UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Programa de Ps-Graduao de Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos Escola de Qumica

Dissertao de Mestrado

Aplicao de Tecnologia Enzimtica na Obteno de -Caroteno a partir de leo de Buriti (Mauritia vinifera)
Bernardo Dias Ribeiro

RIO DE JANEIRO FEVEREIRO/2008

APLICAO DE TECNOLOGIA ENZIMTICA NA OBTENO DE -CAROTENO A PARTIR DE LEO DE BURITI (MAURITIA VINIFERA) Bernardo Dias Ribeiro

DISSERTAO DE MESTRADO APRESENTADA AO CORPO DOCENTE DO CURSO DE PSGRADUAO EM TECNOLOGIA DE PROCESSOS QUMICOS E BIOQUMICOS DA ESCOLA DE QUMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIIRO, COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSRIOS OBTENO DO GRAU DE MESTRE EM CINCIAS (M.Sc.).

Orientadores: Prof. Daniel Weingart Barreto, D. Sc. Prof. Maria Alice Zarur Coelho, D. Sc.

RIO DE JANEIRO FEVEREIRO/2008 ii

T 18 R484a Ribeiro, Bernardo Dias Aplicao de tecnologia enzimtica na obteno de caroteno a partir de leo de buriti (Mauritia vinifera)/ Bernardo Dias Ribeiro. Rio de Janeiro, 2008. xvi, 103 f.: il. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Qumica, 2008. Orientadores: Daniel Weingart Barreto e Maria Alice Zarur Coelho 1. Hidrlise enzimtica. 2. leo de Buriti. 3. Caroteno 4. Lipases I. Barreto, D. W. (Orient.) II. Coelho, M. A. Z. (Orient.) III. UFRJ. Escola de Qumica. IV. Ttulo CDD: 665.3

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AGRADECIMENTOS
Primeiramente, agradeo a Deus por ter me dado fora e autoconfiana para conseguir superar todas as dificuldades que enfrentei durante esta dissertao; minha me Sonia, que sempre lutou muito para me dar estudo, comida, conforto, e tudo mais o que ela pode fazer, apesar de todas as dificuldades que a vida lhe proporcionou. Sempre darei o meu melhor para poder corresponder o seu esforo, me; minha av Maria, meu av Afranio e meu tio Afranio Jos por me apoiarem sempre quando precisei, apesar de no conseguir ser mais presente como era em alguns anos atrs, mas tenham certeza que amo muito todos vocs; minha noiva Aline, porque alm de me fazer muito feliz, me deu algumas sugestes interessantes durante a conduo desta dissertao; A todos os meus amigos e familiares, por no terem me esquecido apesar de toda minha ausncia neste perodo; Ao meu orientador prof. Daniel Barreto, grande mestre e pai cientfico, por ter me ensinado como pensar mais concretamente sobre produtos naturais e tambm na minha vida, a ter mais foco nas pesquisas devido a minha avidez de querer saber sobre tudo e achar tudo interessante. Grandes conversas na hora do almoo que giravam em torno de praticamente qualquer assunto. Acima de tudo, mestre, obrigado por sua amizade e considerao; minha orientadora prof Maria Alice, por ter me acolhido carinhosamente no seu laboratrio desde 2003, e que considero como minha madrinha cientfica. Quem conhece sabe que voc tem um corao imenso, teacher, e s tenho a agradecer por mim e por todos do laboratrio por tudo o que voc faz pensando em ns; Roberta, Etel, Priscilla, Gizele, Ana Iraidy, Ariana, Andr, Mariana, Kelly, Tatiana e todos os outros que freqentaram o laboratrio de Enzimologia Industrial, pela amizade e pelo ambiente agradvel de trabalho; estagiria Lvia, por ter me ajudado em algumas anlises em um ponto crtico da dissertao, e tambm ao pessoal do Departamento de Processos Orgnicos (rika, Elizandra, Karine e Lourdes) pela convivncia pacifica e divertida; prof Suely Freitas, por te me emprestado alguns solventes para realizao de experimentos; prof Eliana Flvia, e ao tcnico Paulinho, por terem permitido o uso do shaker no laboratrio E-107; A prof Magali Cammarota, por ter permitido o uso dos seus equipamentos, enquanto nosso laboratrio estava em obras; A prof Andra Salgado e a ps-doutoranda Ninoska, por ter permitido o uso de seu shaker no Laboratrio de Engenharia Qumica; Ao prof Alexandre Torres (IQ-UFRJ), por ter me tirado vrias dvidas de HPLC, e de anlise de insaponificveis; prof Claudia Rezende (IQ-UFRJ), e as alunas Carolina, Silvia e Michelle, por terem feito e me explicado um pouco mais sobre anlise da composio de cidos graxos em cromatografia em fase gasosa;

 prof Dlia Rodriguez-Amaya (FEA-UNICAMP), por ter me enviado um artigo falando sobre carotenides da polpa de buriti, e por ter feito o guia de anlise e isolamento de carotenides, que foram essenciais para a tese; A todas as demais pessoas que contriburam, direta e indiretamente, para que o presente texto pudesse ser desenvolvido; Aos membros da banca examinadora, pelo aceite do convite; A CAPES, pela bolsa de mestrado concedida; A FAPERJ, pela bolsa ALUNO NOTA 10 concedida;

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Alguns homens vem as coisas como so, e dizem: Por qu? Eu sonho com as coisas que nunca foram e digo: Por que no? George Bernard Shaw vii

RESUMO
RIBEIRO, Bernardo Dias. Aplicao de tecnologia enzimtica para obteno de caroteno a partir de leo de buriti (Mauritia vinifera). Rio de Janeiro, 2008. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos) Escola de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008. O -caroteno utilizado como corante alimentcio ou como complemento nutricional, por ser a principal fonte de pr-vitamina A. Estima-se que o mercado mundial de carotenides, que em 2005 foi de 887 milhes de dlares, ir crescer 3% ao ano, quebrando a barreira de 1 bilho de dlares em 2009, sendo o -caroteno responsvel por quase 30% deste mercado. A maior parte do -caroteno vendido no mundo obtida por sntese qumica a partir da ionona, mas uma pequena parte produzida por processos biotecnolgicos, utilizando diferentes microorganismos, tais como fungos filamentosos (Blaskelea trispora e Phycomyces blaskeleeanus), leveduras (Rhodotorula glutinis), bactrias (Flavobacterium multivorum) e microalgas (Dunaliella salina e D. bardawil). Alguns frutos oleaginosos como o dend (Elaeis guineensis) e o buriti (Mauritia vinifera) apresentam um alto teor de carotenides, principalmente de -caroteno. O buriti uma palmcea que cresce em diversas reas do Brasil, e apresenta diversos usos tradicionais, como na preparao de refrescos e doces da regio Amaznica. O recente interesse em novas fontes naturais de -caroteno tm estimulado o desenvolvimento de processos para a extrao do leo rico em carotenides do buriti. A maior parte desses processos, entretando, ainda baseada em tecnologias convencionais que incluem a secagem e a prensagem do leo da polpa. O presente trabalho trata da caracterizao inicial do leo bruto e refinado de buriti, incluindo a determinao dos insaponificveis, e posteriormente a hidrlise enzimtica de ambos os leos, para a posterior extrao e concentrao de -caroteno. Na etapa de hidrlise foi avaliado o desempenho de duas lipases comerciais, Lipozyme TL IM e CALB L, e tambm de uma lipase produzida em laboratrio originada de Yarrowia lipolytica. Os parmetros avaliados no processo de extrao foram: temperatura, quantidade de enzima (atividade enzimtica) e relao substrato (leo de buriti) / gua. As condies experimentais foram estabelecidas atravs de um planejamento estatstico de experimentos, de forma a se otimizar seus valores em funo do maior rendimento de cidos graxos livres e a perda mnima de carotenides durante o processo. Os resultados foram analisados em relao ao teor de cidos graxos livres por titulao; carotenides totais por espectrofotmetro e composio de carotenides totais por HPLC, utilizando coluna YMC ODS-A com fase mvel de acetonitrila/metanol/THF (50/45/5). Na caracterizao do leo bruto, os resultados foram similares aos j encontrados na literatura, mas o leo refinado apresentou apocarotenides, que so formados durante o processo de refino de leos vegetais. As condies timas de hidrlise enzimtica foram diferentes para cada leo, onde a lipase Lipozyme TL IM apresentou uma atividade lipoltica superior s demais. Aps a hidrlise do leo, foram testados alguns mtodos para separar os cidos graxos formados dos carotenides, e assim aumentar a concentrao de -caroteno no produto final.

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ABSTRACT
RIBEIRO, Bernardo Dias. Aplicao de tecnologia enzimtica para obteno de caroteno a partir de leo de buriti (Mauritia vinifera). Rio de Janeiro, 2008. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos) Escola de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2008. -carotene is the main source of provitamin A, and is widely used as a food colorant and nutritional supplier. The global market for carotenoids, which was of US$ 887 millions in 2005 and has been growing at an yearly rate of 3% , is estimated to surpass US$ 1 billion in 2009., -carotene being responsible for almost 30% of this market. Most of the -carotene sold in the world is produced by chemical synthesis from -ionone, but a small amount is manufactured using biotechnological processes, based on different microorganisms, such as fungi (Blaskelea trispora and Phycomyces blaskeleeanus), yeasts (Rhodotorula glutinis), bacteria (Flavobacterium multivorum) e microalgae (Dunaliella salina and D. bardawil). Some oleaginous fruits such as palm (Elaeis guineensis) and buriti (Mauritia vinifera) present high concentrations of carotenoids, specially -carotene. Buriti is a palm tree that grows wild in different areas of Brazil, and has been traditionally used for the preparation of beverages and candies in the Amazon area. The recent interest about other natural sources of -carotene stimulated the development of processes to extract the carotenoid-rich oil of the buriti fruit. Most processes, however, are still based on the conventional technologies for pulps, including drying and pressing the oil off the pulp. The present work involves the initial characterization of crude and refined buriti oil. The characterization includes the determination of unsaponifiable matter, followed by enzymatic hydrolysis, for further extraction and concentration of -carotene from the buriti oil. In the hydrolysis process, the performance of two commercial lipases Lipozyme TL IM and CALB L, and also a lipase originated from Yarrowia lipolytica produced in our laboratory was evaluated. The analysed parameters in the hydrolysis process were temperature, enzyme quantity (enzymatic activity) and ratio substrate buriti oil/ water. The experimental conditions were established based on an experimental design in order to set the more favourable conditions for the process. The results were analysed for the free fatty acids contents using titration; total carotenoids using spectrophotometry and its composition by HPLC, using a YMC ODS-A column with a mobile phase of acetonitrile/methanol/THF (50/45/5). In the characterization of crude oil, the results were similar with those described in the literature, but the refined oil presented apocarotenoids, which were formed during the refining of the oils. The optimized conditions of the enzymatic hydrolysis were different for each oil, where the Lipozyme TL IM had a higher lipolytic activity. After the hydrolysis of the oil, some methods were tested to separate the fatty acids formed from the carotenoids, increasing the -carotene concentration in the final product.

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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Exemplares de soja, canola e palma ..........................................................................1 Figura 2 - Traumatina .................................................................................................................1 Figura 3 - Principais carotenos ...................................................................................................5 Figura 4 - Principais xantofilas...................................................................................................6 Figura 5 - Biossntese resumida dos insaponificveis (Simes et al, 2003)...............................8 Figura 6 - Esquema geral de biossntese de terpenides (Dewick, 2002) ..................................8 Figura 7 - Biossntese de licopeno. (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005). ..................9 Figura 8 - Biossntese de carotenides a partir do licopeno. (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005)................................................................................................................................10 Figura 9 - Principais ismeros cis do -caroteno .....................................................................11 Figura 10 - Epoxicarotenides derivados do -caroteno..........................................................11 Figura 11 - Apocarotenides derivados do -caroteno ............................................................12 Figura 12 - Formulao de -caroteno dispersvel em gua (http://www.corporate.basf.com/, 2007).........................................................................................................................................15 Figura 13 Alimentos biofortificados. A) Tomate laranja e normal; B) Arroz dourado e branco .......................................................................................................................................16 Figura 14 - Vias sintticas para obteno de -ionona.............................................................18 Figura 15 - Sntese de -caroteno por condensao enol-ter..................................................19 Figura 16 Sntese de -caroteno por condensao de Wittig ................................................19 Figura 17 Dunaliella salina e seu cultivo em tanques abertos ..............................................20 Figura 18 Phycomyces blakesleeanus e um zigosporo de Blakeslea trispora .......................22 Figura 19 - Rhodotorula glutinis e Sporobolomyces roseus ....................................................22 Figura 20 - Halomonas elongata e Escherichia coli ................................................................23 Figura 21 Palmeiras e frutos do buriti ...................................................................................25 Figura 22 Algumas reaes catalisadas por lipases...............................................................30 Figura 23 Esquema geral do stio ativo de uma lipase ..........................................................32 Figura 24 Mecanismo de reao em lipases ..........................................................................33 Figura 25 Perfil de carotenides dos leos de buriti .............................................................55 Figura 26 Avaliao do tempo reacional de hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti .........................................................................................................................................56 Figura 27 Avaliao da quantidade de cidos graxos produzida pelo custo de lipase durante a hidrlise de leo bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................56 Figura 28 Avaliao da temperatura na reduo da concentrao de -caroteno durante a hidrlise de leo bruto (a) e refinado (b) de buriti ...................................................................57 Figura 29 Avaliao da relao leo/gua na hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti .........................................................................................................................................58 Figura 30 Avaliao da quantidade de enzima sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................58 Figura 31 Avaliao da quantidade de enzima sobre a concentrao de carotenides .........58 Figura 32 Avaliao de emulsificantes sobre a hidrlise enzimtica dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................59 Figura 33 - Avaliao da adio de clcio sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti.....................................................................................................................................60 Figura 34 Avaliao de adio de adsorventes sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................61 Figura 35 - Avaliao da quantidade de alumina sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti.................................................................................................................62 x

Figura 36 - Avaliao da quantidade de alumina sobre a concentrao de carotenides durante a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti .............................................................62 Figura 37 - Avaliao da substituio da gua por tampo fosfato sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti ...............................................................................................62 Figura 38 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por Lipozyme TL IM sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b).........................................64 Figura 39 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por Lipozyme TL IM ..................................................................................................................................................65 Figura 40 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por Lipozyme CalB L sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)........................................66 Figura 41 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por Lipozyme CalB L ..................................................................................................................................................67 Figura 42 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b).................................68 Figura 43 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica ...................................................................................................................................69 Figura 44 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por Lipozyme TL IM sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b).........................................71 Figura 45 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por Lipozyme TL IM .............................................................................................................................................72 Figura 46 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por Lipozyme CalB L sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)........................................73 Figura 47 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por Lipozyme CalB L................................................................................................................................................74 Figura 48 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b) ......................75 Figura 49 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica ...................................................................................................................76 Figura 50 Otimizao da quantidade de enzima na hidrlise enzimtica dos leos de buriti79 Figura 51 Avaliao da velocidade de agitao sobre a hidrlise enzimtica dos leos de buriti .........................................................................................................................................79 Figura 52 Otimizao do tempo reacional na hidrlise enzimtica dos leos de buriti ........80 Figura 53 Avaliao de cidos graxos livres e carotenides durante o ps-processamento do leos bruto e refinado de buriti.................................................................................................82 Figura 54 Perfil de carotenides do leo refinado aps desacidificao com soda alcolica82 Figura 55 Fitoesteris ..........................................................................................................101 Figura 56 Retinal .................................................................................................................102 Figura 57 - Tococromanis: (A) Tocoferis, (B) Tocotrienis..............................................102 Figura 58 Toruleno (R = CH3) e Torularodina (R = COOH) ..............................................102

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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Insaponificveis de alguns leos vegetais ................................................................2 Tabela 2 Potenciais fontes vegetais produtoras de -caroteno..............................................24 Tabela 3 Composio centesimal da polpa do fruto de buriti ...............................................26 Tabela 4 Perfil de cidos graxos de frutos oleaginosos.........................................................27 Tabela 5 Perfil de carotenides de alguns leo vegetais .......................................................27 Tabela 6 Faixas timas de atuao de algumas lipases .........................................................31 Tabela 7 - Comparao entre processos convencionais de hidrlise de leos e gorduras........35 Tabela 8 Faixa de valores utilizada para otimizao dos parmetros da hidrlise enzimtica ..................................................................................................................................................50 Tabela 9 Planejamento Composto Central em 3 nveis com 3 pontos centrais.....................51 Tabela 10 Comparao da composio de cidos graxos dos leos de buriti .......................52 Tabela 11 Comparao dos ndices fsico-qumicos dos leos de buriti...............................53 Tabela 12 Comparao da composio de carotenides dos leos de buriti.........................54 Tabela 13 Comparao dos resultados (cidos graxos livres e carotenides) da hidrlise enzimtica do leo bruto de buriti utilizando planejamento composto central ........................63 Tabela 14 Comparao dos resultados (cidos graxos livres e carotenides) da hidrlise enzimtica do leo refinado de buriti utilizando planejamento composto central ...................70 Tabela 15 Comparao das condies timas para hidrlise enzimtica do leo bruto de buriti .........................................................................................................................................77 Tabela 16 Comparao das condies timas para hidrlise enzimtica do leo refinado de buriti .........................................................................................................................................77

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AOT ATP BHT CHB1 CHB2 CHE CRTISO FAO FPP GGPP HPLC IPP LCB LCE PD PEP ppm PUFA Span 20 THF Tween 80 UV-VIS ZD Sulfosuccinato de bis(2-etill hexil) sdio Adenosina Trifosfato Butiril hidroxitolueno Carotenide -hidroxilase non-heme-di-ferro monooxigenase Carotenide -hidroxilase ligada ao ncleo heme do citocromo P450 Carotenide -hidroxilase ligada ao ncleo heme do citocromo P450 Carotenide isomerase Food and Agriculture Organization of the United Nations Pirofosfato de farnesila Pirofosfato de geranilgeranila High Pressure Liquid Chromatography Pirofosfato de isopentenila Licopeno -ciclase Licopeno -ciclase Fitoeno desaturase Fosfoenolpiruvato Partes por milho = mg/kg Poly unsaturated fatty acids Monolaurato de sorbitana Tetrahidrofurano Polioxietileno monooleato de sorbitana Ultravioleta-visvel -Caroteno desaturase

