EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL Rosmarinus officinalis SOBRE EL Streptococcus Viridans, Actinomyces sp. y Lactobacillus spp.

Tacca Q. Janet E.1 Macedo V. Sonia.2 Aquino A. Luz M.3

La cavidad bucal esta colonizada por ms de 400 especies de bacterias aerobias y anaerobias, estas bacterias habitan en los dientes, surco gingival, las mucosas, el dorso de la lengua y la saliva; y tambin pueden actuar como patgenos involucrados en las principales afecciones de la cavidad bucal.1 La placa bacteriana dental es una biopelcula formada por microorganismos adheridos entre s y a una superficie dentaria, embebidos entrelazados y rodeados de un material extracelular de triple origen: bacteriano, saliva y dieta.2, 3 Los principales microorganismos relacionados con la caries dental son aquellos que participan en el desarrollo inicial de la enfermedad s.mutans, s. sobrinus (streptococcus viridans) y el la progresin de las lesiones producidas lactobacilos spp, actinomices spp. Los lactobacillus son los primeros relacionados con la caries de dentina.4 Se ha determinado que la placa bacteriana es el factor fundamental en la presencia de caries y enfermedad periodontal.4, 2, 5 Por eso la importancia de su control. La eliminacin mecnica de la placa es todava la tcnica bsica para evitar las enfermedades dentarias y conservar la salud bucal (el cepillado).5, 6 Sin embargo una mejor comprensin de la naturaleza infectante de los padecimientos dentales revitaliza de modo notable el inters por los mtodos qumicos de control de placa (los enjuagues o colutorios).7, 8 __________________________________________
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Cirujano Dentista Graduada de la Universidad Nacional del Altiplano Magister en Estomatologa, Docente asociada de la Universidad Nacional del Altiplano 3 Estudiante de la Escuela profesional de Odontologa de la Universidad Nacional del Altiplano

La clorhexidina es un antisptico, catinico potente no irritante, que rompe la membrana de la clula bacteriana.7, 9 Es relativamente ms activa contra bacteria gram positivas.7 Antisptico ms utilizado en la odontologa, sobre todo para enjuagues bucales (0.12 0.2 %) o dentifricos (0.5 1 %). Es uno de los agentes ms eficaces contra la placa y la gingivitis.5, 7 Las plantas medicinales han acompaado la evolucin del hombre, y forman parte del curar ancestral. La OMS estima que ms del 80% de todos los habitantes de la tierra confan en medicinas tradicionales para resolver sus principales necesidades de salud.
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El empleo de

plantas medicinales como tratamiento de diversos males, se registra desde tiempos muy remotos, basndose en creencias populares y conocimientos tradicionales, trasmitidos de generacin en generacin. Hoy en da muchas propiedades teraputicas de diversas plantas han sido demostradas cientficamente, en base a la extraccin de sus principios activos.11 El rosmarinus officinalis nombre cientfico del romero, es una planta tradicional usada de diversas maneras para el cuidado de los dientes por pobladores rurales de Puno, sin embargo no es bien conocido su mecanismo de accin. Los beneficios de la medicina tradicional son mejores tanto en el aspecto teraputico como econmico.12, 13 Es considerada como un antioxidante y codimentaria el extracto de desaromatizado se vente como antioxidantes naturales y el aceite esencial se usa como saborizante para licores.14 El aceite esencial de rosmarinus officinalis se emplea por sus propiedades estimulantes, presumiblemente debido a su alto contenido de alcanfor, mientras que, en las industrias cosmeticas, farmaceuticas y de alimentos, se utiliza como fragancia en sopas, cremas, lociones y perfumes, as mismo como preservante de alimentos por sus propiedades antioxidantes.15

MATERIALES Y MTODOS El estudio fue de tipo experimental in vitro con 2 grupos de control; un control positivo representado por los discos de papel filtro con antibacteriano (clorhexidina) y un grupo control negativo representado por discos de papel filtro con agua destilada estril; y un grupo experimental representado por discos de papel filtro con aceite esencial de Rosmarinus Officinalis. La muestra corresponde al cultivos de colonias de Streptococcus viridans, Actinomyces sp, Lactobacillus spp. El mtodo utilizado fue la observacin estructurada y se utiliz una ficha de recoleccin de datos diseada para la investigacin. La investigacin consisti en el anlisis de una base de datos recolectada. La obtencin del aceite esencial del Rosamarinus officinalis, se efectu con el mtodo por arrastre de vapor de agua. La toma de muestras de placa bacteriana para aislar Streptococcus viridans y Lactobacillus spp fue la placa bacteriana supragingival de lasa superficies vestibular y lingual o palatina de los dientes; y del Actinomyces sp fue de placa bacteriana de las superficies oclusal y proximales de los dientes. Se realiz una prueba piloto, para verificar si el instrumento valida la metodologa, donde tuvimos algunos cambios, que fueron reportados a su debido tiempo. As fue donde se determin que se trabajara con 5ul de aceite esencial y la misma cantidad de Clorhexidina al 2%. Para realizar las pruebas de sensibilidad in vitro en dos grupos de estudio, fue necesario emplear un inoculo reconstituido, con asa bacteriolgica 3 colonias bacterianas fueron transferidas a un tubo de ensayo con 5ml de agua destilada estril en la que se cuid que el inoculo bacteriano este suspendido uniformemente. Bajo condiciones estriles se procedi a sembrar con un hisopo la suspensin bacteriana en 3 placas que contienen agar sangre, contienen agar BHI y agar tomate para el S. viridans, Actinomyces sp y Lactobacillus spp respectivamente. Con pinzas estriles se procedi a coloca en cada placa de manera equidistante 1 disco embebido con 5 ul de clorhexidina al 2%, 1 disco de papel embebido con 5 ul de agua destilada y 1 disco de papel embebido con 5 ul de aceite esencial de Rosmarinus officinalis.

