va oral o un tubo que contiene huevo. Huevos en diferentes presentaciones. Leche en polvo. Leche entera en polvo. Casena. Harina de soya. Productos que contienen huevo (fideos, rollos de huevo, macarrones, espaguetis), queso, pasta, ensaladas preparadas (jamn, huevo, pollo, atn, pavo), frutas y verduras frescas, congeladas o secas, carnes de frutos secos, crustceos (camarones, cangrejo, cigalas, langostinos, langosta), y pescado. Levadura seca (levadura activa e inactiva). Coberturas para helado. Especias. Revestimiento de dulces y golosinas (incluido el chocolate). Coco. Colorantes de los alimentos y sustancias alimenticias para colorear. Gelatina. Carnes, sustitutos de carne, subproductos de la carne, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne, hueso). Las ancas de rana. Esqueleto o carcasas de conejo. Goma guar. Jugo de naranja (pasteurizado y no pasteurizado), sidra de manzana (pasteurizada y no pasteurizada), jugo de manzana (pasteurizada). Orejas de cerdo y otros tipos de alimento para perro. Melones. Mangos. Tomates. Ensayos ambientales. Semillas de alfalfa y frijol. Pulpa de mamey. Vegetales de hojas verdes y hierbas (espinaca, lechuga romana, cilantro, perejil rizado, perejil italiano, culantro, repollo y albahaca). Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de Expresin de resultados producto. Informe de la prueba No especifca. Concordancia con No especifca. normas internacionales
las grasas se puede agregar un detergente. Carnes crudas o altamente contaminadas: pesar 25 g de producto en dos vasos de licuadora, agregar 225 ml de caldo selenito cistina o de caldo tetrationato, licuar por 2 min y pasar a matraces Erlenmyer de 500 ml, dejar reposar y ajustar pH.
Presencia o ausencia de Salmonella por g o ml de la muestra. No especifca. No especifca. Puede sugerirse: Esta norma tiene
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BAM Captulo 4
Objetivo
Enumeracin de Escherichia coli y bacterias coliformes.
Fundamento
Fermentacin de lactosa y clculo de nmero ms probable.
Escherichia coli y bacterias coliformes
Procedimiento
General: Dilucin, NMP (inoculacin e incubacin, aislamiento en placa, seleccin de colonias y confirmacin), conteo en placa (inoculacin e incubacin, conteo y seleccin de colonias), confirmacin (subcultivo, confirmacin bioqumica), confirmacin en medio slido y filtracin por membrana.
concordancia con el captulo 10 del BAM en las pruebas de medios selectivos y bioqumicas de identificacin del microorganismo NOM-242-SSA1-2009 Diluciones en tubo mltiple Establecer los requisitos sanitarios para las instalaciones de toda la cadena productiva de productos marinos y establecer las especificaciones sanitarias de dichos productos y mtodos de prueba. Basado en la propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de glucosa y fermentacin de lactosa dentro de las 48 h de incubacin a 35 C (coliformes ) y 44.5 C (Coliformes fecales y E. coli). Prueba presuntiva, prueba confirmatoria (Confirmar en por lo menos el 10 % de las pruebas con resultados positivos a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35 C 0.5 C durante 24 h 2 h, observar las colonias tpicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales biliares.Seleccionar una o ms colonias aisladas y pasar a tubos de fermentacin con caldo lauril triptosa. Hacer tincin de Gram para observacin de la morfologa de las colonias.
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Caldo verde brillante bilis lactosa (BGLB) (M25), caldo lauril triptosa (LST)(M76), caldo EC (M49), azul Levin de metileno-eosina (L-EMB), agar (M80), caldo triptona (triptofano) (M164), caldo MR-VP (M104), caldo citrato de Koser (M72), agar para cuenta en placa mtodo estndar (PCA) (M124), agua Butterfield de tampon de fosfatos (R11) o diluyeente equivalente (excepto para crustceos), reactivo de Kovacs (R38), reactivo Voges-Proskauer (VP) (R89), reactivos para tincin de Gram (R32), indicador rojo de metilo (R44), agar bilis rojo violeta (VRBA) (M174), agar VRBA-MUG (M175), medio ECMUG (M50), caldo lauril triptosa MUG (LSTMUG) (M77), diluyente de peptona 0.1 % (R56).
Caldos: Caldo lauril, caldo EC, agar McConkey, agar eosina azul de metileno de Levin (EMB-L), caldo triptona al 1 % (triptofano), caldo MR-VP, caldo citrato de Koser. Reactivos: reactivo de Kovacs, para prueba de indol, prueba de VogesProskauer, coloracin de Gram, indicador rojo de metilo, medio EC-MUG
Bao de agua con agitacin cubierto y con Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, termostato, termmetro, tubos de cultivo, Aparatos e pipetas, varillas vidrio, asas, pHmetro, contador de campanas de fermentacin (tubos Durham), instrumentos colonia, licuadora, frascos de dilucin, lmpara gradillas, asas, lmpara de luz ultravioleta, lentes UV. protectores. Preparar la muestra como se indica en el mtodo Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico; y de acuerdo con el Preparacin de la Diluciones decimales. tipo de producto, utilizar las diluciones muestra apropiadas, segn se indica en el procedimiento de la densidad microbiana por la tcnica del nmero ms probable. Tabla del nmero ms probable (NMP), Expresin de resultados nmero de Enterobacteriaceae x gramo o por Expresar en NMP/g o ml para alimentos mililitro. Informe de la prueba No especifca. No especifica No especifica. Concordancia con No especifca. Puede sugerirse: Esta norma tiene normas internacionales concordancia con el captulo 4 del BAM. Apartado BAM Captulo 4A Escherichia coli
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Microorg anismo
diarreognica
Objetivo
Fundamento
Procedimiento
Escherichia coli
Identificar y aislar cepas patgenas de E. coli en base a sus propiedades nicas de virulencia en los alimentos para consumo humano. Enriquecimiento en medio lquido, seleccin de cepas fermentadoras de lactosa, caracterizacin primaria y secundaria por pruebas bioqumicas, pruebas mediante cultivo de tejidos, sondas de ADN, PCR en tiempo real de enterotoxignicidad, enteroinvasivadad, enteropatgenicidad, deteccin sistemtica de E. coli serotipo O157:H7. A. Enriquecimiento de cepas patgenas de E. coli. Caldo BHI, caldo de doble fuerza TP incubar 20 h a 44.0 C 0.2 C. Plaquear en medio selectivo, incubar 20 h a 35 C. B. Seleccin. Caractersticas fenotpicas en medio selectivo. C. Anlisis e identificacin bioqumica. Primera y segunda inspeccin con pruebas bioqumicas tradicionales o como alternativa, API20E o el ensayo de pruebas bioqumicas automatizado VITEK. D. Pruebas de E. coli enterotoxignica (ETEC), por anlisis de hibridacin de colonias con sondas de ADN, cultivo de tejidos, prueba del ratn lactante, pruebas comerciales de RPLA y ELISA para detectar toxinas, ensayos de PCR. E. Pruebas de E. coli enteroinvasiva (EIEC), por la prueba de Sereny o el ensayo queratoconjuntivitis con cobayos, ensayo de tejido de clulas HeLa , tcnica de tincin en vitro usando naranja de acridina, sondas de ADN y PCR. F. Pruebas de Escherichia coli enteropatgena (EPEC), por cultivo de tejidos, PCR y sondas. G. Deteccin de E. coli serotipo O157: H7. Medio de enriquecimiento, medio
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slido selectivo, identificacin fenotpica, serologa y la prueba de genes de la Shiga toxina por PCR y PCR en tiempo real. H. Preparacin de la muestra, enriquecimeinto. I. Anlisis de PCR en tiempo real. Preparacin del molde de ADN, controles de PCR positivo y negativo, protocolo de la reaccin del Smart Cycler II y anlisis de datos. J. Anlisis y deteccin de los cultivos aislados. De positivos por el ensayo de PCR en tiempo real. Proceso de aislamiento. Diluir y crecer en medio slido selectivo y agar cromgeno, identificar fenotpicamente, pruebas de antgenos, ensayar en medio selectivo y pruebas bioqumicas, pruebas confirmatorias (bioqumicas, con antgenos, antisueros comerciales, PCR tiempo real). K. Mtodos de anlisis para cepas STECno-O157. Enriquecimiento, aislamiento en medio selectivo, pruebas confirmatorias de los aislados por API20E o VITEK, PCR, electroforesis en gel en campos pulsados. Caldo triptona fosfato (TP) (M162), caldo infusin cerebro corazn (BHI) (M24), agar azul Levine azul de eosina-metileno (L-EMB) (M80), agar MacConkey (M91), agar triple azcar hierro(TSI) (M149), agar base sangre(BAB) (M21), caldo triptona (triptofano) (M164), caldo prpura de bromocresol (M26) suplementado individualmente con 0.5 % (w/v) de cada uno de los azcares: glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa, manitol y lactosa, caldo urea (M171), caldo Falkow lisina decarboxilasa (M87), caldo cianida de potasio (KCN) (M126), caldo MR-VP (M104), medio indol nitrito (nitrato triptico) (M66), agar acetato (M3), caldo mucato (M105), caldo mucato control (M106), caldo malonato (M92), caldo
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citrato de Koser (M72), solucin acuosa de bicarbonato de sodio 10 % (R70), Discos de ONPG (o-nitrofenil--D-galactopiranosido) (R53), solucin salina amortiguador de fosfatos (PBS) (R60), agua diluyente de Butterfield amortiguador de fosfatos (BPBW) (R11), reactivo de Kovac (R38), reactivo VP (R89), reactivo de prueba de oxidasa (R54), reactivo de deteccin de nitritos (R48), acite mineral pesado (R46), reactivos de tincin de Gram (R32). Para pruebas en PCR tiempo real: Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) y suplemento de acriflavinCefsulodin-Vancomicina (ACV) (M192a), oligonucletidos iniciadores y sondas para STEC/O157 especficos para la plataforma de PCR en tiempo real, OmniMix-HS o SmartMix HM reactivos de esferas para PCR (Cepheid o Fisher), LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes M-Grade (Roche Applied Science, Catalog #3 383 393), Agar MacConkey telurito cefiximasorbitol (TC-SMAC) (M194), agar cromognico selectivo: Agar E. coli O157:H7 R&F agar (R&F Laboratories), agar Rainbow O157 (BIOLOG), agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80) (solo seccin R), agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153), amortiguador de fosfato Butterfield (R11) (pH 7.2 0.2), agua destilada, agua grado molecular, solucin fisiolgica salina (0.85 % NaCl), ColiComplete Discs - conteniendo sustrato fluorognico MUG para GUD y X-gal cromognico para GAL (BioControl), reactivo Anti-O157 and anti-H7 latex (Remel), API20E o VITEK GNI (BioMerieux).
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Hornos, autoclaves, incubadoras, tubos, cajas Petri, pipetas, varillas vidrio, licuadora, estomaquer, mezclador rotatorio, vortex, separador magntico con gradilla magntica, Bao de agua, microscopio, pHmetro, microcentrfuga, Termociclador SmartCycler II, tubos para PCR, instrumento LightCycler 2.0 PCR tiempo real, capilares LightCycler para PCR tiempo real. Refrigere las muestras inmediatamente despus de su recepcin. No congelar, excepto para mantener los productos congelados hasta justo antes del anlisis. Analizar las muestras tan pronto como sea posible. Si el recuento lo requiere, preparar un homogeneizado de 25 g en 225 ml de PBS o BPBW. Realizar diluciones decimales (en PBS o BPBW) de la placa de homogeneizado e inocular en cajas directo en agar MacConkey para obtener colonias aisladas. Despus de incubar las placas durante 20 horas a 35C, realizar levantamiento de las colonias y pruebas de hibridacin con sondas genticas especficas para los genes de virulencia. Pruebas con sondas y PCR: Productos con hojas aade un peso igual de amortiguador fosfato de Butterfield a por lo menos 200 g de producto en un recipiente estril o bolsa resellable de plstico y agitar suavemente durante 5 minutos. Pesar 125 g del producto enjuagado en 125 ml de (2X) mBPWp doble fuerza. Jugo, leche u otras muestras de bebidas turbias - aspticamente centrifugar 200 ml de muestra a 10.000 xg durante 10 min. Despus de decantar el sobrenadante, resuspender el material precipitado en 225 ml de mBPWp. Agua embotellada u otros lquidos no turbios pesar 125 ml en 125 ml de mBPWp 2X. Tambin seguir este procedimiento con lquidos en el que no
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sea visible un precipitado despus de la centrifugacin. Todos los dems alimentos - pesar 25 g de alimento en 225 ml de mBPWp. Licuar o mezclar con un stomaquer segn sea necesario. Preparacin del molde de ADN: Enriquecer la cepa durante una noche, centrifugar, resuspender el precipitado en NaCl al 0.85 %, centrifugar, resuspender el precipitado en agua estril, mantener a 100 C durante 10 min, centrifugar, retirar y guardar el sobrenadante como molde de ADN (Esto puede ser congelado, mnimo a -20 C, para las futuras pruebas de PCR), hacer una dilucin 1:10 de este molde. Expresin de resultados Nmero de E. coli por gramo o por mililitro. Informe de la prueba No especifca. Concordancia con No especifca. normas internacionales
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Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios. Mtodo para la cuenta e identificacin de Escherichia coli diarreognica.
PREFACIO En la elaboracin de la presente propuesta de norma participaron los siguientes Organismos e Instituciones: CENAM NDICE Contenido 1. Objetivo y campo de aplicacin 2. Fundamento 3. Referencias 4. Definiciones 5. Smbolos y abreviaturas 6. Reactivos y materiales 7. Equipo 8. Preparacin de la muestra 9. Procedimiento 10. Expresin de los resultados 11. Concordancia con normas internacionales 12. Cepas de referencia 13. Bibliografa
1. Objetivo y campo de aplicacin 1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece un mtodo general para el enriquecimiento y el aislamiento de E. coli en base a sus propiedades nicas de virulencia en los alimentos para consumo humano. 1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas y morales que requieran efectuar este mtodo en productos nacionales y de importacin, para fines oficiales.
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2. Fundamento 2.1 Enriquecimiento en medio lquido, seleccin de cepas fermentadoras de lactosa, caracterizacin por pruebas bioqumicas, PCR en tiempo real para determinar enterotoxignicidad,
enteroinvasivadad, enteropatgenicidad, deteccin de E. coli serotipo O157:H7.
3. Referencias Esta norma se complementa con lo siguiente: NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NOM-110-SSA1-1994 Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
4. Definiciones Para fines de esta norma se entiende por: Coliformes: bacilos Gram negativos, no esporulados aerobios o anaerobios facultativos, que a 35 C fermentan la lactosa con la produccin de gas bajo las condiciones especificadas en NOM-112SSA1-1994 o bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 C fermentan la lactosa con formacin de cido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitacin de las sales biliares segn lo especificado en la NOM-113-SSA1-1994. Dilucin primaria: es la solucin, suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente. Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilucin primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo. Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen determinado de la suspensin inicial con un volumen nueve veces superior de disolvente y repitiendo esta operacin con diluciones decimales sucesivas hasta llegar a un nivel de dilucin adecuado para la inoculacin del medio de cultivo.
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Escherichia coli: Bacteria que a 44 C forma colonias indol positivas (color rosa) bajo las condiciones descritas en la presente norma. Enterobacteriaceae: Microorganismo que fermenta la glucosa y muestra reaccin negativa a oxidasa cuando la prueba se lleva a cabo de acuerdo al mtodo especificado. Escherichia coli O157; E.coli O157: Microorganismos que forman colonias caractersticas en la superficie del medio en placa empleado en esta norma, y que producen indol y aglutinan especficamente con antisuero frente al antgeno O157. Mtodo: es un proceso o camino sistemtico establecido para realizar una tarea o trabajo con el fin de alcanzar un objetivo predeterminado. Procedimiento cientfico seguido en la ciencia para hallar la verdad. Un procedimiento que se usa para realizar una tarea especfica en la clase o mdulo. Muestra para el laboratorio: muestra preparada para ser enviada al laboratorio y destinada a ser utilizada para inspeccin o para anlisis. Muestra representativa: es un nmero de unidades tomadas de un lote, que han sido
seleccionadas en forma aleatoria y cuyas caractersticas son lo ms similar posible a las del lote del que procede. Norma especfica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el anlisis de un producto determinado (o de un grupo de productos) para la deteccin o la determinacin del nmero de un microorganismo especfico (o de un grupo de microorganismos). Porcin para anlisis: muestra representativa medida (volumen o masa) tomada a partir de la muestra para el laboratorio para emplearse en la preparacin de la suspensin inicial. Procedimiento: es un trmino que hace referencia a la accin que consiste en proceder de alguna forma. El concepto, por otra parte, est vinculado a un mtodo una manera de ejecutar algo. Un procedimiento, en este sentido, consiste en seguir ciertas etapas predefinidas para desarrollar una labor de manera eficaz. Suspensin inicial (dilucin base): suspensin, disolucin o emulsin obtenida cuando un peso o volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las partculas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas. Suspensin inicial (dilucin primaria): suspensin, disolucin o emulsin obtenida cuando un peso o volumen determinados del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las partculas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas.
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Toma de muestra: es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad del lote o partida.
5. Smbolos y abreviaturas ms menos / por C grado Celsius % por ciento cm centmetro g gramo h hora kg kilogramo l litro l microlitro M molar ml mililitro mm milmetro min minuto p peso PCR reaccin en cadena de la polimerasa p. ejem. por ejemplo pH potencial de hidrgeno seg segundo UFC unidades formadoras de colonias v volumen x signo de multiplicacin
6. Reactivos y materiales En caso de disponerse de frmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparacin. Las sustancias qumicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analtico. 6.1 Reactivos
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Caldo triptona fosfato (TP) (M162) Triptona 20 g K2HPO4 2 g KH2PO4 2 g NaCl 5 g Polisorbato 80 (Tween 80) 1.5 ml Agua destilada 1 litro.
Preparacin Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Esterilizar por 15 min at 121 C. pH final , 7.0 0.2. Caldo infusin cerebro corazn (BHI) (M24) Medio 1: Infusin de cerebro de ternera 200 g Infusin de corazn de res 250 g
Peptona proteosa (Difco) o polipeptona (Bioquest) 10 g NaCl 5 g Na2HPO4* 2.5 g Dextrosa 2.0 g Agua destilada 1 litro. *Difco no especifica aguas de hidratacin. Medio 2: Infusin cerebro corazn 6.0 g Digerido pptico de tejido animal 6.0 g NaCl 5.0 g Dextrosa 3.0 g Digerido pancretico de gelatina 14.5 g Na2HPO4** 2.5 g Agua destilada 1 litro **BBL no especifica aguas de hidratacin.
Preparacin Medio 1: Disolver los ingredientes del medio 1 en agua destilada con calentamiento suave.
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Medio 2: Suspender los ingredientes del medio 2 en agua destilada y hervir durante 1 min hasta disolver completamente. Para ambos medios 1 y 2, verter el caldo dentro de botellas o tubos para su almacenamiento. Esterilizar 15 min a 121C. pH final , 7.4 0.2. El medio BHI comercial tambin es aceptable.
Agar azul Levine azul de eosina-metileno (L-EMB) (M80) Peptona 10 g Lactosa 10 g K2HPO4 2 g Agar 15 g Eosin Y 0.4 g Azul de metileno 0.065 g Agua destilada 1 L.
Preparacin Disolver la peptona, el fosfato y el agar en el agua por ebullicin si es necesario. Aadir agua para obtener el volumen original. Distribuir en porciones de 100 ml o 200 ml y esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C. pH final 7.1 0.2
Agar MacConkey (M91) Peptona proteosa o polipeptona 3 g Peptona o gelisado 17 g Lactosa 10 g Sales biliares No. 3 o mezcla de sales biliares 1.5 g NaCl 5 g Rojo neutro 0.03 g Cristal violeta 0.001 g Agar 13.5 g Agua destilada 1 L.
