UNIVERSIDAD DE IXTLAHUACA CUI Incorporada a la Universidad Autnoma del Estado de Mxico

Comparacin

cualitativa

mediante CCF de Ginkgo biloba vs EGb 761 para el tratamiento del Alzheimer
Integrantes de equipo: Christian Isa Balderas Lpez Josu Arturo Fernndez Porcayo Daladier Orozco Morales

Vctor Hugo Snchez de Paz Abril Trujillo Ayala Asesores: M. en C Q B. Gabriel Martnez Gonzales Quim. Jos Fernando Fuentes Gutirrez Protocolo de Investigacin 17 de Noviembre de 2013

Comparacin cualitativa mediante CCF de Ginkgo biloba vs EGb 761 para el tratamiento del Alzheimer Objetivo General Extraccin con metanol, acetato de etilo y hexano de metabolitos secundarios de las hojas del Ginkgo biloba y comparacin en CCF. Objetivos Especificos Identificar cualitativamente mediante CCF los metabolitos

secundarios del Ginkgo biloba. Identificar cualitativamente mediante CCF los metabolitos

secundarios del EGb 761 Comparacin de las de los metabolitos del Ginkgo biloba con el EGb 761. Pregunta de Investigacin Los metabolitos secundarios de Ginkgo biloba sern similares a los del Egb 761? Justificacin La problemtica de todo el tiempo ha sido la bsqueda por nuevas alternativas que ayuden al avance de la medicina para el mejoramiento de nuevas formas para la trata de enfermedades crnicas puesto que se basaban solamente en el estudio de frmacos para combatir estos problemas; ahora en da la utilizacin de la herbolaria en el tratamiento de algunas enfermedades va cobrando ms importancia ya que el hecho de que ao tras ao incrementa el nmero de personas mayores que sufren demencia senil, y por ende necesitan cuidados y un tratamiento efectivo. As como tambin la falta de un tratamiento alternativo y los pocos avances existentes en el tratamiento del Alzheimer y los vagos conocimiento que se tienen de este; de tal suerte que el plan de estudios considera en la asignatura metodologa de la investigacin que se cursa en el quinto semestre, la posibilidad de incursionar en estas lneas de investigacin

mismas que posibilitan la generacin y conformacin del perfil de egreso de la licenciatura en Qumico Farmacutico Bilogo. La realizacin de este proyecto permitir la revisin terica y metodolgica, en la construccin de un estado de arte que permita dilucidar cientficamente la posibilidad de un tratamiento alternativo. Hiptesis Basados en la literatura de los componentes de EGb 761 se propone el uso del Ginkgo biloba como alternativa para el tratamiento del Alzheimer. Introduccin El extracto de Ginkgo biloba EGb761 se utiliza comnmente en la prevencin y terapia de los trastornos vasculares y cerebrales, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (AD) [1]. AD, un trastorno neurodegenerativo progresivo, se caracteriza por placas extracelulares -amiloideas y la prdida neuronal masiva en la corteza principales fracciones, los flavonoides del hipocampo . EGb761 es un (principalmente isorramnetol, extracto de las hojas del rbol Ginkgo biloba y es caracterstico por sus canferol y quercetina :22-27%) y terpenolactonas (5-7%). Estas dos fracciones se cree que son, al menos en parte, responsables de propiedades neuroprotectoras potenciales de EGb761. Varios estudios de intervencin en humanos reportan efectos benficos de Ginkgo biloba en la prevencin y terapia de enfermedades neurodegenerativas. Se ha demostrado en estudios en clulas cultivadas, as como en animales de laboratorio que el EGb 761 presenta propiedades antioxidantes y una actividad anti-inflamatoria. Marco terico Demencia

La demencia puede ser definida como un sndrome caracterizado por la presencia de deterioro cognitivo persistente que interfiere con la capacidad del individuo para llevar a cabo sus actividades profesionales o sociales, es independiente de la presencia de cambios en el nivel de conciencia (es decir, no ocurre debido a un estado confesional agudo o delirio) y es causada por una enfermedad que afecta al sistema nervioso central. La demencia es una enfermedad adquirida como el trmino por deterioro deja en claro. Es un sndrome que puede ser causado muchas enfermedades y aunque a ser reversible con el

menudo tenga evolucin lenta, que la

progresiva e irreversible, puede instalarse de manera aguda o subaguda y tratamiento especfico de la enfermedad causa, cuando este es disponible y administrado precozmente. Alzheimer El Alzheimer es el tipo ms comn de demencia. La demencia es un trmino general que describe una variedad de enfermedades y afecciones que se desarrollan cuando las clulas nerviosas en el cerebro (neuronas) mueren o dejan de funcionar normalmente. La muerte o mal funcionamiento de las neuronas provoca cambios en la memoria de uno, el comportamiento, y la capacidad de pensar con claridad. En el Alzheimer, estos cambios cerebrales con el tiempo afectan la capacidad de una persona para llevar a cabo tales funciones corporales bsicas como caminar y tragar. AD, es un trastorno neurodegenerativo progresivo, que se caracteriza por placas celulares -amiloideas adicionales, ovillos neurofibrilares intracelulares y la prdida masiva neuronal en la corteza y el hipocampo.

