UNIVERSIDAD DE ANTOFAGASTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA MDICA

Determinacin de factor v Leiden y mutacin de protrombina G20210A en una poblacin joven con antecedentes propios o familiares de trombosis.
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADO EN TECNOLOGIA MDICA EN LA MENCION DE LABORATORIO CLINICA, HEMATOLOGIA Y BANCO DE SANGRE.

Estudiantes: Javier Castillo Daz Magdalena Vera Zarate Profesores gua: Dra. Vivian Castillo lvarez Mg. Maritza Corbaln Neira

Antofagasta 2013

NDICE DEDICATORIAS...................................................................................................... 1 LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... 2 LISTA DE TABLAS ................................................................................................. 3 LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS ............................................................ 4 RESUMEN ............................................................................................................... 5 MARCO TEORICO .................................................................................................. 7 Hemostasia ......................................................................................................... 7 Regulacin del sistema de coagulacin........................................................... 8 Sistema Antitrombina III .................................................................................. 12 Sistema Protena C ......................................................................................... 14 Inhibidor de la Va Extrnseca ......................................................................... 16 Inhibidor de proteasas dependiente de protena Z ......................................... 17 Trombofilia ........................................................................................................ 18 Resistencia a Protena C activada - Factor V Leiden ..................................... 23 Mutacin del gen de la Protrombina G20210A ............................................... 28 Reaccin en cadena de la polimerasa, PCR .................................................. 34 Fundamento.................................................................................................... 36 Componentes ................................................................................................. 38

Etapas de la PCR ........................................................................................... 39 Tipos de PCR ................................................................................................. 41 Hiptesis ........................................................................................................... 41 Objetivos ........................................................................................................... 42 Objetivo principal ............................................................................................ 42 Objetivos especficos ...................................................................................... 42 MATERIAL Y MTODOS ...................................................................................... 44 Poblacin estudiada ........................................................................................ 44 Obtencin de las muestras.............................................................................. 45 Extraccin de adn a partir de sangre perifrica ............................................ 45 Estudio genotpico ........................................................................................... 46 Condiciones de amplificacin del sistema .................................................... 49 Conservacin.................................................................................................... 50 Tcnica de enzimas de digestin de Factor V ............................................... 50 RESULTADOS ...................................................................................................... 51 ANEXOS ................................................................................................................ 55 Anexo 1: Encuesta al participante para la investigacin del Factor V de leiden y Protrombina G20210A ........................................................................................ 55

Anexo 2: Certificado de consentimiento ............................................................ 56 Anexo 3: Extraccin de ADN con kit miniprep axygen de sangre perifrica ...... 58 Anexo 4: Tcnica de pcr para fragmentos de protrombina, segn port y cols. .. 60 Anexo 5: Tcnica de pcr para fragmentos de factor v, segn port y cols. ......... 61 BIBLIOGRAFA ..................................................................................................... 62

DEDICATORIAS

LISTA DE FIGURAS Figura 1: Esquema de la hemostasia primaria...9 Figura 2: Esquema de la hemostasia secundaria10 Figura 3: Fases de coagulacin..11 Figura 4: Accin anticoagulante de la antitrombina III13 Figura 5: Accin anticoagulante de la Protena C15 Figura 6: Clasificacin de los estados trombofilicos19 Figura 7: Estructura del gen que codifica para el Factor V24 Figura 8: Estructura del gen que codifica para la protrombina..29 Figura 9: Sustitucin de una Guanina por una Adenina en posicin 20210..30 Figura 10: Producto de la amplificacin de la PCR.....51

LISTA DE TABLAS
TABLA1: Poblacin estudiada.44 TABLA 2: Distribucin de los factores de riesgo utilizados en el estudio, presentes en los veinte y un casos encontrados en los encuestados52 TABLA 3: Encuestados con antecedentes tromboticos que presentan uno o ms factores de riesgo .............................................................................................................53 TABLA 4: Encuestados categorizados por sexo con antecedentes familiares...54 TABLA 5: Encuestados categorizados por sexo con antecedentes propios54

LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS

ZPI

A APC Arg ARNm AT ATIII FT G Gln IVE PAI-1 pb PC PCR PZ RCPA TAT t-PA TTPK

Adenina Protena C Activada Arginina cido Ribonucleico Mensajero Transcrito Antitrombina Antitrombina III Factor Tisular Guanina Glutamina Inhibidor De La Va Extrnseca Inhibidor Del Activador Del Plasmingeno-1 Pares De Bases Protena C Reaccin En Polimerasa En Cadena Protena Z Resistencia A La Protena C Activada Complejo Trombina-Antitrombina III Activador Tisular Del Plasmingeno Tiempo De Tromboplastina Parcial Activada Inhibidor De Proteasas Dependientes De Protena Z

RESUMEN

En el siguiente estudio

sobre la mutacin del Factor V de Leiden y de la

protrombina, realizado a una poblacin de jvenes, hombres y mujeres, de entre 18 -25 aos, con antecedentes personales y/o familiares de trombofilia, se pretende investigar la prevalencia de la patologa en la poblacin elegida de la comunidad de estudiantes de la Universidad de Antofagasta. El Factor V de Leiden, presenta una mutacin puntual del gen FV, que consiste en una sustitucin sin sentido produciendo una protena con cambio de nucletidos, Adenina (A) por una Guanina (G) en el nucletido 1692 o 1746 del Factor V (G1692), que causa la sustitucin de los aminocidos Arginina (Arg) por Glutamina (Gln) en el residuo 506 de la protena Factor V. esta alteracin es hereditaria de tipo autosmica dominante, y es la causa ms frecuente de trombofilia transmitida genticamente. La protrombina (G20210A), posee una variante gentica asociada con el aumento del riesgo de trombosis, que se localiza en la regin 3 no codificante y consiste en la sustitucin del nucletido G por un nucletido de A en la posicin 20210, presentando una prevalencia en personas con trombosis. Su distribucin geogrfica es similar a la del Factor V de Leiden. (Palomo y cols, 2004) Segn Palomo, ambas mutaciones pudieron haber tenido origen nico en Oriente Medio y luego se extendieron hacia la India y Europa durante la expansin neoltica.

Por otro lado, estudios realizados en poblaciones del norte de Europa, refieren que la presencia de estas mutaciones en homocigotos aumenta el riesgo de trombosis entre 50 y 100 veces, mientras que en heterocigoto lo aumentara de 5 a 10 veces. Actualmente existen escasos estudios que investigan la prevalencia de estos dos alelos en la poblacin general espaola y latinoamericana. Algunos trabajos sugieren que el principal factor de riesgo de trombosis en poblacin espaola seria el alelo G20210A de la protrombina, predominando este sobre el Factor V de Leiden. Por el contrario, esta ltima variante se ha descrito como ms prevalente en el norte de Europa. En el caso de Argentina y Chile, la prevalencia de ambas variantes parece ser similar y no existen suficientes estudios sobre el impacto de dichos alelos en el riesgo de trombosis. En el estudio se analiza la presencia del Factor V de Leiden y la mutacin de protrombina G20121A en una poblacin joven de la Universidad de Antofagasta, con y sin antecedentes propios y/o familiares de patologa tromboticas, este anlisis se realiz a partir de los leucocitos de una muestra de sangre perifrica, a los que se les extrajo el DNA para someterlos a travs de la tcnica de PCR a la amplificacin de los segmentos alelo especifico del gen del Factor V asociado a Factor V de Leiden y del gen de la protrombina asociado a protrombina G20210A. posteriormente se determin la prevalencia de la mutacin G20210A en el gen de la protrombina y la presencia de la mutacin FQ506 Leiden en el gen del Factor V, para, finalmente identificar la mutacin ms comn en ambos grupos de la poblacin estudiada, sometiendo los resultados a anlisis de

