MANUAL DE PROCEDIMIENTOS PARA LA DETERMINACION DE BACTERIAS DE INTERES EN LOS ALIMENTOS

ELABORADO POR: Zobeyda Vanegas Castillo. Ingeniero en Alimentos

Aerobios mesfilos Staphylococcus aureus. Enterobacterias Coliformes totales. Coliformes fecales Escherichia coli (Placa 3M)

INTRODUCCION Desde los inicios de la humanidad, ha sido una constante preocupacin del hombre, satisfacer sus necesidades de alimentacin, cuando era cazador y recolector tomaba de la naturaleza los alimentos que necesitaba cada da. Posteriormente con el advenimiento de la gran revolucin en los hbitos culturales que ocasiono la agricultura, hubo la necesidad de preservar en el tiempo los alimentos cosechados con tanto esfuerzo. Pero los alimentos pierden sus caractersticas deseables por efectos del tiempo, por efecto de las enzimas, y sobre todo por efecto del microorganismo que existen de manera natural o por contaminacin.

Los anlisis microbiolgicos son realizados al alimento fresco o procesado para valorar la calidad con que este producto ha sido manipulado antes de llegar al consumidor, y as asegurarse que es un producto apto para el consumo humano. Los procedimientos y mtodos que se realizan en este manual se encuentran en las guas de determinacin microbiolgica de 3M y que son aprobados por la AOAC MTODO OFICIAL 998.08 Y 990.12. Elaborado con la finalidad de facilitar al personal de laboratorio en plantas de alimentos la metodologa de forma sencilla para que puedan ser realizadas, adems que sirva como material de apoyo para consultar cualquier duda. MANUAL DE PROCEDIMIENTO LABORATORIO Antes de mencionar las etapas de proceso que tienen en comn la mayora de los anlisis microbiolgicos describiremos los diferentes anlisis que realizamos en busca de bacterias de inters: Anlisis Microbiolgico Tcnica

1. Identificacin de Salmonella sp.____Mtodo Elisa rpido, Presencia /Ausencia en 25 gramos de producto. 2. Recuento de E. Coli.______________Recuento en placa petrifilm. 3. Recuento de Enterobacteriaceae.____Recuento en placa petrifilm. 4. Recuento total de bacterias aerobias mesfilas a 30C.__Recuento en placa petrifilm 5. Recuento de Estafilococcus Aureus.___Recuento en placa petrifilm. 6. NMP/g de producto 7. Coliformes fecales. La metodologa empleada para cada uno de los anlisis microbiolgicos citados con anterioridad se basan en mtodos estndares, mtodos que estn probados y validados por organismos certificados como el AOAC, FDA-BAM, Codex Alimentarius. Estos organismos certificadores proveen procedimientos de trabajo que ayudan a identificar las diferentes bacterias de inters. El inicio del proceso analtico microbiolgico ocurre con la definicin clara de que debemos hacer primero y que despus, siguiendo el orden lgico en cada situacin. - Cuidados a considerar antes y durante un anlisis microbiolgico El inicio de cada etapa en los anlisis microbiolgicos va acompaado de: Lavado de manos con jabn antibacterial antes y despus de terminada cada etapa del proceso: Sanitizado de manos con solucin de alcohol al 70 %

