Medicina, Ribeiro Preto, 32: 167-188, abr./jun.

1999

REVISO

ASPECTOS MOLECULARES DA TRANSMISSO SINPTICA*

MOLECULAR ASPECTS OF SYNAPTIC TRANSMISSION

Ana C. Polli Lopes2, Luciana Casaletti Rosa1, Ren de O. Beleboni3, Rodrigo N. R. Pereira4, Carlos A. C. de Vasconcelos2 & Jorge E. Moreira5.
Alunos de ps-graduao da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto (USP) nos Departamentos de Morfologia1, Patologia2, Bioqumica3 e Fisiologia4. 5Professor do curso de ps-graduao, RMF 5751, Aspectos Moleculares da Transmisso SinpticaDepartamento de Morfologia da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto (USP). CORRESPONDNCIA: Prof. Dr. Jorge E. Moreira Departamento de Morfologia da Faculdade de Medicina da USP CEP:14049-900 Ribeiro Preto, SP, Brasil. e-mail: cello@fmrp.usp.br
1,2,3,4

POLLI LOPES AC; CASALETTI ROSA L; BELEBONI RO; PEREIRA RNR; VASCONCELOS CAC & MOREIRA JE. Aspectos moleculares da transmisso sinptica. Medicina, Ribeiro Preto, 32: 167-188, abr./jun. 1999.

RESUMO: O Sistema Nervoso Central produz o nosso estado consciente mediante um contnuo fluxo de informaes e armazenamento de memrias ao longo da vida, a partir de diferentes estmulos externos. Ao mesmo tempo, controla a concentrao dos nossos fluidos internos e o trabalho de msculos e glndulas. A transmisso sinptica o processo bsico de toda esta atividade. Bilhes de neurnios se comunicam entre si via milhares de sinapses, e cada sinapse, por sua vez, uma estrutura regulada independentemente. A partir desta complexidade, em lugar de caos, surge uma singular ordem na informao processada pelo crebro. A secreo de neurotransmissores na zona ativa da sinapse o evento primrio da comunicao interneuronal. Este processo regulado por um trfego de membranas altamente orquestrado dentro do terminal prsinptico. Os neurotransmissores so armazenados em vesculas sinpticas. A despolarizao de um terminal nervoso por um potencial de ao resulta na abertura de canais de clcio, operados por voltagem. O influxo de Ca2+ resultante deflagra a exocitose, que uma rpida fuso de vesculas com a membrana plasmtica, liberando neurotransmissores para a fenda sinptica. A exocitose envolve a juno de protenas intrnsecas das membranas plasmticas, vesicular e pr-sinptica, mediante protenas especficas de ancoragem e fuso na zona ativa (SNARE). Em seguida liberao, as membranas das vesculas so rapidamente reincorporadas via endocitose e recicladas dentro do terminal sinptico. O terminal , portanto, uma unidade autnoma que contm todos os elementos requeridos para a exocitose das vesculas, as protenas responsveis pela biossntese do neurotransmissor e recaptao das vesculas. Uma vez liberado, o neurotransmissor difunde atravs da fenda sinptica e interage com protenas receptoras na membrana do neurnio pssinptico produzindo, em uma frao de milissegundo, uma permeabilidade intensa e temporria aos ons Na+ e K+, provocando a despolarizao total de cerca de 100 mV desde um potencial de repouso em torno de -60mV. Isto gera um potencial de ao que se difunde ao longo da membrana do neurnio ps-sinptico, podendo alcanar o seu prprio terminal e deflagrar novo movimento de Ca2+ para o citosol, gerando um novo potencial. Vrias protenas dentro do terminal ps-sinptico esto envolvidas neste processo. geralmente aceito que os processos de aprendizado e memria resultam de mudanas estruturais e bioqumicas em sinapses especficas que alteram a liberao de neurotransmissores e a ao ps-sinptica. Tais alteraes podem ser registradas eletrofisiologicamente como uma potenciao ou depresso de durao longa (LTP ou LTD) ou a combinao de ambas. UNITERMOS: go Prazo. Sinapse. Vesculas Sinpticas. Transmisso Sinptica. Potenciao de Lon-

*Resultados de seminrios e discusses realizados durante o curso RMF 5751, entre 31 de agosto e 30 de setembro de 1998.

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O que o crebro faz o tempo todo, dormindo ou acordado, criar imagens. Luz nada mais do que radiao eletromagntica. Cores no existem fora de nossa mente. Nem os sons. O som o produto da relao entre uma vibrao externa e o crebro. Se no existisse crebro, no haveria som, nem cores, nem luz, nem escurido.
Rodolfo Llins (1)

INTRODUO O sistema nervoso produz e regula todos os aspectos das funes do corpo humano e a sua complexidade parece infinita. Bilhes de neurnios agrupados para diferentes funes checam, constantemente, o meio interno da nossa anatomia e o universo exterior: luz, tato, presso, som, equilbrio, imagens, concentraes de muitas substncias, dor, emoo, conscincia. Grupos de neurnios interagem e transmitem a informao resultante a outros grupos para que ela seja processada e armazenada. Mediante o mesmo processo, outros neurnios regulam a contrao dos msculos e a secreo das glndulas endcrinas e excrinas. O crebro, o centro de controle que armazena, computa, integra e transmite a informao, contm ao redor de 1011 neurnios e cada um deles forma conexes, chamadas sinapses, com at duzentos mil (200.000) outros neurnios(2). Um simples neurnio pode ser afetado, simultaneamente, por estmulos excitatrios e inibitrios de axnios provenientes de muitos neurnios. Os diferentes sinais diminuem ou aumentam o potencial que se movimenta ao longo da membrana plasmtica, a partir do ponto de sinapse para o corpo celular, e da para o cone axonal. A partir da, um novo potencial de ao ser gerado ou no, dependendo do balano de tempo, amplitude, e localizao dos vrios potenciais excitatrios e inibitrios, recebidos pelo neurnio. Os potenciais de ao so gerados quando a magnitude do potencial de membrana do cone axonal diminui at o limiar de excitao. De certo modo, cada neurnio um computador individual, que tira uma mdia de todos os distrbios eltricos que recebe atravs de sinapses de outros neurnios, e faz a deciso de disparar um potencial de ao e conduzi-lo at o terminal axonal ou no. Muitos dos sistemas nervosos de maior interesse, como o crebro dos mamferos, so demasiado complexos para serem estudados em neurnios indi168

viduais ou em pequenos grupos que cumprem uma determinada funo. Por exemplo, num fragmento do tamanho de um gro de arroz de crtex cerebral, de qualquer mamfero, como o homem, poderamos encontrar um (01) milho de neurnios, e, portanto, um (01) bilho de sinapses e talvez uns 30 km de fios (axnios) fazendo as interconexes. Nesse sistema, seria, ento, bastante difcil observar um nico neurnio, injet-lo ou estimul-lo para estudar a sua resposta pssinptica (Figura 1). Uma grande quantidade de informao tem sido obtida de sistemas nervosos mais simples. Por exemplo, lulas, caracis-de-mar e nemtodos contm poucos neurnios, grandes, relativamente fceis de serem identificados e manipulados experimentalmente. Nessas espcies, alguns neurnios podem estar envolvidos numa tarefa especfica que pode ser estudada com certo detalhe(3)(Figuras 2 e 3). A maior parte do conhecimento atual sobre o sistema nervoso tem sido obtida a partir de estudos nesses invertebrados. Os princpios envolvidos no funcionamento so gerais e aplicveis a sistemas nervosos mais complexos, como o dos humanos. A natureza e mecanismos que caracterizam a comunicao qumica entre neurnios, chamada de transmisso sinptica, tm sido estudados, principalmente, durante os ltimos trinta anos. A maior parte do sucesso obtido em tal rea foi mediante estudos da sinapse gigante da lula Loligo pealii. Esses estudos tm sido teis para definir o processo temporal, medido em fraes de milissegundo (ms) e o processo espacial, medido em nanmetros. A transmisso qumica envolve dois tipos distintos de especializaes neuronais, os compartimentos pr- e ps-sinpticos. A liberao de neurotransmissor (NT) desde o seu stio intracelular no terminal pr-sinptico e a resposta a tal NT ocorre em estruturas ps-sinpticas atravs do espao intersinptico ou fenda sinptica (FS). Atualmente, os receptores ps-sinpticos so caracterizados at o nvel das subunidades moleculares que os compem(4). Por outro lado, boa parte dos mecanismos de liberao pr-sinptica dos neurotransmissores desconhecida. Blocos de conhecimento faltam nos campos biofsico, biomolecular e celular. As questes a serem respondidas referem-se a quatro reas principais: 1) o mecanismo de liberao dos neurotransmissores; 2) o papel do clcio (Ca2+) em tal processo; 3) o papel dos moduladores qumicos

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Figura 1 - Eletromicrografias de cerebelo (camundongo C57-BL). Em A, a enorme complexidade do neurpilo dos mamferos mostra oitocentos e setenta e nove (879) botes terminais com as suas correspondentes espinhas dendrticas, numa superfcie inferior a 1002. As setas apontam algumas das densidades sinpticas visveis. Em cada sinapse, podem ser observadas as reas pr e ps-sinpticas, pela presena ou no de vesculas, mas seria difcil apont-las individualmente. Uma parte da micrografia ocupada por um capilar (C), processos gliais como em gl, processos dendrticos (den) e parte do citoplasma de um neurnio granular (gr), recebendo contatos sinpticos de terminais axonais no neurpilo (pontas de setas). Em B e C, detalhe dos contatos sinpticos sobre o neurnio granular. Sinapses inibitrias (densidades simtricas e vesculas pleomrficas) mostram aglomerados de vesculas sinpticas pequenas (P), vrias delas ancoradas ou em fuso com a membrana pr-sinptica, na zona ativa. Em um dos terminais h uma vescula coberta, cc, e, em outro, vesculas grandes de corpo denso, vd. Pr, pr-sinptico; Ps, ps-sinptico; N, ncleo; m, mitocndria. As barras indicam 1, 0,5 e 0,25 m respectivamente em A, B e C. (Cerebelo fixado por perfuso intravascular, includo em resina plstica e seccionado a ~70nm. Morfometria feita sobre a micrografia com uma tabuleta digital Zidas em interface com um computador Macintosh G-3; J.E.Moreira, micrografias inditas).