MARCO TEORICO 1. Hemostasia La hemostasia es el proceso que mantiene la integridad del sistema circulatorio despus de un dao vascular, (Alfaro, 2010) es decir es un proceso dinmico constituido por varios sistemas biolgicos interdependientes cuyo fin es detener el sangrado despus que se ha producido la ruptura de un vaso sanguneo, manteniendo la integridad de estos y permitiendo que la sangre siga circulando de forma fluida. (Quinteros y cols., 2004; Berkovits y cols., 201) Para comprender cabalmente este proceso es importante considerar la formacin de fibrina, la fisiologa de la fibrinlisis, los sistemas anticoagulantes naturales, los factores de riego asociados a trombosis, el conjunto de estos procesos debe funcionar adecuadamente para que la hemostasia tenga lugar y se detenga la hemorragia en los sitios traumatizados y se mantenga la sangre circulando en todos los lugares donde el endotelio del sistema circulatorio esta indemne. (Alfaro. 2010) Este proceso se realiza mediante mecanismos como el espasmo vascular o vaso constriccin de las estructuras de soporte, la formacin de un agregado o trombo de plaquetas sobre la superficie vascular lesionada a travs del Factor Von Willebrand, la cascada de coagulacin con sus dos vas (extrnseca e intrnseca) dando origen a la formacin de fibrina, y finalmente el proceso de fibrinlisis, es decir, la degradacin de las redes de fibrina formadas en el proceso de coagulacin sangunea, evitando la formacin de trombos. (Quinteros 2004; Palomo y col., 2005) y cols.,

2. Regulacin del sistema de coagulacin El sistema de coagulacin, implicado en el sistema de defensa del organismo, est encargado de la eficacia hemosttica y en conjunto con el sistema fibrinolitico regula la coagulacin, eliminando la fibrina no necesaria para la hemostasia. (Glvez y Cortes, 2011) Este sistema esta constituidos por mecanismos que incluyen: la hemostasia primaria y la secundaria, finalizando con el proceso de fibrinlisis. La hemostasia primaria o previsional, se inicia a los pocos segundos de producirse la lesin est dada por la interaccin entre las plaquetas y la pared vascular, con el fin de detener la salida de sangre. En primer lugar se produce una vasoconstriccin, y luego, las plaquetas se adhieren a las estructuras subendoteliales que han quedado expuestas por la lesin. La adhesin plaquetaria a la pared vascular est controlada por el equilibrio entre dos prostaglandinas, tromboxano A2 y prostaciclina que realizan tres funciones: aumentar la adhesin plaquetaria iniciada, aumentar la

vasoconstriccin del o los vasos sanguneos y por ultimo contribuir a la activacin de los factores de la coagulacin X y II. En algunos casos, (Figura 1) esta adhesin plaquetaria se ve beneficiada por una protena plasmtica, llamada Factor de Von Willebrand, ayudando a la agregacin de grandes cifras de plaquetas para formar el tapn plaquetario, y as sellas la lesin de la pared vascular y el cese temporal de la hemorragia. (Quinteros y cols., 2004; Glvez y Cortes, 2011)

Figura 1: Esquema de la hemostasia primaria. Se observa la formacin del tapn

hemosttico con que finaliza esta etapa. (Prez y cols., 2008)

La hemostasia secundaria, o tambin llamada fase de coagulacin, es un complejo enzimtico en el que interaccionan protenas p0lasmaticas o factores de coagulacin. (Prez y Bover, 2007; Glvez y Cortes, 2011) La coagulacin (Figura 2), consiste en una serie de reacciones en cascada transformando al fibringeno soluble en fibrina insoluble, capaz de formar el coagulo secundario estable. (Prez y Bover, 2007; Glvez y Cortes, 2011)

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Figura 2: Esquema de la hemostasia secundaria. Esta etapa culmina con la formacin

del coagulo secundaria estable. (Prez y cols., 2008)

La fibrinlisis es la etapa donde se elimina la fibrina no necesaria, para reparar el vaso daado y restablecer el flujo sanguneo, con el proceso de cicatrizacin. (Prez y Bover, 2007; Glvez y Cortes, 2011) La fibrinlisis consta con activadores fisiolgicos, siendo los principales el activador tisular y el urinario del plasminogeno. Estos se difunden desde las clulas endoteliales y convierten el plasminogeno en plasmina; encargada de degradar la fibrina atacando las uniones peptdicas en la regin triple hlice de los monmeros. En estas fases siempre existe la interaccin entre la pared vascular y la sangre. . (Prez y Bover, 2007; Glvez y Cortes, 2011) Estos mecanismos de hemostasia (primaria y secundaria) a su vez constan de tres fases de coagulacin (Figura 3): una inicial, fase de amplificacin y fase de propagacin. (Prez y Bover, 2007)

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Figura 3: Fases de coagulacin. Se indican las fases inicial, de amplificacin y de

propagacin. (Prez, 2007)

La fase inicial comienza con el contacto de la sangre con el sub endotelio, formando el complejo Factor tisular (FT) Factor VII, que en una lesin tisular, activa de forma directa e indirectamente el Factor X a travs del Factor IX. El Factor X transforma pequeas cantidades de protrombina en trombina, siendo cantidades insuficientes para la formacin de fibrina, pero que son necesarias para la activacin de plaquetas y del Factor VIII durante la siguiente fase. (Prez y Bover, 2007; Glvez y Cortes, 2011) La fase de amplificacin es un proceso de retroalimentacin donde las pequeas cantidades de trombina, junto con el calcio de la sangre y los fosfolpidos cidos provenientes de las plaquetas, amplifican la seal inicial y activan los factores XI, IX, VIII y V, que se ensamblan en la superficie plaquetaria. Es aqu donde ocurren las plaquetas en lugares donde se ha expuesto el FT. (Prez y Bover, 2007; Glvez y Cortes, 2011)

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Posteriormente en la fase de propagacin, el complejo tenasa (VIIIa, IXa, Ca ++ y fosfolpidos) permite activar grandes cantidades del Factor y formar el complejo protrombinasa (Xa, Va, Ca++ y fosfolpidos), para convertir la protrombina en trombina y, a expensas de esta, el fibringeno en fibrina, en la superficie plaquetaria para formar un coagulo resistente a la lisis. (Glvez y cortes, 2011)

Estos procesos son regulados por sistemas anticoagulantes naturales, presentes e el endotelio vascular, siendo los ms importante la antitrombina III (ATIII), el sistema de la protena C y S y el inhibidor del FT; que son los encargados de mantener la hemostasia, y evitar la excesiva produccin de trombina (Palomo y cols., 2005 2.1 Sistema Antitrombina III

La Antitrombina (AT), descrita en 1939 por Brinkhous y cols., es una glicoprotena plasmtica con peso molecular de 58 kDa perteneciente al grupo de las serpinas (inhibidores de serin-proteasas), es el principal inhibidor de la trombina (Factor IIa), Factor Xa y en menos medida de los factores IXa, XIa, XIIa, VIIa, asi como d la plasmina. Proporciona el 80% del efecto anticoagulante natural contra la trombina y, junto a las protenas C y S, participa en el ms importante de los sistemas de anticoagulacin. (Muedra y cols., 2012)

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La AT se encuentra bajo 2 formas estructurales: la alfa-antitrombina (casi el 90%) y la beta antitrombina, que carece de un oligosacrido prximo al punto de enlace con la heparina, lo que la hace ms a fin a esta. Su accin depende de 2 sitios activos: uno que cumple una funcin proteoltica y otro que posibilita la unin de la heparina. En presencia de heparina la actividad de AT se incrementa fuertemente. (vila, 2006; Muedra y cols., 2012)

Su accin sobre la trombina depende de la unin de su sitio activo (Arg-393) y sobre el sitio Serina de la trombina (Figura 4), para asi formar el complejo Trombina-antitrombina III (TAT), el cual es inactivo e irreversible. (Muedra y cols., 2012) Figura 4: Accin anticoagulante de la antitrombina III. Se observa el complejo
heparina antitrombina III cuyo efecto se logra con la unin de la Arginina sobre el sitio Serina de la trombina. (Zabalegui, 2000)

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Cuando el complejo heparina-AT se une a la trombina, no consigue efecto inhibidor a menos que se establezca un enlace extra, heparina-trombina. La heparina se une a la trombina en el aminocido ARG-47 lo cual potencia la reaccin de la AT III sobre la trombina, incrementando su capacidad inhibitoria. Este segundo enlace puede presentarse en la heparina y la AT actan de modo sinrgico, de modo que la ausencia de esta ltima hace que no se pueda producir la interaccin con la heparina. (Muedra y cols., 2012)

