FORMAO CONTNUA

DE PROFESSORES

AO DE FORMAO:

Aplicaes da biotecnologia na determinao da filogenia e no melhoramento de plantas

Formadoras: Professora Doutora Maria Susana Pereira Professora Doutora Maria Joo Bala

Formanda: Maria de Ftima Ferreira da Silva Henriques

junho de 2013

INTRODUO
O Tema Central do Programa de Biologia do 12 ano A Biologia e os desafios da atualidade. A Unidade 2 centrada no estudo dos genes e das possibilidades de interveno biotecnolgica ao nvel dos mesmos. No mbito desta interveno so abordadas diversas tcnicas de Engenharia Gentica, muitas das quais no podem ser postas em prtica nas Escolas por falta de materiais e equipamentos. A situao especialmente preocupante considerando a importncia atribuda pelo prprio Programa ao trabalho laboratorial. Na Escola onde exero funes, o material existente para o trabalho laboratorial na rea da Engenharia Gentica limita-se a duas tinas de eletroforese e alguns materiais que as acompanhavam em Kits Biognius, j utilizados. Da a opo pela realizao de um trabalho de eletroforese de corantes alimentares. Os nicos materiais a adquirir sero os corantes alimentares, de fcil aquisio. Apesar da simplicidade do trabalho a desenvolver, este permitir um primeiro contacto dos alunos com uma das tcnicas de Engenharia Gentica estudadas e pode ser explorado sob diferentes perspetivas, como por exemplo: assumindo que os corantes e as misturas dos mesmos correspondem a produtos de PCR (polymerase chain reaction), que aps separao eletrofortica revelam uma ou duas bandas, podem ser identificados indivduos homozigticos e heterozigticos relativamente a um determinado locus; assumindo que foi utilizada a tcnica RFLP (restriction fragment length polymorphism) podem-se identificar mutaes num gene; podem tambm ser realizadas simulaes de testes de paternidade; podem ser criados cenrios de resoluo de crimes, ou proceder avaliao do efeito da concentrao do gel em agar na deslocao de fragmentos de DNA numa eletroforese.

PLANO DE AULA
Disciplina: Biologia Ano: 12 Durao: 90+90

Sumrio: Realizao da atividade laboratorial: CSI na sala de aula

Unidade 2: Patrimnio gentico Fundamentos de engenharia gentica

Contedos/Objetivos: Conhecer tcnicas utilizadas na Biotecnologia e na Biologia Molecular. Compreender os princpios e caractersticas bsicas da eletroforese. Desenvolver competncias metodolgicas. Desenvolver competncias e raciocnio cientfico. Incentivar o interesse pela Biotecnologia. Desenvolver atitudes positivas face Cincia.

Conceitos: Eletroforese / Polimorfismos / DNA / PCR / DNA fingerprint

Estratgias: Anlise das potencialidades das tcnicas de PCR e eletroforese (j abordadas em aulas anteriores) e a sua aplicao s cincias forenses; Apresentao da situao problema; Realizao da atividade laboratorial de acordo com o protocolo experimental. Recursos: Guio da atividade Os peixes roubados - CSI na sala de aula.

Avaliao: Avaliao formativa- Participao na aula, atitudes e conhecimentos demonstrados na concretizao das atividades. Questes de discusso da atividade, includas no protocolo experimental.

Os peixes roubados - CSI na sala de aula

Na escola, os alunos e professores tm no laboratrio um aqurio repleto de peixes exticos. Numa noite a escola foi assaltada e, para surpresa de todos, os peixes foram roubados! Mas o ladro foi desastrado e bateu numa esquina do aqurio que se partiu e o magoou tendo ficado sangue no vidro. Nessa noite, o guarda durante as rondas viu e identificou volta da escola quatro indivduos. So por isso os principais suspeitos do assalto. Como descobrir qual deles roubou os peixes?

PROTOCOLO EXPERIMENTAL
A eletroforese em gel uma tcnica de separao de molculas que envolve a migrao de partculas num determinado gel, durante a aplicao de uma diferena de potencial. As molculas so separadas de acordo com a sua carga e com o seu tamanho. Assim, as de carga negativa iro migrar para o plo positivo e as de carga positiva para o plo negativo e as de menor massa iro migrar mais rapidamente do que as de maior massa. Na preparao do gel para a eletroforese, pode ser utilizada a agarose, polissacardeo que forma uma rede que segura as molculas durante a migrao. Pode igualmente ser utilizado o agar, mistura de polissacardeos, mais acessvel do ponto de vista econmico. Dependendo da concentrao do gel, obtm-se diferenas no gradiente de separao. A eletroforese normalmente utilizada para separar protenas e molculas de DNA e RNA. Neste trabalho vamos proceder separao de molculas constituintes de corantes alimentares, que simulam produtos de PCR, resultantes da amplificao de um marcador gentico a partir do DNA recolhido na cena de crime e dos quatro suspeitos desse crime. O referido marcador gentico um dos utilizados na tcnica de DNA fingerprint.

