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Histrico
M. TSWEET (1903): Separao de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes slidos e solventes variados.
ter de petrleo mistura de pigmentos
CaCO3
pigmentos separados
CROMATOGRAFIA
Princpio Bsico
Separao de misturas por interao diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONRIA (lquido ou slido) e uma FASE MVEL (lquido ou gs).
Modalidades e Classificao
Cromatografia Lquida Cromatografia Gasosa (CG)
CROMATOGRAFIA
FM = Lquido
FM = Gs
CROMATOGRAFIA GASOSA
Histrico
1940
CGS rudimentar CGL proposta (Martin e Synge) Separao de cidos orgnicos por CGL: primeiro cromatgrafo (Martin e James)
1950
Primeiro equipamento comercial (Griffin & George) Detector por Densidade de Gs (Martin e James) Detector por Ionizao em Chama (McWillian e Dewar) Detector por Captura de Eletrons (Lovelock e Lipsky)
1960
Presentemente: Vendas de equipamentos e acessrios para CG nos EUA estimadas em mais de US$ 750.000.000 (1995).
CROMATOGRAFIA GASOSA
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ?
(para uma substncia qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gs ela deve ser dissolver - pelo menos parcialmente nesse gs)
VOLTEIS (=evaporveis)
DE FORMA GERAL: CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e que termicamente estveis.
O Cromatgrafo a Gs
1 2 6
5 3
1 - Reservatrio de Gs e Controles de Vazo / Presso. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrnica de Tratamento (Amplificao) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). Observao: em vermelho: temperatura controlada
INSTRUMENTAO
Gs de Arraste
Fase Mvel em CG: NO interage com a amostra - apenas a carrega atravs da coluna. Assim usualmente referida como GS DE ARRASTE
Requisitos:
INERTE No deve reagir com a amostra, fase estacionria ou superfcies do instrumento.
PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionria.
Impurezas tpicas em gases e seus efeitos:
H2O, O2 hidrocarbonetos
INSTRUMENTAO
Gs de Arraste
Requisitos:
CUSTO Gases de altssima pureza podem ser muito caros.
CUSTO
C A B
PUREZA
COMPATVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gs de arraste especfico para melhor funcionamento.
Seleo de Gases de Arraste em Funo do Detector:
He , H2 N2 , H2 N2 (SS), Ar + 5% CH4
Alimentao de Gs de Arraste
Componentes necessrios linha de gs:
controladores de vazo / presso de gs dispositivos para purificao de gs (traps) 3 4 2 1 6
INSTRUMENTAO
5 1 - Cilindro de Gs 2 - Regulador de Presso Primrio 3 - Traps para eliminar impurezas do gs 4 - Regulador de Presso Secundrio 5 - Regulador de Vazo (Controlador Diferencial de Fluxo) 6 - Medidor de Vazo (Rotmetro) Nota: Tubos e Conexes: Ao Inox ou Cobre
INSTRUMENTAO
t=x
INSTRUMENTAO
1 - Septo (silicone) 2 - Alimentao de gs de arraste) 3 - Bloco metlico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatogrfica
INSTRUMENTAO
1 - Ponta da agulha da microseringa introduzida no incio da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantneamente no incio da coluna. 3 - Plug de vapor de amostra forado pelo gs de arraste a fluir pela coluna.
INSTRUMENTAO
Parmetros de Injeo
TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposio Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulio do componente menos voltil VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado fsico da amostra
COLUNA
empacotada = 3,2 mm (1/4) capilar = 0,25 mm Amostras Lquidas
0,2 mL ... 20 mL 0,01 mL ... 3 mL
Amostras Gasosas
0,1 ml ... 50 mL
INSTRUMENTAO
corpo (pirex)
INSTRUMENTAO
EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m
Recheada com slido pulverizado (FE slida ou FE lquida depositada sobre as partculas do recheio)
INSTRUMENTAO
Temperatura da Coluna
Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE VAPOR (p0). Estrutura qumica do analito Temperatura da coluna
p0 = f
Temperatura da coluna
Presso de vapor
Velocidade de migrao
INSTRUMENTAO
Temperatura da Coluna
INSTRUMENTAO
Forno da Coluna
Caractersticas Desejveis de um Forno: AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA DE USO Pelo menos de Tambiente at 400oC. Sistemas criognicos (T < Tambiente) podem ser necessrios em casos especiais. TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MDULOS No deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector. TEMPERATURA UNIFORME EM SEU INTERIOR Sistemas de ventilao interna muito eficientes para manter a temperatura homognea em todo forno.
TEMPERATURA DA COLUNA
INSTRUMENTAO
Forno da Coluna
Caractersticas Desejveis de um Forno: FCIL ACESSO COLUNA A operao de troca de coluna pode ser frequente. AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RPIDO Importante tanto em anlises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analticas novas.
INSTRUMENTAO
TCOL ALTA:
- Componentes mais volteis no so separados - Componentes menos volteis eluem mais rapidamente
INSTRUMENTAO
TINI Temperatura Inicial TFIM Temperatura Final tINI Tempo Isotrmico Inicial tFIM Tempo Final do Programa R Velocidade de Aquecimento
INSTRUMENTAO
INSTRUMENTAO
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da passagem de substncias que no o gs de arraste
Grfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substncia separada aparece como um PICO no cromatograma.