2.2

Sistema Protena C

La actividad anticoagulante de la protena C (PC) fue reconocida en 1960 por Mammen y cols. Aos ms tarde, en 1976, fue identificada por Stenflo como uno de los picos en la cromatografa de las protenas vitamina K dependientes (pico C) por lo que se le denomino PC. (Zamora, 2013) La PC es una glicoprotena tipo serpina de sntesis he aptica que pertenece al grupo de las protenas dependientes de vitamina K, que mediante un proceso de carboxilacion convierte el precursor inactivo, PC acarboxica, en una molcula funcional: PC carboxilada. Circula en el plasma como cimgenos y est constituida por 3 cadenas poli peptdicas ligadas una con otra por puentes bisulfuros: la cadena ligera tiene los residuos Gln que permite la fijacin de la PC con los fosfolpidos por medio de iones calcio, y la cadena pesada que tiene el sitio cataltico necesarios para la fijacin al calcio y fosfolpidos; transformndose en una enzima activa, cuya activacin depende de un cofactor situado en la superficie endotelial denominado trombomodulina (Figura 5). La trombina unida a este cofactor pierde su capacidad para activar plaquetas y formar el coagulo de fibrina. (Zamora y cols., 2012)

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Figura 5: Accin anticoagulante de la Protena C. Se observa la accin de la

trombomodulina en el proceso anticoagulante de la trombina. (Prez y cols., 1997)

La protena C activada (APC) es un mecanismo importante de regulacin del proceso de coagulacin al neutralizar la actividad procoagulante de los cofactores Va y VIIIa, mediante la accin conjunta de la protena S. de esta forma ayuda a limitar la extensin del trombo, actuando como el principal regulador del proceso de coagulacin. Adems, la APC favorece el incremento de la fibrinlisis al inhabilitar el inhibidor del activador del plasminogeno-1 (PAL-1) , del activador

tisular del plasminogeno (t-PA) y de la uroquinasa. (Daz y Almagro, 2001) La deficiencia de PC puede ser clasificada en dos tipos: Tipo 1: la disminucin de la sntesis de la molcula, que provoca un descenso en los niveles de la protena y de su funcin. Tipo 2: la presencia de una protena anmala desde el punto de vista funcional, pero con niveles cuantitativos normales. (Zamora y cols., 2013)

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2.3

Inhibidor de la Va Extrnseca

El inhibidor de la Va Extrnseca (IVE) es una molcula cargada negativamente en su extremo amino terminal, seguida por tres dominios inhibitorios tipos Kunitz y un extremo carboxilo-terminal varado positivamente. Este inhibidor regula la actividad cataltica del complejo macromolecular Factor VIIa/FT y pertenece a la familia de los inhibidores de proteasas tipo Kunitz. En el plasma humano existen de dos formas principales y varias formas adicionales de menor peso molecular, en condiciones basales la mayora de los IVE circulan asociado con lipoprotenas. (Daz y Almagro, 2001; Forastiero y Martinuzzo, 2006) Las plaquetas contienen aproximadamente el 8% del IVE y posiblemente, este se libera de plaquetas activadas en el sitio de la lesin, lo que elevara sustancialmente su concentracin. La fuente endgena principal del IVE es el endotelio vascular, donde es liberado despus de la infusin de heparina, elevndose sus niveles plasmticos. (Daz y Almagro, 2001) El IVE acta inhibiendo al Factor X directamente, mientras que la inhibicin del Factor VIIa requiere de la presencia simultnea de Factor Xa; mientras que la inhibicin del Factor VIIa procede en dos etapas: en la primera se forma el complejo Factor Xa-IVE, que en una segunda etapa se une con el complejo

Factor VIIa/FT y forma un complejo cuaternario Factor Xa-IVE-VIIa-FT. Una hiptesis alternativa plantea la unin directa del IVE-FT con el complejo Factor VIIa-FT-Xa. A concentraciones supra fisiolgicas, el IVE inhibe al complejo Factor VIIa-FT en ausencia de Factor Xa. (Daz y Almagro, 2001)

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2.4

Inhibidor de proteasas dependiente de protena Z

La protena Z (PZ) es una glicoprotena plasmtica de 62 kDa dependiente de vitamina K. tiene una vida media en plasma de aproximadamente 2,5 das. Acta como cofactor de la inactivacin del Factor Xa por el sistema inhibidor de proteasas dependientes de protena Z (ZPI). Junto con la AT y el IVE juega un rol crucial en el control de los niveles del Factor Xa. (Forastiero y Martinuzzo, 2006) El ZPI es una protena de 72 kDa que pertenece a la sper familia de serpinas de inhibidores de proteasas pero que contienen un residuo de Tirosina en sus sitios reactivo. La PZ circula formando un complejo con el ZPI. Este inhibidor es capaz de inhibidor el Xa en presencia de fosfolpidos y Ca ++ , pero la velocidad de esta inhibicin se incrementa hasta 1000 veces en presencia de PZ. La heparina no tiene efecto en la velocidad de reaccin en presencia de PZ, pero si la incrementa en ausencia de PZ. Hay evidencias de que en el proceso inhibitorio se formara un complejo estequiometrico de PZ-ZPI-Xa en la superficie fosfolipidica. El ZPI no tiene efecto sobre IIa, meizotrombina, VIIa, XIa, XIIa, kalicreina, APC, plasmina, tripsina, etc. EL XIa no obstante, es inactivado por el ZPI es consumida durante la coagulacin a travs de la protelisis mediada por el complejo PZ-Xa y por XIa. (Forastiero y Martinuzzo, 2006)

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3. Trombofilia Cuando hablamos del concepto de trombofilia, descrita por el patlogo alemn Virchow, en el siglo XIX, hablamos de cambio en la composicin de la sangre. Esto ltimo es lo que conocemos como trombofilia o hipercoagulabilidad, es as como se gesta el concepto de trombofilia, que consiste en una alteracin en el sistema de la hemostasia, ya sea heredada o adquirida, que promueve y/o facilita la presentacin de un fenmeno trombotico, el cual habitualmente afecta al territorio venoso. (Lim y Ocquetau, 2001; Kiekebusch y Perucca, 2003; Srur y cols., 2004) Clsicamente se han diferenciado los estados tromboticos en dos grandes grupos: hereditarios y adquiridos. Si bien esta clasificacin es til en categorizar las causas de trombosis y dirigir el estudio, actualmente es bastante simplista. (Figura 6)

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Figura 6: Clasificacin de los estados tromboflicos. Estados de hipercoagulabilidad.

CONGENITOS Dficit de AT III Deficiencia de protena C Deficiencia de protena S Deficiencia de cofactor II de la herparina Disfibrinogenemias Patologa de la fase contacto Patologa del sistema fibrinoltico

Hipoplasminogenemia Displaminogenemia Dficit de t-PA

Aumento de PAI-1 RPCA FV Leiden Protrombina G20210A

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ADQUIRIDOS Primarios Sndrome antifosfolpido primario Secundarios Anomalas de coagulacin y fibrinlisis Sepsis Neoplasias Embarazos Ciruga mayor Anticonceptivos orales Infusin de concentrados protromboticos Sndrome nefrtico Anomalas plaquetarias Sndromes mieloproliferativos Hiperlipemia Diabetes mellitus Trombopenia heparino-dependiente Anomalas vasculares y reologicas Estasis venoso Superficies artificiales Hipervicosidad Purpura trombotica trombocitopenica Vasculitis

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La trombofilia adquirida se puede definir como un estado de hipercoagulabidiad asociado con un incremento del riesgo trombotico. Existen diversas causas siendo la ms comn el Sndrome Antifosfolipidico, tambin llamado Sndrome de Hughes, se puede considerar como la asociacin de al menos una conducta predisponente y adems, en presencia de un anticuerpo antifosfolipido. Aunque inicialmente estos anticuerpos se describieron en paciente con Lupus, se han observado en asociacin con un gran nmero de enfermedades autoinmunes, infecciosas, neoplsicas y hematolgicas. Sin embargo en el 50% de los casos no se detecta una enfermedad de base que lo explique y en ese caso se lo considera como primario. Entre las restantes causas mencionadas se encuentran la hiperhomocisteinemia adquirida que se debe a dficit de vitamina B12, B6, o cido flico; los Sndromes mieloproliferativos se asocian con frecuencia a eventos tromboticos y finalmente se menciona como una causa probable el padecimiento de algunas neoplasias.

