TCNICAS EN BIOLOGA MOLECULAR, APLICACIN EN MEDICINA

1. Explique la tcnica PCR (Reaccin en cadena de polimerasa). Aplicaciones en medicina.

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR ) es una tecnologa de bioqumica en la biologa molecular para amplificar una sola o unas pocas copias de un fragmento de ADN a travs de varios rdenes de magnitud , la generacin de miles a millones de copias de una secuencia particular de ADN . Desarrollado en 1983 por Kary Mullis , la PCR es ahora una tcnica comn y, a menudo indispensable utilizado en los laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una variedad de aplicaciones . Estos incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin , basado en el ADN filogenia , o el anlisis funcional de los genes ; el diagnstico de enfermedades hereditarias , la identificacin de las huellas dactilares genticas ( utilizado en las ciencias forenses y las pruebas de paternidad ) , y la deteccin y el diagnstico de las enfermedades infecciosas . En 1993 , Mullis recibi el Premio Nobel de Qumica junto con Michael Smith por su trabajo en PCR. El mtodo se basa en el ciclo trmico , que consiste en ciclos de calentamiento y enfriamiento repetidos de la reaccin de fusin del ADN y la replicacin enzimtica del ADN . Los cebadores ( fragmentos cortos de ADN ) que contiene secuencias complementarias a la regin de destino , junto con una polimerasa de ADN ( despus de lo cual se denomina el mtodo ) son componentes clave para permitir la amplificacin selectiva y repetida . A medida que avanza la PCR , el ADN generada no es utilizado como una plantilla para la replicacin , poniendo en marcha una reaccin en cadena en la que la plantilla de ADN se amplifica exponencialmente . PCR puede modificarse ampliamente para llevar a cabo una amplia gama de manipulaciones genticas . Casi todas las aplicaciones de la PCR emplean una ADN polimerasa termoestable , tal como Taq polimerasa , una enzima originalmente aislada de Thermus aquaticus la bacteria . Este ADN polimerasa ensambla enzimticamente una nueva cadena de ADN a partir de bloques de construccin de ADN , los nucletidos, mediante el uso de ADN de una sola hebra como molde y oligonucletidos de ADN (tambin llamados cebadores de ADN ) , que son necesarios para la iniciacin de la sntesis de ADN . La gran mayora de los mtodos de PCR utilizar ciclos trmicos , es decir , alternativamente calentamiento y enfriamiento de la muestra de PCR a travs de una serie definida de pasos de temperatura . En el primer paso , las dos hebras de la doble hlice de ADN se separan fsicamente a una temperatura alta en un proceso llamado fusin de ADN . En el segundo paso , la temperatura se reduce y las dos hebras de ADN a convertir en plantillas para la ADN polimerasa para amplificar selectivamente el ADN diana . La selectividad de los resultados de la PCR de la utilizacin de cebadores que son complementarios a la regin de ADN especfica para la amplificacin bajo condiciones especficas de ciclos trmicos. Medicina En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006): Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas caractersticas de tamao o temperatura de fusin que permitan identificarlo de forma inequvoca. En el caso de infecciones virales que implican la integracin del genoma del patgeno en el ADN del hospedador, como es el de la infeccin por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad.6 La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an estn en el periodo de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante.

El diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.

2. Explique la tcnica de ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay) directo y sus aplicaciones en medicina.

Tcnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)Mayo 20, 2009 1. Elaboro , 2 Reviso , 1 Tcnica de ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay) Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Estudios Superiores ZaragozaLaboratorio de Inmunologa L-121, Campus IPrez Prez Jos Manuel 1 ____________ Prez Sevilla Alma Beatriz 2 ____________ Equipo 3, Grupo 2802 Introduccin: La tcnica de ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay) es un procedimiento de ensayoinmunoenzimtico. Se basa en la deteccin antgeno(Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una faseslida y mediante anticuerpos que directa oindirectamente producen una reaccin, la pruebarecurre al empleo de inmungenos, haptenos anticuerpos marcados con una enzima cuyo productocolorido, puede ser medido espectrofotomtricamente.Este principio tiene las propiedades de uninmunoensayo ideal: es verstil, robusto, simple en surealizacin, emplea reactivos econmicos y consigue,mediante el uso de la fase slida, de una separacinfcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre. Lasenzimas utilizadas se muestran en el cuadro 1. Fases de realizacin de una ELISA Sensibilizacin de la placa. Bloqueo de espacios vacos. El Ag o el Ac se fija a una superficie. Aplicacin del espcimen de prueba.Controles positivo y negativo Deteccin y caracterizacin por Ac. 2marcado. Incubacin con la muestra. Incubacin con el sistema de deteccin.

Adicin del sustrato.Los diferentes tipos de ELISA son los que seenumeran a continuacin:Anticuerpos Marcados ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA Sandwich Doble (DAS) Heterologo (HADAS)Antgenos Marcados ELISA CompetitivoELISA Directo.Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenosfijados deficientemente o no fijados. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con losantgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavad

3. Explique la tcnica de ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay) indirecto y sus aplicaciones en medicina.

ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich).Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavadopara eliminar los anticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adicin de la muestraproblema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,etc.), de tal forma que si est presente el agentepatgeno de diagnstico (antgeno), reaccionarespecficamente con los anticuerpos fijados al soporte.Lavado para eliminar los antgenos que no hayanreaccionado y los restos de la muestra no fijados.Adicin de anticuerpos especficos del antgeno adetectar (deben tener un eptopo diferente de losanticuerpos con los que se han tapizado el soporte)conjugados con una enzima, los cuales reaccionan conlos antgenos aadidos con la muestra problema y quese encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado paraeliminar los anticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adicin de un substrato sobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtricadel producto final coloreado. ELISA Sndwich HADAS. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavadopara eliminar los anticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adicin de la muestraproblema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,etc.), de tal forma que si est presente el agentepatgeno de diagnstico (antgeno), reaccionarespecficamente con los anticuerpos fijados al soporte.Lavado para eliminar los antgenos que no hayanreaccionado y los restos de la muestra no fijados.Adicin de anticuerpos especficos del antgeno adetectar (deben tener un eptopo diferente de losanticuerpos con los que se han tapizado el soporte),los cuales reaccionan con los antgenos aadidos conla muestra problema y que se encuentran fijados a losanticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos queno hayan

reaccionado. Adicin de anticuerposconjugados con una enzima antianticuerposempleados en el paso anterior. Lavado para eliminarlos antianticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adicin de un substrato sobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararla reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtricadel producto final coloreado. 4. Explique la tcnica de microarrays y sus aplicaciones en medicina. Microarrays de ADN se pueden utilizar para medir el nivel de ARNm de estado estacionario de la mayora o todos los genes de una clula y entregar una cuantificacin del perfil de la transcripcin en una escala genomwide . Las promesas que vienen junto con esta nueva tecnologa son un rpido acceso a las vas moleculares de la biologa , un diagnstico ms preciso y el pronstico de las enfermedades , una mejor comprensin de la accin de los frmacos , la posibilidad de definir mejor las estrategias teraputicas , y muchos ms . Microarrays de ADN tambin pueden construir un nuevo puente sobre el que los bilogos y los mdicos pueden reunirse y llevar a buen trmino lo que se ha denominado " la medicina traslacional " para el beneficio de los pacientes. Microarrays de ADN se construyen con fragmentos de ADN que representan casi la totalidad de la informacin gentica de un organismo en unos pocos centmetros cuadrados . Estn disponibles comercialmente o se pueden realizar fcilmente en laboratorios con el equipo adecuado . No importa si los oligonucletidos son sintetizados sobre el vidrio por una tecnologa sofisticada desarrollado primero para la industria de los semiconductores o ms largos si los productos de PCR son simplemente salpicado sobre superficies slidas , la comunidad cientfica tiene una nueva y potente herramienta para medir la actividad de los genes . Para descubrir correlaciones entre fenmenos biolgicos o condiciones mdicas y los mecanismos de regulacin gentica , los investigadores ya no tienen que depender de anlisis de un solo gen . Sin embargo , la disponibilidad de los microarrays de ADN no slo se abre la puerta a nuevos tipos de experimentos, pero tambin ofrece un nuevo tipo de datos . Al comparar el nivel de expresin de miles de genes al mismo tiempo no se puede llevar a cabo con las mismas habilidades necesarias para interpretar correctamente autorradiogramas . La potencia del ordenador , el software adecuado y el asesoramiento de expertos en el campo bioinformtico ser necesario. Las posibilidades y promesas de microarrays de ADN son ms numerosos. La investigacin del cncer fue el primer campo importante que utiliza la nueva tecnologa. Ms de 20 aos de investigacin bsica se han sentado las bases para un concepto molecular del cncer como una "enfermedad gentica". Pero tambin demostr la inmensa complejidad de cada una de las ms de 100 enfermedades diferentes que pueden ser clasificados bajo el trmino general de "cncer". Ahora, el perfil de expresin de los tumores con microarrays de ADN ayudar a definir mejor el tipo de tumor y distinguirlo de los dems. Los primeros

