Facultad de ciencias Biologa molecular de la clula 1

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Electroforesis de protenas
Rojas Maya, March Alejandro, Morales Mximo, Adame Luz
Universidad de Nacional Autnoma de Mxico Biologa Molecular de la clula 1 16 de octubre 2013

Resumen
La presente practica se basara en la electroforesis de geles de poliacrilamida , siendo uno de los mtodos ms utilizados para la purificacin, anlisis y caracterizacin de protenas. Esta tcnica permite separar molculas cargadas y se basa en las diferencias de movilidad cuando se somete las protenas a un campo elctrico.

Para la visualizacin de las protenas se utilizan diferentes mtodos En la SDS-PAGE, laseparacin es funcin del tamao (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las protenas. Para ello se compara lamovilidad electrofortica (Rf) de la protena de peso moleculardesconocido con el de protenas de referencia de peso molecularconocido

Palabras clave
V = Eq / f E = Campo elctrico en volts/cm q = Carga neta de la molcula f = Coeficiente de friccin (depende de la masa y de la forma de la molcula) v = Velocidad de migracin de la molcula

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1. Introduccin

e puede entender como electroforesis

al mtodo o tcnica de laboratorio, en el cual se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa, en la cual ayuda tambin al estudio del movimiento de estas mismas con una carga neta a travs de un campo elctrico. Cada molcula presenta una carga, tamao, movilidad y velocidad de migracin en el campo elctrico nica. La siguiente ecuacin representa el movimiento de molculas cargadas en un campo elctrico. (Alberts,1996:179) La electroforesis es una tcnica que ayuda al estudio del movimiento de las biomolculas con una carga neta a travs de un campo elctrico. Su migracin depende de la forma, tamao, carga y composicin qumica; por ejemplo, si se tiene una mezcla, cada molcula presentar una carga y tamao nico, por lo tanto la movilidad y velocidad de migracin en el campo elctrico para cada molcula es nica y se separan en bandas. El movimiento de las molculas cargadas en un campo elctrico se representa por la siguiente ecuacin:

Donde: E = Campo elctrico en volts/cm q = Carga neta en la molcula f= Coeficiente de friccin Idepende de la masa y de la forma de la molcula) i/= Velocidad de migracin de la molcula La electroforesis es una tcnica que se utiliza para analizar y determinar el peso molecular de diferentes tipos de biomolcul as, pero es ms comn utilizarla para protenas y cidos nucleicos. Existen diversos tipos de electroforesis cuya diferencia radica en los distintos tipos de medios de soporte: los geles de celulosa son usados para molculas de bajo peso molecular como los aminocidos y los carbohidratos, los geles de poliacrilamida y agarosa se utilizan para molculas de mayor peso molecular (DNA, RNA y protenas). Los geles de electroforesis pueden ser horizontales, verticales o cilndricos (capilares). Las condiciones electroforticas pueden variar; por ejemplo, la electroforesis de "zona" utiliza un amortiguador a pH constante durante todo el tiempo de separacin. En la electroforesis de gel discontinuo se utilizan dos diferentes geles, uno concentrador y uno separador. Estos geles son preparados con amortiguadores de diferente fuerza inica, pH y tamao de poro. El isoelectroenfoque utiliza un gel con gradiente de pH y se utiliza para sustancias anfotricas; sirve para conocer el punto isoelctrico. En la electroforesis en gel de poliacrilamida, el soporte est constituido por una red tridimensional formada por la polimerizacin de la acrilamida con N,N'metilen-bis- acrilamida, controlada por un sistema de catlisis con el persulfato de