El termino trombofilia hereditaria reconoce la presencia de factores hereditarios que, por si solos, predisponen hacia la trombosis, pero que debido a la naturaleza episdica de estas, requieren interaccin con otros componentes antes de la presentacin clnica de la enfermedad. Por tanto, la definicin ms completa de la trombofilia hereditaria puede formularse asi: La trombofilia hereditaria es una tendencia hacia el trombo embolismo genticamente determinada. Anomalas dominantes o combinaciones de defectos menos importantes puede ser ser clnicamente aparente desde edades tempranas, recurre con frecuencia y suele existir historia familiar. (Sans y cols., 2007)

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Ya han pasado casi 150 aos desde que Virchow describi el concepto de trombofilia y no fue hasta 1965, en que Egeberg describi por primera vez una condicin heredada de trombofilia asociada al dficit de AT III. Posteriormente, en la dcada de los 80 se describen el dficit de protena C y S y recin en 1993, la resistencia a la APC y la mutacin G20210A del gen de la protrombina, y en el ao 1996, el polimorfismo FV Leiden descrita por Poort y cols. La prevalencia del Factor V Leiden y de la mutacin de la protrombina G20210A es de aproximadamente 1,3% y 2,5%, respectivamente, en la poblacin no indgena en Chile. (Lim y Ocquetau, 2001; Palomo y cols., 2005)

La frecuencia de Trombofilia en la gestacin es seis veces mayor que en la poblacin general, que se explica en parte porque el embarazo condiciona un estado de hipercoagulabilidad y protrombtico, con factores coagulantes aumentados (Von Willebrand, Factor VIII, Factor V y Fibringeno) y con niveles disminuidos de anticoagulantes naturales (reduccin de la protena S, resistencia aumentada a la anticoagulacin de la protena C), cambios que se asocian al stasis venoso progresivo hacia el trmino y a la injuria endotelial de vasos pelvianos que ocurre en el parto. (Hasbu y Conte, 2003) A este hecho fisiolgico se pueden agregar factores adquiridos para Trombofilia en el embarazo que tambin promueven stasis venoso e hipercoagulabilidad: edad materna sobre 30 aos, paridad mayor de 4, obesidad, grupo sanguneo distinto de O, reposo en cama o inmovilizacin prolongada, tromboembolismo en gestacin anterior y operacin cesrea. Sin embargo, en esta multicausalidad, la mayor frecuencia de Trombofilia en la gestacin se explica tambin por la presencia, inadvertida hasta hace pocos aos, de la condicin asociada de trombofilia. (Hasbun y Conte, 2003)

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3.1 Resistencia a Protena C activada - Factor V Leiden

En 1993, Dahlbck y cols., describieron una familia en la cual varios de sus miembros presentaban resistencia a la accin de la protena C activada (RCPA), fenmeno que se asociaba a un aumento en el riesgo de trombosis venosa. Y en 1994, Bertina y cols. dan a conocer la alteracin gentica ms frecuente

relacionada con dicha resistencia, la cual corresponde a una mutacin del gen, que consiste en un polimorfismo de nucletido simple situado en el exn 10 del brazo corto del cromosoma 1 humano (Figura 7). Ocurre como una sustitucin sin sentido produciendo una protena con cambio de nucletidos, A por una G en el nucletido 1691 o 1746 del Factor V (G1691A), que causa que se forme un nuevo codon que cambie la Arg por Gln en el residuo 506 de la protena Factor V, la protena resultante de este cambio se conoce como Factor V Leiden, FV:Q506 FV R506Q. Este cambio se traduce en una alteracin en la inactivacin del Factor Va por la APC, ya que el primer sitio de corte de la enzima es precisamente a nivel de la Arg 506. Adems se ha demostrado recientemente que el Factor V constituye un cofactor en la accin anticoagulante de la APC, funcin que tambin se encuentra comprometida en el Factor V Leiden. Este defecto molecular provoca que el Factor V Leiden se inactive 10 a 20 veces ms lentamente que la forma nativa. Cuando el Factor V se mantiene activo, facilita la superproduccin de trombina que conduce a la generacin de fibrina en exceso y el exceso de coagulacin lo que se traduce en un aumento en el riesgo de trombosis venosa de 6 a 8 veces el de la poblacin general. (Kiekebusch y Perucca, 2003; Palomo y cols., 2005)

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Figura 7: Estructura del gen que codifica para el FV. Ubicacin citogentica 1q23
Ubicacin Molecular en el cromosoma 1: 169 481 191 pares de bases de 169.555.768. El gen FV se encuentra en el brazo largo (q) del cromosoma 1 en la posicin 23. Ms precisamente, el gen FV se encuentra desde el par de bases 169 481 191 a 169 555 768 pares de bases en el cromosoma 1.

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En una persona normal, el Factor V es una glicoprotena plasmtica de 300 KDa, de sntesis heptica, que se activa por la trombina, y es el cofactor del factor Xa en el complejo protrombinasa (Xa Va). Tambin funciona como cofactor para permitir que el Factor X active una enzima llamada trombina. La trombina, a su vez se une al fibringeno para convertirla en fibrina, la cual polimeriza para formar la malla densa que constituye la mayor parte de un cogulo sanguneo. La APC es un anticoagulante natural que acta para limitar el alcance de la coagulacin escindiendo degradantes y al mismo Factor V. (Sans y cols., 2007) El tipo de herencia de esta alteracin es autosmico dominante, que presenta dominancia incompleta, los heterocigotos tienen 5-10 veces ms riesgo de sufrir un episodio de trombosis venosa que la poblacin general, y los homocigotos tienen 91 veces ms riesgo donde tambin es importante sealar que un 5-10% de los individuos con RCPA no son portadores de la mutacin R506Q. Adems se ha demostrado recientemente que la RCPA por s misma, independiente de la presencia de Factor V Leiden, constituye un factor de riesgo para trombosis venosa. (Kiekebusch y Perucca, 2003; Palomo y cols., 2005) Existen otras dos mutaciones en el mismo gen que consiste en una transicin de G por Citosina en el nucletido 1091 el cual es responsable de la sustitucin del aminocido Arg por Treonina en la posicin 306 llamadas Factor V Cambridge. La segunda mutacin consta de una transicin de Arg por G en el nucletido en posicin 1090, en el exn 7 del gen del Factor V, producindose esta vez el cambio de aminocido Arg por Glicina en la posicin 306 llamada mutacin Hong Kong. Tambin producen RCPA aunque su papel en la trombofilia no est bien establecido, ya que son muy poco frecuentes. La RCPA puede observarse de manera adquirida en individuos con niveles altos de Factor VIII, pacientes con anticoagulante lpico y mujeres embarazadas. (Kiekebusch y Perucca, 2003)

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La frecuencia de la RCPA vara de un 3-6% en poblacin sana, existiendo diferencias raciales en la prevalencia de RCPA (caucsicos 5,27%; hispanos 2,27%; nativos americanos 1,25%; afroamericanos 1,23%; asiticos 0,45%), encontrndose los valores ms altos en poblaciones del norte de Europa. Si se considera el conjunto el desequilibro de ligamiento entre Factor V Leiden y otros polimorfismos del Factor V, los patrones de distribucin geogrfica sugieren un efecto fundador, es decir, todos los individuos que portan la mutacin R506Q comparten un ancestro comn. La alta frecuencia de Factor V Leiden en algunas poblaciones sugiere que podra conferir un efecto protector durante la evolucin. Por ejemplo, la hipercoagulabilidad asociada a la presencia de R506Q puede haber otorgado proteccin contra sangrados excesivo durante el parto. La ciruga, el uso de anticonceptivos orales y la naturaleza sedentaria de la vida moderna constituyen factores circunstanciales de riesgo a los cuales no se encontraban expuestos nuestros ancestros. (Kiekebusch y Perucca, 2003; Palomo y cols., 2005) Es importante destacar que el riesgo de trombosis venosa en el embarazo, en mujeres con RCPA, es de 0,2% (1 en 500), por otra parte cerca del 80% de las trombosis venosa que se presentan durante el embarazo corresponden a una RCPA y de estas aproximadamente el 46% portan el Factor V Leiden, es decir, la RCPA es la causa ms frecuente de trombosis venosa en el embarazo, pero su potencia trombognica es moderada. (Kiekebusch y Perucca, 2003)

