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INSTITUTO TECNOLOGICO DE COLIMA

INGENIERIA AMBIENTAL CARACTERISTICAS PARA LA IDENTIFICACION MICROBIANA: AISLAMIENTO, PURIFICACION, CLASIFICACION, IDENTIFICACION Y CONSERVACION.

Presentan: RAUL AYALA DE LA MORA DZOARA SAMANTHA BELLO MORALES EDITH ELIZABETH ROLON RICARDO LUIS FELIPE VENTURA MENDEZ

Materia: MICROBIOLOGIA

Maestro: Dr. FRANCISCO JAVIER DELGADO VIRGEN

Fecha: Villa de lvarez, Col., a 28 de Febrero del 2013.

INTRODUCCION Se entiende por identificacin microbiana al conjunto de tcnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un organismo. La identificacin de un MO es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de MO y del fin que se persigue en la identificacin. Los pasos a seguir para una perfecta identificacin bacteriana son: o o Obtener un cultivo puro Examen microscpico de clulas vivas y de frotis teido por coloracin Gram. Se determina as la forma y el Gram del microorganismo en estudio. Tambin es importante determinar la agrupacin y la presencia de esporas y otras caractersticas morfolgicas de inters. o Determinar las caractersticas nutricionales (en general se desprenden de los mtodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoauttrofos, fotohetertrofos,

quimioauttrofos, quimiohetertrofos. o Realizacin de pruebas primarias (Gram, morfologa, catalasa, oxidasa, OF, fermentacin de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad. o Realizacin de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependern del gnero o familia determinado. (ej: produccin de pigmentos, produccin de indol a partir de triptofano, produccin de coagulasa, de fenilalanina de aminasa, etc.) . MTODOS BASADOS EN CRITERIOS MORFOLGICOS: Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas a clasificar organismos. Bajo el microscopio pueden ser tan parecidos dificultndose su clasificacin, aun cuando la morfologa celular dice poco sobre las relaciones filogenticas, sigue siendo til para la identificacin bacteriana.Tambin se pueden identificar a travs, de las caractersticas macroscpicas, en funcin del tamao, altura de la colonia, forma, color, olor, textura y grado de adherencia al medio de cultivo. MTODOS BASADOS EN TINCIN DIFERENCIAL: Es posible sacar conclusiones en relacin con la morfologa examinando una lmina que fue sometida a un proceso de tincin. Estos criterios morfolgicos encabezan la primera etapa del proceso de identificacin la mayor parte de la bacterias teidas con Gram se pueden clasificar como Gram positivas y Gram negativas.

MTODOS BASADOS EN PRUEBAS BIOQUMICAS: Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la produccin de compuestos coloreados. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separase en dos especies diferentes con base a pruebas bioqumicas. DESARROLLO AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

AISLAMIENTO.-Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio de cultivo slido adecuado dispuesta en una placa de Petri.

Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao, consistencia, etc... Los tipos de bacterias presentes en la muestra original son visibles como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original. El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor nmero de estras posible. En las primeras estras aparecern colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estras finales debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie. La identificacin bacteriana y la caracterizacin completa solo son posibles tras el aislamiento de la bacteria y la obtencin de cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de los microorganismos presentes (en una muestra patolgica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el aislamiento es posible obtener la bacteria de inters en cultivo puro.

TECNICAS DE SIEMBRA POR ESTRIA EN PLACA 1. Prende el mechero Fisher para crear un rea estril y as evitar que se contamine los medios de cultivo. Coloca las placas en posicin invertida sobre la mesa de trabajo para que se facilite manipularlas mejor. 2. Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 3. Ahora, toma una placa con agar estril (donde vayas a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posicin ligeramente horizontal realiza las estras (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porcin pequea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca. 4. Esteriliza el asa de nuevo y djala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estras sembradas la primera vez y realiza sobre una porcin virgen del agar una segunda tanda de estras que no toque la primera. 5. Repetir exactamente la operacin descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estras, hasta completar 3 o 4. No hagas ms presin sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgar el agar. 6. Lleva a la incubadora y deja en posicin invertida 24 horas al trmino de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas. SEMBRADO POR ESTRAS EN TUBO INCLINADO 1. Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2. Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del mechero retira el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular y flamea la boca del tubo. 3. Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y empezando en el rea del fondo del agar realiza una estra hacia fuera hasta terminar en la punta del agar. Retira el asa. 4. Flamea la boca del tubo de nuevo y coloca el tapn de algodn bien firme. Esteriliza el asa y djala enfriar. 5. Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la siembra.