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na atividade desses neurotransmissores, e 4) aspectos da plasticidade sinptica. As trs primeiras questes esto entrelaadas a tal ponto que difcil estabelecer uma separao clara entre elas. No entanto, tem sido conhecido, por longo tempo, que o fenmeno da liberao do NT depende da entrada de Ca2+ no citosol e de que o Ca2+ o principal iniciador do processo de secreo(5). Trabalhos recentes tm confirmado essa hiptese, mostrando que o influxo de Ca2+, dada a rapidez da transmisso sinptica, deve ser produzido por uma maquinaria celular altamente estruturada, capaz de causar um fenmeno que pode ser medido em frao de ms(4). Aspectos da plasticidade sinptica so discutidos luz de controversas hipteses que procuram relacionar potenciaes e depresses de longa durao com os processos de memria e aprendizado.

Com base em toda essa informao, torna-se evidente a importncia do trabalho colaborativo entre morfologistas, bilogos moleculares, bioqumicos, farmaclogos e eletrofisilogos. O problema bsico compreender como o potencial de ao de um nervo se transforma num processo de secreo que leva transmisso sinptica. SINAPSES Como mencionamos antes, sinapses so pontos de comunicao pelos quais os neurnios pr-sinpticos, mediante os seus axnios, passam sinais para pontos alvos ps-sinpticos, que podem ser os dendritos, o axnio ou o corpo celular de outro neurnio, clulas musculares ou clulas glandulares. H dois tipos de sinapse, eltricas e qumicas, que diferem em estrutura e funo.

Figura 2 - Diagrama do sistema nervoso da lula Loligo pealii (modificado de Llins & Sugimori, 1988; (3)). Um par de neurnios de primeira ordem recebe impulsos sinpticos de ambos os lados do crebro e se fusiona pelos seus axnios que cruzam na linha mdia, na altura do lobo paliovisceral. Depois do ponto de fuso axoplsmica, sinapses qumicas e eletrotnicas so estabelecidas com vrios axnios gigantes de neurnios de segunda ordem, dentro do mesmo lobo. Axnios dos dois maiores neurnios de segunda ordem formam os elementos pr-sinpticos das sinapses gigantes com axnios gigantes de terceira ordem, no gnglio estrelado. O dgito mais distal, em cada gnglio, forma a maior das sinapses e d origem aos axnios gigantes, que percorrem, caudalmente, todo o comprimento do manto muscular e alcanam at 0,5 mm de espessura (setas). As sinapses gigantes so motoras, acionando a atividade do manto, do sifo, e do jato de tinta no reflexo de fuga. A maior parte do conhecimento atual sobre o funcionamento do sistema nervoso dos animais superiores foi obtida de experimentos realizados nesta espcie. O tamanho dos neurnios e das sinapses permite diferentes tipos de manipulaes experimentais, como injees intra-sinpticas e observao do transporte axonal.

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Figura 3 - Gnglio estrelado da lula Loligo pealii, A e B, fotomicrografias, C e D, eletromicrografias. A simplicidade deste sistema pode ser apreciada na microscopia de luz. Em A, notar que o neurpilo (Neurop.) possui muitos terminais pr e ps-sinpticos, como no cerebelo dos mamferos, mas estes so muito maiores. Os terminais pr-sinpticos so mais claros que os ps-sinpticos. Seco transversal da sinapse gigante mostra a interao entre o terminal pr-sinptico (Pr), e o ps-sinptico (Ps) que dar origem ao axnio gigante da lula. Nas reas de contato, o ps-sinptico envia processos digitiformes que formam zonas ativas nos limites de interao com as vesculas do lado pr-sinptico (setas). Em B, maior detalhe dos limites pr-e ps-sinpticos. A microscopia de luz no consegue resolver as densidades e vesculas sinpticas. Em C, eletromicrografia de baixo aumento; densidades sinpticas e grupos de vesculas podem ser observados (cabeas de setas). Em D, duas densidades sinpticas mostram aglomerados de vesculas sinpticas em correspondncia das zonas ativas. As barras indicam 10m em A e B; 5m em C; e 1m em D. (O gnglio estrelado foi fixado por perfuso intravascular do fixador diludo em gua de mar, includo em resina plstica e seccionado a 0,5m para a microscopia de luz e a ~70nm para a microscopia eletrnica; J.E.Moreira, micrografias inditas).

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Os neurnios que se comunicam mediante siAs sinapses qumicas possuem duas principais napses eltricas so conectados por junes comunivantagens sobre as eltricas. Primeiro, a amplificacantes (gap junction) atravs das quais os impulsos o do sinal, o que comum em sinapses (junes) eltricos passam diretamente da clula pr-sinptica neuromusculares. Um potencial de ao de somente ps-sinptica. A vantagem das sinapses eltricas a um neurnio motor pode causar contrao de mltivelocidade, j que o impulso direto evita a demora ao plas clulas musculares, porque a liberao de relatiredor de 0,5 ms, caracterstica das sinapses qumicas. vamente poucas molculas de NT, na sinapse, todo A sinapse qumica, base funcional do sistema o requerido para estimular a contrao. A segunda nervoso, uma estrutura especializada e auto-regulavantagem o sinal de computao, comum em cada da. integrada por um terminal pr-sinptico, o bosinapse de interneurnios no sistema nervoso central to terminal, e uma rea correspondente do neurnio (SNC). Muitos interneurnios podem receber sinais ps-sinptico, que contm parte da densidade sinptiem mltiplas sinapses excitatrias e inibitrias. Alguca, receptores para neurotransmissores e canais inicos mas mudanas na permeabilidade de ons duram ps-sinpticos. O terminal pr-sinptico contm as vemenos de um ms, outras duram vrios segundos (s). sculas sinpticas, que carream neurotransmissores esSe um potencial gerado ou no, depende de uma pecficos, e a membrana com os canais pr-sinpticomplexa funo de todos os sinais recebidos, o sinal cos. Cada vescula sinptica (VS) consta de um apade computao, que diferente para cada tipo de relho protico, formado por mais de trinta (30) prointerneurnio. tenas especficas para produzir fuso de suas membraEsta reviso est dedicada exclusivamente s nas com a membrana pr-sinptica e secretar o NT. sinapses qumicas, por serem as mais abundantes e Imediata endocitose produzida para reciclar a memsignificativas do sistema nervoso (SN), e, portanto, as (6,7). A fubrana e os componentes no utilizados do NT mais estudadas. Dentro deste tpico, a nfase sero so um processo muito rpido, medido em frao de os processos de exo e endocitose, no terminal prms, produzido pelo potencial de ao pr-sinptico, sinptico, cujos passos principais so a ancoragem e a quando os canais, operados por voltagem, permitem fuso vesicular membrana pr-sinptica para a liberpida e passageira entrada de Ca2+ no terminal. Este rao do NT. clcio interage com vrias das protenas da membrana vesicular(8,9,10). Acredita-se Tabela I - Substncias com propriedades neurotransmissoras que cada VS, no terminal, contm somenou neuromoduladoras te um tipo de NT (Tabela I), mas um mesCatecolaminas Adenosina mo terminal axonal pode conter dois ou Dopamina (DA) Adenosina trifosfato (ATP) mais tipos de vesculas com diferentes neuNorepinefrina (NE) Neuropeptdeos rotransmissores. Para efetuar o sinal, o NT Epinefrina Encefalinas difunde desde o terminal, atravs da FS, Indolaminas -endorfinas para a clula ps-sinptica, onde se une a Serotonina (5-HT) Dinorfina receptores especficos na sua membrana, Triptamina Vasopressina causando uma mudana na permeabilidaMelatonina Ocitocina de a certos ons. Dimetil-triptamina Substncia P As sinapses podem ser excitatrias Colinrgicos Colecistocinina ou inibitrias. Nas excitatrias, o neuroAcetilcolina (ACh) Neurotensina transmissor liberado pela clula pr-sinpColina Peptdeo Vasoativo Intestinal (PVI) tica produz uma mudana localizada na Aminocidos e nucleotdeos Somatostatina membrana da clula ps-sinptica que a Glutamato Neuropeptdeo Y leva a se despolarizar, promovendo a geAspartato Galanina rao de um potencial eltrico. Nas sinapGlicina Hormnios no-peptdicos ses inibitrias, a unio do NT causa uma Histamina Estrgenos mudana na permeabilidade de ons, que cido -aminobutrico(GABA) Andrgenos tende a bloquear o potencial da clula ps-hidroxibutirato (GHB) Corticosterides sinptica por hiperpolarizao de suas Hormnios da tireide Taurina membranas. 172

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O COMPLEXO PR-SINPTICO Biognese da vescula sinptica A biognese da VS diverge da secreo constitutiva(8,11,12,13). As protenas constituintes da membrana vesicular sinptica so sintetizadas no Retculo Endoplasmtico Granular (REG) e carreadas em vesculas do Complexo de Golgi para o terminal pr-sinptico, mediante protenas motoras (kinesina e dinena citoplasmtica) ao longo de microtbulos(9), ou miosinas ao longo de filamentos de actina(14). Uma vez fundidas membrana pr-sinptica, so internalizadas com outros marcadores de endocitose mediada por receptor. As protenas da membrana vesicular, provavelmente selecionadas no endossoma primrio, originaro as VS que, posteriormente, sero preenchidas com NT(15) (Tabela I). Esse processo realizado por um complexo constitudo de transportadores proticos(10) e de uma bomba de prtons(16) que gera um am-

biente luminal cido no interior da vescula, e um gradiente eletroqumico adequado. A entrada do NT ocorre em funo da diferena de pH entre o interior da vescula e o citosol. Algumas protenas, como a sinapsina e a Rab3A, so produzidas nos polissomas e adicionadas ao REG, no terminal sinptico (Figura 4). O tamanho das VS varia, dependendo do tipo de NT contido no seu interior(17). Existem dois tipos de vesculas: as de centro denso (VCD) e as pequenas de centro claro (VP). As VCD apresentam uma regio central eltron-densa e so subdividas em dois tipos: pequenas (PVCD), 80 nm, que contm catecolaminas, e grandes (GVCD), 200 nm, que contm neuropeptdeos. As VP so eltron-lcidas, dimetro de 50 nm e contm um tipo de NT de ao rpida que pode ser acetilcolina, glicina, GABA ou glutamato. Estas vesculas no esto distribudas uniformemente no citoplasma pr-sinptico, estando, a maioria, reunida a uma distncia de aproximadamente 0,5 m da membrana, prximo zona ativa. Tal distncia mantida

Figura 4 - Representao esquemtica dos processos de transporte e biognese da vescula sinptica (VP). Em A, sntese protica no pericrio; B, transportes axonal antergrado e retrgrado e C, processos de exo e endocitose no terminal prsinptico (TPS) e neurnio ps-sinptico (NPS). O transporte axoplasmtico antergrado de vesculas (VT) realizado, principalmente, por kinesinas (Kin) e miosinas (Mio) associadas a microtbulos (MT) e filamentos de actina (At), respectivamente. O transporte retrgrado utiliza dinena citoplasmtica (Din) e, possivelmente, miosina associada a filamentos de actina, orientados no sentido retrgrado. N, ncleo; Re, Retculo endoplasmtico granular; G, Golgi; M, mitocndria; VCD, vescula grande de centro denso; VP, vescula pequena de centro claro; E, endossoma; FS, fenda sinptica; DPS, densidade ps-sinptica. (Figura original dos Autores).