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El riesgo de trombosis de los individuos no depende solamente de la presencia de la mutacin R506Q, sino tambin de la coexistencia de otros factores de riesgo genticos o adquiridos. Esto ha quedado demostrado en numerosos estudios en que se ha encontrado una alta incidencia de trombosis en individuos portadores de la mutacin R506Q una combinacin con hiper homocisteinemia, deficiencias de PC, Protena S o ATIII. Factores de riesgo adquiridos que se asocian a trombosis en paciente con RPCA son el uso de anticonceptivos orales (unas 30 veces ms de riesgo), trauma y ciruga. (Palomo y cols., 2005) Existen varias maneras de demostrar la resistencia a la protena C. El test original de medir tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPK) antes y despus de adicionar APC, fue modificado para ser utilizado en pacientes que estn recibiendo anticoagulantes. Se agrega APC en el plasma del paciente diluido 1:4 con plasma con dficit Factor V. Se obtiene la relacin APC dividiendo TTPK previo y posterior a la adicin del APC. Se considera anormal una relacin menor a 2. Existen falsos positivos, en especial, la presencia del anticoagulante lpico. Adems se puede detectar la presencia de la mutacin Factor V de Leiden mediante reaccin en polimerasa en cadena (PCR), aunque este mtodo no detecta otras causas de RCPA. (Palom y cols., 2005)

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3.2 Mutacin del gen de la Protrombina G2021 0A

El FII o protrombina humana es una glicoprotena de Peso Molecular igual a 72 kD, de cadena simple, vitamina K dependiente y con una vida media de alrededor de tres das. Es una protena sintetizada en las clulas del parnquima heptico. La protrombina mediante el complejo protrombinasa es convertido a trombina, el efecto final de la cascada de la coagulacin, que conduce a la formacin de fibrina. (Lim y Ocquetau, 2001) La protrombina es una enzima clave en el equilibrio entre procoagulacin y anticoagulacin porque promueve la coagulacin por retroalimentacin positiva y tambin promueve la anticoagulacin mediante la activacin de la va de la protena C.

El gen responsable de la protrombina contiene aproximadamente 21.000 pares de bases (pb), que consta de 14 exones y 13 intrones, situadas cerca del centrmero en el cromosoma 11 en posicin 11p11-q12 (Figura 8). Cada uno de estos exones es responsable de la expresin de todos o parte de los dominios funcionales de la protrombina. El cido ribonucleico mensajero transcrito (ARNm) al que da lugar tiene 2,1 Kb incluye una regin 5 no traducida, una secuencia de lectura y una regin 3 no traducida de 97 pb. (Zabalegui, 2011; Herkenhoff y cols., 2012)

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Figura 8: Estructura del gen que codifica para la protrombina.

Ubicacin Citogentica: 11p11. Ubicacin Molecular en el cromosoma 11: pares de bases 46.740.742 a 46.761.055 46.740.742 a 46.761.055

El gen F2 se encuentra en el brazo corto (p) del cromosoma 11 en la posicin 11. Ms precisamente, el gen F2 se encuentra desde el par de bases 46.740.742 a 46.761.055 pares de bases en el cromosoma 11.

En 1996, Poort y cols. identificaron una mutacin puntual en el gen de la protombina, dando lugar a la denominada protrombina G20210A. Esta consiste en una sustitucin del nucletido G por A en la posicin 20210A (Figura 9), situado cerca de un sitio de escisin del ARNm cuya cola poli-A se aade. Esto ocurrira en el gen de la protrombina en una regin 3 no traducida. (Dasi, 2001; Herkenhoff y cols., 2012)

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Figura 9: Polimorfismo G20210A.

Este polimorfismo consiste en una sustitucin de una Guanina por una Adenina en el nucletido de posicin 20210 del gen perteneciente la regin 3 no traducida. (Zabalegui, 2000)

Esta mutacin parece trasmitirse con carcter autosmico dominante y aumenta el riesgo a padecer procesos trombticos venosos y arteriales. Aunque el nivel de protrombina est significativamente elevado, la medida del tiempo de protrombina como test global no es til para el diagnstico. El diagnstico se realiza mediante la deteccin allica, tcnica de biologa molecular basada en PCR y digestin enzimtica. (Dasi, 2001) La mutacin G20210A se asocia a un aumento del nivel plasmtico de la protrombina, especialmente en los homocigotos (A/A). La elevacin plasmtica de la protrombina se asocia con la inhibicin de la protena S, cofactor de la protena C activa; tambin disminuye la actividad anticoagulante no dependiente de la protena C activa lo que aumenta el riesgo de trombosis. (Palomo y cols., 2005)

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Este polimorfismo se asocia con un incremento de 3 veces el riesgo de sufrir un evento trombtico venoso en heterocigotos (G/A), comparado con individuos normales homocigotos (G/G). La importancia de la mutacin protrombina G20210A en la trombosis arterial an no est suficientemente clara. (Palomo y cols., 2005) Desde su primera descripcin se encontr que los portadores heterocigotos del defecto presentaban niveles de protrombina significativamente ms altos (130%) comparados con los homocigotos para la forma 20210 GG (105%). Los individuos portadores de la forma 20210 AA tienen niveles de Factor II de alrededor de 170%. Debido a que el riesgo de trombosis venosa aumenta con los niveles de protrombina, es hipottico que la hiperprotrombinemia seria el mecanismo fisiopatolgico de la predisposicin a la trombosis. Esta hiptesis se ha comprobado recientemente en un estudio en el que observ que en familias portadoras del defecto, el anlisis de ligamiento demostr que la mutacin G20210A influa simultneamente sobre el nivel de protrombina y el riesgo de trombosis. (Palomo y cols., 2005)

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La prevalencia de G20210A parece depender, al igual que en el caso del FV Leiden, de la etnia y distribucin geogrfica elegida en los distintos estudios. En el citado estudio Poort y cols. observan que la prevalencia de la mutacin en la poblacin general era del 2,3%, si bien en estudios posteriores se comprob que vara segn el rea geogrfica considerada. (Zabalegui, 2011)

Segn Herkenhoff y cols. esta mutacin representa el 1 - 3% en la poblacin caucsica, con un riesgo de 2,8 veces para la trombosis. Esta mutacin no se ha encontrado en pacientes de raza negra o asitica hasta la fecha, lo que indica que estos grupos no tienen la frecuencia de mutacin o es muy poco frecuente. (Herkenhoff y cols., 2012) Sin embargo, Palomo y cols. determinan que la prevalencia de este polimorfismo en el sur de Europa es de 2,3% a 6,5%, no as como en el norte de Europa que es de 1,2% - 2,6%. Roseendal y cols. observan una mayor tendencia a portar el polimorfismo en el sur de Europa (3%) que en el norte (1,7%).

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Entre la poblacin espaola, las cifras de prevalencia que se han publicado son muy variadas. (Palomo y cols., 2005; Zabalegui, 2011)

Sin embargo, Palomo y cols. determinan que la prevalencia de este polimorfismo en el sur de Europa es de 2,3% a 6,5%, no as como en el norte de Europa que es de 1,2% - 2,6%. Roseendal y cols. observan una mayor tendencia a portar el polimorfismo en el sur de Europa (3%) que en el norte (1,7%). Entre la poblacin espaola, las cifras de prevalencia que se han publicado son muy variadas. (Palomo y cols., 2005; Zabalegui, 2011)

En Brasil, hay pocos datos en la literatura debido a que este factor de riesgo es relativamente reciente, y hasta ahora, no han sido verificadas las bibliografas relativas a la incidencia de la mutacin de la protrombina en individuos del sur de Brasil. (Herkenhoff y cols., 2012) Hasta ahora no es claro el papel que pueda jugar la mutacin G20210A en la enfermedad trombotica arterial. Aunque varios estudios no han demostrado asociacin de la mutacin con infarto de miocardio y accidente cerebro vascular en poblaciones mayores, varios estudios sugieren que puede ser importante en la gnesis de arteroesclerosis prematura, especialmente asociada a otros factores de riesgo como fumar cigarrillos e hipertensin. (Palomo y cols., 2005)

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4. Reaccin en cadena de la polimerasa, PCR