INSTRUMENTAO
Detectores
Mais Importantes:
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU
FID) ons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD) Supresso de corrente causada pela absoro de eltrons por eluatos altamente eletroflicos. Registradores XY
ANALGICO
REGISTRO DE SINAL
Integradores Computadores
DIGITAL
Tempo de Reteno Ajustado, tR O parmetro diretamente mensurvel de reteno de um analito o TEMPO DE RETENO AJUSTADO, tR: tR tR = tR - tM
SINAL
TEORIA BSICA
tM
TEMPO tR = Tempo de Reteno (tempo decorrido entre a injeo e o pice do pico cromatogrfico) tM = Tempo de Reteno do Composto No-Retido (tempo mnimo para um composto que no interaja com a FE atravesse a coluna) tR = Tempo de Reteno Ajustado (tempo mdio que as molculas do analito passam sorvidas na FE)
Volume de Reteno Ajustado, VR Embora no diretamente mensurvel, o parmetro fundamental de reteno o VOLUME DE RETENO AJUSTADO, VR:
vazo do gs de arraste
TEORIA BSICA
= t R - t M x FC tR
VR = Volume de Reteno (volume de gs de arraste necessrio para eluir um analito) VM = Volume de Fase Mvel (volume de gs de arraste contido na coluna; volume morto) VR = Volume de Reteno Ajustado (volume de gs de arraste consumido enquanto o analito est sorvido na FE) Fatores termodinmicos
VR = f
Parmetros dimensionais da coluna
Constante de Distribuio, KC
Coluna cromatogrfica: srie de estgios independentes onde acontece o equilbrio entre o analito dissolvido na fase estacionria e no gs de arraste:
TEORIA BSICA
KC =
[A]S [A]M
KC = Constante de Distribuio
[A]S = concentrao do analito na FE [A]M = concentrao do analito no gs
Afinidade pela FE
[A]S
[A]M
TEORIA BSICA
Fator de Reteno, k
Exprimindo o equilbrio em termos da MASSA do analito em cada fase, ao invs da concentrao:
FATOR DE RETENO, k: razo entre as massas de analito contidas na FE (Ws) e gs de arraste (WM) RAZO DE FASES, b: razo entre volumes de FE e gs de arraste na coluna
k =
WS WM
b =
VM VS
df = espessura do filme de FE
b =
(rC
- df ) 2rCd f
rC >> df
dC / mm 0.10 0.20 0.20 0.25 0.25 0.32 0.32 0.32 0.53 0.53 0.53
df / m m 0.10 0.11 0.33 0.25 1.00 0.17 0.52 1.00 0.88 2.65 5.00
TEORIA BSICA
Relaes entre VR, KC e
VR depende diretamente da constante de distribuio do soluto entre a FE e o gs de arraste e das dimenses da coluna. Outra combinao possvel:
possvel estimar tanto o fator de reteno quanto a constante de distribuio a partir do cromatograma
TEORIA BSICA
Eficincia de Sistemas Cromatogrficos
A migrao um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos: Separao deficiente de Picos mais largos e analitos com retenes menos intensos = menor detectabilidade prximas.
TEORIA BSICA
Quantificao da Eficincia
Supondo a coluna cromatogrfica como uma srie de estgios separados onde ocorre o equilbrio entre o analito, a FE e o gs de arraste:
tR wb
TEORIA BSICA
Quantificao da Eficincia
ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TERICO (H) Tamanho de cada estgio de equilbrio
(L = comprimento da coluna)
Valores tpicos de H e N:
dC 0.10 0.25 0.32 0.32 0.32 0.32 0.53 0.53 2.16 2.16 df 0.25 0.25 0.32 0.50 1.00 5.00 1.00 5.00 10% 5% H 0.081 0.156 0.200 0.228 0.294 0.435 0.426 0.683 0.549 0.500 N 370370 192308 150000 131579 102041 68966 70423 43924 3643 4000
Capilares, L = 30 m
Empacotadas, L = 2 m
Valores de H para colunas capilares e empacotadas so prximos, mas como L para capilares MUITO maior tipicamente elas so mais eficientes
TEORIA BSICA
Otimizao da Eficincia
A altura equivalente a um prato torico funo da velocidade linear mdia do gs de arraste u:
O valor de H pode ser minimizado otimizandose a vazo de gs de arraste
H
HMIN uMAX
(A, B, C = constantes)
- Colunas Capilares: Equao de Golay
FASES ESTACIONRIAS
Conceitos Gerais
LQUIDOS Depositados sobre a superfcie de: slidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)
FE lquida SUPORTE Slido inerte poroso Tubo capilar de material inerte
SLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfcie interna do tubo (capilar)
FASES ESTACIONRIAS
Caractersticas de uma FE ideal
SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.
FE Seletiva: separao adequada dos constituintes da amostra
Regra geral: a FE deve ter caractersticas tanto quanto possvel prximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromtico ...)
FASES ESTACIONRIAS
Caractersticas de uma FE ideal
AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimizao
da separao.
POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistncia transferncia do analito entre fases)
FASES ESTACIONRIAS
FE Slidas: Adsoro
O fenmemo fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE slida a ADSORO
A adsoro ocorre na interface entre o gs de arraste e a FE slida Slidos com grandes reas superficiais (partculas finas, poros) ADSORO Solutos polares Slidos com grande nmero de stios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...)
FASES ESTACIONRIAS
FE Slidas
Caractersticas Gerais:
- Slidos finamente granulados (dimetros de partculas tpicos de 105 m a 420 m). - Grandes reas superficiais (at 102 m2/g).
