SEMINARIO 3 CINTICA ENZIMTICA

Diseo de un protocolo experimental

Daniel Martnez trabaja en el Laboratorio de Cintica Enzimtica. All se estudia el comportamiento de diversas enzimas, entre ellas la Ca 2+-ATPasa de membrana plasmtica (PMCA).

Para sus experimentos dispone de varias preparaciones a) membranas fragmentadas de glbulos rojos (abundancia de Ca 2+ATPasa = 0.1% de las protenas totales) b) Ca2+-ATPasa purificada e inserta en micelas c) Ca2+-ATPasa purificada e inserta en liposomas.

1) Esquematicen las distintas preparaciones. Cules creen que seran las potenciales ventajas y desventajas de cada una de ellas?

Como Daniel sabe que la actividad de las enzimas depende de las concentraciones de los sustratos y ligandos, desea saber cmo se relaciona la velocidad inicial de hidrlisis del ATP (actividad ATPsica) con la concentracin de Ca++ alrededor de la protena

2) Cul preparacin consideran ms adecuada para cumplir este objetivo? Justifiquen su eleccin. 3) Cul creen que sera la utilidad del estudio? Es la [Ca2+] una variable fisiolgica que pueda modificar el funcionamiento de esta ATPasa?

Para medir la actividad ATPsica el investigador asume que la cantidad de ATP hidrolizado ser igual a la cantidad de fosfato (Pi) liberado, segn la reaccin siguiente: ADP + Pi

ATP

La actividad ATPsica de la preparacin se expresar como masa de Pi tiempo. masa de protena

Para medir la cantidad de fosfato inorgnico que se va formando cuando las membranas se pongan en contacto con ATP, decide utilizar un mtodo colorimtrico. El ensayo colorimtrico de Fiske Subarrow se basa en la formacin de un complejo entre el fsforo y el molibdato de amonio, que al ser reducido da lugar a un compuesto de color azul. La intensidad del color en la solucin analizada se mide como la Absorbancia de luz roja en un espectrofotmetro. Por lo tanto, la absorbancia ser proporcional a la concentracin de Pi.
GRAFICO 1 Curva de calibracin (diluciones de una solucin patrn de fsforo inorgnico)

Habiendo ya elegido la preparacin donde estudiar a la ATPasa y el mtodo para medir el Pi liberado cuando la enzima se ponga en contacto con el ATP, Daniel debe disear un protocolo experimental para cumplir el objetivo: saber cmo vara la velocidad inicial de hidrlisis del ATP (actividad ATPsica) en funcin de la concentracin de Ca2+. Los resultados obtenidos por Daniel a partir de los experimentos que realiz se encuentran en la tabla siguiente
TABLA 1 Absorbancia en funcin del tiempo a distintas concentraciones de Ca2+ (con 1 g de protena)
Conc Ca2+ tiempo (min) 0,1 uM A 690 nm 0,2uM A 690 nm 0,5 uM A 690 nm 1,1 uM A 690 nm 2 uM A 690 nm 5 uM A 690 nm 12 uM A 690 nm

1 2 3 4 5

0,011 0,019 0,03 0,04 0,051

0,015 0,031 0,055 0,077 0,089

0,033 0,058 0,089 0,119 0,155

0,042 0,089 0,13 0,166 0,199

0,045 0,095 0,135 0,188 0,232

0,054 0,109 0,166 0,215 0,276

0,055 0,114 0,174 0,236 0,289

5) Describan en forma aproximada qu experimentos tuvo que hacer Daniel para obtener los datos de la tabla. Realicen los grficos necesarios para obtener los parmetros cinticos de la PMCA (Km y Vmx). 6) Discutan los resultados. a. Cmo es la relacin entre la [Pi] y el tiempo? A qu se refiere el concepto velocidad inicial? Qu esperaran observar a tiempos prolongados? Cules podran ser las causas de la desviacin de la linealidad? b. Qu pueden concluir acerca de la cintica de la reaccin de la Ca 2+ATPasa? Parece vlido aplicar el modelo de Michaelis-Menten? c. Qu mtodos conocen para estimar Km y Vmx? Cules son los valores de Km y Vmx en este caso?

En el laboratorio se hizo un estudio similar para la Ca 2+-ATPasa del retculo sarcoplsmico (SERCA) utilizando clulas musculares. En este caso, los parmetros cinticos obtenidos fueron: Km 0.4 M y Vmx 25 nmoles de Ca ++ / mg prot/ seg.

7) Grafiquen, cualitativamente y en un mismo par de ejes, Velocidad inicial en funcin de [Ca2+] para la SERCA y la PMCA. Para ello, recuerden que para los experimentos con la PMCA se us 1 g de protena en cada condicin y consideren que la abundancia relativa de la enzima en estudio es la misma en ambos casos. Qu explicacin encuentran a la diferencia de comportamiento?

8) USINA BGC-Seminario 3
A travs del sistema USINA podrn acceder a la simulacin correspondiente al seminario 3, tal como lo hicieron con los seminarios anteriores. La ltima actividad de la simulacin debe ser incorporada a este informe. Tengan en cuenta que aunque propiciamos el trabajo grupal para realizar este trabajo de seminario, recomendamos realizar individualmente la actividad USINA.