Edad: suele afectar a los mayores de 60-65 aos, pero tambin se han dado casos entre menores de 40. La edad media de diagnstico se sita en los 80, puesto que se considera que el mal de Alzheimer es una enfermedad favorecida por la edad.

Sexo: las mujeres lo padecen con ms frecuencia, probablemente, porque viven ms tiempo. Razas: afecta por igual a todas las razas. Herencia familiar : la enfermedad de Alzheimer familiar, una variante de la patologa que se transmite genticamente, supone el 1 por ciento de todos los casos. No obstante, se estima que un 40 por ciento de los pacientes con EA presentan antecedentes familiares.

Factor gentico: varias mutaciones en el gen de la protena precursora de amiloide (APP), o en el de las presenilinas 1 y 2. Tambin podra asociarse con mutaciones en el gen de la apolipoprotena E (ApoE). Esta protena est implicada en el transporte y eliminacin del colesterol. estas investigaciones, la nicastrina activara la produccin del amiloide beta.

Factores medioambientales: El tabaco se ha mostrado como un claro factor de riesgo de la patologa, al igual que las dietas grasas. Por otra parte, pertenecer a una familia numerosa tambin parece influir en el riesgo de Alzheimer.

Ginkgo biloba El Ginkgo Biloba es un rbol muy antiguo y muy resistente a los factores climticos adversos. Es una planta originaria de China, Corea y Japn, pero se adapta a los ms variados terrenos y climas. Sus hojas son propietarias de mltiples acciones teraputicas y por ello, stas fueron usadas en la antigedad como moneda de intercambio entre comerciantes. En su composicin podemos hallar mltiples beneficios debido a la variedad de compuestos situados en la hoja del Ginkgo Biloba. Entre otras sustancias, posee gran cantidad de flavonoides, biflavonas, terpenos, sustancias orgnicas con funcin cida, glicsidos cianogenticos, y dems.

Su amplia y variada composicin le confieren al Ginkgo Biloba propiedades teraputicas que giran en torno a la circulacin sangunea, la agregacin plaquetaria y los procesos oxidativos. En especial los flavonoides y los biflavonas, actan

como antioxidantes disminuyendo los efectos negativos de los radicales libres del oxgeno sobre el organismo. Los terpenos inhiben el factor activador de plaquetas actuando as, como antiagregante plaquetario que reduce los procesos inflamatorios y previenen la erosin de las membranas vasculares. Su influencia en la sntesis de glucocorticoides podra relacionarse con un efecto antiestresante y neuroprotector que permiten la utilizacin del extracto de Ginkgo Biloba en afecciones cerebrales como la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil, u otras. Asimismo, los extractos de Ginkgo Biloba han demostrado mejorar unas cuantas condiciones relacionadas con la insuficiencia cerebral como alteraciones de la visin, tiempos de reaccin, depresin, memoria, como as tambin, favorece el rendimiento y reduce los mareos. Fuera del sistema nervioso, la plata contribuye al tratamiento de sntomas del sndrome premenstrual, revierte algunas complicaciones asociadas a la diabetes, como es el caso de la impotencia sexual, previene el vrtigo y otros desrdenes del equilibrio, y adems, mejora notablemente el dolor, calambres y parestesias debido a su influencia vascular perifrica. Su utilizacin ha crecido mucho en el mundo del esttico, ya que se aplica en tratamientos dems o terapia para mejorar la circulacin sangunea y aliviar el estrs. El ginkgo biloba ayuda a mejorar la habilidad para recibir seales de los neuro-transmisores, sobre todo de la serotonina, que se va perdiendo con la edad, con lo que se consigue mejorar la transmisin nerviosa. Al mejorar la transmisin nerviosa se favorece tambin la respuesta muscular.

Composicin estructural

Genistein 4-Omethylpyridoxine.

6-hydroxykynurenic acid.

