LA SEROLOGA COMO INSTRUMENTO DIAGNSTICO EN FAUNA SALVAJE:

EL CUANDO, QUE, Y COMO DE LAS PRUEBAS DIAGNSTICAS DE AGENTES ETIOLGICOS

Ursula Hfle, Juan Manuel Blanco Aquila Foundation y Centro de Estudios de Rapaces Ibricas, Junta de Copmunidades de Castilla - La Mancha, 45671 Sevilleja de la Jara. e-mail: Uholfeh@nexo.es y aquilafoundation@hotmail.com

1- INTRODUCCIN
La serologa aprovecha la habilidad de los organismos de defenderse ante una infeccin por un patgeno. Esta defensa incluye diferentes mecanismos especficos e inespecficos, de los cuales los inespecificos son innatos e incluyen mucosas, sistemas mecnicos, macrofagos etc. Algunos componentes de este sistema constituyen la base sobre la que funciona el sistema especifico dado que es un sistema que adquiere inmunidad tras la fagocitosis y exposicin de un antgeno por los macrofagos, su posterior reconocimiento e interaccin con los linfocitos que estimula la formacin de anticuerpos. Tras una infeccin la presencia de anticuerpos se puede detectar en general en un plazo de entre 10 y 15 das dependiendo del tipo, cantidad, virulencia y patogenidad del antgeno y del estado, la va de infeccin y la capacidad inmune del animal infectado. Tambin influye si se trata de una primera exposicin o de si un animal ya ha tenido contacto con el antgeno en cuestin. Cuando un animal entra en contacto por segunda o consecutiva vez con un antgeno al que ya ha estado expuesto se produce una respuesta ms alta, durante mas tiempo y tras un periodo mas corto de latencia (periodo entre la infeccin y la aparicin de anticuerpos en la circulacin). La respuesta ante una primera infeccin se llama respuesta primaria, mientras la respuesta seguida a una reinfeccin se denomina respuesta secundaria. La rapidez de la respuesta secundaria se debe a la creacin de una "memoria" del antgeno tras su primera aparicin - y la reaccin desencadenada despus de la segunda exposicin es una reaccin anamnestica. La deteccin de anticuerpos circulantes no solo depende de factores ligados al individuo o el patgeno investigado, sino tambin de los mtodos empleados para su deteccin, hecho que tratamos en un captulo posterior. Para la demostracin de una infeccin activa o una respuesta anamnestica hacen en general falta varios (mnimo dos) anlisis consecutivas para visualizar un aumento en los anticuerpos.

2- LAS TCNICAS DE SEROLOGA

Los diferentes test serolgicos aprovechan una serie de fenmenos fisiolgicos como son el sistema de complemento, las reacciones entre anticuerpo y antgeno, la precipitacin y la aglutinacin. Los sistemas ms importantes aprovechados para estas pruebas son: a) El sistema de complemento El sistema o la cascada de complemento consiste en veinte protenas sricas algunas de ellas termolabiles. La formacin de un complejo de antgeno y anticuerpo activa este sistema de protenas que interaciona de forma secuencial. Su activacin resulta en una reaccin con las membranas de clulas que puede causar bien su activacin, la alteracin de su estructura o su destruccin. Eritrocitos sobre la superficie de los cuales se han fijado anticuerpos son destruidos mediante lisis por el sistema de complemento. Una de las pruebas conocidas de serologa aprovecha esta accin litica del complemento. La tcnica utiliza cantidades conocidas de complemento para medir la

cantidad de anticuerpos presentes en una muestra. Para no medir concentraciones errneas los factores de complemento prprios de la muestra, todos ellos termolabiles, se desactivan mediante calentamiento a 56C durante 30 minutos previamente a la realizacin de la prueba. b) La reaccin de anticuerpos con el antgeno La reaccin entre anticuerpos y antgeno es muy especfica, y por esta razn constituye un instrumento muy valioso para mediante un componente conocido (antgeno) identificar la presencia de uno desconocido con un alto nivel de seguridad. La applicacin de estos recursos es muy amplia, sobre todo en el diagnstico y en la monitorizacin de enfermedades infectocontagiosas. La reaccin de un antgeno con anticuerpos resulta en la formacin de complejos inmunes de diferentes tpos (precipitantes, etc.). Dependiendo del antgeno y el sistema de prueba utilizados se pueden obtener y medir diferentes tipos de estos complejos. En general, en las pruebas de serologa se emplea una cantidad conocida de antgeno y se diluye el suero que se investiga de forma seriada. Se mide la concentracin del suero que an inhibe (mediante complejos anticuerpo antgeno) una accin concreta del antgeno, o la que an forma complejos que provocan una reaccin demostrable. Esta concentracin del suero es expresado como el ttulo de anticuerpos del suero.