Las tres placas fueron llevadas a la incubadora a 37C por un periodo de 48 horas ( S. viridans. Y Lactobacillus spp) y las de Actinomyces sp fueron colocadas en una jarra de anaerobiosis, bajo microaerofilia. La jarra de anaerobios fue llevada a la incubadora a 37C por un periodo de 72 horas. Despus de las cuales se procedi a medir el dimetro de los halos de inhibicin, con la ayuda de calibrador. Se emplearon un anlisis Estadstico descriptivo para obtener los promedios y desviaciones estndar de las variables continuas. Se aplic la prueba T students entre el grupo en estudio (aceite esencial de Rosmarinus officilis) y el grupo control positivo (digluconato de

clorhexidina). Para establecer si hay diferencias en los dimetros de los halos de inhibicin por bacteria respecto al uso de la clorhexidina y el aceite esencial, se utiliz la prueba de ANOVA. Esta prueba estadstica permiti evaluar el efecto de las variables independientes en relacin a una dependiente, y los efectos conjuntos de dos o ms variables independientes y una dependiente.

RESULTADOS Al comparar los dimetros de los halos de inhibicin formados por efecto del aceite esencial del romero en la 3 cepas bacterianas estudiadas, se observ que los halos de inhibicin de mayor dimetro fueron formados sobre el Lactobacillus spp (11, 9, 10mm) con una media de 10mm mientras que los halos de inhibicin de menor dimetro fueron formados sobre Streptococcus viridans (8, 8, 9mm) con una media de 8.333mm. Aplicando la prueba de ANOVA se obtuvo diferencia estadsticamente significativa del efecto antibacteriano del AE del romero segn especie bacteriana (p=0.012). Mientras que mediante la prueba de KolmodorovSmirnov, se determin que los dimetros de los halos de inhibicin del romero (p=0.591), tenan una distribucin normal con un nivel de confianza del 95% (ver Tabla N 1 y grfico N 1). TABLA N 1 DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DEL ACEITE ESENCIAL DEL ROMERO FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

GRFICO N 1 COMPARACION DE LOS DIAMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICION DEL ACEITE ESENCIAL DEL ROMERO FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

Al comparar los dimetros de los halos de inhibicin formados por efecto de control positivo (clorhexidina 2%), en las 3 cepas bacterias estudiadas, se observ que los halos de inhibicin de mayor dimetro fueron formados sobre el Actinomices sp (20, 20, 19 mm) con una media de 19.667, mientras que los halos de inhibicin de menor dimetro fueron formados sobre el Lactobacillus spp (12, 12, 13 mm) con una media de 12.333 mm. Aplicado la prueba ANOVA se obtuvo diferencia estadsticamente significativa del efecto antibacteriano de la clorhexidina 2% segn especie bacteriana (p=0.000), mientras que mediante la prueba de KoldorovSmirnov, se determin los dimetros de los halos de inhibicin de la clorhexidina al 2% (p=0.888), tenan una distribucin normas, con un nivel de confianza del 95%(ver Tabla N 2 y grfico N 2).

TABLA N 2 DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DE LA CLORHEXIDINA 2% FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

GRFICO N 2 COMPARACION DE LOS DIAMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICION DE LA CLORHEXIDINA 2% FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

Cuando se analiz los 3 ensayos con Streptococcus viridans, se obtuvo un valor p=0.015 que corrobora la diferencia del promedio de los halos de inhibicin del romero y la clorhexidina 2%. Del anlisis de los 3 ensayos con Actinomyces sp la diferencia tuvo una significancia de p=0.001, lo que corrobora tambin la diferencia del promedio de los halos de inhibicin del romero y la clorhexidina 2%. Al analizar los 3 ensayos con Lactobacillus spp, la diferencia tuvo

una significancia de p=0.118, lo que indica que estadsticamente no hay diferencia en el promedio de los halos de inhibicin del romero y la clorhexidina frente a este tipo bacteriano (ver Tabla N 3 y grfico N 3). TABLA N 3 DIAMETRO DEL HALO INHIBITORIO DEL ACEITE ESENCIAL DEL ROMERO, CLORHEXIDINA 2% Y AGUA DESTILADA FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

GRFICO N 3 COMPARACION DE LOS DIAMETROS DE LOS HALOS DE INHIBICION DEL ACEITE ESENCIAL DEL ROMERO, CLORHEXIDINA 2% Y AGUA DESTILADA FRENTE AL: Streptococcus viridans, Actinomyces sp Y Lactobacillus spp.