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amonio y N,N,N',N'tetrametiletilendiamina (TEMED) (Walker,1996:55) La concentracin de poliacrilamida puede variar de acuerdo al tamao de la molcula que se desea separar, por ejemplo, 7.5% de poliacrilamida para separar protenas de peso molecular mediano, en cambio si se utiliza una baja concentracin de poliacrilamida (5%) se separan protenas de alto peso molecular; en contraste si la concentracin de poliacrilamida es alta (15%) el poro es pequeo y sirve para analizar protenas de bajo peso molecular. Las ventajas de utilizar geles de poliacrilamida son: 1)alta resolucin (I x 106 Da) 2)acepta molculas relativamente grandes 3)hay una interaccin mnima de la molcula que migra con la matriz del gel 4)el gel tiene una estabilidad fsica La desventaja es que el monmero de la acrilamida es altamente neurotxico, por lo tanto debe de manejarse con mucha precaucin (guantes y cubrebocas) y nunca desechar la acrilamida sin polimerizar. Existen geles en una dimensin y en dos dimensiones, isoelectroenfoque para determinar el punto isoelctrico, geles para secuenciacin de cidos nucleicos, geles de agarosa, inmunoelectroforesis, etc. Se pueden preparar dos tipos de geles: Nativos son aquellos en los que las protenas mantienen su conformacin y estructura tridimensional; desnaturalizantes son aquellos a los que se le agrega un detergente, el dodecil sulfato de sodio (SDS), que confiere carga negativa a la protena y un agente reductor, el 2-mercaptoetanol que rompe puentes disulfuro. Estos agentes combinados provocan que las protenas pierdan su estructura secundaria, terciaria

y cuaternaria, desplegando un polipptido de cadena lineal (Biologa

Molecular.Manual de Prcticas. 2010).

2. Objetivos Habituarse con las metodologas de electroforesis de protenas en geles SDS. Separacin de protenas ,en este caso la casena. Determinar del peso molecular de las protenas en estudio.

Hiptesis:S la casena de leche fue aislada

anteriormente en otra prctica, entonces habr mayor concentracin de aminocidos en la casena que en las muestras de sobrenadante y de leche

3.Metodologa Usando la tcnica de electroforesis , descrita a continuacin se llegaron a los resultados de la presente practica: Se agreg cada una de las soluciones en el mismo orden mostrado en la tabla, el TEMED y el persulfato de amonio se agregan al final. Para despus agitarse la mezcla sin formar burbujas ya que la entrada de oxgeno puediera inhibir la reaccin. Esto se hizo la solucin entre las dos placas de vidrio hasta una altura aproximada de 4.5 cm (minigeles). Agregando aproximadamente 1 mL de 2propanol encima del gel dejando polimerizar alrededor de 30 min, este

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paso tiene la finalidad de evitar la entrada de aire y alinear la superficie del gel con las placas de vidrio. 5. Transcurrido este tiempo, se lav la superficie del gel con agua desionizada antes de poner el gel concentrador. Preparacin del gel concentrador al 4% 1. Agregar cada una de las soluciones en el mismo orden mostrado en la tabla, el TEMED y el persulfato de amonio se aaden al final. 2. Se agita la solucin teniendo cuidado de no formar burbujas 3. Se aplica al espacio restante de las placas de vidrio, se inserta el peine 4. Se deja polimerizando por 30 min. 5. Una vez polimerizado, el gel se puede guardar por dos das a 4 C, sin embargo siempre es mejor utilizarlo recin elaborado. El ensamble de la cmara depende del modelo y la marca, sin embargo, el armado de los geles generalmente es muy similar. *. El gel se hace entre dos placas de vidrio, que tienen que estar bien lavadas y enjuagadas con agu destonizada y alcohol, asegurndose de que no tengan restos de detergente o grasa b. Entre las dos placas de vidrio se colocan los separadores (de su grosor depender el grosor del gel) c. Los espaciadores se colocan en las placas de vidrio, una vez ensamblados y alineados se colocan dentro del porta geles d. Una vez ajustados, se verifica que el sistema no tenga fugas (se puede probar con agua que despus se desecha) . Agregar la mezcla del gel separador dejando aproximadamente 2.5 cm antes de llegar al borde superior (ver figura 4) t. AAadir una capa delgada de 2prop<inol

