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Universidad Nacional autnoma de Mxico Facultad de estudios superiores Cuautitln Departamento de Ciencias Biolgicas Seccin de Bioqumica y Farmacologa Humanas

Asignatura Anatoma e Histologa Humanas Grupo 1302 Bioqumica Diagnostica

Practica 6
Cuantificacin de Protenas y Factores que Alteran la Solubilidad Proteica Integrantes
Flores Prez Luis ngel Rodrguez Gmez Luca Ruiz Moreno Raymundo Ivn

Equipo No 10 Profesoras:
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08/ Octubre / 2013

Introduccin
Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de enfermedades, as como para otros muchos propsitos. Las protenas se pueden clasificar de manera general en protenas globulares y fibrosas. Las protenas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes de hidrgeno (caractersticos de las protenas fibrosas) siendo solubilizadas en suspensiones coloidales. En la leche hay tres clases de protenas: casena, lacto albminas y lacto globulinas (todas globulares). Si en una disolucin de protenas se producen cambios de pH,alteraciones en la concentracin, agitacin molecular o variaciones bruscas de temperatura, la solubilidad de las protenas puede verse reducida hasta el punto de producirse su precipitacin. Esto se debe a que los enlaces que mantienen la conformacin globular se rompen y laprotena adopta la conformacin filamentosa. De este modo, la capa de molculas de agua no recubre completamente a las molculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre s dando lugar a grandes partculas que precipitan. Las protenas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseadas, en resumen, no son funcionales. Esta variacin de la conformacin de las protenas se denomina desnaturalizacin. La desnaturalizacin no afecta a los enlaces peptdicos: al volver a las condiciones normales. Son ejemplos de desnaturalizacin, la leche cortada como consecuencia de la desnaturalizacin de la casena, la precipitacin de la clara de huevo al desnaturalizarse la ovoalbmina por efecto del calor. Las Lactoalbminas y lactoglobulinas Son molculas solubles que constituyen el resto de las protenas de la leche. La Lactoalbmina es el segundo tipo de protenas ms abundante en la leche. La Lactoglobulina Es la protena ms abundante en el lacto suero de la leche de vaca, posee numerosos grupos -SH que son responsables del desprendimiento del hidrgeno sulfurado que se produce cuando la leche se caliente por encima de 70C. Para la lactoglobulina de leche de vaca hay por lo menos cuatro variantes que se distinguen la una de la otra por la sustitucin de ciertos aminocidos en la cadena proteica. Sus puntos isoelctricos van de 5,2 a 5,6.

Estas variantes se diferencian por su solubilidad y por su mayor o menor aptitud apolimerizarse y a modificar su estructura, segn el pH.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos colorantes

Mtodos Derivados
Colorimtricos Biuret -Bastante especfico para protenas Muestra pocas interferencias Es barato Pero Tiene poca sensibilidad

Mtodo de Biuret Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero

Objetivos Distinguir los factores que alteran la solubilidad proteica en la leche y el huevo, realizar una curva patrn mediante un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena.

Metodologa
La indicada en el manual de Bioqumica General de la prctica No 6, en la pgina 49, 50 y 51.

Resultados y observaciones
Al agregar las gotas de limn a la solucin de leche con agua destilada, se observo la precipitacin. Cuando centrifugamos a 2500rpm obtuvimos el sobrenadante y la pastilla, los separamos y obtuvimos el peso de la pastilla que fue de 1.1g. Al filtrar la clara de huevo con la solucin salina .9% se logro separar un coagulo de nuestro filtrado.

Tabla 1. Factores que alteran la solubilidad proteica


Contenido de la Observaciones muestra L1 sobrenadante de NO OCURRIO NADA leche con HCl al 2% L2 sobrenadante de Se observo turvio leche con acetona L3 sobrenadante de No ocurrio nada leche con (NH4)2SO4 L4 sobrenadante de No ocurrio nada leche calentado a ebullicion H1 Filtrado de huevo No ocurrio nada con HCl al 2% H2 Filtrado de huevo Se formo un cuagulo grande con acetona en la parte superior H3 Filtrado de huevo Se formo un pequeo con (NH4)2SO4 cuagulo en el fondo, miestras que la parte superior se observa grasoso H4 Filtrado de huevo Se hizo muy turbio calentado a ebullicion Esta tabla fue realizada con el fin de ver qu factores alteran la solubilidad proteica Muestra

Tabla 2 observacin de colores con el reactivo de biuret Color obtenido al adicionar el reactivo de biuret al incubar en un bao a 50C 1 2 Tubos 3 4 5 6 7L 8H

A los tubos 1 ,2,3,4,5 y 6 se le agregaron los reactivos albumina, NaCl y reactivo de biuret respetando ese orden. Al tubo 7L se le agrego sobrenadante de leche, NaCl y reactivo de biuret respetando ese orden. Al tubo 8H se le agrego filtrado de clara de huevo con solucin salina, NaCl y reactivo de biuret en ese orden.