experimentos ya han sealado el camino : perfiles de expresin gnica de muestras tumorales se han correlacionado con los parmetros clnicos . El objetivo es claro : con la ayuda de algoritmos de racimo , cada tumor debe ser etiquetado con una firma molecular extrado de numerosos perfiles de expresin . Por la misma razn , los microarrays de ADN se pueden utilizar para evaluar los efectos de los frmacos sobre la actividad transcripcional de las clulas o tejidos diana . Para los investigadores bsicos esto debe ser de gran ayuda para entender procesos como la apoptosis inducida por frmacos , las drogas inducida por dao en el ADN y la reparacin , o cualquier otro aspecto ms general de la regulacin de genes de molculas pequeas . Para la industria farmacutica , una correlacin entre la actividad de los genes y los efectos de los compuestos candidatos puede ayudar a eliminar aquellos con efectos secundarios graves antes de entrar en los ensayos clnicos . Adems, ayudar a definir los efectos de esos frmacos que ya estn en uso clnico . Esta aplicacin de la tecnologa de microarrays de ADN cae bajo el techo de una nueva disciplina para el que la etiqueta de " farmacogenmica " ya ha sido acuado . Otros microarrays de ADN sern , o ya lo han sido, diseados que permiten detectar la presencia de grmenes especficos en tejidos o fluidos corporales . Ser posible identificar las bacterias o los virus responsables de la enfermedad infecciosa mucho ms rpido y con mayor precisin que antes . Tambin las huellas que los organismos modificados genticamente pueden dejar en los productos alimenticios, industriales pueden ser comprobables en gran escala . Microarrays de ADN diseadas especficamente , que usan " on-chip " reacciones de PCR para los genes conocidos y utilizados para la ingeniera gentica de plantas y animales en la industria alimentaria , ya estn en los tableros de dibujo . Genetistas Humanos usarn microarrays de DNA especficos para detectar las mutaciones subyacentes , enfermedades hereditarias monognicas o para interrogar para predisposiciones ms generales de una serie de condiciones . Adems de las matrices de expresin gnica , lo que ya es posible medir la presencia o ausencia de polimorfismos de nucletido nico (SNP especficos ) en el genoma humano . Las investigaciones en todo el mundo y tambin la industria de la biotecnologa han intensificado su bsqueda de SNPs humanos . Pronto nos veremos enfrentados a una base de datos que describe todo el estimado de 3 millones de SNPs humanos . Puede que no sea demasiado descabellado especular que el anlisis de SNP por la tecnologa de microarrays de ADN puede permitir en el futuro para predecir la aparicin , el pronstico y evolucin de las enfermedades que an no son clnicamente manifiesta en el momento del anlisis. Por otra parte, los protagonistas de anlisis de SNP predicen la aparicin de un nuevo tipo de la medicina predictiva individual, incluso una revolucin en la medicina y la terapia del cncer es proclamada. Con el anlisis de

