PRACTICAS DE BROMATOLOGIA PRACTICA N 2-ANALISIS DE LECHE 1.

CONDICIONES TEORICAS LIQUIDO EMULSION(gotas SOLUCION:sales-en heterogneo-nutrientes d en emulsion/suspensin coloidal/solucin GRA+lecitina+H2O)mg/ml+ Sustancias SUSPENSION(PRO en micelas+sensible Zx) nitrogenadas+lactosa+Vh+GRA GRASA:TG(9899%)+100180mg/l colesterol+A+D+caroteno+glucoL+lipoP PROTEINA:4caseinas()-forma Ca/CaPO)+albumina+globulina CASENA:+acpp(pierde Ca)-70nata x GLO/ALB SUSTANCIAS NITROGENADAS:urea+creatina+uirco++NH3 CARBOHIDRATO:lactosa ZX:catalasa-fosfatasa ac+alc-peroxidasa-reductasa
H2 O 87 GR A 2.8 -5 Solido total 13% S desgrasa do 9% 6.8 .028.032 0.160.18% PR O 3.3 CH O 4.85.5 14 2 pH 12 0 10 5 K Ca Cl N a 6 2 acidez M g 8 0.7%ceni za P+S

4.1.

DETERMINACION

DENSIDAD(wesphal-

picnometro-lactodensimetro Quevene) 1.028AGUADA1.032DESCREMADA-1C15C=0.0002 a la = (lectura1000)+1 4.2. DETERMINACION DE LA GRASA(babcock uso de butirometro) HSO+lechedisuelve solidoslibera GRA x emulsion sube escala d butirometr 17.6ml de leche-la lectura del butirometro es el % de 17.6ml

caseinato

de

4.3.

DETERMINACIN

DE

EXTRACTO

SECO-

ES(ackerman o evaporacin del H20) TODOS LOS COMPONENTES H2O = EXTRACTO SECO(sustancias de SES)
EXTRACTO SECO = SOLIDOS TOTALES= 0.25D + 1.2G

Ca)-+Zxpp(cuajo+retiene

4.4. Extracto

DETERMINACIN desengrasado=

DEL

EXTRACTO

DESENGRASADO(ED) solucin+suspensin coloidal=todo (agua+grasa) ED=0.25D + 0.2G=ES-G 4.5. DETERMINACIN DE CLORUROS (mohrt AgNO3 + KCrOrojoladrillo) 1,2 y 2,7 g/L. Si sobrepasa el valor extremo, se sospechar de anomalas como mamitis o adicin de soluciones preparadas. plata tiene gran afinidad por los cloruros, formando cloruro de plata que es incoloro. Cuando todo el cloro forma de cloruro de plata-plata reacciona con el CrO4K2 formando cromato de plata que es de color mostaza rojizo. 2NO3Ag + CrO4K2 ---- 2KNO3 + CrO4Ag2 En 100 mL NO3Ag 0'1N ------1' 6988 g Ag/Enl mL gastados ------------- x g Ag 169' 88 g de NO3Ag ------35' 5 g de Cl/x g de Ag -------------- y g de Cl Estos gramos de cloruro estan en 10 mL de leche de la muestra, luego en 1 litro habr 100 veces ms (a= y x 100) El PM del NaCl es 58'5, de ellos, 35'5 son de Cl. 58' 5 g de NaCl -----------35' 5 g de CL/z g de NaCl --Y ---------- a g de CL z=g de NaCl/litro de de leche %cloruros=0.035V/M o 0.35 =M/v(10ml)

(g/ml)

2. MUESTREO DE LECHE FRESCA A GRANEL Agitar leche+pasarxreciepientes(3-4)-remover c/varillahomogenizar botella 3. CARACTERES SENSORIALES COLOR:blancomate-amarillo-OLOR:caracterstico agradable SABOR:dulzaina+absorbe olores/sabores-rancio x LIPoxido x recipiente hierro ASPECTO:opalino(xcaseina+Ca3PO estado coloidal)4. CARACTERES FSICO-QUIMICOS