SEMBRADO POR AGITACIN EN CALDO 1. Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera.

2. Ahora toma el tubo con el caldo estril y cerca del mechero retira el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular, flamea la boca del tubo. 3. Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y por agitacin dentro del caldo, siembra el inculo. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapn de algodn firmemente. Esteriliza el asa y djala enfriar. 4. Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la siembra. SEMBRADO EN PICADURA EN TUBO VERTICAL 1. Esteriliza el filamento de la aguja de inoculacin y toma la parte de la caja depetri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera quese enfre la aguja de inoculacin y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2. Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el tapn de algodn ayudndote con los dedos meique y anular, flamea la boca del tubo. 3. Introduce la aguja con el inculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en el centro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja de inoculacin en la misma direccin de la siembra. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapn de algodn firmemente. Esteriliza el asa y djala enfriar. 4. Lleva a incubar y observa las caractersticas del desarrollo a las 24 o 48 horas despus de la siembra. Se ha desarrollado una serie de tcnicas microbiolgicas para aislar microorganismos y obtener cultivos puros, ellos son: Siembra en placas de Petri por rayado Siembra en placa vertida Disoluciones en serie.

LA SIEMBRA EN PLACAS DE PETRI POR RAYADO Esta tcnica se basa en la separacin de los microorganismos al dispersar por rayado sobre agar una muestra que los contiene. Para llevar acabo la disgregacin, se recoge una porcin de la muestra con un asa bacteriolgica y se raya sobre una seccin de una placa de Petri; Luego se repite el rayado en tres secciones ms de la placa. En cada rayado, se toma la muestra de la seccin anterior, por lo que se logra una disminucin gradual en la cantidad de microorganismos. Los microorganismos dispersos en la placa se incuban a la temperatura y el tiempo recomendados; al crecer, formaran colonias separadas unas de otras en algunas de las secciones del rayado. En este paso cada punto

representa una colonia. Posteriormente, se toma una muestra de una de las colonias separadas y se repite el procedimiento, con la finalidad de confirmar la presencia de un solo tipo de microorganismos. LA SIEMBRA EN PLACA VERTIDA. En esta tcnica se hacen crecer los microorganismos en tubos, cada uno con una concentracin diferente, y se vala el tubo en el que las colonias crecieron en forma separada. Como primer paso, se preparan suspensiones de la muestra en diversas disoluciones y se coloca cada una en un tubo con agar fundido. Luego, se vierte la mezcla homogneamente el contenido (el agar y el inculo) de cada tubo y se vierte (no se siembra por rayado) en una placa de Petri. Se incuba cada placa, a la temperatura y el tiempo recomendados, y se selecciona la dilucin en la que se haya obtenido una mayor separacin de las colonias. Por ultimo, de esta dilucin, se toma una muestra de una de las colonias y se siembra en una placa de Petri, por rayado, para confirmar si el cultivo est puro. La confirmacin de pureza se puede realizar por observacin a simple vista (colonias de igual morfologa), por observacin microscpica o mediante pruebas bioqumicas. DILUCIONES EN SERIE. Esta tcnica se aplica cuando se conoce de antemano que el microorganismo de inters se encuentra en mayor cantidad que los dems. Para llevarla a cabo, se preparan varias diluciones de la muestra y se incuban en el medio de cultivo adecuado para que crezca este microorganismo; as, se logra que en alguna de las diluciones solo l aparezca. Es necesario confirmar su presencia, utilizando el mtodo de siembra en placa de Petri por rayado.

CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO. En ocasiones es necesario utilizar un cultivo de enriquecimiento porque las bacterias presentes en pequea cantidad pueden no detectarse, en especial si hay otras bacterias presentes en cantidades mucho mayores. Esto sucede con frecuencia en muestras de suelo o materia fecal. El medio (medio de enriquecimiento) para un cultivo de enriquecimiento suele ser liquido y proporciona nutrientes y condiciones ambientales que favorecen el desarrollo de un microbio particular pero no de otros. En este sentido tambin es un medio selectivo pero esta destinado a aumentar las cantidades muy pequeas del microorganismo deseado hasta niveles detectables. Supngase que se desea aislar de una muestra de suelo un microorganismo que puede crecer en presencia de fenol y que se encuentra presente en cantidades mucho ms pequeas que otras especies. Si la muestra del suelo se coloca en un medio de enriquecimiento liquido en el que el fenol es la nica fuente de carbono y energa, los microorganismos que no puedan metabolizar el fenol no se desarrollaran. El medio de cultivo se incuba durante algunos das y luego se transfiere una alcuota pequea a otro recipiente con el mismo medio. Tras una serie de pasajes la poblacin sobreviviente estar constituida por bacterias capases de metabolizar el fenol. Entre estos pasajes se deja transcurrir cierto tiempo para que las bacterias se desarrollen en el medio; este es el estadio de enriquecimiento. Los nutrientes del inoculo original se diluyen rpidamente con los sucesivos pasajes. Cuando la ltima dilucin se siembre en un medio solido de la misma composicin solo se desarrollaran colonias de microorganismos capaces de utilizar el fenol. Un aspecto destacable de esta tcnica particular es que el fenol resulta letal para la mayora de las bacterias. AISLAMIENTO DE HONGOS La siembra se realiza con el fin de aislar o repicar los hongos para su uso inmediato o para mantenerlos viables por un tiempo corto. La siembra o aislamiento en cultivo puro consiste en dejar crecer el hongo elegido bajo condiciones en las que pueda desarrollar y esporular convenientemente. Para ello es necesario verter el medio de cultivo, dejarlo enfriar, acidificarlo si fuera necesario y colocar una pizca del hongo a sembrar. Se realiza por medio de una aguja o de un ansa, ya sea por un simple toque o por rayado continuo. Generalmente para la siembra se usan placas, tubos y frascos. Despus de la siembra se sellan las placas, tubos y frascos, se coloca la fecha y se incuba durante el tiempo conveniente hasta que se vea que el hongo ha crecido y est esporulando. CLASIFICACION E IDENTIFICACION

TEMPERATURAS CARDINAES: para cada microorganismo existe una temperatura minima por debajo de la cual no es posible el crecimiento, una temperatura optima a la que se produce el crecimiento ms rpido, y una temperatura mxima por encima de la cual no es posible el crecimiento. CLASIFICACION SEGN LA TEMPERATURA PSICROFILOS. Con temperaturas optimas bajas (menor a 15).

MESOFILOS.- con temperaturas optimas moderadas (20C a 40C). Se encuentran en animales de sangre caliente y en medios acuticos y terrestres de latitudes templadas y tropicales. TERMOFILOS.- con altas temperaturas optimas (40C a 70C) HIPERTERMOFILAS. Con temperaturas optimas muy elevadas (mayores de 70C). Son tpicos de ambientes concretos extremadamente calientes como fuentes termales, giser y fuentes hidrotermales submarinas. CLASIFICACION DEACUERDO A SU pH. ACIDOFILOS.- organismos que crecen mejor bajo pH (por debajo de 2). Ejemplo el Thiobacillus, sulfulobus, thermoplasma y ferroplasma. ALCALOFILOS.- presentan un pH ptimo de crecimiento muy elevado, a veces tan alto como pH 10. Se encuentran por lo general en hbitat muy bsico como lagos sdicos y suelos muy carbonatados NEUTROFILOS.- microorganismos cuyo pH optimo para el crecimiento esta entres 6 y 8. CLASIFICACION DEACUERDO A SU CONCENTRACION DE AGUA. HALOFILOS.- los microorganismos marinos generalmente tienen una dependencia especfica del ion sodio, adems de tener un crecimiento optimo al valor de actividad de agua propia del agua de mar. El crecimiento de los halfilos requiere almenos algo de NaCl, pero el optimo varia con el organismo; asi, se usan los trminos halfilos discretos (1-6%), y halfilos moderados (6- 15%) y los halfilos extremos (15-30%) IDENTIFICACION POR TINCIONES El mtodo de GRAM es, sin duda, el ms importante de estos mtodos especiales de tincin. Se trata de un procedimiento de coloracin diferencial, que tie unas bacterias de color purpura original, mientras otras toman el color del contracolorante, generalmente rosado. Las primeras se denominan Grampositivas, y las segundas Gram-negativas. Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la clula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% - 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano Los colorantes son compuestos orgnicos y cada colorante empleado tiene una afinidad particular por sustancias celulares especficas. Por ejemplo, muchos de los colorantes comnmente usados estn cargados positivamente (Catinicos) y se combinan fuertemente con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Como ejemplos de los