Material necessrio:
Para a tina de electroforese Tina (com tampa) Tabuleiro Pente Eltrodos( fio vermelho e fio preto) 5 pilhas de 9 V Fita cola Para as solues Tampo TBE (10x ) Agar gua destilada Gobele Balana Placa de aquecimento Proveta de 50 e 250 ml Para as amostras Suporte para tubos Micropipeta e pontas amarelas Corantes alimentares: Amostra 1 DNA recolhido na cena do crime Amostra 2 DNA do suspeito 1 Amostra 3 DNA do suspeito 2 Amostra 4 DNA do suspeito 3 Amostra 5 DNA do suspeito 4
4

Procedimento:

I. Preparao do gel de agar a 0,8 % em TBE 1X

1. Prepare 150ml de soluo tampo TBE 1X, a partir da soluo tampo TBE 10X fornecida. 2. Coloque 50 ml da soluo tampo TBE 1X num gobel. Ser este o volume utilizado para a preparao do gel. 3. Proceda pesagem do agar necessrio para a preparao do gel e coloque-o no gobel com os 50ml de soluo tampo TBE 1X e agite para diluir um pouco. 4. Coloque o gobel com a soluo sobre a placa de aquecimento at ebulio. Deve agitar de vez em quando e terminar o aquecimento assim que a soluo fique transparente. 5. Deixe arrefecer at aos 60C, aproximadamente (at conseguir segurar o gobel nas mos, sem se queimar). 6. Vede com fita-cola os dois lados abertos do tabuleiro do gel que vem dentro da tina. 7. Coloque o tabuleiro numa bancada plana e verta com cuidado a soluo de agar j arrefecida. 8. Coloque imediatamente o pente a cerca de 3 cm de distncia do fundo do tabuleiro e paralelo ao mesmo. 9. Aguarde cerca de 30 min, at o gel estar totalmente solidificado. 10. Remova o pente para cima, perpendicularmente para no destruir os poos. 11. Retire cuidadosamente a fita-cola e coloque o tabuleiro com o gel dentro da tina, com os poos para o lado do eltrodo preto (plo negativo). 12. Verta, cuidadosamente, tampo TBE 1X para dentro da tina at cobrir todo o gel e o nvel deste atingir cerca de 1 mm acima do gel. Todos os poos devem ficar cheios de tampo.

II. Preparao da corrida eletrofortica

1. Carregue cada um dos poos do gel com uma das amostras de corante, utilizando a seringa e uma ponta diferente para cada amostra. Identifique cada poo tendo em conta a amostra de corante utilizada. 2. Ligue os cabos, colocando o cabo vermelho no terminal vermelho da tina (plo positivo) e o cabo preto no terminal preto (plo negativo). Ligue a outra extremidade dos cabos s pilhas e verifique se h passagem de corrente (nos eltrodos devero comear a libertar-se pequenas bolhas principalmente do lado dos poos). 3. Deixe a eletroforese decorrer at que os corantes cheguem a aproximadamente 2 cm do final do gel. Dever demorar 4 a 5 horas. 4. Desligue os eltrodos, retire o tabuleiro com o gel da tina e observe os resultados.

III. Registo e discusso de resultados

1. Registe os resultados obtidos no esquema abaixo.
plo -

Amostras

plo +

2. Identifique a carga das molculas presentes em cada uma das amostras. 3. Das amostras (de corantes) utilizadas indique a(s) que apresenta(m) as molculas 3.1. de menor tamanho. 3.2. de maior tamanho. 4. Se em vez de corantes alimentares tivssemos realizado a eletroforese de DNA, o pente deveria ser colocado mais perto do plo negativo. Justifique este procedimento. 5. A separao dos produtos de PCR dos quatro indivduos revelou para alguns, uma banda e para outros, duas bandas. Refira o que se pode concluir com base nestes resultados. 6. Indique, de acordo com os resultados obtidos, qual dos suspeitos poderia ser o criminoso. 7. Avalie, justificando, o grau de fiabilidade da resposta anterior. 8. Explique o que um marcador gentico. 9. Os marcadores genticos utilizados na tcnica de DNA fingerprint dizem respeito a zonas codificantes do genoma com grande variabilidade. Comente a afirmao. 10. De que forma se poderia estimar o tamanho dos fragmentos de DNA? 11. Se tivssemos utilizado DNA, qual o procedimento adicional a realizar para se proceder observao das bandas?

CONCLUSO
O trabalho apresentado revela-se de grande importncia para a compreenso de algumas tcnicas usadas na Biologia Molecular, bem como das suas aplicaes em diferentes reas. Apesar de ser uma simulao, utilizando corantes e no DNA, as amostras de corantes utilizadas so misturas de corantes com diferentes cores, apresentando as amostras 1 e 4 a mesma combinao de corantes, surgindo assim o mesmo padro de bandas na eletroforese, semelhana do que poderia acontecer numa situao real. Em contexto de sala de aula, a situao ideal, no entanto, seria explorar com os alunos a situao problema de modo a que eles prprios elaborassem o desenho experimental, uma vez que o prprio Programa atribui especial importncia ao desenvolvimento de atividades que impliquem os alunos na planificao de percursos experimentais (com manipulao e controlo de variveis e deciso sobre a utilizao de rplicas). O trabalho realizado apesar de simples pertinente pelas concluses a que permite chegar e revela-se til no desenvolvimento de competncias diversificadas, contribuindo para integrar as dimenses terica e prtica da Biologia, assim como o trabalho cooperativo entre os alunos. Caber ao professor decidir o grau de abertura das tarefas, ponderando as competncias que os alunos j possuem, o tempo e os recursos disponveis. Esta ao revelou-se de grande importncia na medida em que me familiarizei com as novas tecnologias na rea da Gentica Molecular e com as possibilidades de implementao das mesmas na sala de aula, apesar dos reduzidos recursos existentes na Escola.