MODIFICACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Marco terico La tirosinasa del champin Es la enzima responsable del proceso de melanizacin en los animales y del pardeo en las plantas; haciendo de esta caracterstica un tema de especial nfasis en procesos de transformacin y almacenamiento de productos vegetales. Su actividad modifica el aspecto y sabor de stos productos, por lo que tiene una favorable importancia econmica al evitar o favorecer su actividad en perodos determinados. Posee una actividad cataltica doble, siendo capaz de hidroxilar los mono fenoles a o-difenoles con oxgeno molecular (monofenolasa) adems es capaz de oxidar los o-difenoles a oquinonas con oxgeno molecular tambin (difenolasa).

Procedimiento Materiales y reactivos Espectrofotmetro - colormetro. Bao termosttico. 10 g de championes. 1 g de arena de mar lavada. Tampones fosfato 100 mM de pH 6, 7, 7.5 y 8. Tampn acetato 10 mM de pH 3.6, 4 y 5. Catecol 5 mM en tampn acetato 10 mM pH 5. Catecol 1 mM en tampn acetato 10 mM pH 5. Catecol 5 mM en agua destilada.

cido cinmico 1 mM en tampn acetato 10 mM pH 5.

Mtodos Aislamiento de la enzima

Fragmentar el material biolgico y centrifugar posteriormente. En un mortero con 1 g aproximadamente de arena de mar lavada triturar 10 g de champin durante 10 minutos. A continuacin se aaden 30 ml de tampn de fosfato 100 mM pH 7 y se homogeniza durante 10 minutos. Centrifugar la mezcla a 10000 x g durante 30 minutos. El sobrenadante es la fuente de enzima, almacenar a 4 C. Si no se dispone de centrifuga filtrar al vaco con embudo Buchner, el filtrado es la fuente de enzima, se almacena a 4 C. Medicin de la actividad difenolasa

Mezclar en una cubeta de 1 cm de peso ptico, 1 ml de catecol 5 mM con 1 ml de tampn de acetato 10 mM de pH 5. Aadir 0.1 ml de extracto enzimtico y medir la variacin de absorbancia a 390 nm de longitud de onda en el intervalo de 30 a 90 segundos (formacin de o-benzoquinona). Para el clculo de la Actividad enzimtica se utiliza un = 1050 M -1 x cm-1 para obenzoquinona a 390 nm.

Clculo de KM y VMAX

Medir la actividad enzimtica variando la concentracin de catecol en la celda de medicin: 50 M, 66 M, 100 M, 200 M, 500 M, 1 mM y 3 mM. Hacer la representacin de Lineweaver-Burk correspondiente y evaluar las magnitudes de K M y VMAX. Inhibicin enzimtica

Se realizan dos series de medidas de la actividad, una con concentracin de catecol de 2 mM y otra con 0.5 mM y concentracin variable de cido cinmico desde 0 hasta 0.4 mM. Representar con el mtodo de Dixon. Efecto de la temperatura

Medir la actividad enzimtica en medios de reaccin previamente atemperados en un bao termosttico a temperaturas ente 25 C y 70 C durante 10 minutos, aadiendo la enzima en el momento de medir. Representar la actividad frente a la temperatura utilizada en cada caso y evaluar la temperatura ptima.

Efecto del pH

Medir la actividad enzimtica utilizando disoluciones tampones 10 mM en acetato de pH 3.6, 4, 5 y de tampones 10 mM en fosfato de pH 6, 7 y 8 (utilizar el sustrato disuelto en agua a una concentracin 5 mM). Representar la actividad media frente al pH del tampn utilizado y evaluar el pH ptimo para esta enzima.

Espectrofotmetro - colormetro. Bao termosttico. Mortero y pistilo. Micropipetas y micropuntas. Centrifuga Tubos falcon 10 g de championes. 1 g de arena de mar lavada. 30 ml tampn fosfato 100 mM de pH 7

Catecol 5 mM en tampn acetato 10 mM pH 5. 1 ml catecol 5 mM 1 ml tampn acetato 10 mM pH 5 1 ml catecol 50 M 1 ml catecol 66 M 1 ml catecol 100 M 1 ml catecol 200 M 1 ml catecol 500 M 1 ml catecol 1 mM 1 ml catecol 3 mM 1 ml catecol 2 mM 1 ml catecol 0.5 mM 9 ml tampn acetato 10 mM pH 5

Catecol 1 mM en tampn acetato 10 mM pH 5. Catecol 5 mM en agua destilada.

cido cinmico 1 mM en tampn acetato 10 mM pH 5. 1 ml c. cinmico 0 mM 1 ml c. cinmico 0.1 mM 1 ml c. cinmico 0.2 mM 1 ml c. cinmico 0.3 mM 1 ml c. cinmico 0.4 mM 5 ml tampn acetato 10 mM pH 5.

Tampn acetato 10 mM de pH 3.6, 4 y 5.

Catecol 5 mM en tampn acetato 10 mM pH 5. 3 ml catecol 5 mM 3 ml catecol 3 mM 3 ml catecol 1 mM 3 ml catecol 0.5 mM 3 ml catecol 500 M 5 ml tampn acetato 10 mM pH 5 a 25 C 5 ml tampn acetato 10 mM pH 5 a 50 C 5 ml tampn acetato 10 mM pH 5 a 70 C

datos: n=masa/pm masa=m*pm []=n/v (L) catecol c6h6o2 110.1g/mol