para que el gel quede alineado q. Dejar polimenzar al menos 30 min h. Una vez polimerizado. eliminar el 2 propanol lavando la superficie con agu destilada

i. Agregar el gel concentrador, colocar el peine y dejar polimerizar al menos 1 hr (ver figura 4). j . Colocar el sistema dentro de la cmara de electroforesis, retirar el peine y enjuagar con agua desionizada. k. Agregar el amortiguador de corrida. Los geles quedan listos para aplicar las muestras. nodo Amortiguador Ctodo Marco de plstico ~ Muestra Gel Preparacin de las muestras I. En tubos Eppendorf adicionar cada muestra como se indica en la siguiente tabla Nmero de tubo Muestras obtenidas en la prctica 1 Concentracin final 1 Leche diluida 1:4 0.1 mg/mL 2 Sobrenadante Diluir 1:1 3 Casena purificada 0.6 mg/mL 4 Marcadores de peso molecular 2fiL 2. Poner a cada muestra I nL del amortiguador de la muestra 5X (sin diluir) 3. Hervir todas las muestras 1 minuto. 4. Cargar 10 jaL de cada muestra con una micropipeta dentro de cada pozo del gel. Colocacin recomendada: Carril I. Vaco Carril 2. Marcadores de peso molecular Carril 3. Leche diluida 1:4

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Carril 4. Sobrenadante Carril 5. Casena purificada Carril 6. Vaco Carril 7. Leche diluida 1:4 Carril 8. Sobrenadante Carril 9. Casena purificada Carril 10. Vaco 5. Conectar los cables a la fuente de poder y aplicar 60 mA por gel (120 mA, en caso de tener una cmara de dos geles). El tiempo de corrida es de alrededor de 45 minutos. TINCIN DEL GEL 1. Una vez que los geles terminaron de correr, se descarta el amortiguador de la cmara superior y se libera el porta placas. 2. Retirar con mucho cuidado los separadores de las placas para liberar el gel y con uno de los separadores hacer un corte pequeo en el extremo superior izquierdo, donde se coloc la primera muestra, para identificar la orientacin del gel.

3. Lavar dos o tres veces por 5 min con agua para eliminar el SDS antes de la tincin. 4. Con la ayuda de uno de los separadores o con una esptula, transferir con mucho cuidado el o los geles a una charola que contiene la solucin de tincin de azul de Coomassie. 5. Si hay tiempo suficiente los geles se pueden lavar dos o tres veces por 5 min con agua para eliminar el SDS antes de la tincin (este paso es opcional). 6. Incubar 1 hr con agitacin suave. 7. Quitar la solucin de tincin, guardarla en un frasco etiquetado, marcando cuntas veces ha sido usada y agregar a la charola que contiene el gel suficiente solucin para desteir para cubrirlo. Dejar el gel toda la noche. 8. Descartar la solucin desteidora y cubrir al gel con agua. Los geles pueden ser conservados en agua por varias semanas, tapados y refrigerados.

Resultados: A continuacin se muestra la tabla de la prctica anterior y una fotografa de cmo qued el gel Tabla 1: Datos de prctica anterior

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Nmero de tubo

Muestras obtenidas en la prctica 1 Leche diluida 1:4 Sobrenadante Casena purificada

Concentracin final

1 2 3 4

0.1 mg/mL Diluir 1:1 0.6 mg/mL

Marcadores de peso 2fiL molecular

Imagen 1: foto del gel final (la parte concerniente a nuestro equipo es la de la derecha, aunque la imagen no se ve tan n{ntidamente, real si pudieron distinguirse algunas de las bandas)

Marcador por muestra

leche leche

Distancia recorrida por las bandas (mm) 3 6

Rf (vs. 40 mm)

Promedio de Rf por muestra

0.075 0.15

.258

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leche leche leche leche leche leche sobrenadan te sobrenadan te sobrenadan te sobrenadan te sobrenadan te Casena Casena Casena