Mais usados:
Polmeros Porosos Porapak (copolmero estireno-divinilbenzeno), Tenax (polixido de difenileno) Slidos Inorgnicos Carboplot, Carboxen (carves ativos grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argila microporosa)
- Separao de gases fixos - Compostos leves - Sries homlogas
Principais Aplicaes:
GASES DE REFINARIA Coluna:Carboxen-1000 60-80 mesh; 15 x 1/8 TCOL: 35oC a 225oC / 20oC. min-1 Gs de Arraste: He @ 30 ml.min-1 Detector: TCD
FASES ESTACIONRIAS
Famlias de FE Lquidas
POLIGLICIS Muito polares; sensveis a
umidade e oxidao; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.) Estrutura Qumica: H
O CH2 CH2
OH n
AMINAS ALIFTICAS Coluna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH TCOL: 200oC (isotrmico) Gs de Arraste: N2 @ 20 mL.min-1 Detector: FID Amostra: 0,01 mL da mistura de aminas
FASES ESTACIONRIAS
Famlias de FE Lquidas
Maior parte das aplicaes em CG moderna Quatro grandes grupos estruturais:
POLISTERES steres de dilcoois com dicidos. Polares; altamente sensveis a umidade e oxidao; uso em declnio. Principais: DEGS, EGA, EGS.
STERES METLICOS DE CIDOS GRAXOS Coluna:5%DEGS-PS s/ Supelcoport 100/120 mesh; 6 x 1/8 TCOL: 200oC (isotrmico) Gs de Arraste: N2 @ 20 ml.min-1 Detector: FID Amostra: 0,5 mL de soluo em clorofrmio contendo 0,5 mg de cada ster
FASES ESTACIONRIAS
FE Lquidas: Absoro
O fenmemo fsico-qumico responsvel pela interao analito + FE lquida a ABSORO
A absoro ocorre no interior do filme de FE lquida (fenmeno INTRAfacial) Filmes espessos de FE lquida Grande superfcie lquida exposta ao gs de arraste Interao forte entre a FE lquida e o analito (grande solubilidade)
ABSORO
FASES ESTACIONRIAS
Famlias de FE Lquidas
SILICONES (polisiloxanas) As FE mais empregadas em CG. Cobrem ampla faixa de polaridades e propriedades qumicas diversas.
CH3 H3C Si CH3 R1 O Si R2 CH3 O Si CH3 n CH3
- Ligao Si-O extremamente estvel = elevada estabilidade trmica e qumica das FE.
- Silicones so fabricados em larga escala para diversas aplicaes = minimizao de custo do produto + tecnologia de produo e purificao largamente estudada e conhecida.
- Praticamente qualquer radical orgnico ou inorgnico pode ser ligado cadeia polimrica = FE ajustveis a separaes especficas + facilidade de imobilizao por entrecruzamento e ligao qumica a suportes
FASES ESTACIONRIAS
Famlias de FE Lquidas
FE derivadas de polidimetilsiloxano (PDMS) por substituio de -CH3 por radicais orgnicos, em ordem crescente aproximada de polaridade:
Substituintes
carborano ? fenil 5 % cianopropil 7% fenil 50 % trifluoropropil 50% cianopropil 50% cianopropil 100% fenil 7% fenil 50% -
Nomes Comerciais
SE-30 OV-1 OV-101 SP-2100 Dexsil 300GC SE-52 SE-54 OV-3 OV-5 OV-73 OV-1701 SPB-7 CP-Sil 19CB OV-17 SP-2250 HP-50+ SPB-50 OV-210 QF-1 OV-225 SP-2300 CP-Sil 43CB SP-2340 SP-2330 Silar-9 CP
Observaes
mais apolares da srie pouco seletivas similar a PDMS estvel at > 400oC pouco polar moderadam ente polar moderadam ente polar retm arom ticos moderadam ente polar retm com postos carbonlicos polar retem doadores de eltrons altamente polar
FASES ESTACIONRIAS
Famlias de FE Lquidas
Separao de pesticidas - FE = 100 % PDMS
1 - TCNB 2 - Dichloram 3 - Lindano 4 - PCNB 5 - Pentacloroanilina 6 - Ronilano 7 - Antor 8 - pp-DDE 9 - Rovral 10 - Cypermetrin 11 - Decametrin
17 min
Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 mm) TCOL:195oC (6,5 min) / 195oC a 275oC (10oC.min-1) Gs de Arraste: He @ 35 cm.min-1 Detector: FID
FASES ESTACIONRIAS
Famlias de FE Lquidas
Separao de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone
1 - piridina 2 - 2-metilpiridina 3 - 2,6-dimetilpiridina 4 - 2-etilpiridina 5 - 3-metilpiridina 6 - 4-metilpiridina
Coluna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 mm) TCOL:110oC (isotrmico) Gs de Arraste: N2 @ 16 cm.min-1 Detector: FID Amostra: 0,1mL de soluo 1-2% das piridinas em 3-metilpiridina
3 min
FASES ESTACIONRIAS
Famlias de FE Lquidas
Separao de fenis - FE = fenilmetilsilicones
50% Ph 50% Me
5% Ph 95% Me
FASES ESTACIONRIAS
FE Quirais
Separao de ismeros ticos: PRODUTOS BIOLGICOS Distino entre produtos de origem sinttica e natural (natural = normalmente substncias oticamente puras; sinttico = muitas vezes so misturas racmicas).