Preparacin Suspender los ingredientes y calentar con agitacin hasta disolver. Hervir 1 min -2 min. Esterilizar 15 min a 121 C, enfriar a 45 C 50 C y verter en porciones de 20 ml dentro de cajas Petri
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estriles de 15 mm x 100 mm. Secar a temperatura ambiente con la tapa cerrada. No usar cajas hmedas, . pH final 7.1 0.2.
Agar triple azcar hierro (TSI) (M149) Medio 1: Extracto de carne 3 g Extracto de levadura 3 g Peptona 15 g Peptona proteosa 5 g Cloruro sdico (NaCl) 5 g Lactosa 10 g Sacarosa 10 g Glucosa 1 g Sulfato frrico 0.2 g Tiosulfato sdico 0.3 g Rojo fenol 0.024 g Agar 12 g Agua 1 L Medio 2: Polipeptona 20 g NaCl 5g
Lactosa 10 g Sacarosa 10 g Glucosa 1 g Fe(NH4)2(SO4)26H2O 0.2 g Na2S2O3 0.2 g Rojo fenol 0.025 g Agar 13 g Agua destilada 1 L
Preparacin (Puede utilizarse cualquiera de los dos medios).
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Medio 1: Se disuelven los componentes o el medio completo deshidratado en el agua, calentando si fuera necesario. Se reparte el medio en tubos de ensayo. Se esteriliza en autoclave regulado a 118 C durante 15 min. pH 7.3 0.2. Medio 2: Se prepara de la misma manera que el medio 1 pero se esteriliza en autoclave regulado a 121 C durante 15 min. pH 7.4 0.2.
Agar base sangre (BAB) (M21) Infusin de 375 g de msculo de corazn Tiotona 10 g NaCl 5 g Agar 15 g Agua destilada 1 L
Preparacin Calentar suavemente hasta disolver. Esterilizar 20 min a 121C. pH final 7.3 0.2. Tambin puede utilizarse agar de infusin de corazn deshidratado comercial.
Caldo triptona (triptofano) (M164) Triptona o tripticasa 10 g Agua destilada 1 L
Preparacin Disolver y verter porciones de 5 ml en tubos de ensayo de 16 mm x 125 mm o 16 mm x 150 mm. Esterilizar 15 min a 121 C. pH final 6.9 0.2.
Caldo prpura de bromocresol (M26) suplementado individualmente con 0.5 % (w/v) de cada uno de los azcares: glucosa, adonitol, celobiosa, sorbitol, arabinosa, manitol y lactosa, caldo urea (M171) Base: Peptona 10 g Extracto de carne de res 3 g NaCl 5 g Prpura de Bromocresol 0.04 g
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Agua destilada 1 L
Preparacin Verter porciones de 2.5 ml de solucin base dentro de tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm conteniendo tubos de fermentacin invertidos de 6 mm x 50 mm. Esterilizar 10 min a 121C. pH final 7.0 0.2. Esterilizar en autoclave, por separado, soluciones madre de carbohidratos (50 % p/v) o preferentemente por filtracin (0.2 m tamao de poro). Adicionar 0.278 ml 0.002 ml de la solucin madre de carbohidratos a 2.5 ml de medio basal para dar una concentracin final de carbohidratos de 5 % p/v.
Caldo urea (M171) Urea 20 g Extracto de levadura 0.1 g Na2HPO4 9.5 g KH2PO4 9.1 g Rojo de fenol 0.01 g Agua destilada 1 L
Preparacin Disolver los ingredientes en agua destilada. No calentar. Esterilizar por filtracin a travs de una membrana de 0.45 m. Verter aspticamente porciones de 1.5 ml - 3.0 ml dentro de tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm. pH final 6.8 0.2.
Caldo Falkow lisina decarboxilasa (M87) Peptona 5 g Extracto de levadura 3 g Glucosa 1 g L-lisina 5 g Prpura de bromocresol 0.02 g Agua destilada 1 L
Preparacin
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Calentar hasta disolver. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos con tapn de rosca de 16 mm x 125 mm. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 C. pH final 6.8 0.2.
Caldo cianuro de potasio (KCN) (M126) Cianuro de potasio (KCN) 0.5 g Proteasa peptona N 3 o polipeptona 3 g NaCl 5 g KH2PO4 Na2HPO4 0.225 g 5.64 g
Agua destilada 1 L
Preparacin Disolver los ingredientes excepto el cianuro de potasio. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 C. Enfriar y refrigerar entre 5 C y 8 C. pH final 7.6 0.2. Preparar el KCN disolviendo 0.5 g de KCN en 100 ml de agua destilada estril y a una temperatura entre 5 C y 8 C. Pipetear 15 ml de la solucin fra de KCN a 1 L del medio base estril y fro. Mezclar y distribuir porciones de 1 ml 1.5 ml en tubos de ensayo estriles. Utilizando una tcnica asptica tapar los tubos con tapones de corcho impregnados con parafina. Almacenar los tubos a 5 C - 8 C. No pipetear con la boca. Usar guantes. No almacenar por ms de 2 semanas.
Caldo MR-VP (M104) Medio 1: Agua peptonada amortiguada en polvo 7 g Glucosa 5 g K2HP04 5 g Agua destilada 1L Medio 2: Digerido pancretico de casena 3.5 g Digerido pptico de tejido animal 3.5 g Dextrosa 5 g Fosfato de potasio 5 g Agua destilada 1 L Medio 3:
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Peptona 5 g Glucosa 5 g Amortiguador de fosfato 5 g Agua destilada 1 L
Preparacin Medio 1 y 2: Disolver los ingredientes en agua con agitacin y calentamiento moderado. Distribuir porciones de 10 ml en tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 118 C -121 C. pH final 6.9 0.2. Medio 3: Disolver los ingredientes en agua. Verter 10 ml dentro de tubos de ensayo de 16 mm x 150 mm y esterilizar en autoclave 15 min a 121C. pH final , 7.5 0.2.
Medio indol nitrito (nitrato trptico) (M66) Tripticasa 20 g Na2HPO4 2 g Dextrosa 1 g KNO3 1 g Agar 1 g Agua destilada 1 L
Preparacin Calentar con agitacin suave. Mezclar y verter porciones de 11 ml dentro de tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 118C. pH final 7.2 0.2.
Agar acetato (M3) Acetato de sodio 2 g NaCl 5g
MgSO4 (anhidro) 0.2 g Fosfato de amonio 1 g K2HPO4 1 g Azul de bromotimol Agar 20 g 0.08 g
Agua destilada 1 L
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Preparacin Adicionar todos los ingredientes excepto MgSO4 a un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin con agitacin. Adicionar MgSO4 y ajustar el pH. Verter porciones de 8 ml dentro de tubos de 16 mm x 150 mm. Esterilizar 15 min a 121C. Inclinar los tubos para obtener inclinacin de 5 cm, pH final 6.7.
Caldo mucato (M105) Peptona 10 g cido mucico 10 g Azul de bromotimol 0.024 g Agua destilada 1 L
Preparacin Disolver la peptona. Disolver el cido mucico aadiendo lentamente NaOH 5 N y agitando. Verter porciones de 5 ml dentro de tubos con tapn de rosca de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 10 min a 121C. pH final 7.4 0.1.
Caldo mucato control (M106) Peptona 10 g Azul de bromotimol 0.024 g Agua destilada 1 L
Preparacin Disolver los ingredientes. Verter porciones de 5 ml dentro de tubos de tapn de rosca de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 10 min a 121C. pH final 7.4 0.1.
Caldo malonato (M92) Extracto de levadura 1 g (NH4)2SO4 2 g K2HPO4 0.6 g KH2PO4 0.4 g NaCl 2 g
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Malonato de sodio 3 g Glucosa 0.25 g Azul de bromotimol Agua destilada 1 L 0.025 g
Preparacin Disolver calentando si es necesario. Verter porciones de 3 ml dentro de tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm. Esterilizar 15 min a 121C. pH final , 6.7 0.2.
Caldo citrato de Koser (M72) NaNH4HPO44H2O 1.5 g KH2PO4 (monobsico) 1 g MgSO47H2O 0.2 g Citrato de sodio2H2O 3 g, Agua destilada 1 L
Preparacin Verter el medio dentro de tubos de tapn de rosca como se desee. Esterilizar 15 min a 121C. pH final 6.7 0.2. Esta formulacin se enlista en los Mtodos Oficiales de Anlisis de la AOAC Internacional y los mtodos estndar para la examinacin de aguas residuales de la APHA. La composicin difiere del medio deshidratado comercial. Este ltimo es satisfactorio.
Caldo lauril sulfato triptosa (LST) Triptosa 20 g Lactosa 5 g K2HPO4 2.75 g KH2PO4 NaCl 2.75 g 5g 0.1 g
Lauril sulfato de sodio Agua destilada 1 L
Preparacin
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Disolver los componentes en 1 L de agua. Distribuir en volmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 mm x 160 mm, cada tubo debe tener campana de fermentacin. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 C 1.0 C. pH final 6.8 0.2
Agar recuento en placa (mtodos estndar) Triptona 5 g Extracto de levadura 2.5 g Dextrosa 1 g Agar 15 g Agua destilada 1 L
Preparacin Calentar para disolver los ingredientes. Colocar el medio en tubos o frascos. Esterilizar 15 min a 121 C, pH final 7.0 0.2.
Solucin acuosa de bicarbonato de sodio 10 % (R70) Bicarbonato de sodio 100 g Agua destilada para aforar a 1 L Discos de ONPG (o-nitrofenil--D-galactopiranosido) (R53) Solucin de fosfato monosdico 1.0 M pH 7: NaH2PO4H20 6.9 g Agua destilada 45 ml Solucin NaOH 30 % (p/v) 3 ml o-Nitrofenil-D-galactosido (ONPG) 0.0133 M: ONPG 80 mg Agua destilada a 37C 15 ml Solucin de fosfato de monosodio 1.0 M pH 7 5 ml.
Preparacin Solucin de fosfato monosdico 1.0 M pH 7: disolver el NaH2PO4H2O en agua destilada. Adicionar la solucin de 30 % NaOH y ajustar a pH 7. Aforar a 50 ml con agua destilada y almacenar en refrigeracin (alrededor de 4 C).
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0.0133 M o-Nitrofenil-D-galactosido (ONPG): disolver el ONPG en agua destilada a 37 C. Adicionar la solucin 1.0 M de NaH2PO4. La solucin no debe tener color. Almacenar en refrigeracin (alrededor de 4 C). Calentar una porcin suficiente para el nmero de pruebas a 37 C antes de usar.
Solucin salina amortiguador de fosfatos (PBS) (R60) Solucin Madre (Stock, 0.1 M): Na2HPO4 (anhidro) 12.0 g NaH2PO4 H20 2.2 g NaCl 85 g Agua destilada 1 L Preparacin Disolver los ingredientes en agua destilada y aforar a 1 litro. Diluir la solucin madre 1+9 en agua doble destilada. Mezclar bien. Ajustar pH a 7.5 con 0.1 N HCl o 0.1 N NaOH si es necesario. Se encuentra disponible comercialmente en Difco Laboratories y BBL en su forma deshidratada. Agua diluyente de Butterfield amortiguador de fosfatos (BPBW) (R11) KH2PO4 34 g Agua destilada 500 ml
Preparacin Ajustar pH a 7.2 con NaOH 1 N. Aforar a 1 litro con agua destilada. Esterilizar 15 min a 121 C. Almacenar en el refrigerador. Blancos de dilucin: Tomar 1.25 ml de la solucin madre descrita anteriormente y aforar a 1 litro con agua destilada. Verter dentro de frascos a 90 ml o 99 ml 1 ml. Esterilizar 15 min a 121 C.
Reactivo de Kovacs (R38) p-Dimetilaminobenzaldehido 5g
Alcohol Amlico (normal) 75 ml HCl (concentrado) 25 ml
Preparacin
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Disolver el p-dimetilaminobenzaldehido en alcohol amlico normal. Lentamente adicionar HCl. Almacenar a 4 C. Para la prueba de indol, adicionar 0.2 ml -0.3 ml del reactivo a 5 ml de un cultivo de 24 h en caldo triptona. Una capa color rojo oscuro en la superficie es una prueba positiva para la prueba de indol.
Reactivo VP (R89) Solucin 1: -Naftol 5 g Alcohol (absoluto) 100 ml Solucin 2: Hidrxido de potasio 40 g Agua destilada 100 ml
Preparacin Transferir 1 ml del cultivo de 48 h y aadir 0.6 ml de la solucin 1 ml y 0.2 ml de la solucin 2. Agitar despus de cada adicin. Para intensificar y apresurar la reaccin, aadir unos cristales de creatina a la mezcla. Dejar a temperatura ambiente. Observar los resultados despus de 4 h de adicionar los reactivos.
Reactivo de prueba de oxidasa (R54) N,N,N',N'-Tetrametil-p-fenilenediamina2HCl 1 g Agua destilada 100 ml
Preparacin Usar un preparado fresco. Sin embargo, el reactivo puede ser usado hasta por 7 das si es almacenado en un frasco de vidrio oscuro en refrigeracin. Aplicar la solucin recientemente preparada (fresca) directamente a un cultivo joven (24 h) en cajas Petri o tubos inclinados. Las colonias oxidasa-positivas desarrollan un color rosa que progresivamente se torna prpura oscuro. Transferir las colonias fuera del reactivo dentro de 3 min, si es que los cultivos se van a conservar debido a que el reactivo es txico para los organismos. Mtodo opcional: Transferir una pequea cantidad de cultivo a un papel filtro impregnado con el reactivo. Un color prpura oscuro dentro de 10 s indica una prueba positiva. Usar un asa de platino, un aplicador de madera o un palillo estril debido a que las asas que contienen hierro (ejemplo asa de nicromo) dan reacciones falsos positivos.
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Alternativamente, la prueba se puede hacer con una solucin al 1 % de hidroclrido de N,N-dimetilp-fenilenediamina. Aplicar la solucin directamente al cultivo en caja o tubo inclinado.
Reactivo de deteccin de nitritos (R48) Reactivo cido sulfanilico: cido sulfanlico 1 g cido actico 5 N 125 ml Reactivo N-(1-naftil)etilendiamina: N-(1-naftil)etilendiamina dihidrocloruro cido actico 5 N 200 ml Reactivo -Naftol: -Naftol 1 g cido actico 5 N 200 ml 0.25 g
Reactivos alternativos para la prueba: El cido sulfnico 5-Amino-2-naftileno (cido de Cleve) y N,N-dimetil- 1-naftilamina han sido recomendados como sustitutos para la preparacin del reactivo B. Etanol absoluto puede ser sustituido por cido actico en el reactivo C. Sin embargo, se debern realizar evaluaciones comparativas antes de sustituir los reactivos originales.
Preparacin Para preparar el cido actico 5 N, adicionar 28.75 ml de cido actico glaciar a 71.25 ml de agua destilada. Almacenar los reactivos en frascos color mbar. Almacenar los reactivos en frascos de vidrio color caf con tapn. Para realizar la prueba adicionar 0.1 ml -0.5 ml de los reactivos A y reactivos B o reactivos C (segn lo descrito en el mtodo) a un cultivo en medio lquido o semislido. El desarrollo de un color rojo-violeta con los reactivos A y B o un color naranja con los reactivos A y C indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. Debido a que el color producido por los reactivos A y B puede desvanecerse o desaparecer en muy pocos minutos, la reaccin debe registrarse tan pronto como el color aparezca. Si no se desarrolla color, la prueba de presencia de nitrato por la adicin de una pequea cantidad de polvo de zinc. Si se desarrolla color, el nitrato no ha sido reducido. Prueba de reduccin del nitrato para E. coli enteropatognica. Para 3 ml de un cultivo de 18 h -24 h en medio indol-nitrito, adicionar 2 gotas de los reactivos A y B. Un color rojovioleta indica que el nitrato ha sido reducido a nitrito. Revisar las pruebas negativas aadiendo pequeas cantidades de polvo de zinc; si el color rojo-violeta no aparece, el nitrato ha sido reducido.
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Aceite mineral pesado (R46) Esterilizar 30 min a 121C. Usar contenedores con tapn de rosca a la mitad de su capacidad con 20 ml -50 ml.
Reactivos de tincin de Gram (R32) Cristal violeta de Hucker Solucin A: Cristal violeta (90 %) 2 g, Etanol (95 %) 20 ml Solucin B: Oxalato de amonio 0.8 g, Agua destilada 80 ml.
Preparacin Mezclar las soluciones A y B. Almacenar 24 h y filtrar con papel filtro.
Lugol Yodo 1 g Yoduro de potasio (KI) 2 g Agua destilada 300 ml
Preparacin Colocar el yoduro de potasio en el mortero, aadir el yodo, moler de 5 min a 10 min. Aadir de manera espaciada 1 ml de agua, 5 ml de agua y 10 ml de agua, moler entre cada aplicacin. Verter esta solucin en una botella, lavar el mortero con el resto del agua destilada y adicionar a la botella del reactivo.
Contraste de Hucker (solucin stock) Safranina O 2.5 g Agua destilada 100 ml
Preparacin Solucin de trabajo: aadir 10 ml de la solucin stock a 90 ml de agua destilada.
Tincin de Gram Transferir a una laminilla la muestra del cultivo. Pasar la laminilla por la flama varias veces muy rpido y esperar que la muestra se seque. Aadir una gota de cristal violeta, esperar 1 min a que
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seque. Lavar con agua. Esperar a que se seque. Colocar una gota de LUGOL, dejar secar y lavar con agua. Secar. Decolorizar con etanol al 95 %. Lavar con agua. Dejar secar. Agregar una gota de safranina, dejar secar aprox. 1 min, lavar con agua, secar nuevamente. Observar al microscopio.
Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) (M192a) Peptona 10 g NaCl 5 g Na2HPO4 3.6 g KH2PO4 1.5 g Casaminocidos 5 g Extracto de levadura 6 g Lactosa 10 g Piruvato de sodio 1 g Agua destilada 1 L
Preparacin Esterilizar en autoclave. pH 7.2 0.2.
Suplemento de acriflavin-Cefsulodin-Vancomicina (ACV) (M192a) Acriflavin 1.125 g Cefsulodin 1.125 g Vancomicina 0.90 g
Preparacin Disolver cada uno de los suplementos en 500 ml de agua destilada. Esterilizar por filtracin. Aadir 1 ml de cada uno a 225 ml de mBPWp.
Agar MacConkey sorbitol (SMAC) (M139) Peptona proteosa o polipeptona 3 g Peptona o gelisado 17 g Sorbitol 10 g 1.5 g
Sales biliares No. 3 o mezcla de sales biliares NaCl 5g
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Rojo neutro 0.03 g Cristal violeta 0.001 g Agar 13.5 g
Agua destilada 1 L
Preparacin Disolver los ingredientes en agua destilada, con calentamiento y agitacin. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 C. pH final, 7.1 0.2.
Agar MacConkey telurito cefixima-sorbitol (TC-SMAC) (M194) Telurito de potasio 2.5 mg/L Cefixima 0.05 mg/L
Preparacin Preparar Agar MacConkey sorbitol (SMAC) (M139) como se indica. Despus de esterilizar y temperar aadir los 2 aditivos. Esterilizar por filtracin.
Agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80) Peptona 10 g Lactosa 10 g K2HPO4 2 g Agar 15 g Eosina Y 0.4 g Azul de metileno 0.065 g Agua destilada 1 L
Preparacin Hervir para disolver la peptona, el fosfato y el agar en 1 litro de agua. Aadir agua para completar el volumen original. Distribuir en porciones de 100 ml o 200 ml cada vez y esterilizar en autoclave 15 minutos a no ms de 121 C. Antes de su uso, aadir a cada porcin de 100 ml: 5 ml de solucin estril de lactosa al 20 %; 2 ml de solucin acuosa de eosina y al 2 %; y 4.3 ml de solucin acuosa de azul de metileno al 0.15 %. Cuando se usa el producto deshidratado completo, hervir para
144
disolver todos los ingredientes en un litro de agua. Distribuir porciones de 100 ml o 200 ml. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 C. El pH final 7.1 0.2.
Agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153) Agar soya tripticasena 40 g Extracto de levadura 6 g Agua destilada 1 L
Preparacin Pesar los ingredientes, adicionar agua y mezclar. Esterilizar en autoclave 15 min a 121 C. pH final 7.3 0.2.
Amortiguador de fosfato Butterfield (R11) KH2PO4 34 g
Agua destilada 500 ml
Preparacin Ajustar el pH a 7.2 con NaOH 0.1 N. Ajustar el volumen a un litro con agua destilada. Esterilizar 15 min a 121 C. Almacenar en refrigeracin. Dilucin de los blancos: Tomar 1.25 ml de la solucin madre anterior y ajustar el volumen a un litro con agua destilada. Distribuir en botellas de 90 ml o 99 ml 1 ml. Esterilizar 15 minutos a 121 C.
Reactivo de Kovacs (R38) -dimetilaminobenzaldehido 5 g Alcohol amlico 75 ml HCl (concentrado) 25 ml
Preparacin Disolver el -dimetilaminobenzaldehido en alcohol amlico. Lentamente adicionar HCl. Almacenar a 4 C. Para la prueba de indol, adicionar 0.2 ml -0.3 ml del reactivo a 5 ml de cultivo bacteriano de 24 h en caldo triptona.
Para pruebas en PCR tiempo real:
145
Agua peptonada amortiguada con piruvato (mBPWp) y suplemento de acriflavin-CefsulodinVancomicina (ACV) (M192a), oligonucletidos iniciadores y para STEC/O157 especficos para la plataforma de PCR en tiempo real, OmniMix-HS o SmartMix HM reactivos de esferas para PCR (Cepheid o Fisher), LightCycler FastStart DNA Master Hybridization Probes M-Grade (Roche Applied Science, Catalog #3 383 393), agar MacConkey telurito cefixima-sorbitol (TC-SMAC) (M194), agar cromognico selectivo: Agar E. coli O157:H7 R&F agar (R&F Laboratories), agar Rainbow O157 (BIOLOG), agar Levin azul de eosin-metileno (L-EMB) (M80) (solo seccin R), agar tripticasa de soya con extracto de levadura (TSAYE) (M153), amortiguador de fosfato Butterfield (R11) (pH 7.2 0.2), agua destilada, agua grado molecular, solucin fisiolgica salina (0.85 % NaCl), ColiComplete Discs - conteniendo sustrato fluorognico MUG para GUD y X-gal cromognico para GAL (BioControl), reactivo Anti-O157 and anti-H7 latex (Remel), API20E o VITEK GNI (BioMerieux).
Tabla 2. Secuencias de oligo/sonda para su uso en la plataforma SmartCycler II. Oligos1 Stx1F934 Stx1R1042 Stx2F1218 Stx2R1300 UidAF241 UidAR383 IAC55F2 IAC186R Sonda
1 2
GenBank # Bases M19473 M19473 X07865 X07865 AF305917 AF305917 26 21 24 26 21 22 17 19 GenBank # Bases M19473 X07865 AF305917 31 25 15 26
5' 3' Secuencia gTg gCA TTA ATA CTg AAT TgT CAT CA gCg TAA TCC CAC ggA CTC TTC gAT gTT TAT ggC ggT TTT ATT TgC Tgg AAA ACT CAA TTT TAC CTT Tag CA CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T ATg ggT gCC gTT CgA gc Cga gaC gAT gCa gCC aTT C 5' 3' Secuencia TxRd-TgA TgA gTT TCC TTC TAT gTg TCC ggC AgA T-BHQ2 6FAM-TCT gTT AAT gCA ATg gCg gCg gAT T-BHQ1 TET-ATT gAg CAg CgT Tgg-MGB/NFQ Cy5- TCT CAT gCg TCT CCC Tgg TgA ATg Tg-BHQ2
Stx1P990 Stx2P1249 UidAP266 ICP-Cy52,3

