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1. El color y los colorantes HEMATOLOGICOS 2. El color y las estructuras celulares 3. Problemas TECNICOS en las tinciones 4. Casos de morfologa
Qu es un COLOR? Es la longitud de onda del espectro de LUZ VISIBLE que absorbe y refleja un cuerpo Espectro de la luz visible: 380 nm........Violeta 780 nm..........Rojo
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Un cuerpo es BLANCO cuando refleja todas las longitudes de onda Un cuerpo NEGRO absorbe todas las longitudes de onda Un cuerpo ROJO absorbe todas las longitudes de onda menos las rojas
Qu es un COLORANTE? Un colorante es una sustancia con capacidad de transmitir un color a un sustrato Debe penetrar e interactuar con las estructuras moleculares de las clulas
HEMATIES PLAQUETAS 5
Durante la FIJACION se producen varios fenmenos: Se coagulan las protenas celulares conservando su arquitectura Pueden perderse algunas sustancias no esenciales para la interpretacin citomorfolgica; los alcoholes disuelven las grasas Las extensiones sanguneas se pueden fijar con calor seco, alcoholes, formaldehdo, acetona, etc. El mejor fijador para morfologa es el metanol (alcohol metlico)
CELULA PLASMATICA (LINFOCITO B): A LA IZQUIERDA IMAGEN AL MICROSCOPIO ELECTRONICO Y A LA DERECHA UN ESQUEMA DE LA MISMA
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MITOCONDRIAS
NUCLEO
APARATO DE GOLGI
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ATRACCION ELECTROSTATICA
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Directa: Se produce una unin electro polar entre colorante y sustrato Indirecta: El colorante necesita una pieza de unin intermedia, a la que se denomina mordiente
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El conjunto colorante + mordiente se denomina laca Ejemplo: Tanto la Hematoxilina como el Rojo Nuclear emplean el Aluminio como mordiente
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Coloracin regresiva
Partiendo del colorante muy concentrado, se enjuagan gradualmente las muestras (diferenciacin) hasta lograr la mejor visualizacin de determinadas estructuras celulares
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BASOFILO 21
cromforo
cromgeno
auxcromo
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Aninicos (-):
Nota: Actan como lugar de enganche al sustrato celular. Para ser activos deben hallarse como sales solubles (sdicas, potsicas, cloruros, sulfatos, etc)
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Los AUXOCROMOS CATIONICOS o bsicos (+) se salifican con los cidos (-) del sustrato:
BASOFILO
BASOFILIA
afinidad del sustrato celular [-] por colorantes bsicos [+]
BASOFILIA INTENSA EN EL CITOPLASMA DE 27 UN PLASMOCITO
Los AUXOCROMOS ANIONICOS o cidos (-) se salifican con las sustancias bsicas (+) contenidas en las estructuras celulares:
ACIDOFILIA
afinidad del sustrato celular [+] por colorantes cidos [-]
EOSINOFILO
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[+]/Cl-
[-]/Na+
BASOFILIA
CELULA
+
ACIDOFILIA
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Ejemplo: El eosinato de azul de metileno tie los ncleos de las clulas reaccionando con los cidos nucleicos (azul de metileno[+]) y con las nucleoprotenas (eosinato[-])
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Variando el pH del medio en el que interaccionan el colorante y los sustratos celulares, se puede modificar la afinidad y por tanto la coloracin final
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COLORANTES NEUTROS
Las protenas celulares contiene grupos aminos y grupos cidos: Cualquier protena a un pH inferior a su punto isoelctrico (PI) se carga [+], con lo que tendr mayor afinidad por los colorantes cidos [aninicos -]. Por el contrario, si elevamos el pH por encima de su PI se pondrn de manifiesto sus cargas [-], aumentando su avidez por los colorantes bsicos [catinicos +].
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HEMOGLOBINA: protena eritrocitaria rica en grupos cidos (-COO-) y amino (-NH2). La tincin de MGG proporciones varias coloraciones: = Sepia (beige claro), a pH 7 - 7.2 = Rosa a rojo, a pH 6.4 6.8 (til si policromasia) = Gris-azulada, a pH 7.2 7.6
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pH 6.8
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COLORANTES NEUTROS
Normalmente para teir extensiones de citologas sanguneas se emplean colorantes qumicamente neutros, con los que se obtiene una:
En 1.891, ROMANOVSKI emple una solucin acuosa de Azul de Metileno para teir una muestra de sangre con Plasmodios, en la que haban aparecido colonias de hongos despus de 3-4 meses. Sorprendido, observ que los ncleos de los polimorfo nucleares adquiran un tono rojo prpura, mientras el citoplasma permaneca ms o menos azulado.