FE Quirais
FASES ESTACIONRIAS
FE Quirais
FE oticamente ativas mais importantes:
CH3 O Si CH3 CH3 O CH3 Si CH2
n
C
CH O C O N H
C*
CH CH 3 CH3
Chiralsil-Val
CH3 O Si CH3 O
/2
Chiralsil-Metal
FASES ESTACIONRIAS
FE Quirais
Derivados de ciclodextrinas alquiladas:
b-ciclodextrina:
oligosacardeo cclico quiral
Chiralsil-Dex
- Introduzidas em 1983 - Quando ligadas a cadeias de polisiloxano: uso extremamente favorvel como FE lquida (viscosidade baixa, estabilidade ...) - Podem ser quimicamente imobilizadas nas colunas - Colunas disponveis comercialmente
FASES ESTACIONRIAS
FE Quirais: Aplicaes
leo essencial artificial de limo: separao de terpenos primrios
Coluna: Rt-DEXsm (30 m x 0.32 mm x 0.25 m) TCOL: 1 min a 40C / 2C min-1 / 3 min a 200C Gs de Arraste: H2 @ 80 cm.min-1 Detector: FID
FASES ESTACIONRIAS
FE Quirais: Aplicaes
Aroma de bergamota: distino entre aroma natural e artificial
Essncia artificial
Coluna: Rt-DEXse (30 m x 0.32 mm x 0.25 m) TCOL: 1 min a 40C / 4C min-1 / 200C Gs de Arraste: He @ 80 cm.min-1 Detector: MS
FASES ESTACIONRIAS
FE Quirais: Aplicaes
Anfetaminas: resoluo dos ismeros
Coluna: Rt-DEXcst (30 m x 0.25 mm x 0.25 m) TCOL: 1 min a 120C / 1,5C min-1 / 3 min A 175C Gs de Arraste: He @ 25 cm.min-1 Detector: MS
COLUNAS EMPACOTADAS
Definies Bsicas
Tubo de material inerte recheado com FE slida granulada ou FE lquida depositada sobre suporte slido.
ao inox vidro pirex nquel TEFLON MESH dp 177 - 250 mm 149 - 177 mm 125 - 149 mm
MATERIAL DO TUBO
= 3 mm a 6 mm L = 0,5 m a 5 m
Granulometria do recheio
COLUNAS EMPACOTADAS
FE Lquidas: Suporte
A FE lquida deve ser disposta sobre um SUPORTE slido
rea superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1 microporos regulares (~ 1 mm) NO interagir com a amostra boa resistncia mecnica
DIATOMCEA
secagem calcinao
COLUNAS EMPACOTADAS
FE Lquidas: Suporte
Chromosorb - caractersticas gerais Chromosorb P Rseo, muito ativo. Chromosorb W Branco, mais inerte que o P. Chromosorb G Similar ao W, maior resistncia mecnica
Ordem crescente de inrcia
Densidade Aparente Tamanho de Poro rea Superficial
NOME
Chromosorb P Chromosorb W Chromosorb G
m 2 .g -1
g.ml
-1
mm
0,4 - 2 8-9 -
30 15 5
Tratamentos especiais: AW
Lavado com cido, para remoo de metais
NAW Sem lavagem com cido HP ou DMCS ou HDMS Silanizados (menor adsoro)
% Mx. de FE
COLUNAS EMPACOTADAS
FE Lquidas: Carga de FE
df = f (% FE no recheio)
Maior eficincia (d f = N) Menor sangria da FE com temperatura programada Separaes rpidas e em temperaturas menores
% FE
Maiores volumes de amostra Melhor blindagem dos stios adsortivos do suporte Melhor reprodutibilidade no preparo do recheio
TIPICAMENTE % FE = 1 % a 30 % do recheio
COLUNAS CAPILARES
Definies Bsicas
Tubo fino de material inerte com FE lquida ou slida depositada sobre as paredes internas. MATERIAL DO TUBO
slica fundida vidro pirex ao inox Nylon Silcosteel
Colunas de slica so revestidas externamente com camada de polmero (poliimida) para aumentar resistncia mecnica e qumica
WCOT (Wall coated open tube) FE liquida deposida (ligada // entrecruzada) sobre as paredes internas. PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE slida presa s paredes internas SCOT (Support coated open tube) Predes internas revestidas
com material de recheio similar ao das colunas empacotadas
COLUNAS CAPILARES
Dimetro Interno
dC =
Eficincia
1
1
Colunas de altssima eficincia (amostras complexas, Fast GC); capacidade volumtrica limitada de processamento de amostra Dimetros mais comuns; capacidade volumtrica limitada de amostra requer dispositivos especiais de injeo
Colunas megabore: menor eficincia, mas maior capacidade de processamento permite uso de injetores convencionais
COLUNAS CAPILARES
Fast GC: Colunas Capilares Finas
Alm de colunas finas: necessrio controle acurado de vazo (controle eletrnico de presso) e altas velocidades de aquecimento da coluna. Destilao simulada de leo diesel:
Coluna: HP-1 (1 m x 0.10 mm x 0.40 m) TCOL: 35C / 40C min-1 / 0,75 min A 310C Gs de Arraste: He @ 90 ml.min-1 Detector: FID
COLUNAS CAPILARES
Colunas Capilares: Injeo
Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro)
1 2 3 4 5
1 - Septo; 2 - Entrada de gs de arraste; 3 - Liner (misturador); 4 - Coluna Capilar 5 - Purga de gs de arraste; 6 - Vlvula de controle de purga.
