Cintica enzimtica

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Imagen generada por ordenador de un modelo de la estructura tridimensional de la enzima purina nuclesido fosforilasa bacteriana. Para otros usos de este trmino, vase Cintica. La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es

controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Las enzimas, en su mayora, protenas con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato. El conocimiento adquirido acerca de la estructura de las enzimas ha sido de gran ayuda en la visualizacin e interpretacin de los datos cinticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cmo permanecen unidos sustrato y producto durante la catlisis, qu cambios conformacionales ocurren durante la reaccin, o incluso el papel en particular de determinados residuos aminocidos en el mecanismo cataltico. Algunas enzimas modifican su conformacin significativamente durante la reaccin, en cuyo caso, puede ser crucial saber la estructura molecular de la enzima con y sin sustrato unido (se suelen usar anlogos que se unen pero no permiten llevar a cabo la reaccin y mantienen a la enzima permanentemente en la conformacin de sustrato unido). Los mecanismos enzimticos pueden ser divididos en mecanismo de nico sustrato o mecanismo de mltiples sustratos. Los estudios cinticos llevados a cabo en enzimas que solo unen un sustrato, como la triosafosfato isomerasa, pretenden medir la afinidad con la que se une el sustrato y la velocidad con la que lo transforma en producto. Por otro lado, al estudiar una enzima que une varios sustratos, como la dihidrofolato reductasa, la cintica enzimtica puede mostrar tambin el orden en el que se unen los sustratos y el orden en el que los productos son liberados. Sin embargo, no todas las catlisis biolgicas son llevadas a cabo por enzimas proteicas. Existen molculas catalticas basadas en el ARN, como las ribozimas y los ribosomas, esenciales para el splicing alternativo y la traduccin del ARNm, respectivamente. La principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas radica en el limitado nmero de reacciones que pueden llevar a cabo las primeras, aunque sus mecanismos de reaccin y sus cinticas pueden ser estudiadas y clasificadas por los mismos mtodos.

ndice

1 Principios generales 2 Ensayos enzimticos o 2.1 Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica 3 Reacciones con un sustrato

3.1 Cintica de Michaelis-Menten 3.2 Representacin de la ecuacin de Michaelis-Menten 3.3 Significado de las constantes cinticas 4 Reacciones multisustrato o 4.1 Mecanismo de complejo ternario o 4.2 Mecanismo de ping-pong 5 Cinticas no Michaelianas 6 Cintica del estado preestacionario 7 Mecanismo qumico 8 Inhibicin enzimtica o 8.1 Inhibidores reversibles o 8.2 Inhibidores irreversibles 9 Mecanismos de catlisis 10 Catlisis enzimtica 11 Vase tambin 12 Notas 13 Referencias 14 Para ms informacin 15 Enlaces externos

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Principios generales

La velocidad de la reaccin va aumentando a medida que aumenta la concentracin de sustrato hasta que la enzima se satura. La reaccin qumica catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reaccin no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catlisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reaccin entre sustrato y producto.1 Sin embargo, al contrario que las reacciones qumicas, las enzimas se saturan. Esto significa que a mayor cantidad de sustrato, mayor nmero de centros catalticos estarn ocupados, lo que incrementar la eficiencia de la reaccin, hasta el momento en que todos los sitios posibles estn ocupados. En ese momento se habr

alcanzado el punto de saturacin de la enzima y, aunque se aada ms sustrato, no aumentar ms la eficiencia. Las dos propiedades cinticas ms importantes de una enzima son: el tiempo que tarda en saturarse con un sustrato en particular y la mxima velocidad de reaccin que pueda alcanzar. El conocimiento de estas propiedades hace posible hipotetizar acerca del comportamiento de una enzima en el ambiente celular y predecir cmo responder frente a un cambio de esas condiciones.

Ensayos enzimticos
Artculo principal: Ensayo enzimtico.