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SUMRIO
CAPTULO 1 INTRODUO _____________________________________________ 1 CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA _________________________________ 5 2.1) CAROTENIDES ___________________________________________________ 5 2.1.1) Caractersticas Gerais ______________________________________________ 5 2.1.2) Biossntese _______________________________________________________ 7 2.1.3) Propriedades e modificaes ________________________________________ 10 2.1.4) Aes benficas sade ____________________________________________ 12 2.1.5) -Caroteno ______________________________________________________ 14 2.1.5.1) Formas de comercializao ______________________________________ 14 2.1.5.1.1) Matrizes lipoflicas_________________________________________ 14 2.1.5.1.2) Matrizes hidroflicas________________________________________ 15 2.1.5.1.3) Alimentos biofortificados____________________________________ 16 2.1.5.2) Mercado_____________________________________________________ 17 2.1.5.3) Fontes Comerciais_____________________________________________ 17 2.1.5.3.1) -caroteno Sinttico ________________________________________ 17 2.1.5.3.2) -caroteno Natural _________________________________________ 20 A Processos Biotecnolgicos ___________________________________ 20 A.1 Microalgas ______________________________________________ 20 A.2 Fungos Filamentosos______________________________________ 21 A.3 Leveduras _______________________________________________ 22 A.4 Bactrias ________________________________________________ 23 B Extrao de Fontes Vegetais _________________________________ 24 2.2) BURITI____________________________________________________________ 2.2.1) Caractersticas Gerais _____________________________________________ 2.2.2) leo de Buriti ____________________________________________________ 2.2.3) Outras Tecnologias _______________________________________________ 2.3) LIPASES __________________________________________________________ 2.3.1) Fontes e Propriedades _____________________________________________ 2.3.2) Estrutura e Aspectos cinticos _______________________________________ 2.3.3) Especificidade ___________________________________________________ 2.3.4) Hidrlise Enzimtica de leos e Gorduras _____________________________ 25 25 26 27 29 30 31 33 35

CAPTULO 3 MATERIAIS E MTODOS __________________________________ 39 3.1) MATERIAIS _______________________________________________________ 39 3.2) EQUIPAMENTOS __________________________________________________ 39 3.3) MTODOS ANALTICOS ___________________________________________ 3.3.1) Composio de cidos graxos _______________________________________ 3.3.2) ndices _________________________________________________________ 3.3.2.1) Saponificao (IS) _____________________________________________ 3.3.2.2) Perxido (IP) _________________________________________________ 3.3.2.3) Iodo (II) _____________________________________________________ 3.3.2.4) cidos graxos livres (AGL) _____________________________________ 3.3.3) Densidade _______________________________________________________ 3.3.4) Umidade ________________________________________________________ 3.3.5) Material Insaponificvel ___________________________________________ 40 40 40 40 41 42 42 42 42 43 xiv

3.3.5.1) Teor de Insaponificveis ________________________________________ 3.3.5.2) Carotenides _________________________________________________ 3.3.5.2.1) Carotenides Totais ________________________________________ 3.3.5.2.2) Composio de carotenides _________________________________ 3.3.5.3) Tocoferis Totais _____________________________________________ 3.3.5.4) Esteris Totais________________________________________________ 3.3.6) Atividade Lipoltica _______________________________________________ 3.4) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS _______________________________ 3.4.1) Caracterizao dos leos de buriti ___________________________________ 3.4.2) Pr-Avaliao do Processo Enzimtico ________________________________ 3.4.2.1) Tempo reacional e Seleo de enzimas_____________________________ 3.4.2.2) Temperatura _________________________________________________ 3.4.2.3) Relao leo/gua ____________________________________________ 3.4.2.4) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimtica) ______________________ 3.4.2.5) Aditivos _____________________________________________________ 3.4.3) Otimizao da Hidrlise Enzimtica __________________________________ 3.4.4) Desacidificao e Concentrao de -Caroteno _________________________ 4.1) CARACTERIZAO DOS LEOS DE BURITI ________________________ 4.1.1) Composio em cidos graxos _______________________________________ 4.1.2) Determinao dos ndices Fsico-Qumicos ____________________________ 4.1.3) Composio e Perfil de Carotenides _________________________________ 4.2) PR-AVALIAO DO PROCESSO ENZIMTICO _____________________ 4.2.1) Determinao do Tempo Reacional e Seleo das Enzimas ________________ 4.2.2) Pr-avaliao dos Parmetros do Planejamento Experimental _____________ 4.2.2.1) Temperatura _________________________________________________ 4.2.2.2) Relao leo/gua ____________________________________________ 4.2.2.3) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimtica) ______________________ 4.2.3) Pr-avaliao dos Aditivos _________________________________________ 4.2.3.1) Emulsificantes ________________________________________________ 4.2.3.2) Clcio ______________________________________________________ 4.2.3.3) Adsorventes__________________________________________________ 4.2.3.4) Tampo Fosfato_______________________________________________ 4.3) OTIMIZAO DA HIDRLISE ENZIMTICA ________________________ 4.3.1) Planejamento Experimental do leo Bruto de Buriti _____________________ 4.3.1.1) Lipozyme TL IM______________________________________________ 4.3.1.2) Lipozyme CALB L ____________________________________________ 4.3.1.3) Lipase de Yarrowia lipolytica ____________________________________ 4.3.2) Planejamento Experimental do leo Refinado de Buriti ___________________ 4.3.2.1) Lipozyme TL IM______________________________________________ 4.3.2.2) Lipozyme CALB L ____________________________________________ 4.3.2.3) Lipase de Yarrowia lipolytica ____________________________________ 4.3.3) Resumo das Condies timas na Hidrlise dos leos de Buriti ____________ 4.3.4) Otimizao ______________________________________________________ 4.3.4.1) Quantidade de Enzima _________________________________________ 4.3.4.2) Agitao ____________________________________________________ 4.3.4.3) Tempo Reacional _____________________________________________

43 44 44 44 45 45 45 46 46 47 47 48 48 48 48 49 51 52 52 52 53 55 55 57 57 57 58 59 59 59 60 62 63 63 63 66 68 70 70 73 75 77 78 78 79 79 xv

CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO _______________________________ 52

4.4) DESACIDIFICAO E CONCENTRAO DE -CAROTENO ___________ 80

4.4.1) Recuperao da Alumina ___________________________________________ 4.4.2) Mtodos de Desacidificao ________________________________________ 4.4.2.1) Partio com Etanol ___________________________________________ 4.4.2.2) Saponificao ________________________________________________ 4.4.2.3) Winterizao _________________________________________________

80 81 81 82 83

CAPTULO 5 CONCLUSO _____________________________________________ 84 CAPTULO 6 SUGESTES ______________________________________________ 86 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ________________________________________ 88 GLOSSRIO ___________________________________________________________ 101 APNDICE _____________________________________________________________ 103

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CAPTULO 1 INTRODUO
Os leos vegetais so a maior fonte de lipdeos comestveis, contabilizando mais de 75% do total de gorduras consumidas no mundo, com uma produo anual de cerca de 150 milhes de toneladas. Entre estes, quase 75% extrada do endosperma de sementes de oleaginosas, como a soja e a canola, enquanto os demais so extrados do pericarpo de frutos, como oliva e palma (Figura 1) (Salas et al, 2000; FAO, 2007).

Figura 1 - Exemplares de soja, canola e palma

A funo do leo na maioria dos vegetais superiores de reserva energtica primria nas sementes, sendo metabolizado atravs de reaes de -oxidao para produo de acetato, que aciona o ciclo do glioxilato, gerando os intermedirios para a formao de monossacardeos via gliconeognese, auxiliando a germinao e o crescimento durante o desenvolvimento da planta (Eastmond & Graham, 2001). A presena de leo no pericarpo de frutos tem como funes principais a proteo contra perda de gua pela formao de ceras; e o auxlio na defesa contra injrias superfcie do fruto, onde pela degradao enzimtica por lipoxigenase so gerados aldedos precursores de um hormnio vegetal chamado traumatina (Figura 2), que induz o reparo na planta e tem atividade antimicrobiana. (Salas et al, 2000).

Figura 2 - Traumatina

Nos plastdeos, como cloroplastos e cromoplastos ocorre, alm da produo de triglicerdeos, a biossntese de outras molculas, como os intermedirios destes triacilgliceris, que so os fosfatdeos, os diglicerdeos e os cidos graxos livres, e tambm do material insaponificvel (Salas et al, 2000). Os insaponificveis so definidos como a soma dos componentes dissolvidos em leos e gorduras, que aps saponificao alcalina, permanece como resduo no reagido e novoltil, sendo solveis em solventes apolares (por exemplo, ter dietlico e ter de petrleo) (Matissek et al, 1998). Estes insaponificveis contm principalmente carotenides, fitoesteris e tococromanis e seus derivados (vitamina E), alm de alguns componentes menores como clorofila, polifenis, hidrocarbonetos (esqualeno) e lcoois triterpnicos, agindo como antioxidantes e fotoprotetores, que ajudam a evitar a oxidao dos cidos graxos insaturados. A Tabela 1 apresenta o teor e o perfil de insaponificveis de alguns leos vegetais (Gunstone & Padley, 1997; Gunstone, 2002).
Tabela 1 Insaponificveis de alguns leos vegetais

leos Coco Milho Algodo Amendoim Palma Palmiste Oliva Canola Soja Girassol Arroz

Insaponificveis (%) 0,8 1,5 1,3 2,8 1,5 2,0 0,4 1,0 1,2 0,1 0,8 0,5 1,5 1,2 2,0 0,5 1,6 1,5 35

Fitoesteris (ppm) 500 1100 7900 22100 2700 5900 900 2900 400 500 800 1400 1200 2700 4800 11300 1800 4100 2400 4500 1800

-Tocoferol Carotenides (ppm) (ppm) 5 112 134 389 130 130 260 62 119 210 75 - 117 487 608 800 1,2 3,6 500 700 4,3 11,8 1 20 130 1,0 1,5 -

Os insaponificveis tm sido objeto de grande ateno devido as descobertas recentes sobre seus inmeros benefcios sade, a partir das evidncias publicadas sobre a ao protetora dos antioxidantes, vitamina E e -caroteno, contra radicais livres que mediam diferentes tipos de dano celular, que tm implicao no desenvolvimento de vrias doenas degenerativas, como cncer, doenas cardiovasculares, catarata e degenerao macular (Gl-stndag & Temelli, 2004). Como consequncia dessas descobertas, o interesse na incorporao de componentes das fraes insaponificveis em produtos de consumo, como alimentos, cosmticos ou suplementos nutricionais tambm aumentou muito, como por exemplo a incorporao de fitoesteris derivatizados em margarinas aumentando seus benefcios sade, como a reduo do risco de doenas cardiovasculares (Moreau et al, 2002). As principais formas de obteno dos insaponificveis so por sntese qumica, que geralmente simples e de baixo custo, ou por extrao e isolamento a partir de leos vegetais ou de subprodutos do refino (destilado de leo desodorizado) atravs de diversos processos como extrao lquido-lquido (Bhosle & Subramanian, 2005), extrao com fluido supercrtico (Lau et al, 2007), cristalizao fracionada (Xu et al, 2005), destilao molecular (Moraes et al, 2006), saponificao (Bhosle & Subramanian, 2005), adsoro (Rossi et al, 2001) ou separao por membranas (Subramanian et al, 2001). Alm da extrao e refino, tambm so estudados processos de derivatizao das fraes para melhor estabilizao de seus componentes ativos frente a agentes oxidantes (oxignio, luz e metais) (Abidi, 2000; Ruprez et al, 2001, Gl-stndag & Temelli, 2004).

Devido semelhana entre as propriedades fsicas (solubilidade, polaridade, massa molar) de carotenides e triglicerdeos, alm da baixa seletividade da maioria dos mtodos de separao fsica empregados atualmente para a extrao dos carotenides, bem como as alteraes estruturais irreversveis induzidas pelos mtodos qumicos, a busca por mtodos mais brandos e especficos para a extrao dos carotenides contidos em leos vegetais constitui um grande desafio (Gl-stndag & Temelli, 2004). Nesta dissertao, a abordagem utilizada emprega a tecnologia enzimtica como alternativa limpa para obteno de carotenides de leos vegetais. As enzimas so protenas que participam de vrias reaes bioqumicas, aceleram reaes termodinamicamente favorecidas, e apresentam caractersticas estereoespecficas. Normalmente os processos enzimticos tm ao rpida, ausncia de toxidez e no geram problemas ambientais, alm de ocorrerem em temperaturas e pHs brandos, atuando sobre um substrato especfico com uma baixa concentrao de preparado enzimtico (Godfrey & West, 1996; Uhlig, 1998). O objetivo desta dissertao consiste no desenvolvimento de um bioprocesso utilizando a hidrlise enzimtica do leo bruto e refinado de buriti atravs de lipases, visando a alterao de polaridade e solubilidade dos triglicerdeos com a gerao de cidos graxos e glicerol, facilitando assim a extrao e concentrao de -caroteno por diferentes mtodos com potencial de aplicao comercial.

CAPTULO 2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1) CAROTENIDES 2.1.1) Caractersticas Gerais
Carotenides so os pigmentos responsveis pelas cores vermelho, amarelo e laranja, largamente distribudos em frutas, flores, razes, algas, invertebrados, peixes, pssaros, bactrias, fungos e leveduras e tm como principais funes o auxlio na fotossntese e a fotoproteo (Isler,1971; Ikan,1991; Britton et al, 1995). Os carotenides incluem 2 classes de compostos: carotenos propriamente ditos, compostos por hidrocarbonetos poliinsaturados C40 (Figura 3), e xantofilas, seus derivados oxigenados (Figura 4).

Figura 3 - Principais carotenos

Dos carotenos acclicos, licopeno e -caroteno so os mais comuns. O licopeno o principal pigmento de muitos frutos carnosos avermelhados, como tomate (Lycopersicon esculentum), melancia (Citrullus lanatus), mamo (Carica papaya), goiaba (Psidium guajava) e toranja (Citrus paradisi), enquanto o -caroteno est presente em pequenas quantidades em grande nmero de plantas, sendo que apenas na carambola (Averrhoa carambola) e no maracuj (Passiflora alata) este adquire maior importncia, aparecendo como seu principal pigmento. Outros carotenos como o fitoflueno e fitoeno so incolores e provavelmente mais largamente distribudos do que o reportado (Isler,1971; Britton et al,1995). Dentre os carotenos cclicos, o que mais se destaca o -caroteno, presente em cenoura (Daucus carota), manga (Mangifera indica), acerola (Malpighia glabra), damasco (Prunus armeniaca), nspera (Mespilus germanica) e frutos da famlia Palmae/Arecaceae. O -caroteno e o -caroteno esto geralmente em menor concentrao que o -caroteno, sendo o primeiro encontrado em cenouras e abboras (Cucurbita sp.), e o ltimo em rosa silvestre (Rosa canina) e pitanga (Eugenia uniflora). O -caroteno menos freqente, mas encontrado em tomate e pupunha (Bactris gasipaes) (Goodwin, 1976; Rodriguez-Amaya, 2001).

Figura 4 - Principais xantofilas

Dentre as xantofilas hidroxiladas, as principais so derivadas do - e -caroteno, como a -criptoxantina, lutena e zeaxantina. -criptoxantina o principal pigmento de frutos alaranjados, como pssego (Prunus persica), caqui (Diospyros kaki) e caj-mirim (Spondias mombin). Lutena o carotenide predominante em folhas, vegetais verdes e flores amarelas, e a zeaxantina o principal no milho (Zea mays) e no piqui (Cariocar villosum). As xantofilas epoxidadas como a violaxantina e a anteraxantina so os produtos da degradao de outros carotenides, como a zeaxantina, e subestimadas nos alimentos, como a manga, por exemplo (Goodwin, 1976; Rodriguez-Amaya, 2001). H algumas xantofilas incomuns como a capsantina, presente em pimenta malagueta (Capsicum frutescens), bixina, principal pigmento do urucum (Bixa orellana) e a crocetina, que predominante no aafro (Crocus sativus) (Isler,1971; Britton et al,1995). Embora folhas verdes contenham hidroxicarotenides no esterificados, quando o fruto amadurece, estes so esterificados com cidos graxos. Mas em alguns frutos como kiwi (Actinidia chinensis), que permanecem verdes mesmo quando maduros, estes compostos no so esterificados (Rodriguez-Amaya, 2001; Bouvier et al, 2005).

2.1.2) Biossntese
Os precursores dos metablitos especiais presentes nos leos vegetais, e o prprio leo so intermedirios no metabolismo primrio, que se inicia a partir da fotossntese, onde a glicose gerada para depois ser consumida na respirao e produzir gua e CO2, sendo que esta ocorre em 3 etapas: gliclise, ciclo do cido ctrico e fosforilao oxidativa. De uma forma resumida, a Figura 5 mostra a formao destes metablitos visando principalmente nos insaponificveis (Berg et al, 2004).

Figura 5 - Biossntese resumida dos insaponificveis (Simes et al, 2003)

A biossntese dos carotenides segue o padro usual da sntese de terpenides, que segue a via do cido mevalnico, onde este descarboxilado gerando o pirofosfato de isopentenila (IPP) principal bloco construtivo dos isoprenides. O esquema geral da biossntese de terpenides pode ser visto na Figura 6 (Bouvier et al, 2005).

FPP IPP

IPP

GGPP

Figura 6 - Esquema geral de biossntese de terpenides (Dewick, 2002)

A passagem do intermedirio fitoeno para o licopeno (Figura 7) ocorre atravs de enzimas que promovem a desidrogenao, envolvendo a remoo de pares de tomos de hidrognio de forma alternada (Dey & Harborne, 1997; Fraser & Bramley, 2004; Bouvier et al, 2005). Aps a formao do licopeno, ocorre a ciclizao atravs da licopeno ciclase, podendo gerar -caroteno (anel ) ou -caroteno (anel ), que so os precursores do -caroteno e do caroteno, respectivamente. Estes carotenos formados podem ser modificados para gerao de outros carotenides como lutena e zeaxantina (Figura 8) e outras xantofilas, atravs de hidroxilases, epoxidases, cetolases e sintases.

PD

PD

ZD

CRTISO

ZD

Figura 7 - Biossntese de licopeno. PD: fitoeno desaturase; ZD, -caroteno desaturase; CRTISO, carotenide isomerase (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005).

LCE

LCB

LCB

LCB

CHB1, CHB2

CHB1, CHB2

CHE CHB1, CHB2

Figura 8 - Biossntese de carotenides a partir do licopeno. LCE, licopeno -ciclase; LCB, licopeno -ciclase; CHB1, carotenide -hidroxilase non-heme-di-ferro monooxigenase; CHB2, carotenide -hidroxilase ligada ao ncleo heme do citocromo P450; CHE, carotenide -hidroxilase ligada ao ncleo heme do citocromo P450 (Dey & Harborne, 1997; Bouvier et al, 2005).

2.1.3) Propriedades e modificaes

A presena de ligaes duplas conjugadas na estrutura dos carotenides contribui para sua pigmentao, absoro de radiao na faixa de UV-VIS e atividade antioxidante, mas tambm so a principal razo da sua instabilidade qumica, pois as ligaes duplas conjugadas so muito suscetveis oxidao e isomerizao geomtrica. Alguns fatores como calor, luz, cidos, refluxo em solvente orgnico, fuso de cristais e tratamento com iodo, podem promover a isomerizao cis-trans dos carotenides (Figura 9). A isomerizao de trans-carotenides, que a configurao usual dos carotenides na natureza, para a forma cis aumenta a solubilidade e diminui a intensidade da cor, o ponto de fuso e a atividade de pr-vitamina A (Goodwin, 1976; Britton et al, 1995; RodriguezAmaya, 2001; Schiebe & Carle, 2005).

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Figura 9 - Principais ismeros cis do -caroteno

A oxidao, o principal mecanismo de degradao dos carotenides, acelerada pela luz, calor, presena de cidos graxos insaturados, perxidos, metais como ferro, cobre e mangans, e exposio a solventes orgnicos e enzimas (lipoxigenases, fenoloxidases e peroxidases) (Goodwin, 1976; Britton et al, 1995; Rodriguez-Amaya, 2001). Os principais derivados da degradao de carotenides so os epoxicarotenides (Figura 10), apocarotenides (Figura 11) e compostos volteis, que apesar de terem sua atividade pr-vitammica A muito reduzida, ainda podem ser aproveitados como corantes alimentcios, no caso de alguns apocarotenides, ou como aromatizantes naturais, no caso dos compostos volteis (Rodriguez & Rodriguez-Amaya, 2007; Uenojo et al, 2007).