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por um balano entre foras de atrao (van der Waals) e de repulso (eletrosttica e de hidratao). A hidratao a principal fora que determina a distncia com a membrana, e o ntimo contato s possvel com a abolio desta fora(18). O conjunto de vesculas reciclado continuamente(19;20) e mantido por elementos do citoesqueleto, prximo membrana prsinptica. Quando um potencial de ao alcana o terminal, esperado que, pelo menos, alguma vescula se fusione com a membrana pr-sinptica. Vesculas em contato com a regio especializada da membrana so definidas como docked (ancoradas), e algumas delas completaro a fuso(21). Aps a fuso, a membrana da vescula torna-se parte da membrana pr-sinptica, sendo endocitada para reutilizao (Figuras 4 e 5). Protenas do ciclo sinptico As membranas das vesculas sinpticas, no terminal axonal, esto providas de complexos proticos para fuso. Vrias protenas participam na exocitose dependente de clcio (Figura 5 e Tabela II). Conhecimentos recentes sobre a liberao sinptica vm sendo, obtidos mediante estudos bio-

qumicos das interaes proticas do terminal pr-sinptico, efeitos de toxinas (tais como botulnica e tetnica), anticorpos especficos, e protenas homlogas nos eventos sinpticos, alm de mutaes em camundongos e invertebrados atravs de knockout gentico(6,7,22,23,24). Secreo do neurotransmissor ereciclagem vesicular Segundo Thomas C. Sdhof (4), o ciclo da vescula sinptica pode ser dividido em nove passos (Figura 6): 1. Docking (Ancoragem): Contato inicial entre as membranas da VS e membrana pr-sinptica, antes do amadurecimento vesicular. Esse contato inicial garantido por um sistema de ancoragem, exercido por interaes de protenas da membrana vesicular e da zona ativa (local onde ocorre a extruso do NT). 2. Priming (Engatilhado): As VS se tornam aptas para uma rpida e completa fuso com a membrana pr-sinptica. Provavelmente, neste estgio, h fuso parcial de membranas.

Figura 5 - Vescula sinptica de acetilcolina (ACh) e suas protenas de membrana. Adaptado de Robert, 1997 (43).

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Tabela II - Protenas envolvidas no processo de endocitose e exocitose das vesculas sinpticas Protenas da membrana da vescula sinptica SINAPTOBREVINA 1 e 2 (VAMP-1 e 2): Protenas que interagem com a sintaxina e SNAP-25 na membrana prsinptica durante o priming da exocitose vesicular (11). SINAPTOFISINA(S): Protenas com quatro domnios transmembrnicos e de 38 KDa, que impedem a formao do ncleo complexo fora da zona ativa pela ligao com a sinaptobrevina (3). Importantes na biognese da vescula sinptica (11). SINAPTOTAGMINAS (p65): Protena transmembrnica de 58 KDa, definida como um sensor de clcio, devido a seus domnios C2A e C2B. O domnio C2A, atravs de sua interao com clcio, sofre uma alterao conformacional, levando-o a fusionar fosfolipdeos da membrana vesicular e pr-sinptica. Esta protena central na fuso das vesculas sinpticas pelo clcio, assim como na reciclagem de vesculas sinpticas pelo domnio C2B.(19,20,25). PROTENA RICA EM CISTENA: Ainda no clara a funo desta protena. Parece ser importante na fuso vesicular com o endossoma (11). RAB3A: Protena de 25 KDa que se liga a GTP e GDP. Importante para o processo de trfego intracelular e secreo sinptica. Funciona como uma trava, durante uma intensa estimulao do terminal pr-sinptico, impedindo que todas as vesculas sejam exocitadas (11,24). RABFILINA 3A: Possui 78 KDa e liga-se a GTP e a RAB3A, interagindo no trfego vesicular (11,24). SINAPSINAS (Ia, Ib, IIa, IIb): Fosfoprotenas que regulam a disposio das vesculas sinpticas para ancoragem e fuso, pelo controle de suas ligaes com o citoesqueleto no pool vesicular (11,24). Protenas da Membrana Plasmtica SINTAXINA: Protena de 35 KDa, componente do complexo 20S, juntamente com NSF, SNAPs e Sinaptobrevina, essenciais no processo de ancoragem e fuso vesicular. Anticorpos contra sintaxina e clivagem pela toxina botulnica bloqueiam a transmisso sinptica (11,21,22,24). SNAP-25: Protena do complexo 20S, de 25 KDa envolvida no processo de ancoragem e fuso (11,24). GAP-43 (F-1, B-50 ou neuromodulina): Possui importante papel na neuritognese, regenerao de nervos e LTP, bem como no processo inibitrio da ancoragem e fuso vesicular (11). NEUREXINAS: Protenas de superfcie celular, que podem atuar no reconhecimento clula-clula. Apresentam mais de mil (1000) isoformas, incluindo o receptor para -latrotoxina (11).

Protenas Citoslicas ou Citoplasmticas MUNC-18: Homlogo mamfero das protenas NSEC1 (levedura) e UNC-18 (C. elegans) que se liga sintaxina. Participa na secreo sinptica e inibio do processo de fuso fora da zona ativa (3,11,24). NSF (N-ethylmealeimide-sensitive factor): Participa no trfego vesicular intra-Golgi e na fuso exocittica (11). Quando a NSF cliva ATP, ela deve promover uma alterao conformacional na sinaptobrevina, provocando rearranjos da membrana lipdica, facilitando a formao de uma vescula hemifundida (24,26). SNAPs: Envolvidas na fuso vesicular e nos processos de plasticidade sinptica (11). Dinamina I: GTPase necessria endocitose, fosforilada pela PKC e desfosforilada pela calcineurina mediante despolarizao da membrana (11,24,27). Protena AP2: Protena que se liga dinamina e sinaptotagmina, iniciando a formao dos pits de clatrina para a endocitose (24).

Protenas Adicionais PITP e PIP5K: Protenas que agem em fosfolipdeos, essenciais na reconstituio da secreo sinptica e na regulao da fuso vesicular (11). ANEXINAS: Ligam-se ao clcio e fosfolipdeos, podendo influenciar na restaurao da secreo (11). EXO-1: Funes pouco conhecidas, necessrias no processo de fuso e trfego vesicular (11). p145: Protena clcio-dependente, de 145 KDa, envolvida no engatilhamento do processo de fuso (11). p115: Conjuno semelhante a anterior e participa no processo de transporte intra-Golgi e ancoragem (11)

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Figura 6 - Os nove passos do ciclo da vescula sinptica, de acordo com Sdhof

(4)

3. Fuso/Exocitose: As membranas da VS e pr-sinptica se fusionam completamente, aps rpida entrada de Ca2+ no citosol. Uma ou poucas vesculas so levadas fuso completa, e o NT extrudo para a fenda sinptica. 4. Endocitose: As membranas das vesculas extrudas so internalizadas nos locais demarcados com clatrina, formando vesculas cobertas. 5. Translocao: As vesculas cobertas migram em direo ao endossoma, sofrem acidificao, e perdem a cobertura de clatrina. 6. Fuso com o endossoma: Nesta etapa, h um alto teor da protena Rab5 nas vesculas sinpticas. A Rab5 um marcador endossomal. 7. Budding (Brotamento): Estrangulamento do endossoma primrio, com formao de VSs prontas para a recaptao de NT. 8. Recaptao de NT: As vesculas acumulam NT em seu interior, atravs de transporte ativo, dirigido por gradiente eletroqumico, produzido por uma bomba de prtons. 9. Translocao: As VSs migram de volta ao pool vesicular, e seguem para a zona ativa. Processos difusionais, orientados pelo citoesqueleto, participam da migrao vesicular. Durante o Priming, que provavelmente 176

deflagrado por despolarizao do terminal axonal, ocorre a formao de um complexo protico, formado por sintaxina, SNAP-25 e sinaptobrevina(15). No estado de Docking, o complexo no se forma, porque protenas especficas, tais como Munc-18 e sinaptofisina, impedem a interao da sintaxina e sinaptobrevina, respectivamente(25,26,27) (Figura 7). Depois da formao do ncleo 7S, junta-se a ele outra protena, a SNAP, que, por sua vez, cria um ponto de ligao para a protena NSF, formando um segundo complexo protico, chamado 20S. A NSF, clivando ATP, faz com que o complexo 20S seja inativado e haja a formao de um estado de hemifuso entre as membranas plasmtica e vesicular(28,29). Uma vez formado este estado de hemifuso, a entrada de Ca2+ produz a alterao conformacional na sinaptotagmina, cujo domnio C2A dispara, fuso vesicular completa(4,6,7,30,31). O domnio C2B da sinaptotagmina parece estar envolvido na recaptao de membrana aps a extruso(6,7). A formao das cavolas encapadas com clatrina (pits de clatrina) e, conseqentemente, a endocitose so iniciadas pela desfosforilao da protena dinamina pela calcineurina. A dinamina se liga ento protena AP2, possibilitando a ligao da AP2 sinaptotagmina, no domnio C2B, levando ao processo de endocitose(7,32,33).