Durante las ltimas dos dcadas han surgido una serie de procedimientos de laboratorio que facilitan en mucho el anlisis del ADN; entre ellos, la reaccin en cadena de la polimerasa, o PCR (Polymerase Chain Reaction), probablemente es el que ha tenido el mayor impacto en el avance reciente de la biologa molecular. En los estudios genticos, se hace referencia al impacto de esta tcnica, dado que en 1989 se publicaron ms de 800 artculos de investigacin y alrededor de 2000 durante 1992. (Arredondo, 2005) Esta tcnica es un mtodo in vitro que fue desarrollada en 1983 por el Doctor Kary Mullis, quien recibi en 1993 el Premio Nobel de Qumica por aquel descubrimiento. Como en el caso de muchas invenciones, el descubrimiento de la PCR tuvo lugar buscando la solucin a otro problema. De hecho, antes de la PCR existan mtodos para aislar fragmentos de DNA basados en la clonacin, pero estos mtodos resultaban mucho ms costosos en tiempo y en dinero. Ya podemos intuir, aun sin conocer los detalles, la importancia del descubrimiento de la PCR. (Prez, 2006) La Reaccin en cadena de la polimerasa hace posible el estudio y anlisis de una amplia gama de genes, que incluso pueden obtenerse a partir de un genoma complejo, como es el de los mamferos, donde pueden existir alrededor de 100.000 genes. (Torres y Baca, 1995)

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Esta tcnica permite amplificar a gran escala regiones especficas del ADN o ARN, sin tener que clonarlo; logrando la obtencin de un gran nmero de copias de los fragmentos de ADN o ARN, facilitando la manipulacin posterior de los fragmentos amplificados, para as lograr la distincin del resto del ADN total extrado. (Rodrguez y Barrera, 2004; Prez y Arredondo, 2005) Pero la PCR no es slo una tcnica especfica, sino tambin muy sensible. Tambin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo. (Rodrguez y Barrera, 2004) Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas. (Torres y Baca, 1995)

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4.1 Fundamento

El mtodo se basa en las caractersticas de la estructura qumica del ADN y su replicacin semi conservativa, es decir, es un polmero formado por dos cadenas complementarias. Para duplicarse, el ADN se separa en sus dos cadenas complementarias; as, cada una de ellas sirve de molde o plantilla. Al final del proceso se obtendrn dos molculas de ADN, cada una de ellas formada por una cadena original y una cadena complementaria que ha sido sintetizada de novo. (Torres y Baca, 1995) El procedimiento consiste en realizar ciclos repetitivos de desnaturalizacin del ADN molde, el alineamiento de dos oligonucletidos se alinean en los extremos del fragmento del ADN molde que se desea amplificar, de tal manera que despus de la sntesis de la cadena complementaria se desnaturaliza con calor, el dplex resultante dar lugar a una amplificacin exponencial segn las veces que se haya repetido el ciclo. (Arredondo, 2005)

37

Este

proceso se lleva a cabo en tres fases: desnaturalizacin, hibridacin y

elongacin. En primer lugar es necesario que el ADN se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de ADN se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalizacin y se lleva a cabo elevando la temperatura alrededor de 94C. El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al ADN molde. Esta segunda fase se conoce como hibridacin. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60C. Por ltimo, en la fase de elongacin o extensin, la enzima polimerasa incorpora nucletidos complementarios a partir del extremo 3 lib re de la regin en que se han hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongacin suele ser de 72C. (Prez, 2006) Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95C en las fases de desnaturalizacin del ADN) protena, se emplean suponen la inmediata desnaturalizacin de toda polimerasas termoestables, extradas de

ADN

microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos.

Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy posesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de errores. (Torres y Baca,1995)

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Como una caracterstica importante, el ADN molde puede estar en forma pura o formar parte de una mezcla de biomoleculas, y adems puede presentar cierta degradacin; esto ha permitido amplificar fragmentos a partir de muestras de tejidos cerebral momificado, e inclusive a partir de un mamut congelado que data de unos 40.000 aos de antigedad. (Arredondo, 2005)

4.2 Componentes

Para realizar una PCR se necesita mezclar en un tubo el ADN que contiene la secuencia a amplificar, que depender de la fuente utilizada, e idealmente se requieren aproximadamente de 300 nanogramos a 1 microgramo de ADN genmico. Ambos cebadores o iniciadores tiene que ser complementarios a una de las dos hebras del ADN, estos van a permitir que la polimerasa inicie la reaccin. (Torres y Baca, 1995; Rodrguez y Barrera, 2004) La mezcla de los cuatro desoxirribonuclesidos trifosfatados (dNTPs) deben estar presentes en cantidades suficientes, ya que en concentraciones mnimas disminuyen el ndice de incorporacin de los nucletidos. Tambin se necesita un tampn de reaccin para la polimerasa, as como agua ultrapura para completar el volumen final de reaccin (que normalmente oscila entre 20 y 100 l), y como ingrediente final crucial para la reaccin debe estar presente la enzima ADN polimerasa termoestable. (Torres y Baca,1995; Rodrguez y Barrera, 2004) Se puede utilizar un termociclador, aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

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4.3 Etapas de la PCR

Tres son los pasos a seguir y a repetir por cada ciclo de la PCR. A stos comnmente se les refiere como desnaturalizacin, alineamiento y extensin. Si se trabaja con ADN genmico, regularmente se agrega una etapa previa de desnaturalizacin a 94C, para relajar las posibles estructuras secundarias y de otros tipos. Despus de concluida sta, se repiten los diferentes ciclos en los que tanto la temperatura como el tiempo sern especficos del producto a amplificar y del origen del cido nucleico que servir, como ya se mencion, de plantilla o molde a copiar por la polimerasa utilizada. (Rodrguez y Barrera, 2004) Desnaturalizacin

En primer lugar, se requiere un sustrato para la PCR que es el ADN de simple cadena que acta como molde para la sntesis de su nueva cadena complementaria. Se desnaturaliza el ADN; se separan las dos cadenas de las cuales est constituido. Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el ms comn el calentamiento a 94 95C, durante por lo menos un minuto. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la actividad de la enzima decrece de manera muy rpida a partir de los 95C, por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubacin. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin. (Rodrguez y Barrera, 2004)

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Alineamiento o unin del cebador

En una segunda fase se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40 - 68C durante 20 - 40 seg., permitiendo as el alineamiento. La enzima, como todas las ADN polimerasas, necesita del grupo OH- libre en el extremo 3 del iniciador ya apareado al sitio blanco de la amplificacin, a partir de donde se inicia la sntesis. Este punto constituye el sitio de crecimiento de la cadena complementaria al molde para luego as la polimerasa unir el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empezar a sintetizar el ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada. (Rodrguez y Barrera, 2004) Extensin o elongacin de la cadena

Con el ADN molde de cadena sencilla, excepto en los sitios donde los iniciadores se aparean, la polimerasa empieza a copiar la hebra, incorporando dNTP en direccin 53. Esta etapa debe realizarse a una temperatura alta, que es la que coincide con la mxima actividad de la polimerasa (72C) para evitar alineamientos inespecficos de los iniciadores. El tiempo de extensin depende del tamao de la amplificacin, debiendo estimar un min. para alargar 1.000 nucletidos. Es comn que al finalizar todos los ciclos se realice un ltimo alargamiento por 5 min. a 72C, para asegurar que todos los productos de amplificacin estn completamente terminados y tengan, por ende, exactamente la misma longitud. (Rodrguez y Barrera, 2004)

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Elongacin final

Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70 - 74C durante 5 - 15 min. tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado.

4.4 Tipos de PCR PCR anidada PCR de extensin solapada (Mutagnesis) PCR in situ PCR mltiple PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)

5. Hiptesis Los antecedentes de trombofilia en la poblacin joven incrementan la posibilidad de encontrar la mutacin del Factor V de Leiden y del gen de la protrombina G20210A.

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6. Objetivos 6.1 Objetivo principal

Demostrar la presencia del Factor V de Leiden y la mutacin de Protrombina G20210A en una poblacin joven de la Universidad de Antofagasta, con y sin antecedentes propios y/o familiares de patologas tromboticas y cuyas edades fluctan entre los 18 y 25 aos edad.

6.2 Objetivos especficos

Realizar 100 encuestas, al azar, a estudiantes de la Universidad Antofagasta. (Anexo 1)

de

Seleccionar a los estudiantes que presenten antecedentes propios y/o familiares de patologas tromboticas para la extraccin de sangre perifrica. Realizar toma de muestra por puncin venosa a los participantes seleccionados. Extraer el ADN a partir de la muestra de sangre perifrica de cada participante.

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Realizar PCR para la amplificacin de los segmentos alelo especfico del gen del Factor V asociado a Factor V Leiden y del gen de la protrombina asociado a protrombina G20210A.