DISCUSIN Los resultados demostraron que existen diferencias significativas respecto al dimetro de los halos de inhibicin formados ante la presencia de clorhexidina 2% y aceite esencial del romero frente al Strepcoccus viridans y Atinomyces sp, mas no existe diferencia significativa en los dimetros de los halos de inhibicin formados en presencia de clorhexidina 2% y aceite esencial del romero frente al Lactobacillus spp. Para la investigacin usamos como control negativo al agua destilada, lo cual no fue halo inhibitorio en ninguno de las pruebas, mantenindose como constante en 0 mm. Lo cual nos sirve a manera de control de calidad, garantizando la siembra bacteriana y que la formacin de los halos de inhibicin alrededor de los discos de la clorhexidina 2% y romero fueron formadas por estas sustancias. En esta investigacin no se siguieron las pautas dadas por el NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory) las que fueron dadas para estandarizar el procedimiento de la realizacin de antibiogramas mediante el mtodo de disco difusin (Kirby-Bauer) y as determinar la susceptibilidad antimicrobiana 16 , debido a la falta de materiales y presupuesto que implicara, sin embargo el mtodo seguido que se asemeja y es vlido por contar con un control positivo y otro negativo, adems de que nos ayud a cumplir nuestro objetivo. En esta investigacin no se determin la concentracin mnima inhibitoria (CMI) porque para que tenga un realce cientfico tuvo que seguirse el mtodo de Kirby Bauer, adems de no ser este nuestro objetivo, pues este trabajo es el inicio para empezar un estudio ms minucioso acerca del efecto antibacteriano del aceite esencial del romero tiene o no efecto antibacteriano frente a las bacterias de la placa bacteriana dental, pues no se contaba con antecedentes de investigacin que respondieran esta pregunta, este fue ms un trabajo exploratorio. Con este trabajo podemos corrobora que el medio de cultivo ms eficaz para el aislamiento de Actinomyces sp es el agar BHI y para la formacin de colonias debe ser incubado a 37 por 5 das en microaerofilia, para el aislamiento Lactobacillus spp no se tuvo problemas el agar Tomate fue un medio de cultivo selectivo adecuado. Segun Flores Q. y Col.
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1mg/ml del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (romero) que

inhibi el crecimiento de la bacteria Staphylococcus ureos, no se pueden hacer comparaciones entre este resultado y los de esta investigacin pues trabajamos con distintos especies y diferentes mtodos.

Diaz L.18 determino que el dimetro del halo inhibitorio del aceite esencial del Minthostachys mollis Griseb (mua) frente al Lactobacillus spp y Actinimyces sp, tuvieron una medida de 14.38mm y 11.00mm respectivamente. En esta investigacin el dimetro de halo inhibitorio del aceite esencial del romero frente al Lactobacillus spp y Actinomyces sp tuvieron una media 10.0mm y 9.333mm, resultados que se asemejan, las diferencias tal vez de deba a que se trabajaron con aceites esenciales de diferentes plantas, adems que la cantidad de aceite con que se empaparon los discos de sensibilidad con 10ul de aceite esencial de mua, en esta investigacin los discos de sensibilidad empapamos con 5 ul de aceite esencial de romero. Segn los resultados en esta investigacin el efecto antibacteriano del aceite esencial del romero frente al Lactobacillus spp es estadsticamente igual al efecto antibacteriano de la clorhexidina al 2% frente al lactobacillus spp, este se debera a que segn Sanchez L. la clorhexodina es estable a un PH entre 5 y 8, en medios cidos pierde estabilidad, razn por la que tal vez en esta investigacin tubo menor efecto, ya que el medio de cultivo de agar tomate tena un pH aproximado de 3, entonces los aceites esenciales de las plantas podran ser eficaces en cuanto efecto antibacteriana en medios cidos, medio en el que se desarrollan los Lactobacillus spp. CONCLUSIONES El aceite esencial del Rosmarinus officinalis tiene efecto antibacteriano in vitro frente a bacterias de la placa bacteriana: Streptococcus viridans, Actinomyces sp y Lactobacillus spp. El aceite esencial del Rosmarinus officinalis es ms efectivo frente al Lactobacillus spp y menos efectivo frente al Streptococcus viridans. El diglucinato de clorhexidina al 2% es ms efectivo frente al Actinomyces sp y menos efectivo frente al Lactobacillus spp. La clorhexidina al 2% es ms efectiva que el aceite esencial de Rosmarinus officinalis frente al Streptococcus viridans y Actinomyces sp e igual de efectivo frente al Lactobacillus spp.

Nota: Dra. No le inclu la bibliografa porque tal vez tenga que modificar la INTRODUCCION, Y CAMBIARE LAS TABLAS Y LOS GRFICOS.