CROMATOGRAFA EN PAPEL

INTRODUCCIN Los mtodos ms usados en la separacin de molculas son la ultracentrifugacin, la electroforesis y la cromatografa (Cardella-Hernandez, n.d.). Esta tcnica incluye una serie de mtodos analticos de separacin que tienen como caracterstica general el de estar constituidos por una fase estacionaria y una fase mvil, entre las que se distribuyen diferencialmente las sustancias a separar. Cuando la fase mvil, la que arrastra a las partculas que se van a separar, es un liquido (solvente o mezcla de solventes) se denomina cromatografa de lquidos. Si la fase mvil es un gas se denomina cromatografa de gases (Gonzales et al, 2008). La cromatografa en papel (cromatografa en la que la fase estacionaria es papel), es una tcnica en la que se aplica un pequeo volumen de la muestra cerca de uno de los extremos de una hoja de papel filtro. Este tipo de cromatografa puede ser ascendente, en la que el papel se sujeta a la parte superior de la cmara y se sumerge en el solvente, que se encuentra en el fondo, entonces el solvente se mueve hacia arriba por capilaridad. Al realizarse la separacin, los solutos de la mezcla original migran a lo largo del papel con diferentes velocidades, dependiendo de la solubilidad en el solvente. La relacin de migracin de una sustancia (Rf) puede expresarse de acuerdo con la siguiente frmula (Gonzales et al, 2008):

La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas pequeas como lpidos, nucletidos, vitaminas, frmacos y aminocidos; debido a que cada sustancia exhibe un valor Rf particular, es posible separar aminocidos y pptidos, ya que estos presentan caractersticas particulares, de solubilidad, polaridad y tamao, por la composicin qumica de sus grupos R (Koolman & Roehm, 2005).

OBJETIVO GENERAL Determinar la presencia de un edulcorante artificial en una muestra problema mediante su Rf, y ver sus propiedades de solubilizacion comparndolo con los Rf de los aminocidos que los componen. OBJETIVOS PARTICULARES Separar aminocidos y pptidos mediante el uso de la cromatografa en papel. Determinar el corrimiento cromatogrfico de un aminocido polar y uno no polar, comparando el Rf de cada uno de ellos. Separar e identificar, por medio de la cromatografa en papel, el aspartame presente en un refresco diettico, comparando su Rfcon el del Canderel. HIPTESIS Si se utiliza la tcnica de cromatografa es posible separar las sustancias en sus componentes esenciales. MATERIAL Y MTODO Primero, se recort un rectngulo de papel de whatman con medidas de 20x9cm con guantes de ltex puestos para no contaminarlo. Enseguida se coloco encima de un pliego de cartulina para su fcil manipulacin. Despus, se marcaron seis puntos sobre el papel, los cuales se colocaron a un centmetro de la base del papel y a unos 0.5 cm entre punto y punto,

aproximadamente. Posteriormente, en los espacios comprendidos entre cada punto se pusieron las muestras de cinco sustancias diferentes: Fenilalanina, Acido Apartico, Canderel, Refresco Normal (sin colorante) y Refresco de Dieta (sin colorante). Estas muestras se tomaron con un capilar para cada substancia y se pusieron cinco gotas de cada solucin entre cada espacio del papel (entre cada aplicacin de las muestras se secaba con una secadora). Despus se coloco dentro de la cmara para cromatografa que tena una mezcla eluyente de Butanol, Acido Actico y agua, que se encontraba dentro de la campana

de extraccin con una parrilla magntica con una temperatura de 250C, ahi se dejo por una hora y media aproximadamente. Despus se marc con un lpiz hasta donde llego la fase mvil en el papel de whatman, enseguida se dispuso a dejar secar dentro de la campana de extraccin y con una parrilla elctrica se mantena la temperatura deseada. En el momento en el que se seco se aplico ninhidrina con un atomizador para poder revelar el lugar donde se encontraban las muestras, solo hasta donde se marco con el lpiz. RESULTADOS En el corrimiento cromatogrfico (figura 1) se observan 5 bandas teidas de color purpura correspondientes a las 5 muestras utilizadas, en las cuales es posible identificar manchas de diferentes tamaos y a diferentes distancias.