6
- Menor sensibilidade (boa parte da amostra desprezada) - Diviso da amostra raramente uniforme (frao purgada dos constituintes menos volteis sempre menor) - Ajuste da razo de diviso mais uma fonte de erros
COLUNAS CAPILARES
Large Volume Injection (LVI)
Combinando injetores com temperatura programada, vlvulas controladas por microprocessador e pr-colunas pode ser feita injeo de grandes volumes (> 100 m L) de amostra
1 Colunas e
injetor frios; vlvula de purga aberta (solvente eliminado)
2 Colunas e injetor aquecidos; vlvula de purga fechada (constituintes de interesse transferidos para coluna analtica)
COLUNAS CAPILARES
Large Volume Injection (LVI)
Separao de PAH com LVI (Vinj = 25 mL, soluo 400 ppb em CH2Cl2)
Coluna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 m) TCOL: 5 min a 50C / 20C min-1 / 2 min A 320C Gs de Arraste: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID
COLUNAS CAPILARES
Colunas Multicapilares
Feixes paralelos de colunas capilares com dC convencional
- Eficincia prxima das colunas convencionais - Capacidade similar das colunas empacotadas - Colunas mais curtas: anlises mais rpidas
DETECTORES
Definies Gerais
Dispositivos que geram um sinal eltrico proporcional quantidade eluida de um analito ~ 60 detectores j usados em CG
DCT TCD
DIC FID
DCE ECD
Detector por Captura de Eletrons
EM MS
DETECTORES
Parmetros Bsicos de Desempenho
QUANTIDADE MNIMA DETECTVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a trs vezes o nvel de rudo S =3 N
RUDO (N)
RUDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que no se origina da amostra
SINAL (S)
Fontes de Rudo
DETECTORES
Parmetros Bsicos de Desempenho
LIMITE DE DETEO Quantidade de analito que gera um pico com S/N = 3 e wb = 1 unidade de tempo
Mesmo detector, nvel de rudo e massa de analito MAS diferentes larguras de base:
DETECTORES
Parmetros Bsicos de Desempenho
VELOCIDADE DE RESPOSTA Tempo decorrido entre a entrada do analito na cela do detector e a gerao do sinal eltrico.
t
SINAL
63,2% FSD
Constante de Tempo, t : tempo necessrio para o sinal chegar a 63,2 % FSD (full scale deflection = fundo de escala) aps a entrada de amostra
TEMPO A constante de tempo do sistema (detector + dispositivos de registro de sinal) igual ou menor a 10% da largura a meia altura (w0.5 ) do pico mais estreito do cromatograma
t >> w0.5
DETECTORES
Parmetros Bsicos de Desempenho
SENSIBILIDADE Relao entre o incremento de
rea do pico e o incremento de massa do analito
REA
Sensibilidade
DETECTORES
Parmetros Bsicos de Desempenho
FAIXA LINEAR DINMICA Intervalo de massas
dentro do qual a resposta do detector linear
REA
MASSA O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razo (rea / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinao da reta na regio linear:
REA / MASSA
1,05 S
0,95 S
MASSA
DETECTORES
Classificao
UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substncia eluida.
ESPECFICOS: Detectam substncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas
DETECTORES
Detector por Condutividade Trmica
PRINCPIO Variao na condutividade trmica do gs quando da eluio de um analito.
A taxa de transferncia de calor entre um corpo quente e um corpo frio depende da condutividade trmica do gs no espao que separa os corpos
Se a condutividade trmica do gs diminui, a quantidade de calor transferido tambm diminui - o corpo quente se aquece.
i
5
3 4
5 Alimentao de corrente
eltrica para aquecimento do filamento
DETECTORES
Detector por Condutividade Trmica
Configurao tradicional do DCT: bloco metlico com quatro celas interligadas em par - por duas passa o efluente da coluna e por duas, gs de arraste puro:
CELAS DA AMOSTRA CELAS DA AMOSTRA CELAS DE REFERNCIA
CORTE SUPERIOR
CORTE LATERAL
CELAS DE REFERNCIA
Quando da eluio de um composto com condutividade trmica menor que a do gs de arraste puro:
Filamentos nas celas de amostra se aquecem Resistncia eltrica dos filamentos nas celas de amostra aumenta
DETECTORES
Detector por Condutividade Trmica
Os filamentos do DCT so montados numa ponte de Wheatstone que transforma a diferena de resistncia quando da eluio de amostra numa diferena de voltagem:
V Fonte de CC / Bateria (18 V a 36 V, tpico) F Ajuste da corrente nos filamentos I Medida da corrente nos filamentos (100 mA - 200 mA, tpico) B1 B2 Balanceamento / ajuste de zero R1 R2 Filamentos das celas de referncia A1 A2 Filamentos das celas de amostra
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCT
SELETIVIDADE Observa-se sinal para qualquer substncia eluida diferente do gs de arraste = UNIVERSAL
SENSIBILIDADE / LINEARIDADE Dependendo da configurao particular e do analito: QMD = 0,4 ng a 1 ng com linearidade de 104 (ng - dezenas de mg) VAZO DE GS DE ARRASTE O sinal proporcional concentrao do analito no gs de arraste que passa pela cela de amostra.
Fc = 0
VAZO DE GS DE ARRASTE CONSTANTE DURANTE A ELUIO VARIAO DA VAZO DE GS DE ARRASTE DURANTE A ELUIO
Com DCT, a rea dos picos cromatogrficos MUITO dependente da vazo do gs de arraste !!!
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCT
NATUREZA DO GS DE ARRASTE Quanto maior a
diferena Dl entre a condutividade trmica do gs de arraste puro, lA, e do analito, lX, maior a resposta.
Como:
(M = massa molecular)
1
1 2
Usando He ou H2 como gs de arraste, Dl maximizado: MAIOR RESPOSTA Com outros gases, eventualmente lX > lA: PICOS NEGATIVOS
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCT
FATORES DE RESPOSTA Quanto menor a condutividade
trmica do analito, maior o sinal.
lX
CHCl3 Mistura de quantidades equimolares de:
Etano l = 17,5 Clorofrmio l = 6,0 Etanol l = 12,7
Dl
C2H5OH C2H6
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCT
TEMPERATURAS DE OPERAO Quanto maior a diferena entre a temperatura dos filamentos e do bloco metlico maior a resposta.
Temperatura do filamento, TF: entre 300oC e 350oC. funo da corrente de alimentao dos filamentos, i.