colorantes catinicos tenemos el azul de metileno, el cristal violeta, y la safranina. Otros (por ejemplo, la eosina, la fucsina acida, el rojo congo) estn cargados negativamente y se combinan con constituyentes cargados positivamente, como numerosas protenas. Entre las sustancias empleadas para la tincin negativa tenemos la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbn coloidal) y nigrosina (colorante negro insoluble en agua). El procedimiento clsico de la coloracin de Gram incluye la fijacin del material, ya sea por calor en la llama del mechero o por accin del alcohol. Luego de la fijacin, el primer paso de la coloracin de Gram es la aplicacin del cristal violeta; a continuacin se agrega como mordiente la solucin de yodo de Gram que fija qumicamente el colorante alcalino a la pared bacteriana. La etapa de decoloracin permite distinguir los grmenes Gram positivos de los Gram negativos. Es probable que por el mayor contenido en lpidos de las paredes celulares de las bacterias Gram negativas, el alcohol o la acetona aumenten la permeabilidad de la pared y el colorante sea eliminado. Adems, la presencia de un mayor nmero de residuos de cido teicoco con uniones cruzadas en las bacterias Gram positivas es posible que aumente la fijacin del cristal violeta. Los microorganismos Gram positivos que han perdido la integridad de su pared celular debido a un tratamiento con antibiticos, envejecimiento o accin de enzimas auto lticas tambin permiten el escape del cristal violeta en la etapa de la decoloracin. A esta altura de la coloracin, los organismos Gram positivos retienen el cristal violeta mientras que las Gram negativas permanecen sin teir. El agregado de un colorante de contraste como safranina teir a estos microorganismos y clulas (leucocitos y eritrocitos) de un color rosado o rojo. Las levaduras tambin son Gram positivas, aunque el micelio de los hongos toma la coloracin de Gram en forma variable. PROCEDIMIENTO PARA TINCIONES GRAM 1. Sobre un portaobjetos limpio y seco, se coloca una gota de solucin salina fisiolgica o una gota de agua. 2. Se esteriliza el filamento del asa de siembra a la llama del mechero y se deja enfriar. Se toma una pequea cantidad de un cultivo bacteriano y se resuspende en la gota de agua o solucin salina del portaobjetos. Tambin puede ser utilizada una aguja de inoculacin estril para tomar la muestra bacteriana. 3. Se deja secar al aire y luego se fija a la llama del mechero, pasndolo de 4 a 5veces sobre esta; teniendo cuidado de no calentar demasiado pues el portaobjetos puede romperse (no es vidrio pyrex).Tener cuidado al fijar el frotis para evitar quemaduras. 4. Tambin se pueden realizar frotis del material directo de las muestras clnicas (exudados farngeos, heridas). Se hace rodar el hisopo con que se tom la muestra sobre el portaobjetos limpio y se fija con calor para proceder a la tincin. 5. Cubrir el frotis bacteriano con cristal violeta durante 1 minuto. Enjuagar con agua. 6. Aplicar el yodo Gram y dejarlo reaccionar durante 1 minuto. Escurrir. 7. Ahora, decolorar con la solucin de alcohol-acetona, agregando gota a gota en el portaobjetos inclinado sobre el fregador (o tarja), hasta que deje de salir colorante. Enjuague. 8. Finalmente cubrir el frotis con la solucin de safranina y dejarla actuar durante1 minuto. Lavar el exceso de colorante y dejar secar al aire. 9. Coloca aceite de inmersin al frotis seco y teido para observarlo al microscopio, con el objetivo de 100X MORFOLOGIA BACTERIANA: A las bacterias de forma esfrica u ovoide se les denomina cocos. A las bacterias con forma cilndrica se les denomina bacilos. Algunos bacilos se curvan con forma de espiral, y se les llama entonces espirillos. Las clulas de muchos procariotas se mantienen juntas despus de la divisin celular formando grupos, y estas asociaciones frecuentemente son caractersticas de diferentes organismos.