Aspectos moleculares da transmisso sinptica

O clcio O Ca2+ desempenha um importante papel na regulao de uma grande variedade de processos neuronais. Os neurnios utilizam fontes extra e intracelulares deste on. O influxo de Ca2+ atravs dos canais operados por voltagem provoca a secreo do NT. Tal influxo leva formao dos microdomnios de clcio que se localizam, preferencialmente, nas zonas ativas dos terminais pr-sinpticos, em correspondncia com os pools de VSs(34). A liberao do NT tambm pode ser regulada pelo Ca2+ liberado de estoques intracelulares(35/38), com a participao de canais de Ca+2 ativados por inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) ou rianodina (RYRs), distribudos pelo retculo endoplasmtico (RE) e responsveis pelo aumento da concentrao de Ca2+ necessria para a exocitose. O retculo endoplasmtico uma rede contnua, distribuda por toda a clula. Pode ser considerado como um neurnio dentro de outro neurnio devido ao fato de apresentar, como a membrana plasmtica, propriedades integrativas e regenerativas, que poderiam desempenhar um papel importante na sinalizao neural(39). A despolarizao induz, pelo menos, dois processos, a abertura de canais de Ca2+ operados por voltagem (a entrada de Ca+2 se d em 0,8 ms) e a ativao da maquinaria de liberao do NT. A maquinaria de liberao do NT formada pelo complexo protico pr-sinptico, prximo aos canais de Ca2+. De acordo com o estado conformacional desse complexo, como discutido na sesso anterior, a maquinaria ativada ou desativada. O estado ativado interage com o Ca2+ e induz a fuso de membranas e a liberao do NT. A repolarizao desativa esse estado, voltando a uma situao indiferente s altas concentraes de Ca2+. O Ca2+, ento, necessrio como cofator e no controla o tempo de liberao, mas, sim, junto com o estado ativo, a quantidade de liberao(18). O que parece ocorrer uma adaptao dos receptores proticos aos altos nveis de clcio, limitando a quantidade de NT liberada pelo terminal. Nessa condio, as vesculas sinpticas tm diminuda sua fuso mesmo na 177

Figura 7 - Detalhe das interaes proticas durante a exocitose e incio da endocitose da vescula sinptica (VS). A-C, provveis etapas da exocitose mediada por Ca+2 e rpida endocitose. A) o docking (ancoragem) comea quando a sintaxina (Synt) interage com Munc18 (M), e sinaptobrevina (Syb) com a sinaptofisina (Syph). B) durante o priming, a SNAP-25 forma um complexo com a Synt, criando um stio de ligao de alta afinidade para a Syb. Esse complexo atua como receptor para alfa, beta e gama-SNAPs, onde se liga NSF. A NSF rompe o complexo sinptico atravs da hidrlise de ATP, levando hemifuso com Syb. Sinaptotagmina (Stg) conecta a VS membrana pr-sinptica (MPS) mediante a neurexina e atua como sensor de Ca+2 pelo seu domnio C2A. Durante a despolarizao da MPS, o canal de Ca+2 operado por voltagem aberto. O Ca+2 ativa o domnio C2A, completando a fuso das membranas mediante interao com Synt. C) imediatamente aps a fuso, o domnio C2B da Stg atua como receptor para o complexo de clatrina (AP2). Dinamina se associa a AP2, produzindo a endocitose. (Figura original dos Autores).

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presena de Ca2+. A adaptao contribui para o encerramento da liberao(40). A Fenda sinptica Espao de aproximadamente 10-50 nm entre o terminal axonal pr-sinptico e a membrana ps-sinptica. A FS contnua com o fluido extracelular que serve como condutor de baixa resistncia para o deslocamento inico, alm da superfcie sinptica. Algumas vezes, h filamentos inter-sinpticos que servem para manter associadas as membranas pr e pssinpticas e, talvez, guiar os neurotransmissores a seus stios receptores (41). Esse material constitudo por proteoglicanas com propriedades hidroflicas, que produzem fluidos mucilaginosos e lubrificantes. Tambm, observa-se, na fenda, a presena de caderinas, molculas de adeso celular, envolvidas na manuteno da sinapse (42). Clulas gliais prximas FS, provavelmente, participam na remoo de NT aps a repolarizao e na sinalizao interneural. Diferentes glicoprotenas so encontradas nas membranas sinpticas associadas enzimas de vrios tipos, como glicosil transferases, que alteram as estruturas glicdicas de glicoprotenas, e exoglicosidades. Provavelmente, o tamanho da fenda determina o tempo em que o NT secretado alcana a membrana ps-sinptica (Tabela I). A remoo de neurotransmissores da FS, aps sua liberao, um processo finamente orquestrado. Se a substncia neurotransmissora liberada permanecesse mais do que o necessrio, um novo sinal que chegasse ao terminal poderia ser bloqueado. A sinapse poderia se tornar refratria devido dessensibilizao dos receptores pela contnua exposio aos neurotransmissores. Conhecem-se trs mecanismos pelos quais o tecido nervoso retira o excesso de substncias transmissoras solveis e no ligadas a receptores: difuso, degradao enzimtica e reabsoro. A difuso remove lentamente uma parte dos mensageiros qumicos presentes na fenda. A degradao enzimtica feita pela enzima acetilcolinesterase, no sistema colinrgico. A enzima inativa rapidamente as molculas de acetilcolina (Ach) na fenda, encurtando a transmisso sinptica e favorecendo a recaptura da colina pelo terminal. Existem muitas vias enzimticas que degradam neurotransmissores dentro dos neurnios. Essas enzimas podem ser importantes para controlar a concentrao de NT intraneuronal ou inativ-los aps a secreo na fenda. Muitas dessas vias so de importncia clnica, for178

necendo stios para a ao de drogas e oportunidade de diagnstico. A reabsoro , talvez, o mecanismo mais comum de inativao de neurotransmissores. Nos terminais neuronais, existe reabsoro de alta afinidade, mediada por protenas transportadoras e, tambm, por clulas gliais. Mecanismos como este foram descritos para norepinefrina, dopamina, serotonina, glutamato, GABA, glicina e colina, sendo neurnioespecficos. Algumas drogas psicotrpicas cocana e antidepressivos tricclicos bloqueiam esses processos. Os transportadores de neurotransmissores dependem de antiporte inico, geralmente Na+, e operam com consumo de ATP. O COMPLEXO PS-SINPTICO Receptores As protenas receptoras de neurotransmissores (Tabela I) podem ser classificadas em dois grupos de protenas membranares: os receptores do tipo canal inico (ionotrpicos) e os receptores acoplados a protenas-G (metabotrpicos). So duas superfamlias, que apresentam diferentes mecanismos de respostas e modulaes frente aos neurotransmissores (43). Receptores Ionotrpicos So protenas compostas de vrias subunidades, associadas membrana plasmtica. Exibem considervel heterogeneidade na composio de suas subunidades, refletindo-se na diversidade funcional dos receptores. Um exemplo a presena de uma subunidade especfica no receptor para GABA - GABAA, que lhe confere sensibilidade ao etanol. Os receptores ionotrpicos apresentam, em sua estrutura, um stio de ligao para o NT e um canal inico intrnseco. A despolarizao ou hiperpolarizao da membrana ps-sinptica depende da permeabilidade desse canal a ons especficos. Alguns canais inicos, como os ativados por Ach (tipo nicotnicos), glutamato e serotonina (tipo 5-HT3), possuem permeabilidade no especfica para ctions univalentes e geram despolarizao por influxo de Na+ atravs da membrana. O receptor de glutamato do tipo N-metilD-aspartato (NMDA), alm de ter alta condutncia ao Na+, apresenta alta condutncia ao Ca+2 (Figura 8). Receptores do tipo GABAA, assim como aqueles para o aminocido glicina, so permeveis aos ons _ Cl . A passagem desses ons pela membrana plasmtica, geralmente, conduz a uma hiperpolarizao do terminal ps-sinptico.

Aspectos moleculares da transmisso sinptica

Alm do stio de ligao ao NT, os receptores ionotrpicos possuem, em sua estrutura protica, regies de interao com outras molculas. Esses stios distintos tm a capacidade de modular seu comportamento bioqumico mediante os diferentes estados do organismo (Figura 8). Os receptores GABAA, por exemplo, tm sua funo potencializada por drogas benzodiazepnicas e barbitricos. Receptores do tipo NMDA, por outro lado, so inibidos pela droga fenciclidina e correlatos. Esses receptores apresentam uma cintica de curta latncia, da ordem de ms, e a dissociao do NT provoca um rpido fechamento do canal, importante na rpida sinalizao dentro do SN. Alm disso, apresentam uma perda de atividade por exposio prolongada a agonistas, fenmeno denominado de dessensibilizao. Esse evento limita a resposta ps-sinptica a elementos pr-sinpticos em alta atividade.

Receptores acoplados a protenas-G (Metabotrpicos) Os receptores metabotrpicos diferem dos receptores ionotrpicos, tanto estrutural quanto funcionalmente. Eles consistem de uma nica cadeia polipeptdica que apresenta sete domnios transmembranares. Dentre os receptores dessa classe, encontramse os receptores muscarnicos para Ach, todos os receptores dopaminrgicos e adrenrgicos, todos os serotoninrgicos ( exceo do receptor 5-HT3), alguns glutamatrgicos, o receptor GABAB, o de histamina, dos canabinides e todos os receptores conhecidos de neuropeptdeos. Essas protenas receptoras operam atravs de seu acoplamento a protenas-G, assim chamadas por se ligarem a molculas de GTP (na forma ativa) e GDP (na forma inativa). Pertencem a uma famlia distinta das protenas Rab, que participam da secreo sinptica (Figura 9). Cada receptor metabotrpico interage com um tipo especfico de protena-G, o que lhe confere especificidade na resposta celular. Uma vez ativada, a protena-G age, estimulando ou inibindo protenas efetoras que, em geral, catalizam a sntese de segundos mensageiros: cAMP, cGMP, diacil glicerol (DAG), IP3 (inositol trifosfato) e cido araquidnico (AA). Durante a cascata de ativao celular, essas molculas iro desencadear uma variedade de processos bioqumicos, que podem incluir da abertura ou fechamento de canais inicos at a sntese protica (Figura 10). Os eventos celulares, mediados por segundos mensageiros, tm latncias de ms, at minutos. Por tais Figura 8 - Desenho esquemtico de um receptor glutamatrgico, ionotrpico do tipo NMDA, mostrando vrias possibilidades de modulao de sua atividade. O glutamato (agonista caractersticas, esse sisteendgeno) interage diretamente com o receptor, produzindo aumento nas condutncias de ma atua na sinalizao lenNa+, K+ e Ca+2 atravs do canal. Outras molculas e ons apresentam stios de ligao neste ta porm sustentada, modureceptor, modulando sua atividade positivamente (glicina, poliaminas) ou negativamente (Mg+2, Zn+2, fenciclidina). FC, fenciclidina. Adaptado de Robert, 1997 (43). lando a atividade de neurotransmisso rpida. Tam179