ADULTERACIONES DE LA LECHE

4.6. CONDICIONES HIGIENICAS Y CONSERVACIN DE LA LECHE 4.6.1. DETERMINACIN DE LA ACIDEZ(conservacion) ACIDEZ:fosfatos+PRO+citratos+CO2-pH mastitis/M-leche ~tiene ac lctico Acidez; expresa en %de ac lctico(grados dornic)0.16a0.18% 18 x acido lctico/calostro-16aguado/HCO=/mastitis t-NaOH/ fenolftaleinarosa dbil%acidez=0.09xVxFC 4.6.2. PRUEBA DEL ALCHOL(conservacion) Leche cruda a medida de que se incrementa la acidez por accin de bacterias se modifica las estructuras proteicas y la leche se coagula. Alcohol precipita las micelas afectando la termoestabilidad-cuajo en pared del tubo la prueba es + 4.6.3. PRUEBA DE LA REDUCTASA (higiene) Determina contenido microbiano-Si existen pocos m.o. azul se pierde lentamente Descomposicon de color por accin de la reductasa leche Muy mala Mala Buena Muy buena 2horas 2-5 5 T decoloracion 20 20 millones 4-20 millones 4millones millones +32 horas 23-32 15-20 m.c./ml T duracion 10-15

Lote+3und al azar+punto en centro+corta en cua 2 tajadas+rpido para no perder H%+fresco se lava bien+anlisis en 12 horas 3. CARACTERES ORGANOLPTICOS FRESCO Color Olor Sabor Aspe cto Blanco claro Agradable+suave Agradable+saladit o Blando+uniforme+ ~hueco Dura+grasoso+consistente +uniforme PARMESANO Marilloblanco amarillento Penetra+ligero a cuajo Agradable

4. CARACTERES FSICO-QUIMICOS 4.1. HUMEDAD RELATIVA(H%-metodo gravimtricocon 2 g de muestra) H% = [(m muestra-m final)(100)]/m muestra 4.2. DETERMINACION DE PROTEINAS(casenakjeldahl) Fresco(15-20%)-duro(20-25) 4.3. DETERMINACION DE LA GRASA(babcock uso de butirometro) 8g + 5ml H2Od + 3-6 gotas de NaOHemulsionigual q leche % grasa = lectura x 18/m muestra Se puede usar soxhlet con ter/etanol x 2 horas 4.4. DETERMINACIN DE LA ACIDEZ(conservacion) 1g + 50ml H2O+desmenuzarobtener liquido+3 fenolfta+tNaOHexpresar resultado en %d ac lctico1ml NaOH 0.1N=0.09g de ac lactico

4.5. CONDICIONES SANITARIAS PRACTICA N 3-ANALISIS DE QUESO 1. CONDICIONES TEORICAS Constituido PRO+GRA d leche (parmesano+fresco)!GRA+PRO+H+ac+lactosa+Cz
H2O PRO 15-20/2025 fresco 30 crema 65 zuiso 45 parmesano 50 CHO Ca Cl Na Mg P+S

DUROS(PARMESANOZUISO) duracion 10-12 meses consistencia/[]dainas

FRESCO 10-15 dias

Se agrega colorante+conservador+gomas para

4.5.1. PRUEBA CUALITATIVA PARA CONSERVADORES 3g en capsula+3fenolf+10ml de con H2O H2O+desmenusarmasacremosa +10mlNaOH(15%)vaso+10mlferrcianuro K(15%)+10ml hasta ZnSO(30%)+mezclar+diluir pera

2. MUESTREO

60ml+pasar

decantacin+neutralizar

c/HSO(10%)+extraer con 30ml benceno+eliminar fase acuosafase bencnica+KOH0.1N hasta color rosadorecoger fase acusosa y repetir la extraccin+1ml KNO+HSO(105%)+enfriar+2ml H2O+2mlcl,orhidrato de hidroxilamina(2%)+12mlNH4OH(15%)+mezclar dicloro benzoico. 4.5.2. PRUEBA CUALITATIVA PARA GOMAS 10g+10ml H2O+5ml ac tricloacetico(20%)+agitartomar 1ml del filtrado+2ml etanolsi aparece pp turbio en 30in dica presencia de gomas vegetales y calentar a 60Cx5rojo=ac benzoico/verde=ac p-

Por lo tanto, no es fcil decidir si la velocidad inicial, la Vmax o la pendiente de la curva en otro punto dan una medida exacta de la actividad de la enzima

MEDICIN DE LA VELOCIDAD Por esta razn solo se trabaja en velocidad inicial (vi) de reaccin enzimtica. Es decir: a) en el punto inicial, b) cuando las causas anteriores no tienen tiempo para operar, c) donde las condiciones son correctamente conocidas. Para obtener la velocidad inicial, solo es necesario determinar la primera parte de la curva de progreso y luego se traza una tangente al origen. Las curvas casi son lneas rectas cuando el cambio no excede de 20% del