 Limpieza y sanitizacin del rea antes y despus de trabajas cada etapa del proceso. Utilizar guantes ltex estriles para protegerse en cada proceso que se realicen anlisis, tenga cuidado cuando utilice el mechero. Utilice siempre el mechero en cada etapa del proceso Cuando utilice el mechero y las manos con lo que esta trabajando siempre detrs. Mantenga el equipo correcto en horas de trabajo, gabacha, boquilla, gorro. Revise las temperaturas de las incubadoras y tome acciones correctivas si lo amerita Calibre balanza, termmetro antes de utilizarla. Verifique la adecuada esterilizacin de los medios de cultivos, equipo de trabajo como pipetas etc. Si utiliza medios lquidos observe que estn claros sin algn indicio de turbidez. Asegrese que cada etapa del proceso cumpla con las condiciones de temperatura y tiempo de incubacin. Recoleccin de muestras Es obligatorio el cumplimiento de procedimientos que estn encaminados a la recoleccin de muestras bajo condiciones de asepsia. El personal encargado en recolectar las muestras son personas calificadas, previamente entrenadas. Antes y despus de recolectar las muestras lave sus manos con jabn antibacterial y sanitize con alcohol al 70 % o solucin clorada a 200 ppm. Al momento de recolectar las muestras se debe utilizar guantes estriles con el fin de no tocar las muestras con las manos descubiertas y provocar una contaminacin cruzada en el producto. La metodologa del muestreo es aleatoria y se realiza extrayendo una muestra por lote procesado. Las muestras recolectadas pueden ser productos frescos si se recolecta en el momento que entra el producto a la planta de proceso, y producto terminado cuando ya ha formado parte del proceso, se deben cumplir con la toma de muestra representativa segn la cantidad de productos a procesar. A cada muestra se le realizaran seis anlisis microbiolgicos. El peso necesario para realizar los anlisis microbiolgicos es de 100 gramos, segn las indicaciones del AOAC, pero tambin se aplica que a mayor cantidad de muestra tomada (400 gramos) el resultado obtenido es mas representativo. Las muestras recolectadas son depositadas en bolsas de polietileno estriles, Las bolsas se rotulan identificndolas con un nmero de muestra. El nmero de muestra es tomado de un libro de registro que contiene informacin del producto, como lote procesado, fecha de proceso. (Para asegurar

la trazabilidad del producto) completa de la muestra adems la fecha en que el producto el producto ingreso a la planta, nombre del proveedor. Las muestras recolectadas son refrigeradas antes de realizar el anlisis para evitar que aumente su flora bacteriana y evitar obtener falsos positivos. PROCESAMIENTO DE MUESTRA PREENREQUECIMIENTO La etapa de pre enriquecimiento requiere de medios lquidos que se caracterizan por ser medios no inhibitorios del resto de la flora acompaante de los microorganismos de inters. A continuacin se describe los medios de pre enriquecimiento utilizados por el laboratorio para la identificacin bacteriana de inters: MEDIOS DE CULTIVO Agua peptonada: Es utilizada en los anlisis siguientes: Recuento de Aerobios mesfilos Recuento de Enterobacteriaceae Recuento de Estafilococcus aureus Recuento de E.coli Recuento de Coliformes totales Recuento de Coliformes fecales La descripcin general de esta etapa ocurre de la siguiente manera: El medio de pre enriquecimiento seleccionado tiene que estar dentro de las bolsas de polietileno con sello mgico, la medida del volumen es de 225 ml de medio estril el cual debe estar a temperatura ambiente. La bolsa con el medio seleccionado debe estar rotulada con el mismo nmero de muestra que trae la bolsa en la cual se ha recolectado la muestra original. El proceso de pesado y macerado. En primera instancia lave y sanitize sus manos, generalmente hay dos personas trabajando una abre la bolsa recolectora de muestra y la otra esta macerando y pesando, coloque el recipiente con la bolsa estril con Agua Peptona (225 ml),tare la pesa y adicione los 25 gramos de producto, no comience el proceso si la muestra esta congelada todava presenta signos de congelacin, despus de pesados los 25 gramos de producto, macerar la muestra y proceder segn el anlisis a realizar. Incube a 37C x 24 h. Etapa de preenrequecimiento:

Brinda condiciones para que las bacterias inicien su proceso de recuperacin. El producto debe estar a temperatura ambiente (no congelado) Mantener un flujo continuo de agua en el grifo, antes de abrirlo flamearlo con el mechero Utilizar jabn antibacterial antes y despus de iniciado cada proceso en este caso el macerado y pesado de producto. Tiempo de lavado 15 segundos. Mantener un recipiente con solucin clorada a un a concentracin de 50 ppm, sumerja las manos por un espacio de 15 segundos. Macere y pese 25 gramos Introdzcalo en 225 ml de agua peptonada. Incubar a 35C - 37C x (18-24)h. Mesfilos: En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a temperaturas entre 20 - 40 C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulacin, las condiciones higinicas de la materia prima planta de proceso. Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patgena. Un recuento elevado de aerobios mesfilos puede significar Excesiva contaminacin de la materia prima Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos La inmediata alteracin del producto El recuento de mesfilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

Diagnstico de Recuento de Aerobios Mesfilos Mtodo de placa difusa: Se preparan los platos con anterioridad dejndolos a una temperatura d 38 C para que se deshidraten un poco y as puedan absorber con mayor facilidad la muestra inoculada que en este caso es de 0.1 ml de muestra diluida. Incubando a 30 C por 24 horas. Equipos, Materiales y Reactivos: 1. Estufa. 2. Autoclave.