Figura 1: Corrimiento cromatogrfico. De izquierda a derecha: Fenilalanina, cido aspartico, refresco diettico y no diettico y Canderel. Pueden observarse manchas de diferentes tamaos y distancias recorridas diferentes, lo que permite calcular el Rf de cada una de ellas.

De acuerdo a la relacin de migracin para las sustancias aqu utilizadas (aminocidos, refrescos y canderel) se obtuvieron los valores de Rf para cada una de ellas utilizando la frmula siguiente:

Como la distancia recorrida por la mezcla eluyente fue de 8.8 cm y las distancias recorridas por las muestras fueron diferentes, los Rf quedan: Tabla 1: valores de Rf para las muestras de aminocidos, refrescos y canderel Muestras Fenilalanina Acido asprtico Refresco diettico Refresco no diettico Canderel Distancia recorrida por la mezcla eluyente Distancia recorridas por las muestras 7.0 cm 1.5 cm 1 cm 8.8 cm 3 cm 2.5 cm 3cm 8 cm Rf de las muestras 0.7955 0.1705 0.113636 0.340909 0.2840 0.340909 0.909090

R.F. de la sustancias trabajadas en el laboratorio

ANLISIS DE RESULTADOS Ninguna muestra estudiada present el mismo Rf, ya que la tendencia relativa de las molculas en la mezcla (aminocidos) para asociarse con mayor fuerza a una o a otra fase no es la misma (Murray et al, 2007). Aunque las muestras de canderel (aspartame, compuesto formado por fenilanina y acido apartico) y del refresco diettico no tengan precisamente el mismo Rf, estas presentan la misma tendencia a disociarse en dos manchas, la mancha con un valor mayor de Rf parece ser la fenilalanina y la otra el cido asprtico, tal como lo muestran las dos primeras columnas de la imagen 1 del corrimiento cromatogrfico para la fenilalanina y el cido asprtico, respectivamente. Puesto que los dos tipos de

refresco no presentan el mismo Rf, ni el patrn de disociacin es el mismo, queda determinado que el aspartame est presente en el refresco diettico, no as en el refresco normal.

CONCLUSIN Debido a que cada sustancia exhibe un Rf caracterstico, diferente a las dems, debido a sus propiedades de solubilizacion, es posible la separacin de aminocidos presentes en muestras problema, como la fenilalanina y cido asprtico, en forma de aspartame, presentes en los refrescos dietticos, mediante la tcnica de la cromatografa en papel. BIBLIOGRAFA Cardella-Hernndez. Bioqumica mdica, tomo I: Biomolculas. n.d. Gonzlez-Soto, E.; L. Bucio-Ortiz; P. Damin-Matzumura; F. Daz de LenSnchez; E. Corts-Barberena; L.J. Prez-Flores. (2009) Manual de bioqumica 1. 3 ed. Mxico. Koolman, J. & K.H. Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. 2 edicin. Thieme. New York. EU. Murray, R. K.; D.K. Granner; V.W. Rodwell; P.A. Mayes (2007) Harper. Bioqumica ilustrada. 14 ed. Mxico, Manual Moderno ANEXO (CUESTIONARIO) 1.- que son la fase estacionaria y la fase mvil de un sistema cromatografico? La fase estacionaria de una cromatografa, consta de un slido o un lquido

adherido a un slido, por el cual se hace pasar un fluido. La fase mvil de una cromatografa, consta de un lquido o un gas que es capas de moverse a travs de la fase estacionaria, a diferentes velocidades dependiendo de su afinidad. Cromatografa sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979