TECNICAS ENZIMATICAS I. TCNICA ENZIMATICA La propiedad mas caracterstica de una enzima es su poder para catalizar una reaccin qumica definida La presencia de una enzima se detecta por las reacciones que ellas catalizan La cantidad de una enzima se estima a partir de la velocidad de reaccin MEDICION DE LA VELOCIDAD Las curvas de progreso de las reacciones enzimticas, muestran que la velocidad decae con el tiempo (velocidad vs. tiempo) Las causas de esta cada son: A) Los productos de la reaccin pueden inhibir a la enzima. B) El grado de saturacin de la enzima por el S puede disminuir a causa de la caida de la [S] conforme procede la reaccin C) La reaccin inversa puede hacerse mas importante a medida que aumenta la [ ] de los productos. D) La enzima puede inactivarse por la temperatura o el pH de la reaccin

total (P. ej. 20% de consumo de sustrato). Mejor no mas del 5% del S. CLASES DE METODOS Para seguir las reacciones enzimticas existen dos tipos de mtodos: Mtodos por muestreo: se realizan Las observaciones no en la misma mezcla de reaccin

sino sobre muestras retiradas a varios tiempos (puntos separados, curvas discontinuas) Mtodos continuos: Las observaciones se hacen en la misma mezcla de reaccin. Muchas lecturas o por registro automtico, curvas continuas. ASPECTOS PRACTICOS: Para obtener linearidad Se deben mantener constantes las condiciones de la mezcla de reaccin La reaccin debe ser realizada en un termostato Todos los reactivos deben ser llevados a la temperatura correcta antes de iniciar la reaccin Usar un buffer adecuado para evitar cambios en el pH Escoger condiciones de pH y temperatura adecuados apara la enzima

 ASPECTOS PRCTICOS: Debido a la alta actividad cataltica de las enzimas Evitar las trazas de enzimas en las puntas de pipetas o los polvos enzimticos (trazas de saliva: usar tapones de algodn en los topes de las pipetas cuando se trabaje con amilasas) ASPECTOS PRACTICOS: Para hacer lecturas correctas Ajustar la velocidad de reaccin por dilucin adecuada de la enzima Mezcla rpida y completa ASPECTOS PRACTICOS: Cmo guardar las enzimas Las enzimas deben ser guardadas en soluciones stock altamente concentradas: A. Precipitacin con sulfato de amonio B. Concentracin con cromatografa C. Concentracin con membranas diaflo (AMICON) Para iniciar la reaccin: realizar mezcla rpida y completa por agitacin (manual o con vortex) MANEJO GENERAL DE ENZIMAS Evitar inactivacin Eliminar condiciones en las que la enzima es inestable: altas temperaturas, soluciones cidas o alcalinas (evitar pH <5 o >9), alcohol Durante la purificacin usar cuarto frio, o bao refrigerado que contiene alcohol diluido (usar vasos de acero) La mayora de enzimas se inactivan a pH pH <5 o >9. Agregar cido por las paredes del vaso y con agitacin Evitar formacin de espuma, pues las enzimas se desnaturalizan en las superficies: El vaciado de un vaso a otro se debe realizar por las paredes (inclinando); hojas de agitador sumergidas profundamente y el vstago debe girar a plomo Las sales: agregar poco a poco para evitar burbujas. Usar soluciones saturadas de sal. Usar solventes fros para el fraccionamiento (acetona, alcohol)

Los detergentes pueden afectar a la enzima y son difciles de eliminarlos Los precipitados deben ser separados por centrifugacin; solo en algunos casos por filtracin (papel, celita, hyflo, supergel, etc.) Realizar la purificacin sin prdida de tiempo para evitar prdida de actividad (en 2 3 das) a menos que la enzima sea bastante estable. Guardar las enzimas en fro (congelacin) El secado de las enzimas debe hacerse al vacio y a baja temperatura (liofilizacin) La contaminacin bacteriana, solo es un problema si las soluciones se dejan en reposo por largos tiempos

II. EL ESTUDIO DE UNA ENZIMA Propiedades proteicas Homogeneidad Nmero de isoenzimas Peso molecular Forma de la molcula Curva de titulacin Punto isoelctrico Movilidad electrofortica Grado de hidratacin Estabilidad frente al pH, calor, oxidacin y radiaciones Disociacin en pequeas subunidades Espectro de absorcin, etc. Composicin de aminocidos Nmero de cadenas peptdicas Secuencia de aminocidos Plegamiento de las cadenas Presencia de grupos prostticos Nmero de grupos SH Efecto de reactivos qumicos Dispersin rotatoria ptica Dicroismo circular Resonancia magntica nuclear Resonancia del spin electrnico