11 13 15 21 22 27 17 22 24 33 38 31 34 38

0.275 0.325 0.375 0.525 0.55 0.675 0.425 0.55 0.6 0.825 0.95 0.775 0.85 0.95 .85 .506

Tabla 2: Resultados de las distancias de las bandas y la distancia recorrida de stas

Grfica 1: distribucin de los datos crudos

Al graficar los datos de la tabla 2, (x=Rf, y=Log PM) se observa la relacin mencionada

Grfica 2: Regresin lineal de los datos obtenidos

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El modelo propuesto es: Y= 2.47786 1.83310 (x), donde Y es PM(logKDa) y X la Rf Multiple R-squared: 0.9757 Nota: los Log de KDa son:

Al sustituir en el valor en X el promedio de distancia recorrida (Rf) por cada muestra, leche, sobrenadante y casena, se obtiene la siguiente tabla informativa

KDA

log

250 150 100 75 50 37 25 20

2.397940009 2.176091259 2 1.875061263 1.698970004 1.568201724 1.397940009 1.301029996

Muestras

Peso Antilog molecular en logKDa 1.00

Peso molecular (Da) 1000

AA (Da/110)

Leche diluida 2.00 1:4

9.09

Slo tomamos los primeros 8 datos Sobrenadante 1.55 de mayor a menor que nos proporcionaron en el laboratorio con la siguiente tabla, ya que como se ve en la imagen del gel, los PM conocidos que se observan slo Casena .919 alcanzan los primeros 8 valores aislada Imagen 2: Valores estndar en Kilodaltons de protenas

35.48

35480

322.54

8.29

8290

75.36

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5. Discusin de Resultados: A pesar de que no fue sencillo entender y quizs realizar los clculos, al final comprendimos que el desplazamiento de las cadenas poli peptdicas es proporcional al logaritmo de su masa, de esta forma podemos estimar el peso molecular de una protena comparndola con la distancia de migracin de un patrn de protenas de peso molecular conocido. Asimismo podemos estimar qu cantidad de aminocidos poseen

Como no tenamos bien arraigados estos conocimientos errneamente hipotetizamos que habra mayor AA en la casena, y no fue as , ya que por un lado la cantidad de sta era mnima, incluso menor que otros equipos y otra el sobrenadante y laleche contienen ms protenas que slo la casena , por tanto es coherente que los resultaos arrojen mayor cantidad de AA en stos.

6.- Conclusiones: Como se trat de un tipo de electroforesis desnaturalizante en la que las muestras se desnaturalizaron por calor en presencia de agentes betamercaptoetanol, que destruye los puentes disulfuro y SDS que desnaturaliza y recubre a la protena con cargas netas negativas, presumimos que se separaron bien las cadenas polipeptdicas aisladas, sin embargo, hay que considerar que como prctica de laboratorio de un curso semestral, no pudimos invertir muchas horas en ella, por lo que seguramente hubieron errores metodolgicos, no obstante se cumplieron con los objetivos acadmicos y de conocimiento de la tcnica.

Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirn separaciones paralelas. Cada separacin mostrar distintas bandas correspondientes a cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dar un solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o ms componentes. Las bandas en diferentes separaciones paralelas que estn a la misma distancia del principio significa que contienen molculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Conocimos que existen marcadores especiales que contienen una mezcla de molculas de tamao conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamao. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) y como se mencion, inversamente proporcional al logaritmo del tamao de la molcula, razn por la cual hicimos uso del log y el antilog para los clculos. (Suelter, 1991:266).

Referencias: Alberts et. Al (1996)Biologa Molecular de la clula. Barcelona:Omega

Biologa Molecular.Manual de Prcticas. (2010) Biologa Molecular de la Clula 1. Mxico.

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UNAM Lehninger (2005). Principios de Bioqumica. 4 edicin. Ed. Omega. Suelter, et. Al (1991) Methods of biochemical analysis . Cana: John Wiley & sansa Inc. Walker, et. Al. (1996). The Protein Protocols Handbook. New Jersey: Human Press Inc.