3. Balanzas. 4. Botellas de dilucin. 5. Incubadora. 6. Placas Petrifilm 3M. 7. Pipetas, Pipetas aids. 8. Refrigerador 9. Termmetros 10. rea de trabajo. 11. Medios APC o un equivalente Interpretacin de Resultados Recuento en placa difusa. Inmediatamente despus de la incubacin cuente todas las colonias de las placas seleccionadas. Cuente las placas donde hubo crecimiento aplicando la Formula: N = C / [(1 * n1) + (0.1 * n2)] / (d) N= nmero de colonias. C = la suma de todas las colonias en los platos n 1= Nmero de platos contados en la primera dilucin. n 2= Nmero de platos contados en segunda dilucin. d = factor de dilucin de la primera cuenta

FORMULA PARA DIFERENTES CONCENTRACIONES DE DILUCIONES Dilucin Consecutiva 10-1 a 10-2 10-2 a 10-3 10-3 a 10-4 Frmula c/1.1 x (10-1) c/1.1 x (10-2) c/1.1 x (10-3) Rango c/0.11 c/0.011 c/0.0011

10-4 a 10-5 c/1.1 x (10-4) c/0.00011 C: es la suma de colonias contadas en las placas seleccionadas de las 2 diluciones sucesivas.

Diagnstico Staphylococcus aureus El Staphylococcus aureus es una bacteria que se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y en el hombre se encuentra en la piel y fosas nasales de las personas sanas, pero en ocasiones en que la defensa de la piel caen pueden causar enfermedad o incluso hasta la muerte. Tambin la encontramos en el ambiente estn presente en las aguas salinas toleran

salinidades del 10% de sal, es por esto que se le clasifica como una bacteria patgena que puede ser un riesgo para la salud pblica. Es una especie bacteriana integrada por formas cocaceas, que se dividen en ms de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmviles y carecen de esporas. Son gram positivas. Su metabolismo es de tipo fermentativo, son aerobios y anaerobios facultativos, catalasa positivo y oxidasa negativo. Son capaces de fermentar la glucosa sin produccin de gases y producen acetin metil carbinol. Fermentan el manitol con formacin de cidos y puede hacerlo en anaerobiosis. No hidrolizan el almidn y son capaces de crecer en presencia de un 40% de bilis. Soportan tasas elevadas de cloruro sdico, hasta un 15%. La temperatura ptima de crecimiento va de 35 a 40C y el pH ptimo oscila entre 7,0 y 7,5 aunque soportan pHs mucho ms extremos. Poseen una enzima, coagulasa que los diferencia del resto de las especies del gnero, esta tiene la facultad de reaccionar con el fibringeno dando lugar a un cogulo de fibrina. Poseen igualmente una desoxirribonucleasa ( Dnasa ) que es una nucleasa exocelular que depolimeriza el DNA. A esta enzima se la denomina termonucleasa por se termorresistente en las cepas de Aureus. Mtodo de placa petrifilm (Mtodo oficial AOAC 2003.07, 08 y 11) es equivalente al mtodo BAM de 3 placas agar BAIRD Parker y confirmacin de coagulasa en tubos. Cuando el alimento tiene altas concentraciones de carga microbiana es probable que otros microorganismos se presenten en la placa adems de las colonias rojovioleta; estas colonias generalmente aparecen como colonias negras o azul verdosas. Cuando esto sucede, se debe emplear el Disco 3M Petrifilm Staph Express para distinguir S. aureus (colonias rojo-violeta) de las otras colonias sospechosas. El disco contiene DNA y el indicador O-toluidina. El DNA presente en el disco reacciona con la enzima DNAsa que producen las colonias de S.aureus. Al mismo tiempo, la enzima DNAsa se combina con la O-toluidina del disco y se forman las zonas rosadas que confirman la presencia del estafilococo. Cuando sea necesario realizar el paso confirmatorio con el disco incube la placa con el disco insertado de 1 a 3 horas (no ms) a la misma temperatura (35 C 2 C). Equipos, Materiales y Reactivos: 1. Estufa. 2. Autoclave. 3. Incubadora 35C 4. Balanzas. 5. Platos petri./Petri film 6. Pipetas automticas de 1 ml 7. Puntas de pipetas automticas estriles