Figura 10 - Epoxicarotenides derivados do -caroteno

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Estes derivados so formados em vrios tipos de processamento de alimentos, como cozimento, fritura, pasteurizao, extruso e desidratao, com perdas em torno de 25-35% (Marty & Berset, 1990; Pinheiro-Santana et al, 1998; Rodriguez & Rodriguez-Amaya, 2007), e tambm na etapa de refino de leos vegetais, onde ocorrem processos de desacidificao, branqueamento e desodorizao (Ouyang et al, 1980).

Figura 11 - Apocarotenides derivados do -caroteno

2.1.4) Aes benficas sade

A mais importante funo nutricional dos carotenides como precursor da vitamina A (pr-vitamina A). O envolvimento do retinal (vitamina A) como cromforo de pigmentos visuais no olho central no processo da viso. Hipovitaminose A ainda um grande problema nutricional em reas subdesenvolvidas do mundo onde suas conseqncias, como xeroftalmia, cegueira e morte prematura, ainda so comuns, particularmente em crianas.

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A vitamina A tambm tem funes sistmicas importantes no crescimento e na eficincia reprodutiva, alm da manuteno dos tecidos epiteliais e preveno da sua queratinizao. Por isso, os retinides tm sido utilizados para tratamento dermatolgicos, como a acne (Britton et al, 1995; Rucker et al, 2001; Niizu, 2003). Qualquer carotenide cclico que possua um anel tem atividade pr-vitamnica A, principalmente o -caroteno, podendo ser clivado por uma -caroteno-15,15-dioxigenase para gerar retinal (Della Penna & Pogson, 2006). A propriedade antioxidante dos carotenides independente da atividade de prvitamina A, e est associada com a capacidade de se ligar a oxignio singlete atravs do sistema de duplas ligaes conjugadas, e a mxima proteo dada pelos carotenides com mais de 9 duplas ligaes, razo pela qual o licopeno tem demonstrado maior eficincia antioxidante que o -caroteno. Em altas presses parciais de oxignio ou altas concentraes de carotenides, entretanto, estes podem apresentar atividade pr-oxidante (Packer et al, 1999; Rodriguez-Amaya, 2001; Niizu, 2003; Palozza et al, 2003). Devido sua capacidade antioxidante, o -caroteno utilizado como protetor solar oral para prevenir o fotoenvelhecimento da pele e as queimaduras de sol, devendo ser ingerido por vrias semanas para aumentar o seu teor no plasma e na pele (Packer et al, 1999). Os carotenides, principalmente o licopeno, vm sendo utilizados na proteo de doenas cardiovasculares e degenerativas, cncer de prstata, estmago e pulmo, agindo em possveis mecanismos de modulao do metabolismo de carcingenos, inibio da proliferao celular, aumento da diferenciao de clulas atravs dos retinides, estimulao da comunicao intercelular e aumento da resposta imunolgica (Niizu, 2003; Fraser & Bramley, 2004). A zeaxantina e a lutena tm uma maior ao na preveno da degenerao macular relacionadas a idade (Packer et al, 1999; Rodriguez-Amaya, 2001; Fraser & Bramley, 2004). 13

2.1.5) -Caroteno
O caroteno foi isolado pela primeira vez por Wackenroder em 1831 na forma de cristais de cor vermelho-rubi extrado a partir da cenoura. Mas somente em 1907, Willstder identificou a frmula molecular correta para o caroteno, C40H56, apesar de ainda ser uma mistura de -caroteno e -caroteno. Em 1930, Karrer e Kuhn, obtiveram a formulao correta do licopeno, -caroteno, -caroteno, zeaxanatina e lutena (Isler,1971; Britton et al,1995). 2.1.5.1) Formas de comercializao O -caroteno utilizado como corante alimentcio, variando de amarelo a laranja, em concentraes entre 2 a 50 ppm, ou como complemento nutricional, por ser a principal fonte de pr-vitamina A, j que 100% pode ser convertido a vitamina A (Britton et al,1995). Os carotenides sintticos so purificados por cristalizao com o objetivo de formar grandes cristais, os quais podem ser facilmente separados por filtrao e lavados dos ismeros cis e dos subprodutos remanescentes na soluo. Para serem comercializados, os carotenides precisam ser formulados para aplicao em matrizes hidroflicas (sucos e bebidas) ou lipoflicas (manteigas, margarinas e queijos), e para isso preciso tambm diminuir o tamanho dos cristais.

2.1.5.1.1) Matrizes lipoflicas

A solubilidade dos carotenides comercialmente disponveis em leos vegetais em torno de 1000 ppm, mas concentraes entre 10 e 100 ppm j so suficientes para colorao intensa. Para assegurar uma rpida dissoluo, os cristais so cominudos em moinhos de bolas, alcanando dimetros de 1 a 4 m. Disperses pastosas preparadas dessa maneira tm concentraes de carotenides entre 20 e 30%, e so predominantemente utilizadas para colorir e estabilizar gorduras vegetais, por exemplo, na produo de margarina (Britton et al,1996). 14

2.1.5.1.2) Matrizes hidroflicas

Os carotenides produzidos industrialmente so praticamente insolveis em meio aquoso, sendo ento um desafio desenvolver preparaes dispersveis em gua para o setor de alimentos e raes. Foi demonstrado que a intensidade de colorao suficiente e a biodisponibilidade mxima podem ser conseguidas pela reduo do dimetro de partcula a menos que 0,5 m. Os mtodos de formulao individual diferem nas medidas utilizadas para micronizao de cristais de carotenides sintticos. Em um processo desenvolvido pela Danochemo, os cristais so cominudos em meio aquoso por meios mecnicos, gerando partculas com dimetro mdio de 0,4 m, as quais so misturadas a um hidrocolide (gelatina), que adsorvido na superfcie dos cristais, tornando-os hidroflicos, podendo formar disperses estveis e prevenir a reagregao. A biodisponibilidade aumentada pelo rpido aquecimento (20 s) da suspenso a 180C, o que torna o composto ativo amorfo. A matriz aquosa pode conter outros aditivos, como antioxidantes (-tocoferol e cido ascrbico), emulsificantes (lecitina e palmitato de ascorbila), acar e amido para melhorar as propriedades mecnicas do produto final (Britton et al,1996).

Figura 12 - Formulao de -caroteno dispersvel em gua (http://www.corporate.basf.com/, 2007)

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No processo de soluo/precipitao desenvolvido pela Roche, uma disperso de carotenide preparada para matriz lipoflica tratada muito rapidamente (0,5 s) com vapor superaquecido, onde em seguida a mistura leo-gua e carotenide estabilizada pela emulsificao em uma matriz aquosa, e ento os carotenides precipitam da sua soluo inicial na fase oleosa em uma forma amorfa finamente dividida. A BASF tambm produz preparaes de carotenides dispersveis em gua pelo processo soluo/precipitao (Figura 12). Os carotenides sintticos so transformados em uma disperso molecular em solventes hidroflicos, de baixo ponto de ebulio e incuos, como lcool ou acetona e aquecidos a 170C, por menos de 0,5 s, evitando assim a isomerizao. Em outro tanque, essa mistura adicionada a uma matriz aquosa, e os ncleos cristalinos so formados espontaneamente. O crescimento do ncleo pode ser controlado pela escolha apropriada do colide protetor e pode ser restrita a 0,1 m. O solvente orgnico ento removido em um evaporador em filme (Paust, 1994; Britton et al,1996). Ao final, estas preparaes comerciais de carotenides dispersveis em gua so desidratadas atravs de spray-drying e vendidas na forma de p (Britton et al,1996).

2.1.5.1.3) Alimentos biofortificados

Um outro mtodo de se obter um alimento com -caroteno adicionar suco de cenoura, ou promover alteraes genticas na planta de forma a torn-la apta para a biossntese deste carotenide, como o caso do arroz dourado e tomate. (b)

Figura 13 Alimentos biofortificados. A) Tomate laranja e normal; B) Arroz dourado e branco

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O arroz dourado gerado pela insero de genes da bactria Erwinia e de narciso (Narcissus pseudonarcissus) e contm cerca de 2 mg de -caroteno por g de arroz. No tomate, as modificaes genticas geram uma diminuio no teor de carotenides totais no fruto de 10 mg para 5 mg por 100 g de fruto, mas em compensao o licopeno, que correspondia 90% dos carotenides totais, agora foi substitudo pelo -caroteno que teve sua biossntese aumentada em 5 vezes, e representa mais de 50% dos carotenides, conforme visto na Figura 13. Estes alimentos biofortificados podem contribuir bastante para deficincia de vitamina A no mundo, j que so amplamente consumidos (Giuliano et al, 2000; Fraser & Bramley, 2004; Al-Babili & Beyer, 2005). 2.1.5.2) Mercado Estima-se que o mercado mundial de carotenides, que em 2005 gerou cerca de 887 milhes de dlares, ir crescer 3% ao ano quebrando a barreira de 1 bilho de dlares em 2009, sendo o -caroteno responsvel por quase 30% deste mercado. No mercado brasileiro, o produto em p com 20% de -caroteno oferecido por R$ 215 a 240 por quilo, isso quer dizer, de R$ 1075 a 1200 por quilo de -caroteno puro. O mercado internacional dominado por empresas como Roche, BASF, Merck, Rhne-Poulenc e DSM (Fraser & Bramley, 2004; http://www.sbaf.org.br/, 2006; http://aliceweb.desenvolvimento.gov.br/, 2007). 2.1.5.3) Fontes Comerciais

2.1.5.3.1) -caroteno Sinttico

O -caroteno sinttico tm sido produzido desde 1954 pela Roche e desde de 1960 pela BASF. A sua importncia econmica aumentou nas dcadas seguintes, sendo particularmente acelerado a partir de 1990. Cada empresa utiliza um mtodo diferente para sua produo, mas ambas utilizam o mesmo precursor, que a -ionona.

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Este intermedirio era originalmente obtido de fontes naturais como o leo de capimlimo (Cymbopogon citratus) ou a terebentina do pinho (Pinus caribea), mas atualmente a ionona obtida a partir da acetona, ou atravs do butadieno, como mostrado na Figura 14 (Isler,1971; Britton et al, 1996).

Figura 14 - Vias sintticas para obteno de -ionona

A primeira sntese industrial de -caroteno pela Roche seguiu os princpios C19 + C2 + C19 de sntese. Como no processo de obteno de vitamina A, a cadeia polinica foi produzida por acoplamento de Grignard, eliminao e hidrogenao parcial. Alm disso, uma nova e eficaz sntese para aldedos polinicos tem sido agora desenvolvida na forma da condensao enol-ter e empregada industrialmente pela primeira vez na produo de C19 aldedo (8[2,6,6-trimetil-ciclohex-1-enil]-2,6-dimetil-octa-2,4,6-trien-1-al). A condensao enol-ter permite um alongamento gradual especfico de aldedos conjugados por dois tomos de carbono a cada vez, como visto na Figura 15 (Isler,1971; Britton et al,1996).

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Figura 15 - Sntese de -caroteno por condensao enol-ter

J a BASF utiliza a condensao de Wittig para produzir -caroteno, onde sais de fosfnio, anteriormente derivatizados com a trifenilfosfina (PPh3), reagem com um aldedo, formando uma dupla ligao e aumentando a cadeia polinica. Na Figura 16, a reao ocorre entre o retinal e o sal de retiniltrifenilfosfnio. O processo de sntese de -caroteno da Roche apresenta um rendimento de 60%, enquanto que o empregado pela BASF de 85%, sendo que este ltimo necessita da reciclagem do xido de trifenilfosfina, devido sua baixa biodegrabilidade. Este processo para recuperao da trifenilfosfina contm trs fases: purificao por destilao, clorao com fosgnio e desalogenao com alumnio (Isler,1971; Britton et al,1996).

Figura 16 Sntese de -caroteno por condensao de Wittig

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2.1.5.3.2) -caroteno Natural

Embora tanto o -caroteno sinttico quanto o natural possuam a mesma estrutura molecular polinica, o -caroteno natural contm vrios outros carotenides em concentraes menores, que apresentam benefcios sade adicionais podendo ser consumidos em maiores quantidades. O -caroteno natural pode ser produzido por processos biotecnolgicos utilizando fungos filamentosos, leveduras, bactrias ou microalgas, ou ainda por extrao de fontes vegetais. Apenas 2% do total de -caroteno produzido natural, sendo principalmente utilizado como suplemento nutricional (Dufoss et al, 2005;

http://www.cotecportugal.pt/, 2006).
A Processos Biotecnolgicos

A.1 Microalgas O gnero Dunaliella pertence ao grupo das microalgas unicelulares halotolerantes que acumulam uma grande quantidade de -caroteno em seu cloroplasto devido a alta intensidade luminosa, obtendo em mdia, sob condies ideais em tanques abertos (Figura 17), 400 mg caroteno por rea (m) de cultivo ao dia, i. e. 10 a 14 % em peso seco no caso de Dunaliella salina e D. bardawil (Dufoss et al, 2005; Gobbi, 2006; Spolaore et al, 2006). GarcaGonzlez et al (2005) tambm testaram a produo de -caroteno por cultivo em fotobiorreatores tubulares, gerando 100 mg/m ao dia.

. Figura 17 Dunaliella salina e seu cultivo em tanques abertos

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Para se promover a carotenognese em D. salina, alm dos nutrientes essenciais, uma alta concentrao de sal (1,5 M NaCl) e estresse luminoso, com intervalos de fotoperodo de 12 h por 15 dias so condies requeridas (Dufoss et al, 2005; Gobbi, 2006; Spolaore et al, 2006). Outros mtodos de estresse podem ser utilizados, tais como a supresso de fontes de nitrognio ou adio de solventes orgnicos com log P superiores a 5,6, como o decano e hexadecano ou misturas destes solventes apolares biocompatveis com pequenas concentraes de outros solventes mais polares, como diclorometano e metil etil cetona, o que possibilita o uso de biorreatores bifsicos, com o objetivo de produzir e extrair -caroteno simultaneamente (Hejazi & Wijffels, 2003; Lon et al, 2003; Mojaat et al, 2007) O -caroteno produzido, neste caso, uma mistura de ismeros cis e trans, onde h 10% de 15-cis--caroteno, 41% de 9-cis--caroteno, 42% de trans--caroteno e 6% de outros ismeros, e responde por cerca de 80% dos carotenides totais produzidos sendo a lutena responsvel por 15%. As principais empresas produtoras de -caroteno a partir de cultivo de microalgas so as companhias Cognis Nutrition and Health (Austrlia) e Nature Beta Technologies (Israel) (Dufoss et al, 2005; Garca-Gonzlez et al, 2005; Gobbi, 2006). A.2 Fungos Filamentosos Os principais fungos filamentosos produtores de -caroteno so Blakeslea trispora e Phycomyces blakesleeanus (Figura 18), que tambm geram ubiquinona, ergosterol, cidos orgnicos e outros carotenides como licopeno, -caroteno e fitoeno. Como nas microalgas, a carotenognese induzida na forma de alguns estmulos como luz azul, interao sexual, adio de retinol e ftalato de dimetila em Phycomyces sp., e ausncia de luz, no caso da Blakeslea sp..

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Figura 18 Phycomyces blakesleeanus e um zigosporo de Blakeslea trispora

Algumas linhagens modificadas geneticamente de Phycomyces sp. podem alcanar at 30 mg de -caroteno por grama de miclio seco em 4 dias de cultivo, mais de 100 vezes a quantidade da linhagem selvagem, correspondendo entre 90 a 95% do total de carotenides; j Blakeslea sp. pode gerar de 13 a 19 mg de -caroteno em grama de miclio seco, representando cerca de 73 a 85% do total de carotenides. A DSM produz na Europa, desde 2000, -caroteno a partir de cultivo de Blakeslea trispora para uso em alimentos (Dufoss et al, 2005; Mehta et al, 1997; Kuzina e Cerd-Olmedo, 2007; Choudhari & Singhal, 2008). A.3 Leveduras No gnero Rhodotorula, h algumas espcies produtoras de carotenides como a R. glutinis, R. minuta, R. mucilaginosa, R. graminis, e tambm em outro gnero como Sporobolomyces roseus e S. patagonicus (Figura 19). Alm do -caroteno, estas leveduras geram toruleno, torularodina e -caroteno, alcanando at 330 mg carotenides/g clula seca em 6-7 dias de fermentao (Tinoi et al, 2005; Buzzini et al, 2007; Maldonade et al, 2008).

Figura 19 - Rhodotorula glutinis e Sporobolomyces roseus

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Dependendo das condies de cultivo, como fontes de carbono e nitrognio, leveduras como Rhodotorula glutinis podem gerar um perfil de carotenides bastante variado, onde o caroteno pode ser o principal produto (43%) e o toruleno, o secundrio (30%), ou o inverso, com 28% de toruleno e 25% de -caroteno. Casos em que concentrado de uva foi utilizado como a fonte de carbono do meio, a torularodina foi o principal carotenide obtido (60 79%). Sporobolomyces roseus apresenta um perfil de carotenides composto por 50% de caroteno e 30% de toruleno, mas com rendimento bem menor que R. glutinis, sendo cerca de 72 g/g clula seca (Maldonade et al, 2008). A.4 Bactrias Entre as bactrias, h algumas espcies carotenognicas, mas para produzir -caroteno como seu principal carotenide, estas precisam ter seu metabolismo central inibido atravs de sais inorgnicos e uria, como no caso de Flavobacterium multivorum, ou ento ser modificadas geneticamente, como no caso de Halomonas elongata, Escherichia coli e Sphingomonas paucimobilis (Figura 20).

Figura 20 - Halomonas elongata e Escherichia coli

A produo por F. multivorum foi de 2,9 mg/g de carotenides totais, sendo 82% de caroteno, 7% -criptoxantina e 11% zeaxantina em 2 dias de fermentao (Bhosale & Bernstein, 2004).