Curva de progreso de una reaccin enzimtica. La pendiente representa, en el perodo inicial, la velocidad de la reaccin. La zona de la meseta representa el equilibrio de la reaccin (no confundir con la saturacin). Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica.2 Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas para

detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es convertido en producto. Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lseres dirigidos a travs de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catlisis.3 Estos estudios estn dando una nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una poblacin de millones de molculas de enzima. En la figura de la derecha se puede observar la tpica evolucin de una curva obtenida en un ensayo enzimtico. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reaccin, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta en forma de curva asinttica en la grfica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el perodo inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimticos suelen estar estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas ms fcilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rpida de lquidos permiten llevar a cabo medidas cinticas de perodos iniciales cuya duracin puede llegar a ser inferior a un segundo.4 Este tipo de ensayos rpidos son esenciales para medidas de la cintica del estado estacionario, discutida ms abajo. La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial, es decir, en la zona lineal de la reaccin enzimtica. Sin embargo, tambin es posible medir toda la curva de la reaccin y ajustar estos datos a una ecuacin no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimticas es denominada anlisis de la curva de progreso.5 Esta aproximacin es muy til como alternativa a las cinticas rpidas, cuando el perodo inicial es demasiado rpido para ser medido con precisin.

Factores fsico-qumicos que pueden modificar la actividad enzimtica

Temperatura: las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad por este factor. Los rangos de temperaturas ptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima ver incrementada su actividad hasta el momento en que comience la desnaturalizacin de la misma, que dar lugar a una reduccin progresiva de dicha actividad. pH: el rango de pH ptimo tambin es muy variable entre diferentes enzimas. Si el pH del medio se aleja del ptimo de la enzima, esta ver modificada su carga elctrica al aceptar o donar protones, lo que modificar la estructura de los aminocidos y por tanto la actividad enzimtica.

Concentracin salina: al igual que en los casos anteriormente mencionados, la concentracin de sales del medio es crucial para una ptima actividad enzimtica. Una elevada concentracin o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimtica, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentracin de iones para mantener su carga y su estructura.

Reacciones con un sustrato

Las enzimas que presentan un mecanismo de nico sustrato incluyen isomerasas, tales como la triosafosfato isomerasa o la bisfosfoglicerato mutasa, y liasas intramoleculares, tales como la adenilato ciclasa o la ribozima ARN-liasa.6 Sin embargo, existen ciertas reacciones enzimticas de nico sustrato que no pertenecen a esta categora de mecanismos, como es el caso de la reaccin catalizada por la catalasa. La catalasa reacciona inicialmente con una molcula de perxido de hidrgeno (agua oxigenada) y queda en un estado oxidado tras liberar el producto (agua), y, posteriormente, es reducida por una segunda molcula de sustrato. Aunque durante la reaccin solo participa un sustrato, la existencia de un intermediario enzimtico modificado permite incluir al mecanismo de la catalasa en la categora de mecanismos de ping-pong, un tipo de mecanismo discutido ms adelante.

Cintica de Michaelis-Menten
Artculo principal: Cintica de Michaelis-Menten.

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catlisis no muestra un comportamiento lineal en una grfica al aumentar la concentracin de sustrato. Si la velocidad inicial de la reaccin se mide a una determinada concentracin de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reaccin (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad mxima (Vmax), que no sobrepasar en ningn caso, independientemente de la [S].

Mecanismo de unin de nico sustrato para una reaccin enzimtica. k1, k-1 y k2 son las constantes cinticas para cada una de las etapas de la reaccin. El modelo de cintica michaeliana para una reaccin de nico sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reaccin qumica bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formndose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimtico para una reaccin unimolecular puede ser bastante

complejo, existe una etapa enzimtica limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cintica nica cuya constante es k2. (Ecuacin 1) k2 tambin llamado kcat o nmero de recambio, hace referencia al mximo nmero de reacciones enzimticas catalizadas por segundo. A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la [S] tambin aumentamos la [ES] a expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reaccin hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reaccin depende de la [ES], la velocidad es sensible a pequeos cambios en la [S]. Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reaccin (v k2[E]tot = Vmax) deja de ser sensible a pequeos cambios en la [S]. En este caso, la concentracin total de enzima ([E]tot) es aproximadamente igual a la concentracin del complejo ES:

Representacin grfica de la curva de saturacin de una enzima donde se puede observar como evoluciona la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin. La ecuacin de Michaelis-Menten7 describe como la velocidad de la reaccin depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1 (aproximacin del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuacin:

(Ecuacin 2) Esta famosa ecuacin es la base de la mayora de las cinticas enzimticas de sustrato nico. La constante de Michaelis Km se define como la concentracin a la que la velocidad de la reaccin enzimtica es la mitad de la Vmax. Esto puede verificarse sustituyendo la concentracin de sustrato por dicha constante ([S] = Km). Si la etapa limitante de la velocidad de la reaccin es lenta comparada con la disociacin de sustrato (k2 <<< k1), la constante de Michaelis Km ser aproximadamente la constante de disociacin del complejo ES, aunque sea una situacin relativamente rara. La situacin ms comn, donde k2 > k1, es denominada cintica de Briggs-Haldane.8 La ecuacin de Michaelis-Menten an se mantiene bajo estas condiciones ms generales, como puede derivarse de la aproximacin del estado estacionario. Durante el perodo inicial, la velocidad de la reaccin es ms o menos constante, indicando que la [ES] tambin se mantendr constante:

De esta forma, la concentracin de ES viene dada por la siguiente expresin:

donde la constante de Michaelis Km se define as:

Con lo cual, despus de operar todos los factores, obtenemos una frmula general para la velocidad de la reaccin que coincide con la ecuacin de Michaelis-Menten:

La constante de especificidad kcat / Km mide la eficiencia con la que una enzima convierte un sustrato en producto. Utilizando la definicin de la constante de Michaelis Km, la ecuacin de Michaelis-Menten podra escribirse de la siguiente forma:

donde [E] es la concentracin de enzima libre. As, la constante de especificidad se convierte en una constante bimolecular efectiva de la enzima libre que reacciona con sustrato libre para formar producto. Esta constante viene definida por la frecuencia con la que el sustrato y la enzima se encuentran en una solucin, y ronda aproximadamente un valor de 1010 M-1 s-1 a 25 C. Curiosamente, este mximo no depende del tamao del sustrato o de la enzima. La proporcin de las constantes de especificidad para dos sustratos es una comparacin cuantitativa de la eficiencia de la enzima para convertir en productos dichos sustratos. La pendiente de la ecuacin de Michaelis-Menten a bajas concentraciones de sustrato (cuando [S] << Km) tambin proporciona la constante de especificidad.

Representacin de la ecuacin de Michaelis-Menten

Artculo principal: Diagrama de Lineweaver-Burke. Artculo principal: Diagrama de Eadie-Hofstee.

La grfica de Lineweaver-Burke o del doble recproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad. La grfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentracin de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, poda llegar a ser realmente difcil estimar los valores de la Km y la Vmax en las grficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten, dando como resultado la grfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial de la cintica de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia , se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinticas.

La grfica de Lineweaver-Burk o representacin de doble recproco es la forma ms comn de mostrar los datos cinticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuacin de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo de representacin es una lnea recta cuya ecuacin es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.

Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]; el mnimo valor posible es 1/[S] = 0, que correspondera a una concentracin infinita de sustrato, donde 1/v = 1/Vmax. El valor del punto de corte entre la recta y el eje x es una extrapolacin de datos experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las grficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la Vmax y de la Km.9 Un modelo lineal mucho ms exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones cientficas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han sido sustituidos por mtodos ms fiables basados en anlisis de regresin no lineal. Para analizar los datos es conveniente la normalizacin de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del anlisis.10