Metabolitos Secundarios Terpenolactonas Glucsidos de flavonol Isoflavonoides Biflavonas

Efectos Cuales sirven para el alzheimer: Quercetina, el kaempferoly el isorhamnetiny la cianidina son los compuestos ms tiles en el tratamiento del alzheimer El metabolito del ginko biloba en el que nos vamos a enfocar es la cianidina EGb-761 El Ginkgo biloba de uso teraputico farmacolgico debe ser estandarizado para poder cumplir con las normas mundiales y se le ha designado el nmero o nombre definida. El extracto de Ginkgo biloba se utiliza en pacientes con insuficiencia circulatoria cerebral, cuando se detecta vrtigo, problemas de carcter. Tambin est indicado en secuelas de accidentes cerebrovasculares y traumatismos del encfalo y crneo. EGb-761 como indicador de calidad farmacutica

Se ha demostrado en estudios en clulas cultivadas, as como en animales de laboratorio que el EGb 761 presenta propiedades antioxidantes [16-18] y una actividad anti-inflamatoria [19]. En disminucin de la memoria y del estado de alerta y atencin. No obstante varios estudios cientficos contradicen la eficacia del mismo en la prevencin de la enfermedad de Alzheimer y la demencia, as como en la mejora de la memoria. Investigaciones han demostrado que la estructura del EGb-761 contiene doce compuestos, esencialmente por flavonoides (principalmente isorramnetol, canferol y quercetina :22-27%) y terpenolactonas (5-7%).

Efectos Secundarios del EGb 761 Como todos los medicamentos, EGb 761 puede tener efectos adversos. No hay datos verificados sobre la frecuencia de los efectos indeseables observados durante el tratamiento con preparados que contienen Ginkgo biloba, ya que estos efectos se conocen slo a travs de informes individuales de los pacientes, mdicos o farmacuticos. De acuerdo con estos informes, los siguientes efectos secundarios pueden ocurrir durante el tratamiento con EGb 761: Puede ocurrir sangrado de rganos individuales, en particular en caso de medicacin concomitante con medicamentos inhibidores de la coagulacin como fenprocoumon, cido acetil saliclico u otros antireumticos no esteroideos .En personas con hipersensibilidad puede ocurrir shock alrgico o reacciones alrgicas de la piel (rojez, hinchazn, picor). Adems

pueden ocurrir trastornos gastrointestinales leves, cefaleas, vrtigo o agravacin del vrtigo ya existente.

Mtodos y materiales Planta: Gingko biloba y pastillas de EGb761 Disolventes polares: metanol,acetato de etilo,hexano, acetona Se utilizo el rotabapor el cual es un tubo de refrigeracin de serpentin, una bomba, una cubetapara un bao maria y una brazo el cuan se introducir en el bao con la muestra concentrada; la cual consiste en la concentracin de la muestra extraida con algn disolvente en este caso con acetona y hexano. A las 16:20 horas que comenz a rotaboporar con una temperatuba de 34 grados con 300 revoluciones por minutos (r.p.m) con un tiempo de 8 minutos, en el caso del hexano , miestras que la maceracin con acetona la temperatura fue de : -------- con 300 revoliciones por minuto (r.p.m) con un tiempo de 5 minutos ya que al exponer la acetona al medio ambiente esta es muy voltil puesto que es considerado un compuesto organico voltil.

Cromatografa La cromatografa se define como la separacin de una mezcla de dos o ms compuestos por distribucin entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase mvil. Varios tipos de cromatografa son posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases involucradas: slido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-liquido y gases-liquido ( fase vapor ). Todas las tcnicas cromatogrficas dependen de la distribucin de los componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase mvil, llamada tambin activa, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en relacin con la otra, denominada fase estacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o un gas y la estacionaria puede ser un slido o un lquido. Rf Rf: es el registro, es una relacin de distancias, y se define como:

Solventes El principal disolvente que arrastrara los metabolitos secundarios seria el metanol (MeOH). Este disolvente es polar y los metabolitos del ginkgo biloba como los flavonoides son polares, con lo que estos sern arrastrados.

Identificacin y revelacin Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las incoloras pueden revelarse mediante: a) Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 F366), el nmero que aparece como subndice nos indica Ia longitud de onda de excitacin del indicador utilizado" b) La introduccin de la placa en vapores de yodo c) El roco con una solucin de agua-H2SO4 1:1 (dentro de un compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de extraccin de gases). Despus calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero. Hasta carbonizar los compuestos.

Ensayo Shinoda Para este tipo de ensayo los flavonoides con el ncleo benzopirona producen las coloraciones rojas cuando se les adiciona magnesio en presencia de HCl concentrado. El ensayo de Shinoda, permite reconocer la presencia de flavonoides en un extracto vegetal. El ensayo se considera positivo cuando el alcohol amlico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo, intensos en todos casos. Extraccin de flavonoides Muestra de hoja: trituracin o maceracin Etanol-agua a un pH de 8 Muestra flavonoide en bruto: 70C en microondas Resultado de flavonoides de 92.2% de eficiencia Purificacin: glucoflavonoides (20% de glicsido de flavonoides) y aglicona (20%) los

Cromatografa de capa fina de alto rendimiento para la cuantificacin de flavonoides Fase estacionaria: placas de slica gel de 20x20 cm x 2mm Fase mvil: 5% de cido frmico en metanol-agua (70:30)

Protocolo de Investigacin Este se realizar en una prueba in-vitro con el uso de ratones transgnicos los cuales se sometern a pruebas con base al tratamiento del EGb 76.