8. Tubos con agua peptonada estril 9. Hisopos estriles. 10. Refrigerador 11. Termmetros Cuando la placa slo presente colonias rojo-violetas, o no presente ningn crecimiento despus de las 22 24 horas de incubacin, la prueba est concluida. Si fuera necesario utilizar el disco para diferenciar las colonias rojo-violetas cuente todas las zonas rosadas que aparecen, incluso cuando no se encuentre presente una colonia. Diagnstico de Enterobacterias La taxonoma define a esta familia como Enterobacteriacea incluye a los bacilos gram negativas anaerobias facultativas, que fermentan la glucosa (cido) son oxidasa negativo, usualmente catalasa positiva, generalmente reductoras de nitrato, hay mviles e inmviles. Los miembros de esta familia; Citrobacter, Enterobacter, Erwina, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shiguella, y Yersinia. Las entero bacterias se encuentran ampliamente distribuidas como bacterias mesfilas. Las enterobacterias han sido usadas en Europa como indicadores la calidad de los alimentos que incide en la seguridad alimentaria. El uso de Coliformes como indicador de la calidad de los alimentos de desinfeccin en las plantas de proceso de alimentos, est basado en la tradicin o costumbre en los Estados Unidos. Esta practica arbitraria, basa su juicio en la calidad de los alimentos sobre la recuperacin de algunos miembros de la familia de las enterobacterias (ej. Coliformes) que fermentan la lactosa, ignorando de esta manera a los no fermentadores de la lactosa, hay que buscar tambin los glucosa positiva, lactosa negativa (ej. Salmonella) El Procedimiento en placa difusa para la determinacin de Enterobacterias, Coliformes totales, fecales y E. coli es el mismo que el citado en los anlisis anterior (Recuento Staphylococcus aureus)

Diagnstico de Coliformes Totales, fecales y E.coli El trmino Coliformes aparece en 1893 por Blachstein, el se refiere a los bacilos que se asemejan a E.coli y producen colonias similares. El grupo Coliformes es definido en base a las reacciones bioqumicas, no hay ninguna relacin gentica, el termino Coliformes no tiene ninguna validez taxonmica. Los Coliformes son aerobios y anaerobios facultativos, gram negativos, no formadores de esporas, fermentan la lactosa, forman acido y gas a 35 C, el grupo

Coliformes podra contener organismos que no estn incluidos en la familia enterobacterias, ej. Aeromonas Aunque coliformes eran fciles de detectar, su asociacin con contaminacin fecal es cuestionable debido a que algunos coliformes se encuentran naturalmente en muestras ambientales. Esto llev a la introduccin de los coliformes fecales como indicador de contaminacin. Coliformes fecales, se define sobre la base de las obras de Eijkman, es un subconjunto del de coliformes totales que crece y fermenta la lactosa a elevada temperatura de incubacin, por lo tanto, tambin denominado coliformes termo tolerante. El grupo Coliforme fecal consiste principalmente de la E. coli, pero algunos otros, como Klebsiella, Enterobacter, y Citrobacter que tambin fermentan la lactosa a 44.5C, se consideran como coliformes fecales. La inclusin de Klebsiella spp en la definicin de coliformes fecales a disminuido la correlacin de este grupo con la contaminacin fecal. Como resultado de ello, E. coli ha reaparecido como un indicador, en parte facilitado por la introduccin de nuevos mtodos que pueden identificar rpidamente la E. coli Actualmente, los 3 grupos se utilizan como indicadores, pero en diferentes aplicaciones. La deteccin de coliformes se usa como un indicador de calidad sanitaria del agua o como un indicador general de la condicin sanitaria en el entorno de procesamiento de alimentos. Los Coliformes fecales, siendo el indicador estndar de eleccin para la recoleccin de moluscos, crustceos, aguas; y E. coli se utiliza para indicar la contaminacin fecal reciente. Casi todos los mtodos utilizados para la deteccin de E. coli, coliformes totales y coliformes fecales son los mtodos de enumeracin

NMP DE PRODUCTO PARA DETERMINACION DE E. coli Mantener un flujo continuo de agua en el grifo, antes de abrirlo flamearlo con el mechero Utilizar jabn antibacterial antes y despus de iniciado cada proceso en este caso el macerado y pesado de camarn. Tiempo de lavado 15 segundos. Mantener un recipiente con solucin clorada a un a concentracin de 50 ppm, sumerja las manos por un espacio de 15 segundo.