Tabla 3 cuantificacion de protenas No tubo 1 2 3 4 5 6 7 Concentracin (mg) 0 0.5 1.5 2.5 5 7.5 0 absorvancia 0 0.002 0.017 0.026 0.191 0.005 0.089 La tabla numero 3 muestra las lecturas en el espectrofotmetro. 8 0 0.045

Clculos y grficos
Concentracin mg 8
7 6 5 4 3 2 1 0 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Absorvancia Concentracion

Absorbancia

Anlisis de resultados
En la separacin de casena de la leche lo primero que hicimos fue precipitar la solucin de la leche con el agua destilada Esta precipitacin tiene lugar con cualquier cido que baje el pH por debajo de 5,5. Dependiendo de la cantidad y fortaleza del cido agregado, la precipitacin es ms o menos drstica y completa. Nosotros utilizamos el jugo de limn que contiene cido ascrbico, cido ctrico y otros cidos como el mlico, actico y fmico, aunque en pequeas cantidades. La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza es decir los grupos fosfato se protonan y la protena neutra precipita. Las protenas que aparecern en el sobrenadante cuando precipitemos la casena en medio cido son protenas globulares, hidrofilicas y fcilmente solubles en agua as como susceptibles de desnaturalizacin por calor. Las principales son -lacto

globulina, alfa-lacto albumina, inmunoglobulinas (Ig).

Albmina

de

suero

bovino

(BSA),

Luego centrifugamos para obtener el sobrenadante que luego ocupamos para ver qu factores alteran la solubilidad proteica. Lo mismo hicimos con la albumina de huevo. Como ya vimos existen varios agentes desnaturalizantes: como la fuerza ionica del medio, el pH, la temperatura y la constante dielctrica del solvente. Al haber cualquiera de estos cambios la solubilidad de las protenas puede verse reducida hasta el punto de producirse su precipitacin. Esto se debe a que los enlaces que mantienen la conformacin globular se rompen y la protena adopta la conformacin filamentosa. De este modo, la capa de molculas de agua no recubre completamente a las molculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre s dando lugar a grandes partculas que precipitan.Las protenas que se hallan en ese estado no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseadas, en resumen, no son funcionales. Esta variacin de la conformacin de las protenas se denomina desnaturalizacin. Al agregar HCl a las muestras del sobrenadante de la leche y el filtrado dehuevo este se combinan con proteinas con carga positiva formando complejos proteinados insolubles es por eso que los tubos L1 y H1 no presentaron cambios al agregar el HCl. Al variar el pH de la solucin de protena, los radicales de los Aa sufren disociacin y en el punto isoelctrico cuando la molcula est totalmente disociada la fuerza de atraccin electrosttica es mxima y la solubilidad decrece. Al agregar acetona que es un solvente orgnico a las muestras con el sobrenadante de la leche y el filtrado de huevo presentan cte dielctrica inferior al agua entonces la atraccin entre cargas opuestas es alta, esto quiere decir que se precipita en por eso que en la muestra L2 se forma un precipitado blanco y el la muestra H1 se forma un coagulo blanco grande. La precipitacin salina de las protenas es una tcnica en donde se logra la precipitacin de una fraccin de protenas mediante el aumento de la fuerza inica del medio. Grandes cantidades de una sal agregada a una solucin de protenas, disminuye la interaccin protena- H2O porque quita la capa de solvatacin, predominando la interaccin protena-protena y generando la precipitacin de las mismas. La concentracin salina a la que se produce la precipitacin no es igual para todas las protenas. Comnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad y porque el in sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas

inicas. La adicin gradual de sta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas. En la prctica a la muestra L3 no le ocurri nada mientras que al H3 se le formo un pequeo coagulo en el fondo. Al calentar en un bao a ebullicin las muestras con sobrenadante de la leche y el filtrado de huevo se observo que en el L4 no ocurrio nada miestras que en la muestra H4 se hizo turbia esto se debe a que la agitacin trmica afecta las interacciones que estabilizan la estructura tridimensional de las protenas. Al realizar la cuantificacin de protenas ocupamos la Reaccion de Biuret: Al realizar este mtodo obtuvimos colores que se muestran en la tabla nmero 3. Donde a los tubos 1,2,3,4,5 y 6 o no presentaron cambios o la solucin se volvi azul mientras que en los tubos 7L y 8L que eran nuestros tubos problema, cambiaron a color violeta esto se debe a que el reactivo de Biuret detecto la presencia de protenas presentes en esas muestras. El reactivo de Biuret que es cuando una solucin fuertemente alcalina de sulfato cprico (CuSO4) se aade a una solucin de protena se forma una complejo entre el ion cprico y los enlaces peptdicos, con aparicin de una coloracin violeta-prpura, que presenta un mximo de absorcin a 540 nm.

Conclusiones
-SE puede precipitar Protenas alterado las propiedades del Solvente con cambios de PH, temperatura, polaridad y concentraciones de Sales, As como se llevo a cabo en la casena hubo un cambio en el PH del Solvente. - La protena mayoritaria de la leche es la casena esta al cambiar el Ph del medio en el que se encontraba sufri una desnaturalizacin en su estructura por ello se hiso insoluble en el agua. - Se logro precipitar la albmina de un huevo de gallina diluyo en solucin salina al 0.9% alterando la concentracin de sales. -En la cuantificacin de Protenas se logro ver cmo funcionan las pruebas de identificacin de protenas, principalmente la de Biuret.

-Se comprendi como determinar la cantidad de protenas mediante el uso de un espectrofotmetro y la interpolacin, segn la ley de Lambert-Beer

Bibliografa
JC Cheftel, H Cheftel y P Besanon (1989); Introduccin a la bioqumica y tecnologa de los alimentos. Ed. Acribia. J.G.morris (1975) fisicoqumica para bilogos. Barcelona. Editorial reverte Roberto martinez alvarez(2005). Qumica un proyecto de la ACS. Barcelona, editorial Reverte Salvador Badui Derkgak(1981) qumica de los alimentos. 1 ed. Mexico, editorial alhambra mexicana