1
Nombre de oligo / sonda compuesto por gen de inters (stx1, stx2 o uidA), oligo directo (F), oligo
reverso (R) o sonda (P), posicin de la base 5' del oligonucletido en la respectiva secuencia del gen especificada en la columna 2.
146
2
Los oligos y sondas para control interno de amplificacin (IAC) estn cubiertos por U.S. Patent
Application 0060166232.
Tabla 3. Secuencias de los oligos y sondas para su uso en la plataforma LightCycler 2.0. Oligos1 uidA F 241 uidA R 383 stx1 F 406 stx1 R 667 stx2 F 492 stx2 R 737 GenBank # AF305917 AF305917 M19573 M19573 X07865 X07865 Bases 21 22 25 27 28 22 5' 3' Secuencia CAg TCT ggA TCg CgA AAA CTg ACC AgA CgT TgC CCA CAT AAT T gAg gAA ggg Cgg TTT AAT AAT CTA C CAC TAT gCg ACA TTA AAT CCA gAT AAg gTT TTg ACC ATC TTC gTC TgA TTA TTg A ACT CCA TTA ACg CCA gAT ATg A
5' 3' Secuencia LCRed705-CTT TCC CAC CAA CgC TgC TCA ATT CCA-Phosphate CAC AgC AAT TgC CCg gCT TTC TTg TAA CguidA FL P 319 AF305917 29 Fluoroscein LCRed610-gTC Tgg TgA CAg TAg CTA TAC CAC stx1 610 LC 552 M19573 32 gTT ACA gC-Phosphate CCT TTC CAg gTA CAA CAg Cgg TTA CAstx1 FL P 524 M19573 26 Fluoroscein LCRed670-gCT ggA ACg TTC Cgg AAT gCA AAT stx2 670 LC 670 X07865 28 CAg T-Phosphate gTT ATA CCA CTC TgC AAC gTg TCg CAstx2 FL P 642 X07865 26 Fluoroscein 1 Nombre del oligo / sonda compuesto por el gen de inters (stx1, stx2 o uidA), oligo directo (F), Sondas1 GenBank # Bases uidA 705 LC AF305917 27 288 oligo inverso (R) o una sonda (610LC, 670LC, 705LC, o P FL), posicin de la base 5 ' de los oligonucletidos en el secuencia del gen respectivo especificado en la columna 2.
Reactivos para pruebas de PCR Agua peptonada alcalina (APW) Peptona NaCl Agua destilada Preparacin: Ajustar el pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 8.5 0.2. Distribuir en tubos con tapn de rosca. Esterilizar 10 min a 121 C. 10.0 g 10.0 g 1000 ml
147
Solucin maestra de oligos para PCR 10 pmol/l (ver seccin especfica) Taq ADN polimerasa (nativa disponible de mltiples proveedores) o Amplitaq (Perkin-Elmer) Solucin maestro de 2'-Deoxinucleosido-5'-trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 1.25 mM de cada dNTP Amortiguador de PCR 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2) Aceite mineral ligero Agua desionizada estril 10X TBE (0.9 M Tris-borate, 0.02 M EDTA, pH 8.3) Agarosa (grado electroforesis de cidos nucleicos) Solucin de bromuro de etidio, 10 mg/ml Amortiguador de carga de muestra 6X [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.0 3% azul de bromofenol, 0.03 % cianol xileno FF, 60 % glicerol, 60 mM EDTA, Sambrook y col. 1989] Marcadores de peso molecular de ADN (ejem., escalera 123 bp, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)
7. Equipo Balanza, 2 kg con 0.1 g de sensibilidad Licuadora, Waring o modelo equivalente con operacin a baja velocidad a 8000 rpm, con vaso de vidrio o metal de 1 litro Incubadoras, 35 C 0.5 C y 44 C 1 C Cajas Petri 20 mm x 150 mm Pipetas Pasteur Potencimetro o tiras reactivas de pH, intervalo 6.0-8.0 Frascos esterilizables para enriquecimiento Opcional: homogeneizador tipo estomaquer con bolsas plsticas de 250 ml Bolsas plsticas resellables de 200 g de capacidad Incubadoras: 36 C 1 C y 42 C 1 C Cajas Petri de 20 mm x 150 mm Tubos para centrfuga (0.5 ml a 2.0 mL) Tubos cnicos para centrfuga (50.0 mL) Micropipetas (0.5 L -20 L, 20 L -200 L, 200 L -1000 L) Microcentrfuga (capacidad de 15000 x g) Pipetas (1 ml a 10 ml)
148
Puntas para pipeta (0.2 l a 1000 l) (puntas resistentes a aerosol) Mezclador Vortex Papel filtro Bao de agua o bloque de calentamiento capaz de mantener 100 C Termociclador SmartCycler II PCR (Cepheid, Sunnyvale, CA) capaz de llevar a cabo los parmetros de ciclos descritos y deteccin simultnea de la secuencia en tiempo real para colorantes FAM, TET, Texas Red y Cy5 Tubos de reaccin para PCR SmartCycler (volumen mnimo de reaccin de 25 l) y racks compatibles con el termociclador Microcentrfuga con adaptadores capilares (#11909312001) o centrfuga LC Carousel 2.0 (#03 709 507 001) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) Instrumento de PCR en tiempo real LightCycler (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) capaz de llevar a cabo los parmetros de ciclos descritos y deteccin simultnea de la secuencia en tiempo real para colorantes LightCycler LC610, LC670 y LC705 Tubos capilares para PCR LightCycler (volumen mnimo de reaccin de 20 l, #04929292001) y bloque de enfriamiento (#11909339001) compatible con el termociclador Hielo Pinzas estriles Guantes de ltex o equivalentes Termociclador automtico programable Aparato para gel de electroforesis horizontal Fuente de poder para electroforesis con voltaje constante Transiluminador UV Cmara Polaroid o digital Pelcula Polaroid
8. Preparacin de la muestra 8.1 Preparacin de los alimentos para el aislamiento de E.coli patgena. Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
8.2 Procedimiento general para la preparacin de muestras
149
Refrigere las muestras inmediatamente despus de su recepcin. No congelar las muestras, excepto para mantener los productos congelados hasta justo antes del anlisis. Analizar las muestras tan pronto como sea posible. Si el recuento lo requiere, preparar un homogeneizado de 25 g en 225 ml de PBS o BPBW. Realizar diluciones decimales (en PBS o BPBW) del homogeneizado y plaquear directo en agar MacConkey para obtener colonias aisladas. Despus de incubar las placas durante 20 horas a 35 C, realizar levantamientos de las colonias y pruebas de hibridacin con sondas genticas especficas para los genes de virulencia. Este procedimiento de recuento es ms eficaz si E. coli constituye al menos el 10 % del crecimiento microbiano en agares de aislamiento y est presente a un nivel de > 1 000 clulas/g.
8.3 Pruebas con sondas y PCR Productos de hojas - aade un peso igual de amortiguador fosfato de Butterfield a por lo menos 200 g de producto en un recipiente estril o en una bolsa resellable de plstico y agitar suavemente durante 5 minutos. Pesar 125 g del producto enjuagado con el amortiguador fosfato de Butterfield y adicionarlo en 125 ml de mBPWp doble fuerza (2X).
Jugo, leche u otras muestras de bebidas turbias - aspticamente centrifugar 200 ml de muestra a 10 000 x g durante 10 min. Resuspender el material precipitado en 225 ml de mBPWp despus de decantar el sobrenadante.
Agua embotellada u otros lquidos no turbios - pesar 125 ml en 125 ml de mBPWp 2X. Tambin seguir este procedimiento con lquidos en los que no sea visible un precipitado despus de la centrifugacin.
Todos los dems alimentos - pesar 25 g de alimento en 225 ml de mBPWp. Licuar o mezclar con un estmaquer segn sea necesario.
Preparacin del ADN molde: Enriquecer la cepa durante una noche, centrifugar, resuspender el precipitado en NaCl al 0.85 %, centrifugar, resuspender el precipitado en agua estril, mantener a 100 C durante 10 min, centrifugar, retirar y guardar el sobrenadante como ADN molde (Esto puede ser congelado, mnimo a -20 C, para las futuras pruebas de PCR), hacer una dilucin 1:10 de este molde.
150
9. Procedimiento 9.1 Enriquecimiento 9.1.1 Enriquecimiento para cepas patgenas de E. coli Lo que aqu se recomienda permite la determinacin cualitativa de la presencia de cepas patgenas de E. coli patgena. Pesar aspticamente 25 g de muestra en 225 ml de caldo BHI (factor de dilucin de 1:10). Dependiendo de la disponibilidad de la muestra, si es necesario el tamao de la muestra puede variar de los 25 g, siempre y cuando el diluyente se ajuste proporcionalmente. Mezclar o colocar brevemente el homogeneizador tipo estomacher. Incubar el homogeneizado durante 10 min a temperatura ambiente con agitacin peridica, luego dejar asentar la muestra por gravedad durante 10 minutos. Decantar el medio cuidadosamente en un recipiente estril e incubar durante 3 horas a 35 C para resucitar las clulas daadas. Transferir el contenido de 225 ml de caldo TP de concentracin doble en un recipiente estril e incubar durante 20 horas a 44.0 C 0.2 C. Despus de la incubacin, estriar en agar L-EMB y agar MacConkey. Incubar estos agares durante 20 horas a 35 C. 9.1.2 Enriquecimiento para pruebas con PCR Incubar estticamente el homogenizado a 37 C 1 C durante 5 horas, luego adicionar 1ml de cada suplemento ACV e incubar estticamente a 42 C 1 C durante toda la noche (18-24 h). Se debe realizar el enriquecimiento para las cepas control: 465-97 del USDA (stx1-, stx2- uidA+). Como alternativa, utilice ATCC43890 (stx1+, stx2-, uidA+), ATCC 43888 (stx1, stx2- uidA+) o su equivalente si 465-97 no est disponible. Nota: estas cepas carecen de ambos genes stx y no debe utilizarse como controles en la PCR.
OPCIONAL: El uso de separacin inmunomagntica (IMS) previo a la etapa de seleccin puede resultar til cuando se sospecha de la contaminacin con O157:H7, sobre todo en los alimentos con altos niveles de la flora microbiana competidora tales como los brotes o carnes crudas. Varios procedimientos de IMS estn disponibles, incluyendo Dynabeads anti-E.coli O157 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) y sistema de inmunocaptura Pathatrix de E. coli O157 (Matriz de Micro Ltd., Reino Unido) y algunos de ellos ya han sido probados en alimentos seleccionados. Realizar la IMS en el enriquecimiento de 5 h o de toda la noche (dependiendo del sistema IMS utilizado). Sembrar en placa o ensayar el PCR en tiempo real desde la suspensin final de las esferas de IMS (aproximadamente 100 l), tal como se describe ms adelante.
151
9.2 Seleccin Las colonias tpicas que fermentan lactosa en agar L-EMB aparecen con centro color negro, planas con o sin brillo metlico. Las colonias tpicas en agar MacConkey que fermentan lactosa presentan color rojo ladrillo. Los biotipos no fermentadores de lactosa en ambos agares producen colonias incoloras o ligeramente rosado.
NOTA: Algunas colonias de EIEC no fermentan la lactosa y pueden haber cepas atpicas no fermentadoras de lactosa en otros grupos de E. coli patgenos, por lo tanto, debern seleccionarse al menos 20 colonias (10 tpicas y 10 atpicas) para su posterior caracterizacin.
9.3 Deteccin bioqumica convencional e identificacin de E. coli Realizar la tincin de Gram. Todos los cultivos que aparezcan como bacilos cortos Gram-negativos deben ser ensayados con las reacciones IMViC y se debern inocular en caldo LST para confirmar la produccin de gas. Sin embargo, debido a que muchas bacterias entricas tambin puede crecer en el caldo de enriquecimiento TP, adems tambin se debe considerar la realizacin de pruebas adicionales para aquellas cepas de E. coli anaerognicas, no mviles y no fermentadoras o lentamente fermentadoras de lactosa. Algunas de estas nuevas o modificadas reacciones se discuten a continuacin.
9.3.1 Pruebas bioqumicas tradicionales: Produccin de indol. Inocular un tubo de caldo triptona e incubar por 24 horas 2 horas a 35 C. Ensayar para prueba de indol mediante la adicin de 0.2 ml -0.3 ml de reactivo de Kovacs. La aparicin de un distintivo color rojo en la capa superior es positiva para la prueba.
Reactivo Voges-Proskauer (VP). Inocular un tubo de caldo MR-VP e incubar 48 horas 2 horas a 35 C. Transferir 1 ml a un tubo de 13 mm x 100 mm. Aadir 0.6 ml de -naftol y 0.2 ml de KOH al 40 % y agitar. Aadir unos pocos cristales de creatina. Agitar y dejar reposar durante 2 horas. La prueba es positiva si se desarrolla eosina color rosa.
Reactivo rojo de metilo. Despus de la prueba VP, incubar un tubo adicional de MR-VP por 48 horas 2 horas a 35 C. Agregar 5 gotas de la solucin de rojo de metilo a cada tubo. Un color rojo caracterstico indica una prueba positiva. Un color amarillo indica una reaccin negativa.
152
Citrato. Inocular ligeramente tubos de caldo citrato de Koser, evitar una turbidez detectable. Incubar durante 96 horas a 35 C. El desarrollo de turbidez distintiva indica una reaccin positiva.
Produccin de gas de lactosa. Inocular un tubo de LST e incubar 48 horas 2 horas a 35 C. La produccin de gas (desplazamiento del medio en el vial interno) o efervescencia despus de una ligera agitacin indica una reaccin positiva.
Interpretacin: Todos los cultivos que (a) fermentan la lactosa con produccin de gas dentro de 48 horas a 35 C, (b) aparecen como bacilos Gram-negativos no formadores de esporas y (c) dan patrones de IMViC ++-- (biotipo 1) o -+-- (biotipo 2) se considerarn como E. coli.
NOTA: Como alternativa, en lugar de realizar la prueba de IMViC puede utilizar API20E o las pruebas bioqumicas automatizadas VITEK para identificar el organismo como E. coli. Utilizar el crecimiento en los cultivos inclinados de PCA y realizar estos ensayos como lo describe el fabricante.
9.3.2 Pruebas no tradicionales: a) Inspeccin primaria. Transferir las colonias sospechosas a agar TSI, agar BAB, caldo triptona, caldo arabinosa y caldo urea. Incubar por 20 horas a 35 C. Rechazar las cepas H2S-positivas, ureasa positivas, arabinosa no fermentadora, e indol-negativa. Para probar la reaccin ONPG, suspender el crecimiento obtenido en el medio TSI en solucin salina al 0.85 % para dar turbidez detectable. Aadir un disco impregnado con ONPG e incubar 6 horas a 35 C. El color amarillo indica una reaccin positiva. Rechazar las cepas aerognicas ONPG-negativas. Algunas cepas Alcalescens-Dispar (es decir, E. coli anaerognica) son ONPG-negativas. b) Inspeccin secundaria (48 h de incubacin a 35 C a menos que se especifique lo contrario). Para identificar los cultivos y subdividir Escherichia spp se deben ensayar las reacciones adicionales que se muestran en las Tablas 3 y 4. c) Como alternativa, puede utilizar API20E o el ensayo de pruebas bioqumicas automatizadas VITEK para identificar el organismo como E. coli.
Tabla 3. Lista parcial de los kits bioqumicos miniaturizados y sistemas automatizados para la identificacin de las bacterias transmitidas por los alimentos *. Sistema Formato Fabricante Organismos
153
Enterobacteriaceae, API
b
Listeria, Campylobacter,
Bioqumica
bioMerieux
Staphylococcus,
No-fermentadoras, anaerobias Cobas IDA Micro-IDb EnterotubeII Spectrum 10 RapID BBL Crystal Minitek Bioqumica Bioqumica Bioqumica Bioqumica Bioqumica Bioqumica Bioqumica Hoffmann LaRoche REMEL Roche Austin Biological Innovative Diag. Becton Dickinson Becton Dickinson Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae, Listeria Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae, Vibrionaceae,
No-fermentadoras, anaerobias Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae, Gram
Microbact
Bioqumica
Microgen
negativas, Listeria
No-fermentadoras,
Vitekb
Bioqumicaa Oxidacin de Ca
bioMerieux
Enterobacteriaceae, negativas, Gram positivas Enterobacteriaceae, negativas, Gram positivas Enterobacteriaceae, Listeria,
Gram
Microlog
Biolog
Gram
MIS
cidos grasos
Microbial-ID
Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter Enterobacteriaceae, Listeria,
Walk/Away
Bioqumica
MicroScan
Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter Enterobacteriaceae, Listeria,
Replianalyzer
Bioqumicaa
Oxoid
Bacillus, Staphylococcus, Campylobacter
Riboprinter
cidos nucleicosa Bioqumicaa Conductanciaa
Qualicon
Salmonella, Staphylococcus, Listeria, Escherichia coli Enterobacteriaceae, Gram negativas, No-fermentadoras Salmonella, Listeria,
Cobas Micro-ID Malthusb
Becton Dickinson Malthus
154
Campylobacter,
a
E.
coli,
Pseudomonas, coliformes Bactometer