Posteriormente despus se har una determinacin de flavonoides y una cuantificacin de anticuerpos los cuales se harn bajo un anlisis estadstico esto es mediante un software.

Animales, dieta y tipo de Alzheimer inducido. Se usaron ratones de la sepa Transgnicos Tg2576 que expresan la mutacin sueca de la APP695 humana (APPK670N/M671L) * refirindonos a APP695 humana como Alzheimer Los ratones transgnicos fueron criados en el apareamiento Tg2576 machos con hembras F1 C57B6/SJL. A la edad de 4 meses, las hembras Tg2576 se dividieran aleatoriamente en cuatro grupos (n = 10 para el tratamiento a corto plazo de 4 semanas y n = 6 para el tratamiento a largo plazo de 16 meses, el peso corporal 21,5) Los ratones se sometern a una dieta de control la cual ser baja en

flavonoides durante 1 semana. Durante la investigacin (4 semanas y 16 meses, respectivamente), los ratones sern alimentados con la dieta de EGb761 (300 mg / kg de dieta). Los ratones se alojarn en condiciones estndar (21-23 C, 50-60% de humedad, 14-h oscuridad ciclo light/10h) y los pesos corporales se registrarn semanalmente. Los procedimientos experimentales se basarn en Reglamentos sobre Proteccin de los Animales; a la edad de 5 y 20 meses, respectivamente, los ratones se decapitarn y se diseccionarn el cerebro (corteza e hipocampo). Se tomar sangre de todos los animales y las muestras de cada grupo diettico se agruparn.

Determinacin del contenido de flavonoides en el plasma.

El plasma obtenido se someter a el proceso de centrifugacin (2000 g durante 10 min, 4 C) y se almacenar a 80 C hasta el da del anlisis. Los flavonoides se analizarn en alcuotas de plasma mediante HPLC (Cromatografa lquida de alta eficacia-).* Todas las muestras de plasma se tratarn con -glucuronidasa / sulfatasa antes de hacer la extraccin de flavonoides.

Resultados

Despus de 4 semans de arduo trabajo y las pruebas a las que se sometieron lo xtractos de Ginkgo biloba y de EGb761 podemos dar a conocer los siguientes resultados. Macerados Tabla 1 Caracteristicas Genrales

Ginkgo biliba (hojas)

EGb 761 (pastillas)

23 mil solucin Hexano 5 gramos 3 das

----------------

23 mil solucin 5 gramos 3 das

10 pastillas 17 mililitros 3 das

Metanol

23 mil solucin Acetato de Etilo 5 gramos 3 das

--------------------

1 pastilla + 1:1 de Acetona -------------NaOH+ 1ml + 1 de H2O

3 das Tabla 1: Se muestras en primer instacia los militros de la solucin correspondiente (hexano, metanol, acetato de etilo y acetona) posteriormete se observan los gramos utlizados de las hojas de Ginkgo Biloba y de las pastillas y finaliza con los das que se dejaron macerar cada uno.

Ginkgo y Frasco

peso de frascos

Metanol

Figura 1 : secuencias de macerado de hojas de Ginkgo Biloba y EGb761

Cromatografa en capa fina (C.C.F.) Las cromatoplacas tuvieron una dimecin de 5x2 y de 5x3; posteriormete se prepararn los elyentes las cuales fueron distribuidasde la siguiente manera. Tabla 2 : Comparacin de Cromatoplacas

Ginkgo biliba (hojas, hexano)

Ginkgo biliba (hojas, metanol)

Ginkgo biliba (hojas,acetato de etilo )

EGb 761 (pastillas, metanol)

1:1 diclorometanohexano

si

no

si

no

Si Metanol

Si

Si

Si

concentrado

Hexano concentrado

No

no

Si

Si

9:1 diclorometano 7:3 hexanoacetato de etilo Si Si Si Si

Tabla 2; en ella se puede observar que el mejor eluyente fue 7:3 hexano acetato de etilo puesto que las manchas observadas eran mas fciles de identificar en la lmpara de UV mientras que en el caso del metanol sabiedo que es un buen eluyente no se observaba nada en la cromatoplaca sometia a la lmpara de UV .

Anlisis Fitoqumico En etsa prueba no apunte nada*

Conclusiones

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