Tema 2

Procedimientos y mtodos de investigacin 1.-Proceso de ablacin experimental

1.1.-La lesin cerebral
La ablacin experimental consiste en destruir una parte del cerebro y observar a posteriori que efectos tiene sobre la conducta del organismo. in embargo! no se puede concluir en que un n"cleo cerebral es el encargado de una funcin por el simple #ec#o de que su lesin interfiera en dic#a funcin! pues ese n"cleo puede formar parte de un circuito $esto implicar%a que el n"cleo lesionado interviene en la transmisin del impulso nervioso procedente de otro n"cleo que es el verdadero encargado de producir una funcin&. '() si lesionamos el n"cleo geniculado lateral del t*lamo la visin se ver* per(udicada! pero no podemos concluir en que dic#o n"cleo es el encargado de la visin $al fin y al cabo tan solo es un n"cleo tal*mico de relevo&. Para no caer en el error expuesto anteriormente existen dos proicedimientos de lesin que se pueden emplear selectivamente. 'l primer procedimiento es la lesin estereot*xica consiste en introducir mediante ciru(%a estereot*xica una agu(a cuya punta produce una descarga electrica que genera una lesin. La lesin que este mtodo produce destruye tanto los somas como los axones que se #allan en la parte adyacente del electrodo! por lo que este mtodo! al lesionar los axones adyacentes podr%a da+ar los tractos y #acernos caer en el error anterior. 'l segundo procedimiento es la lesin excitoqu%mica! que consiste en inyectar un amino*cido excitador! que produce una excitacin de los cuerpos neuronales que acaba por inutili,arlos. La lesin excitotxica destruye el soma pero no los axones adyacentes! por lo que nos ayuda a no caer en el error. Tambin podemos equivocarnos al asumir que la lesin estereot*xica de un n"cleo causa un fallo en una funcin debido a que la introduccin del propio instrumento estereot*xico #asta el n"cleo a lesionar tambin provoca ciertos da+os. 'sto se soluciona empleando a otro animal de la misma especie e introduciendo el instrumento estereot*xico #asta el mismo n"cleo pero sin producir la lesin $falsa lesin&. 'l instrumento estereot*xico consiste en un aparato que fi(a la cabe,a del su(eto y que tiene una agu(a preparada para producir la lesin. Para llegar al n"cleo espec%fico que se desea lesionar se recurre a el atlas estereot*xico! que toma como referencia el punto llamado bregma $punto donde se cru,an la union sagital y coronal del craneo. 'n el instrumento se marcan las coordenadas tridimensionales compuestas por los tres e(es medial.lateral! dorsal-ventral y anterior-posterior.

1.2.-Tcnicas #istolgicas
Las tcnicas #istolgicas consisten en observar los cambios producidos en los te(idos cerebrales despues de la lesion! y se reali,an en casi todos los casos cuando el animal est* muerto $a excepcin de la microscopia confocal con laser&. 'n primer lugar se extrae el encfalo del animal y se trata con formol o otro fi(ador neural. 'l ob(etivo del formol es eliminar las en,imas encargadas de la autlisis $autodisolucin&! y evitar que tenga lugar la descomposicin de los te(idos. 'n segundo lugar se reali,a la perfusin! que consiste en sustituir la sangre de los vasos por otro tipo de sustancia! normalmente alguna solucin salina. -na ve, fi(ado el encfalo se secciona en l*minas. Para ello se emplea un micrtomo! que es un instrumento que permite cortar el encfalo en l*minas de entre 1. y /. micrometros de anc#o. 0uando las l*minas son para microscopio electrnico se cortan con un espesor inferior a 1 nanmetro. 1ic#as l*minas se ponen encima de una pl*nc#a portaob(etos t%picas de laboratorio.

-na ve, en el portaob(etos de vidrio! las l*minas pueden ser te+idas. 'xisten un montn de sustancias que pueden ser empleadas para la tincin de te(idos! pero la mas com"n es el violeta de cresilo. 'ste tinte fue descubierto por 2ran, 3issl! y funciona ad#erindose a cuerpos que se #allan en el n"cleo de las clulas $453! 413 y proteinas asociadas&. 'stos cuerpos son conocidos como sustancia de 3issl. 'l tinte permite la coloracin solo de los somas y no de los axones por lo que no se colorean los tractos propios de la sustancia blanca. Tambin #ay que tener en cuenta que el violeta de cresilo ti+e a todas las clulas y no solo a las neuronas $por tanto ti+e tambin a las glias&. -na ve, te+idas las l*minas de cerebro se reali,a la observacin microscpica. 'l microscopio ptico tiene poca reslucin por lo que para poder observar los detalles mas peque+os es necesario que se emplee el microscopio electrico. 'l microscopio electrico de transmisin funciona #aciendo que atraviese una corriente de electrones por la superficie de una l*mina de seso y se capta una foto o se escanea $proporciona una detallada imagen bidimensional&. 'l microscopio electrnico de barrido permite observar una detallada imagen tridimensional. 6ay otro tipo de microscopio conocido como microscopio confocal con laser que permite reali,ar observaciones de te(idos mas gruesos que con el microscopio electrnico y que incluso se puede observar te(idos de organismos en vida.