SNP y perfiles de expresin gnica , que debera ser posible disear terapias individuales adaptados para un solo paciente despus de su / sus respuestas individuales hacia las drogas , la radiacin, u otros tipos de terapias . Microarrays de ADN son una tecnologa nueva y emocionante. Al igual que todas las nuevas innovaciones de esta tecnologa viene con muchas promesas para los pacientes , mdicos, e investigadores . Algunas de las promesas se mantendr , algunos resultan ser ilusiones , y otros pueden llegar a ser muy difcil de manejar sin una legislacin adicional. Clasificacin del cncer ha comenzado y los resultados ya han ayudado a reevaluar la terapia y pronstico en ciertos casos. Del mismo modo , la investigacin bsica se ha beneficiado de la nueva tecnologa. En este sentido, algunas promesas se han mantenido . Tenemos que esperar y ver en qu medida todas las dems aplicaciones de la tecnologa de microarrays de ADN estarn a la altura de las sus expectativas. El nuevo conocimiento de las secuencias de todo el organismo y la aplicacin de la tecnologa de microarrays de ADN genmico como han abierto una nueva y emocionante era de la biologa . A pesar del gran progreso que se ha logrado en la comprensin de los sistemas biolgicos en las ltimas dcadas , estamos de nuevo en un nuevo comienzo.

5. Marcadores celulares: protena verde fluorescente. La protena verde fluorescente (GFP ) es una protena compuesta de 238 residuos de aminocidos ( 26,9 kDa ) que exhibe una fluorescencia verde brillante cuando se expone a la luz en el azul a la gama ultravioleta. Aunque muchos otros organismos marinos tienen protenas fluorescentes verdes similares , GFP se refiere tradicionalmente a la protena aislado por primera vez de la medusa Aequorea victoria . La GFP de A. victoria tiene un pico de excitacin importante en una longitud de onda de 395 nm y uno menor a 475 nm. Su pico de emisin es de 509 nm , que est en la parte inferior verde del espectro visible . El rendimiento cuntico de fluorescencia ( QY ) de GFP es 0,79 . La GFP del pensamiento mar ( Renilla reniformis ) tiene un nico pico principal de excitacin a 498 nm. En biologa celular y molecular , el gen GFP se utiliza con frecuencia como un reportero de expresin. [ 4 ] En formas modificadas que se ha utilizado para hacer los biosensores , y muchos animales se han creado que expresan GFP como una prueba de concepto de que una gen se puede expresar a travs de un organismo dado . El gen GFP se puede introducir en los organismos y se mantiene en su genoma a travs de la cra , la inyeccin con un vector viral , o la transformacin celular . Hasta la fecha , el gen GFP se ha introducido y se expresa en muchas bacterias, levaduras y otros hongos , pescado (como el pez cebra ) , planta, ventanas, y clulas de mamferos , incluyendo humanos . Martin Chalfie , Osamu Shimomura y Roger Y. Tsien fueron galardonados con el Premio Nobel de Qumica 2008 , el 10 de octubre de 2008 por su descubrimiento y desarrollo de la protena verde fluorescente .

Tambin se ha encontrado que las nuevas lneas de ratas transgnicas GFP pueden ser relevantes para la terapia gnica , as como la medicina regenerativa . Mediante el uso de " alto expresor " GFP , ratas transgnicas muestran alta expresin en la mayora de los tejidos , y muchas clulas que no se han caracterizado o han sido slo mal caracterizado en ratas GFP transgnicos anteriores . A travs de su capacidad para formar cromforo interno sin necesidad de accesorios cofactores , enzimas o sustratos distintos de oxgeno molecular , GFP es una excelente herramienta en todas las formas de la biologa .