Por ejemplo: algunos cocos o bacilos pueden formar largas cadenas. En otras ocasiones, los cocos pueden formar finas capas de clulas, estructuras tridimensionales cubicas o agrupaciones irregulares. Varios grupos de bacterias pueden ser inmediatamente reconocidas, gracias a sus formas peculiares. Por ejemplo, las espiroquetas, que son bacterias con forma de sacacorchos, las bacterias con apndices, que presentan protuberancias celulares en forma de largos tubos o tallos, o las bacterias filamentosas, que forman clulas largas y delgadas o cadenas de clulas. Segn su forma, agrupamientos celulares, capacidad para formar esporas y reaccin algunos colorantes especiales, se han dado a las bacterias ms comunes nombres carentes de base cientfica. Se denominan cocos a todas las bacterias de forma redondeada; son casi invariables inmviles y no esporulados. Con una sola excepcin (mas adelante se mencionara) son todas GRAM-POSITIVOS, en cultivos jvenes. Basndose en su agrupamiento celular se designan algunos cocos con nombres mas definidos. Diplococos: cocos Gram-positivos en forma de lanza, agrupados en parejas. Neisseria: cocos apareados, Gram-negativos en forma de habichuelas. Cuando los diplococos son Gram-positivos se renen en grupos, forman cadenas con los estreptococos, mientras que las Neisserias pueden formas paquetes pero nunca cadenas. Estreptococos: cocos en cadenas Tetracocos: cocos reunidos en cocos de cuatro elementos. Sarcinas: cocos en paquetes cbicos regulares. Micrococos: cocos en masas racemosas irregulares. El termino estrafilococo es sinnimo. Espirilos bastoncillos espirales: son helicoidales y no ondulados. Son mviles pero carecen de esporas. Bacilos son bastoncillos rectos: Los bacilos pueden tener o no tener esporas y ser mviles o inmviles. Los que forman esporas son generalmente Gram (+) en estado vegetativo. Las especies no esporuladas mas frecuentemente son bacilos Gram (-). Debido a la gran cantidad de variantes en este grupo, el termino bacilo debe siempre calificarse con adjetivos apropiados, por ejemplo; bacilo esporulado Gram (+); bacilo no esporulado Gram (-), inmvil. Corinebacterias: bastoncillos Gram (+) con granulos o barras. Pertenecen a este grupo los bacilos diftericos, denominndose difteroides o pseudodiftericos, otros de morfologa similar.

Todos estos microorganismo son inmviles y carecen de endosporas, y se les incluye en este grupo, por que tienden a formas filamentos, y otros cuerpos, llamados conidias, semejantes a las esporas de los hongos tabicados. Sin embargo, los filamentos son mucho ms finos que las hifas de los hongos, y los cuerpos esporuloides no son verdaderas esporas. Los tres tipos ms importantes son: Actinomicetos: compuestos de filamentos finos ramificados que se fragmentan en bastoncillos cortos. Estreptomicetos: compuestos de filamentos finos ramificados provistos de cadenas conidias. Micobacterias: bastoncillos acido-resistentes. En este tipo es rara la formacin de ramificaciones y conidias. Debido a la capsula crea que envuelve a las clulas, estos microorganismo toman los colorantes con dificultad, pero una vez teidos, no es fcil decolorarlos por tratamiento con cidos. Espiroquetas: son formas espirales mviles que difieren de los espirilos por ser flexuosos, mas difcil de teir y cultivar. Treponemas: son clulas enrolladas que forman espirales regulares.

TRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN MEDIO SLIDO

MORFOLOGIA COLONIAL DE LAS BACTERIAS El crecimiento bacteriano en una superficie slida presenta caractersticas de cultivo llamadas: morfologa colonial. Una colonia se define como una masa visible de microorganismos, todos originados de una slo clula madre, de manera que una colonia constituye clones de bacterias, todas genticamente similares. Los siguientes adjetivos pueden usarse para describir la morfologa colonial o caractersticas de cultivo: 1) Tamao: medido en milmetros; menos de 1mm = puntiforme 2) Forma: Circula, Irregular, Filamentosa, Rhizoide y Ondulada 3) Margen: (la forma del contorno de la colonia): Entero, Ondulada, Lobada, Irregular, Concntrica, Arrugado, Circular irradiado, Filamentoso (filiforme), Ciliado. 4) Propiedades pticas: Opaca, Translcida y Transparente y Brillante (mucoide). 5) Elevacin: Elevada, Convexa, Plana, Gotiforme (forma de gota), Umbonada, Crateriforme. Colonias de bajo crecimiento. 6) Textura: Suave, Granular, Tenaz, Mucoide. 7) Pigmento: Hialino a colores blanquesinos, y de amarillos a rojos.