1.7.-8arcado de conexiones neuronales

'l procedimiento de marcado de conexiones neuronales busca detectar cuales son tanto las aferencias como las eferencias de la estructura cerebral lesionada. 'n el caso de la deteccin de las conexiones eferentes se emplean sustancias que son absorbidas por las dendritas y el soma de la neurona y que se extienden #asta el axn $la inyeccin de estas sustancias se reali,a mediante estereotaxia&. -na de estas sustancias se llama P64-L! y es producida por algunas legumbres. 1espues se emplean tcnicas inmunocitoqu%micas! que son tcnicas que sacan provec#o de las reacciones inmunolgicas para la tincin. 1espues se observa #asta donde llegan los axones eferentes. 'n cuanto a la detecccin de las conexiones aferentes se debe inyectar una sustancia llamada oro fluorado que es absorbido por el botn terminal y que via(a mediante transprte retrgrado #asta el soma neuronal. 1espues se emplean tambin tcnicas inmunocitoquimicas para la tincin. 6asta a#ora se #a descrito el mtodo de detectar las eferencias y aferencias monoaxnicas! pero existen mtodos para detectar los circuitos eferentes y aferentes que van en serie $marcado transneuronal&. 'n el caso del transporte retrgrado se emplea un virus de la seudorrabia $rabia del cerdo& que provoca que los axones se vayan contagiando los unos a los otros en serie #asta llegar al n"cleo del que proceden. 'n el caso del transporte antergrado se emplea un virus de la rabia simple que funciona de la misma manera pero en el sentido opuesto.

1.9.-'studio del encfalo #umano en vivo

'n la ablacin experimental #umana! la lesin se #a producido accidentalmente. Para el estudio de la lesin! a la gente no le gusta que le abran la cabe,a cuando est*n vivos $al menos a la normal& por lo que se pueden emplear tcnicas de visuali,acin no invasivas. La primera de estas tcnicas que se descubri fue la tomograf%a axial computeri,ada $T40&. 'sta emplea los rayos :. e introduce la cabe,a del su(eto en un c%rculo que emite por un lado rayox : y que por el otro lado recoge la cantidad de radioactividad que se transmite $llega menos radiactividad cuanta mas materia tiene que atravesar&. -n ordenado representa visualmente estos datos. ;tra tcnica es la resonancia magntica $58&. 'sta tcnica no emplea rayos :. 0onsiste en someter al cerebro a un campo magntico muy intenso lo que #ace que los nucleos de algunos *tmos de moleculas del organismo roten en una determinada direccin. 'n ese momento se pasa una onda de radiofrecuencia lo que #ace que dic#os *tomos emitan ondas de radio las cuales son detectadas por un dispositivo especiali,ado. Las im*genes de 58 tienen me(or resolucin que las del T40 y permiten distinguir la sustancia gris de la sustancia blanca. La resonancia magntica permite distinguir los #aces de fibra nerviosa si se emplea una peque+a

variante conocida como imagenes tensoriales de difusin $<T1&. 'stas imagenes se aprovec#an de que las molculas de agua giran de forma paralela a la direccin del #a, de sustancia blanca al que pertenecen.

2.-5egistro y estimulacin de la actividad neural

2.1.-5egistro de la actividad electrica neural
0onsiste en registrar la actividad elctrica de las neuronas del cerebro. Puede reali,arse un registro crnico $implantando un electrodo permanente al su(eto& o agudo $registrando la actividad electrica durante la anestesia del animal. e puede registrar la actividad de neuronal individuales implantando microelectrodos! que son extremadamente peque+os $lo suficiente como para poder conectarse solo a una neurona&. e implantan en el encfalo mediante ciru(%a estereot*xica y se conectan a un ,calo que se situar* en la cabe,a! ad#erida con cemento dental. 'l ,calo se conectar* al ordenador que representar* visualmente las ondas electricas. 1ebe tenerse en cuenta que dado que las se+ales de una sola neurona son muy dbiles estas deber*n ser amplificadas. Tambin se puede registrar la actividad elctrica de un grupo grande de neuronas mediante un macroelectrodo. 'stos suelen ser un alambre! un disco met*lico pegados sobre el cuero cabelludo! tornillos... La actividad neural de cada dispositivo implantado se representa o en un pol%grafo o en un ordenador. 0uando se registra en un pol%grafo u ordenador la actividad elctrica de todas las regiones del encfalo se #abla de electroencfalograma. Tambin se puede estudiar el campo magntico que genera la actividad neural. 0uando por un conductor atraviesa una corriente elctrica se genera un campo magntico. 'n la corriente neural no es una excepcin ! solo que se genera un campo magntico tan dbil que debe ser detectado mediante un dispositivo superconductor llamado =-<1.