Estructura

Propiedades de la enzima Naturaleza de la reaccin

Implicacin de coenzima Especificidad por el sustrato Reversibilidad de la reaccin Especificidad hacia inhibidores

Existencia de isoenzimas Efectos de la deficiencia de enzimas Efectos del envenenamiento especfico Comportamiento inmunolgico Antienzimas

Centro activo Nmero por molcula Estructura qumica Efecto de la combinacin con el sustrato Mecanismo de reaccin Modo de accin del grupo prosttico

LAS ACTIVIDADES ESPECIFICA Y MOLECULAR Se debe definir un parmetro que exprese la velocidad de reaccin que puede ser alacanzada por una determinada cantidad de enzima En otros campos se usa: cantidad / unidad de peso con el adjetivo Especfico Cantidad / molcula con el adjetivo molecular

Cintica Actividad especfica Actividad molecular Actividades absolutas por centro activo Medida de las constantes de velocidad Efecto de activadores Efecto de iones a diferente pH Efectos alostricos Secuencia de las etapas de reaccin Ecuacin de velocidad

Actividad especfica Ha sido expresada de diferentes maneras: A) Unidades / mg de enzima; la unidad es arbitraria (p.ej. P.Z. para peroxidasas) B) Constante de velocidad / mg de enzima; Kat. F. para catalasa; coeficiente proteoltico, para peptidasas C) mMoles de S que reaccionan / min / mg de enzima D) mMoles de S que reaccionan / min / 100,000 g de enzima Actividad molecular Molculas de S que reaccionan / min / molcula de enzima ( = actividad molecular) Molculas de S que reaccionan / min / centro activo ( = actividad de centro cataltico)

Termodinmica Reversibilidad y Keq de la reaccin Coeficiente de temperatura Energas libres y entropas Afinidad de la enzima por el sustrato (Km) Efecto del pH sobre Km Afinidad por un inhibidor (Ki)

Propiedades biolgicas Significado de las enzimas en el metabolismo Acoplamiento con otras enzimas Ocurrencia y distribucin en especies y tejidos Localizacin intracelular Formacin a partir de precursores Formacin adaptativa Gentica de la enzima Efecto de las mutaciones gnicas

Nota: Nmero de recambio: se us para las dos, pero ha creado confusin. Por acuerdo internacional, para la segunda se usa actividad de centro cataltico Segn la I.U.B. (E.C.) Una unidad U: cantidad de enzima que transforma 1 mMol de S / min Actividad especfica: Unidades de enzima / mg de protena

Propiedades biolgicas

Actividad molecular: Unidades / mMol de enzima ( = N de molculas de S transform,adas / min / molcula de enzima

1. FACTORES Q INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN ENZIMTICA Son varios y determinan las curvas de progreso de las reacciones enzimticas Por tanto, es difcil derivar las ecuaciones cinticas progreso [E], [S], que pH, representan las curvas de

Actividad absoluta por centro activo, o actividad de centro cataltico: N de molculas de S transformadas / min / centro cataltico

Katal (kat) Cantidad de enzima que transforma 1 mol de S / seg Microkatales (mkat); nanokatales (nkat) o

Temperatura,

inhibidores,

activadores EFECTO DE LA CONCENTRACION DE EL E La velocidad es proporcional a la [ E]: v = k[ E] Esto se da en la gran mayora de casos (caso normal) Pero hay desviaciones en algunos casos CASOS EN LOS Q HAY CURVATURA HACIA ARRIBA: hay dos posibles causas a) Presencia de pequeas cantidades de alguna impureza altamente txica en uno de los componentes de la mezcla, pero no en la solucin enzimtica misma Ejm. Iones metlicos pesados, presencia de pequeas cantidades de Cu en el buffer o en el agua destilada usada Efecto de las impurezas txicas en los reactivos, pero no en la solucin enzimtica b) Presencia de un activador disociable o coenzima en la preparacin enzimtica E + A EA Por tanto el porcentaje de la enzima que est en la forma activa aumenta conforme aumenta la concentracin del activador en la mezcla de incubacin (el activador est siendo aadido junto con la enzima, por tanto una cantidad creciente de la enzima estar en la forma activa) Efecto de un activador o coenzima que est en la preparacin enzimtica. Arilsulfatasa Efecto de un activador o coenzima disociable. Ficina Un caso interesante se da cuando la enzima activa consiste en un complejo de subunidades

picokatales (pkat) 1 kat = 6 x 107 UI 1 UI = 0.01667 mkat = 16.67 nkat

AFINIDADES ENZIMATICAS Constantes de disociacin E S Km: E + S ==== ES Ki: Ka E + I E + A ==== EI ==== EA