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A bactria haloflica H. elongata modificada com genes de Pantoea agglomerans e Haematococcus pluvialis produz 0,56 mg/g clula seca, sendo 98% de -caroteno, com 2% NaCl no meio (Rodrguez-Saz et al, 2007). E. coli recombinante com genes de Erwinia uredovora e E. herbicola produz em um biorreator de 5 L em 2 dias de fermentao cerca de 270 mg/L de -caroteno, representando 60% dos carotenides totais (Kim et al, 2006). A bactria do solo S. paucimobilis tratada com metanosulfonato de etila gera 3,27 mg caotenides /g clula seca, sendo 70,7% -caroteno (Silva et al, 2004).
B Extrao de Fontes Vegetais

O -caroteno de origem vegetal geralmente obtido por extrao com solventes de cenoura e dend, com contedos menores de -caroteno, -caroteno e algumas xantofilas. Mas outras fontes vegetais tm sido encontradas com grande potencial para produo de caroteno, como visto na Tabela 2 (http://www.fao.org/, 2008).
Tabela 2 Potenciais fontes vegetais produtoras de -caroteno

Fontes Vegetais Cenoura (Daucus carota) Dend (leo) (Elaeis guineensis) Batata doce (Ipomoea batatas) Buriti (fruto) (Mauritia vinifera) Buriti (leo) Acerola (Malpighia glabra) Tucum (Astrocaryum aculeatum) Marimari (Geoffrola striata) Physalis (Physalis angulata) Acuri (Scheelea phalerata) Pajur (Couepia bracteosa) Piqui (Caryocar villosum) Umari (Poraqueiba sericea) Bocaiva (Acrocomia mokayaba)

Carotenides (g/g) 85 -174 470-700 160-226 513,9 1150-3380 8,8 - 18,8 62,6 - 96,6 38 80,9 22,7 17,8 21 102,9 59,6

-caroteno (%) 49 - 65 54,4 92-95 72,5 69,8-90,6 75,6-89,3 61,1 76,9 76,2 92,1 85,4 78,9 92,3

Referncias
Rodriguez-Amaya, 2001 Rodriguez-Amaya, 2001 Rodriguez-Amaya, 1996 De Rosso & Mercadante, 2007 Rodriguez-Amaya, 2001 De Rosso & Mercadante, 2005 Marinho & Castro, 2003; De Rosso & Mercadante, 2007 De Rosso & Mercadante, 2007 De Rosso & Mercadante, 2007 Hiane et al, 2003 Marinho & Castro, 2003 Marinho & Castro, 2003 Marinho & Castro, 2003 Rodriguez-Amaya, 1996

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2.2) BURITI 2.2.1) Caractersticas Gerais

Na Tabela 2, verifica-se que o buriti uma das fontes vegetais de maior potencial para extrao de -caroteno, com seu leo podendo alcanar at 3380 g de carotenides totais por g de leo, sendo mais de 70% de -caroteno. O buriti uma planta da famlia Arecaceae, antigamente conhecida como Palmae, sendo nativa da Amrica Latina, principalmente Brasil, Peru, Bolvia, Equador, Colmbia, Venezuela e Guiana. H duas espcies de buriti, sendo a Mauritia flexuosa nativa do Peru, e conhecida como aguaje, e a Mauritia vinifera nativa do Brasil, conhecida tambm como miriti. Podem chegar entre 35 a 40 m de altura, com ramos de 10 a 20 folhas, cada uma com 5 a 6 m de comprimento, gerando 3 a 4 cachos com 800 a 1000 frutos cada, sendo estes variando entre 5 a 7 cm de dimetro, e 40 a 85 g cada (Figura 21). A polpa destes frutos de buriti consumida pela populao local em doces e sucos (Silveira, 2004; Santos, 2005; http://www.fao.org/, 2008).

Figura 21 Palmeiras e frutos do buriti

Em 1996, a produo brasileira chegou a quase 5000 toneladas de frutos, sendo o Piau responsvel por cerca de 70% deste valor, alcanando prximo de 5 toneladas de leo por hectare (http://www.sidra.ibge.gov.br/, 2008). 25

A composio centesimal da polpa do fruto de buriti descrita na Tabela 3, em termos percentuais, comparando vrias referncias (g/100 g de polpa). tambm verificado um teor significativo de vitamina C (cido ascrbico), entre 19,8 e 26 mg, e de clcio, entre 113 e 156 mg por 100 g de polpa de buriti (Tavares et al, 2003; Santos, 2005), alm do altssimo teor de vitamina A derivado das concentraes presentes de -caroteno.
Tabela 3 Composio centesimal da polpa do fruto de buriti

Componentes gua Protenas Lipdios Carboidratos Cinzas

Mariath et al (1989) 64,2 1,8 8,1 25,2 0,7

Tavares et Santos al (2003) (2005) 67,2 1,5 3,8 26,1 1,4 49,77 2,82 19,8 26,76 0,85

Manhes (2007) 62,93 2,1 13,85 20,18 0,94

2.2.2) leo de Buriti

O leo de buriti apresenta um alto teor de cidos graxos insaturados, muito semelhante ao azeite de oliva (Olea europaea) e leo de abacate (Persea americana) (Tabela 4) (Silva, 2002). Alm disso, contm uma alta concentrao de carotenides, principalmente caroteno, superando o azeite de dend (Tabela 5), conferindo uma alta estabilidade oxidativa ao leo tambm devido aos teores de tocoferis (700 ppm) e fitoesteris (800 1000 ppm) presentes (Godoy & Rodriguez-Amaya, 1995; Rodriguez-Amaya, 2001; Silveira, 2004; De Rosso & Mercadante, 2007). Outro uso ao leo de buriti foi dado por Dures et al (2006) na sntese de compsitos de poliestireno e de polimetacrilato para produo de plsticos mais biodegradveis.

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Tabela 4 Perfil de cidos graxos de frutos oleaginosos

% 12:0 14:0 16:0 18:0 20:0 16:1 18:1 18:2 18:3

cidos graxos lurico mirstico palmtico esterico araqudico palmitolico olico linolico linolnico Referncias

Buriti ---------0,1 17,3 - 19,3 1,86 2,0 ------------------73,3 78,7 2,4 3,9 2,17 2,2
Santos, 2005

Tucum ------------------13,86 9,80 0,82 0,17 46,81 26,13 0,93

Bora et al, 2001

Oliva ---------0,67 10 - 11,7 2,15 0,48 1,45 73,8 -78 7 - 9,8 ---------Gunstone & Padley, 1997

Abacate ---------0,02 - 0,13 0,5 1,0 ---------3,9 5,6 60 - 71 7,1 15,3 0,37 1,03
Danieli, 2006

Dend 0,1 1,0 0,9 1,5 4,2 5,1 0,2 0,7 0,1 0,3 37,3 40,8 9,1 11 0 0,6
Choo, 1994

19,8 22,7 41,8 46,8

Tabela 5 Perfil de carotenides de alguns leo vegetais

% -Caroteno -Caroteno -Caroteno -Caroteno -Caroteno -zeacaroteno Outros carotenos xantofilas

Tucum 75,6-89,3 2,68 3,29 0,22 0,83 3,27 1,63 8,58

Dend 54,4 56,7 25,2 37,6 1,16 - 3,3 0,7 2,3 0,2 2,0 0,6 1,0 3,15 12,6 0 - 0,4

Buriti 72,3 75,2 3,9 - 15,9 5,3 - 7,2 0,9 2,5 0 0,7 1,1 2,41 0,95 1,7 13,6

2.2.3) Outras Tecnologias

Vrias outras tecnologias esto sendo estudadas, alm da extrao por solventes, para recuperao de -caroteno de matrizes, como leo de dend e do buriti. Frana & Meirelles (1997) estudaram a extrao com fluido supercrtico dos carotenides de leo de dend retido na torta de prensagem, enquanto Frana et al (1999) reportaram a utilizao de CO2 supercrtico na extrao de carotenides do fruto de buriti. Porm, nestes trabalhos apesar de extrarem at 10000 ppm de carotenides, tambm so obtidos triglicerdeos e cidos graxos. 27

Algumas modificaes foram propostas por Chuang & Brunner (2006) neste processo de extrao com fluido supercrtico para contornar sua baixa seletividade. Os autores utilizaram a transesterificao do leo de palma e em seguida a extrao em trs etapas obtendo um produto 200 vezes mais concentrado em carotenides, praticamente ausente de steres, cidos graxos e triglicerdeos. Todavia, na temperatura utilizada (60C) e dada a presena de O2 no CO2 supercrtico, condies que auxiliam a degradao dos carotenides, necessria a adio de antioxidantes (BHT) ao processo (Cocero et al, 2000). A transesterificao tambm utilizada como pr-etapa no processo de destilao molecular, onde os carotenides so o resduo do processo, alcanando at 24000 ppm de carotenides, com perdas de at 14%, a 210C em destilador centrfugo com tempo de residncia em torno de 50s (Batistella & Maciel, 1998), ou ento em um destilador em filme descendente em duas etapas, obtendo 80000 ppm de carotenides, com perdas de 25%, mas sem alterao significativa no seu perfil (Ooi et al, 1994). O processo de separao por membranas, que inicialmente era realizado para degomagem de leos vegetais, foi testado tambm para recuperao de carotenides utilizando-se membranas densas polimricas, mas na realidade este processo bastante efetivo na separao das xantofilas e clorofila, alm dos fosfolpideos, com reteno entre 80 e 100%, produzindo um leo rico em carotenos (Subramanian et al, 2001; Arora et al, 2006). Este processo, apesar de positivo na concentrao unicamente de carotenos, apresenta a necessidade de uma etapa adicional de hidrlise ou transesterificao. A hidrlise enzimtica tambm foi testada como pr-tratamento para facilitar a recuperao de carotenide podendo substituir com xito a hidrlise alcalina, sem perdas por degradao e isomerizao dos mesmos.

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Lietz & Henry (1997) testaram a hidrlise do leo de palma utilizando a lipase de Candida rugosa em uma concentrao de 10% p/v leo solubilizado em tampo fosfato 0,08M, mantendo a relao de leo e soluo aquosa em 1/175, e agitao em atmosfera de N2, a 35C, durante 4 horas. Os autores obtiveram um rendimento de 96% em cidos graxos, mantendo inalterada a concentrao de carotenides. Resultado similar foi alcanado por Fernandez et al (2000), que apenas modificaram a relao de leo e soluo aquosa para 1/350, mostrando que tambm nessas condies a quantidade de carotenides se manteve praticamente constante e igual a 330 ppm, enquanto que a saponficao alcalina promoveu a reduo em 15% no teor de carotenides. Segundo os autores, a reduo era ainda maior quando o sabo formado era removido por filtrao. You et al (2002) utilizaram tambm leo de palma e lipase de Candida rugosa, mas em condies diferentes. Neste trabalho, a quantidade de enzima empregada foi de 1% p/v, substituindo o tampo fosfato por gua, alterando a relao leo/gua para 1/1, e aumentando a temperatura para 50C e o tempo reacional para 24 h. Os autores obtiveram um rendimento de 94% em cidos graxos e uma reduo no teor de carotenides da ordem de 15%, provavelmente devido temperatura empregada.

2.3) LIPASES
As lipases so enzimas classificadas como hidrolases (glicerol ster hidrolases, E.C. 3.1.1.3) e atuam sobre a ligao ster de vrios compostos, tendo os acilgliceris como os melhores substratos, podendo catalisar reaes de hidrlise, sntese, transesterificao e interesterificao (Figura 22). As lipases so distintas de outras esterases, pois atuam de forma nica em substratos insolveis em gua, atuando na interface leo-gua de solues emulsionadas. Alm disso, caractersticas como estabilidade na presena de solventes orgnicos, ausncia da necessidade de cofatores e alta enantiosseletividade, permitem que as lipases tenham grande interesse tecnolgico (Sharma et al, 2001; Castro et al, 2004). 29

Figura 22 Algumas reaes catalisadas por lipases

2.3.1) Fontes e Propriedades

As lipases podem ser obtidas a partir de vrias fontes animais, vegetais e microbianas. Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molecular variando entre 20 a 75 kDa, atividade em pH na faixa entre 4 a 9 e em temperaturas variando desde a ambiente at 70 C. Lipases so usualmente estveis em solues aquosas neutras temperatura ambiente apresentando, em sua maioria, uma atividade tima na faixa de temperatura entre 30 e 40 C. Contudo, sua termoestabilidade varia consideravelmente em funo da origem, sendo as lipases microbianas as que possuem maior estabilidade trmica (Castro et al, 2004). 30

A maioria das preparaes lipsicas comerciais so compostas pela mistura de vrias isoenzimas em diferentes propores, como no caso daquelas obtidas a partir de culturas Candida rugosa, C. antarctica, Rhizopus niveus, Chromobacterium viscosum, entre outras. Cada isoforma tem propriedades diferentes, tais como massa molar, especificidade, estereosseletividade, presena de glicosilaes e preferncia por substratos (Sharma et al, 2001; Saxena et al, 2003; Mara et al, 2006). As principais fontes de lipases e suas propriedades esto descritas na Tabela 6.
Tabela 6 Faixas timas de atuao de algumas lipases

Fontes Candida rugosa Candida antarctica A Thermomyces lanuginosus Aspergillus niger Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Geotrichum candidum Streptomyces rimosus Yarrowia lipolytica Rhizopus niveus Rhizomucor miehei Pncreas suno Mamona (Ricinus communis)

pH 5-8 6 - 10 69 68 5,5 7,5 8 10 6,5 - 8 8,5 - 10 4-7 5-7 6,5 7,5 6-9 4 - 4,5

T (C) 35 - 50 35 - 70 30 - 50 40 - 55 35 - 45 30 - 40 32 - 42 45 - 60 30 - 45 30 - 45 30 - 40 40 - 55 30 - 35

Referncia Lpez et al, 2004 Pfeffer et al, 2006 Fernandes et al, 2004 Shu et al, 2007 Ogino et al, 2000 Lesuisse et al, 1993 Burkert et al, 2004; Maldonado, 2006 Abrimic et al, 1999 Destain et al, 1997; Aloulou et al, 2007; Brgida et al, 2007 Uhlig, 1998 Abbas et al, 2002 Godfrey & West, 1996 Eastmond, 2004; Cavalcante, 2006

2.3.2) Estrutura e Aspectos cinticos

As lipases mostram uma caracterstica padro conhecida como o entrelaado de / hidrolase. O stio ativo da lipase formado por uma trade cataltica constituda pelos aminocidos: serina, cido asprtico (ou glutmico) e histidina; o resduo nucleoflico serina localizado no C-terminal da fita 5 de um pentapeptdeo GXSXG altamente conservado, formando uma caracterstica principal em torno de , designada como a cavidade nucleoflica. 31

Como visto na Figura 23, o stio composto de uma folha central consistindo de 8 diferentes fitas (1-8) conectadas com seis -hlices (A-F) (Jaeger et al, 1999; Martins, 2001; Castro et al, 2004).

Figura 23 Esquema geral do stio ativo de uma lipase

A hidrlise do substrato inicia-se com o ataque nucleoflico pelo oxignio da serina no tomo de carbono carbonlico na ligao ster, levando formao de um intermedirio tetradrico estabilizado pelas ligaes do hidrognio a tomos de nitrognio de resduos da cadeia principal pertencente cavidade de oxinion. Um lcool liberado aps a formao do complexo acil-lipase, o qual finalmente hidrolisado com a liberao dos cidos graxos e regenerao da enzima, conforme demonstrado na Figura 24 (Jaeger et al, 1999, Martins, 2001; Amaral, 2007). As reaes lipolticas ocorrem na interface gua-lipdeo podendo, em alguns casos, impedir que as cinticas das reaes enzimticas sejam descritas pelo mecanismo de Michaelis-Menten, que s so vlidas se a reao ocorrer em fase homognea. O mecanismo cintico mais aceito para descrever a ao das lipases o Ping-Pong Bi Bi (Cunha, 2007).

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Figura 24 Mecanismo de reao em lipases

O fenmeno conhecido como ativao interfacial foi originado de estudos cinticos recentes de reaes lipolticas e relaciona o aumento da atividade da lipase com a presena de substratos insolveis, que formam emulso. Isso porque o stio ativo de algumas lipases coberto por uma superfcie entrelaada, denominada de tampa (ou borda). Quando h ligao do substrato na superfcie da enzima, esta tampa move-se, alterando a forma fechada da enzima para a forma aberta, com o centro ativo agora acessvel ao substrato e, ao mesmo tempo, expondo uma larga superfcie hidrofbica que facilita a ligao da lipase interface. Este modelo de ativao interfacial tem excees tais como as cutinases, que no apresentam tampa cobrindo o stio ativo (Meirelles, 1997; Jaeger et al, 1999; Gama, 2000; Castro et al, 2004).

2.3.3) Especificidade
Para aplicaes industriais, a especificidade da lipase um fator crucial. A enzima pode ser especfica com relao a estrutura cida ou alcolica do substrato, e tambm em relao aos seus ismeros. As lipases podem ser subdivididas em 3 grupos baseados em sua especificidade. 33

Lipases no especficas (como por exemplo as produzidas por Candida rugosa, Staphylococcus aureus, Chromobacterium viscosum, Thermomyces lanuginosus e

Pseudomonas sp.) quebram as molculas de acilglicerol randomicamente, produzindo cidos graxos livres, glicerol, monoacilgliceris e diacilgliceris como intermedirios. Neste caso, os produtos so similares queles produzidos por catlise qumica, porm com menor grau de termodegradao, pois a temperatura do meio reacional bem inferior s temperaturas empregadas nos processos qumicos (Uhlig, 1998; Castro et al, 2004; Amaral, 2007). Lipases 1,3 especficas (ex: de Aspergillus niger, Mucor javanicus, Rhizopus delemar, Rhizopus oryzae, Yarrowia lipolytica, Rhizopus niveus e Penicillium roquefortii) liberam cidos graxos das posies 1 e 3 e formam, por esta razo, produtos com composies diferentes daquelas obtidas pelas lipases no regiosseletivas, ou mesmo pelos catalisadores qumicos. Geralmente, a hidrlise de triglicerdeos em diglicerdeos bem mais rpida do que destes em monoglicerdeos (Meirelles, 1997; Uhlig, 1998; Castro et al, 2004). Lipases cido graxo especficas so lipases com ao especfica na hidrlise de steres, cujos cidos graxos apresentam cadeia longa insaturada com duplas ligaes, em cis no carbono 9. steres com cidos graxos insaturados, ou sem insaturao no carbono 9, so lentamente hidrolisados. Este tipo de especificidade no comum entre as lipases e o exemplo mais estudado at hoje a lipase produzida por Geotrichum candidum (Meirelles, 1997; Uhlig, 1998; Gama, 2000; Martins, 2001; Castro et al, 2004). Lipases tambm podem ser estereoespecficas, onde um dos ismeros de um racemato pode ser hidrolisado preferencialmente em detrimento de outro, ou ainda, a formao de um ismero pode ser catalisada seletivamente a partir de precursores pr-quirais, como os compostos meso-disteres ou meso-diis. Como exemplos podemos citar as lipases originadas de Burkholderia cepacia, Candida antarctica, Candida rugosa e Rhizopus delemar (Gama, 2000; Martins, 2001). 34

2.3.4) Hidrlise Enzimtica de leos e Gorduras

A hidrlise de leos e gorduras pode ocorrer a partir de processos convencionais (Tabela 7; Shreve & Brink Jr, 1997), onde se utilizam temperaturas e presses elevadas na presena de catalisadores inorgnicos, resultando em um alto consumo de energia e vrios subprodutos indesejveis (polimerizao e degradao de cidos graxos insaturados, produo de cetonas e hidrocarbonetos); ou ento a partir de processos enzimticos, onde as reaes so conduzidas a presses e temperaturas menores na presena de um biocatalisador (lipase), proporcionando menor consumo energtico, minimizao de degradao trmica e a possibilidade de recuperar e concentrar molculas de alto valor agregado, como os cidos poliinsaturados (PUFA) e os insaponificveis (Queiroz, 1996; Castro et al, 2004; Hasan et al, 2006; Gunstone et al, 2007).
Tabela 7 - Comparao entre processos convencionais de hidrlise de leos e gorduras

Processos Convencionais Temperatura (C) Presso (atm) Tempo (h) Rendimento (%) Catalisador