a b
Impedancia
bioMerieux
Salmonella
* Tabla modificada de: Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed. Sistemas automatizados. Sistemas adoptados por la AOAC.
NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista mtodos disponibles conocidos. La presencia en esta lista no indica la verificacin, endose o la aprobacin de la FDA para su uso en anlisis de alimentos.
Tabla 4. Lista parcial de ensayos de cidos nucleicos comercialmente disponibles utilizados para la deteccin de bacterias patgenas transmitidas por los alimentos. Organismo Clostridium botulinum Campylobacter Escherichia coli E. coli O157:H7 Nombre comercial Probelia AccuProbe GENE-TRAK GENE-TRAK BAX Probelia GENE-TRAKc Listeria AccuProbe BAX Probelia GENE-TRAK Salmonella BAX BINDb Probelia Staphylococcus aureus Yersinia enterocolitica
a b c
Formato PCR Prueba Prueba Prueba PCRa PCR Prueba Prueba PCR PCR Prueba PCR Fago PCR Prueba Prueba
Fabricante BioControl GEN-PROBE Neogen Neogen Qualicon BioControl Neogen GEN-PROBE Qualicon BioControl Neogen Qualicon BioControl BioControl GEN-PROBE Neogen
AccuProbe GENE-TRAK GENE-TRAK
Prueba Neogen * Tabla modificada de: Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed. Reaccin en cadena de la polimerasa. Diagnstico bacteriano por nucleacin de hielo.
155
c
Adoptado por AOAC.
NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista mtodos disponibles conocidos. La presencia en esta lista no indica la verificacin, endose o la aprobacin de la FDA para su uso en anlisis de alimentos.
9.4 Pruebas de deteccin de genes de virulencia de E. coli mediante PCR punto final. 9.4.1 Pruebas para E. coli enterotoxignica (ETEC), genes de enterotoxina termo-lbil (LT) y genes de enterotoxina estable al calor (ST)
Existen pruebas comerciales disponibles de RPLA y ELISA para la deteccin de toxinas LT y ST (Tabla 5), as como tambin se pueden realizar ensayos de PCR punto final con los oligos especficos tomados de Nataro y Kaper, 1998 . STI 5'-TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG-3' 5'-CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC-3' LT 5'-GGCGACAGATTATACCGTGC-3' 5'-CCGAATTCTGTTATATATGTC-3'
Las enterotoxinas termo-lbiles (LT) de E. coli son un grupo de protenas estrechamente relacionado que se distinguen de enterotoxinas termoestables (ST) por ser inmunognicas y por ser inactivadas por calentamiento a 60 C durante 10 min. Las toxinas estimulan la adenilato ciclasa y pueden ser detectadas mediante ensayos de cultivo de tejidos de clulas de ovario de hmster chino o clulas suprarrenales de ratn Y-l.
La enterotoxina estable al calor (ST) de E. coli se distingue de la LT (arriba) por la estabilidad al calor y falta de inmunogenicidad. Puede ser detectada por el bioensayo de ratn lactante y acta mediante la estimulacin de guanilato ciclasa. Hay al menos dos tipos diferentes: ST I (tambin conocido como STa y STP) y ST II (tambin conocido como STb y STH). La ltima toxina no es activa en el ensayo del ratn lactante. Estos genes se han clonado y las secuencias de nucletidos de la regin codificante STa y STb se ha determinado.
156
Tabla 5. Lista parcial de pruebas comercialmente disponibles basadas en ensayos de anticuerpos para la deteccin de patgenos y toxinas*. Escherichia coli EHEC**c O157:H7 RIM E. coli O157 Prolex Ecolex O157 Wellcolex O157 E. coli O157 O157&H7 PetrifilmHEC EZ COLI Dynabeads EHEC-TEK Assurance
e
LA LA LA LA LA LA Ser Ab-blot Tube-EIA Ab-beads ELISA ELISA ELISA ELISA ELISA ELISA ELISA ELISA ELISA EIA/capture Ab-ppt Ab-ppt Ab-ppt Ab-ppt ELFAb ELISAb ELISA ELISA RPLA
REMEL Unipath PRO-LAB Orion Diagnostica Murex TechLab Difco 3M Difco Dynal Organon-Teknika BioControl 3M Canada TECRA LMD Lab Meridian Binax Microgen Diffchamb TECRA BioControl Neogen Universal HealthWatch Meridian bioMerieux Foss MicroCarb Meridian Denka Seiken
HECO157 TECRA E. coli O157 Premier O157 E. coli O157:H7 E. coli Rapitest Transia Card E. coli O157 E. coli O157 VIP
e
Reveal Quix Rapid O157 ImmunoCardSTAT VIDAS EiaFOSS Shiga toxina (Stx) VEROTEST Premier EHEC Verotox-F
157
ETECc Toxina labil (LT) Toxina (ST) Enterotoxina SET-EIA SET-RPLA TECRAe Transia Plate SE RIDASCREEN VIDAS OPUS VET-RPLAd
a
VET-RPLA
RPLA ELISA
Oxoid Oxoid
estable E. coli ST
ELISA RPLA ELISA ELISA ELISA ELFA