Significado de las constantes cinticas

La importancia del estudio de la cintica enzimtica reside en dos principios bsicos. En primer lugar, permite explicar cmo funciona una enzima, y en segundo lugar, permite predecir cmo se comportar esa enzima in vivo. Las constantes cinticas definidas anteriormente, Km y Vmax, son los pilares fundamentales a la hora de intentar comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del metabolismo. Sin embargo, llevar a cabo estas predicciones no es trivial, incluso en los sistemas ms simples. Por ejemplo, la malato deshidrogenasa sintetiza, en el interior de la mitocondria, oxalacetato, el cual puede ser sustrato de diversas enzimas como la citrato sintasa, en el ciclo de los cidos tricarboxlicos, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, en la gluconeognesis, o la aspartato aminotransferasa, en la biosntesis de cido asprtico. Para ser capaz de predecir cunto oxalacetato ser desviado por cada una de las rutas es necesario saber tanto la concentracin del oxalacetato como la concentracin y los parmetros cinticos de cada una de las enzimas. Este ejemplo denota la complejidad que podemos llegar a encontrar al intentar predecir el comportamiento de rutas metablicas completas o de organismos enteros, por medio de modelos matemticos. Aunque estos objetivos an no se han alcanzado en eucariotas, se han obtenido ciertos progresos en bacterias, utilizando modelos del metabolismo de Escherichia coli.11 12

Reacciones multisustrato

Las reacciones multisustrato siguen una serie de complejas ecuaciones que describen cmo se unen los sustratos y en qu orden lo hacen. El anlisis de estas reacciones es mucho ms sencillo si la concentracin del sustrato A se mantiene constante y la del sustrato B vara. En estas condiciones, la enzima se comporta igual que una enzima de nico sustrato, por lo que en una grfica de velocidad la concentracin de sustrato dar unos valores aparentes de las constantes cinticas, Km y Vmax, para el sustrato B. Si se realizan una serie de medidas a diferentes concentraciones fijas de sustrato A, los datos obtenidos permitirn saber a qu tipo de mecanismo pertenece la reaccin enzimtica. Para una enzima que una dos sustratos A y B, y los transforme en dos productos P y Q, existen dos tipos de mecanismos descritos hasta ahora.

Mecanismo de complejo ternario

Mecanismo de complejo ternario al azar para una reaccin enzimtica. La enzima E une los sustratos A y B y libera los productos P y Q en un orden no definido. Las enzimas (E) que presentan este mecanismo de reaccin unen al mismo tiempo los dos sustratos (A y B), dando lugar a un complejo ternario EAB. El orden secuencial de unin de los sustratos puede ser al azar (mecanismo al azar) o seguir un orden en particular (mecanismo ordenado). Si fijamos la concentracin del sustrato A y variamos la de B, y representamos grficamente el comportamiento de la enzima mediante un diagrama de Lineweaver-Burke, obtendremos una serie de rectas con un punto de interseccin comn a todas ellas. Entre las enzimas que presentan este mecanismo podemos encontrar la glutation Stransferasa,13 la dihidrofolato reductasa14 y la ADN polimerasa.15 Los siguientes enlaces muestran animaciones del mecanismo de complejo ternario de la dihidrofolato reductasa y de la ADN polimerasa .

Mecanismo de ping-pong
Como se puede apreciar en la figura de la derecha, las enzimas con un mecanismo de pingpong pueden presentar dos estados, la conformacin normal (E) y la conformacin modificada qumicamente (E*) o conformacin intermedia. En este tipo de mecanismo, el sustrato A se une a la enzima E, que pasa a un estado intermedio E*, por ejemplo, por transferencia de un grupo qumico al centro activo de la enzima, pudiendo ya ser liberado en forma de producto P. nicamente cuando el sustrato A ya ha sido liberado del centro

activo de la enzima puede unirse el sustrato B, que devuelve a la enzima modificada E* a su estado original E, y liberarlo en forma de producto Q. Si fijamos la concentracin de A y variamos la de B, y representamos grficamente una enzima con mecanismo de ping-pong en un diagrama de Lineweaver-Burke, obtendremos una serie de rectas paralelas entre s.