TF
Limitaes:
Sinal
- Correntes excessivas podem fundir o filamento ( tpicos do filamento = 20 mm) - Diminuio do tempo de vida til dos filamentos (oxidao por traos de O2 no gs de arraste)
TB
Limitao:
Sinal
- Temperaturas excessivamente baixas podem provocar a condensao de analitos nas celas (erros analticos, danos aos filamentos)
DETECTORES
DCT: Aplicaes
1 Separao e quantificao de compostos que no geram
sinal em outros detectores (gases nobres, gases fixos)
DETECTORES
Detector por Ionizao em Chama
PRINCPIO Formao de ons quando um composto queimado em uma chama de hidrognio e oxignio
O efluente da coluna misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 no existem ons, ela no conduz corrente eltrica.
Quando um composto orgnico elui, ele tambm queimado. Como na sua queima so formados ons, a chama passa a conduzir corrente eltrica
DETECTORES
Detector por Ionizao em Chama
COLETOR
AR
FLAME TIP
H2
BLOCO
COLUNA
O ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se misturam ao efluente da coluna e queimam: Uma diferena de potencial eltrico aplicada entre o flame tip e o coletor - quando se formam ons na chama, flue uma corrente eltrica:
DETECTORES
Detector por Ionizao em Chama
Qumica da Chama de Hidrognio:
Incandescncia
Reao Quebra
Regio de quebra Mistura dos gases, pr-aquecimento, incio da quebra das molculas de H2, O2 e dos analitos. Zona de reao Reaes exotrmicas com produo e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e ons CHO+ (analito). Zona de incandescncia Emisso de luz por decaimento de espcies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visvel).
Queima de H2
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DIC
SELETIVIDADE Seletivo para substncias que contm ligaes C-H em sua estrutura qumica.
(como virtualmente todas as substncias analizveis por CG so orgnicas, na prtica o DIC UNIVERSAL)
DIC
CH4 CO2 O2 N2
DCT
SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD tpicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a mg)
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DIC
VAZES DE GASES Alm do gs de arraste, as vazes de alimentao de ar (comburente) e hidrognio (combustvel) devem ser otimizadas.
Grficos Sinal x Vazo de Gases tpicos:
SINAL
AR
H2
150
300
450
600
15
30
45
60
VARIAES NAS VAZES DE AR E H2 AFETAM APENAS MARGINALMENTE O SINAL = MAIORES REPRODUTIBILIDADE E REPETIBILIDADE
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DIC
TEMPERATURA DE OPERAO O efeito da temperatura sobre o sinal do DIC negligencivel. TRATAMENTO DE SINAL Por causa da baixa magnitude da corrente eltrica gerada (pA a nA) ela deve ser amplificada para poder ser registrada.
2 Diagrama eletrnico simplificado de um DIC 3
1 4
Amplificador Eletromtrico Deve amplificar o sinal e converter uma corrente varivel em uma
voltagem varivel (pA mV).
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DIC
FATORES DE RESPOSTA O fator de resposta de um determinado composto aproximadamente proporcional ao nmero tomos de carbono. Presena de heteroelementos diminui o fator de resposta. Nmero Efetivo de Carbonos (NEC) Prev com ~20% de
aproximao o fator de resposta de um composto.
tomo C aliftico C aromtico C olefinco C carbonila O lcool prim. Cl aliftico X +1,00 +1,00 +0,95 +0,00 -0,60 -0,12
Mistura com quantidades equimolares de: C2H6 NEC = 2,00 C2H5OH NEC = 1,40 CH3CHO NEC = 1,00
DETECTORES
Detector de Nitrognio - Fsforo
Modificao do DIC altamente seletiva para compostos orgnicos nitrogenados e fosforados
Prola de sal de metal alcalino: RbCl (normal), KCl
Seletividade S para fosforados ou nitrogenados: 10.000 x - 100.000 x em relao a hidrocarbonetos similares QMD = 0,4 pg a 10 pg (N) e 0,1 a 1 pg (P)
Pesticidas Triaznicos usando DNP:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Desetilatrazina Desisopropilatrazina Atraton Atrazina Trietazina Secbumeton Sebutilazina Simetrin Dipropretrina Dimetametrina Metroprotrina
(100 pg cada)
DETECTORES
Detector por Captura de Eletrons
PRINCPIO Supresso de um fluxo de eletrons lentos (termais) causada pela sua absoro por espcies eletroflicas
Um fluxo contnuo de eletrons lentos estabelecido entre um ando (fonte radioativa b -emissora) e um catodo.
Na passagem de uma substncia eletroflica alguns eletrons so absorvidos, resultando uma supresso de corrente eltrica.
DETECTORES
Detector por Captura de Eletrons
1
3 4
1 Ando (fonte radioativa b - emissora) 2 Sada de gases 4 Cavidade 3 Catodo 5 Coluna cromatogrfica
DETECTORES
Detector por Captura de Eletrons
Mecanismo de Captura de Eletrons
Gerao de eletrons lentos pela interao entre a radiao b, molculas do gs de arraste G e molculas de bloqueador (quencher) Q b + G G + + e + e* energia b + G G* + Q G + e + Q energia
AB + e AB + energia
O decrscimo na corrente eltrica fluindo pela cela de deteco proporcional concentrao a da espcie absorvente no gs de arraste
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCE
FONTE RADIOATIVA O ando deve estar dopado com um istopo radioativo b - ou a- emissor Emprego universal em DCE comerciais:
3H
63Ni
Sob a forma de Ta3H3 Maior sensibilidade Tdet deve ser < 225oC
63Ni
- Maior durabilidade (t1/2 = 100 a x 12 a para 3H) - Maior estabilidade trmica - Menor risco de uso (radioatividade)
Raramente usados:
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCE
POLARIZAO DOS ELETRODOS Vrios modos de polarizao possveis
VOLTAGEM CONSTANTE Pouco usada modernamente - picos cromatogrficos podem ser deformados. VOLTAGEM PULSADA Menos anomalieas eltricas: maior sensibilidade e linearidade.