b b
Toxin Technology Unipath TECRA Diffchamb R-Biopharm bioMerieux TECRA Unipath
ELISA RPLA
* Tabla modificada de: Feng, P., App.I., FDA Bacteriological Analytical Manual, 8A ed. Abreviaturas: ELISA, ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzima; ELFA, ensayo por
fluorescencia ligado a enzima; RPLA, aglutinacin pasiva reversa de ltex; LA, aglutinacin de ltex; Ab-ppt, inmunoprecipitatin.
b
ELISA automatizada.
Reaccin en cadena de la polimerasa.

b c d e
Diagnstico bacteriano por nucleacin de hielo. EHEC - E. coli Enterohemorgica; ETEC - E. coli enterotoxignica. Tambin detecta la enterotoxina LT de E. coli. Adoptado por AOAC.
** ATENCION: a menos que los ensayos afirmen que son especficos para el serotipo O157: H7, la mayora de estas pruebas slo detectan el antgeno O157, por lo que tambin reaccionan con las cepas O157 que no son del serotipo H7. Estas cepas O157 no H7, por lo general no producen Shiga toxinas y son consideradas como no patgenas para los humanos. Adems, algunos anticuerpos para O157 tambin pueden producir reacciones cruzadas con Citrobacter, E. hermanii y otros organismos entricos. NOTA: Esta tabla es solamente una referencia general y enlista los mtodos disponibles conocidos. La presencia en esta lista no indica la verificacin, endose o la aprobacin de la FDA para su uso en anlisis de alimentos.
9.4.2 Pruebas para E. coli enteroinvasiva (EIEC)
158
Si un aislado es sospechoso de ser EIEC, el potencial invasivo de la cepa puede ser probado mediante la prueba de PCR punto final usando la secuencia del gen invA de EIEC.
Oligos tomados de Lampel y col. (1990): KL1 (5'-TAATACTCCTGAACGGCG-3', oligo sentido) 18 bases de longitud, temperatura de disociacin 54 C. KL8 (5'-TTAGGTGTCGGCTTTTCTG-3', oligo antisentido) 19 bases de longitud, temperatura de disociacin 52 C. Precaucin: Dado que tanto EIEC y Shigella darn resultados positivos en las reacciones de PCR con esas sondas, es fundamental que los organismos sean identificados primero como E. coli.
Oligos tomados de Nataro y Kaper, 1998 5'-CTGGATGGTATGGTGAGG-3' 5'-GGAGGCCAACAATTATTTCC-3'
9.4.3 Pruebas para E. coli enteropatgena (EPEC) Las cepas EPEC se identifican a partir de 3 caractersticas fundamentales: la adherencia, la eficacia de la lesin (A/E), la adherencia localizada en las clulas y la ausencia de produccin de Shiga toxina (Stx). Este ltimo rasgo tambin se utiliza para distinguir las cepas de EPEC de las cepas EHEC. Existen sondas de PCR para el plsmido EAF que codifica para la adherencia localizada y el gen eae que codifica para la intimina que causa el fenotipo A/E. Precaucin: Existen mltiples variantes del gen eae y algunas cepas EPEC llevan variantes del gen eae idnticos a los serotipos de EHEC, por lo que estas pruebas detectan las cepas patgenas de ambos grupos.
Oligos tomados de Nataro y Kaper, 1998 EAF 5'-CAGGGTAAAAGAAAGATGATAA-3' 5'-TATGGGGACCATGTATTATCA-3'
9.5 Procedimiento para la amplificacin de secuencias de genes txicos de E. coli usando caldo de enriquecimiento APW mediante PCR de punto final. Preparacin de las muestras y enriquecimiento con APW 9.5.1 Preparacin del lisado enriquecido en APW. Preparar lavados o mezclas con APW. Muestrear y congelar de manera inmediata. Despus del enriquecimiento (6 h 24 h), preparar lisados crudos
159
de APW para PCR mediante el calentamiento a ebullicin de 1 ml de las muestras en tubos de 1.5 ml durante aproximadamente 5 min. Los lisados debern ser usados para el ensayo de PCR de manera inmediata o almacenar en congelamiento a -20 C hasta su uso. NOTA: Debido a las enormes posibilidades de amplificacin con PCR, pequeas cantidades de contaminacin podran generar falsos positivos. Es recomendable que la preparacin de la muestra, preparacin de la reaccin y el anlisis de los productos de PCR deben estar separados fsicamente uno de otro para minimizar la contaminacin. Usar puntas de pipetas resistentes a aerosol para preparar las muestras y los reactivos para las reacciones de PCR y si es posible separar un juego de pipetas para el anlisis de los productos de reaccin.
9.5.2 Preparacin de la reaccin de PCR. Para minimizar la contaminacin cruzada de los reactivos de PCR es recomendable que las mezclas de soluciones maestras sean separadas en alcuotas y almacenadas en congelamiento. Las mezclas maestras debern contener todos los reactivos excepto la Taq polimerasa y los lisados a amplificar. Las reacciones finales debern contener 10 mM TrisHCl, pH 8.3; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 M de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; de 2 % a 5% (v/v) del lisado APW; 0.5 M de cada oligo (ver 9.4.1-9.4.3) y 2.5 U Taq polimerasa por 100 l; los volmenes de reaccin de 25 l -100 l pueden ser utilizados. Adicionar la Taq polimerasa a la mezcla maestra y adicionar el lisado hasta homogeneizar, todo dentro de un tubo de reaccin de 0.6 ml. Cubrir con aproximadamente 50 l -70 l de aceite mineral.
9.5.3 Temperatura de los ciclos. Mientras exista cierta variabilidad en la dinmica del calentamiento y la refrigeracin de los termocicladores de diferentes fabricantes, el uso del rgimen de ciclos de temperatura siguiente, debe producir una amplificacin eficaz del fragmento del gen ctx: desnaturalizacin durante 1 min a 94 C, la hibridacin del oligo durante 1 minuto a 55 C y la extensin del oligo a 72 C durante 1 min, repetido durante no ms de 35 ciclos. El aumento en el nmero de ciclos ms all de 35 ciclos a menudo conduce a la formacin de productos de amplificacin no especficos, incluyendo dmeros de cebadores.
9.5.4 Anlisis en gel de agarosa de los productos de PCR. Mezclar porciones de 10 l -20 l de las reacciones de PCR con amortiguador de carga de gel 6X y cargar en los pocillos de muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8% sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de etidio. Despus de la apropiada migracin con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el gel de agarosa
160
con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relacin a la migracin del marcador de peso molecular. Tome fotografas Polaroid o digitales de los geles para documentar los resultados.
9.5.5 Controles adecuados. No se puede exagerar la necesidad de una serie de reacciones de control para garantizar una interpretacin precisa de los resultados de PCR. Como mnimo, para el anlisis por PCR de tipos de alimentos previamente optimizados para este mtodo, incluir un control de contaminacin con mezcla maestra que no contiene lisado y un control positivo de E. coli APW en todos los anlisis. Para cada mezcla nueva de alimento para ser analizado por este mtodo de PCR, se deben determinar los posibles efectos inhibitorios de estos los alimentos. Mnimamente, esto implica la adicin de 1 ml de una dilucin 1:10 y 1:100 de la mezcla APW post-enriquecimiento con aproximadamente 5 x 106 organismos por ml (o una cantidad equivalente de lisado de control positivo). Una comparacin directa de estas muestras enriquecidas con el lisado APW (sin alimento) que contenga nmeros idnticos de clulas ctx+, permitir determinar si se produce cualquier inhibicin en cualquiera de las dos concentraciones de alimento y prevendr la aparicin de falsos negativos. Es poco probable que los alimentos lavados (por ejemplo, frutas y verduras) inhiban la reaccin de PCR a menos que los frutos estn magullados y el lavado aporte acidez excesiva para el APW lavado.
9.6 Mtodo de deteccin para E. coli del serotipo O157:H7 a partir de los alimentos. Este mtodo de deteccin utiliza agua peptonada amortiguada modificada con piruvato (mBPWp), la cual contiene varios reactivos antimicrobianos que inhiben efectivamente el crecimiento de la flora normal y los competidores no objetivo, sin embargo, permite el crecimiento de las clulas viables de O157:H7 (incluyendo otras STEC) y es capaz de detectar <1 ufc/g en los alimentos.
El ensayo de PCR en tiempo real configurado tanto para las plataformas del SmartCycler II o LightCycler 2.0, es especfico para los genes stx1 y stx2 y para el polimorfismo de un solo nucletido +93 en el gen uidA que codifican para la enzima -D-glucuronidasa (GUD). El SNP +93 est altamente conservado en las cepas O157:H7 y O157:H- que producen Stx y sirve como un marcador para la identificacin precisa de estos patgenos. El ensayo de PCR en tiempo real tambin detecta otras cepas STEC, algunas de las cuales son conocidos patgenos humanos.
Las muestras que son positivas en la deteccin por PCR en tiempo real, requieren la confirmacin por cultivo, involucrando el crecimiento en placas con agar diferencial para establecer la
161
incapacidad de la cepa para fermentar el sorbitol, identificar el aislado como E. coli, y tipificar serolgicamente para los antgenos O157 y H7. Tambin es aconsejable que los aislados se pongan a prueba una vez ms por PCR para los genes stx1 y stx2 para confirmar su potencial toxicolgico.
9.7 Deteccin con PCR en tiempo real A continuacin se describe el montaje de PCR en tiempo real y los protocolos de anlisis de datos para dos plataformas de instrumentos; SmartCycler II y Light Cycler 2.0. El uso de otras plataformas y protocolos debe ser validado primero.
1. Preparacin del ADN plantilla: a. Transferir 1 ml del enriquecimiento de toda la noche a un tubo de microcentrfuga y centrifugarlo a 12 000 x g por 3 min. b. Retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla completamente en 1 ml 0.85 % NaCl. c. Centrifugar a 12 000 x g por 3 min. d. Retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla completamente en 1 ml de agua estril. e. Colocar en un bao de agua o bloque de calentamiento a 100 C por 10 min. f. Centrifugar a 12 000 x g por 1 minuto, retirar y guardar el sobrenadante como ADN plantilla (ste puede congelarse para pruebas futuras de PCR mnimo a -20 C). g. Hacer una dilucin 1:10 de esta plantilla y usar 1 l para la prueba de PCR en tiempo real. h. Para los cultivos puros (incluyendo los cultivos control), suspender 1 ml del caldo de cultivo o una colonia crecida en agar, en solucin salina 0.85 % y prepararlos como se indic anteriormente (pasos a-g). Las plantillas pueden ser congeladas para su posterior uso a mnimo -20 C. 2. Controles de PCR: a. Para un control positivo de PCR incluir una plantilla de E. coli O157:H7 de la cepa ATCC 43895 (EDL 933) o ATCC 43894, ambas cepas poseen los tres genes de inters (stx1+, stx2+ y uidA+). b. Si no se incorpora un control de amplificacin interno en la reaccin, preparar un tubo de reaccin incluyendo 1 l de una dilucin 1:10 de la plantilla control EDL 933 y 1 l de una dilucin 1:10 de la plantilla de la muestra del alimento. c. Incluir siempre un tubo de control negativo sin plantilla (agua) en cada corrida. 3. Smart Cycler II Ensamble de reaccin y protocolo de anlisis de datos: a. Ensamble de la reaccin
162
i.
Preparar una mezcla maestra de PCR a partir de los componentes de reaccin y las concentraciones finales para STEC/O157 enlistadas en la Tabla 4. Mantenga todas las reacciones y los reactivos descongelados en hielo. Alternativamente se puede preparar una mezcla maestra de PCR mediante el paquete inserto para STEC/O157 CSR y OmmiMix HS o SmartMix HM.
ii. iii. iv.
Aadir 24 l de mezcla maestra a cada tubo SmartCycler y taparlo libremente. Aadir 1 l de la plantilla de muestra o control y taparlo con fuerza. Centrifugue brevemente para llevar todo el lquido a la parte inferior del tubo y colocarlo en el termociclador.
v.
Crear una "corrida" en la SmartCycler II. D a cada corrida un nombre de corrida nica, seleccione el conjunto de colorante FTTC25, seleccione el protocolo de PCR de 2 pasos como se describe a continuacin y asigne los lugares apropiados en el bloque SC.
Paso Activacin inicial 40 ciclos
Criterio 60 s a 95 C 10 s a 94 C, (ptica apagado) 40 s a 63 C, (ptica encendido)
Tabla 4. Componentes de reaccin para el protocolo de amplificacin Smart Cycler II1. Volumen/rxn Ajustar a 25 l 2 0.625 l 0.625 l 0.625 l 0.375 l 0.625 l 0.625 l 0.625 l 0.375 l Componente Agua destilada estril Oligo stx1F934 (10 M solucin de trabajo) Oligo stx1R1042 (10 M solucin de trabajo) Oligo stx2F1218 (10 M solucin de trabajo) Oligo IAC55F (10 M solucin de trabajo) Oligo stx2R1300 (10 M solucin de trabajo) Oligo uidAF241 (10 M solucin de trabajo) Oligo uidAR383 (10 M solucin de trabajo) Oligo IAC186R (10 M solucin de trabajo) 0.25 M 0.25 M 0.25 M 0.15 M 0.25 M 0.25 M 0.25 M 0.15 M Concentracin final
163
0.375 l
Sonda stx1PTxRd990 (10 M solucin de trabajo) Sonda stx2PFAM1249 (10 M solucin de trabajo) Sonda uidAPTET-MGB266 (10 M solucin de trabajo) Sonda ICPCy5 (10 M solucin de trabajo) Plantilla de ADN IAC
3
0.15 M
0.0625 l
0.025 M
0.25 l 0.375 l
0.1 M 0.15 M
0.5 esferas 1-5 l

1
OmniMix-HS o SmartMix-HS Plantilla (Muestra o control)
Todos los oligos, sondas as como tambin los oligos y sondas de ADN IC se encuentran
liofilizados en las esferas CSR STEC/O157.