Autoclave (mdia presso) 149 177 5,1 10,2 5 - 10 85 -98 xidos de zinco, clcio ou magnsio

Twitchell 100 - 104 12 - 48 85 -98 cidos sulfnicos em H2SO4

Colgate Emery 252 40,8 47,6 2-3 97 - 99 -

A hidrlise enzimtica de leos e gorduras pode ser conduzida de vrias formas. Neste processo necessria a formao de uma interface lipdeo/gua e a absoro da lipase nesta interface, e para isso podem-se empregar enzimas livres ou imobilizadas em sistemas emulsionados, apenas agitados ou na presena de solventes orgnicos (Queiroz, 1996; Sharma et al, 2001; Castro et al, 2004; Brigida, 2006). Muitos trabalhos tm sido realizados utilizando sistemas emulsionados para hidrlise enzimtica. Yao et al (2005) mostraram que a conduo de sistemas microemulsionados de AOT (sulfosuccinato de bis(2-etill hexil) sdio) em isooctano para hidrlise de azeite de oliva 35

utilizando lipase de Candida rugosa em tampo fosfato 0,05M a 30C e 150 rpm, apresentou um rendimento em cidos graxos de apenas 30% em 72 h de reao, sendo o baixo rendimento atribudo a inativao que este sistema causa lipase. Padilha & Augusto-Ruiz (2007) apresentaram resultados um pouco melhores utilizando um sistema com acetato de polivinila e detergente aninico como emulsionantes para hidrlise de leo de pescado com uma soluo tamponada de lipase pancretica, a 38C por 1 h resultando em 44% de cidos graxos livres como resultado. Noor et al (2003) testaram a hidrlise de leo de palma utilizando a lipase SP398 em tampo emulsionado com goma arbica agitado a 1000 rpm, a 40C por 90 min, obtendo hidrlise total do leo. Outras alternativas para se produzir emulses com maior rea interfacial vm sendo testadas como a emulsificao por ultrassom, que aumenta em 67 vezes a rea de contato do que o sistema conduzido por agitao a 1000 rpm, apesar de manter a emulso estvel apenas por 2 h (Ramachandran et al, 2006). Mas a hidrlise enzimtica no necessita exclusivamente de emulsionantes. Esta pode ocorrer apenas com a agitao mecnica, apresentando taxas de hidrlise similares, conforme verificado por Wang et al (1988). Com o sistema apenas agitado, Gutierrez-Ayesta et al (2007) testaram vrias lipases com diferentes estruturas conformacionais em tampo para hidrlise de leo de girassol solubilizado em heptano, mantendo uma relao fase orgnica/fase aquosa de 1/1, e uma quantidade de lipase de 5% em peso em relao ao leo, durante 6 h, a 60C. As lipases de Thermomyces lanuginosus e Pseudomonas cepacia forneceram os melhores resultados, correspondendo respectivamente a 85,3 e 69% de cidos graxos livres. A lipase tipo B de Candida antarctica, tanto livre como imobilizada, por outro lado, forneceu as piores taxas de hidrlise, em torno de 5%.

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Vacek et al (2000) compararam dois procedimentos experimentais para hidrlise de leo de semente de groselha. No primeiro mtodo, sob agitao, foram misturados 100 mg de leo e 100 mL de gua, a 40C por 24 h. No outro, 300 mg de leo foram solubilizados em 2 mL de isooctano e misturados com 1 mL de tampo fosfato 0,1 M, a 30C, durante 4 h, sendo neste mtodo utilizadas apenas enzimas imobilizadas. No primeiro mtodo foi utilizada uma quantidade de enzima 4 vezes maior em relao ao segundo. Os melhores resultados foram obtidos no primeiro procedimento utilizando-se as lipases de Pseudomonas cepacia imobilizada e de Mucor miehei imobilizada em resina macroporosa de troca inica (Lipozyme RM IM) com rendimentos superiores a 80% de cido graxo livre. A hidrlise de leo de soja com diferentes tipos de lipase foi estudada por Park et al (1988), tendo como principal objetivo a comparao das atividades dessas enzimas em sistemas isolados e combinados. Aps 10 h de reao, foi verificado que os sistemas combinados de lipases microbianas, tais como Penicillium sp. e Rhizopus niveus ou Penicillium sp. e Rhizopus delemar, forneceram rendimentos mais elevados (98,0 e 99,5% de hidrlise) que os obtidos em sistemas contendo apenas uma lipase (7,2 e 44,4% de hidrlise). A relao leo/gua na mistura reacional foi avaliada por Rooney & Weatherley (2001) utilizando uma lipase de Candida rugosa para hidrlise de leo de girassol em diferentes quantidades. A reao conduzida com 0,8% peso de lipase em peso de mistura reacional, a temperatura ambiente (20 25C) durante 90 min e 500 rpm, variando a relao leo/gua em 3/1, 4/1, 8/1 e 16/1 obteve como resultados 88, 68, 64 e 45% de cidos graxos livres, respectivamente. Alguns aditivos podem ser usados para aumentar a hidrlise enzimtica, como ons Ca+2 que agem como ativadores de lipases; alumina e ciclodextrinas que retiram os cidos graxos da mistura reacional atravs de adsoro e de complexos de incluso, respectivamente; ou ento remoo do glicerol com recirculao da lipase (Queiroz, 1996). 37

Considerando que inmeras variveis podem estar envolvidas nesse tipo de processo, observa-se uma tendncia pelo emprego da metodologia de planejamento estatstico, que possibilita verificar a influncia das variveis e suas interaes no rendimento de um determinado processo com grande economia de tempo, material e recursos. Como exemplo, cita-se o trabalho desenvolvido por Oliveira et al (1999) no qual foi analisada a influncia da concentrao de lipase e do tempo de reao no desempenho da hidrlise da gordura de babau por lipase comercial empregando a metodologia de superfcie de resposta, sendo obtidos rendimentos entre 6,52 e 41,44% de cidos graxos livres. O ponto timo do processo (maior porcentagem de hidrlise no menor tempo possvel), entretanto, no foi alcanado, pois o planejamento fatorial proposto no cobriu a faixa correspondente a maiores tempos de reao.

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CAPTULO 3 MATERIAIS E MTODOS

3.1) MATERIAIS
Os leos de buriti bruto RF3800 e refinado RF3810 foram cedidos pela empresa Beraca Sabar. As lipases utilizadas foram Lipozyme TL IM proveniente de Thermomyces lanuginosus; Lipozyme CALB L e Novozym 435, que so produzidas por Candida antarctica, onde a primeira est na forma livre, e a ltima, na forma imobilizada. Todas foram doadas gentilmente pela Novozymes. A lipase de Yarrowia lipolytica IMUFRJ 50682 foi produzida em biorreator multifsico de acordo com a metodologia desenvolvida por Amaral (2007). O padro de -tocoferol foi cedido pelo Laboratrio de Bioqumica Nutricional e de Alimentos do Instituto de Qumica da UFRJ. O kit enzimtico para determinao de esteris totais foi doado pela Laborlab.

3.2) EQUIPAMENTOS
Os equipamentos utilizados no presente trabalho esto relacionados a seguir: Centrfuga Fanem modelo 204-NR; Transmissor de pH (pHmetro) Actron pH-2000; Espectrofotmetro Hach DR/4000 UV; Incubador com agitao e controle de temperatura (Shaker) Certomat BS-1; Cromatgrafo lquido de alta eficncia (HPLC), equipado com uma bomba binria Waters 1525, de um detector UV-Visvel Waters 2487, alm de injetor e aquecedor de coluna. Para processamento e anlise de dados foi utilizado o software Breeze v. 3.30. A coluna analtica empregada foi a YMC-Pack ODS-A (100 x 4,6 mm), com tamanho de poro de 120 39

 Cromatgrafo em fase gasosa HP 6890 acoplado a um detector de massas HP 5972 com ionizao por impacto de eltrons a 70 eV. A coluna utilizada foi DB-1 30 m x 0,25 mm x 0,25 m pertencente ao Laboratrio de Anlise de Aromas do Instituto de Qumica da UFRJ.

3.3) MTODOS ANALTICOS 3.3.1) Composio de cidos graxos

Os leos bruto e refinado de buriti foram inicialmente transesterificados atravs da adio de metanol, na razo molar de 1/9, e de 3 mol % de carbonato de potssio, a 100C por 2 h. A mistura reacional foi resfriada e neutralizada com soluo aquosa de HCl 10%, sendo os steres metlicos isolados por extrao com acetato de etila. A fase orgnica resultante foi submetida a lavagens sucessivas com gua destilada (3 x), tratada com sulfato de sdio anidro e evaporada. Os steres metlicos formados foram analisados em um cromatgrafo em fase gasosa, que operou sob as seguintes condies: temperatura do injetor e do auxiliar = 280C; temperatura inicial da coluna, 100C (32 min.), com rampa de 5C/min at 140C, uma espera (hold) de 5 min, mais uma rampa de 5C/min at 200C, e depois mais uma rampa de 15C/min at a temperatura final da coluna, 280C; Splitter (razo de diviso da amostra), 1:20; o gs de arraste utilizado foi hlio (0,9 mL/min); volume da amostra injetada, 0,5 L. A varredura foi efetuada na faixa de massa de 40 a 500 Daltons. O mtodo utilizado para a determinao quantitativa dos steres foi o da normalizao interna (Rezende, 2006)

3.3.2) ndices
3.3.2.1) Saponificao (IS) O ndice de saponificao uma medida dos cidos graxos livres e combinados que existem no leo e diretamente proporcional massa molar mdia (MMM). Quanto menor esta MMM, maior ser o IS. 40

O mtodo utilizado o oficial Cd-3b-76 (Firestone, 1997), onde foram adicionados 2 g de amostra a 25 mL de soluo alcolica 0,5M de KOH e prolas de vidro, mantendo em refluxo por 60 minutos, garantindo a solubilizao total da amostra. Depois foram adicionadas 2 gotas de uma soluo alcolica 1% de fenolftalena, e titulando-se com uma soluo 0,5 M HCl at desaparecimento da cor vermelha. O branco foi preparado com gua ao invs da amostra. Na frmula abaixo, a representa o volume (mL) de HCl titulado quando se utiliza a amostra, e b o volume (mL) titulado quando a amostra a gua.

IS =
3.3.2.2) Perxido (IP)

(b a) * 0,5 * 56,1 (mg KOH/g leo) 2

O ndice de perxido uma medida do oxignio ligado aos leos em forma de perxido. O mtodo utilizado o oficial Ja-8-87 (Firestone, 1997), tambm conhecido como mtodo de Wheeler. Inicialmente, o material de vidro deve estar totalmente limpo, por isso incialmente foi lavado com gua quente, em seguida imerso em soluo sulfocrmica, e depois lavado mais 5 vezes com gua destilada. A 1 g de amostra foi adicionado 30 mL de uma mistura 3/2 (v/v) de cido actico glacial/clorofrmio, e depois mais 0,5 mL de soluo saturada de KI, agitando energicamente por 1 minuto exato. Imediatamente depois, a soluo foi diluda com 30 mL de gua destilada, e o iodo liberado foi titulado com soluo 0,01M de tiossulfato de sdio. Pouco antes de desaparecer a cor amarela, 0,5 mL de soluo 1% de amido foi adicionada, mantendo a titulao at desaparecer a cor azul ou turvao. O branco foi preparado com gua ao invs da amostra. Na frmula abaixo, a representa o volume (mL) de Na2SO3 titulado quando se utiliza a amostra, e b o volume (mL) titulado quando a amostra a gua. IPO = (a b) * 0,1 *1000 meq O2/kg 1

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3.3.2.3) Iodo (II) O ndice de iodo uma medida do grau de insaturao dos componentes do leo.

Quanto maior o nmero de duplas ligaes por unidade de leo, maior o II. O ndice de iodo foi calculado a partir da composio em cidos graxos de acordo com o mtodo oficial Cd-1c-85 (Firestone, 1997), de acordo com a seguinte equao, sendo AOD, cido octadecenico; AODD, cido octadecadienico e AODT, cido octadecatrienico.

II = % AOD * 0,86 + % AODD * 1,732 + % AODT * 2,616 g I2 /100 g leo 3.3.2.4) cidos graxos livres (AGL) O mtodo utilizado foi de titulao potenciomtrica, onde as amostras so adicionadas a lcool quente neutralizado, completando 50 mL de soluo, e os grupos cidos so neutralizados com soluo 1M NaOH at deteco do ponto final a pH 10,2, j que o cido esterico tem pKa neste valor (Kanicky & Shah, 2002; Osawa & Gonalves, 2006). A %AGL na maioria dos tipos de leos calculada tendo como base cido oleico: %AGL = Vol(mLNaOH) 28,2 Amostra(g)

3.3.3) Densidade
Um balo volumtrico vazio (m1) foi pesado, sendo depois preenchido com gua destilada, que tenha sido antes fervida e resfriada, e depois pesado novamente (m2). E finalmente, o balo foi rinsado com amostra, e em seguida preenchido com esta e pesado (m3), obtendo a densidade relativa, de acordo com frmula abaixo (Matissek et al, 1998):
d 20 =
20

m3 m1 m2 m1

3.3.4) Umidade
O mtodo utilizado foi o oficial Bc-2-49 (Firestone, 1997), que consiste em se retirar uma alquota de 2 mL de amostra, adicionando-a ao cadinho (m2), previamente seco e pesado (m1), e seca em uma estufa a 103C, durante 24 horas (m3). O teor de umidade na amostra foi determinado pela frmula:
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 m 3 m1 % Umidade = 100 1 m m 2 1

3.3.5) Material Insaponificvel

3.3.5.1) Teor de Insaponificveis O mtodo utilizado o oficial Tk-1a-64 (Firestone, 1997), sendo feito em trs etapas: saponificao, extrao e concentrao. A 0,1 g de amostra foram adicionados 50 mL de soluo hidroalcolica (90% lcool) 2M de KOH, em banho-maria, em refluxo por 1 hora. A soluo quente saponificada obtida foi colocada em um funil de decantao, sendo a vidraria de refluxo rinsada 3 vezes com 17 mL de gua destilada para evitar perdas de material. Depois de esfriar, 100 mL de ter de petrleo foram adicionados ao funil, agitado energicamente, e deixado em repouso at clara separao de fases, sendo ento retirada a fase inferior (fase B). Em seguida, a fase A (superior) foi lavada 2 vezes com 40 mL de gua destilada, e depois retirada a fase inferior, reunindo-a a fase B anterior. A esta fase B foram adicionados mais 100 mL de ter de petrleo, repetindo-se o procedimento acima. Com toda a fase A reunida, fez-se uma lavagem com 50 mL de etanol 50% at a gua de lavagem estar em pH neutro. Depois, foram adicionados 1,5 g de sulfato de sdio anidro, secando por 10 minutos, e agitando um pouco. Finalmente, a fase A foi colocada em um balo previamente seco e pesado (m1), e acoplado a um rotovaporador para eliminao do solvente. Depois foi seco na estufa por 30 minutos a 103C (m2). Com isso, o teor de insaponficveis foi calculado de acordo com a equao abaixo:
% Insaponificavel = m2 m1 100 0,1

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3.3.5.2) Carotenides

3.3.5.2.1) Carotenides Totais

Neste ensaio, a amostra foi solubilizada e diluda em ter de petrleo, sendo detectada a 450 nm no espectrofotmetro (Rodriguez-Amaya, 2001). A concentrao de carotenides totais foi calculada de acordo com a equao abaixo: Carotenides totais (ppm) = Abs. (Amostra) Vol.Amostra(mL) 10 4 A 1% 1 cm ( caroteno) Amostra ( g )

3.3.5.2.2) Composio de carotenides

As amostras foram analisadas quanto a sua composio em carotenides em HPLC, utilizando uma fase mvel de acetonitrila/metanol/THF (50/45/5 v/v/v), com adio de 0,05% trietilamina ao metanol, sendo submetida a ultrassom antes do uso. A vazo da fase mvel foi de 1,0 ml/min. A temperatura da coluna era a ambiente (25 2C), e a absorbncia foi detectada a 450 nm. As amostras foram solubilizadas em acetona, e diludas para depois serem injetadas (5 L) no HPLC (http://www.waters.com/, 2006). Os padres de carotenides utilizados foram obtidos atravs de separao por cromatografia em coluna 2,5 cm x 30 cm, usando como adsorvente uma mistura ativada 1/1 de xido de magnsio e terra diatomcea (Celite). Inicialmente foi adicionada uma amostra da frao insaponificvel do leo bruto de buriti coluna, e em seguida eluda com ter de petrleo em concentraes variando de 4 a 20% de ter etlico. As fraes obtidas foram -caroteno, -caroteno e -caroteno. O 10-apo-carotenal foi obtido por partio em etanol do leo refinado de buriti, e purificado pelo HPLC, injetando 100 L por 3 vezes nas condies j supra citadas. Estes carotenides foram confirmados pela varredura no espectro visvel em espectrofotmetro (Godoy & RodriguezAmaya, 1995; Rodriguez-Amaya, 2001). 44

3.3.5.3) Tocoferis Totais As amostras foram analisadas quanto aos tocoferis totais em HPLC, utilizando uma fase mvel de isopropanol (grau HPLC)/gua ultra-pura milli-Q (65/35 v/v), sendo submetida a ultrassom antes do uso. A vazo da fase mvel foi de 0,7 ml/min. A temperatura da coluna foi ajustada para a temperatura ambiente (25 2C), e a absorbncia foi detectada em 295 nm. As amostras foram solubilizadas em metanol, e diludas para depois serem injetadas (7 L) no HPLC. O padro utilizado foi o -tocoferol (Satomura et al, 1992). 3.3.5.4) Esteris Totais Para determinao de fitoesteris totais, foi utilizado um mtodo espectrofotomtrico atravs de um kit enzimtico que contm lipase, colesterol oxidase e peroxidase, tendo como padro uma soluo de colesterol de 200 mg/mL (Moreau et al, 2003). Inicialmente, o reativo de trabalho (0,5 mL de 4-aminofenazona 0,025 M + 19 mL gua + 0,5 mL fenol 0,055 M + 0,2 mL reativo enzimtico) preparado, sendo utilizado: Branco 2,0 mL Padro 2,0 mL 20 L Amostra 2,0 mL 20 L

Reativo de Trabalho Reativo Padro Amostra

As solues branco, padro e amostra so incubadas a 37 C em um banho-maria por 60 minutos, e depois detectados em espectrofotmetro a 505 nm. A concentrao de esteris totais calculada de acordo com a frmula abaixo. EsterisTotais (mg / dL) = Abs.( Amostra ) 200 Abs.( Padro)

3.3.6) Atividade Lipoltica

A atividade da lipase foi estimada mediante a variao de absorbncia a 410 nm em espectrofotmetro devido oxidao do p-nitrofenil laurato (p-NFL) com uma concentrao de 0,162 mg.mL-1 em tampo fosfato de potssio (0,05 M), pH 7,0 (Meirelles, 1997). 45