Determinar la prevalencia de la mutacin: G20210A en el gen de la Protrombina. Determinar la prevalencia de la mutacin: FQ506 Leiden en el gen del factor V. Identificar la mutacin ms comn en ambos grupos de la poblacin estudiada.

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MATERIAL Y MTODOS

1. Poblacin estudiada Mediante un enfoque cuantitativo se determin la presencia de la mutacin del Factor V de Leiden y de la protrombina G20210A, tras encuestar 100 estudiantes de ambos gneros de la Universidad de Antofagasta, cuyas edades fluctuaban entre los 18 y 25 aos de edad. Se confeccion una encuesta que se aplic de manera individual (Anexo 1). 79 de los encuestados no refirieron presentar el factor de riesgo, los otros 21 participantes presentaron uno o ms de un factor de riesgo, ya sea propio y/o familiar, de padecer la mutacin G1691A o G20210A. Los otros 21 encuestados presentaban uno o ms de un factor de riesgo, ya sea, propio y/o familiar de padecer la mutacin G1691A o G20210A, tal como se presenta en la tabla 1: TABLA 1: Poblacin estudiada.

SEXO

CON ANTECEDENTES

PORCENTAJE C/ ANTECEDENTES

SIN ANTECEDENTES

PORCENTAJE S/ ANTECENDENTES

FEMENINO

10

47,60%

47

59,50%

MASCULINO

11

52,40%

32

40,50%

TOTAL

21

100%

79

100%

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Los aspectos ticos de nuestro protocolo fueron sometidos al Comit de tica de la Universidad de Antofagasta, generando un documento sobre Consentimiento Informado que firm cada participante.

2. Obtencin de las muestras De los 100 participantes se extrajo una muestra de sangre perifrica a los 21 que refirieron presentar uno o ms factores de riesgo. Se obtuv 4 ml de sangre completa por puncin venosa perifrica mediante la tcnica de venopuncin aprobada por el ISP. Esta se deposit en tubos esteriles que contenan 40 uL de anticoagulante cido etilendiaminotetraacetico (EDTA) que equivale a una concentracin de 1 gr de ml de sangre. Los tubos fueron debidamente rotulados y congelados a 18C, posteriormente las muestras se analizaron en el laboratorio de hematologa, del departamento de Tecnologa Mdica de la Universidad de Antofagasta; realizando las tcnicas de biologa molecular. 3. Extraccin de adn a partir de sangre perifrica El ADN se extrajo de leucocitos de sangre perifrica utilizando un kit miniprep AXYGEN de ADN genmico de sangre perifrica, cuyo protocolo se describe en el ANEXO 3.

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4. Estudio genotpico A. Para fragmentos de Protrombina: la muestra fue procesada a travs de la Tcnica de PCR anidada. La amplificacin de la muestra se realiz en un volumen final de 50 ul, agregando a un tubo de PCR 1 ul de ADN. Posteriormente se dispensaron 49 ul del Mix de amortiguacin cuya concentracin y volumen de los componentes de ste se detallan en el ANEXO 4, segn tcnica descrita por Port y cols. B. Para fragmentos del Factor V: la muestra fue procesada a travs de la

Tcnica de PCR anidada. La amplificacin de la muestra se realiz en un volumen final de 50 ul, agregando a un tubo de PCR 1 ul de ADN. Posteriormente se dosificaron 49 ul del Mix de amortiguacin. Luego de la PCR se efectu la digestin de los fragmentos de ADN, utilizando la enzima de digestin MNL1; (Anexo 5) la concentracin y volmenes de los Mix y de la enzima de restriccin se especifican en el siguiente cuadro:

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COMPONENTE

CONCENTRACIN

VOLUMEN

PRIMERS: 378 PMOL 331 PMOL 1L 1 L

Factor V

Protrombina 320 PMOL 308 PMOL 1 L 1 L

311 PMOL 289 PMOL

1L 1L

DNTPS

10 MM

1 L

BUFFER (10X)

1X

5 L

MG CL2

50 MM

2 L

TAQ DNA POLIMERASA

5 U/L

0.5 L

MNL1

---

1 L

H2O DESTILADA ESTERRIL

---

38,5 L

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La secuencia de los inciadores (Primers) utilizados para la amplificacin del gen del Factor V y del gen de la Protrombina se prepararon como se describe a continuacin:

concentracin de 120 pmol/ul. Para los primers 1, 2, 3 y 4 se prepararon a partir de soluciones de 320 pmol, 308 pmol, 311 pmol y 289 pmol respectivamente.

concentracin final de 120 pmol/ul. Se obtuvo a partir de las concentraciones de 378 pmol del primer 1 y de 331 pmol primer 2. La secuencia de los primers se resume en el siguiente cuadro:

GEN

SECUENCIAS DE PRIMERS

PRIMER 1 FV PRIMER 2 PCR ANIDADA FII PRIMER 3 PRIMER 4

5 - TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA - 3 5 - TGTTATCACACTGGTGCTAA - 3'

PRIMER 1 PRIMER 2

5 TCC GCC TGA AGA AGT GGA TA 3 5 GAG TGC TCG GAC TAC CAG CGT GC 3 5 - TTC CCA ATA AAA GTG ACT CTA GCA 3 5 TTC CCA ATA AAA GTG ACT CTC AGC G 3

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5. Condiciones de amplificacin del sistema El programa de amplificacin se llev a cabo en un termociclador de ADN (Escohealthcare, swift max pro), segn el siguiente protocolo descrito por Port y cols.

TEMPERATURA

TIEMPO

N CICLOS

DESNATURALIZACIN

94C

5 MINUTOS

DESNATURALIZACIN HIBRIDACIN ELONGACIN

94C 57C 72C

45 SEGUNDOS 45 SEGUNDOS 1 MINUTO 30

ELONGACIN FINAL

72C

5 MINUTOS

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6. Conservacin Finalizado el proceso de amplificacin, las muestras fueron conservadas a 4C.

7. Tcnica de enzimas de digestin de Factor V El DNA amplificado (267pb) fue cortado con la enzima de restriccin Mnl1, que reconoce la secuencia 5-CCTC (N)7-3, incubndose por 6 horas a 37C, el genotipo del factor V Leiden fue identificado sometiendo las muestras del DNA digerido, a electroforesis en geles de agarosa SFRtm (super fine resolution) marca AMRESCO, al 3%, en regulador TAE. Las bandas se visualizaron tiendo los geles con bromuro de etidio (1 g/mL). Para calcular el tamao de los

fragmentos se utiliz el marcador de pares de bases GelPilot 50 bp Ladder de la marca Quiagen. Esta digestin origina fragmentos de 37, 67 y 163 pb cuando G est presente en la posicin 1691 (alelo normal), mientras que la 39 ciclos.

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RESULTADOS

La poblacin estudiada no presento prevalencia del factor V G1691A ni de la mutacin de la PT G20210A. (Figura 10)

Figura 10: El producto de la amplificacin de la PCR del Factor V de Leyden y los

encuestados, muestran una banda de 267 pb. Se utiliz la mutacin de factor V de Leyden como control del estudio, obteniendo dos fragmentos de 200 y 67 pb. Los productos de la enzima de restriccin consisten en 3 fragmentos de 163, 67 y 37 pb en individuos normales.

PATRN PCR PM 300

MUTACIN

NORMAL

267 PB 200 PB 163 PB

200 00 100

67 PB

37 PB

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De

los

21/100

(21%),

que

se

encontraron

que

presentaban

factores

predisponentes propios y/o familiares a padecer alguna de las dos mutaciones, en donde, los encuestados del estudio presentaban uno o ms de un factor predisponente. De estos veintin encuestados 17(80,95%) presentaban

trombosis, de ellos 14(66,67%) presentaban factor familiar y 3(%) presentaban factor propio, 4(19,05%) presentaban factor familiar de paro cardiaco, 5(23,81%) presentaban factor familiar de hipertensin, 6(28,57%) presentaban factor familiar de lesin vascular y por ltimo 3(4,9%) presentaban otros, de ellos 2 (%) presentaban factor propio y 1(%) presento factor familiar. (Tabla 1)

TABLA 2: Distribucin de los factores de riesgo utilizados en el estudio, presentes en los veinte y un casos encontrados en los encuestados.
Trombosis Propio Familiar Paro cardiaco Propio Familiar Lesin vascular Propio Familiar Hipertensin Propio Familiar Otros Propio Familiar

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 X X X X X X X X X X X X X X

X X X X X X

X X X

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TABLA 3: Encuestados con antecedentes tromboticos que presentan uno o ms factores de riesgo.