2 3
Se adicionar el volumen de agua estril adecuado dependiendo del volumen de plantilla a utilizar. Molcula de cido nucleico de longitud completa (252 pb) de control interno como se describe en
U.S. Patent Application 0060166232. La cantidad de plantilla IAC necesita ajustarse dependiendo de la concentracin de la solucin madre para reportar el umbral de ciclo en alrededor de 25 ciclos35 ciclos cuando ningn inhibidor est presente en la reaccin.
4. Anlisis de datos cualitativos En el instrumento SmartCycler II, establezca los siguientes parmetros de anlisis para FAM, TET, TxRd y canales Cy5. Actualice los parmetros de anlisis si stos se cambian antes de registrar los resultados. Nota: El umbral de ciclo (Ct) del control interno (CI) es especfico para cada lote de CSR (Ct = 25-35). Si el Ct no se presenta consistentemente en la IC (Cy5, canal 4) dirija el tubo de control negativo slo a 15 fsu. Recomendaciones especficas del lote para el establecimiento manual del umbral para el Cy5 pueden ser solicitadas. Usage: Assay Curve Analysis: Primary Threshold Setting: Manual Manual Threshold Fluorescence Units: 15.0 Auto Min Cycle: 5 Auto Max Cycle: 10 Valid Min Cycle: 3 Valid Max. Cycle: 60
164
Background subtraction: ON Boxcar Avg. Cycles: 0 Background Min. Cycle: 5 Background Max. Cycle: 40
Las curvas de fluorescencia principales que cruzan el umbral ser registrado como "POS" y el nmero del ciclo cuando se cruz el umbral se mostrar en la tabla de resultados (Figura 1A). Los resultados negativos se muestran como "NEG". Los FAM, TET, TxRd y los canales de Cy5 se correlacionan con stx2, +93 uidA, stx1 y los IC objetivo, respectivamente. Los resultados tambin se pueden ver de forma grfica. Por ejemplo, la Figura 1B representa una grfica de los cuatro canales para una cepa aislada EDL 933 de E. coli O157:H7 que lleva los 3 objetivos. Figura 1. Ejemplo del resultado de salida del Smart Cycler II. A. Resultados vistos en forma de tabla, B. representacin grfica de los resultados. A. Resultados de la vista de tabla
B. Vista grfica de los resultados
5. Protocolo LightCycler 2.0
165
a. Archivo de compensacin de color: Antes de la configuracin es necesario ejecutar un archivo de compensacin de color para los mltiples tintes [para una de las sondas de fluorescena marcadas utilizadas en este experimento (es decir stx1 FL P524), stx1 610LC 552, stx2 670LC 670, uidA 705LC 288 o tener archivos de compensacin equivalentes en el instrumento. Consultar el manual de instrucciones para la corrida y almacenamiento de un archivo de compensacin de color. Si el archivo de compensacin del color ya existe para los canales adecuados, proceder a continuacin con la ejecucin del programa de la muestra. b. Ensamble de la reaccin: i. Preparar una mezcla maestra de acuerdo con la Tabla 5 para obtener el nmero deseado de reacciones. Tabla 5. Componentes de reaccin para el protocolo de amplificacin LightCycler 2.0 Volumen/rxn Ajustar a 18 l 0.27 l 0.90 l 0.27 l 0.90 l 0.54 l 0.36 l 0.36 l 0.36 l 0.36 l 0.36 l 0.36 l 0.36 l 1.44 l 1.8 l 1-5 l
1 1
Componente Agua destilada estril Oligo stx1F406 (10 M solucin de trabajo) Oligo stx1R667 (10 M solucin de trabajo) Oligo stx2F492 (10 M solucin de trabajo) Oligo stx2R737 (10 M solucin de trabajo) Oligo uidAF241 (10 M solucin de trabajo) Oligo uidAR383 (10 M solucin de trabajo) Sonda stx1 610LC552 (10 M solucin de trabajo) Sonda stx1 FL524 (10 M solucin de trabajo) Sonda stx2 670LC670 (10 M solucin de trabajo) Sonda stx2 FL642 (10 M solucin de trabajo) Sonda uidA 705LC288 (10 M solucin de trabajo) Sonda uidA FL319 (10 M solucin de trabajo) MgCl2 (25 mM) FastStart DNA Master2 Plantilla (muestra o control)
Concentracin final
0.15 M 0.50 M 0.15 M 0.50 M 0.30 M 0.20 M 0.20 M 0.20 M 0.20 M 0.20 M 0.20 M 0.20 M 3.0 mM
El volumen de reaccin se ajusta a 18 l en lugar de los 20 l estndares. La cantidad apropiada
de agua destilada estril se aade en funcin del volumen de la plantilla muestra utilizada.
2
Preparar las mezclas de sondas de hibridacin grado M FastStart DNA Master segn lo
especificado por el fabricante.
166
ii.
Asegure una completa mezcla en el tubo pipeteando suavemente o con agitacin lento, y centrifugue rpidamente el tubo para que el contenido se vaya al fondo.
iii.
Pipetear 17 l de la mezcla maestra al nmero deseado de tubos capilares de vidrio (de 20 l de capacidad), incluidos los controles.
iv.
Aadir 1 l de ADN plantilla a cada uno de los capilares para completar un volumen total de 18 l y colocar la tapa.
v. vi. vii.
Crear un nuevo experimento LightCycler. Programe la corrida en 4 segmentos (Tabla 6) en su instrumento LightCycler. Introducir la informacin de programacin como se indica:: Canal por defecto: 530 Temperatura de solicitud: 30 Max. Pos Solicitud: Nmero de muestras a ser analizadas en el instrumento: 6 Ch. Capacidad del capilar: 20 l
viii.
Cargar los capilares dentro del carrusel de tubos de 20 l y coloque el carrusel en la centrfuga para bajar las muestras contenidas en los tubos. Nota: Los tubos pueden ser centrifugados de manera individual usando adaptadores apropiados. Coloque el carrusel en el LightCycler y en el mdulo de corrida comience la corrida". Introduzca un nombre de corrida nico y contine. Dentro del mdulo muestras, introduzca un identificador en el lugar del capilar.
ix.
x.
Tabla 6. Parmetros de programa para LightCycler Temperatura de los objetivos Nombre del programa Cicl os Modo de Anlisis Velocid Objeti Manten Objeti ad de la vo er vo Sec rampa (C) (m o s) (C) (C/s) 95 10 m 10 s 40 s 0s 15 s 0s 20 20 20 20 20 0.1 0 0 0 0 0 0 Retra Tama so en o de Modo de la la adquisici etapa etapa n (ciclos (C) ) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ninguno Ninguno nico Ninguno Ninguno Continuo
Activacin
ninguno
Amplificaci 40 n
cuantificaci 95 n 63 fundido 95 55 95
Fundido
curvas
167
Enfriamient 1 o
ninguno
40
30 s
20
Ninguno
c. Anlisis cuantitativo de los datos: i. Seleccionar Anlisis de la barra del men. Escoger Deteccin Cualitativa bajo el ttulo Anlisis de amplificacin. ii. Bajo la "Compensacin de color" del men desplegable, seleccionar el archivo de compensacin de color previamente creado por este ensayo. iii. Seleccionar el canal 610 en el men desplegable que corresponder con el gen stx1 objetivo. Haga clic en la pestaa "Avanzado" y ampli la barra de la ventana que le permitir ver el CP (punto de cruce) y la puntuacin de los valores asignados a la llamada. Los datos pueden ser registrados capturando la pantalla e importar en Excel o Word a travs de las instrucciones del fabricante o siguiendo los procedimientos establecidos. iv. v. Seleccione el canal 670 (stx2) en el men desplegable y repita el paso 3. Seleccione el canal 705 (uidA) en el men desplegable y repita el paso 3. d. Anlisis de la curva de fusin de stx1, stx2 y uidA +93 SNP (O157: H7): i. Seleccione "Anlisis" en la barra de men superior. Seleccione la opcin "Llamar Tm" en la seccin "Anlisis de la curva de fusin" ii. Bajo la "Compensacin de color" del men desplegable, seleccione el archivo de compensacin del color creado previamente para este ensayo. iii. Seleccione el canal 610 en el men desplegable de canal que corresponder con los genes stx1 objetivo. En la seccin del men desplegable "Display" seleccione la pestaa con la opcin "Altura mxima". Ajuste la ventana para ver los datos si es necesario. iv. v. Un pico predominante de fusin alrededor de 68 C es indicativo de stx1. Seleccione el canal 670 (stx2) del men desplegable. stx2 exhibe un pico de fusin predominante alrededor de 70 C. vi. Seleccione el canal 705 (uidA) del men desplegable. Los picos de fusin predominante son los siguientes: E. coli Tm 65 C E. coli O157:H7 Tm 71 C Nota: Si hay un pico de fusin a ~ 71 C es positivo para O157: H7. Tambin puede haber un pico de fusin a ~ 65 C cuando alguna otra E. coli pueda estar presente.
168
Si la muestra contiene el gen stx1 y stx2, se le denomina "positivo" en el mdulo de deteccin cualitativo para el canal 610 y 670 respectivamente. Ninguno de los genes est presentes si es "negativo" en ambos canales. La muestra es positiva para el +93 uidA SNP indicativo de O157:H7 si el mdulo de deteccin cualitativo para el canal 705 muestra "positivo" y un pico de fusin se observa en ~ 71 C. Otros E. coli sern "positivos" en el canal 705 del mdulo de deteccin cualitativo, pero no presentar un pico de fusin a 71 C.
Figura 2. Ejemplo del resultado de salida de Light Cycler 2.0. A. Resultados de amplificacin, B. Resultados de la curva de fusin. A. Llamada de resultados, punto de cruce (CP) y grfico de la curva de amplificacin para stx2 (Canal 670). Pantallas de resultados similares para stx1 en el canal 610.
B. Vista de resultados del anlisis de la curva de fusin para uidA +93 SNP, (canal 705). O157: H7 tienen una temperatura de fusin (Tm) de ~ 71 C en comparacin con una Tm de ~ 65 C para E. coli.
169
6. Interpretacin de los resultados del PCR en tiempo real (Smart Cycler II y LightCycler 2,0) i. Muestras negativas: Los tres genes objetivo - stx1, stx2 y +93 uidA SNP son "negativos" y los picos de control de PCR son positivos para uno o ms objetivos. Si un control interno (IC) se incorpora en la reaccin como esferas CSR y es positivo, indicara que las reacciones funcionaron correctamente. No se necesitan ms anlisis. ii. Probables muestras O157 positivas: Si el +93 uidA SNP objetivo es positivo por s mismo o en combinacin con cualquier positivo de stx1, stx2 o ambos. Proceda a la seccin 9.8 para el aislamiento del cultivo y la confirmacin. iii. Probables muestras STEC positivas: Si el +93 uidA SNP objetivo es negativo pero cualquiera o ambos stx1 y stx2 son positivos, la muestra puede contener un STEC no-O157 o posiblemente el +93 uidA SNP objetivo no se amplific por encima del ruido de fondo. Contine con la seccin 9.8. Tambin vea la seccin 9.9, para obtener informacin adicional. NOTA: Es posible tener una IC negativa cuando uno o ms genes objetivos son positivos, la amplificacin de los genes objetivo puede competir con el control interno de los reactivos disponibles. En esos casos, el anlisis sigue siendo vlido, siempre que la amplificacin del gen objetivo haya cruzado el umbral para indicar el xito de la PCR. Contine con la seccin P para el aislamiento. Sin embargo, si todos los genes objetivos son negativos, as como los picos del control de los alimentos o IC se invalida el anlisis de PCR. Solucionar los problemas de la reaccin y vuelva a ejecutar el ensayo o estre en medio de enriquecimiento como se describe en la seccin 9.8.
170
9.8 Asilamiento del cultivo y anlisis presuntivo del aislado. Para las muestras enriquecidas durante la noche que se encuentran como probable positivo mediante el ensayo de PCR en tiempo real, se requiere la confirmacin del cultivo. Del mismo modo, para las muestras que no han sido analizadas por PCR en tiempo real siga estos procedimientos para el aislamiento del cultivo. 9.8.1 Aislamiento del cultivo. a. Realice diluciones seriadas de la muestra enriquecida durante la noche en amortiguador fosfato de Butterfield (R11) y siembre en placa las diluciones apropiadas (normalmente 0.05 mL de las diluciones 10-2 y 10-4 debe producir aproximadamente 100 colonias-300 colonias aisladas) por duplicado en TC-SMAC y un agar cromgeno (agar Rainbow O157 o agar R&F E. coli O157: H7). Tambin, de manera opcional se puede incluir una caja estriada. b. Incubar las placas a 37 C 1 C durante 18 h a 24 h. Las colonias O157:H7 tpicas en TC-SMAC son incoloras o neutro/gris con un centro color humo y de 1 mm-2 mm de dimetro. Bacterias fermentadoras de sorbitol tales como la mayora de E. coli aparecen como colonias de color rosa a rojo. En agar Rainbow O157 o agar R&F E. coli O157: H7, las colonias de E. coli O157H7 debe aparecer como colonias color negro o negro azulado.
171
Figura 3. Apariencia tpica de E. coli O157:H7 en TC-SMAC, agar Rainbow O157 y agar R&F E. coli O157:H7.
Colonias tpicas de E. coli O157:H7 en agar selectivo
c. Analice colonias tpicas tomando una porcin de cada colonia sospechosa aislada del agar de aislamiento y realice pruebas para el antgeno O157 por aglutinacin de ltex (Remel kit). d. Tome todas las colonias tpicas que den positivo (hasta 10, si > 10 estn presentes) en el agar de aislamiento y estre en placas TSAYE para comprobar su pureza. e. Coloque un disco ColiComplete (CC, BioControl, Bellevue, WA) en el rea ms densa del estriado en la placa TSAYE. Preparar una placa de TSAYE similar utilizando una cepa de E. coli MUG-positiva como control positivo. Incubar las placas 18 horas-24 horas a 37 C 1 C. CC posee un ensayo cromognico para galactopiranosidasa (X-gal) y un ensayo fluorognico para glucuronidasa (MUG) en el mismo disco. El control positivo debe mostrar color azul sobre y alrededor del disco (indicativo de coliformes) y fluorescencia azul alrededor del disco bajo luz UV de onda larga (365 nm) (indicativo de E. coli). Las cepas O157:H7 son X-gal (+) pero MUG (-).
172
Figura 4. Resultados del disco ColiComplete (CC) para E. coli y E. coli O157:H7
f. Prueba de la mancha de indol: Ponga en contacto el crecimiento de la placa TSAYE con un papel filtro humedecido con el reactivo de Kovac. E. coli O157:H7 es indol positivo.
173
Figura 5. Resultados indol positivos tpicos para E. coli O157:H7.
9.9 Pruebas confirmatorias del aislado 9.9.1 Para las colonias tpicas que muestran ser X-gal positivo, MUG negativo e indol positivo, realice las siguientes pruebas de confirmacin de la colonia aislada en TSAYE. a. Confirmar la presencia de la O157 y antgenos H7 utilizando antisueros comerciales y siguiendo las instrucciones del fabricante. RIM E. coli O157:H7 Latex Test (Remel, Lenexa, KS, 800-255-6730), o equivalente proporciona resultados satisfactorios. NOTA: Si el aislamiento es O157 y H7 positivo, es evidencia de que el aislado es del serotipo O157:H7. Pero si el aislado es O157 (+) pero H7 (-), proceder con pasos de confirmacin descritos a continuacin, ya que puede ser una variante no mvil (O157:NM), por lo tanto, tiene que ser ensayado mediante PCR para determinar su potencial toxignico. El aislamiento tambin se puede subcultivar en agar sangre para inducir la motilidad y reanalizar la reaccin H7. Precaucin: Asegrese de probar el aislamiento con el ltex de control suministrado con el kit, para descartar la posibilidad de cepas de E. coli autoaglutinantes que reaccionarn con los dos reactivos. Adems, no utilice el reactivo ltex H7 sin probar primero con el reactivo O157 debido a que otros serotipos de E. coli tambin puede llevar el antgeno H7.
174
Figura 6. Resultado de aglutinacin de latex tpico para E. coli O157:H7.
b. Pruebe las cepas O157 y H7 positivas con API20E o VITEK para identificar como E. coli. NOTA: Un aislado que es sorbitol (-), indol (+), MUG (-), serolgica (+) para O157 y H7 y se identifica como E. coli es un positivo confirmado para E. coli O157: H7. c. Los aislados que han sido confirmados como cepas O157:H7 y cepas que son O157 (+) pero H7 (-), deben ser reexaminados para verificar su potencial toxignico. Hay varios ensayos que se pueden utilizar como el PCR en tiempo real (Smart Cycler II o LightCycler 2.0) y el otro es 5P PCR multiplex que simultneamente ensaya para stx1, stx2, el +93 uidA SNP, as como otros 2 factores de virulencia O157:H7: los de los genes de enterohemolisina (ehxA) y el alelo gamma () intimina (eae), que se encuentra principalmente en O157:H7 y otros pocos serotipos. El protocolo 5P se describe a continuacin.
9.9.2 5P PCR Multiplex para la confirmacin de O157:H7. i. Las secuencias de los oligos y los tamaos esperados de los amplicones de 5P PCR se muestran en la Tabla 7.
175
ii. Para el control positivo, usar el ADN de una cepa O157:H7, tal como EDL933 o cualquier otra cepa O157:H7 que se conoce como portadora de todos los 5 genes objetivos. iii. Preparar una mezcla maestra de oligos 10X que contenga concentraciones 2 000 nM de cada uno de los 10 cebadores. La mezcla maestra de cebadores se puede almacenar congelado a -20 C. Usar 5 l por 50 l de volumen de reaccin para producir una concentracin de uso final de 200 nM de cada cebador. iv. Usar el crecimiento de la placa en el paso TSAYE 9.9.1 para preparar moldes de ADN para el anlisis de PCR. Preparar el molde de ADN mediante la resuspensin de una colonia o una asada de la siembra crecida en TSAYE en 100 l de agua. Mezclar y calentar durante 5 min en un bao de agua hirviendo. Centrifugar para peletizar los desechos. Utilizar 2 l de reaccin por sobrenadante. Las plantillas pueden ser almacenadas congeladas a -20 C. v. La mezcla de PCR de 50 l contienen amortiguador de Taq polimerasa 1X (Qiagen, Valencia, CA), 3 mM MgCl2, 250 mM de dNTP, 2 l de plantilla de ADN crudo, mezcla maestra de oligos 1X, 3.75 U de HotStarTaq (Qiagen) y agua estril. Las condiciones de PCR son: 95 C durante 15 min, luego los 25 ciclos, consistiendo cada ciclo de: 95 C durante 1 min, 56 C por 1 min y 72 C durante 1 min y una extensin final a 72 C de 5 min. Examinar los amplicones en electroforesis en gel de agarosa (1 %) en 1X TBE (Trisborato-EDTA) pH 8.2. Los resultados esperados se muestran en la figura 7.
Tabla 7. Secuencias de los oligos 5P PCR y tamaos esperados del amplicn. Gen stx1 stx2 Oligo LP30 LP31 LP43 LP44 +93 uidA PT-2 PT-3 - eaeA AE22 AE20-2 ehxA MFS1Fb Secuencia 5' - CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG - 3' 5' - CACCAGACAATGTAACCGCTG - 3' 5' - ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG - 3' 5' - GCGTCATCGTATACACAGGAGC - 3' 5' - GCGAAAACTGTGGAATTGGG - 3' 5' - TGATGCTCCATCACTTCCTG - 3' 5'- ATTACCATCCACACAGACGGT - 3' 5'- ACAGCGTGGTTGGATCAACCT - 3' 5'- GTTTATTCTGGGGCAGGCTC - 3' 166 pb 397 pb 252 pb 584 pb Amplicn 348 pb
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MFS1R
5'- CTTCACGTCACCATACATAT - 3'
Figura 7. Gel de agarosa de los amplicones 5P PCR. Las muestras son: 1. O157:H7 y 2. Genricos de E. coli (control negativo).
NOTA: Un aislado O157:H7 y O157:NM que lleva stx es considerado patgeno. Sin embargo, una cepa O157:NM que no lleva stx u otros factores de virulencia de EHEC probablemente no es patgena. Hay muchos serotipos de E. coli O157 que llevan antgenos distintos al H7 (es decir: H3, H12, H16, H38, H45, etc.), y estos a menudo no tienen factores de virulencia de EHEC. Pero las variantes de estos NM han sido aisladas.
a. La posterior caracterizacin de la cepa aislada puede hacerse por electroforesis en campo pulsado (PFGE). Utilice los protocolos estandarizados para PFGE de PulseNet para subtipificar todas las cepas de E. coli O157:H7 y O157:NM.
9.10 Mtodo de anlisis para las cepas STEC no-O157. Tanto los genes stx1 y stx2 como las formas allicas de estos genes se encuentran en ~ 200 serotipos STEC, pero muchos de ellos no han sido implicados en la enfermedad y pueden ser encontrados en la flora intestinal de los seres humanos sanos. Tenga en cuenta que el ensayo de PCR en tiempo real, que se describe en la seccin 9.7 tambin detectar estas cepas STEC. As, un resultado para
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uidA +93 (-), pero stx1 y/o stx2 (+) de PCR en tiempo real, es slo indicativo de que la muestra posiblemente contiene un STEC, pero no se debe interpretar que es una STEC patgena.
Las EHEC como grupo son un subconjunto de STEC y se compone de cepas patgenas, de las cuales la O157:H7 es la cepa prototpica (seropatotipo A). Se conocen varias cepas de EHEC que han causado enfermedad en todo el mundo: O26, O111, O121, O103, O145, O45, etc (seropatotipo B). Pueden darse situaciones, como en anlisis de alimentos asociadas con un brote de enfermedades no-O157 de EHEC, donde el analista tendr que perseguir el aislamiento de esta probable STEC (+). La siguiente seccin describe los procedimientos de aislamiento y la confirmacin de la no-O157 STEC. NOTA: El procedimiento de enriquecimiento y el ensayo de anlisis de PCR en tiempo real descrito en las secciones 9.1 y 9.8 tambin se han validado para la deteccin y la recuperacin de otros productos STEC no O157. Consulte las secciones 6, 7, 9.1, 9.6 y 9.7 para el equipo necesario, los medios y reactivos, preparacin de muestras, enriquecimiento y los procedimientos de deteccin de PCR en tiempo real. 1. Procedimiento de aislamiento. Se requiere la confirmacin en cultivo para las muestras de enriquecimiento durante la noche que se encontraron como presuntos positivos para STEC (positivo para uno o ambos de los genes objetivo de stx) por el ensayo de PCR en tiempo real. Del mismo modo, para las muestras que no han sido seleccionadas por PCR en tiempo real debido a la falta de instrumentacin, siga estos procedimientos para el aislamiento de cultivo. a. Diluya las muestras enriquecidas durante la noche de manera seriada en amortiguador fosfato de Butterfield (R11) y siembre en placa las diluciones apropiadas (normalmente 0.05 ml de las diluciones 10-2 y 10-4 deben producir aproximadamente 100 colonias-300 colonias aisladas) por duplicado en agar L-EMB (M80) y un agar cromognico como se describe en la seccin 9.8. De manera opcional tambin se puede incluir una placa estriada. b. Incubar las placas a 37 C 1 C durante 18 h a 24 h. En L-EMB, las colonias tpicas de E. coli aparecen como colonias planas y con centro oscuro, con o sin un brillo metlico. c. Elegir colonias tpicas de E. coli a partir de L-EMB (hasta 10) y la placa estriada en TSAYE con CC (vase la Seccin 9.8.1.e.). E. coli ser X-gal (+), pero puede ser MUG (+) o (-).
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Figura 8. Apariencia tpica de colonias de E. coli en agar L-EMB
d. Pruebe los aislamientos X-gal positivos con la prueba mancha de indol (Seccin 9.8.1.f.). 2. Pruebas confirmatorias de los aislados. Confirmar los aislados que aparecen como E. coli tpicos en L-EMB y son X-gal (+), MUG (+) o (-) e indol positivo. b. Identificar los aislados como E. coli utilizando API20E o VITEK siguiendo las instrucciones del fabricante. c. Los aislados identificados como E. coli necesitan ser reexaminados para el potencial toxignico (ver seccin 9.9.1.c.). d. La posterior caracterizacin de la cepa aislada puede hacerse por electroforesis en campo pulsado (PFGE). Utilice los protocolos estandarizados de PulseNet para PFGE.
10. Expresin de los resultados Informar resultado negativo o positivo con UFC/g o ml de muestra.
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11. Concordancia con normas internacionales Esta norma es prcticamente una traduccin del captulo 4A y captulo 28 del Bacteriological Analytical Manual (2011).
12. Cepas de referencia E. coli 465-97 USDA (stx1-, stx2- uidA+), ATCC43890 (stx1+, stx2-, uidA+), ATCC 43888 (stx1-, stx2- uidA+) o equivalente, ATCC 43895 (EDL 933) o ATCC 43894 (stx1+, stx2+ and uidA+).
13. Bibliografa FDA. 2011. Captulo 4A. Diarrheagenic Escherichia coli. Bacteriological Analytical Manual. Nataro, J. P. and J. B. Kaper. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 11:132201. Lampel, K.A., J.A. Jagow, M. Trucksess, and W.E. Hill. 1990. Polymerase chain reaction for detection of invasive Shigella flexneri in food. Appl. Environ. Microbiol. 56:1536-1540. Weagant, S. D., K. C. Jinneman, and J. H. Wetherington. 2000. Use of multiplex polymerase chain reaction for identification of enterotoxigenic Escherichia coli. FDA LIB 4227. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
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Propuesta de Norma Oficial Mexicana, bienes y servicios. Mtodo para la deteccin de Vibrio cholerae enterotoxignico.
PREFACIO En la elaboracin de la presente propuesta de norma participaron los siguientes organismos e instituciones: CENAM
NDICE Contenido 1. Objetivo y campo de aplicacin 2. Fundamento 3. Referencias 4. Definiciones 5. Smbolos y abreviaturas 6. Reactivos y materiales 7. Equipo 8. Preparacin de la muestra 9. Procedimiento 10. Expresin de los resultados 11. Concordancia con normas internacionales 12. Cepas de referencia 13. Bibliografa 14. Anexo
1. Objetivo y campo de aplicacin 1.1 Esta Norma Oficial Mexicana establece un mtodo general para el enriquecimiento, deteccin y confirmacin de Vibrio cholerae enterotoxignico, V. parahaemolyticus y V. vulnificus en base a sus propiedades nicas de virulencia en los alimentos para consumo humano mediante la tcnica de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y crecimiento en medios selectivos.
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1.2 Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas y morales que requieran efectuar este mtodo en productos nacionales y de importacin, para fines oficiales.
2. Fundamento 2.1 Enriquecimiento de la muestra, deteccin por medio de PCR y confirmacin morfolgica en medio selectivo. 3. Referencias Esta norma se complementa con lo siguiente: NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NOM-110-SSA1-1994 Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NOM-112-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. NOM-242-SSA1-2009, Productos y servicios. Productos de la pesca frescos, refrigerados, congelados y procesados. Especificaciones sanitarias y mtodos de prueba.
4. Definiciones Para fines de esta norma se entiende por: Dilucin primaria: es la solucin, suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporcin del diluyente. Diluciones decimales adicionales: las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilucin primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada dilucin as preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculacin de medios de cultivo. Diluciones decimales sucesivas: suspensiones o disoluciones obtenidas al mezclar un volumen determinado de la suspensin inicial con un volumen nueve veces superior de disolvente y repitiendo esta operacin con diluciones decimales sucesivas hasta llegar a un nivel de dilucin adecuado para la inoculacin del medio de cultivo.
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Mtodo: es un proceso o camino sistemtico establecido para realizar una tarea o trabajo con el fin de alcanzar un objetivo predeterminado. Procedimiento cientfico seguido en la ciencia para hallar la verdad. Un procedimiento que se usa para realizar una tarea especfica en la clase o mdulo. Muestra para el laboratorio: muestra preparada para ser enviada al laboratorio y destinada a ser utilizada para inspeccin o para anlisis. Muestra representativa: es un nmero de unidades tomadas de un lote, que han sido
seleccionadas en forma aleatoria y cuyas caractersticas son lo ms similar posible a las del lote del que procede. Norma especfica: Norma internacional o documento de apoyo que describe el anlisis de un producto determinado (o de un grupo de productos) para la deteccin o la determinacin del nmero de un microorganismo especfico (o de un grupo de microorganismos). Porcin para anlisis: muestra representativa medida (volumen o masa) tomada a partir de la muestra para el laboratorio para emplearse en la preparacin de la suspensin inicial. Procedimiento: es un trmino que hace referencia a la accin que consiste en proceder de alguna forma. El concepto, por otra parte, est vinculado a un mtodo una manera de ejecutar algo. Un procedimiento, en este sentido, consiste en seguir ciertas etapas predefinidas para desarrollar una labor de manera eficaz. Suspensin inicial (dilucin base): suspensin, disolucin o emulsin obtenida cuando un peso o volumen determinado del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las partculas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas. Suspensin inicial (dilucin primaria): suspensin, disolucin o emulsin obtenida cuando un peso o volumen determinado del producto en examen (o de una muestra de ensayo preparada a partir del producto) ha sido mezclado con una cantidad nueve veces superior de disolvente, dejando que las partculas grandes, si las hubiera, queden sedimentadas. Toma de muestra: es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad del lote o partida.
5. Smbolos y abreviaturas ms menos / signo de divisin C grado Celsius % por ciento
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cm centmetro g gramo h hora kg kilogramo l litro l microlitro M molar ml mililitro mm milmetro min minuto p peso pb pares de bases PCR reaccin en cadena de la polimerasa p. ejem. por ejemplo pH potencial de hidrgeno UFC unidades formadoras de colonias v volumen x signo de multiplicacin
6. Reactivos y materiales En caso de disponerse de frmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparacin. Las sustancias qumicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analtico. 6.1 Reactivos Agua peptonada alcalina (APW) Peptona NaCl Agua destilada Preparacin: Ajustar el pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 8.5 0.2. Distribuir en tubos con tapn de rosca. Esterilizar por 10 min a 121 C. 10.0 g 10.0 g 1 000 ml
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Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS) Extracto de levadura Peptona Sacarosa Tiosulfato de sodio Citrato de sodio Bilis seca de bovino NaCl Citrato frrico Azul de bromotimol Azul de timol Agar Agua destilada 5.0 g 10.0 g 20.0 g 10.0 g 10.0 g 8.0 g 10.0 g 1.0 g 0.04 g 0.04 g 8.0 a 18.0 g 1 000 ml