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Figura 9 - Modelo de ao de receptores acoplados a protenas-G. Aps a interao do agonista com o receptor, a subunidade da protena-G troca uma molcula de GDP por uma molcula de GTP ligada em sua estrutura. Esta subunidade se dissocia das subunidades e , e interage com protenas efetoras que produzem molculas de segundos mensageiros e respostas intracelulares especficas. A atividade GTPsica da subunidade hidrolisa GTP em GDP, levando reassociao com e sua inativao (43).

bm observada a modulao direta de protenas-G sobre canais inicos, com latncia mais curta. Plasticidade sinptica At o momento, falamos a respeito dos mecanismos moleculares envolvidos na transmisso sinptica, sem considerarmos como o organismo utiliza essa unidade funcional para gerar a imensa variedade de comportamentos de um animal. Cada sinapse funciona independentemente e apresenta um padro de atividade dinmico, onde suas propriedades podem se modificar ao longo do tempo, em resposta a estmulos do ambiente e mediante experincia. A essas modificaes damos o nome de Plasticidade Sinptica. Vrios tipos de plasticidade sinptica ocorrem no SN, dentre eles a Potenciao de Longa Durao (LTP) e a Depresso de Longa Durao (LTD), que so fenmenos caracterizados por aumento ou reduo na eficcia da comunicao sinptica, respectivamente, e so os principais correlatos moleculares dos processos de aprendizado e memria (44). 180

LTP A Potenciao de Longa Durao (LTP) pode ser definida como um aumento persistente (de horas/dias) do potencial de repouso da clula ps-sinptica, desencadeado por um estmulo tetnico em uma via sinptica especfica (estmulo de 100Hz). Aps uma srie de eventos bioqumicos nos terminais pr e/ou ps-sinpticos, esse estmulo promove o aumento da eficincia de transmisso sinptica naquela via, ou mesmo, em uma via associada(44,45,46). A LTP ocorre em vrias reas do crebro e pode ser classificada em dependente ou independente de receptores glutamatrgicos do subtipo NMDA. Na presente reviso, procuraremos focalizar, mecanisticamente, apenas a LTP induzida no hipocampo e dependente de receptores NMDA (Figura 11). Induo da LTP - papel dos receptores NMDA e dos ons de clcio O hipocampo uma estrutura cortical, envolvida na formao da memria, em mamferos, onde pri-

Aspectos moleculares da transmisso sinptica

Primeiro mensageiro
Canais inicos Neurotransmissor ou outro mensageiro extracelular
Receptor Protena G

Regio ps-sinptica ou dendrtica

Segundo mensageiro
cAMP cGMP Ca2+ Diaciglicerol IP3

Terceiro mensageiro
Protena quinase Defosfoprotena Fosfoprotena

Protena fosfatase

Respostas multifisiolgicas

Processo mediatrio rpido Ativao ou inibio dos canais inicos

Processo modulatrio de curta durao Metabolismo geral, sntese e liberao do neurotransmissor, sensibilidade do receptor, potencial de membrana e LTD

Processo modulatrio de longa durao Sntese dos canais, receptores, mensageiros intracelulares, etc Sinaptognese Aprendizado e memria

Figura 10 - Esquema ilustrativo da cascata de eventos intracelulares, desencadeados pela interao de uma molcula agonista com seu receptor acoplado protena-G Diacilglicerol (43).

meiro se identificou o fenmeno de LTP. No hipocampo, a induo da LTP somente se realiza quando um estmulo de alta frequncia, como o tetnico, ativa simultaneamente o neurnio pr e ps-sinptico, envolvidos em uma via de transmisso, como postulado por Donald Hebb(47). Esse tipo de estmulo necessrio para a ativao de receptores glutamatrgicos do subtipo NMDA no neurnio ps-sinptico(48). Sabe-se que receptores glutamatrgicos do subtipo AMPA (-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropionato) tambm localizam-se no neurnio ps-sinptico(48). Durante a estimulao de baixa freqncia, somente os receptores AMPA contribuem para a despolarizao do neurnio ps-sinptico. Os receptores NMDA, em tais condies, mantm-se fechados e impermeveis entrada de Ca2+ e Na+. O estmulo de baixa frequncia no competente para retirar o bloqueio produzido pelo on magnsio, que, constitutivamente, bloqueia seu canal, mesmo com a ligao do glutamato em seu stio receptor. O desbloqueio do canal operado por voltagem. Somente quando o agonista est ligado ao receptor e a clula est suficientemente des-

polarizada, ele se abre(48,49). Portanto, na estimulao de alta freqncia, tanto receptores AMPA quanto NMDA estaro ativados e contribuindo para a resposta ps-sinptica, enquanto que, em estmulos de baixa freqncia, somente se ativam os receptores AMPA. O uso de antagonistas de receptores NMDA faz com que a induo de LTP fique bloqueada, aumentando, assim, as evidncias da participao desses receptores no processo(50,51). A aplicao de EGTA (um quelante de Ca2+) no neurnio ps-sinptico inibe a induo da LTP, indicando a importncia do Ca2+ na iniciao do fenmeno(52). Alm disso, tcnicas experimentais de imagem, atravs do uso de corantes especiais, permitem demonstrar o aumento da concentrao de Ca2+ nos espinhos dendrticos ps-sinpticos, aps a induo de LTP(53). Alm do Ca2+, provindo da ativao dos receptores NMDA, a ativao de canais de Ca2+ operados por voltagem e de estoques intracelulares de Ca2+, devem contribuir para o alcance da concentrao necessria ao disparo da LTP. A liberao de Ca+2, dos estoques intracelulares, seria ativada pelo prprio 181

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Figura 11 - Vias excitatrias, usadas no estudo de LTP e LTD, em fatias de hipocampo. No circuito hipocampal, o crtex entorrinal projeta fibras para as clulas granulares atravs da via perfurante e os axnios das clulas granulares (fibras musgosas) fazem sinapses com clulas piramidais da camada CA3. Estas, por sua vez, se projetam para a camada CA1 (colaterais de Schaffer) que retornam ao crtex entorrinal(45). A LTP pode ser observada nestas sinapses que utilizam, principalmente, o glutamato como neurotransmissor.

on (via receptor NMDA) e por molculas de IP3 liberadas durante a ativao de receptores glutamatrgicos do tipo metabotrpico - mGlu (44). Em resumo, o aumento da resposta ps-sinptica gerada pode ser o resultado da ao final de vrios compartimentos: 1. modificaes pr-sinpticas: na quantidade de L-glutamato liberado por impulso; 2. modificaes ps-sinpticas: aumento no nmero de receptores ps-sinpticos ou alteraes em suas propriedades funcionais; 3. alteraes extra-sinpticas: reduo na recaptao de L-glutamato pelas clulas gliais, aumentando a disponibilidade do NT; 4. alteraes morfolgicas. Mecanismos de transduo do sinal aps ativao de receptores NMDA A induo da LTP, no terminal ps-sinptico, envolve uma intrincada cascata de eventos bioqumicos. Ao longo do processo, muitas protenas entram em cena, tendo destaque as protenas quinases. Den182

tre elas, temos a protena quinase II dependentes de Ca2+/calmodulina (CaMKII), a protena quinase C (PKC) e a protena quinase A (PKA). As duas primeiras j so conhecidas por serem ativadas de uma maneira dependente de receptor NMDA atravs de estimulao tetnica(48,54). A PKA, por sua vez, ativada na presena de altos nveis de cAMP, gerados pela ao da enzima adenilato ciclase, existentes durante a LTP(55). Inibidores dessas enzimas so capazes de reduzir e/ou impedir a LTP(44). O mesmo ocorre em animais que apresentam ausncia da expresso do gene para CaMKII (56). Esta enzima, quando ativada por Ca2+/calmodulina, se autofosforila, adquirindo atividade permanente, a qual, somada com a de outras quinases, pode explicar a manuteno da LTP por perodos prolongados(57). Considerando que a LTP tenha um tempo de durao longo, porm varivel, tem-se suposto que aquelas formas mais curtas utilizam, para a sua manuteno, protenas quinases j sintetizadas, enquanto as formas mais longas, envolveriam, alm disso, a ativao da expresso gnica dessas enzimas(44).

Aspectos moleculares da transmisso sinptica

A entrada de grandes quantidades de Ca2+, via receptor NMDA, alm do Ca2+o provindo dos estoques intracelulares e dos canais de Ca2+ operados por voltagem, ativa a calmodulina. Essa protena que modulada por Ca2+, interage com a protena quinase CaMKII, ativando-a. A CaMKII, por sua vez, pode atuar, modificando a cintica de receptores AMPA, aumentando sua condutncia ao Na+ ou sua afinidade pelo L-glutamato, incrementando a resposta ps-sinptica a estmulos subseqentes e conseqente LTP(48). De fato, o uso do inibidor de quinases K-252b dificulta a LTP(58). Outra quinase possvel de executar fosforilao de receptores AMPA a PKA, visto que esses receptores, em sua seqncia primria, possuem uma srie de regies candidatas a serem stios de fosforilao da citada enzima(44). A ao da PKA mantm ativo o inibidor da protena fosfatase 1, sendo um evento importante para a manuteno da LTP, j que a protena fosfatase 1 antagoniza o efeito da LTP, favorecendo a LTD. Isso se d pela desfosforilao de quinases(48) (Figura 12). Os eventos moleculares, desencadeados pela LTP, podem aumentar o nmero de receptores AMPA

no neurnio ps-sinptico, ativando sua expresso gnica(59). Tambm poderiam modificar o processamento ps-traducional das cadeias polipeptdicas, constituintes do citado receptor, facilitando a produo de um receptor AMPA com cintica mais rpida(44). No terminal ps-sinptico, a PKC tambm pode fosforilar os receptores NMDA, diminuindo sua susceptibilidade ao bloqueio por ons Mg2+(60). Outras substncias, como o AA e IP3, liberadas pela ativao dos receptores mGlu, podem potenciar a funo dos receptores NMDA(61,62). Essas modificaes seriam responsveis pelo aumento da eficincia de transmisso sinptica em uma determinada via neuronal. Durante muito tempo, foi discutido se o aumento da eficincia na transmisso sinptica, levada a termo pela LTP, ocorreria apenas no terminal ps-sinptico, ou somente no terminal pr-sinptico. Apesar de ainda haver controvrsias, o mais aceito que as modificaes ocorram em ambos os terminais(44,63,64). A possibilidade de modificaes pr-sinpticas, sugere a existncia de mensageiros retrgrados, que, produzidos ao nvel ps-sinptico, atingiriam o terminal prsinptico, promovendo alteraes que levariam LTP.