2.2.-5egistro de la actividad metablica del cerebro

's evidente que las regiones encef*licas que #an sido activadas #an tenido que consumir nutrientes para poder abrir y cerrar los canales y bombas inicas que intervienen en la generacin de los potenciales de accin. 'l ob(etivo de estas tcnias es observar que ,onas se activan y cuales no lo #acen cuando tiene lugar una determinada conducta. La primera tcnica se llama autorradiograf%a. 'n ella se inyecta 2-desoxiglucosa $2-1>& en el torrente sanguineo para que alcance el encfalo y las neuronas que necesitan nutrientes. La 2-1> un compuesto radioactivo que es quimicamente muy similar a la glucosa! por lo que las neuronas activas la captan! pero tiene la peculiaridad de que las clulas no consiguen metaboli,arla! por lo que se queda almacenada dentro de la clula. 4s%! las clulas que mas 2-1> contengan son las clulas que #an intentado captar mas alimento por que #an tenido mas actividad. -na ve, inyectada la 2-1> se secciona el encfalo del su(eto y se corta en l*minas! y se #ace una autoradiograf%a $se llama autorradiograf%a por que la misma radiacin de la 2-1> es la que da la imagen sin necesidad de un aparato que emita rayos :&. Las ,onas de la autorradiograf%a mas oscuras son las que #an sido mas activadas. ;tro mtodo es la tomograf%a por emision de positrones $T'P&. e inyecta al su(eto 2-1>! que se dirige a las neuronas con mayor necesidad de alimento! y una ve, dentro de la neurona! la 2-1> se acaba descomponiendo con el tiempo y emite una part%cula subatmica denominada positrones. 'xiste un dispositivo que es capa, de detectar dic#os positrones y emitir una imagen. 'sta imagen es capa, de detectar las diferencias de concentracin de positrones! sin emgargo presenta la desventa(a de tener muy poca resolucin. La resonancia magntica funcional $582& sigue la misma lgica que la 58 pero los ingenieros #an dise+ado un sift?are que es capa, de detectar las concentraciones de ox%geno en los n"cleos de las

clulas. Teniendo en cuenta que las neuronas necesitan oxigeno para vivir! y que necesitan mas ox%geno cuanta mas actividad presenten podemos deducir el grado de actividad de las neuronas atendiendo a su concentracin. La 582 tiene una resolucin muy buena.

2.7.-'stimulacin de la actividad neural

2.7.1.-'stimulacin electrica y quimica
Las neuronas pueden estimularse electrica o quimicamente. Para estimularlas de forma elctrica se #ace pasar una corriente electrica a traves de las neuronas que se desea estudiar. Para estimular quimicamente a las neuronas deben introducirse sustancias excitadoras como el acido cainico o el *cido glut*mico $glutamato&. 1eben introducirse en dosis ba(as por que en dosis altas podr%an destruir las neuroas debido al eceso de excitacin $recuerdese las lesiones excitotxicas&. 'stas sustancias se introducen en el organismo a traves de una c*nula insertada en el craneo y su(etada con cemento dental. 'n el caso de la estimulacin elctrica! el electrodo estimula tanto los somas de las neuronas como los axones que pasan por la ,ona estimulada. in embargo! en la estimulacin qu%mica con glutamato! solo se excitan los somas y las dendritas neuronales por que solo en esas partes se #allan los receptores glutamatrgicos! por lo que es imposible que se exciten los axones que est*n alli de paso.

2.7.2.-2otoestimulacin
e #a descubierto que las membranas neuronales presentan ciertas proteinas que son sensibles a la lu,. Las dos principales son la 5odopsina-canal-2 $0#52& y la 3p65. La 0#52! cuando recibe lu, a,ul provoca la apertura de canales ionicos de 3a y 0a! y al abrirse estos canales entran iones de 3a y 0a cargados positivamente! lo que produce una despolari,acin y por tanto la activacin de la neurona. La 3p65! cuando recibe lu, a,ul! provoca la apertura de canales ionicos de 0l! por lo que entran iones de 0l cargados negativamente en la membrana produciendose una #iperpolari,acin y dificultando por tanto que se produ,can potenciales de accin. Por tanto! siguiendo estos principios se puede provocar la activacin o in#ibicin de las diferentes regiones cerebrales #aciendo que incida lu, sobre ellas! y de este modo estudiar como funcionan los circuitos cerebrales. 0uando la regin a fotoestimular se #alla en la corte,a se #ace un peque+o agu(ero en el craneo y se proyecta lu,. 0uando se #alla en partes profundas del cerebro se introduce mediante ciru(%a estereot*xica una fibra ptica y se proyecta lu,. 'l "ltimo mtodo de estimulacin neuronal $no se incluye en la fotoestimulacin& es el de estimulacin magntica transcraneal $'8T&. Para ello se utili,a una bobina electromagntica que estimula las neuronas de la corte,a cerebral . 'l campo magntico genera corrientes elctricas que pueden ser registradas.