Mecanismo de ping-pong para una reaccin enzimtica. La unin de los sustratos A y B tiene lugar en un orden definido y secuencial, por medio de un intermediario enzimtico modificado, E*. Entre las enzimas con este tipo de mecanismo podemos encontrar alguna oxidorreductasa, como la tiorredoxima peroxidasa,16 transferasas, como la acil-neuraminato citidil transferasa,17 y serin proteasas, como la tripsina y la quimiotripsina.18 Las serin-proteasas conforman una diversa familia de enzimas muy comunes, que incluyen enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina y elastasa), varias enzimas del proceso de coagulacin y muchas otras. En las serin-proteasas, el estado intermedio E* es una especie acilada en una serina del centro cataltico de la enzima. El siguiente enlace muestra una animacin del mecanismo cataltico de la quimiotripsina .

Cinticas no Michaelianas

Curva de saturacin de una enzima alostrica, donde se puede apreciar una cintica sigmoidea. Algunas reacciones enzimticas dan lugar a curvas sigmoideas, al ser representadas en una curva de saturacin, lo que suele indicar una unin cooperativa del sustrato al centro

cataltico de la enzima. Esto quiere decir que la unin de una molcula de sustrato influye en la unin de las molculas de sustrato posteriores. Este comportamiento es el ms comn en las enzimas multimricas, que presentan varias zonas de interaccin con el sustrato.19 El mecanismo de cooperacin es semejante al observado en la hemoglobina. La unin de una molcula de sustrato a una de las zonas de interaccin altera significativamente la afinidad por el sustrato de las dems zonas de interaccin. Las enzimas con este tipo de comportamiento son denominadas alostricas. La cooperatividad positiva tiene lugar cuando la primera molcula de sustrato unida incrementa la afinidad del resto de zonas de interaccin. Por el contrario, la cooperatividad negativa tiene lugar cuando la primera molcula de sustrato unida reduce la afinidad de la enzima por nuevas molculas de sustrato. Como ejemplos de enzimas con cooperatividad positiva tenemos la aspartato transcarbamilasa bacteriana20 y la fosfofructoquinasa,21 y con cooperatividad negativa, la tirosil ARNt-transferasa de mamferos.22 La cooperatividad es un fenmeno bastante comn y puede llegar a ser crucial en la regulacin de la respuesta enzimtica a cambios en la concentracin de sustrato. La cooperatividad positiva hace que la enzima sea mucho ms sensible a la concentracin de sustrato, con lo que su actividad puede llegar a variar en gran medida aunque se mueva en rangos muy estrechos de concentracin de sustrato. Por el contrario, la cooperatividad negativa hace que la enzima sea insensible a pequeos cambios en la concentracin de sustrato. La ecuacin de Hill23 suele ser utilizada para describir cuantitativamente el grado de cooperatividad en cinticas no michaelianas. El coeficiente de Hill (n) indica cuntas de las zonas de unin de sustrato de una enzima afectan a la afinidad de la unin del sustrato en el resto de las zonas de unin. El coeficiente de Hill puede tomar valores mayores o menores que 1:

n < 1: indica cooperatividad negativa. n > 1: indica cooperatividad positiva.

Cintica del estado preestacionario

Representacin grfica del estado preestacionario de una reaccin enzimtica donde se puede apreciar la fase inicial rpida. Al realizar un ensayo enzimtico y mezclar la enzima con el sustrato, existe un breve perodo inicial en el que no se produce ni sntesis de producto, ni estado intermedio de la enzima. El estudio de los milisegundos siguientes a la mezcla es denominado cintica del estado preestacionario y est relacionado con la formacin y consumo de los intermediarios enzima-sustrato (ES o E*) hasta el momento en el que se alcanzan ciertas concentraciones y comienza el estado estacionario. La primera enzima en la que se estudi este proceso, durante la reaccin de hidrlisis, fue la quimiotripsina.24 La deteccin de intermediarios suele ser la principal evidencia necesaria para saber bajo qu mecanismo acta la enzima. Por ejemplo, al realizar un ensayo de cintica rpida de una reaccin enzimtica gobernada por un mecanismo de ping-pong, podremos hacer un seguimiento de la liberacin de producto P y medir la formacin de intermediarios enzimticos modificados E*.25 En el caso de la quimiotripsina, el intermediario enzimtico se produce por un ataque nucleoflico del sustrato sobre una serina del centro cataltico, lo que genera una forma intermediaria acilada de la quimiotripsina. En la figura de la derecha, se puede observar como la enzima pasa rpidamente a un estado intermedio E* durante los primeros segundos de la reaccin. Posteriormente, cuando es alcanzado el estado estacionario, la velocidad disminuye. Esta primera fase de la reaccin proporciona la tasa de conversin de la enzima. Por lo tanto, la cantidad de producto liberado durante esta fase (que puede obtenerse prolongando la recta correspondiente al estado estacionario hasta cortar el eje y) tambin da la cantidad de enzima funcional presente en el ensayo.26