METODOS PARA SEGUIR CUANTITATIVAMENTE LAS REACCIONES ENZIMATICAS Mtodos espectrofotomticos Mtodos de fluorescencia Mtodos manomtricos Mtodos de electrodo Mtodos polarimtricos Mtodos por muestreo

III. IMPORTANCIA DE LA CINETICA ENZIMATICA Conocer la velocidad de la reaccin Conocer el mecanismo de accin variando las condiciones de la reaccin Conocer las mejores condiciones para la accin de la enzima y el efecto de varios factores sobre esta. Ayuda a entender muchos fenmenos biolgicos Sin un conocimiento de la cintica de una enzima no se puede saber cmo trabaja en trminos qumicos o cmo funciona en la clula

que son inactivas individualmente. Al aumentar la concentracin se favorece la agregacin Efecto de la asociacin de subunidades. Fosfofructoquinasa CASOS EN LOS QUE HAY UNA CURVATUTRA HACIA ABAJO Es mas comn que el caso anterior; hay varias causas posibles. a) Hay una limitacin en la capacidad del mtodo para estimar la actividad de la enzima en lugar de una disminucin de la actividad de la enzima Ejm. Cuando el mtodo depende de la adicin de una segunda enzima, la actividad de esta ltima pone un lmite a la primera Limitacin de la velocidad por el mtodo de prueba b) Puede haberse aadido una enorme cantidad de enzima P. ej. Si la enzima tiene alta afinidad por una coenzima, toda estar unida a la enzima y no estar disponible para reaccionar con las otras enzimas u otras molculas enzimticas. Ejm. Lactato deshidrogenasa Efecto de una cantidad muy grande de enzima en un sistema complejo. Ejm. Lactato deshidrogenasa c) Se ha medido el cambio en un periodo de tiempo dado, en lugar de las velocidades iniciales Se debe al agotamiento del S y a la formacin de inhibidores. Ejm. Aldolasa d) La preparacin enzimtica contiene un I irreversible que se combina con la E para dar un complejo inactivo EI: E + I EI Por lo tanto, el % de enzima inactiva aumenta conforme aumenta la [I] en la mezcla de incubacin

Efecto

del

inhibidor

reversible

en

la

preparacin enzimtica. Arilsulfatasa Efecto del inhibidor reversible aadido a la preparacin enzimtica. Tripsina EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO El estudio de la cintica enzimtic se inici en 1902 con el trabajo de Adrian Brown acerca de la hidrlisis de la sacarosa por la invertasa de levadura (hoy b-fructofuranosidasa) Sacarosa + H2O Glucosa + Fructosa A altas concentraciones de sacarosa la velocidad es independiente de la sacarosa, por eso propuo que la reaccin total est compuesta de dos etapas en las cuales el S forma un complejo con la E, el cual se descompone en productos y E E + S ES P + E V = d[P]/dt = kp[ES] Velocidad total d produccin de [ES] d[ES]/dt = k1[E][S] - k-1[ES] - kp[ES] Sin embargo, esta ecuacin no puede ser integrada explcitamente sin hacer simplificaciones. Hay 2 posibilidades 1. Suposicin del equilibrio (1913) Leonor Michaelis y Maude Menten, usando los datos de Victor Henry, asumieron que k-1 alcanza el equilibrio Ks = k-1/k1 =[E][S]/[ES] 2. Suposicin del estado estable (1925) Briggs y Haldane d[ES]/dt = 0 1. Ecuacin de Henri, 1903 V = K[S]/1 + [S]/Ks Ks = k-1/k1 = [E][S]/[ES] La derivacin de la ecuacin de Henri en las suposiciones que: Suposiciones de Henri 1. La enzima es un catalizador (propuesto por Berzelius en 1833 1837) kp, de modo que la primera etapa de la reaccin

 2.