Vias sinpticas estimuladas simultaneamente a diferentes freqncias

Estimulao tetnica de 100 Hz durante 1s no neurnio pr-sinptico inicia LTP LTP 1 Via 1 Fluxo de Ca+2 em direo ao stio 2 Via 2 LTD 2 Neurnio pr-sinptico sob estimulao de baixa frequncia (5Hz)
Figura 12 - Mecanismos bioqumicos que definem a formao de LTP ou LTD numa via sinptica, de acordo com a concentrao de Ca+2 alcanada no neurnio ps-sinptico. A via I ativada em altas concentraes de Ca+2 e a via II em concentraes baixas deste on. Se a PKA ativada (via I), o inibidor da fosfatase I fosforilado, impedindo a desativao da enzima CaMKII pela fosfatase I, facilitando ento a LTP. Por outro, se a calcineurina ativada (via II), o inibidor da fosfatase I desfosforilado, permitindo a desativao da enzima CaMKII, facilitando a LTD. Adaptada de Lindon & Connor, 1995(92)

Neurnio ps-sinptico

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Os mensageiros, no terminal pr-sinptico, aumentariam a quantidade de NT liberado a cada impulso e tambm poderiam inibir a recaptao de glutamato em clulas gliais(44). Dois candidatos a mensageiros retrgrados so o xido ntrico (NO) e o AA. A favor do NO existem as seguintes evidncias: 1 - em cultura de neurnios, o NO tem sua concentrao aumentada no meio extracelular aps a LTP(65); 2 - induz aumento de freqncia nos potenciais em miniatura, em cultura de clulas hipocampais(66) e 3 - inibidores da enzima sintase do xido ntrico (NOS) bloqueiam a LTP(67). No entanto, estudos histoqumicos tm demonstrado a presena dessa enzima nos interneurnios hipocampais e sua ausncia nas clulas do giro denteado e clulas piramidais(68). H um aumento na concentrao de AA no meio extracelular de neurnios em cultura, aps LTP(69). Inibidores da fosfolipase A2, enzima que libera tal composto a partir de fosfolipdeos da membrana, bloqueiam a LTP(70). H ainda a possibilidade de o K+ e de o glutamato agirem como mensageiros no terminal prsinptico(44). Suspeita-se que o mensageiro retrgrado aumente a liberao do NT atravs da manuteno de elevadas concentraes de Ca+2 no terminal pr-sinptico, durante a LTP(71). Outra possibilidade seria um maior influxo de Ca+2 por potencial de ao(44) e/ou um aumento da afinidade da maquinaria celular pelo Ca2+(72). LTD A LTD, descrita como uma diminuio atividade dependente na transmisso sinptica, por longos perodos, tem sido identificada principalmente no hipocampo(73), entre neurnios piramidais da rea CA3 e CA1 (Figura 11), e no cerebelo(74,75), entre fibras paralelas (FP) e clulas de Purkinje (CP). Durante a ltima dcada, alguns mecanismos que controlam a induo dessa forma de plasticidade sinptica tm sido identificados. A induo de LTD na via das FPs desencadeada pelo influxo de Ca+2 em CPs, atravs de canais de Ca+2 operados por voltagem e pela ativao de receptores de glutamato ionotrpico do tipo AMPA e metabotrpico do tipo mGluR1. , geralmente, aceito que, aps o aumento da concentrao de Ca+2 intracelular, ocorra uma cascata de segundos mensageiros envolvendo a ativao da protena kinase C (PKC) e a produo de NO(76). Mais especificamente na LTD hipocampal, a entrada de Ca2+, via receptores NMDA, ativaria a protena calcineurina, uma fosfatase dependente de Ca2+-calmodulina (fosfatase 2B;) (77,78) conduzindo desfosforilao do inibidor 1, protena que, em seu estado fosforilado, inibe a ativao da fosfoprotena 184

fosfatase 1 (PP1)(79). A desinibio de PP1 o evento subjacente diminuio da transmisso sinptica, associada LTD. Bolshakov & Siegelbaum(80) mostraram a participao do cido araquidnico como um mensageiro retrgrado durante a manuteno da LTD. Embora o Ca+2 tenha se mostrado de real importncia na LTD cerebelar, o significado fisiolgico da liberao de Ca+2 de estoques intracelulares permanece em discusso. Dendritos das CP expressam dois tipos de estoques de liberao interna: os sensveis a rianodina e os sensveis a (IP3), sendo sugerido que a cascata de eventos que conduz LTD pode envolver a liberao desses estoques alm da entrada de Ca+2 pelos canais operados por voltagem(81,82). Mesmo que, em alguns protocolos, a liberao de Ca+2 de estoques intracelulares seja necessria para induzir LTD, ainda no est claro se esta liberao, combinada com a despolarizao de CP suficiente para gerar LTD, na ausncia de estimulao das fibras paralelas. Alguns experimentos, em fatias de cerebelo, reforam a idia de que o NO um sinal crucial nos eventos que levam LTD. No cerebelo, a enzima sintase do xido ntrico neuronal (nNOS) tem sido identificada em CP atravs de RT-PCR, a partir de mRNA, obtido por patch-clamp(83). Por outro lado, a nNOS expressa em altos nveis nas fibras paralelas e nas clulas em cesto(84,85). Dada essa localizao, foi sugerido que, aps um aumento de Ca+2 intracelular nas CP, o efluxo resultante de K+, atravs de canais de K+, Ca+2 e dependentes despolariza elementos pr-sinpticos vizinhos, a ponto de produzir NO e ativar a enzima guanilato ciclase de CP prximas, por um efeito parcrino(84,86). Existem algumas evidncias sobre os mecanismos de manuteno da LTD potencialmente envolvidos na memria de longa durao. Em CP em cultura, o estabelecimento de uma fase tardia de LTD cerebelar (comeando 30-45 min. aps o protocolo de induo) requer sntese protica ps-sinptica(87). Alm disso, a completa ativao de PKC, necessria induo de LTD, envolve a ativao da enzima fosfolipase A2 Ca+2 dependente (PLA2), somando-se cascata intracelular de produo de diacilglicerol (DAG) (81,88). O uso de animais geneticamente alterados para diferentes genes tem mostrado ser importante na compreenso da LTD. O bloqueio da expresso do gene para o receptor mGluR11 mostrou alterao na induo de LTD(89,90), enquanto que o bloqueio da protena PKC no apresentou mudanas no padro de LTD cerebelar em camundongos(91), embora inibidores de PKC levem abolio de LTD. Isso mostra que devem existir mecanismos compensatrios.

Aspectos moleculares da transmisso sinptica

LTP ou LTD ? Tanto a LTP, quanto a LTD so processos dependentes de Ca+2. No hipocampo, o que define se uma via sinptica produzir LTP ou LTD a freqncia do estmulo, e o aumento correspondente da concentrao de Ca+2. Em concentraes baixas deste on, haver LTD(92,93), e, em concentraes altas, LTP (43,44,48). Se aps estmulo, altas concentraes de Ca+2 se estabelecerem no terminal ps-sinptico, o on ligado calmodulina ativar enzima adenilato ciclase (AC). A AC, por sua vez, produzir grandes quantidades de cAMP, ativando a PKA. Esta ltima fosforila o inibidor da fosfatase I, impedindo a LTD e facilitando a LTP. No entanto, se a concentrao de Ca+2, atingida no terminal, for apenas baixa, o complexo Ca+2 e calmodulina ativar a enzima calcineurina. A calcineurina desfosforila o inibidor da fosfatase I, permitindo que esta atue sobre protenas como a CaMKII, impedindo a LTP e facilitando a LTD (48,93) (Figura 12).

CONCLUSES E PERSPECTIVAS FUTURAS Pela leitura desta bibliografia, constatamos que, na transmisso sinptica, participam numerosas protenas conhecidas e provavelmente outras desconhecidas e que as funes das protenas conhecidas no esto totalmente elucidadas. Concluimos, portanto, que h muito trabalho a ser realizado por bilogos moleculares e estruturais, bioqumicos, farmaclogos e eletrofisilogos na busca de esclarecer o papel e a interao das protenas sinpticas para chegarmos a compreender o funcionamento do sistema nervoso, inclundo memria, aprendizado e estado de conscincia. AGRADECIMENTOS A Gabriel M. Arisi e Roy E. Larson pela leitura crtica do manuscrito; a Jos Augusto Maulin, Maria Dolores Ferreira e Silvia Regina Andrade Nascimento, pelo excelente auxlio tcnico. JEM, ao suporte tcnico parcial da FAPESP 95/6206-0 e 97/3026-6.

POLLI LOPES AC; CASALETTI ROSA L; BELEBONI RO; PEREIRA RNR; VASCONCELOS CAC & MOREIRA JE. Molecular aspects of synaptic Ttransmission. Medicina, Ribeiro Preto, 32: 167-188, apr./june 1999.