Preparacin: Aadir los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver. Llevar a ebullicin y retirar inmediatamente del fuego. NO UTILIZAR AUTOCLAVE. Enfriar a 50 C y verter en cajas Petri. Ajustar el pH a 8.6 0.2
Caldo soya tripticasa (TSB-2 % NaCl). Peptona de tripticasa (triptona) 17.0 g Peptona de fitona (soytona) Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Dextrosa Agua destilada 3.0 g 20.0 g 2.5 g 2.5 g 1 000 ml
Preparacin: Suspender los ingredientes en agua destilada y calentar suavemente hasta su completa disolucin. Distribuir 225 ml en matraces de 500 ml. Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 C. El pH final debe ser de 7.3 0.2.
Solucin salina fisiolgica 0.85 % (estril)
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NaCl Agua destilada
8.5 g 1 000 ml
Preparacin: Disolver el NaCl en el agua. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 C. Almacenar a temperatura ambiente.
Amortiguador fosfato salino (PBS), pH 7.4 NaCl Na2HPO4 anhidro KH2PO4 Agua destilada 7.65 g 0.72 g 0.210 g 1 000 ml
Preparacin: Disolver los ingredientes en agua destilada. Ajustar el pH a 7.4 (con NaOH 0.1 N). Esterilizar por 15 min a 121 C.
Agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS) Extracto de levadura Peptona Sacarosa Tiosulfato de sodio 5H2O Citato de sodio 2H2O Colato de sodio Oxgall NaCl Citrato frrico Azul de bromotimol Azul de timol Agua destilada 5.0 g 10.0 g 20.0 g 10.0 g 10.0 g 3.0 g 5.0 g 10.0 g 1.0 g 0.04 g 0.04 g 1 000 ml
Preparacin:
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Preparar en un matraz de al menos 3 veces ms grande que el volumen requerido de medio. Aadir los ingredientes al agua destilada y calentar para disolver. Llevar a ebullicin y retirar inmediatamente del fuego. NO UTILIZAR AUTOCLAVE. Enfriar a 50 C y verter en cajas Petri.
Agar modificado celobiosa-polimixina B-colistina (mCPC) Solucin 1: Peptona Extracto de carne NaCl Solucin stock de colorante 1000X Agar Agua destilada 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1.0 ml 15.0 g 900 ml
Solucin 2: Celobiosa Colistina Polimixina B Agua destilada 10.0 g 400 000 unidades 100 000 unidades 100 ml
Preparacin: Solucin 1: ajustar el pH a 7.6. Hervir para disolver el agar. Enfriar a 48 C -55 C. Solucin 2: disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave. Enfriar. Aadir los antibiticos. Adicionar la solucin 2 a la solucin 1 enfriada. Mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final: verde oscuro a verde marrn. Solucin stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 % 100 ml. Disolver los colorantes en etanol para una solucin stock al 4 % (p/v). Utilizando 1 ml de esta solucin por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por litro. Solucin 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente. Enfriar. Adicionar los antibiticos y esterilizar por filtracin. Adicionar la solucin 2 a la solucin 1 enfriada, mezclar, y distribuir en cajas Petri. El color final es de un verde oscuro a un verde caf. NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere esterilizacin por autoclave. El medio puede ser almacenado 2 semanas a temperatura de refrigeracin.
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Agar celobiosa-colistina (CC) Solucin 1: Peptona Extracto de carne NaCl Solucin stock colorante 1000X Agar Agua destilada Solucin 2: Celobiosa Colistina Agua destilada 10.0 g 400 000 unidades 100 ml 10.0 g 5.0 g 20.0 g 1.0 ml 15.0 g 900 ml
Preparacin: Solucin 1: ajustar el pH a 7.6. Hervir para disolver el agar. Enfriar a 48 C -55 C. Solucin 2: disolver la celobiosa en agua destilada con calentamiento suave. Enfriar. Aadir el antibitico. Adicionar la solucin 2 a la solucin 1 enfriada. Mezclar y distribuir en cajas Petri. Color final: verde oscuro a verde marrn. Solucin stock de colorante 1000X: Azul de bromotimol 4 g, rojo de cresol 4 g, etanol al 95 % 100 ml. Disolver los colorantes en etanol para una solucin stock al 4 % (p/v). Utilizando 1 ml de esta solucin por litro de agar mCPC da 40 mg de azul de bromotimol y 40 mg de rojo de cresol por litro. Solucin 2: Disolver la celobiosa en agua destilada calentando suavemente. Enfirar. Adicionar los antibiticos y esterilizar por filtracin. Adicionar la solucin 2 a la solucin 1 enfriada, mezclar y distribuir en cajas Petri. El color final es de un verde oscuro a un verde caf. NOTA: Este medio como el TCBS es muy inhibitorio y no requiere esterilizacin por autoclave. El medio puede ser almacenado 2 semanas a temperatura de refrigeracin.
Tiras reactivas de diagnstico y reactivos API 20E (BioMerieux) Solucin maestra de oligos de Vibrio cholerae enterotoxignico para PCR 10 pmol/l ((5'TGAAATAAAGCAGTCAGGTG-3', 5'-GGTATTCTGCACACAAATCAG-3') Taq ADN polimerasa (nativa disponible de mltiples proveedores) o Amplitaq (Perkin-Elmer)
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Solucin maestra de 2'-Deoxinucleosido-5'-trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 1.25 mM de cada dNTP Amortiguador de PCR 10X (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2) Aceite mineral ligero Agua desionizada estril 10X TBE (0.9 M Tris-borato, 0.02 M EDTA, pH 8.3) Agarosa (grado electroforesis de cidos nucleicos) Solucin de bromuro de etidio, 10 mg/ml Amortiguador de carga de muestra 6X [10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.03 % azul de bromofenol, 0.03 % cianol xileno FF, 60 % glicerol, 60 mM EDTA, Sambrook y col. 1989] Marcadores de peso molecular de ADN (p. ejem., escalera 123 pb, Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD)
7. Equipo Microondas Cajas Petri Homogeneizador Termociclador programable automtico Aparato de electroforesis en gel horizontal Fuente de poder de voltaje para electroforesis Parrilla de calentamiento Tubos para microcentrfuga Micropipetas digitales Pipetas Microcentrfuga Transiluminador UV Cmara Polaroid o digital Film Polaroid
8. Preparacin de la muestra 8.1 Preparacin de los alimentos para la identificacin de Vibrio cholerae enterotoxignico. Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo a la NOM-110-SSA1-
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1994. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
8.2 Procedimiento general para la preparacin de muestras Refrigere las muestras inmediatamente despus de su recepcin. No congelar las muestras, excepto para mantener los productos congelados hasta justo antes del anlisis. Analizar las muestras tan pronto como sea posible.
9. Procedimiento 9.1.1 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. cholerae Pesar 25 g de muestra en un frasco tarado (capacidad de aproximadamente 500 ml). Los productos tales como mariscos o verduras se pueden mezclar o se pueden cortar en trozos pequeos con tijeras estriles. Aadir 225 ml de APW al frasco o recipiente del homogeneizador. Mezclar la muestra durante 2 min a alta velocidad. Incubar el APW a 35 C 2 C durante 6 horas a 8 horas. Volver a incubar el frasco durante la noche si la muestra hubiera sido procesada de alguna forma. Para el anlisis de ostras crudas, incluir un segundo matraz tarado con 25 g de producto con 2 475 ml APW. Este matraz se incubar de 18 horas a 21 horas a 42 C 0.2 C en un bao de agua.
9.1.2 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. parahaemolyticus Pesar 50 g de muestra de mariscos en recipiente de licuadora. Obtener la superficie de los tejidos, las agallas y el intestino de los peces. Las muestras de mariscos son la carne y el lquido propio de la muestra. Normalmente se mezclan 12 animales a alta velocidad durante 90 segundos y 50 g de este homogeneizado ser utilizado para el anlisis. Para los crustceos como el camarn debe usarse el animal entero, si es posible y si es demasiado grande, se debe seleccionar la parte central que incluye las branquias y el intestino. Nota: lo mismo se recomienda para V. vulnificus Aadir 450 ml de TSB-2 % NaCl y mezclar durante 1 min a 8 000 rpm. Esto constituye la dilucin 1:10. De ser necesario preparar diluciones 1:100, 1:1 000, 1:10 000 o superiores en TSB-2 % NaCl. Para los moluscos mezclar 12 animales durante 90 segundos con un volumen igual de TSB-2 % NaCl (dilucin 1:2). Prepare una dilucin 1:10 transfiriendo 20.0 g (se recomienda que se utilice el peso porque las burbujas de aire en la dilucin 1:2 evita una transferencia volumtrica precisa) de la dilucin 1:2 a 80 ml de TSB-2 % NaCl. Pueden prepararse diluciones decimales adicionales volumtricamente; es decir, 1 ml de 1:10 a 9.,0 ml de TSB-2 % NaCl para una dilucin de 1:100.
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Para el producto que ha sido procesado, es decir calentado, secos, o congelado, inocular porciones de 3 x 10 ml de la dilucin 1:10 en 3 tubos con 10 ml de TSB-2 % NaCl 2X. Esto representa la porcin de 1 g. Del mismo modo, inocular 3 x 1 ml de las diluciones 1:10, 1:100, 1:1 000 y 1:10 000 en 10 ml de concentracin simple de TSB-2 % NaCl. Si se espera un nmero elevado de V. parahaemolyticus, la exploracin puede comenzar en la dilucin 1:10 del producto. Incubar durante toda la noche a 35 C 2 C. Centrifugar un ml de cultivo en un tubo de microcentrfuga durante 3 min a 15.000 x g. Lavar el sedimento dos veces con solucin salina fisiolgica. Resuspender el precipitado en 1.0 ml dH20 y hervir durante 10 min. Almacenar la plantilla o molde a -20 C hasta su uso.
9.1.3 Procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. parahaemolyticus Preparar una dilucin inicial 1:10 de la muestra en PBS siguiendo el procedimiento descrito para V. parahaemolyticus. Preparar diluciones decimales en PBS. Preparar una dilucin 1:10 a partir del homogeneizado de ostra como se describe a continuacin: pesar 20 gramos del homogeneizado en un frasco estril y aadir PBS para diluir hasta un peso final de 100 g. Mezclar por agitacin. Diluciones decimales adicionales pueden prepararse volumtricamente (es decir, 1 ml de 1:10 a 9.0 ml de PBS para una dilucin 1:100). Inocular porciones x 3 de 1 ml de las diluciones en 3 tubos que contengan 10 ml de APW. Si se espera un nmero bajo, porciones de 2 g (1 g de ostra) pueden ser inoculadas directamente desde el homogeneizador en 3 x 100 ml APW. Incubar los tubos durante 18 horas a 24 horas a 35 C 2 C. Centrifugar un ml de cultivo en un tubo de microcentrfuga durante 3 min a 15.000 x g. Lavar el sedimento dos veces con solucin salina fisiolgica. Resuspender el precipitado en 1.0 ml dH20 y hervir durante 10 min. Almacenar la plantilla o molde a -20 C hasta su uso.
9.2 Preparacin del lisado del enriquecimiento APW para detectar V. cholerae Preparar los lavados o mezclas con APW. Tomar las muestras y congelarlas inmediatamente (aproximadamente 1 ml). Preparar lisados crudos del APW para la PCR despus del enriquecimiento (6 h -24 h) mediante la ebullicin de las muestras de 1 ml en tubos para microcentrfuga de 1.5 ml durante aproximadamente 5 min. Los lisados pueden ser utilizados para la PCR inmediatamente o almacenarse en un congelador a -20 C hasta su posterior uso.
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NOTA: Debido a la enorme amplificacin posible con la PCR, los niveles de contaminacin que pueden dar lugar a falsos positivos deben ser minimizados. Se recomienda que la preparacin de las muestras, la puesta en marcha de la PCR y el anlisis del producto de PCR deban estar separados fsicamente, uno del otro, para minimizar la contaminacin. Como mnimo es absolutamente necesario el uso de una tcnica asptica en el manejo de todos los reactivos de PCR. Usar puntas de pipeta aerosol resistente para la preparacin de muestras y reactivo para la PCR y si es posible, deber utilizar un juego de pipetas diferente para el anlisis de productos de la PCR.
9.3 Preparacin de la reaccin de PCR para detectar V. cholerae Para minimizar la contaminacin cruzada de los reactivos de PCR es recomendable que las mezclas de soluciones maestras sean separadas en alcuotas y almacenadas en congelamiento. Las mezclas maestras debern contener todos los reactivos excepto la Taq polimerasa y los lisados a amplificar. Las reacciones finales debern contener 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 M de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP; de 2 % a 5 % (v/v) del lisado APW; 0.5 M de cada oligo y 2.5 U Taq polimerasa por 100 l; los volmenes de reaccin de 25 l -100 l pueden ser utilizados. Adicionar la Taq polimerasa a la mezcla maestra y adicionar el lisado hasta homogeneizar, todo dentro de un tubo de reaccin de 0.6 ml. Cubrir con aproximadamente 50 l 70 l de aceite mineral.
9.4 Temperatura de los ciclos para detectar V. cholerae Mientras exista cierta variabilidad en la dinmica del calentamiento y la refrigeracin de los termocicladores de diferentes fabricantes, el uso del rgimen de ciclos de temperatura siguiente, debe producir una amplificacin eficaz del fragmento del gen ctx: desnaturalizacin durante 1 min a 94 C, la hibridacin del oligo durante 1 min a 55 C y la extensin del oligo a 72 C durante 1 min, repetido durante no ms de 35 ciclos con una extensin final durante 3 min a 72 C. El aumento en el nmero de ciclos ms all de 35 ciclos, a menudo conduce a la formacin de productos de amplificacin no especficos, incluyendo dmeros de cebadores.
9.5 Anlisis en gel de agarosa de los productos de PCR para detectar V. cholerae Mezclar porciones de 10 l -20 l de las reacciones de PCR con amortiguador de carga de gel 6X y cargar en los pocillos de muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de etidio. Despus de la apropiada migracin con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar
192
las bandas en relacin a la migracin del marcador de peso molecular. Los oligos iniciadores generan un fragmento de 777 pb. Tome fotografas Polaroid o digitales de los geles para documentar los resultados.
9.6 Controles adecuados para detectar V. cholerae No se puede exagerar la necesidad de una serie de reacciones de control para garantizar una interpretacin precisa de los resultados de PCR. Como mnimo, para el anlisis por PCR de tipos de alimentos previamente optimizados para este mtodo (por ejemplo, lavados vegetales, ostras, cangrejos y camarones mezclas; Koch, et al. 1993) deben incluir en todos los anlisis una mezcla maestra de control de contaminacin que no contenga lisado y un control de APW V. cholerae positivo. Determinar los posibles efectos inhibitorios para cada mezcla de alimento nuevo a ser analizados por este mtodo PCR. Como mnimo se deber realizar la adicin de 1 ml de una dilucin 1:10 y 1:100 de la mezcla APW post-enriquecimiento con aproximadamente 5 x 106 organismos por ml (o una cantidad equivalente de lisado de control positivo). Una comparacin directa de estas muestras enriquecidas con el lisado APW (sin alimento) que contenga nmeros idnticos clulas ctx+, permitir determinar si se produce cualquier inhibicin en cualquiera de las dos concentraciones de alimento y prevendr la aparicin de falsos negativos. Es poco probable que los alimentos lavados (por ejemplo, frutas y verduras) inhiban la reaccin de PCR a menos que los frutos estn magullados y el lavado aporte acidez excesiva para el APW lavado.
9.7 Confirmacin por crecimiento en medio selectivo y pruebas bioqumicas para detectar V. cholerae. Se recomienda que los caldos de enriquecimiento con agua peptonada alcalina (APW) utilizados para el anlisis de PCR tambin se siembren en medio selectivo y se ensayen las pruebas bioqumicas descritas en el anexo B.19 Tcnicas y procedimientos para la investigacin de Vibrio cholerae de la NOM-242-SSA1-2009 para el aislamiento y la confirmacin directa de la presencia de V. cholerae en muestras que den resultados positivos de PCR.
9.7.1 Aislamiento en medio selectivo para detectar V. cholerae Preparar placas secas de agar TCBS. Transferir una asada (con asa de 3 mm) de la pelcula en la superficie del cultivo en APW a la superficie de una placa seca TCBS y estriar de una manera que producir colonias aisladas. Incubar las placas con el agar TCBS estriadas durante toda la noche (18 h a 24 h) a 35 C 2 C.
193
Las colonias tpicas de V. cholerae en agar TCBS son grandes (2 mm a 3 mm), lisas, de color amarillo y ligeramente aplanadas con centro opaco y de periferia translcida.
9.8 Otros Vibrios 9.8.1 Deteccin de V. parahaemolyticus mediante PCR Multiplex Preparar plantillas o moldes a partir de un cultivo crecido durante toda la noche a 35 C 2 C en TSB-2 % NaCl. El conjunto de oligos iniciadores que deben utilizarse para la deteccin de V. parahaemolyticus son los siguientes: Oligos iniciadores Genes tlh espcficos de la especie (450 pb) L-TL R-TL Gen trh (500 pb) VPTRH-L VPTRH-R Gen tdh (270 pb) VPTDH-L 5' aaa gcg gat tat gca gaa gca ctg 3' 5' gct act ttc tag cat ttt ctc tgc 3' 5' ttg gct tcg ata ttt tca gta tct 3' 5' cat aac aaa cat atg ccc att tcc g 3' 5' gta aag gtc tct gac ttt tgg ac 3'
VPTDH-R 5' tgg aat aga acc ttc atc ttc acc 3'
Se recomiendan los siguientes reactivos de PCR para la deteccin de V. parahaemolyticus Reactivo H2O desionizada 10 Buffer.MgCl2 dNTPs Mezcla de oligos (6 oligos) Templado o molde Taq polimerasa Volumen total Volumen de reaccin (concentracin final) 28.2 l 5.0 l 8.0 l 7.5 l 1.0 l 0.3 l 50.0 l
Se debern usar las siguientes condiciones de PCR para la deteccin de V. parahaemolyticus: Condiciones de PCR: Desnaturalizacin 94 C 94 C 3 min 1 min
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Alineamiento Extensin Extensin final Mantener
60 C 72 C 72 C 8 C
1 min 2 min 3 min Indefinido
25 ciclos
Anlisis en gel de agarosa de los productos de PCR para la deteccin de V. parahaemolyticus Mezclar 10 l de producto de PCR con 2 l de amortiguador de carga 6X y cargar en los pocillos de muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de etidio. Despus de la apropiada migracin con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relacin a la migracin del marcador de peso molecular. Tome fotografas Polaroid o digitales de los geles para documentar los resultados. Se deben incluir tanto los controles positivos como negativos del cultivo as como tambin un control de reactivo con cada corrida de PCR.
9.8.2 Deteccin de V. vulnificus por PCR Partir de las plantillas obtenidas en el procedimiento para el enriquecimiento de la muestra presuntiva de V. parahaemolyticus (9.1.3). Los oligos iniciadores para PCR vvhA son parte del gen de citolisina de la posicin 785 a la 1 303. Los oligos a utilizar son los siguientes: Vvh-785F Vvh-1303R 5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3' 5'cgc cac cca ctt tcg ggc c 3'
Se recomiendan los siguientes reactivos de PCR para la deteccin de V. vulnificus: Reactivo H2O desionizada 10 Buffer.MgCl2 dNTPs Mezcla de oligos (6 oligos) Templado o molde Taq polimerasa Volumen de reaccin (concentracin final) 28.2 l 5.0 l 8.0 l 7.5 l 1.0 l 0.3 l
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Volumen total
50.0 l
Se debern usar las siguientes condiciones de PCR para la deteccin de V. vulnificus Condiciones de PCR: Desnaturalizacin Alineamiento Extensin Extensin final Mantener 94 C 94 C 62 C 72 C 72 C 8 C 25 ciclos 10 min 1 min 1 min 1 min 10 min Indefinido
Anlisis en gel de agarosa de los productos de PCR para la deteccin de V. vulnificus Mezclar 10 l de producto de PCR con 2 l de amortiguador de carga 6X y cargar en los pocillos de muestra del gel de agarosa 1.5 %-1.8 % sumergido en 1X TBE conteniendo 1 mg/ml de bromuro de etidio. Despus de la apropiada migracin con un voltaje constante de 5 V/cm -10 V/cm, iluminar el gel de agarosa con un transiluminador UV y visualizar las bandas en relacin a la migracin del marcador de peso molecular. Tome fotografas Polaroid o digitales de los geles para documentar los resultados. Se deben incluir tanto los controles positivos como negativos del cultivo as como tambin un control de reactivo con cada corrida de PCR.
9.9 Confirmacin por crecimiento en medio selectivo y pruebas bioqumicas para detectar V. parahaemolyticus y V. vulnificus Se recomienda que los caldos de enriquecimiento utilizados para el anlisis de PCR tambin se siembren en medio selectivo y se ensayen las pruebas bioqumicas para el aislamiento y la confirmacin directa de la presencia de V. parahaemolyticus y V. vulnificus en muestras que den resultados positivos de PCR.
Estriar con un asa de 3 mm desde 1 cm de la parte superior de los tubos con APW con las tres diluciones ms altas de la muestra que mostraron crecimiento en TCBS (y agares mCPC o CC para el aislamiento de V. vulnificus). Incubar las placas de TCBS a 35 C 2 C (y las placas de mCPC o CC preferiblemente a 39 C 40 C o 35 C -37 C si no es posible a 39 C -40 C) durante toda la noche.
196
El crecimiento de colonias tpicas de V. parahaemolyticus en agar TCBS aparece como colonias redondas, opacas, verde o azul, de 2 mm a 3 mm de dimetro. Colonias interferentes competitivas de V. alginolyticus son grandes, opacas y de color amarillo. La mayora de las cepas de V. parahaemolyticus no crece en agar MCPC o CC. Si se produce el crecimiento, las colonias sern de color verde-prpura debido a la falta de fermentacin celobiosa. Purificar los aislados y almacenarlos.
La identificacin bioqumica de los aislados puede ser realizada utilizando las pruebas diagnsticas API 20E preparando una suspensin de clulas de los cultivos sospechosos en 2 % de NaCl (Anexo 1).
Cuando las colonias sean identificadas bioqumicamente finalmente como V. parahaemolyticus se debern referir a las diluciones positivas originales en el caldo de enriquecimiento y aplicar las tablas de NMP para 3 tubos descritas en la NOM-112-SSA1-1994 para el recuento final del organismo.
10. Expresin de los resultados Informar resultado negativo o positivo con UFC o NMP por g o ml de muestra.
11. Concordancia con normas internacionales Esta norma es prcticamente una traduccin y adaptacin del captulo 9 y 28 del Bacteriological Analytical Manual (2011).
12. Cepas de referencia Cepa de coleccin de Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus y V. vulnificus.
13. Bibliografa FDA. 2001. Captulo 28. Detection of enterotoxigenic Vibrio cholerae in foods by the polymerase chain reaction. Bacteriological Analytical Manual.
FDA. 2004. Captulo 9. Vibrio. Bacteriological Analytical Manual.
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Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
14. Anexo
198
Tabla 1. Caractersticas bioqumicas de Vibrionaceae patognico para el humano comnmente encontrado en alimentos marinos.
V. alginolyticus V. cholerae V. fluvialis V. furnissii V. hollisae V. metschnikovii V. mimicus V. parahaemolyticus V. vulnificus A. hydrophilia P. shigelloides ** ** Agar TCBS Agar mCPC Agar CC AGS Oxidasa Arginina dihidrolasa Lisina descarboxilasa 0 % NaCl 3 % NaCl Crecimiento 6 % NaCl en (p/v): 8 % NaCl Crecimiento a 42 C Sacarosa Y NG NG KA + + + + + + + Y P P Ka + + + + + + + + + + V S S + Y NG NG KK + + + + V V + + + + + + R S + Y NG NG KK + + + + + + + + + + R S + NG NG NG Ka + + + nd + + nd nd Y NG NG KK + + + + V V + + + + + S S + G NG NG KA + + + + + + + + + S S + G NG NG KA + + + + + + + V + + + R S + V G Y Y KA + + + + + + + + + V + S S + Y NG NG KK + + V + + + V V + V V V + + + R R + G NG NG nd + + + + + + + S S
Ornitina descarboxilasa +
10 % NaCl +
D Celobiosa Lactosa cido a partir de: Arabinosa D-Manosa + D-Manitol ONPG +
Voges+ Proskauer 10 g O/129 R
Sensibilidad 150 g S O/129 a: Gelatinasa + Ureasa
** Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides Abreviatyras: TCBS, tiosulfato-citrato-sales biliares -sacarosa; mCPC, celobiosa-polimixin B-colistina modificado; AGS, placa arginina-glucosa; Y = amarillo NG = nulo o pobre crecimiento S = susceptible nd = no determinado G = verde V = variable entre las cepas R = resistente KK = Placa alcalina / Fondo alcalino KA = Placa alcalina /Fondo cido, Ka = Placa alcalina / Fondo ligeramente cido P = prpura, V = variable ,
199
CONCLUSIONES
Con la realizacin del presente informe correspondiente a la Demanda 6.- Desarrollo de normatividad y mtodos para deteccin y medicin de organismos microbiolgicos en alimentos del proyecto CONACYT SAGARPA-2011-09-172352 Desarrollo de materiales de referencia certificados, validacin de mtodos y fortalecimiento de la infraestructura de las redes de laboratorios para la Inocuidad y Calidad Alimentaria se puede concluir de manera resumida lo siguiente: 10. En el estado actual, las metodologas microbiolgicas nacionales para el anlisis microbiolgico de productos crnicos, frutas, verduras y marinos, en comparacin con las internacionales, (metodologas propuestas y validadas por organismos de reconocimiento internacional ISO, AOAC, BAM) no son concordantes en el uso de tcnicas de biologa molecular, pruebas automticas y ensayos rpidos mediante kits comerciales, pero si son concordantes parcialmente concordantes, dependiendo del caso, con las metodologas tradicionales de identificacin bioqumica y medios selectivos. 11. Se expone la oferta y la demanda de proveedores de ensayos para anlisis de microorganismos patgenos de los alimentos y se proporciona el fundamento cientfico y la factibilidad tcnica en relacin a la actualizacin de la normatividad nacional y su aplicacin referente a estudios microbiolgicos en productos crnicos, frutas, verduras y marinos. 12. Se informa acerca de los programas internacionales implementados en materia de inocuidad de los alimentos, y se sugiere su adopcin en Mxico. 13. Una vez considerado que la presentacin de las normas internacionales se realiza por patgeno y que tenemos dos dos modelos a seguir, el de los Estados Unidos de Norteamrica y el de la Comunidad Europea. a) En el caso de seguir el modelo utilizado por Estados Unidos de Norteamrica, se sugiere elaborar un manual con los mtodos de determinacin de los patgenos en las diferentes matrices, al cual se podra hacer referencia en las normas, lo que facilitara y mantendra actualizados los mtodos de medicin sin la necesidad de esperar los largos periodos de tiempo que implican la actualizacin de una norma. Dicho manual como el presentado por CENAM en este informe podra contener los mtodos estandarizados por nuestros principales socios comerciales (en este caso Estados Unidos de Norte Amrica, la Comunidad Europa y Reino Unido) de tal forma que el usuario pueda elegir el adecuado para su propsito, sin restringirlo a un kit, equipo mtodo especifico, sin embargo sera un requisito el utilizar patrones de medicin Materiales de Referencia Certificados con los cuales se garantice la trazabilidad, incertidumbre y calidad del resultado de la medicin realizada. b) En el caso de seguir el modelo de la Comunidad Europea se sugiere tener una norma por patgeno para las diferentes matrices alimentarias de inters, en lugar de tener una norma por producto para los diferentes patgenos. 14. Considerando lo anterior, se presentan dos propuestas de norma para la evaluacin, validacin y aplicacin de nuevos mtodos para la deteccin de Vibrio cholerae, Vibrio paraemoliticus, Vibrio vulnificus y E. coli productora de shiga toxinas (STEC) en las diferentes matrices alimentarias, tomando como base lo expuesto en el BAM de los Estados Unidos de Norteamrica. 15. Se realiz un comparativo de normas nacionales y extranjeras de aplicacin actual y un estudio de factibilidad (en base a la consulta con las instituciones nacionales de
200
16.
17.
18.
19.
investigacin, laboratorios de ensayo, laboratorios de gobierno federal y del sector productivo que requieren u ofrecen el servicio de evaluacin de la inocuidad de los alimentos nacionales e internacionales) para introducir modificaciones en las normas nacionales sobre la deteccin y/o cuantificacin de microorganismos patgenos en alimentos en sus diferentes matrices. Se sugiere que las normas nacionales sean concordantes con la correspondiente seccin del BAM y con los mtodos de anlisis reconocidos a nivel internacional para la determinacin de los patgenos de inters requeridos para los productos exportables hacia los Estados Unidos de Norteamrica y/o los distintos socios comerciales de Mxico. Se sugiere la implementacin de pruebas interlaboratorio nacionales, tomando la experiencia de proveedores de ensayos de anlisis de microorganismos patgenos de los alimentos internacionales. Se propone trabajar en las comparaciones del recin formado grupo de trabajo de microbiologa del CCQM con el objetivo de desarrollar materiales de referencia nacionales tomando la experiencia del proceso de desarrollo de los MRC internacionales para la determinacin de los patgenos motivo de este estudio en alimentos. A continuacin se propone la ruta cadena de trazabilidad al mol de las mediciones en microbiologa usando el procedimiento de PCR digital, el cual es considerado como potencialmente primario.
201
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INFORME TCNICO DEL PROYECTO SECTORIAL SAGARPA CONACYT-2011-09-172352 DEMANDA 6.