O substrato (p-NFL) foi preparado solubilizando 0,018 g deste em 1 mL de dimetilsulfxido (DMSO). Em seguida, uma alquota foi diluda 100 vezes em tampo fosfato de potssio (0,05 M). Um tubo de ensaio contendo 1,8 mL do substrato previamente preparado foi aclimatado a 37C por, aproximadamente, 15 minutos. Aps esse tempo, foram adicionados 0,2 mL de soluo de enzima e a absorbncia acompanhada em espectrofotmetro a 410 nm contra o branco de reao (0,2 mL do tampo fosfato de potssio adicionados a 1,8 mL do substrato). O clculo da atividade realizado utilizando a equao abaixo: A= onde: A = atividade da enzima (U.L-1), onde 1 Unidade enzimtica (1U) a quantidade de enzima capaz de produzir 1mol de p-nitrofenol por minuto nas condies de ensaio;

(Abs ) * D * f *1000
(t ) * V

Abs = variao de absorbncia no intervalo de tempo t (em minutos) transcorrido durante a

fase de aumento linear da absorbncia; D = diluio da soluo enzimtica; V = volume (mL) da soluo enzimtica utilizado no ensaio. f = fator de converso (0,1062 mol/mL)

3.4) PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS 3.4.1) Caracterizao dos leos de buriti

Nesta etapa inicial, foi conduzida a caracterizao dos leos bruto e refinado de buriti, permitindo avaliar alguns parmetros-base, como a composio em termos de cidos graxos; suas propriedades fsico-qumicas (ndices de perxido, saponificao e iodo; cidos graxos livres; densidade e umidade) e o teor e a composio de material insaponificvel, dentre os quais esto tocoferis, fitoesteris e carotenides. 46

3.4.2) Pr-Avaliao do Processo Enzimtico

A pr-avaliao do processo enzimtico foi realizada para se determinar uma faixa de valores mais restrita para as variveis a serem testadas, como o tempo reacional mnimo para cada enzima; a temperatura de atuao tima das enzimas sem que haja degradao dos carotenides; a quantidade e a seleo de enzimas a serem adicionadas ao sistema reacional; e a melhor proporo entre leo e gua. Alm disso, foram testados alguns aditivos como emulsificantes, clcio, alumina bsica ativada S, amberlita XAD-2 e substituio da gua por tampo fosfato. Estes parmetros foram avaliados em relao formao de cidos graxos livres por titulao, a quantidade de carotenides totais por espectrofotometria e a variao no perfil destes atravs de HPLC. 3.4.2.1) Tempo reacional e Seleo de enzimas Nesta etapa, foram avaliados o tempo reacional (1, 2, 4 e 24 h) a ser fixado para o planejamento experimental e quais enzimas deveriam ser testadas. Para isso foram utilizados alguns parmetros fixos como agitao (200 rpm), quantidade de enzima (1 U de atividade em 8 mL de volume total), temperatura (30C) e relao leo/gua (1/1). Cada enzima apresenta uma atividade lipoltica diferente: Novozym 435 possui 1835,6 96,3 U por kg de enzima imobilizada, a Lipozyme CALB L apresenta 53106 640 U/L, a Lipozyme TL IM apresenta 690,24 6 kU/kg de atividade e a lipase de Yarrowia lipolytica, inicialmente tinha 2000 U/L quando produzida em frascos agitados (utilizada nesta pravaliao). Posteriormente, quando a produo foi conduzida em biorreator, foi obtido 30184 500 U/L de atividade lipoltica (utilizada no planejamento experimental). Isso quer dizer que para representar 1 U de atividade foram necessrias 0,545 g de Novozym 435; 18,83 L de Lipozyme CALB L; 1,5 mg de Lipozyme TL IM e 0,5 mL de lipase de Yarrowia lipolytica para um total de 8 mL de mistura reacional.

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O custo destas enzimas no mercado em 2007 est em US$ 1785,70 por kg de Novozym 435; US$ 86,42 por kg de Lipozyme TL IM e US$ 138,36 por kg de Lipozyme CALB L. Neste trabalho foi estimado que o valor de mercado da lipase de Yarrowia lipolytica teria o mesmo custo da Lipozyme CALB L por esta tambm estar na forma livre. 3.4.2.2) Temperatura Para avaliar a cintica de degradao do -caroteno, foram feitos ensaios que consistiram da manuteno dos leos bruto e refinado em tubos fechados em diferentes temperaturas (25, 35, 45, 55 ,65 e 75C) controladas durante 2 horas. 3.4.2.3) Relao leo/gua Para avaliar a relao leo/gua, foram empregadas como condies experimentais: temperatura (30C), agitao (200 rpm), lipase (Lipozyme TL IM, 10 U) e tempo reacional (2 h), variando esta relao de leo para gua em 7/1, 3/1, 1/1, 1/3 e 1/7. 3.4.2.4) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimtica) Como na etapa anterior, alguns parmetros operacionais foram adotados como temperatura (30C), agitao (200 rpm), lipase (Lipozyme TL IM), relao leo/gua (1/1) e tempo reacional (2 h) para avaliao da quantidade de enzima (1, 10, 50, 100 e 250 U) sobre a hidrlise enzimtica dos leos de buriti. 3.4.2.5) Aditivos Nesta etapa foram testados alguns aditivos (emulsificantes, clcio, adsorventes, tampo fosfato) que poderiam promover um aumento na hidrlise dos leos de buriti. O desempenho de todas as lipases selecionadas foi avaliado, uma vez que estes aditivos podem ter atuao diferente sobre cada uma destas, j que possuem estruturas distintas. Nesta avaliao foram empregadas as seguintes condies: temperatura (30C), agitao (200 rpm), lipase (10U), relao leo/gua (1/1) e tempo reacional (1,5 h).

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3.4.3) Otimizao da Hidrlise Enzimtica

Nesta etapa foi feito o planejamento experimental composto central para cada varivel selecionada na respectiva faixa de valores determinada na etapa anterior (item 3.4.2), constitudo de 17 experimentos para cada enzima e para cada leo, gerando um total de 102 experimentos, como mostrado nas Tabelas 8 e 9. Os parmetros e suas interaes foram avaliados de acordo com o diagrama de Pareto, e as condies timas obtidas atravs de resposta por desirability, gerando os grficos de contorno de superfcie, e um modelo com o qual se estimam os valores a serem obtidos das variveis-resposta: cidos graxos livres e carotenides. A correlao deste modelo com os resultados obtidos foi avaliada pelo coeficiente de correlao, R, permitindo verificar o ajuste do modelo. O diagrama de Pareto um histograma que apresenta os efeitos padronizados (valores absolutos calculados atravs da distribuio t de Student) de cada parmetro em termos lineares, quadrticos e a interao do seu termo linear com o de outro parmetro, sendo estes considerados relevantes se forem estatisticamente significativos, isto , quando o efeito padronizado do parmetro for inferior ao p-valor (probabilidade de significncia) de 0,05, para 95% de confiana (Rodrigues & Iemma, 2005). A abordagem geral da funo desirability consiste em converter primeiro cada resposta yi em uma funo individual desirability di , que varia de 0 a 1, onde quanto mais prximo de 1, melhor o ajuste. Assim, as variveis independentes so escolhidas de modo a maximizar a desirability global, definida como a mdia geomtrica de todas as funes individuais di.

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Atravs desta funo podem-se obter superfcies de resposta, curvas de nvel e tambm as condies timas das variveis independentes. As superfcies de resposta apresentam o comportamento da desirability global perante a variao de 2 parmetros, mas neste trabalho optou-se pelas curvas de nvel para uma melhor visualizao da regio de maior desirability (Calado & Montgomery, 2003).
Tabela 8 Faixa de valores utilizada para otimizao dos parmetros da hidrlise enzimtica

Fatores Temperatura (C) Atividade Enzimtica (U) Relao leo/gua

-1,68 25 1 1/1 (1)

-1 29 10,7 7/5 (1,4)

0 35 25 2/1 (2)

+1 41 39,9 13/5 (2,6)

+1,68 45 50 3/1 (3)

Tabela 9 Planejamento Composto Central em 3 nveis com 3 pontos centrais

Ensaios 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 (C) 16 (C) 17 (C)

T(C) Ativ(U) Oleo/agua 29,0 10,7 1,4 29,0 10,7 2,6 29,0 39,9 1,4 29,0 39,9 2,6 41,0 10,7 1,4 41,0 10,7 2,6 41,0 39,9 1,4 41,0 39,9 2,6 25,0 25,0 2,0 45,0 25,0 2,0 35,0 1,0 2,0 35,0 50,0 2,0 35,0 25,0 1,0 35,0 25,0 3,0 35,0 25,0 2,0 35,0 25,0 2,0 35,0 25,0 2,0

Os parmetros fixados foram: volume reacional (8 mL), tempo reacional (4 h), agitao (200 rpm), enzimas (Lipozyme TL IM, Lipozyme CALB L e lipase de Yarrowia lipolytica), aditivo (alumina em concentrao de 10% em peso em relao ao volume de leo adicionado). As condies a serem otimizadas foram: temperatura, quantidade de enzima (atividade enzimtica) e relao de quantidade de substrato (leo de buriti) para uma quantidade de gua. Os resultados foram analisados atravs do software STATISTICA 6.0. 50

Com as condies timas obtidas neste planejamento, foram realizados testes variando alguns parmetros em intervalos menores, como a quantidade de enzima (5, 15, 25, 35, 45, 55 e 65 U), agitao (200, 300 e 400 rpm) e tempo reacional (0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8 h) para se alcanar maiores rendimentos em cidos graxos livres.

3.4.4) Desacidificao e Concentrao de -Caroteno

Inicialmente, a fase aquosa (gua + glicerol), os cidos graxos precipitados, a alumina e lipase foram separadas da fase orgnica (carotenides + cidos graxos). Alguns testes foram feitos para recuperao da alumina com vrios solventes orgnicos para dessoro de cidos graxos e carotenides. A desacidificao da fase orgnica foi testada atravs de partio com lcool etlico, adicionado com o mesmo volume da fase rica em carotenides, agitado a 300 rpm por 15 min a 45C por 4 vezes (Gonalves et al, 2007), sendo avaliada a concentrao de carotenides na fase orgnica. Outros mtodos tambm foram testados como saponificao utilizando soda alcolica e aquosa (NaOH 0,5 M) nas mesmas condies utilizadas na partio com etanol. A winterizao foi testada mantendo a fase orgnica em temperaturas de 4C por 2 h seguida de centrifugao.

51

CAPTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1) CARACTERIZAO DOS LEOS DE BURITI 4.1.1) Composio em cidos graxos
A Tabela 10 indica as composies em cidos graxos dos leos bruto e refinado de buriti. Os dados obtidos referentes ao leo bruto de buriti esto de acordo com trabalhos reportados por Garca-Quiroz et al (2003) e Santos (2005). J os dados referentes ao leo refinado de buriti no foram relatados na literatura. Os resultados aqui obtidos apresentaram um alto teor de cidos graxos insaturados (88,3%), podendo ser indicado como alimento funcional e para aplicao em cosmticos.
Tabela 10 Comparao da composio de cidos graxos dos leos de buriti

cidos graxos Miristico (14:0) Palmtico (16:0) Esterico (18:0) Oleico (18:1) Linolico (18:2) Linolnico (18:3) Araquidico (20:1)

% Bruto 19,58 2,62 74,74 1,83 1,23

% Refinado 11,68 73,16 15,16 -

4.1.2) Determinao dos ndices Fsico-Qumicos

A Tabela 11 compara os principais ndices fsico-qumicos dos leos bruto e refinado de buriti. Alguns ndices foram comparados com valores referenciados pelo grupo empresarial Beraca-Sabar, como o ndice de iodo, o ndice de saponificao, o ndice de perxido, os cidos graxos livres e a densidade. Garca-Quiroz et al (2003) tambm mediram alguns ndices do leo de buriti, obtendo uma densidade de 0,86 g/cm, ndice de iodo de 77,2 g I2 /100g e ndice de saponificao de 169,9 mg KOH/g. Todos os ndices encontrados esto de acordo com estas referncias.

52

Tabela 11 Comparao dos ndices fsico-qumicos dos leos de buriti

Anlises ndice de Iodo (g I2/100g) ndice de Saponificao (mg KOH/g) ndice de Perxido (meq O2/1000g) cidos Graxos Livres (%) Densidade, a 20C (g/cm) Umidade (%) Teor de Insaponificveis (%) Tocoferis Totais (ppm) Esteris Totais (ppm) Carotenides Totais (ppm)

leo Bruto 67,45 1,0 186,53 6,0 3,79 0,4 10,0 1,0 0,844 0,03 0,73 0,1 1,99 0,2 777 20 1600 50 1817 30

Referncias 115 - 150 180 - 250 mx. 10 mx. 5 0,86 0,98 700 800 - 1000 1150 - 3380

leo Refinado 89,17 1,0 174,8 6,0 1,19 0,2 4,37 0,4 0,812 0,02 1,90 0,2 1,23 0,1 159 20 1083 50 864 7

Referncias 80 150 150 210 mx. 7 mx. 1 0,8 0,98 -

O teor de insaponificveis foi comparado ao de leo de palma (1,2%), pois tambm apresenta teor representativo de carotenides (500-700 ppm), sendo bastante similar ao leo de buriti, apesar de este ser ligeiramente maior devido ao alto teor de carotenides (1150-3380 ppm) (Gunstone & Padley, 1997; Rodriguez-Amaya, 2001). Os tocoferis totais no leo bruto encontrado foram um pouco inferior ao reportado por Silveira (2004), mas considerando os esteris totais esta concentrao foi muito superior. Poucos trabalhos fornecem dados de concentraes de carotenides em relao ao leo, como Garca-Quiroz et al (2003) que encontraram 1706 54 ppm. No leo refinado, os insaponificveis so parcialmente removidos ou degradados durante as etapas de desacidificao, branqueamento e desodorizao (Ouyang et al, 1980), sendo por isso seus teores menores que no leo bruto.

4.1.3) Composio e Perfil de Carotenides

Na Tabela 12, a composio de carotenides de ambos os leos de buriti estudados so comparadas. O leo bruto de buriti apresenta percentuais semelhantes aos descritos na literatura (Godoy & Rodriguez-Amaya, 1995; Garcia-Quiroz et al, 2003; de Rosso & Mercadante, 2007), sendo que neste trabalho no foi utilizada coluna cromatogrfica especfica para deteco de cis-carotenides, que geralmente representam de 2 a 18% de caroteno presente no leo de buriti.

53

Os outros carotenides presentes, alm dos j mencionados, so variados, como os encontrados por Godoy & Rodriguez-Amaya (1995) utilizando uma coluna C18 Vydac 201TP54, 250 x 4,6 mm, com a seguinte composio: 3,9% zeaxantina, 1,1% -zeacaroteno e 0,9% -caroteno. Garcia-Quiroz et al (2003) detectaram fitoflueno (0,95%), -zeacaroteno (2,4%), -caroteno (2,5%), -caroteno (0,7%), mutacromo (2,86%), -10-apocarotenal (4,4%) e zeaxantina (6,2%), mas sem mencionar qual coluna foi utilizada. De Rosso & Mercadante (2007) utilizando uma coluna C30 YMC, 250 x 4,6 mm, com detector PDA e espectrmetro de massas, analisaram o leo de buriti e encontraram derivados epoxidados de -caroteno (1,6%), -caroteno (2,2%), -criptoxantina (0,25%), -caroteno (0,016%) e lutena (0,007%).
Tabela 12 Comparao da composio de carotenides dos leos de buriti

Carotenides -caroteno -caroteno -caroteno Apocarotenides Outros

% Bruto 76,8 0,4 8,8 0,1 4,5 0,1 0,45 0,07 9,4 0,4

% Refinado 45,0 0,3 2,5 0,1 1,9 0,1 45,0 1,2 6,0 0,2

No caso do leo refinado de buriti, a composio de carotenides demonstra como o processo de refino promove a degradao dos carotenides, sendo quase metade do caroteno transformado em apocarotenides, principalmente em 10-apo--carotenal. Este problema inicial pode na verdade ser uma soluo futura, pois alm do aproveitamento do caroteno natural, poder-se-ia separar este apocarotenide para aplicao em margarinas como substituto de corantes sintticos, como cantaxantina e 8-apo--carotenal. Na Figura 25 encontram-se os perfis de carotenides dos leos de buriti, diludos 500 vezes em acetona, com identificao do tempo de reteno de cada carotenide.

54

leo bruto
Beta-caroteno Alfa-caroteno Gamacaroteno

Apocarotenides

leo refinado

Gamacaroteno

Alfa-caroteno

Beta-caroteno

Figura 25 Perfil de carotenides dos leos de buriti

4.2) PR-AVALIAO DO PROCESSO ENZIMTICO 4.2.1) Determinao do Tempo Reacional e Seleo das Enzimas
Na Figura 26, observa-se que a enzima que apresentou melhor rendimento na hidrlise dos leos de buriti bruto e refinado foi a Novozym 435, alcanando 60% em cidos graxos livres em 24 h. Porm, na Figura 27 avaliada a produo de cidos graxos pelo custo destas enzimas. Tal anlise permite concluir que a Lipozyme TL muito mais eficiente em hidrolisar o leo, com uma quantidade mnina de biocatalisador (0,01875% de peso por volume total), sendo portanto selecionadas a Lipozyme TL IM, a Lipozyme CalB L e a lipase de Y. lipolytica para o planejamento experimental. 55

(a)
60 50
CalB TL 435 Yarrowia

(b)
60
CalB 435 Yarrowia

50
% AGL

TL

% AGL

40 30 20 10 0 0 5 10 15 tempo (h) 20 25

40 30 20 10 0 0 5 10 15 tempo (h) 20 25

Figura 26 Avaliao do tempo reacional de hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti
10 x % AGL/ US$ lipase
CalB
TL

435
Yarrowia

10 x % AGL/ US$ lipase

400 350 300 250 200 150 100 50 0

(a)

7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 tempo (h) 20 25

Ampliando

10 15 tempo (h)
435
Yarrowia

20

25

400 350 300 250 200 150 100 50 0

10 x % AGL/ US$ lipase

(b)

TL

Ampliando

10 15 tempo (h)

20

25

10 x % AGL/ US$ lipase

CalB

5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 5 10 15 tempo (h) 20 25

Figura 27 Avaliao da quantidade de cidos graxos produzida pelo custo de lipase durante a hidrlise de leo bruto (a) e refinado (b) de buriti

Quanto ao tempo reacional, apesar de em 24 horas haver maior hidrlise, foi escolhido o tempo de 4 horas uma vez que a cintica j tende a estabilidade na formao de cidos graxos. Os carotenides tambm foram avaliados nesta etapa, mas no apresentaram alteraes muito significativas nos perfis, concentrando em mais de 10% do seu valor total em 24 horas de hidrlise, provavelmente pela precipitao dos cidos graxos, diminuindo um pouco o volume total de fase orgnica.

56

4.2.2) Pr-avaliao dos Parmetros do Planejamento Experimental

4.2.2.1) Temperatura Na Figura 28 apresentada a influncia da temperatura sobre os carotenides, demonstrando que h uma ligeira diminuio no teor de -caroteno presente no leo bruto de buriti entre 25 e 45C, sendo esta queda ainda mais pronunciada entre 45 e 75C. No leo refinado, a queda na concentrao de -caroteno e o aumento de apocarotenides so praticamente complementares, indicando tambm que a melhor faixa de operao est entre 25 e 45C, a qual foi mantida para o planejamento experimental.
(a)
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 20 30
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 20

(b)

beta-caroteno
Apocarotenides

ppm

beta-caroteno
Apocarotenides

40

Figura 28 Avaliao da temperatura na reduo da concentrao de -caroteno durante a hidrlise de leo bruto (a) e refinado (b) de buriti

50 T (C)

60

70

80

ppm

30

40

50 T (C)

60

70

80

4.2.2.2) Relao leo/gua Foram escolhidas relaes leo/gua com maior proporo de gua para comprovar que estas condies promovem uma maior hidrlise do leo, mas necessitam de um maior tempo operacional para hidrolisar grandes quantidades de leo, gerando custos operacionais maiores e tambm um maior gasto no ps-processamento dos efluentes gerados. Portanto, a relao leo/gua deve ser pelo menos com propores iguais entre as fases, ou com quantidade superior de leo. Na Figura 29 visualizado que a relao leo/gua 7/1 possui baixo teor em cidos graxos livres. Com isso, a faixa operacional foi delimitada entre 3/1 e 1/1.