Etapa de Pre enriquecimiento Macere y pese 25 gramos de Langosta en agua peptonada Introdzcalo en 225 ml de agua peptonada Realizar proceso dilutorio de la dilucin, 10 -2,10 -3. De la primera dilucin de agua peptona (dilucin madre) realizar dos diluciones mas: 10 -2,10 -3. Etapa Presuntiva A cada dilucin (10-1,10-2,10-3 )se le extraern tres ml y se inoculara en tres tubos con caldo lauril sulfato LST. Incubar a 44.5 C 45.5 C x (24-48 horas). Seleccionar los tubos que presenten gas y turbidez, inocular Utilizando un asa de 3mm, inocule los tubos positivos en tubos de caldo Ec. Incubar a 44.5 C 45.5 C x (24-48 horas). Etapa Confirmativa De los tubos con caldo Ec turbios y con gas, inocular a caldo de Agua Triptona ya incubado por 24 horas a 44.5 C 45.5 C. Adicione de 3 a 5 gotas de Reactivo de Kovac s al tubo de 5ml de agua triptona incubada. Materiales: Tubos Campanas Drham Tapones plsticos Gradillas Marcadores Pipetas serolgicas estriles de 1.0 ml Pipetas serolgicas estriles de 10.0 ml Asas de 10l Recipientes de licuadora estriles Mechero Cuchillos estriles Mesa de diseccin desinfectada. Pinzas estriles. Tijeras estriles. Esptulas estriles. Probetas de 100 y 500ml estriles. Probeta con solucin desinfectante.

Coliformes fecales /Escherichia coli Etapa de Pre-enriquecimiento 225 ml Agua Peptona buffer. Buffer

Pesar y macerar 25 gr de Producto (Langosta, Camarn, Pescado, Caracol) y adicionarlo al agua peptona buffer al 0 % de NaCl Esta es la dilucin 10-1 Realizar Proceso Dilutorio a partir de la dilucin 10-1, se obtienen 10-2 y 10-3 si es necesario. 10-1
Adicionar 1 ml

10-2
Adicionar 1 ml

10-3 Tubo 16 x 150 mm _ _ _ 9 ml Agua Peptona al 0%

225 ml Agua Peptona AL 0 % NaCl 225 ml AP 0% + Buffer 25 gr Alimentos

_ _ _ 9ml Agua Peptona al 0%

Etapa de Presuntiva Inocular 1 ml de las diluciones anteriores en AP 0% a los tubos rotulados Caldo Lauril Sulfato (LST, 10 ml) con las respectivas diluciones, 3 por cada dilucin, con campana Durham.

LST

Tubos 20 x 125 mm

10-1

LST 10-2

LST 10-3

Incubar a 43-44.5 C x 24-48 horas. Tubos con presencia de Gas y Turbidez son positivos Etapa Confirmativa Seleccionar los Tubos Positivos con Gas del LST y extraiga una muestra con un Asa de ojo de 3mm de Dimetro e Inocule cada tubo positivo en Caldo Ec Coliforme fecal. Incubar a 43-44.5 C x 24-48 horas. Tubos con presencia de Gas y Turbidez son positivos. Ejemplo

Tubos de - 20 x 125 mm -

EC 10-1 EC 10-2 EC 10-3 Seleccionar los Tubos Positivos con Gas por dilucin del EC y extraiga una muestra con un Asa de ojo de 3mm de Dimetro e Inocule cada tubo positivo en tubos de 5 ml de Agua Triptona. Ejemplo Tubos de 13 x 100 mm AT 10-1 AT 10-2

Incubar a 43-44.5 C x 24 horas. Tubos con presencia de Turbidez son positivos. La lectura se realiza en Tabla de Referencia con los tubos positivos de Ec. Adicionar 0.5 ml de Reactivo de Kovacs, si se forma anillo Rosado intenso/Rojo es una Reaccin Positiva a la presencia de E. coli. Resultado se expresa NMP/gr. Se expresa tambin lectura de Coliformes fecales.