Mecanismo qumico

Uno de los objetivos ms importantes en los estudios de la cintica enzimtica es determinar el mecanismo qumico que subyace en la reaccin enzimtica, por ejemplo, determinar la secuencia ordenada de sucesos que transcurren en la transformacin de sustrato en producto. Las aproximaciones cinticas discutidas anteriormente pueden proporcionar informacin relacionada con la velocidad de reaccin de los intermediarios enzimticos formados, pero no permitirn identificar qu intermediarios son exactamente. Con el fin de determinar la etapa limitante de la reaccin o los intermediarios que se forman durante la misma, se pueden llevar a cabo ensayos enzimticos en diversas condiciones con enzimas o sustratos ligeramente modificados, que aporten datos al respecto. Un ejemplo caracterstico de etapa limitante de una reaccin es aquella en la que se rompe un enlace covalente dando lugar a un tomo de hidrgeno. Si intercambiamos cada tomo de hidrgeno por su istopo estable, deuterio, podremos saber cual de los posibles hidrgenos transferidos es el que determina la etapa limitante. La velocidad sufrir una variacin cuando el hidrgeno crtico sea reemplazado, debido al efecto isotpico cintico primario, cuyo origen se encuentra en la mayor estabilidad de los puentes de deuterio, ms difciles de romper que los puentes de hidrgeno.27 Tambin es posible medir efectos similares por medio de otras sustituciones isotpicas, tales como 13C/12C 18O/16O, pero los efectos producidos en estos casos son ms difciles de detectar. Los istopos tambin pueden ser utilizados para obtener informacin acerca del destino de diversas partes de la molcula de sustrato cuando este es transformado en producto. Por ejemplo, a veces es difcil de determinar el origen de un tomo de oxgeno en el producto final, ya que puede provenir del agua o de la molcula de sustrato. Esto puede resolverse mediante la sustitucin sistemtica de los tomos de oxgeno de las molculas que participen en la reaccin, por su istopo estable 18O, llevando posteriormente a cabo una bsqueda del istopo en el producto obtenido. El mecanismo qumico tambin puede ser elucidado estudiando los efectos cinticos e isotpicos bajo diferentes condiciones de pH,28 alterando los niveles de iones metlicos u otros cofactores,29 por mutagnesis dirigida de aminocidos conservados, o mediante el estudio del comportamiento de la enzima en presencia de anlogos del sustrato.

Inhibicin enzimtica
Artculo principal: Inhibidor enzimtico.

Esquema de una reaccin enzimtica en presencia de un inhibidor enzimtico de unin reversible. Los inhibidores enzimticos son molculas que reducen o anulan la actividad enzimtica. Estos inhibidores pueden unirse a las enzimas de forma reversible (la desaparicin del inhibidor restaura la actividad enzimtica) o irreversible (el inhibidor inactiva permanentemente a la enzima).