La

enzima

el

sustrato

reaccionan

rpidamente para formar un copmplejo ES (propuesto en 1902 por Brown) 3. Un solo S y un solo complejo ES estn implicados y el complejo ES se rompe 5. Ecuacin de Woolf Augustinsson Hofstee (1932): a partir de la ecuacin de Michaelis dividiendo numerardor y denominador por [S] y simplificando directamente para formar E libre y producto 4. La E, el S y el complejo ES estn en equilibrio; es decir, la velocidad con que se disocia ES a E + S es mucho mayor que la velocidad a la que ES se rompe para formar E + P (suposicin del cuasi equilibrio o equilibrio rpido; k-1 >> kp) 5. La [S] >> [E], de modo que la formacin de un complejo ES no altera la [S] 6. La velocidad total de la reaccin est limitada por la descomposicin del complejo ES para formar E libre y producto 7. La velocidad se mide durante los estados muy tempranos de la reaccin, de modo que la reaccin inversa es insignificante ( se mide velocidad inicial) 2. Ecuacin de Michaelis-Menten (1913); BriggsHaldane (1925) 6. Ecuacin de Lineweaver Burk (1934): dobles inversas

7.

Ecuacin

de

Eadie

Scatchard

(1949):

a)

dividiendo numerador y denominador por [S]; b) dividiendo ambos miembros por Km

3. Ploteo de v frente a pS (=-log S) Kuhn (1923)

4. Ecuacin de Hanes-Woolf (1932): multiplicando todo la ecuacin anterior por [S]

8. Mtodo de Dixon (1972)

Representacin grfica de Lineweaver-Burk La figura muestra la grfica de dobles inversas, en la que se representa 1/v frente a 1/[S], segn la ecuacin 1/v = KM/Vmax[S] + 1/Vmax. La extrapolacin de los 9. Mtodo de Eisenthal, Cornish-Bowden (1974) datos nos permite calcular los valores de Vmax y KM. (Tesis: Jos Arce Flores, 2002)

Figura 9 Efecto de la concentracin del sustrato pNPP sobre la actividad de la Fac-IV de trigo (Triticum

aestivum L.) var. Gaviln. Representacin grfica de

dobles recprocas de Lineweaver-Burk. Las condiciones de ensayo se indican en 2.6 y 2.8.3 (Tasis Salvador Galdos Galvan, 2002) III. AISLAMIENTO DE ENZIMAS Introduccin El estudio completo de una enzima involucra la investigacin de un gran nmero de propiedades caractersticas que se detallan a continuacin, pero de las que generalmente se estudian solo unas pocas: a) propiedades fisicoqumicas: coeficientes de Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad de la fosfatasa acida de quinua (Faq-I) En este grfico se representa la ecuacin v = Vmax [S] / KM + [S], segn la cintica de Michaelis-Menten, la cual muestra la variacin de la velocidad de reaccin en funcin de la concentracin de sustrato. Tesis: Jos Arce Flores, 2002) sedimentacin y difusin; peso molecular; forma; punto isoelctrico; estabilidad frente al calor, pH y oxidacin; reversibilidad de la reaccin y constante de equilibrio; calor, energa libre y entropa de la combinacin enzimasustrato y de su conversin en productos; medida de las constantes de velocidad de la reaccin, efecto de activadores e inhibidores.

b) estructura:

composicin

en

aminocidos,

producto y otras la medicin de la desaparicin de sustrato Actividad La actividad de una enzima depende de condiciones tales como temperatura, pH, concentracin; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las mismas condiciones para comparar actividades. La eleccin del sustrato es muy importante: debe ser barato, de fcil determinacin, estable en ausencia de enzima y no sufrir reacciones laterales. Es necesario usarlo en concentracin tal que sature la enzima, de modo que la velocidad sea independiente de la concentracin de sustrato y proporcional a la cantidad de enzima.

secuencia, presencia de grupos prostticos, grupos sulfhidrilos, etc. c) propiedades enzimticas: naturaleza de la reaccin, coenzimas, especificidad. d) propiedades biolgicas: significado en el metabolismo, acoplamiento con otras enzimas, localizacin, gentica, efectos de su deficiencia, inmunologa. Objetivos del Aislamiento y Purificacin de Enzimas Obtener un rendimiento mximo Poseer actividad cataltica mxima Mxima pureza