CRITERIOS MICROBILOGICOS Un criterio microbiolgico para un alimento define la aceptabilidad de un proceso, producto o lote de alimento basndose en la ausencia o presencia o el numero de microorganismos y /o la investigacin de sus toxinas por unidad de masa, volumen o rea. La representatividad de los resultados del laboratorio en microbiologa de alimentos depende del nmero de muestras recolectadas, de si la distribucin de los patgenos en el lote es homognea o no y de si el muestreo es realizado de manera aleatoria /dirigida. La confiabilidad de los resultados obtenidos depende de la tcnica seleccionada para realizar el anlisis (sensibilidad y especificada) DETERMINACIONES MICROBILOGICAS NICARAGUENSE PRODUCTOS PESQUEROS Y ACUICOLA. NTON 03 003-04

n = tamao de la muestras. c = numero de aceptacin. M = nivel de aceptacin.

RECUENTO EN PLACAS PETRIFILM 3M CONTROL MICROBIOLOGICO AMBIENTAL Y DE SUPERFICIE. Este control se realiza una veces por semana, se realiza de la siguiente manera:

Coliformes fecales NMP/gr. M m Peces Frescos 1 x 102 3 Crustceos 1 x 102 frescos 3 Moluscos 1 x 102 (Carne de 3 caracol fresca) Peces 1 x 102 congelados 3 Cretceos 1 x 102 congelados 3 Moluscos 1 x 102 (carne de 3 caracol congelada) n 5 5 5

Staphylococcus Salmonella Coagulasa + 25 gr. Ufc/gr. M n m 1x 103 5 ausencia 3 1x 103 5 ausencia 3 1x 103 5 ausencia 3 5 ausencia 5 ausencia 5 ausencia

Vibro Pharahemolitico Ufc/gr. M n m 1x103 3 1x103 3 1x103 3 1x103 3 1x103 3 1x103 3 5 5 5

5 1x 103 3 5 1x 103 3 5 1x 103 3

5 5 5

1. Control ambiental Para obtener una numeracin bacteriolgica representativa, se coloca un 1ml de agua peptonada al 1%, sobre la superficie de la placa petrifilm 3M, (aerobios Mesofilos) se deja endurecer por un minuto se retira la membrana

y se coloca adherida a la pared con una cinta en el rea a investigar, destapada por 5 minutos, se cubre luego y se procede a incubar a 37 por 24 horas (dos placas por anlisis). Observar la gua de interpretacin. Mtodo AOAC MTODO OFICIAL 990.12. 2. Mtodo del hisopado Usar tubos de 10 ml de agua peptona, realizar hisopado sobre las superficies que se deseen analizar, luego introducirlo en el tubo con agua peptona, y llevarlo al laboratorio para inocular en placas petrifilm. Incubar y leer los resultados siguiendo las instrucciones en la gua de interpretacin.

CONTROL MICROBILOGICO DE EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y ENVASES. ( Higiene y Desinfeccin) La toma de muestra de la planta se realiza de preferencia antes de iniciar el trabajo (6:00 A: M) tres veces por semana con el objeto de obtener informacin sobre el status de limpieza previa al da de produccin en la planta. Los mtodos de evaluacin varan segn la forma de dichos objetos. MTODO DE ENJUAGUE: Para envases, se vierte 20ml de agua destilada o agua peptonada al 1%, en cada envase (la cantidad es variable segn el tamao del recipiente), se tapa y se agita horizontal y verticalmente enjuagando as completamente la parte interna. Este lquido se vierte en un matraz estril y se analiza segn lo conveniente ya sea para placas de recuento de E. Coli, Coliformes totales y fecales, Aerobios mesofilos, Listeria Monositogena etc., se agrega 1 ml a la placa y se procede a incubar a 37( +-2) por 24 horas( +-3). MTODO DE FROTACION: Para evaluar maquinas, instrumentos, envases as como los dedos de las manos y superficies irregulares, se humedece un hisopo (o una gasa cogida con una pinza) estril con solucin salina peptonada y se limpia una determinada superficie, se le coloca un matraz estril y se aade 9 ml de la solucin salina peptonada al 1%. Se obtiene as el lquido de anlisis para evaluar grmenes Coliformes, E. Coli, listeria, etc. Se procede a incubar las placas por 24 horas (+-2) a 35c (+-1c). CONTROL MICROBILOGICO DE LOS TRABAJADORES. Este procedimiento se realiza dos veces por semana de forma aleatoria o dirigida segn se observe el comportamiento del personal. MTODO DE FROTACION O BARRIDO. Se humedece un hisopo de algodon de madera esteril en tubos de 10 ml de agua peptonada al 1% y se frota la superficie de las manos y entre los dedos como tambin parte del ante brazo de la persona. Otros lugares (boquilla, guantes, gabachas, etc.). Este hisopo se coloca en el tubo con cuidado de no tocar el borde, luego se inoculan en placas petrifilm 3M con una

