QIAquick Gel Extraction Kit Protocol (Microcentrifuga) Este protocolo est diseado para extraer y purificar DNA de 70 pb a 10 kb a partir

de geles de agarosa estndar o de bajo punto de fusin en TAE o buffer TBE. Hasta 400 mg de agarosa pueden ser procesados por la columna de centrifugacin. Este kit adems puede ser usado para limpiar ADN a partir de reacciones enzimticas. Para la limpieza de DNA a partir de reacciones enzimticas usando este protocolo, adicionar 3 volmenes de Buffer QG y 1 volumen de isopropanol a la reaccin, mezclar, y proceder con el paso 6 del protocolo. Alternativamente, usar el kit MinElute Reaction Cleanup. Puntos importantes antes de empezar: El color amarillo del buffer QG indica un pH 7.5 Adicionar etanol (96-100%) al buffer PE antes de usar (ver en la etiqueta para el volumen) Todos los pasos de centrifugacin se llevan a cabo a 10.000 x g (~ 13.000 rpm) en una microcentrfuga de sobremesa convencional. Acetato de sodio 3 M, pH 5,0, puede ser necesario.

Procedimiento: 1. Disponer del fragmento de ADN a partir del gel de agarosa cortando con un bistur limpio y afilado. Reducir al mnimo el tamao de la porcin del gel de agarosa mediante la eliminacin adicional. 2. Pesar la porcin de gel en un tubo incoloro. Aadir 3 volmenes de tampn QG a un volumen de gel (100 mg ~ 100 l). Por ejemplo, adicionar 300 l de buffer QG por cada 100 mg de gel. Para geles de agarosa al >2% agregar 6 volmenes de buffer QG. La cantidad mxima de gel por columna de QIAquick es 400 mg; para cortes de gel> 400 mg usar ms de una columna QIAquick. 3. Incubar a 50C por 10 minutos (o hasta que el corte de gel se disuelva completamente). Para ayudar a disolver el gel, mezclar el tubo en vortex cada 2 a 3 minutos durante la incubacin. IMPORTANTE: solubilizar la agarosa completamente. Para geles al >2%, incrementar el tiempo de incubacin. 4. Despus de que el trozo de gel se haya disuelto completamente, checar que el color de la mezcla sea amarillo (similar al buffer QG sin la agarosa disuelta). Si el color de la mezcla es naranja a violeta, adicionar 10 l de acetato de sodio 3 M, pH 5.0, y mezclar. El color de la mezcla debe regresar a amarillo. La absorcin del DNA a la membrana QIAquick es eficiente nicamente a pH 7.5. El buffer QG contiene un indicador de pH el cual es amarillo a pH 7.5 y naranja a violeta a un pH ms alto, permitiendo la fcil determinacin del pH ptimo para la unin del DNA. 5. Adicionar 1 volumen de isopropanol por uno de gel a la muestra y mezclar.

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Por ejemplo, si el trozo de gel de agarosa es de 100 mg, aadir 100 l de isopropanol. Este paso aumenta el rendimiento de fragmentos de ADN <500 pb y> 4 kb. Para los fragmentos de ADN entre 500 pb y 4 kb, la adicin de isopropanol no tiene ningn efecto sobre el rendimiento. No centrifugue la muestra en esta etapa. Coloque la columna de centrifugacin QIAquick en un tubo limpio de 2 ml. Para unir el ADN, aplicar la muestra a la columna de la QIAquick, y centrifugar durante 1 min. El volumen mximo que puede contener la columna es 800 l. para volumenes de muestra mucho mayores a 800 l, simplemente cargar y centrifugar de nuevo. Descartar el sobrenadante y colocar la columna QIAquick en el mismo tubo colector. Los tubos colectores son reusados para reducir el gasto de plstico. (Opcional): Aadir 0,5 ml de tampn QG a la columna Qiaquick y centrifugar durante 1 min. Este paso servir para eliminar todo rastro de agarosa. Slo se requiere cuando se puede utilizar posteriormente el ADN para la secuenciacin directa, la transcripcin in vitro o microinyeccin. Para lavar, adicionar 0.75 ml de buffer PE a la columna QIAquick y centrifugar durante 1 minuto. Nota: si el DNA va a ser usado para aplicaciones sensibles a la sal, tales como la ligadura de extremos romos y secuenciacin directa, dejar la columna en reposo durante 2-5 min despus de la adicin del tampn PE, antes de centrifugar. Descartar el sobrenadante y centrifugar la columna QIAquick por un minuto adicional a 17900 x g (13000 rpm). IMPORTANTE: el etanol residual del buffer PE puede que no se remueva completamente sino hasta que se descarte con la segunda centrifugacin. Colocar la columna QIAquick dentro de un tubo de microcentrifuga de 1.5 ml limpio. Para eluir el DNA, adicionar 50 l de buffer EB (Tris-Cl 10 mM, pH 8.5) o agua (pH 7.0-8.5) al centro de la membrana QIAquick y centrifugar la columna por 1 minuto. Alternativamente, para incrementar la concentracin de ADN, adicionar 30 l de buffer de elucin al centro de la membrana QIAquick, dejar la columna reposar por 1 minuto, y despus centrifugar por 1 minuto. IMPORTANTE: Asegurarse que el buffer de elucin se dispensa directamente dentro de la membrana QIAQUICK para completar la elucin del ADN. El volumen medio de elucin es 48 l de 50 l de volumen de tampn de elucin, y 28 l de 30 l. Si el DNA purificado es analizado en gel, aadir 1 volumen de buffer de carga a 5 volmenes de DNA purificado. Mezclar la solucin por pipeteo (hacia arriba y hacia abajo) antes de cargar en el gel. El buffer de carga contiene tres marcadores (azul de bromofenol, cianol xileno, y naranja G) esto facilita la estimacin de la distancia de la migracin del DNA y optimiza el tiempo del gel de agarosa al tiempo de ejecucin.