Aislamiento y Purificacin En general, las enzimas se encuentran formando parte de mezclas complejas, usualmente en el interior de clulas que adems poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares, complejos con otras enzimas, protenas inertes, cidos nucleicos, polisacridos o lpidos. Para estudiar una en particular, se hace indispensable entonces un proceso de purificacin. Mtodos de Estimacin - Unidades Ensayo El primer requerimiento para aislar una enzima es encontrar un ensayo cuantitativo de actividad mediante el cual pueda valorrsela convenientemente. Para decidir si un paso de la purificacin tiene sentido, es necesario medir la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y despus de ese paso, y comparar los resultados de varios procedimientos posibles. Slo en trminos cuantitativos se puede saber si se ha producido algn progreso. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el aislamiento de una enzima est dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones, es deseable que sta sea una operacin rpida; es preferible sacrificar precisin por rapidez en las determinaciones. La naturaleza del ensayo depender del tipo de reaccin que cataliza la enzima. A veces resultar conveniente la medicin de la aparicin de un Mtodos para determinar Protenas Mtodo de Kjeldahl El mtodo se basa en la destruccin de la materia orgnica con cido sulfrico concentrado, formndose sulfato de amonio que en exceso de hidrxido de sodio libera amonaco, el que se destila recibindolo en: a) Acido sulfrico donde se forma sulfato de amonio y el exceso de cido es valorado con hidrxido de sodio en presencia de rojo de metilo, o b) Acido brico formndose borato de amonio el que se valora con cido clorhdrico Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para anlisis elemental (p.e., alimentos Protena total= N x 100/16 Unidad Enzimtica Es necesario definir una unidad enzimtica arbitraria para poder expresar, en forma cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la purificacin. La unidad enzimtica se define en forma particular para cada reaccin segn sea conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formacin de una determinada cantidad de producto (desaparicin de reactivo) en un tiempo dado. La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad especfica que es el cociente de actividad enzimtica (expresada en unidades enzimticas) y la cantidad total de protenas

Mtodo de Biuret Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico dando una coloracin violeta. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin d protenas en preparados muy concentrados. Mtodo de Bradford Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas Absorcin a 280 nm Se fundamenta en la absorcin a 280 nm producida por los aminocidos aromticos Phe, Tyr y Trp Sensible y fcil de practicar Requiere soluciones puras de protena; no es aplicable absorcin, a mezclas dependiendo de su contenido en Distintas protenas dan diferente grado de aa. aromticos Tabla de Purificacin Estndar PURIFICACION DE ISOCITRATO DESHIDROGENASA (NADP+) (E.C. 1.1.1.42) A PARTIR DE HIGADO DE CERDO (BASADO EN DATOS DE ILLINGWORTH Y TIPTON, 32 1. Da una breve descripcin de la fraccin

probada 2. Volumen 3. Concentracin de la enzima 4. Unidades totales (= columna 3 x columna 2) 5. Concentracin protica 6. Actividad especfica (= columna 3/columna5) 7. Rendimiento ( obtenido a partir de la columna 4 tomando el primer valor de esta columna como 100%) 8. Grado de purificacin (obtenido a partir de la columna 6 tomando el primer valor de esta columna como equivalente a 1) Seleccin de la fuente La actividad de una enzima vara considerablemente en diferente organismos y an en los diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecansticos generales, debe seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en tejidos animales, la fuente debe ser fresca, dado que la mayora de las enzimas se deterioran rpidamente. Frecuentemente una buena eleccin de la fuente de enzima permite simplificar la extraccin y purificacin de la enzima. Recuerde la fuente debe ser: Abundante Disponible Se deben hacer estudios comparativos Se debe saber su localizacin subcelular

Importancia de la localizacion intracelular de la enzima Las enzimas pueden localizarse dentro de los siguientes grupos:

I.

Enzimas

en

solucin

verdadera

en

el

KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico, en un buffer adecuado para controlar el pH. b) Homogeneizacin snica: el choque de ondas snicas o ultrasnicas provoca cambios de presin de miles de atmsferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para determinados tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos). c) Desintegracin trmica: rpidos forman las El y congelamiento repetidos de y descongelamiento congelacin intracelulares, descongelarse, se suelen hielo Al

citoplasma. Permanecen en el sobrenadante luego de la eliminacin de los componentes particulados. La ruptura de las clulas en un buffer adecuado libera tales enzimas al medio. II. Enzimas asociadas a estructuras celulares (membranas, mitocondrias, etc.). Pueden encontrarse a) en solucin dentro de una membrana y pueden ser extradas despus de la destruccin de la misma; b) asociadas a material lipoproteico insoluble. Para pasarlas a solucin debe disociarse el complejo. El conocimiento de la localizacin intracelular y solubilidad relativa de las enzimas ha permitido desarrollar procedimientos de extraccin diferencial que facilitan la purificacin EXTRACCION DE ENZIMAS Las condiciones para extraer las enzimas y pasarlas a solucin son a menudo crticas y requieren el estudio de muchas variables. Es necesario destruir las clulas, eventualmente las estructuras subcelulares y disociar las enzimas de otras molculas. A veces es necesario pasarlas a solucin como complejo mucoproteico o nucleoproteico purificacin. y disociarlo luego durante la

usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por cristales la se destruyendo estructura.