3- LAS DIFERENTES PRUEBAS SEROLGICAS

En el momento de realizar pruebas diagnsticas de enfermedades infectocontagiosas hay dos posibles vas principales: pruebas directas encaminadas a la deteccin del agente etiolgico o de parte de su ADN en el animal afectado, o pruebas indirectas que demuestran que el sistema inmune del individuo afectado ha estado en contacto con el agente en cuestin. Cualquiera de los tipos de prueba aporta una informacin diferente y las pruebas aplicables varan en especfidad y sensibilidad. En lo presente nos centramos principalmente en las pruebas que permiten la deteccin de anticuerpos aunque algunas tcnicas son parecidas para la deteccin de anticuerpos y antgeno. 1- Precipitacin/ La adicin de un antgeno soluble a una solucin con anticuerpos homlogos resulta en la formacin de complejos inmunes que precipitan de la solucin. Cuando se aumenta la cantidad de antgeno que se aade se forman cantidades variables de complejos y con esto de precipitado, obteniendo la mayor cantidad de complejos cuando la proporcin de antgeno y anticuerpo en la solucin es equivalente o ptimo. Esto se aprovecha en los test serolgicos de inmunoprecipitacin como por ejemplo para la identificacin de diferentes estreptococos. 2- Inmuno difusin

Cuando esta tcnica se utiliza en un medio semisolido como los geles de agar en los cuales los dos componentes el antgeno y el anticuerpo migran a travs del agar hasta que se encuentren y precipitan en el lugar donde su proporcin es optima, se trata de inmunodifusin. Este mtodo permite identificar anticuerpos y antigenos desconocidos y comparar antgenos parecidos entre si (mtodo de Ouchterloney). Tambin permite cuantificar el antgeno presente en una solucin determinada. Para ello se pueden obtener resultados mas exactos mediante inmunodifusin radial (el antgeno se encuentra en pequeas indentaciones y difunde por un gel que contiene una concentracin conocida de antisuero, de modo que dimetro del anillo de precipitacin que se forma es proporcional a la cantidad de antgeno. 3- Inmunoelectroforesis En lquidos que contienen mezclas de antgeno se puede aplicar primero una electroforsis para separar los antgenos presentes y luego la inmunodifusin para su identificacin. 4- Aglutinacin Anticuerpos pueden reaccionar con un antgeno determinado y luego interconectar entre ellos o diferentes componentes antgenos presentes por ejemplo en la superficie de una bacteria. Este proceso resulta en la aglutinacin que es visible macroscopicamente y es un instrumento til en la identificacin de bacterias, hongos e incluso protozoos medinte antisueros especificos. Del mismo modo utilizando un antgeno purificado especifico se puede demostrar la presencia de anticuerpos frente a este antgeno en una muestra. Ambos mtodos se realizan con frecuencia de forma directa en un porta y estan conocidos como Aglutinacin en porta. Ejemplos son la aglutinacin en porta para la deteccin rpida de anticuerpos frente a diferentes Mycoplasma spp. o Salmonella spp. as como el test de rosa bengala para la deteccin de anticuerpos frente a Brucella abortus. Para determinar anticuerpos frente a Leptospira spp. se utilizan cultivos vivos de Leptospira en una aglutinacin en porta bajo el miscroscopio en campo obscuro. Para cuantificar anticuerpos mediante aglutinacin se puede utilizar el test de aglutinacin en tubo, diluyendo el antisuero en pasos de dos en dos (a veces dificl de interpretar y requeriendo muestras seriadas). En el caso de antgenos que se pueden fijar sobre glbulos rojos (de forma pasiva o mediante tratamiento qumico), por ejemplo de ovejas, la hemaglutinacin en placas de microtitracin se puede utilizar para cuantificar anticuerpos (la mnima concentracin que an aglutina los glbulos rojos). 5- Fijacin de complemento (CFT) El test de fijacin de complemente utiliza el hecho de que complejos de anticuerpo y antgeno activan el sistema de complemento que, entre otras actuaciones, causa la lisis de eritrocitos que muestran antgeno. la prueba se desarolla en dos pasos: Tras la inactivacin de los sueros (para eliminar la actuacin del complemento proprio del suero), en una placa de microtitracin (pozos en V) se aade antgeno y una cantidad conocida de complemento (de cobaya). Tras 30 minutos de incubacin se aaden