2.- como se puede modificar la fase mvil de un sistema cromatografico? Dependiendo del eluyente que se utilice en la cromatografa, la fase mvil debe elegirse de forma que se eluyan todos los componentes de la muestra y no se produzca una acumulacin en la base de la cromatografa. Cromatografa sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979 3.- Qu es el Rf de una sustancia? Se define Rf como el cociente entre la distancia recorrida por una sustancia desde el origen y la distancia recorrida del eluyente. El Rf es una cifra til porque es constante cuando se reproduce el experimento en todas las condiciones adems de ser tan caracterstico y descriptivo de un compuesto como puede serlo el punto de fusin. Por supuesto, el Rf de un compuesto dado ser diferente para distintos disolventes, pero ello constituye una ventaja, puesto que as es posible caracterizar a un compuesto ms especficamente registrando sus Rf en varios disolventes. Algunos factores que afectan al Rf son: el grado de pureza del adsorbente, la concentracin del ambiente de la cmara y la temperatura. Cromatografa sobre papel y capa fina.smith ivor.madrid,alambra.1979 4.- investigue las caractersticas de los aminocidos utilizados en esta prctica y como se clasifican.
Aminocidos Esenciales vs. No Esenciales

No esenciales

Esenciales

Alanina Asparagina Aspartato Cisteina

Arginina* Histidina Isoleucina Leucina

Glutamato

Lisina

*Los aminocidos arginina, metionina y fenilalanina se consideran esenciales por razones no directamente relacionadas por la falta de sntesis. La arginina es sintetizada por las clulas de mamferos pero en un rango que es insuficiente para resolver las necesidades de crecimiento del cuerpo y la mayora que es sintetizada es procesada para formar urea. La metionina es requerida en grandes cantidades para producir cisteina, si el ltimo aminocido no es provisto adecuadamente en la dieta. Igualmente, la fenilalanina se necesita en grandes cantidades para formar tirosina, si este ltimo aminocido no es adecuadamente provisto en la dieta. La fenilalanina: Es un aminocido esencial aromtico (junto con el triptfano y la tirosina) cuyo grupo R contiene un anillo bencnico (Ruta 2). Uno de los aspectos ms relevantes de su biosntesis es el mecanismo a travs del cual los anillos aromticos se forman a partir de precursores alifticos. Tambin se le clasifica, junto con el triptfano, como un aminocido hidrofbico con estructura cclica. Segn los ltimos estudios sobre los aminocidos esenciales parece que en la fenilalanina, la estructura carbonada sera su parte considerada esencial ya que esta estructura es transaminada con rapidez por el organismo. La mayor parte de este compuesto se transforma, por medio de hidroxilacin, en tirosina que es otro aminocido, en este caso considerado como semiesencial. Adems la fenilalanina es el precursor de las catecolaminas en nuestro cuerpo, si bien acortamos el mecanismo en la sntesis de catecolaminas utilizando la tirosina como precursor (ver Ruta 3). Tambin es un constituyente importante de los neuropptidos cerebrales, como la somatostatina, vasopresina,

melanotropina, encefalina, ACTH, angiotensina, sustancia P y colecistoquinina. Muchas drogas de las que conocemos como psicotrpicas, contienen fenilalanina. La fuente ms importante de fenilalanina son los alimentos ricos en protenas, como es la carne y los productos lcteos. La fenilalanina tiene utilidades en la

industria de la alimentacin, por ejemplo, en la elaboracin de edulcorantes artificiales. Acido asprtico: Aminocido glucognico (puede convertirse en glucosa y glucgeno) cuyo grupo R posee carga negativa a pH 7,0. Se trata de un compuesto muy hidroflico, y como tal se encuentra casi siempre en la superficie externa de las protenas globulares. Es un compuesto metablicamente activo debido a su interconversin con los cidos dicarboxlicos tetracarbonados del ciclo de los cidos tricarboxlicos, despus de sufrir una transaminacin. Es el precursor de la asparagina. Tambin interviene en otras reacciones como dador de aminos en la sntesis de urea y de purinas, y como precursor de los anillos pirimidnicos a travs de la formacin de carbamoilaspartato en el citosol. Es, junto con el glutmico, el principal neurotransmisor excitatorio de la corteza cerebral. http://www.biopsicologia.net/fichas/page_592.html http://themedicalbiochemistrypage.org/spanish/amino-acid-metabolism-sp.html 5.- investigar los Rf reportados en la literatura para los aminocidos aqu utilizados. Anote el sistema de fase mvil y fase estacionaria utilizado para obtenerlos. Rf de los aminocidos de referencia