Inhibidores reversibles
Los inhibidores enzimticos reversibles pueden ser clasificados como competitivos, acompetitivos, no competitivos y mixtos, segn el efecto que produzcan en las constantes cinticas Km y Vmax. Este efecto depender de que el inhibidor se una a la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES o a ambos, como se puede observar en la figura de la derecha y en la tabla inferior. Para clasificar correctamente un inhibidor pueden llevarse a cabo estudios de su cintica enzimtica en funcin de la concentracin de inhibidor. Los cuatro tipos de inhibicin dan lugar a diagramas de Lineweaver-Burke y de Eadie-Hofstee9 que varan de diferente forma con la concentracin de inhibidor. Para abreviar, se usan dos smbolos:

y donde Ki y K'i son las constantes de disociacin para unirse a la enzima y al complejo enzima-sustrato, respectivamente. En presencia de un inhibidor reversible, los valores aparentes de la Km y la Vmax pasan a ser (/')Km y (1/')Vmax, respectivamente, como se puede apreciar en la tabla inferior para los casos ms comunes. Tipo de inhibicin ( solo Ki ) solo Ki' Ki = Ki' ) ( Ki Ki' ) Los ajustes por regresin no lineal de los datos de cintica enzimtica30 pueden proporcionar estimaciones muy precisas de las constantes de disociacin Ki y Ki'. mixta ( ) ( no competitiva acompetitiva competitiva Km aparente Vmax aparente

Inhibidores irreversibles
Los inhibidores enzimticos tambin pueden unirse e inactivar una enzima de forma irreversible, generalmente por medio de modificaciones covalentes de residuos del centro cataltico de la enzima. Estas reacciones decaen de forma exponencial y suelen ser saturables. Por debajo de los niveles de saturacin, mantienen una cintica de primer orden con respecto al inhibidor.

Mecanismos de catlisis

La variacin de energa como funcin de una coordenada de reaccin muestra la estabilizacin del estado de transicin cuando dicha reaccin es llevada a cabo por una enzima. El modelo de ajuste inducido es el ms utilizado al realizar estudios de interaccin enzimasustrato.31 Este modelo propone que las interacciones iniciales entre la enzima y el sustrato son relativamente dbiles, pero suficientes para producir ciertos cambios conformacionales en la enzima, que estabilizan e incrementan la fuerza de la interaccin. Estos cambios conformacionales implican a una serie de aminocidos catalticos del centro activo, en los cuales se producen los enlaces qumicos correspondientes entre la enzima y el sustrato. Despus de la unin, uno o ms mecanismos de catlisis disminuyen la energa del estado de transicin de la reaccin, por medio de una ruta alternativa a la reaccin. Los mecanismos de catlisis se clasifican acorde a diferentes criterios: catlisis covalente, catlisis por proximidad y alineacin de orbitales, catlisis cido-base general, catlisis por iones metlicos y catlisis electrosttica. Los estudios de cintica enzimtica no permiten obtener el tipo de catlisis utilizada por una enzima. Sin embargo, algunos datos cinticos pueden proporcionar una serie de

indicios que lleven a realizar otro tipo de estudios dirigidos a determinar dicho tipo de catlisis. Por ejemplo, en un mecanismo de ping-pong la cintica del estado preestacionario puede estar sugiriendo una catlisis de tipo covalente. Por otro lado, variaciones en el pH pueden producir efectos drsticos en la Vmax pero no en la Km, lo que podra indicar que un residuo del centro activo precisa un estado concreto de ionizacin para que se pueda llevar a cabo la catlisis enzimtica.

Catlisis enzimtica

Representacin de la variacin y diferencias de la energa libre de Gibbs entre una reaccin no catalizada por una enzima (arriba, en rojo) y otra que s lo es (abajo, en azul). La catlisis enzimtica es una disciplina de la enzimologa que estudia los mecanismos de catlisis por los cuales las protenas o cidos nucleicos con actividad enzimtica pueden favorecer la reaccin de ciertos sustratos y su conversin en productos. Este hecho est subordinado a las leyes de la catlisis qumica convencional: es decir, la existencia de un enzima no permite la aparicin de nuevas reacciones, ni va en contra de la termodinmica del proceso; simplemente, acelera su velocidad favoreciendo una ruta de menor coste energtico incluyendo en la dinmica de la reaccin un estado intermediario de alta energa de modo que el nmero de molculas activas, capaces de crear y destruir nuevos enlaces, aumente.