TEMPERATURA DO DETECTOR Dependncia do sinal com temperatura de operao bastante significativa Variao de 3oC na temperatura Erro de ~ 10% na rea dos picos
Magnitude e sinal do erro depende do composto analisado !
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCE
GS DE ARRASTE Funcionamento do DCE muito dependente da natureza do gs de arraste MAIS USADOS:
N2 Ar + 5% CH4
O gs deve ser o mais puro possvel !!! (traos de H2O e O2 comprometem o sinal do DCE)
Sinal
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCE
SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD = 0,01 pg a 1 pg (organoclorados), linearidade ~ 104 (pg a ng)
PESTICIDAS 1 tetracloro-m-xileno 2 a - BHC 3 Lindano 4 Heptachlor 5 Endosulfan 6 Dieldrin 7 Endrin 8 DDD 9 DDT 10 Metoxychlor 10 decaclorobifenila
DETECTORES
Caractersticas Operacionais do DCE
SELETIVIDADE / FATORES DE RESPOSTA Valores de S maximizados para compostos eletroflicos S tpicos (clorobenzeno: S = 1)
hidrocarbonetos e esteres alifticos, dienos lcoois, cetonas e aldedos alifticos, aminas, nitrilas, mono - Cl, mono - F enis, oxalatos, mono - Br, di - Cl, hexa - F tri - Cl, cloretos de cidos, alquil - Pb, anidridos mono - I, di - Br, tri - Cl, mono - nitro, CS2 di - I, tri - Br, poli - Cl, di - nitro, 1,2 - dicetonas, fumaratos, organo - Hg
I > Br > Cl > F Comparando-se organoalogenados: a>b>g Terc > Sec > Prim trans > cis Tri > Di > Mono
DETECTORES
DCE: Aplicaes
Contaminantes em ar atmosfrico - deteco paralela DIC + DCE
DIC
DCE
ANLISE QUALITATIVA
Conceitos Gerais
Identificao individual das espcies contidas na amostra
Aplicaes Qualitativas de CG
Para anlise qualitativa confivel por CG recomendvel combinao de dados provenientes de pelo menos duas fontes
ANLISE QUALITATIVA
Tempos de Reteno
Interaes analito / FE
tR = f
PADRO
ANLISE QUALITATIVA
Tempos de Reteno
Identificao por tR muito pouco confivel: Dependncia com FC e TCOL Variaes nestas condies afetam sensivelmente os tR
VARIAO DE 1% NO tR
Sobrecarga na coluna Aumento excessivo na massa de material eluido deforma o pico cromatogrfico e altera o seu tR
Saturao da coluna cromatogrfica com aumento de massa eluida provoca cauda frontal no pico
MASSA
ANLISE QUALITATIVA
Tempos de Reteno
Comparao de tR usando dopagem (spiking) da amostra com o analito suspeito: aumento da confiabilidade de identificao.
Comparao com cromatograma da amostra dopada permite identificao mais confivel do desconhecido
ANLISE QUALITATIVA
ndice de Reteno de Kovts
FUNDAMENTO Os tR isotrmicos para uma srie homloga de compostos dependem logaritmicamente do nmero de tomos de carbono na cadeia.
ANLISE QUALITATIVA
ndice de Reteno de Kovts
O ndice de reteno de Kovts I para um analito definido por:
tR (A) Tempo de reteno ajustado do analito A tR (N) Tempo de reteno ajustado do n-alcano com N carbonos tR (n) Tempo de reteno ajustado do n-alcano com n carbonos (n = N + 1)
Ex.: um analito com I = 874 teria um tempo de reteno ajustado equivalente ao de um n-alcano hipottico com cadeia de 8,74 tomos de carbono
ANLISE QUALITATIVA
ndice de Reteno de Kovts
REPETIBILIDADE - REPRODUTIBILIDADE Os efeitos de TCOL e FC nos ndices de Kovts so pequenos
ANALITO
CHCl3 CH3CH2OH CH3CHO CH3(CO)CH3
DI/DT
+0,02 % -0,12 % -0,05 % -0,04 %
Dependncia de I para algumas substncias em uma coluna apolar na faixa de TCOL = 70oC a TCOl = 130oC
NDICE DE RETENO DE KRATZ Para programao linear de temperatura a relao entre tR e nC linear: clculo dos ndices de reteno modificado
ANLISE QUALITATIVA
Retention Time Locking (RTL)
PRINCPIO Em cromatgrafos com: controles pneumticos e trmicos microprocessados, injetores automticos e colunas cromatogrficas de qualidade excepcional possvel alta repetibilidade nos tR
CORRIDA #1 TCOL (1) FC (1) Coluna A CORRIDA #2 TCOL (2) FC (2) Coluna B
O software RTL (Hewlett-Packard) automaticamente ajusta as condies operacionais em um segundo CG para reproduzir os tR obtidos em um primeiro equipamento
Cromatogramas obtidos em diferentes equipamentos e colunas com condies operacionais da segunda corrida ajustadas pelo software de RTL
ANLISE QUALITATIVA
Mtodos de Deteco Qualitativos
Mtodos de deteco que fornecem informaes qualitativas sobre os analitos eludos:
ANLISE QUALITATIVA
Espectrometria de Massas
PRINCPIO A amostra fragmentada e ionizada em um padro caracterstico da espcie qumica. 1 Molculas da amostra so bombardeadas por eltrons (electron impact = EI) ou ons (chemical ionization = CI): ABCDE + e- ABCDE + + 2 e2 O on formado se fragmenta: . . ABCDE + AB + CDE+ . + ABCDE AB+ + CDE. ABCDE.+ A+ + BCDE. 3 Os fragmentos inicos formados so separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados:
ABUNDNCIA
O grfico do nmero de ons formados em funo da razo Massa / Carga dos ons o ESPECTRO DE MASSAS do analito MASSA / CARGA
ANLISE QUALITATIVA
Espectrmetro de Massas
1 3
Cmara de Ionizao Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) so repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador magntico.