Aminocido Lisina cido glutmico Glicina Cisteina Serina Metionina

Rf

0.24 0.47 0.49 0.12 0.31 0.59

Fenilalanina Arginina Valina Triptfano Histidina Treonina

0.66 0.28 0.59 0.60 0.29 0.39

http://www.doschivos.com/display.asp?ID=625&f=135478 6.- hacer una investigacin sobre el uso actual del aspartame. Anote posibles beneficios y perjuicios del uso de este producto. Comunicado de la FDA sobre el Estudio Europeo de aspartame CFSAN / Oficina de Seguridad Alimentara de aditivos 20 de abril 2007 La FDA ha concluido su examen sobre el estudio de carcinogenicidad a largo plazo de aspartame titulado, "a largo plazo de carcinogenicidad bioensayos para evaluar el potencial de los efectos biolgicos, en particular cancergenos, del aspartame administrado en la alimentacin de ratas Sprague-Dawley", realizado por el Ramazzini Europea Fundacin (ERF), con sede en Bolonia, Italia. La FDA revis los datos del estudio puestos a su disposicin por el ERF y considera que no es compatible con la conclusin de la ERF que el aspartame es un agente carcingeno. Adems, estos datos no proporcionan evidencia para alterar la conclusin de la FDA que el uso del aspartame es seguro. El aspartame fue aprobado por primera vez en los Estados Unidos en 1981 y es uno de los edulcorantes artificiales ms utilizados. Cuando metabolizado por el organismo, el aspartame se descompone en dos aminocidos comunes, cido asprtico y fenilalanina, y una tercera sustancia, el metanol. Estas tres sustancias estn en cantidades similares o mayores al comer alimentos comunes.

Al primero de aprendizaje de los resultados del estudio ERF, la FDA pidi a los datos de la ERF para evaluar los resultados. El 28 de febrero de 2006, la agencia recibi slo una parte de los datos del estudio solicitado. En junio de 2006, la FDA pidi ERF para proporcionar el resto de los datos del estudio solicitado inicialmente y tambin se ofreci a revisar muestras de patologa del estudio. ERF no present datos adicionales a la FDA y no est de acuerdo a la revisin de la FDA de las muestras de patologa.

La FDA no pudo llevar a cabo una revisin completa y definitiva del estudio porque ERF no proporcion los datos del estudio completo. Con base en los datos disponibles, sin embargo, hemos identificado deficiencias significativas en el diseo, realizacin, presentacin de informes, y la interpretacin de este estudio. La FDA considera que la fiabilidad y la interpretacin de los resultados del estudio se ve afectada por estas deficiencias y variables no controladas, tales como la presencia de la infeccin en los animales de experimentacin. Adems, los datos que fueron proporcionados a la FDA no parecen apoyar los hallazgos relacionados con el aspartame informado por el ERF. Basado en nuestra revisin, los cambios patolgicos fueron incidentales y apareci espontneamente en el estudio, los animales, y ninguno de los cambios histopatolgicos inform parecen estar relacionados con el tratamiento con aspartame. La FDA considera que una visin adicional sobre los resultados del estudio podran ser proporcionadas por una patologa a nivel internacional de trabajo respaldado por el examen conjunto de las muestras de tejido apropiado en el estudio. Teniendo en cuenta los resultados de la gran cantidad de estudios sobre la seguridad del aspartame, incluyendo cinco con anterioridad a cabo estudios negativos carcinogenicidad crnica, un estudio recientemente la epidemiologa grande con asociaciones negativas entre el uso de aspartame y la aparicin de tumores, y los resultados negativos de una serie de transgnicos tres ensayos del ratn, la FDA no encuentra ninguna razn para modificar su conclusin anterior

de que el aspartame es seguro como edulcorante de uso general en los alimentos.