MORFOLOGIA DE HONGOS Los hongos pueden crecer como mohos o como levaduras. Algunas especies son dimrficas, es decir a temperatura de 37 C (temperatura corporal) son capaces de crecer como levaduras, y a 25C (temperatura ambiente) se desarrollan como mohos.

MOHOS Microscpicamente. Los mohos son organismos multicelulares, forman tbulos cilndricos y ramificados denominados hifas, poseen un dimetro de 2 a 10 m y crecen por extensin en longitud desde el extremo de un filamento, as se forma una masa de hifas entrelazadas denominada micelio. En algunas especies de hongos las hifas estn divididas en clulas por tabiques o septos que se forman con intervalos regulares durante el crecimiento filamentoso; cada tabique posee un poro septal que permite la continuidad citoplasmtica entre una clula y otra del filamento. Otros especies carecen de tabiques septales por lo que se denominan hongos cenocticos. En estas condiciones las hifas que penetran en el sustrato cumplen funciones de sostn y de absorcin de nutrientes por lo que se denominan hifas vegetativas o de sustrato. Los filamentos del micelio que se proyectan por encima de la superficie del sustrato hacia el aire, constituyen hifas areas o reproductoras ya que contienen las estructuras reproductoras del hongo llamadas conidias o esporas. Macroscpicamente. Los mohos se desarrollan en el laboratorio sobre la superficie de sustratos o medios de cultivo, formando colonias areas, de aspecto algodonoso, vellosas o pulvurulentas y de color variable. LEVADURAS Microscpicamente. Las levaduras son organismos unicelulares, de forma esfrica o elipsoidal, y tamao variable de 3 a 15 m de dimetro. Macroscpicamente. Las levaduras crecen en los medios de cultivo slidos formando colonias opacas, de aspecto pastoso, color cremoso aunque algunas especies son caractersticamente pigmentadas.

IDENIFICACION POR PRUEBAS BIOQUIMICAS CATALASA

Prueba en portaobjetos: 1. Con una aguja de puncin o un aplicador de madera con la punta aguzada transferir clulas del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un portaobjetos. 2. Aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3% (diluir la solucin al 30%con agua destilada). Se recomienda no aadir el organismo al reactivo (invirtiendo el orden), especialmente si se utilizan agujas o asas que contienen hiero, ya que se pueden producir resultados falsos positivos. Prueba en tubos o placas de agar: 1. Diluir 1:10 el perxido de hidrgeno al 30% en agua destilada para obtener una solucin al 3%. 2. Aadir unas gotas (aproximadamente 1 ml) del perxido de hidrgeno al 3%directamente sobre la superficie del desarrollo de una placa o pico de agar. INTERPRETACIN: La rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una reaccin positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el perxido de hidrgeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 a 30segundos no se consideran una prueba positiva. COAGULASA Prueba en portaobjetos (coagulasa fija): 1. Coloca una gota de agua destilada o solucin salina fisiolgica estril sobre un portaobjetos. 2. Emulsionar suavemente una suspensin del organismo en estudio en la gota de agua utilizando un asa o una varilla. 3. Coloca una gota del plasma junto a la gota de la suspensin bacteriana. Mezclarlas bien. 4. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. INTERPRETACIN: Una reaccin positiva se detecta usualmente en 15 a 20segundos por la aparicin de un precipitado granular o la formacin de grumos blancos. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en 2 o 3minutos. Esta prueba solo se considera presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de S. aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba en portaobjetos. Prueba en tubos (coagulasa libre): 1. Colocar aspticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo estril. 2. Aadir 0.5 ml de un cultivo puro de 18 a 24 horas en caldo del organismo por investigar (caldo BHI). 3. Mezclar por rotacin suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.