pipeta estril descartable se coloca 1ml a la placa petrifilm totales, coliformes, etc. Segn se requiera la determinacin luego este se incuba por 24 horas (+-2) a (35c+-1c). CONTROL MICROBILOGICO DEL AGUA. Este procedimiento una vez a la semana y cuando se observe sospecha de mala manipulacin de las tuberas y pilas de almacenamiento. Para la toma de muestra se desinfecta la llave con algodn impregnado de alcohol al 98%, se abre la llave de salida y se espera que fluya un minuto, luego se cierra la llave y se coloca un mechero encendido flamendola por un tiempo de dos minutos se abre nuevamente la llave a flujo continuo por espacio de cinco minutos para tomar la muestra directamente. Se toma 20ml de agua en un matraz esterilizado y con guantes estriles se siembra 1ml en 3 placas petrifilm utilizando pipetas estriles. Utilizando las placas para la determinacin de E. coli o coliformes segn sea el casos debe incubar las placas por 24 horas (+-2 hrs) y a 35c (+-1c) realizar el recuento.

CONTROL MICROBILOGICO DEL HIELO DE PROCESO. Se levanta una muestra representativa del cuarto con un recipiente estril y guantes del almacenamiento de hielo aproximadamente 4 libras, se colocan en un matraz estril se cubre con papel de aluminio para que cuando se descongele no se contamine con el ambiente del laboratorio, cuando ya se ha descongelado se buscan las placas segn la bacteria que se determinara y se agrega 1ml con una pipeta estril descartable luego se procede a incubar por 24 horas (+-2) a 35c (+1) para el recuento leer la gua de interpretacin segn la bacteria. Mtodo oficial 998.08 de la AOAC.

CONTROL MICROBIOLOGICO EN PRODUCTO FRESCO Y TERMINADO. Se levanta una muestra representativa del lote que se procesa en un recipiente estril y cubierto con guantes para no contaminar la muestra. Se realizan anlisis de recuento de Aerobios mesofilos,E. Coli, coliformes, Staphylococcus aureus y Enterobacterias Leer la gua de interpretacin para realizar el recuento. Mtodo oficial AOAC 998.08. PRUEBA RAPIDA PARA SALMONELLA. Se levanta la muestra del lote involucrado y pesa 25gr de producto (langosta, caracol, pescado etc.) Macerado en un mortero y se depositan en bolsas de polietileno esterilizadas con teniendo el medio (Revive para Salmonella) se mezcla bien y se deja a 43c debidamente rotuladas con 200 mililitros del caldo durante 4

horas. Una hora antes de las 4 horas de incubacin, se preparan las bolsas con 200 mililitros de agua destilada a una temperatura de 43c a esta se le agrega un frasco selectivo para enriquecimiento de Salmonella (Rappaport Vassiliadis Broth). Al completar las 4 horas. Ya completadas las horas se prepara el test (Salmonella test Device) esta prueba trae incluido el indicador Enchancement, al cual se le agregan 3 gotas de la muestras incubada donde se obtienen los resultados en trminos de 10 minutos, pasado este tiempo la lectura ya no es validad.

BIBLIOGRAFIA

*Mtodo Compemdium of Methods for the Microbiological Examination of Food, Fourth Edition, Frances Pouch Downes, Anlisis de Estreptococos feacalis: Capitulo 9, Pgina 83:85. Mtodo publicado en el libro Microbiologa prctica de los alimentos, segunda edicin, Diane Robert, William Hooper, Melody Greenwood, pagina 112, 113, 124, 125, 126, mtodo 5.4, 5.10. Hisopado en superficie.

**Anlisis: pueden ser todos o al menos uno de estos anlisis: Recuento Total Bacteriano a 30 C, Coliforme Totales, Coliformes Fecales, E. coli, Estafilococos aureus. Ficha tcnicas de los medios de Petrifilm 3M para recuento de E.coli/Coliformes (EC); Aerobios (AC); Enterobacteria (EB); Estafilococos aureus Staph express (ST).