FACTORES DE RIESGO TROMBOSIS PARO CARDIACO HIPERTENSIN LESIN VASCULAR OTROS TOTAL

CON ANTECEDENTES 17 4 5 6 7 39

PORCENTAJE % 43.6 10.3 12.8 15.4 17.9 100

TABLA 4: Encuestados categorizados por sexo con antecedentes familiares.

FACTORES DE RIESGO TROMBOSIS PARO CARDIACO HIPERTENSIN LESION VASCULAR OTROS TOTAL

FEMENINO 5 3 2 3 1 14

PORCENTAJE PORCENTAJE MASCULINO % % 35.7 21.4 14.3 21.4 7.1 100 9 1 3 3 2 18 50 5.6 16.7 16.7 11.1 100

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TABLA 5: Encuestados categorizados por sexo con antecedentes propios.

FACTORES DE RIESGO TROMBOSIS PARO CARDIACO HIPERTENSIN LESION VASCULAR OTROS TOTAL

FEMENINO 1 0 0 0 2 3

PORCENTAJE MASCULINO % 33.3 0 0 0 66.7 100 2 0 0 0 2 4

PORCENTAJE % 50 0 0 0 50 100

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ANEXOS

ANEXO 1: Encuesta al participante para la investigacin del Factor V de leiden y Protrombina G20210A
ENCUESTA AL PARTICIPANTE PARA LA INVESTIGACIN DEL FACTOR V DE LEIDEN Y PROTROMBINA G20210A NOMBRE: _____________________________________________CDIGO:__________ SEXO: _____ EDAD:_________________FECHA DE NACIMIENTO: ________________ RUT:______________PROCEDENCIA:_____________________FECHA: ____________ ANTECEDENTES CLNICOS: PERSONALES SI TROMBOSIS PARO CARDIACO HIPERTENSIN LESIN VASCULAR OTROS___________________________________ _____________________ Firma y nombre tesista NO FAMILIARES SI NO

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ANEXO 2: Certificado de consentimiento

Certificado de consentimiento

Propsito u objetivo de la investigacin: Determinacin de factor V de Leyden y mutacin de protrombina en una poblacin joven de la universidad de Antofagasta

Procedimiento: Se obtendrn muestras de sangre con anticoagulante EDTA de personas entre 18 y 25 aos con antecedentes propios o familiares de trombosis de la universidad de Antofagasta y se les realizara la determinacin por biologa molecular de factor V de Leiden y la mutacin de protrombina.

Riesgos y molestias: Solo las inherentes a la extraccin.

Beneficios: No se ofrecen beneficios directos o indirectos por el hecho de ser partcipe de la investigacin.

Costos: La participacin en este estudio no generar ningn coste econmico para el participante.

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Compensacin (eventual) No existir un mecanismo compensatorio por participar del estudio o bien por eventuales perjuicios

Ante cualquier duda por favor consultar al investigador principal doa MAGDALENA VERA ZARATE o don JAVIER CASTILLO DIAZ en el fono 95542579 o 85734587 al Sr. Julio Alfaro Toledo; Presidente Comit de tica en Investigacin Universidad de Antofagasta al fono 637502. Yo he ledo la explicacin referente a este estudio y he tenido la oportunidad de discutirlo y aclarar todas mis dudas, las que han sido respondidas a mi entera satisfaccin. El investigador me ha sealado que la informacin obtenida no ser mal utilizada y mis datos permanecern en la ms entera confidencialidad. Adems tengo en claro que puedo retirarme del estudio cuando lo desee, sin que esto me perjudique de ninguna manera.

Por lo anterior acepto voluntariamente participar del estudio descrito.

NOMBRE

FIRMA

Antofagasta 2012

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ANEXO 3: Extraccin de ADN con kit miniprep axygen de sangre perifrica

1.- Aadir 500 ul de buffer AP1 en un tubo de micro centrfuga de 1,5 ml.

2.- Aadir 200 - 250 ul de sangre con anticoagulante. Cerrar la tapa del tubo de micro centrfuga y se mezcla mediante agitacin con un vrtex a velocidad mxima durante 10 segundos.

3.- Aadir 100 ul de buffer AP2 y mezclar en vortex a velocidad mxima durante 10 segundos.

4.- Centrifugar a 12.000 Xg durante 10 minutos a temperatura ambiente para sedimentar los restos celulares.

5.- Colocar una columna miniprep en un tubo de micro centrfuga de 2 ml. Pipetear el sobrenadante clarificado obtenido del paso 4 en la columna Centrifugar a 12.000 Xg durante 1 minuto. miniprep.

6.- Desechar el filtrado desde el tubo de micro centrfuga de 2 ml. Colocar la parte trasera de la columna miniprep en el tubo de micro centrfuga de 2 ml. Pipetear 700 ul de tampn W1A en la columna miniprep y dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 minutes. Centrifugar a 12.000 Xg durante 1 minuto.

7.- Desechar el filtrado desde el tubo de micro centrfuga de 2 ml. Colocar la parte trasera de la columna miniprep en el tubo de micro centrfuga de 2 ml. Aadir 800 ul de tampn W2 a la columna miniprep y se centrifuga a 12.000 Xg durante 1 minuto.

59

8.- Paso opcional: descartar el filtrado desde el tubo de microcentrfuga de 2 ml. colocar la parte trasera columna miniprep en el tubo de microcentrfuga de 2 ml. aadir 500 ul de tampn W2 a la columna miniprep y se centrifuga a 12.000 Xg durante 1 minuto.

9.- Descartar el filtrado desde el tubo de microcentrfuga de 2 ml. Colocar la parte trasera de la columna miniprep en el tubo de microcentrfuga de 2 ml. Centrifugar a 12.000 Xg durante 1 minuto.

10.- Coloque la columna miniprep en un tubo de microcentrfuga de 1,5 ml (suministrada).

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ANEXO 4: Tcnica de pcr para fragmentos de protrombina, segn port y cols.

Se utiliz PCR anidado (Nested PCR); el mtodo reportado por Poort et al, detecta la mutacin usando un PCR alelo especfico, sin la necesidad de

digestin con una enzima de restriccin. Se utilizan dos partidores externos (1 forward: 5'-TCCGCCTGAAGAAGTGGATA-3' y 2 backward: 5'

GAGTGCTCGGACTACCAGCGTGC-

3') y dos partidores internos forward

(nested) (3 forward: 5'-TTCCCAATAAAAGTGACTCTCAGCA- 3' y 4 forward: 5' TTCCCAATAAAAGTGACTCTCAGCG- 3'). Los dos partidores internos 3 y 4 difieren en el ltimo nucletido, por ejemplo 20210 G o A. El fragmento de ADN de 270 pb producido por los partidores externos 1 y 2 sirven como un templado para los partidores 3 4 y un control interno de la reaccin de PCR. Al usar los partidores 3 4 generan un fragmento de 148 pb.

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ANEXO 5: Tcnica de pcr para fragmentos de factor v, segn port y cols.

Para la PCR RFLP (Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism), la reaccin en cadena de la polimerasa, se realiz en un volumen final de 25 L, conteniendo: amortiguador de reaccin (10 mM TrisHCl pH 8,3, 50 mM KCl), 10 mM MgCl2, 400 M de cada dNTP, 0,4 M de partidores (primer 1: 5'-TGCCCAGTGCTTAACAAGACCA- 3' y primer 2: 5' TGTTATCACACTGGTGCTAA- 3') 100 a 500 ng de ADN genmico, y 5 U de Taq polimerasa (Invitrogen Life Technologies). La amplificacin se realiz en un termociclador (PTC-100 thermocycler, Mj. Research Inc.): la denaturacin inicial fue a 94C por 5 min seguido de 39 ciclos a 94C por 20 s, 62C por 15 s, 72C por 40 s y la extensin final a 72C por 10 min. Para la digestin se utiliz la enzima de restriccin Mnl1 (New England Biolabs, Beverly, MA). El producto digerido de PCR fue analizado en un gel de agarosa al 3%, teido con bromuro de etidio.

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