4. Colocar el tubo en un bao de agua a 37C. Observar la formacin de un coagulo visible. INTERPRETACIN: La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visible dentro del tubo. La reaccin se observa mejor inclinando el tubo. Si es positiva, el coagulo o gel permanece en el fondo del tubo. Las bacterias fuertemente coagulasa positivas pueden producir un coagulo en 1 a4 horas; por lo tanto, se recomienda observar el tubo a intervalos de 30 minutos durante las primeras 4 horas de la prueba. Algunas cepas de S. aureus pueden formar fuertes fibrinolisinas que disuelven el coagulo recin formado. Por consiguiente, pruebas positivas pueden pasar inadvertidas si no se observa el tubo a intervalos frecuentes. Otras cepas de S. aureus pueden producir slo suficiente coagulasa como para dar una reaccin positiva tarda luego de 18 a 24horas de incubacin; por lo tanto, todas las pruebas negativas a las 4 horas, deben observarse despus de las 18 a 24 horas de incubacin. INDOL Es un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cidopirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos, siendo especialmente til para diferenciar Escherichia coli (positiva) de miembros del grupo Klebsiella- Enterobacter (la mayora negativos).La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovac y ehrlich. Se debe utilizar un medio rico en triptfano. En la prctica se emplean medios combinados tales como sulfuro-indol-movilidad (SIM), movilidad-indol-ornitina (MIO) o indol-nitrato. Prueba de Indol 1. Inocular caldo triptfano (u otro medio con indol) con el organismo en estudio e incubar a 3537C. 2. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. Si se emplea reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por la adicin de 1 ml de cloroformo. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac. INTERPRETACIN: El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo (o en la capa de cloroformo) segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva PRUEBA DEL ROJO DE METILO Es cuantitativa para la produccin de cido y requiere organismos positivos que produzcan cidos fuertes (lctico, actico, frmico) a partir de glucosa, por la va de la fermentacin cida mixta. Dado que son muchas las especies de Enterobacterias que pueden producir cantidades suficientes de cidos fuertes detectables con el indicador rojo de metilo durante la fase inicial de la incubacin, slo se

consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que pueden mantener este pH bajo luego de una incubacin prolongada (48 a 72 horas), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. PRUEBA DEL CITRATO 1. Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario e inocularla en una sola estra en el pico de agar citrato de Simmons. Incubar a 35C durante 24 a 48 horas. INTERPRETACIN: El desarrollo de un color azul intenso en 24 a 48 horas indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formacin de productos alcalinos. PRUEBA DE LACTOSA Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminacin fecal en anlisis, sobre todo, de aguas. En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacin de gas a 35C en 48 horas". No se trata de un grupo taxonmico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayora de ellas de origen intestinal. Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentacin de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar McConkey, ya que este medio, adems de selectivo frente a bacterias no entricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro). En agar McConkey las bacterias Gram positivas ven inhibido su crecimiento debido a la presencia de sales biliares y cristal violeta y slo crecern las enterobacterias, pero entre ellas las que fermenten la lactosa (coliformes) liberarn productos cidos que producirn un cambio de pH que se detectar gracias al rojo neutro. Las colonias lactosa (+) aparecern de color rojo o violeta contrastando con la coloracin amarillenta de las colonias lactosa (-). CONSERVACION

CONGELACION La congelacin bacteriana es un mtodo fsico qumico que permite conservar microorganismos viables por un tiempo sin sufrir cambios genotpicos. En este proceso se involucra el agua como microambiente y es ella la que cambia su estado de lquido a slido; de otro lado, la bacteria inmersa en este medio debe adaptarse a las condiciones de este nuevo ambiente, transformar la velocidad de su metabolismo, conservar su viabilidad y evitar que los cristales de hielo formados por el cambio de temperatura del agua le ocasione algn dao.

Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centgrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las clulas de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las clulas as conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y adems existe el peligro de que algn fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento. Tambin resulta ser el mtodo ms molesto para realizar el envo de las cepas. Las clulas congeladas, preparadas adecuadamente pueden permanecer viables durante mucho tiempo (al menos varias dcadas) Cuando se enfra rpidamente un alimento muchas de las bacterias mesfilas que normalmente resistiran la temperatura de refrigeracin, mueren como consecuencia del choque de fro. Esto es ms frecuente en Gram-negativas que en Gram-positivas. La congelacin detiene el crecimiento de todos los microorganismos. Los superiores (hongos, levaduras, helmintos) son ms sensibles que las bacterias y mueren. . Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las clulas conservadas por este mtodo son los siguientes: 1. Edad de las clulas: En la mayora de los casos conviene utilizar clulas maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algn estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. 2. Velocidad en la congelacin y descongelacin: Aunque hay programas de congelacin bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rpidas, tanto para la congelacin como para la descongelacin, por lo que para descongelar conviene poner las clulas a 37C. 3. Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo ms baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las clulas microbianas, sumergidos en nitrgeno lquido, que tiene una temperatura de -195C, o bien en la fase gaseosa del nitrgeno lquido, con una temperatura de -140C. 4. Empleo de agentes crioprotectores: Estas sustancias protegen del dao que se pueda producir en las clulas microbianas en el momento de la congelacin. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con ms frecuencia es el glicerol, a una concentracin del 15 al 20%. Tambin se pueden utilizar el dimetilsulfxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su eleccin influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar.

