Laboratorio : Control microbiolgico

Gua Laboratorio
1. Recuento de levaduras

Objetivo 1.1 Determinar la concentracin de clulas en una muestra en fermantacin a travs de la cmara de recuento Neubauer. 1.2 Determinar la viabilidad aproximada del cultivo. 1.3 Calcular la dilucin necesaria para realizar el recuento de clulas viables en placa Petri para luego comparar la equivalencia de ambos mtodos. Procedimiento Actividad en parejas. Use la muestra de levaduras que se le proporciona. 1.1 Usa el objetivo 40x (sin aceite de inmersin). Cuente por lo menos 100 clulas. Cargue la cmara por capilaridad despus de colocar el cubreobjeto. Mezcle bien la muestra antes de usarla. Tome la muestra aspticamente con una pipeta Pasteur. Para el clculo de volumen considere que la cmara tiene una profundidad de 0.1 mm; la superficie de un cuadrado grande es de 1 mm2 y este se divide en 25 cuadrados medianos y 400 cuadraditos chicos. 1.2 Mezcle una parte de azul de metileno con una parte de la suspensin de levaduras directamente en un portaobjeto corriente (Solucin de azul de metileno: 0.4% azul de metileno, 10% etanol (95%), 0.4 M KH2PO4). Repita la determinacin de viabilidad luego de apretar las clulas con el cubreobjeto. 1.3 En base al recuento original y el % aproximado de viabilidad calcule la dilucin necesaria para realizar el recuento de clulas viables en placa Petri. Se proporciona pipetas de 1 ml estriles y tubos con 9 ml de agua estril. Efecte la dilucin de manera que 0.1 a 0.2 ml, que puede distribuir sobre la superficie de la placa, le den un recuento entre 50 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC) por placa. Distribuya la dilucin elegida mediante un rastrillo flameado, hecho con una pipeta Pasteur. Haga el recuento de UFC 7 das despus. Compare el resultado de este recuento con su estimacin original basada en el recuento al microscopio y la viabilidad. Utilizando los resultados de todo el curso determine si ambos recuentos son estadsticamente equivalentes (Test T). 2. Control microbiolgico de vinos envasados

Objetivo 2.1 Hacer un control microbiolgico a travs de la determinacin de UFC en un vino envasado 2.2 Confirmar el tipo de microorganismos aislados a travs de observacin microscpica y test de la catalasa.

Procedimiento 2.1 El sistema se basa en la filtracin del vino a travs de una membrana estril, la que despus se incuba sobre un medio adecuado. Medio para levaduras: Agar extracto de Malta o medio WLN; ambos se pueden adquirir preparados. Previo a su empleo, agregar 0.15 ml de solucin alcohlica de difenil al 0.75% para eliminar hongos y distribuirla sobre la superficie de la placa con un rastrillo flameado. Medio para bacterias lcticas: Medio Manzana-Rogosa-Actidiona (Cicloheximida) o medios WLD y MRS. El primero puede ser preparado segn frmula descrita en el texto de Boulton et. al. Los otros dos tambin se pueden adquirir listos para su empleo. Procedimiento: Colocar una membrana estril en el portafiltro previamente esterilizado utilizando una pinza flameada. No es necesario esterilizar el recipiente en el que se recibe el vino. Antes de tomar la muestra agitar el vino para poner los organismos en suspensin. Flamear la boca de la botella y el sacacorchos y extraer el corcho hasta la mitad. Volver a flamear y completar la extraccin del corcho. Vaciar aspticamente 100 ml de vino en el portafiltro, conectar el vaco y filtrar la muestra. Retirar la membrana con la pinza flameada y ponerla (cara cuadriculada hacia arriba) sobre una de las placas con medio Extracto de Malta, evitando que se formen burbujas bajo la membrana. Utilizando una nueva membrana estril, repetir el procedimiento y poner la membrana en una placa de medio para bacterias lcticas. Incubar las placas boca abajo a temperatura ambiente, las de levaduras (Agar extracto de Malta) aerbicamente y las de bacterias lcticas bajo condiciones semi anaerbicas si est disponible el equipamiento o incube aerbicamente. Realizar el recuento a los 7 a 10 das. Expresar los resultados como nmero de UFC por litro de vino. 2.2 Confirmar que las colonias corresponden a los microorganismos buscados por observacin al microscopio y en el caso de las bacterias a travs de la prueba de la catalasa: Mezclar una buena cantidad de bacterias con una gota de agua oxigenada al 3% (dilucin al 10% de agua oxigenada comercial). Las bacterias acticas, positivas, burbujean mientras las lcticas son negativas. Observacin microscpica de muestras.

3.

Objetivos 3.1 3.2 Aprender a regular el microscopio de contraste de fases. Observar y dibujar los microorganismos de diferentes muestras.

Procedimiento 3.1 Observe y dibuje los microorganismos que observe en las muestras que se le presenten. Manipule las muestras con pipeta Pasteur o asa de pt segn corresponda. Emplee el objetivo 40x en primera instancia. Slo si la muestra corresponde a bacterias pase al objetivo 100x y use aceite de inmersin. Si emplea aceite, limpie cuidadosamente el objetivo con alcohol luego de usarlo. 3.2 Se dispone de un microscopio con contraste de fases. Aprenda a regular el

sistema con un ayudante. Describa el procedimiento en el informe. Observe una mismas muestra de bacterias bajo contraste de fases y en un microscopio normal. INFORME Recordar que cada informe debe contener lo siguiente: Objetivo Procedimiento: si fue similar al descrito en la gua, no describirlo nuevamente, slo poner las variantes. Resultados: Poner todos los datos obtenidos, adems el de sus compaeros en caso que ello contribuya a la discusin del experimento. Si lo amerita, grafique los datos. Discusin: Discuta los resultados, los factores que los hayan determinado o alterado y adems responda las siguientes preguntas: Con respecto al recuento de levaduras, Existen diferencias significativas entre el recuento al microscopio, considerando la viabilidad, y el realizado en placa Petri? Cul resultado es ms variable? En que contribuy el difenil al recuento? Cul es el fundamento en el cual se basa el test de la catalasa? Qu limitantes y/o ventajas tiene el microscopio contraste de fases en relacin al tradicional? Conclusin