TINCION NORMAL CON AZUL DE METILENO 36
AZUL DE METILENO
cromgeno
cromforo
N+
AZUL DE METILENO
AZUL-VIOLETA
-CH3
AZUR B
VIOLETA-ROJO
-CH3
AZUR A
ROJO OSCURO
-CH3
VIOLETA DE METILENO
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El azul de metileno y sus derivados aportan 3 colores principales: Rojo Azul Violeta
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TINCION PANCROMATICA
Una SOLUCION UNICA, compuesta por varios colorantes y sus derivados qumicos en solucin aportan toda una gama de colores
NEUTROFILIA 40
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Azur B (I)
Azur A (II)
Violeta de Metileno
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(*): Eosinato de Azul de Metileno (una molcula de Eosina unida a dos de Azul de Metileno) al 0.2-0.25% en metanol
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GIEMSA
NOTAS: La adicin de pequeas cantidades de GLICERINA a la solucin de Giemsa aumenta la ionizacin del colorante y su disponibilidad, y por otra parte disminuye la formacin de precipitados cuando la tincin es prolongada. Si adems se aade una gota de ACETONA (x 20 cc de sol. de Giemsa) se mejora la penetrabilidad del colorante, hecho muy til cuando existe una gran densidad celular 46
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Para COMUNICAR lo que vemos al microscopio debemos reconocer determinadas CARACTERISITCAS de las clulas teidas, e informar en trminos concretos que definan situaciones de normalidad o de anormalidad. Vamos a tratar a continuacin sobre la TERMINOLOGIA que debemos usar para expresar nuestros resultados
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(+): alcalino, carcter bsico, pH elevado (>7), catin (-): carcter cido, pH bajo (<7), anin 49
= GRANULOS EOSINOFILOS: su contenido fuertemente bsico atrae nicamente a colorantes cidos, como la eosina = VACUOLAS: cuando su contenido es graso puede ser disuelto por el alcohol usado como fijador, y aparecen como estructuras vacas
MONOCITO 52
BASOFILIA
La GRANULACION del basfilo (-COO-) tiene afinidad por los colorantes alcalinos (+). Igual ocurre en la basofilia difusa de las clulas plasmtica, ricas en ARN (-COO-)
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cromforo
cromgeno
auxcromo
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AZUL DE METILENO
cromgeno
cromforo
A veces se comenta errneamente que el Azul de Metileno produce metacromasia, y no es cierto. Se trata en realidad del fenmeno de AZUROFILIA, coloracin violeta-rojiza y no azul como sera de esperar, debida a la presencia de pequeas cantidades de derivados trimetilados del A.M., denominados Azur I (o Azur B).
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AZUROFILIA
La GRANULACION del mielocito neutrfilo es tpicamente azurfila, igual que la de algunos linfocitos
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EOSINA
cromgeno
COO-/Na+ auxcromo
ACIDOFILIA
Br O Br Br cromforo
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Na+/Oauxcromo
ACIDOFILIA
La GRANULACION del eosinfilo (protenas catinicas [+]) tiene avidez por los colorantes cidos [-](como la eosina)
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HIPOCROMIA
HIPERCROMIA
ANISOCROMIA
POLICROMASIA
Redondeado
Hendido
Lobulado
Linfocito
Linfocito hendido
Polimorfonuclear Neutrfilo
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Arrionado
Irregular
Bilobulado
Monocito
Monocito
Eosinfilo
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Centrado
Excntrico
Eritroblasto
Cl. Plasmtica
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Cromatina laxa
Cromatina densa
Blasto indiferenciado
Eritroblasto
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Un nuclolo
Dos nuclolos
>2 nuclolos
Mononucleosis Infecciosa
Blasto maligno
Blasto maligno
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INTENSAMENTE BASOFILO Es decir contiene sustancias con gran avidez por los colorantes bsicos. Y concretamente las clulas con gran actividad de sntesis poseen una gran basofilia debido a la presencia en el citoplasma de ARN, que contiene abundantes grupos fosfricos (PO3-).
PLASMOCITO
LINFOCITO ACTIVADO
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DE BASOFILIA MEDIA Como ocurre en los linfocitos ligeramente activados o en los promielocitos
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Bordes netos
Bordes irregulares
Linfocito
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Granulocito Eosinfilo
Granulocito Basfilo
Granulocito Neutrfilo
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PROBLEMAS TECNICOS
Vamos a revisar brevemente algunos defectos comunes en las tinciones de rutina que se realizan en los laboratorios de Hematologa
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Entre otros excesos se observa una sobre-tincin que impide reconocer las caractersticas de la cromatina de los ncleos
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T. PANCROMATICA CORRECTA
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LA GRANULACION ESPECIFICA DEL BASOFILO SE HA PERDIDO PARCIALMENTE. AL SER SU CONTENIDO SOLUBLE EN AGUA, UN EXCESO DE LAVADO LA HA ELIMINADO
LA GRANULACION SECUNDARIA DEL BASOFILO MUESTRA SU TIPICA COLORACION NEGRUZCA DEBIDO A LA AVIDEZ DE LA HEPARINA (ACIDO) POR EL AZUL DE METILENO (BASE) 84
En las tinciones que usamos, ya hemos comentado que el color se logra por una atraccin electrosttica, establecindose enlaces qumicos estables aunque no muy fuertes. Por ello un lavado excesivo, combinado o no con una cantidad insuficiente de solucin colorante, puede conducir a una decoloracin ms o menos intensa
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Limpieza de los portaobjetos Eter / Alcohol [1:1] pH del agua destilada: 7-7.2 Hervir o tamponar Secado de las extensiones Mnimo 2 horas; ptimo 24 h
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Sobrecarga de color: precipitados Glicerina Suciedad de fondo Lavar con A.D. Conservacin Cubrir con DPX
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CASOS DE MORFOLOGIA
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Fig. 1: Linfocito
Bordes Grnulos
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Fig. 2: Eosinfilo
Bordes Grnulos
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Fig. 3: Mielocito
Bordes Grnulos
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Bordes Grnulos
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Fig. 5: Linfocito
Bordes Grnulos
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Fig. 6: Basfilo
Bordes Grnulos
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Bordes Grnulos
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Fig. 8: Monocito
Bordes Grnulos
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Fig. 9: Blasto
Bordes Grnulos
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Bordes Grnulos
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