ABSTRACT: The Central Nervous System produces our conscious state out of various external inputs in a continuous stream of information and storing a lifetime of memories, while keeping track of the concentration of our internal fluids and the work of muscles and glands. Synaptic transmission is the key process of all that activity. Billions of neurons communicate with each other via thousands of synapses, each of which is independently regulated. From that complexity, instead of chaos, arises the pristine order of information processed by the brain. The secretion of neurotransmitters at the synaptic active zone is the primary event of interneuronal communication. This process is regulated by a highly orchestrated cycle of membrane trafficking within the presynaptic nerve terminal. Neurotransmitters are stored in synaptic vesicles. Depolarization of the nerve terminal by an action potential results in the opening of voltage-gated Ca2+ channels. The resulting influx of calcium ions triggers exocytosis which is a rapid fusion of the vesicles with the plasma membrane, releasing neurotransmitters into the synaptic cleft. Exocytosis involves the linking of intrinsic membrane proteins of the vesicle and the plasma membranes by specific docking and fusion, the SNARE proteins, at the active zone. The vesicle membranes are rapidly retrieved by endocytosis and the synaptic vesicles recycled within the nerve terminal. The nerve terminal is thus an autonomous unit that contains all elements required for synaptic vesicle exocytosis and proteins responsible for neurotransmitter biosynthesis and vesicular uptake. Once the neurotransmitter have been released, diffuses across the synaptic cleft and combines with receptor molecules in the membrane of the postsynaptic neuron producing, in a fraction millisecond, a large transient increased permeability to Na+ and K+ ions, provoking a net depolarization to about 100mV from the resting potential of about -60mV. This generates an action potential which spreads along the surface of the postsynaptic cell membrane which in turn may trigger Ca2+ movement to the cytosol in the synaptic terminal to generate a new response. Several proteins inside the post synaptic terminal are involved in this process. It is generally accepted that learning and memory result from structural and biochemical changes in specific synapses which alter neurotransmitter release and post synaptic action. These alterations are perceivable electrophysiologically as a long term potentiation (LTP),long term depression (LTD), or a combination of both. UNITERMS: Synapses. Synaptic Vesicles. Synaptic Transmission. Long-Term Potentiation.

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AC Polli Lopes; L Casaletti Rosa; RO Beleboni; RNR Pereira;CAC de Vasconcelos & JE Moreira

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
1 - LLINS RR. A fora da mente. Veja 19 de agosto: 102109, 1998. 2 - KUFLLER SW; NICHOLLS JG & MARTIN AR. From neuron to brain, 2nd. ed. Sinauer Associates, Massachussets, 1984. 3 - LLINS RR. Calcium in synaptic transmission. In: The biology of the brain: From neurons to networks , Freeman WH Publishers, New York, Chap. 4, p. 53-69, 1988. 4 - SDHOF TC. The synaptic vesicle cicle: a cascade of protein-protein interactions. Nature 375: 645-653, 1995. 5 - SMITH SJ & AUGUSTINE GJ. Calcium ions, active zones and synaptic transmitter release. Trends Neurosci 11: 458464, 1988. 6 - MIKOSHIBA K; FUKUDA M; MOREIRA JE; LEWIS FMT; SUGIMORI M; NIINOBE M & LLINS RR. Role of the C 2b of synaptogmin in vesicular release and recycling as determined by specific antibosy injection into the squid giant synapse preterminal. Proc Natl Acad Sci USA 92: 10708-10712, 1995. 7 - FUKUDA M; MOREIRA JE; LEWIS FMT; SUGIMORI M; NIINOBE M; MIKOSHIBA K & LLINS RR. Role of the C 2b domain of synaptogamin in transmitter release as determined by specific antibody injection into the squid giant synapse preterminal. Proc Natl Acad Sci USA 92: 10703-10707, 1995. 8 - RGNIER-VIGOUROUX A; TOOZE AS & HUTTNER WB. Newly synthesized synaptofisin is transported to synaptic-like microvesicles via constitutive secretory vesicles and the plasma membrane. EMBO J 10: 3589-3601, 1991. 9 - VALE RD; REESE TS & SHEETZ MP. Identification of a novel force-generating protein kinesina involved in microtubulebosed motility. Cell 42: 39-50, 1985. 10 - EDWARDS RH. The transport of neurotransmitters into synaptic vesicles. Curr Opin Neurobiol 2: 586-594, 1992. 11 - CAMERON PL; SDHOF TC; JAHN R & DECAMILLI P. Colocalization of synaptofisin with transferrin receptors : implications for synaptic vesicle biogenesis. J Cell Biol 115: 151-164, 1991. 12 - JOHNSTON PA; CAMERON H; STUKENBROK R; JAHN R; CAMILLI PD & SDHOF TC. Synaptofisin is targed to similar microvesicles in CHO and PC12 cells. EMBO J 8: 28632872, 1989. 13 - LINSTEDT AD & KELLY RB. Endocitosis of the synaptic vesicle protein, sinaptofisin, requires the COOH-terminal tail. J Physiol (Paris) 85: 90-96, 1991. 14 - BEARER EL; DEBIRGIS JA; BODUER RA; KOO AW & REESE TS. Evidence for miosin motors on organelles in squid oxoplasm. Proc Natl Acad Sci USA 90: 11252-11256, 1993. 15 - CALAKOS N & SCHELLER RH. Sinaptic vesicle biogenesis, docking, and fusion : a molecular description. Physiol Rev 76, 1-29, 1996. 16 - NELSON N. The vacuolar H+-ATPase - one of the most fundamental ion pumps in nature. J Exp Biol 172: 19-27, 1992.

17 - BURNS ME & AUGUSTINE GJ. Sinaptic structure and function: dynamic organization yields architetural precision. Cell 83: 187-194, 1995. 18 - PARNAS H & PARNAS I. Neurotransmissor release at fast synapses. J Membr Biol 142: 267-279, 1994. 19 - BETZ WJ & BEWICK GS. Optical monitoring of neurotransmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J Physiol (Lond) 460: 287-309, 1993. 20 - RYAN TA & SMITH SJ. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron 14: 983-989, 1995. 21 - SCHWEIZER FE; BETZ H & AUGUSTINE GJ. From vesicle docking to endocytosis: Intermediate reactions of exocytosis. Neuron 14: 689-696, 1995. 22 - MARSAL J; RUIZ-MONTACELL B; BLASI J; MOREIRA JE; CONTRERAS D; SUGIMORI M & LLINAS RR. Block of transmitter release by botulinium C1 action on syntaxin at the squid giant synapse. Proc Natl Acad Sci USA 94: 14871-14876, 1997. 23 - SUGIMORI M; TONG C; FUKUDA M; MOREIRA JE; KOJIMA T; MIKOSHIBA K & LLINAS RR. Presynaptic injection of syntaxin-specific antibodies block transmission in the squid giant synapse. Neuroscience 86: 39-51, 1998. 24 - LLINS RR; SUGIMORI M; LANG EJ; MORITA M; FUKUDA M; NIINOBE M & MIKOSHIBA K . The inositol high-polyphosphate series block synaptic transmission by preventing vesicular fusion : a suid giant synapse. Proc Natl Acad Sci USA 91: 12990-12993, 1994. 25 - HATA Y; SLAUGHTER CA & SUDHOF TC. Synaptic vesicle fusion complex contains unc-18 homologue bound to syntaxin. Nature 366: 347-351, 1993. 26 - JOHNSTON PA & SDHOF TC. The multisubunuit structure of synaptophysin. Relationship between dissulfide bonding and homo-oligomerization. J Biol Chem 265: 8869-8873, 1990. 27 - GARCIA EP; GATTI E; BUTLER M; BURTON J & DE CAMILLI P. A rat brain Sec 1 homologue relatad to ROP and UNC 18 interacts with syntaxin. Proc Natl Acad Sci USA 91: 20032007, 1994. 28 - MCMAHON HT & SDHOF TC. Synaptic core complex of Synaptobrevin, Syntaxin, and SNAP25 forms high affinity SNAP binding site. J Biol Chem 270: 2213-2217, 1995. 29 - WHITEHEART SW; ROSSNAGEL K; BUHROW SA; BRUNNER M; JAENICKE R & ROTHUW JE. N-ethilmaleimide-sensitive fusion protein : a trimeric ATPase whose hydrolysis of ATP is required for membrane fusion. Cell Biol 126: 945-954, 1994. 30 - DAVLETOV BA & SDHOF TC. Ca -dependent conformational change in synaptotagmin I. J Biol Chem 269: 2854728550, 1994. 31 - GEPPERT M; GODA Y; HAMMER RE; LI C; ROSAHL TW; ++ STEVENS CF & SDHOF TC. Synaptotagmin I: a major Ca sensor for transmitter release at a central synapse. Cell 79: 717-727, 1994. 32 - ZHANG JZ; DAVLETOV BA; SDHOF TC & ANDERSON RGW. Synaptotagmin I is a high affinity receptor for clathrin AP2: implications for membrane recycling. Cell 78: 751-760, 1994.
++

186

Aspectos moleculares da transmisso sinptica

33 - WANG LH; SDHOF TC & ANDERSON RGW. The appendage domain of alpha-adaptin is a high affinity binding site for dynamin. J Biol Chem 270: 10079-10083, 1995. 34 - LLINS RR; SUGIMORI M & SILVER RB. The concept of calcium concentration microdomains in synaptic transmission. Neuropharmacology 34: 1443-1451, 1995. 35 - BLCHL A & THOENEN H. Characterization of nerve growth factor release from hippocampal neurons evidence for a constitutive and an unconventional sodium-dependent regulated pathway. Eur J Neurosci 7: 1220-1228, 1995. 36 - PENG YY. Ryanodine-sensitive component of calcium transients evoked nerve firing at presynaptic nerve terminals. J Neurosci 16, 6703-6712, 1996. 37 - SMITH AB & CUNNANE TC. Ryanodine-sensitive calcium stores involved in neurotransmitter release from sympathetic nerve terminals of the guinea pig. J Physiol (Lond) 497: 657-664, 1996. 38 - TSE FW; TSE E; HILLE B; HORSTMANN H & ALMERS W. Local Ca2+ release from internal stores controls exocytosis in pituitary gonodotrophs. Neuron 18: 121-132, 1997. 39 - BERRIDGE M. 13-26, 1998. Neuronal calcium signaling. Neuron 21:

52 - LYNCH G; LARSON J; KELSO S; BARRIONUEVO G & SCHOTTLLER F. Intracellular injection of EGTA block inducion of hippocampal long-term potentiation. Nature 305: 719-721, 1983. 53 - MLLER M & CONNOR JA. Dendritic spines as individual neuronal compartments for sinaptic Ca ++ responses. Nature 354: 73-76, 1991. 54 - SCKTOR TC; OSTEN P; VALSAMIS H; JIANG X; NAIK M & SUBLETTE E. Persistent activation of the isoform of protein kinase C in the maintenance of long-term potentiacion. Proc Natl Acad Sci USA 90: 8342-8346, 1993. 55 - CHETKOVIH DM;GRAY R; JOHNSTON D & SWEATT JD. N-Methil-D-aspartate receptor activation increases cAMP ++ levels and voltage-gated Ca channel activity in area CA1 of hippocampus Proc Natl Acad Sci USA 88: 6467-6471, 1991. 56 - SILVA AJ; STEVENS CF; TONEGAWA S & WANG Y. Deficient hippocampal long-term potentiation in -CalciumCalmodulin kinase II mutant mice. Science 257: 201-206, 1992. 57 - LISMAN JE & GOLDRING MA. Feasibility of long-term storage of graded information by the Ca++/Calmodulin-dependent protein kinase molecules of the postsynaptic density. Proc Natl Acad Sci USA 85: 5320-5324, 1988. 58 - REYMANN KG; DAVIES SN; MATTHIES H; KASE H & COLLINGRIDGE GL. Inibitors of calmodulin and protein Kinase C block different phases of hippocampal long-term potentiation. Brain Res 461:388-392, 1998. 59 - SOMMER B; KOLLER M; SPRENGEL R & SEEBURGH PH. RNA editing in brain controls a determinant of ion flow in glutamate-gate channels. Cell 67: 11-19, 1992. 60 - CHEN L & HUANG LYM. Protein kinase C reduces Mg ++ block of NMDA-receptors channels as a mechanism of modulation. Nature 356: 521-523, 1992. 61 - MILER B; SARANTIS M; TRAYNELIS SF & ATTWELL D. Potentiation of the NMDA receptor currents by arachidonic acid. Nature 355: 722-725, 1992. 62 - MARKRAN H & SEGAL M. The inositol 1,4,5-trisphosphate pathway mediates cholinergic potentiation of rat hippocampal neuronal responses to NMDA. J Phisiol (Lond) 447: 513-533, 1992. 63 - MANABE T; RENNER P & NICOLL RA. Postsinaptic contribuition to long-term potentiacion revealed by the analysis of miniature synaptics currents. Nature 355: 50-55, 1992. 64 - MALGAROLI A & TSIEN RW. Glutamate-induced long-term potentiation of the frequency of miniature sinaptic currents in cultured hippocampal neurons. Nature 357: 134-139, 1992. 65 - GARTHWAITE J; CHARLES SL & CHESS-WILLIANS R. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptor suggests role as intracellular messenger in the brain. Nature 336: 385-388, 1988. 66 - O,DELL TJ; HAWKINS RD; KANDEL ER & ARANCIO O. Tests of the roles of two diffusible substances in long term-potentiation : evidence for nitric oxide as a possible early retrograde messenger. Proc Natl Acad Sci USA 88: 1128511289, 1991.

40 - HSU SF; AUGUSTINE GJ & JACKSON MB. Adptation of Ca++ - triggered exocitosis in presynaptic terminals. Neuron 17: 501-512, 1996. 41 - DE ROBERTIS E. Ultrastructure and cytochemistry of the synaptic region. Science 156: 907-914, 1967. 42 - UEMURA T. The cadherin superfamily at the synapse: more members, more missions. Cell 93: 1095-1098, 1998. 43 - ROBERT S; FELDMAN JS & MEYER LF. Principles of neuropsycopharmacology . Ed. Sinauer Assoc., Massachussets, 1997. 44 - BLISS, TVP & COLLINGRIDGE, GL. A synaptic model of memory : long - term potentiation in the hippocampus. Nature 361: 31-39, 1993. 45 - MCNAUGHTON BL; DOUGLAS RM & GODDART GV. Synaptic enhancement in fascia dentata : cooperativity among coative afferents. Brain Res 15: 277-294, 1978. 46 - LEVY WB & STEWARD O. Synapses as associative memory elements in the hippocampal formation. Brain Res 175: 233-245, 1979. 47 - HEBB DO. The organization of behavior . Wiley, New York, 1949. 48 - MALENKA RC. Synaptic plasticity in the hippocampus : LTP and LTD. Cell 78: 535-538, 1994. 49 - DAVIES CH; STARKEY SJ; POZZA MF & COLLINGRIDGE GL. GABAb autoreceptors regulate the inducion of LTP. Nature 349: 609-611, 1991. 50 - COLLINGRIDGE GL; KEHLSJ & MCLENNAN HJ. Excitatory aminoacids in synaptic transmission in the Schaffer collateral-commissural pathway of the rat hippocampus. J Physiol (Lond) 334: 36-46, 1983. 51 - BASHIR ZI; TAM B & COLLINGRIDGE GL. Activation of the glicine site in the NMDA receptor is necessary for the inducion of LTP. Neurosci Lett 108: 261-266,1990.

187

AC Polli Lopes; L Casaletti Rosa; RO Beleboni; RNR Pereira;CAC de Vasconcelos & JE Moreira

67 - HALEY JE; WILCOX GL & CHAPMAN PF. The role of nitric oxide in hippocampal long-term potentiation. Neuron 8: 211216, 1992. 68 - BREDT SB & SNYDER SH. Nitric oxide, a novel neuronal messenger. Neuron 8: 3-11, 1992. 69 - DUMUIS A; SEBBEN M; HAYNES L; PIN JP & BOCKAERT J. NMDA receptors activates the arachidonic acid cascade system in striatal neurons. Nature 336: 68-70, 1988. 70 - WILLIANS JH & BLISS TVP. An in vitro study of the effect of lipoxygenase and cyclo-oxigenase inhibitors of arachidoni acid on the indution and maintenance of long-term potentiation in the hippocampus. Neurosci Lett 107: 301-306, 1989. 71 - LYNCH MA & VOSS KL. Presynaptic changes in the longterm potentiation : elevated synaptosomal calcium concentration and basal phosphoinositide turnover in dentate gyrus. J Neurochem 56: 113-118, 1991. 72 - LYNCH MA & BLISS TVP. On the mechanism of enhanced 14 release of [C ]-glutamate in hippocampal long-term potentiation. Brain Res 369: 405-408, 1986. 73 - BEAR MF & MALENKA RC. Synaptic plasticity : LTP and LTD. Curr Opinn Neurobiol 4: 389-399, 1994. 74 - ITO M. Long-term depression. Annu Rev Neurosci 12: 85-102, 1989. 75 - LINDEN DJ. Long-term synaptic depression in the mammalian brain. Neuron 12: 457-472, 1994. 76 - DANIEL H; LEVENES C & CREPEL F. Cellular mechanism cerebellar LTD. Trends Neurosci 21: 401-407, 1998. 77 - MULKEY RM; HERRON CE & MALENKA RC. Na essential role for protein phosphatases in hippocampal long-term depression. Science 261: 1051-1055, 1993. 78 - MLKEY RM; ENDO S; SHENOLIKAR S & MALENKA RC. Involvement of a calciuneurin \inhibitor 1 phosphatase cascade in hippocampal long-term depression. Nature 369: 486-488, 1994. 79 - INGEBRITSEN TS & COHEN P. Protein phosphatases: properties and role in cellular regulation. Science 221: 331-338, 1983. 80 - BOLSHAKOV VY & SIEGELBAUM SA. Hippocampal longterm depression: arachidonic acid as a potentiation retrograde messenger. Neuropharmacology 34: 1581-1587, 1995. 81 - ROSS CA; DANOFF SK; SCHELL MJ; SNYDER SH & ULLRICH A. Three additional inositol 1,4,5-trisphosphate receptors : molecular cloning and differential localization in the brain and peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci USA 89: 42654269, 1992. 82 - KUWAJIMA G; FUTATSUGI A; NIINOBE M; NAKANISHI S & MIKOSHIBA K. Two types of ryanodine receptors in mouse brain: skeletal muscle type exclusively in Purkinje cells and cardiac muscle type in various neurons. Neuron 9: 1133-1142, 1992.

83 - CREPEL F; AUDINAT E; DANIEL H; HEMART N; JAILLARD D; ROSSIER J & LAMBOLEZ B. Cellular locus of the nitric oxidesynthase involved in cerebellar long-term depression induced by high external potassium concentration. Neuropharmacology 33: 1399-1405, 1994. 84 - BREDT DS; HWANG PM & SNYDER SH. Localization of nitric oxide synthase indicating a neural role for nitric oxide. Nature 347: 768-770, 1990. 85 - SOUTHMAN E; MORRIS R & GARTHWAITE J. Sources and targets of nitric oxide in rat cerebellum. Neurosci Lett 137 : 241-244, 1992. 86 - ITO M & KARACHOT L. Protein kinases and phosphatase inhibitors mediating long-term desensitization of glutamate receptors in cerebellar Purkinje cells. Neurosci Res 14: 2738, 1992. 87 - LINDEN DJ. A protein synthesis-dependent late phase of cerebellar long-term depression. Neuron 17: 483-490, 1996. 88 - LINDEN DJ. Phospholipase A2 controls the induction of shortterm versus long-term depression in the cerebellar Purkinje neuron in culture. Neuron 15: 1393-1401, 1995. 89 - CONQUET F; BASHIR ZI; DAVIES CH; DANIEL H; FERRAGUTI F; BORDI F; FRANZ-BACON K; REGGIANI A; MATARESE V & CONDE F. Motor deficit and impairment of synaptic plasticity in mice lacking mGluR1. Nature 372 : 237-243, 1994. 90 - AIBA A; KANO M; CHEN C; STANTON ME; FOX GD; HERRUP K; ZWINGMAN TA& TONEGAWA S. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mGluR1 mutant mice. Cell 79: 377-388, 1994. 91 - CHEN C; KANO M; ABELIOVICH A; CHEN L; BAO S; KIM JJ; HASHIMOTO K; THOMPSON RF & TONEGAWA S. Impaired motor coordination correlates with persistent multiple climbing fiber innervation in PKC gamma mutant mice. Cell 83: 1233-1242, 1995. 92 - LINDEN DJ & CONNOR JA. Long term synaptic depression. Annu Rev Neurosci. 18: 319-357, 1995. 93 - LISMAN J. A mechanism for the Hebb and the anti-Hebb processes underlying learning and memory. Proc Natl Acad Sci USA 86: 9574-9578, 1989. Recebido para publicao em 17/12/98 Aprovado para publicao em 01/06/99

188