1 2 3 4
Sada de Vcuo
Separador Magntico A ao do campo magntico deixa apenas ons com determinada razo Massa / Carga atravessar esta rea do equipamento. Detector Uma vlvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo gera um sinal eltrico proporcional ao nmero de ons que incide sobre o elemento.
ANLISE QUALITATIVA
Espectro de Massas
20
40
60
80
100
120
m/Z
- CO
m/Z = 80
m/Z = 118
- (CO + H)
m/Z = 79
m/Z = 90
ANLISE QUALITATIVA
Acoplamento CG - EM
Interface cromatgrafo - espectrmetro:
CG
EM
Separador Molecular O gs de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vcuo.
Coluna Capilar
ANLISE QUALITATIVA
Acoplamento CG - EM
Sistema de Controle e Aquisio de Dados:
1 2 3
Gerencia e monitora o funcionamento dos mdulos de CG e EM. Coleta e arquiva espectros de massa em intervalos regulares de tempo e constroi o cromatograma. Aps a corrida, compara espectros coletados com bases de dados para identificao dos eluatos.
ANLISE QUALITATIVA
CG-EM: Gerao do Cromatograma
Espectros de massas completos coletados e arquivados em intervalos regulares de tempo Gerao do cromatograma a partir dos espectros: CROMATOGRAMA DE ONS TOTAIS (TIC = Total Ion Chromatogram)
Para cada espectro o nmero total de ons detectados na faixa de massas varrida somado e plotado em funo do tempo, gerando o cromatograma.
TIC
Universal Similar a DIC
SIM
Seletivo Maior Sensibilidade
ANLISE QUALITATIVA
CG-EM: TIC x SIM
Aroma de polpa industrializada de caj aps extrao por SPME
TIC
Aparecem os picos correspondentes a todas substncias eludas
ANLISE QUALITATIVA
Identificao de Eluatos
1 Seleo manual ou automtica do espectro de massa correspondente a um eluato.
CONTAGENS
MASSA / CARGA
CONTAGENS
TEMPO
2 Interpretao manual do espectro e / ou comparao automtica com biblioteca de espectros padro do equipamento.
ANLISE QUALITATIVA
Identificao de Eluatos
Busca automtica em bibliotecas de espectros: comparao estatstica ( Probability Based Matching )
ESPECTRO DESCONHECIDO
PBM
BIBLIOTECA DE ESPECTROS
# 1
2 3 4 5 6
LIMITAES:
Limitada pelo tamanho da base de dados (NIST = 66.000 espectros) Diferenas entre espectros gerados por diversos EM
ANLISE QUALITATIVA
Emisso Atmica em Plasmas
PRINCPIO A amostra fragmentada num plasma, os fragmentos so excitados e emitem luz ao retornarem aos seus estados fundamentais. 1
Amostra fragmentada ao colidir com molculas excitadas do gs de suporte do plasma.
ANLISE QUALITATIVA
Gerao e Sustentao de Plasmas
PLASMA Gs ionizado por aplicao de uma descarga eltrica e sustido por um campo eltrico oscilante
ons formados so acelerados pelo campo eltrico aplicado gerando continuamente mais ons e espcies excitadas
Gs de Suporte: HLIO (espcies formadas tem energia suficiente para excitar tomos e fragmentos de no metais) Sustentao: MICROONDAS (outros tipos de campos eltricos oscilantes no mantm plasmas estveis de He a presso atmosfrica de forma conveniente)
ANLISE QUALITATIVA
Espectro de Emisso Atmica
Mistura de raias de emisso atmicas e moleculares de fragmentos do analito e raias de emisso do plasma e impurezas
n-Hexano
Fragmentos: CN C2 OH NH
200 nm
800 nm
Naled (C4H7Br2Cl2O4P)
Fsforo Bromo Cloro
456 nm
566 nm
ANLISE QUALITATIVA
Esquema Tpico de um CG-DEA
1 Cromatgrafo Gasoso 2 Alimentao de Gs de Suporte do Plasma (He) 3 Linha de Transferncia (acoplamento CG - DEA) 4 Cavidade Ressonante (gerao do plasma) 5 Lente de Focalizao 6 Monocromador / Policromador 7 Detector de Luz (fotomultiplicadora / diode array) 8 Amplificao / Digitalizao de Sinal 9 Computador
ANLISE QUALITATIVA
DEA: Gerao de Plasma
Uma cavidade ressonante focaliza potncia gerada por uma fonte de microondas no interior de uma cela de deteco por onde passa o gs de suporte.
He
CELA DE DETECO
PLASMA
Permite plasmas de He estveis a presso atmosfrica e potncias de microondas < 100 W CELA DE DETECO Tubo de material isolante eltrico e altamente refratrio (quartzo, alumina, BN)
ANLISE QUALITATIVA
Interface CG - DEA
Plasmas de He se extinguem pela passagem de grandes quantidades de material (~ 1 m L de lquido vaporizado)
Antes de ser misturado ao He, o efluente da coluna passa por uma vlvula diversora
PURGA
COLUNA
CELA
VLVULA DIVERSORA
Quando da eluio de grandes quantidades de analito o fluxo da coluna desviado para a purga