clulas

destruyen

osmticamente debido a la presencia de agua pura y se libera su contenido. d) Desintegracin qumica: se utilizan agentes que atacan la pared celular, como el etanol, ter de petrleo, isopentanol, etc. e) Homogeneizacin por deshidratacin: se basa en la precipitacin de protenas por solventes orgnicos. En la preparacin del "polvo acetnico" se utiliza acetona en fro.

IV. METODOS DE PURIFICACION Aunque la dispersin de agregados moleculares puede frecuentemente lograrse mediante medios mecnicos, en muchos complejos enzimticos estn involucradas fuerzas especficas; de la naturaleza de las mismas depende el mtodo a emplear. Mtodos de Homogenizacin Implica la destruccin de la clula y el pasaje de las enzimas a solucin o suspensin. Esto puede llevarse a cabo por: a) Homogenizacin mecnica: puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero, licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como almina, arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0,25 M, NaCl 0,9%, Los Cromatogramas Precipitacin con solventes orgnicos Etanol usado para la precipitacin de protenas sanguneas. Acetona para separar enzimas de extractos de msculo 1. Precipitacin fraccionada por cambios de pH 2. Desnaturalizacin fraccionada por calentamiento 3. Precipitacin fraccionada con solventes orgnicos 4. Precipitacin fraccionada por sales 5. Absorcin fraccionada 6. Cromatografa en columna 7. Electroforesis

CROMATOGRAFA SEPHAROSA

EN

CONCANAVALINA

A-

. La fraccin de fosfatasa cida de Ullucus

tuberosus "olluco" obtenida de la columna en SP

Sephadex C-50 (32ml), fue cromatografiada sobre una columna de Concanavalina A-Sepharosa, bajo las condiciones de 2.4. La enzima fue eluda con 0.15 M de metil -D manopiransido. Se colectaron fracciones de 3ml, con un flujo de 1.2 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR - Separa segn tamao molecular Fase estacionaria: dextrano o agarosa ELECTROFORESIS entrecruzados - Fase mvil: solucin tamponada CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO Separa segn carga elctrica - Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble - Fase mvil: gradiente de sal o de pH CROMATOGRAFA EN SP SEPHADEX C-50. La fraccin de la etapa anterior (50ml) del extracto de enzima preparado de tubrculos de Ullucus tuberosus "olluco" fue cromatografiada sobre una columna de SP Sephadex C-50 bajo las condiciones de ensayo de 2.3. La enzima fue eluda con 0.10 M de NaCl se CRITERIOS DE PUREZA DE UNA ENZIMA Ultracentrfuga Analtica Mtodos Electroforticos Enfoque Isoelctrico Prueba de Solubilidad colectaron fracciones de 4ml. CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD Separa segn la afinidad de la protena por un ligando inmovilizado - Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble - Fase mvil: (1) solucin sin ligando (2) solucin con ligando libre V. DERIVACIN DE ECUACIONES COMPLICADAS DEL ESTADO ESTACIONARIO POR EL METODO DE KING Y ALTMAN (1956) REGLAS 1. Se dibuja el esquema de reaccin interconectando con flechas todas las especies enzimticas relevantes 2. Se anotan todas las flechas de las reacciones con la correspondiente constante de velocidad ml por minuto

3. Para las n formas de la E se dibujan los patrones de reaccin que tienen n -1flechas y se obtiene una ruta o rutas continuas que conlleven a la forma de la E

4. Se define la velocidad (v) y la [E]t 5. Se divide v entre Et 6. Se hacen los reemplazos y simplificaciones correspondientes

FORMAS DE LA ENZIMA Pasos 1 y 2: El patrn maestro es: Paso 3: Los patrones de reaccin para E son: Paso 4: Se define la velocidad y Enzima total Paso 5: Se divide v entre Et

Paso 6: Simplificando

[E] [ES] [EP]

= = =

(k2k4) +

(k2k5)

(k3k5)

(k1k4S) + (k1k5S) + (k4k6P) (k1k3S) + (k2k6P) + (k3k6P)