57

80 70 60 50 40 30 20 10 0

(a)

% AGL

% AGL

80 70 60 50 40 30 20 10 0

(b)

7\1

3\1

1\1

1\3

1\7

7\1

3\1

1\1

1\3

1\7

Figura 29 Avaliao da relao leo/gua na hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti

Os carotenides tambm foram avaliados nesta etapa, no havendo alteraes no seu perfil, tendo sido concentrado em mais de 25% quando a relao 1/7 foi utilizada, provavelmente devido ao seu maior rendimento na hidrlise. 4.2.2.3) Quantidade de Enzima (Atividade Enzimtica) Os resultados obtidos no que tange a quantidade de biocatalisador indicam que concentraes muito altas de enzima, como 100 U e 250 U em 8 mL de mistura reacional, produziram rendimentos maiores em cidos graxos (Figura 30). Porm, o suporte em que a lipase (Lipozyme TL IM) est imobilizada adsorve carotenides (Figura 31), alterando parcialmente o perfil dos mesmos nos leos. Assim, a faixa operacional foi delimitada entre 1 e 50 U para o planejamento experimental, mantendo sempre o volume reacional de 8 mL.
80 70 60 50 40 30 20 10 0 1U 10U 50U 100U 250U

(a)
%AGL

80 70 60 50 40 30 20 10 0

(b)

%AGL

1U

10U

50U

100U

250U

Figura 30 Avaliao da quantidade de enzima sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti
2500

Oleo Bruto

Carotenides (ppm)

2000 1500 1000 500 0 1U 10 U 50 U

Oleo Refinado

100 U

250 U

Figura 31 Avaliao da quantidade de enzima sobre a concentrao de carotenides

58

4.2.3) Pr-avaliao dos Aditivos

4.2.3.1) Emulsificantes A adio de emulsificantes a este sistema reacional poderia aumentar a rea interfacial entre a fase oleosa e a aquosa, facilitando a atuao lipsica na hidrlise. Na Figura 32 apresentado o rendimento em cidos graxos encontrado quando alguns emulsificantes (goma arbica, Tween 80 e Span 20) foram adicionados na concentrao de 5% em peso pelo volume de gua presente. Para uma melhor comparao, foi realizado um experimento sem adio de emulsificantes (branco). Nenhum dos emulsificantes promoveu um aumento em cidos graxos livres comparativamente ao branco, e tambm no alterou significativamente o teor de carotenides presentes com as trs lipases testadas.
(a)
30 25
% AGL
Yarrowia
TL
CalB

(b)
30 25
Yarrowia
TL
CalB

15 10 5 0 Branco Goma arabica Tween Span

% AGL

20

20 15 10 5 0

Branco

Goma arabica

Tween

Span

Figura 32 Avaliao de emulsificantes sobre a hidrlise enzimtica dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti

4.2.3.2) Clcio A adio de ons clcio a esse sistema reacional poderia: na forma solvel, estabilizar a lipase, dependendo da estrutura tridimensional da enzima, alm de possibiltar a formao de sabo (interao entre ons clcio e os cidos graxos gerados); ou ainda na forma insolvel, atuando como adsorvente dos cidos graxos formados, deslocando o equilbrio da reao no sentido da hidrlise. Na Figura 33 apresentado o rendimento em cidos graxos quando o clcio adicionado substituindo a gua por uma soluo aquosa de CaCl2 a 0,01 e 0,05M ou na forma de CaCO3 em concentraes de 5% em peso pelo volume de leo presente.

59

Para uma melhor comparao, foi feito um experimento sem adio de clcio (branco). A adio de CaCO3 gerou um aumento (2 vezes) no rendimento em cidos graxos com todas as lipases avaliadas, mas ao mesmo tempo, este reduziu a concentrao de carotenides em 20%, alm de necessitar de um maior nmero de centrifugaes para sua separao da fase orgnica. A adio de soluo de CaCl2 apresentou um pequeno aumento no rendimento em cidos graxos quando foram utilizadas enzimas livres, no sendo este aumento porm muito siginificativo. No caso da Lipozyme TL, a adio de CaCl2 teve efeito negativo na hidrlise dos leos de buriti, principalmente no leo refinado. Isso pode ter ocorrido pela formao de sabo e possvel ocluso dos poros do suporte.
(a)
60 50
% AGL

60
Yarrowia
TL
CalB

(b)
Yarrowia

50

TL

CalB

30 20 10 0

% AGL
Branco CaCl2 0,05M CaCl2 0,01M CaCO3 5%

40

40 30 20 10 0

Branco

CaCl2 0,05M

CaCl2 0,01M

CaCO3 5%

Figura 33 - Avaliao da adio de clcio sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti

4.2.3.3) Adsorventes Foram testados dois adsorventes nesta etapa, um inorgnico (alumina bsica, pH entre 9-10, para cromatografia em coluna, com dimetro de partcula de 0,05-0,15 mm e rea superficial de 155 m/g) e um polimrico (amberlita XAD2, uma resina de poliestirenodivinilbenzeno, com dimetro de partcula de 0,25 0,80 mm e rea superficial de 300 m/g). A alumina foi selecionada dada a sua grande interao com cidos carboxlicos (KasprzykHordern, 2004), inclusive com cidos graxos (Queiroz 1996). J a amberlita adsorve vrios tipos de compostos hidrofbicos at massa molar de 20 kDa, o que possibilitaria a adsoro de cidos graxos, deslocando o equilbrio da reao no sentido da reao de hidrlise.

60

Inicialmente ambos os adsorventes foram adicionados em concentraes de 5% em peso por volume de leo. Ambos os adsorventes apresentam rendimentos em cidos graxos similares (Figura 34), sendo facilmente removidos por centrifugao aps a hidrlise. A concentrao de carotenides se manteve inalterada no caso da amberlita e apresentou uma reduo de 9% quando a alumina utilizada. Mas, entre estes dois adsorventes, h uma grande diferena em relao aos seus custos. A alumina bsica tem um custo de US$37 / kg, e amberlita XAD2 apresenta um custo bem maior: US$116 / kg.
60 50 40
% AGL
%AGL

(a)
Yarrow ia

60 50 40 30 20 10 0

(b)
Yarrow ia TL CalB

TL

CalB

30 20 10 0 Branco Amberlita Alumina

Branco

Amberlita

Alumina

Figura 34 Avaliao de adio de adsorventes sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti

Por isso, alumina foi escolhida para fazer os testes alterando sua concentrao no meio reacional, como apresentado nas Figuras 35 e 36. O aumento da concentrao de alumina na hidrlise enzimtica levou a uma maior adsoro dos carotenides, como no caso da utilizao de 20% de alumina onde houve a reduo de 15% no leo bruto e de 35% no leo refinado, sendo esta adsoro preferencial por apocarotenides. At a concentrao de 10% de alumina, esta adsoro de carotenides menos evidenciada, e apresenta um alto rendimento em cidos graxos (superior a 60%), sendo por isso a quantidade de alumina escolhida para ser usada no planejamento experimental.

61

70 60 50

(a)
Yarrowia
TL
CalB

70 60 50

(b)
Yarrowia TL

% AGL

40 30 20 10 0 0 1 5 10 % Alumina no leo 20

% AGL

40 30 20 10 0

CalB

1 5 10 % Alumina no leo

20

Figura 35 - Avaliao da quantidade de alumina sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti
2100 1800

(a)
Yarrowia
TL
CalB

2100 1800

(b)
Yarrowia
TL
CalB

Carotenides (ppm)

Carotenides (ppm)

1500 1200 900 600 300 0 0 1 5 % Alumina no leo 10 20

1500 1200 900 600 300 0 0 1 5 10 % Alumina no leo 20

Figura 36 - Avaliao da quantidade de alumina sobre a concentrao de carotenides durante a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti

4.2.3.4) Tampo Fosfato A utilizao de uma soluo tampo neste sistema reacional poderia manter o pH de melhor atuao lipsica durante a hidrlise, promovendo um aumento da produo de cidos graxos. A substituio da gua por uma soluo tampo fosfato de sdio 0,05 e 0,2M promoveu um ligeiro aumento no rendimento em cidos graxos, mas no muito representativo, como visto na Figura 37, sem alteraes na concentrao de carotenides. Por isso, a gua foi mantida para o planejamento experimental.
40 35 30
%AGL

(a)
Yarrowia

40

(b)
Yarrowia
TL
CalB

TL

CalB

35 30
%AGL

25 20 15 10 5 0 Branco 0,05M 0,2M

25 20 15 10 5 0 Branco 0,05M 0,2M

Figura 37 - Avaliao da substituio da gua por tampo fosfato sobre a hidrlise dos leos bruto (a) e refinado (b) de buriti

62

4.3) OTIMIZAO DA HIDRLISE ENZIMTICA 4.3.1) Planejamento Experimental do leo Bruto de Buriti
Os resultados obtidos durante o planejamento experimental so apresentados na Tabela 13 referente hidrlise enzimtica do leo bruto de buriti, sendo destacados em negrito os melhores rendimentos em cidos graxos livres para cada lipase utilizada.
Tabela 13 Comparao dos resultados (cidos graxos livres e carotenides) da hidrlise enzimtica do leo bruto de buriti utilizando planejamento composto central

Ensaios 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 (C) 16 (C) 17 (C)

Lipozyme TL IM
%AGL
Carotenides (ppm)

Lipozyme CALB L
%AGL
Carotenides (ppm)

Lipase de Y. lipolytica
%AGL
Carotenides (ppm)

62,89 56,58 73,61 73,04 62,53 52,83 76,46 61,20 60,11 66,06 18,78 72,00 64,24 67,86 66,06 62,61 68,87

1539 1810 1561 1732 1580 1692 1609 1609 1547 1570 1814 1602 1631 1596 1728 1746 1720

13,22 13,86 17,51 14,72 14,29 15,30 15,72 15,59 14,40 18,16 13,77 18,78 17,94 16,41 13,77 14,08 14,40

1879 1920 1903 1754 1725 1575 1857 1666 1749 1712 1758 1811 1665 1552 1700 1658 1730

15,36 15,30 34,30 32,04 15,72 11,84 34,30 25,98 32,56 25,67 9,08 35,06 31,29 33,65 28,80 30,05 31,43

1696 1799 1565 1648 1607 1693 1791 1773 1644 1754 1756 1754 1769 1868 1802 1792 1778

4.3.1.1) Lipozyme TL IM Na Figura 38 so apresentados os diagramas de Pareto referentes aos cidos graxos livres e aos carotenides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear da atividade enzimtica, no caso dos cidos graxos e o termo quadrtico da temperatura, no caso dos carotenides. O coeficiente de correlao, R, para os cidos graxos livres foi igual a 0,75, e para os carotenides foi de 0,74, tendo baixo ajuste ao modelo.

63

(a)

(b)

Figura 38 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por Lipozyme TL IM sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)

Na Figura 39, o intervalo timo (com maior desirability) foi determinado em 10 - 35U de atividade enzimtica, 1,9 - 2,9 de relao leo/gua e 27 - 36C de temperatura. As condies timas encontradas foram: temperatura de 31,2C, atividade enzimtica de 21,6U e relao leo/gua de 2,33. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em 64,48% e 1749 ppm, respectivamente.

64

Figura 39 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por Lipozyme TL IM

65

4.3.1.2) Lipozyme CALB L Na Figura 40 so apresentados os diagramas de Pareto referentes aos cidos graxos livres e aos carotenides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear da atividade enzimtica, no caso dos cidos graxos; e o termo linear da temperatura, no caso dos carotenides. O coeficiente de correlao R para os cidos graxos livres foi calculado como 0,70, e para os carotenides 0,77, tendo baixo ajuste ao modelo. (a)

(b)

Figura 40 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por Lipozyme CalB L sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)

Na Figura 41, o intervalo timo (com maior desirability) foi de 45 - 50U de atividade enzimtica, 1,0 - 1,6 de relao leo/gua e 25 - 45C de temperatura. As condies timas encontradas foram: temperatura de 45C, atividade enzimtica de 50U e relao leo/gua de 1,6. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em 18,80% e 2067 ppm, respectivamente. 66

Figura 41 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por Lipozyme CalB L

67

4.3.1.3) Lipase de Yarrowia lipolytica Na Figura 42 so apresentados os diagramas de Pareto referentes aos cidos graxos livres e aos carotenides, sendo estatisticamente significativo os termos linear e quadrtico da atividade enzimtica, no caso dos cidos graxos; e o termo linear da relao leo/gua, o termo quadrtico da temperatura e a interao entre atividade enzimtica e a temperatura, no caso dos carotenides. O coeficiente de correlao R para os cidos graxos livres foi de 0,92, e para os carotenides foi de 0,88, tendo melhor ajuste ao modelo do que aquele obtido nos ensaios empregando as demais lipases. (a)

(b)

Figura 42 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)

Na Figura 43, o intervalo timo (com maior desirability) foi de 45 - 50U de atividade enzimtica, 1,0 - 1,3 de relao leo/gua e 40 - 45C de temperatura. As condies timas encontradas foram: temperatura de 42,4C, atividade enzimtica de 47,6U e relao leo/gua

68

de 1,0. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em 34,56% e 1861 ppm, respectivamente.

Figura 43 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo bruto de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica

69

4.3.2) Planejamento Experimental do leo Refinado de Buriti

Os resultados obtidos durante o planejamento experimental foram distribudos na Tabela 14 referente a hidrlise enzimtica do leo refinado de buriti, sendo destacados em negrito os melhores rendimentos em cidos graxos livres para cada lipase utilizada.
Tabela 14 Comparao dos resultados (cidos graxos livres e carotenides) da hidrlise enzimtica do leo refinado de buriti utilizando planejamento composto central

Ensaios 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 (C) 16 (C) 17 (C)

Lipozyme TL IM
%AGL
Carotenides (ppm)

Lipozyme CALB L
%AGL
Carotenides (ppm)

Lipase de Y. lipolytica
%AGL
Carotenides (ppm)

68,42 51,07 66,56 68,80 61,35 39,66 74,37 71,20 62,88 63,20 14,66 68,74 59,04 46,02 65,81 67,07 63,85

760 844 863 804 812 690 878 641 829 849 697 673 693 642 813 778 796

8,55 8,11 28,63 8,71 11,15 8,71 16,36 12,92 11,73 7,82 6,84 14,99 14,76 8,68 11,08 11,73 11,08

788 632 686 789 690 675 780 762 759 761 686 807 654 592 720 709 706

8,92 7,81 30,49 27,04 8,18 6,91 7,44 6,01 22,15 5,21 4,56 9,77 12,15 8,68 9,42 9,12 8,67

820 755 864 939 867 773 814 864 834 708 806 865 898 919 889 876 873

4.3.2.1) Lipozyme TL IM Na Figura 44 so apresentados os diagramas de Pareto referentes s variveis-resposta, cidos graxos livres e carotenides, sendo estatisticamente significativo apenas o termo linear da atividade enzimtica, no caso dos cidos graxos livres; e a interao entre a temperatura e a relao leo/gua, no caso dos carotenides. O coeficiente de correlao R para os cidos graxos livres foi de 0,80, e para os carotenides foi de 0,81.

70

(a)

(b)

Figura 44 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por Lipozyme TL IM sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)

Na Figura 45, o intervalo timo (com maior desirability) foi de 25 - 40U de atividade enzimtica, 1,0 - 1,8 de relao leo/gua e 25 ou 45C de temperatura. As condies timas encontradas foram: temperatura de 45C, atividade enzimtica de 31,2U e relao leo/gua de 1,8. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em 75,86% e 878 ppm, respectivamente.

71

Figura 45 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por Lipozyme TL IM

72

4.3.2.2) Lipozyme CALB L Os diagramas de Pareto referentes aos cidos graxos livres e aos carotenides para a enzima Lipozyme CalB L so apresentados na Figura 46, sendo estatisticamente significativo o termo linear da atividade enzimtica e da relao leo/gua, no caso dos cidos graxos; e o termo linear da atividade enzimtica, o termo quadrtico da relao leo/gua e a interao entre a atividade enzimtica e a relao leo/gua, no caso dos carotenides. O coeficiente de correlao R para os cidos graxos livres foi de 0,83, e para os carotenides foi de 0,84. (a)

(b)

Figura 46 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por Lipozyme CalB L sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)

Na Figura 47, o intervalo timo (com maior desirability) foi obtido em 50U de atividade enzimtica, 1,2 - 2,0 de relao leo/gua e 25 - 30C de temperatura. As condies timas encontradas foram: temperatura de 25C, atividade enzimtica de 50U e relao leo/gua de 1,667.

73

Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em 28,55% e 792 ppm, respectivamente.

Figura 47 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por Lipozyme CalB L

74

4.3.2.3) Lipase de Yarrowia lipolytica Os diagramas de Pareto referentes aos cidos graxos livres e aos carotenides para a ao de hidrlise de Yarrowia lipolytica so apresentados na Figura 48. O termo linear da atividade enzimtica e da temperatura, o termo quadrtico da temperatura e a interao entre temperatura e atividade enzimtica mostraram-se estatisticamente significativos, no caso dos cidos graxos; e o termo linear e quadrtico da temperatura, o termo linear da atividade enzimtica e as interaes entre a atividade enzimtica e a relao leo/gua, e tambm com a temperatura, no caso dos carotenides. O coeficiente de correlao R para os cidos graxos livres foi de 0,94, e para os carotenides foi de 0,92, tendo um bom ajuste ao modelo. (a)

(b)

Figura 48 Diagrama de Pareto para avaliao da hidrlise do leo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica sobre cidos graxos livres (a) e carotenides (b)

Na Figura 49, o intervalo timo (com maior desirability) foi determinado no intervalo de 40 - 50U de atividade enzimtica, 2,5 - 3,0 de relao leo/gua e 25 - 28C de temperatura. 75

As condies timas encontradas foram: temperatura de 29C, atividade enzimtica de 50U e relao leo/gua de 3,0. Com estas condies foram calculadas as variveis de resposta (cidos graxos livres e carotenides) atravs do modelo utilizando os coeficientes de regresso resultando em 30,80% e 708 ppm, respectivamente.