9.-8todos neuroqu%micos
9.1.-Locali,acin de neuronas productoras de neuroquimicos espec%ficos
Para averiguar que neuronas producen una determinada sustancia neuroqu%mica $ya sea neurotransmisor o neuromodulador& pueden emplearse tres tcnicas) 1&1etectar el neuroqu%mico en cuestin dentro de las neuronas@ 2&1etectar la en,ima encargada de la produccin del neuroqu%mico@ 7&1etectar el 453 mensa(ero encargado de la sintesis de la en,ima. Para detectar en neuroqu%mico dentro de las neuronas es necesario que el neuroqu%mico sea un pptido $prote%na&. i es el caso se emplean mtodos inmunocitoqu%micos para que se ti+a la sustancia neuroqu%mica. 'n el caso de que la sustancia neuroqu%mica no sea un pptudo se puede intentar observar si las neuronas contienen en su interior la en,ima que se encarga de la s%ntesis del neuroqu%mico $para ello se debe saber que en,ima se encarga de sinteti,ar el neuroquimico -normalmente se sabe cual es-&. 'n

este caso tambin se emplean tcnicas inmunocitoqu%micas para te+ir la en,ima en cuestin. 'l tercer mtodo consiste en detectar la presencia de 453 mensa(ero $#ibridacin in situ&. 0uando se sinteti,a cualquier sustancia en una clula se reali,a una copia de una seccin de un cromosoma que contiene las caracter%sticas de la sustancia que se debe sinteti,ar! y est* copia $453 mensa(ero& se despla,a #asta los ribosomas! que es donde se sinteti,ar* la sustancia. 'l procedimiento consiste en introducir en la clula un fragmento de 453 radioactivo cuya ordenacin de nucletidos sea complementaria a la del fragmento de 453 mensa(ero encargado de la sintesis del neuroqu%mico. -na ve, reali,ado esto se reali,a una autorradiografia.

9.2.-Locali,acin de receptores de neuroqu%micos

e puede llevar a cabo mediante dos procedimientos. 'l primero de ellos consiste en exponer el te(ido cerebral que se quiere investigar al contacto con la sustancia neuroqu%mica $en este caso la sustancia debe ser radioactiva& para que se unan a sus receptores espec%ficos. -na ve, concluido este proceso se debe autorradiografiar la seccin cerebral expuesta! y aquellas neuronas que presenten ,onas blancas en la autorradiograf%a son aquellas en las que #ay receptores del neuroqu%mico. 'l segundo procedimiento consiste en emplear tcnicas inmunocitoqu%micas. 'sto puede reali,arse debido a que los receptores de los diferentes neuroqu%micos son prote%nas insertadas en la membrana neuronal y por tanto se pueden producir anticuerpos contra ellas.

A.-8todos genticos
Los mtodos genticos parten del supuesto de que la gentica tiene influencias en como nace y se desarrolla nuestro cerebro. -no de los mtodos genticos mas comunes es el estudio de gemelos. 'n el caso de los gemelos #omocigoticos! stos comparten el total del genoma y en el caso de los gemelos dicigticos comparten al menos el A.B del genoma. i dos gemelos $sean #omocigticos o dicigoticos& presentan el mismo trastorno se dice que son concordantes y si solo lo padece uno se dice que son discordantes. i es mas #abitual que se de concordancia en los gemelos #omocigticos que en los dicigtucos se concluye en que el trastorno tiene bases #ereditarias $e() la esqui,ofrenia&. ;tro procedimiento empleado en investigacin gentica #an sido los estudios sobre adopcin. e elige un su(eto que #aya crecido con padres no biolgicos y se comparan sus rasgos con los de sus padres biolgicos. >racias a estos estudios se puede estudiar la influencia del ambiente y la influencia de los genes. Tambin deben destacarse las mutaciones dirigidas. 'n este procedimiento se introducen en lanimales de laboratorio genes creados artificialmente que no producen ning"n en,ima productivo para el desarrollo celular. Tambin pueden introducirse genes que provocan una sobreproduccin de sustancias o una infraproduccin. 'l "ltimo procedimiento es el llamado oligonucletidos antisentido. 0onsiste en introducir fragmentos de 413 o 453 que tienen una organi,acin de nucletidos inversa al del fragmento de 453 mensa(ero que se desea anular. 's parecido al procedimiento de #ibridacin in situ.