Desarrollo de normatividad y mtodos para deteccin y medicin de organismos microbiolgicos en alimentos.

71 79 79 81 83 84 84 85 125 181 200 202

Agradecimientos por su contribucin en la elaboracin del presente informe tcnico

UAQ Dra. Blanca Garca Almendarez profesor-investigador de la Universidad Autnoma de Quertaro

JUSTIFICACIN DEL PROYECTO

114-SSA11994 Revisin 1995 143-SSA11995 Revisin 1997

115-SSA11994 Revisin 1995

E coli O157 Escherichia coli diarreognica

5763:Part 7:1983 Revisin 1983

Bacterias coliformes y E. coli

16654:2002 Revisin 2002

5763:Part13:1989 Revisin 1989 5763:Part 10:1993 Revisin 1993 10

Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras Preparacin y dilucin de muestras

Revisin 1995 NOM-242SSA1-2009 Revisin 2010 109-SSA11994 Revisin 1994

5763:Part14:1991 Revisin 1991 5763:Part 0:1986 Revisin 1986

110-SSA11994 Revisin 1995

6887-1 Revisin 2000

5763:Part 0:1986 Revisin 1996

Amenazas La falta de estandarizacin de las tcnicas

Preparacin y dilucin de muestras

Escherichia coli O157

Listeria spp. y L. monocytogenes

Establece las especificaciones sanitarias de los pescados frescosrefrigerados y congelados.

Establece las especificaciones sanitarias de los moluscos bivalvos frescos-refrigerados y congelados.

Oficial Establece las NOM-032- especificaciones sanitarias de

los moluscos bivalvos en conserva.

Establece un mtodo general para la determinacin de Salmonella en alimentos.

procedimientos estandarizados recomendados en mbito internacional. Se complementa con: NOM-109-SSA1-1994

Disposiciones sanitarias para moluscos bivalvos crudos.

cumplan con la Norma Mexicana correspondiente.

Protocolo de validacin de mtodos alternativos (ISO 16140:2003).

EUA (BAM) Mtodo

Referencia EN-ISO 16654: 2002 ISO 7251: 2005

Referencia Feng et al., 2002

Convencional Escherichia coli Convencional

Convencional Inmunolgico Conv-Molec

ISO (EN-ISO) 11290-1: 2005

Hitchins y Jinneman, 2011 Andrews et al., 2011

Convencional Staphylococcus aureus

Bennett y Lancette, 2001 Bennett y Lancette, 2001

Convencional Convencional Vibrio cholerae

ISO 21872-1: 2007

Convencional Vibrio vulnificus

ISO 21872-2: 2007

Numero de indentificacion del metodo y apendices

Numero de indentificacion del metodo y apendices

MFLP-67 Enterotoxin Immunological MFLP-68

Numero de indentificacion del metodo y apendices

in foods and environm

feeds, raw foods, fece

foods and in agricultu

in raw (ground chicke

foods, food ingredien

animal feed, chicken,

foods, animal feed an feeds, raw foods and

has been validated fo

foods and other samp

Numero de indentificacion del metodo y apendices

The method has been produce satisfactory re in food

raw ground beef and pasteurised whole mil

MFLP-91 MFLP-92 MFLP-94 MFLP-95 MFLP-98

MFLP-16 MFLP-24 Genticos MFLP-30