Figura 49 Curvas de nvel fixadas no ponto timo: efeitos de temperatura, atividade enzimtica e relao leo/gua sobre a hidrlise de leo refinado de buriti por lipase de Yarrowia lipolytica

76

4.3.3) Resumo das Condies timas na Hidrlise dos leos de Buriti

Para uma melhor comparao dos resultados obtidos neste planejamento experimental, foram dispostos nas Tabelas 15 e 16 os dados referentes s condies timas e os rendimentos em cidos graxos livres e carotenides previstos pelos modelos da hidrlise enzimtica dos leos bruto e refinado de buriti, respectivamente.
Tabela 15 Comparao das condies timas para hidrlise enzimtica do leo bruto de buriti

Enzimas
T (C)

Condio tima
Ativ (U) leo/Agua % AGL

Rendimento
Carotenides (ppm)

Lipozyme TL Lipozyme CalB L Lipase de Y. lipolytica Enzimas

31,2 45 42,4

21,6 50 47,6 Condio tima

2,33 1,6 1,0

64,48 18,80 34,56

1749 2067 1861 Rendimento

Tabela 16 Comparao das condies timas para hidrlise enzimtica do leo refinado de buriti T (C) Ativ (U) leo/Agua % AGL Carotenides (ppm)

Lipozyme TL Lipozyme CalB L Lipase de Y. lipolytica

45 25 29

31,2 50 50

1,8 1,67 3,0

75,86 28,55 30,80

878 792 708

Os rendimentos em cidos graxos to distintos podem ser explicados pelas diferentes estruturas tridimensionais dos stios ativos das lipases utilizadas (Gutierrez-Ayesta et al, 2007) ou tambm pela possvel hiperativao ocasionada pelo mtodo de imobilizao usado na produo da Lipozyme TL IM, que deixaria o stio ativo sempre exposto e ativado (Cunha, 2007). Devos et al (2006) fez uma comparao entre 12 lipases na hidrlise de fosfolipdeos de biomassa algal, mostrando que a Lipozyme TL IM tambm gerou rendimentos em cidos graxos saturados e monoinsaturados de 75%, apesar de utilizar maior tempo reacional (24 h), maior agitao (24 h), maior quantidade de enzima (1% p/v) e maior proporo entre fase orgnica e aquosa (1/10). J a lipase imobilizada de Candida antarctica apresentou resultados abaixo dos 20% de cidos graxos livres, valor prximo ao obtido na hidrlise do leo bruto de buriti.

77

As lipases de Candida antarctica e Yarrowia lipolytica no possuem um histrico em reaes de hidrlise de leos vegetais na literatura, e sim na resoluo de misturas racmicas (Guieysse et al, 2004; Ong et al 2006), na sntese de novas molculas (Fantin et al, 2001; Yoshida et al, 2006) ou em outras modificaes de leos e gorduras (Hrnandez-Martn & Otero, 2008). Por isso, a obteno de baixos rendimentos em cidos graxos no foi surpreendente, mas o estudo foi necessrio, justamente pela falta de dados na literatura.

4.3.4) Otimizao
Em ambas as hidrlises enzimticas, tanto do leo bruto como do leo refinado de buriti, o maior rendimento em cidos graxos livres (at 75%) foi obtido quando utilizou-se a Lipozyme TL IM com pequenas perdas de carotenides. Em todos os diagramas de Pareto analisados foi verificado que a atividade enzimtica foi estatisticamente significativa na hidrlise dos leos no que se refere produo de cidos graxos livres. Porm, como a correlao dos dados experimentais com o modelo teve um baixo ajuste na maioria das avaliaes, decidiu-se testar este parmetro isoladamente, mantendo as outras condies timas previstas pelo modelo. Ainda objetivando uma maior hidrlise do leo, foram testadas diferentes velocidades de agitao do sistema, de forma a aumentar a rea interfacial, facilitando a atuao lipsica. Tambm foi avaliada a cintica reacional de hidrlise da Lipozyme TL IM em intervalos de tempo menores que os utilizados no item 3.4.2.1. 4.3.4.1) Quantidade de Enzima Na Figura 50, pode-se determinar como condies timas de atividade enzimtica 25 U (0,47% p/v) e 35 U (0,66% p/v) de Lipozyme TL IM para o leo bruto e refinado, respectivamente, sendo obtidos os maiores rendimentos em cidos graxos livres (prximo de 70%), sem perdas significativas de carotenides.

78

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30

leo Bruto
leo Refinado

40

50

60

70

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 10 20

Carotenides (ppm)

%AGL

leo Bruto leo Refinado

30

40

50

60

70

Ativ Enz (U)

Ativ Enz (U)

Figura 50 Otimizao da quantidade de enzima na hidrlise enzimtica dos leos de buriti

4.3.4.2) Agitao Mantendo as condies obtidas no item 4.3.3.1., a velocidade de agitao de 300 rpm foi escolhida, pois gerou maiores incrementos nos rendimentos em cidos graxos livres, alcanando perto de 75%, com perdas de carotenides ligeiramente inferiores aos obtidos a 400 rpm (Figura 51).
80
Carotenides (ppm)
1800
200 rpm
300 rpm
400 rpm

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

200 rpm 300 rpm 400 rpm

75
% AGL

70 65 60 leo Bruto leo Refinado

leo Bruto

leo Refinado

Figura 51 Avaliao da velocidade de agitao sobre a hidrlise enzimtica dos leos de buriti

4.3.4.3) Tempo Reacional Tendo como condies iniciais para leo bruto (25U de atividade enzimtica, 2,33 de relao leo/gua e 31,2C de temperatura) e para o leo refinado (35U de atividade enzimtica, 1,8 de relao leo/gua e 45C de temperatura), alm da velocidade de agitao de 300 rpm, foi avaliada nesta ltima etapa a cintica reacional. Na Figura 52, observa-se que a partir de 4 h de reao, a hidrlise tanto do leo bruto como do refinado se estabiliza, sendo ento esta condio mantida como tempo reacional necessrio ao processo.

79

Adicionalmente, o rendimento em cidos graxos parece ter estabilizado em 75% fato que pode ter ocorrido pela alterao do pH, que alcanou valores prximos a 5, pela formao dos cidos graxos livres, levando a uma possvel inibio da lipase.
80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 1 2
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 1 2 3 4 5

Carotenides (ppm)

% AGL

leo Bruto
leo Refinado

leo Bruto
leo Refinado

3 4 5 tempo (h)

tempo (h)

Figura 52 Otimizao do tempo reacional na hidrlise enzimtica dos leos de buriti

4.4) DESACIDIFICAO E CONCENTRAO DE -CAROTENO 4.4.1) Recuperao da Alumina

A alumina nos experimentos de hidrlise do leo de buriti adsorveu cerca de 15% dos cidos graxos liberados e ainda 5% dos carotenides presentes no caso do leo bruto, e prximo de 10% no caso do leo refinado. Esse aumento da adsoro de carotenides pela alumina no leo de refinado deve estar relacionado com a grande presena de apocarotenides, que apresentam grupos aldedos ou carboxlicos, os quais possuem afinidade com a alumina (Kasprzyk-Hordern, 2004). Para a recuperao da alumina, e, por conseguinte dessoro dos cidos graxos e carotenides, foram utilizados alguns solventes orgnicos como etanol, acetona e ter de petrleo, puros ou em mistura. A mistura 1/1 (v/v) de etanol e acetona promoveu a dessoro de 60% dos carotenides em apenas uma extrao no caso da alumina usada durante a hidrlise do leo bruto de buriti, e utilizando o lcool etlico em 2 extraes obteve-se a remoo de 50% ds carotenides da alumina referente a hidrlise do leo refinado. A utilizao de 3 extraes, sendo duas iniciais de etanol e uma ltima sendo uma mistura 1/1 de lcool etlico e acetona removeu 85% dos cidos graxos adsorvidos da alumina referente a hidrlise de ambos os leos de buriti. 80

4.4.2) Mtodos de Desacidificao

4.4.2.1) Partio com Etanol Inicialmente foi avaliado o tempo de agitao para a partio dos cidos graxos ao etanol, verificando que em 15 min a concentrao de cidos graxos j se estabilizava em 10%. Resultado superior foi obtido por Gonalves & Meirelles (2004) onde 53% dos cidos graxos presentes na fase oleosa distriburam-se para fase alcolica, mas neste trabalho foi includa uma etapa de repouso de 24 h para que as fases atingissem o equilbrio e quantidade de cidos graxos livres presentes em sua amostra era pequena, cerca de 4%. Em relao aos carotenides apenas 2% se distribuem para a fase etanlica quando utilizado o leo bruto de buriti, e cerca de 8%, no caso do leo de refinado, onde 90% so apocarotenides. Gonalves et al (2007) verificaram que os carotenides de leo de palma se distribuem para a fase alcolica entre 1,6 a 2,7%, podendo incrementar essa proporo se a quantidade de gua no sistema for menor, por exemplo com a utilizao de etanol anidro aumenta a partio dos carotenides para 13%. Na Figura 53 observa-se a variao dos cidos graxos livres e dos carotenides desde a finalizao do processo enzimtico (1), a separao da fase orgnica (carotenides + cidos graxos) da fase aquosa (gua + glicerol + alumina + enzima + cidos graxos precipitados) (2), e aps 4 extraes sucessivas da fase orgnica com lcool etlico (3). Com as extraes por etanol, houve uma perda de 4,4% de carotenides quando a fase orgnica do leo bruto de buriti foi utilizada, e 18,5% de carotenides referentes ao leo refinado. Pela tendncia descendente de cidos graxos livres presentes na fase orgnica, demonstrada na figura 53, para se alcanar 5% de cidos graxos livres (tendo como referncia a quantidade inicial de cidos graxos livres do leo refinado de buriti), seriam necessrias mais 4 extraes sucessivas com etanol.

81

80 70 60 50 40 30 20 10 0 1 2

3500
Carotenides (ppm)

3000 2500 2000 1500 1000 500 0

leo Bruto

leo Bruto
leo Refinado

% AGL

leo Refinado

Figura 53 Avaliao de cidos graxos livres e carotenides durante o ps-processamento do leos bruto e refinado de buriti, onde (1) representa a finalizao do processo enzimtico; (2), a separao das fases orgnica e aquosa e (3), a desacidificao com etanol em 4 extraes sucessivas

4.4.2.2) Saponificao A saponificao foi realizada com solues aquosas e alcolicas 0,5 M de NaOH. A saponificao aquosa no obteve separao de fases em nenhum dos dois leos de buriti, gerando apenas sabo. A saponificao alcolica s obteve separao de fases com o leo refinado de buriti, j que o leo bruto se tornou uma fase homognea com a soda alcolica. A saponificao alcolica foi realizada por 2 vezes sucessivas no leo refinado, removendo mais de 90% dos cidos graxos livres, e tambm 35% dos carotenides presentes, alm da diminuio de 63% do volume da fase rica em carotenides. Apesar desses fatores, esta fase ainda manteve 1085 ppm de carotenides com uma grande alterao no seu perfil (Figura 54), se aproximando muito do perfil de carotenides encontrado no leo bruto, com 69% de -caroteno e 5% de apocarotenides.

Figura 54 Perfil de carotenides do leo refinado aps desacidificao com soda alcolica

82

4.4.2.3) Winterizao A winterizao foi realizada apenas no leo bruto, pois no leo refinado de buriti no ocorreu a formao de nenhum precipitado ao se resfriar a fase orgnica. Aps a winterizao do leo bruto, foram obtidas 2 fases: a primeira slida com 43% de cidos graxos livres e 3186 ppm de carotenides, enquanto a outra lquida obtendo 26% de cidos graxos livres e 3910 ppm de carotenides.

83

CAPTULO 5 CONCLUSO
A caracterizao do leo bruto e refinado de buriti se mostrou coerente com os dados referenciados na literatura. A presena de apocarotenides em quantidades elevadas no leo refinado de buriti confirma que o processo de refino promove a degradao de carotenides e a diminuio do seu valor nutricional. A pr-avaliao do processo enzimtico determinou os intervalos de alguns parmetros para o planejamento experimental, como temperatura (25 a 45C), relao leo/gua (1/1 a 3/1) e atividade enzimtica (1 a 50U) em um volume de mistura reacional de 8 mL. Alm disso, determinaram-se o tempo reacional (4 h), as lipases a serem utilizadas (lipase de Yarrowia lipolytica, Lipozyme TL IM e CALB L) e o uso da alumina em concentrao de 10% p/v como aditivo para aumentar a hidrlise enzimtica dos leos bruto e refinado de buriti. O planejamento experimental composto central determinou que tanto para hidrlise do leo bruto como do leo refinado de buriti a Lipozyme TL IM foi a enzima que gerou melhor rendimento em cidos graxos livres, com pequenas perdas em carotenides. Mas como os modelos obtidos neste planejamento obtiveram baixo ajuste aos dados experimentais, e tambm devido atividade enzimtica se demonstrar estatisticamente significativa, foram realizadas etapas adicionais de otimizao para avaliao da influncia de outras quantidades de Lipozyme TL IM, tempo reacional e agitao sobre a hidrlise. Com isso, concluiu-se que as condies timas para a hidrlise enzimtica dos leo de buriti so: bruto - 25U de atividade enzimtica, 2,33 de relao leo/gua e 31,2C de temperatura e refinado - 35U de atividade enzimtica, 1,8 de relao leo/gua e 45C de temperatura, mantendo o tempo reacional em 4 horas e alterando a velocidade de agitao para 300 rpm.

84

 Dos mtodos de desacidificao realizados, a utilizao de soluo etanlica 0,5M NaOH sobre a fase orgnica do leo refinado de buriti removeu 90% dos cidos graxos livres presentes, alm dos apocarotenides, permitindo um perfil de carotenides prximo ao do leo bruto de buriti. J para o leo bruto de buriti, a combinao dos mtodos de winterizao e partio com etanol parece ser a melhor alternativa para a desacidificao, pois a winterizao promove uma grande concentrao de carotenides e o etanol remove gradualmente os cidos graxos livres.

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CAPTULO 6 SUGESTES
No caso do leo refinado de buriti, poder-se-ia testar a remoo dos apocarotenides por processos com membranas, antes mesmo de se realizar a hidrlise enzimtica. O leo de palma tambm poderia ser utilizado como matria-prima para obteno de caroteno atravs de hidrlise enzimtica. A adio de leo vegetal em matrizes vegetais ricas em -caroteno, como a cenoura e a batata-doce; em licopeno, como o tomate e a melancia, ou ainda em xantofilas de interesse comercial, caso de lutena e zeaxantina para a extrao dos carotenides, seguida de uma posterior hidrlise enzimtica do leo vegetal poderia ser uma alternativa interessante, a ser investigada. Novas opes de processo, como: a combinao de duas lipases distintas, sendo que uma delas com maior atuao em faixa mais cida de pH; outros emulsificantes; outros adsorventes; maiores velocidades de agitao; e outras lipases, sendo estas originadas de microrganismos diferentes deveriam ser testadas visando o aumento no rendimento da hidrlise. Outros mtodos de desacidificao poderiam ser testados como a extrao supercrtica, a extrao por solventes utilizando outros lcoois de cadeia curta (metanol, propanol e butanol) puros, ou com concentraes variadas de gua. Diferentes concentraes de NaOH poderiam ser testadas para verificar a quantidade mnima de base para a remoo de cidos graxos livres e apocarotenides. A possibilidade de integrar os mtodos de winterizao e extrao com etanol para aumentar a eficincia do processo na remoo dos cidos graxos livres e na concentrao de -caroteno do leo bruto de buriti tambm poderia ser verificada. 86

 Mtodos mais focados na complexao ou na encapsulamento dos carotenides, invs da remoo dos cidos graxos, poderiam ser testados como a utilizao de ciclodextrinas e uria. A presena dos outros insaponificveis (fitoesteris e tocoferis) durante o processamento enzimtico e desacidificao, para verificar seu aproveitamento futuro, deveria ser analisada.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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GLOSSRIO
Cloroplasto: uma organela presente nas clulas das plantas e algas, rico em clorofila, responsvel pela sua cor verde, e onde a fotossntese realizada. Cromoplasto: uma organela presente nas clulas das plantas e algas, onde ocorre a biossntese de pigmentos. Distribuio t de Student: uma distribuio de probabilidades referente a inferncias de mdias de populaes normalmente distribudas, sendo a base para o popular teste t de Student onde se avalia a significncia estatstica da diferena entre 2 mdias amostrais, e tambm os intervalos de confiana da diferena entre 2 mdias populacionais (Morettin & Bussab, 2002). Endosperma: um tecido vegetal, que se encontra nas sementes de muitas angiospermas e acumula reservas nutritivas, como amido, protenas e leo, utilizadas pelo embrio durante seu desenvolvimento. Fitoesteris: alcois cristalinos, neutros e de alto ponto de fuso, sendo que os principais so -sitosterol, campesterol e estigmasterol (figura 55, Moreau et al, 2002).

Figura 55 Fitoesteris

Log P: logaritmo do coeficiente de partio da substncia de um sistema padro bifsico 1octanol/gua. Quanto maior o log P, mais apolar o solvente ou a mistura (Mojaat et al, 2007). Mecanismo Ping-Pong Bi Bi: mecanismo cintico de reaes com mltiplos produtos e substratos catalisadas por lipases, onde E enzima; Es, ster; Al, lcool; Ac, cido; W, gua; F, enzima em outro estado conformacional (Cunha, 2007)

Pericarpo: o tecido do fruto que envolve e protege a semente nas angiospermas, incluindo trs camadas: epicarpo (mais externa), mesocarpo (intermediria) e endocarpo (mais interna). Retinides: derivados de sntese de vitamina A, dentre eles retinal (figura 56), retinol e tretinona (Rucker et al, 2001). 101

Figura 56 Retinal

Significncia estatstica: a probabilidade mxima de se rejeitar acidentalmente uma hiptese nula (a ser testada) verdadeira. Spray-drying: um mtodo em que o material a ser seco passa por um tubo at um vaso vertical e cilindrico, onde pulverizado na forma de pequena gotas (dimetro em torno de 2 mm), e geralmente na direo contrria alimentado uma grande vazo de ar ou vapor quente com energia suficiente para completa vaporizao do lquido, em menos de 30 s (Perry & Green, 1999). Terebintina: o destilado obtido de resina de pinheiros, sendo geralmente composto de terpenos, principalmnete de -pineno e -pineno. Tococromanis: consistem principalmente de tocoferis (, , , ) e tocotrienis (, , , ), consistindo de um anel cromano e uma longa cadeia saturada fitil no caso de tocoferis, enquanto os tocotrienis tm uma cadeia com insaturaes. Os quatro ismeros (, , , ) diferem apenas no nmero e na posio dos grupos metila (figura 57, Gl-stndag & Temelli, 2004).

R1 = CH3, R2 = CH3 R1 = H, R2 = CH3 R1 = CH3, R2 = H R1 = H, R2 = H

Figura 57 - Tococromanis: (A) Tocoferis, (B) Tocotrienis

Torularodina: um dos carotenides produzidos pela levedura Rhodotorula glutinis, sendo um derivado carboxilado do toruleno (Figura 58).

Figura 58 Toruleno (R = CH3) e Torularodina (R = COOH)

Xeroftalmia: uma doena caracterizada pela no produo de lgrimas e por dificuldades de viso, principalmente durante a noite.

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APNDICE

Cintica de hidrlise enzimtica do leo bruto de buriti utilizando Lipozyme TL IM, onde os tubos esto na seguinte seqncia temporal: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8h

Cintica de hidrlise enzimtica do leo refinado de buriti utilizando Lipozyme TL IM, onde os tubos esto na seguinte seqncia temporal: 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6 e 8h (a) (b)

Antes (a) e depois (b) da winterizao

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