LIOFILIZACION Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este mtodo, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilizacin, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad gentica es alta, pero a veces no tanto como en la congelacin, porque la liofilizacin se consigue por sublimacin del hielo de las clulas. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las clulas y despus eliminarla mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabara afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que hay muchos modelos en el mercado. Las clulas microbianas as conservadas se someten a un tratamiento ms complejo que en el caso de la congelacin, pues la liofilizacin se hace en dos etapas y se aade la sublimacin del agua a la congelacin previa. Sin embargo, este es un mtodo muy recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envo de las cepas, pues una vez conseguidos los lifilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18C-20C), con lo cual su envo es muy cmodo. Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilizacin son los mismos que influyen en la congelacin, a los que habr que aadir otros que surgen como consecuencia de la deshidratacin. Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la liofilizacin como medio de conservacin son: 1. Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilizacin y lgicamente sern aquellos que contengan ms agua en su interior. Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros mtodos. 2. Concentracin celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con una concentracin del orden de 108-109 clulas/ml en el caso de las bacterias y algo inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras. 3. Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima de 50C. 4. Grado de deshidratacin alcanzado. Debe ser lo ms alto posible, aunque la concentracin de solutos puede conllevar una pequea cantidad de agua remanente que no es perjudicial. 5. Atmsfera de oxgeno en el tubo. Las clulas liofilizadas se guardan en tubos cerrados al vaco para evitar, tanto la rehidratacin como la presencia de algn gas dentro del tubo, como el oxgeno que puede daar a las clulas. 6. Condiciones de almacenamiento. La temperatura debe ser constante, preferentemente a 18C y sin bajar de los 0C. Los lifilos se deben guardar en la oscuridad.

CONSERVACION POR SUSPENSIN EN AGUA DESTILADA O EN AGUA DE MAR ESTERIL Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estril unas cuantas clulas del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentracin celular no debe ser superior a 104-105 clulas/ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensin trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensin se hace en agua de mar diluida. La estabilidad para caracteres morfolgicos y fisiolgicos es buena, pero no se ha comprobado para caracteres especficos como la virulencia, el poder fermentativo, etc.

CONCLUSION Es frecuente encontrar que una tcnica de preservacin resulte ms efectiva para un grupo microbiano que para otro, eso depender de las caractersticas fenotpicas y genotipicas especiales que cada uno de ellos posee. A pesar de que cada MO en ocasiones suele parecerse ya sea, en forma, tamao o tipo de tincin sabemos que a travs de diferentes tipos de pruebas podemos identificarlos. Por otra parte gracias a la morfologa de las colonias de bacterias se pueden conocer el tipo de bacterias que se estn cultivado, ya que, todas son originadas de una sola clula madre, de manera que una colonia constituye clones de bacterias. Tambin podemos agregar que en cualquier tipo de ambiente se encuentran microorganismos con caractersticas especiales que solo ellos poseen, y dependiendo de la temperatura podemos determinar que MO puede tratarse. Otra cosa importante es que gracias a la conservacin de los MO hoy en da podemos guardarlos por unos cuantos aos, alargando as su tiempo de vida, sin afectar su estructura, ni sus caractersticas que lo definen. Podemos entonces resaltar que no existe una tcnica universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos, ya que, como se menciono anteriormente todo depender de las caractersticas y propiedades que cada microorganismo posea.

BIBLIOGRAFIA Michael J. Pelczar, Roger D. Reid, (1982), Microbiologa (4ta edicin), Mxico: Mc Graw-Hill. Thomas D. Brock, David W. Smith, Michael T. Madigan (1993), Microbiologa (4ta edicin), Mxico: Prentice-Hall. Geneviene Gray Young (1980), microbiologa, Mxico: McGraw-Hill. Michael T. Madigan, Jonh M. Martinko, Jack Parker (2004), Biologa de los Microorganismos (10 edicin), Espaa: Prentice-Hall.

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