eritrocitos de oveja (sensibilizados mediante suero de conejo con hemolysina) y se incuba otra media hora. En los sueros que contenan anticuerpos, se han formado complejos que se han ligado al complemento y han evitado la destruccin de los eritrocitos mientras que en las muestras en las que no hay anticuerpos se lisan los glbulos rojos. Por ejemplo para deteccin de anticuerpos frente a Chlamydia psittaci (mamferos). 6- Hemaglutinacin e inhibicin de la misma (HA y HAI) Algunos virus, especialmente los Paramixovirus aviares o los virus de influenza, pueden adherirse a la superficie de los glbulos rojos y aglutinarlos. Esto, y el hecho que la presencia de anticuerpos inhibe esta aglutinacin es utilizado en una tcnica serolgica que se aplica con frecuencia. Primero se suele probar la actividad aglutinante del virus que se va a utilizar como antgeno y determinarse su concentracin en cuatro unidades hemaglutinantes. El anlisis tambin discurre en dos pasos: Los sueros a analizar se diluyen en dos por dos en una placa de microtitracin, y se aade el antgeno en una concentracin de 4 unidades aglutinantes. Tras 30 minutos de incubacin se aaden eritrocitos lavados y se incuba otros 30 minutos y luego se determina el ttulo de inhibicin de hemaglutinacin de los sueros analizados. 7- Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) El descubrimiento de que una serie de encimas como por ejemplo la fosfatasa alcalina se podan ligar a anticuerpos sin perder su actividad ni interferir con la accin de los anticuerpos llevo al desarrollo de un gran grupo creciente de pruebas diagnsticas que aprovechan la posibilidad de detectar los anticuerpos mediante la actividad de la encima ligada. Los llamados Enzyme-linkedimmunosorbent assays (ELISA) son seguros y faciles de utilizar y permiten tanto la determinacin y cuantificacin de anticuerpos (ELISA indirecto, competitivo, o blocking) como de antgeno (ELISA directo o Sandwich) y por eso tienen una amplia aplicacin en el diagnstico tanto de enfermedades viricas y bacterianas como las causadas por hongos o parsitos. El ELISA indirecto para la deteccin de anticuerpos utiliza antgeno adherido a membranas o recipientes de poliestireno, al que se adiciona el suero a analizar y sueros de control. Tras una incubacin y el lavado para eliminar los anticuerpos sobrantes se aade un suero anti-inmunoglobulina conyugado con una encima y se incuba y lava de nuevo. Aadiendo ahora un substrato para la encima que esta transforma causando una reaccin de color que se puede determinar visualmente o mediante un espectrofotometro. El problema de esta prueba es la necesidad de una antiinmunoglobulina que sobre todo en aves es un impedimiento por que no hay reacciones cruzadas entre las inmunoglobulinas de especies diferentes y las inmunoglobulinas comerciales existentes solo pertenecen a muy pocas especies. Un intento de obviar esta necesidad son los ELISAS bloqueantes (blocking ELISA). Para la deteccin de antgeno se utiliza una versin directa del ELISA o el mtodo de sandwich y se puede aplicar tanto en suero como en otras secreciones. Este test utiliza anticuerpos especficos fijados en placas de poliestireno y que capturan el

antgeno al adicionar el suero. Tras incubacin y un lavado se adiciona otor anticuerpo especifico ligado una encima que al igual que con el mtodo indirecto luego transforma un substrato produciendose una reaccin de color que se puede leer luego. 8- Radioimmunoassay (RIA) Este sistema utiliza una metodologa similar a la del ELISA o de la inmunofluorescencia, pero aplicando moleculas marcados con radioisotopos. Esto hace el test extremadamente sensitivo y permite detectar cantidades mnimas de antgeno o anticuerpos. 9- Inmunofluorescencia En la inmunofluorescencia se utilizan inmunoglobulinas marcadas con sustancias fluorescentes como isotiosyanato de fluorescina o rhodamina, parecido a las encimas empleados en los ELISA. Se trata de un mtodo muy sensible pero que requiere el uso de un microscopio de fluorescencia con lampara de mercurio y experiencia en la interpretacin para evitar errores. Tiene un campo muy amplio de aplicacin y se utiliza con frecuencia para la deteccin de antgeno en tejidos. 10- Inmunoperoxidasa Este mtodo permite la deteccin de entgeno en tejidos mediante el uso de inmunoglobulins marcadas con una encima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) que generan una coloracin desde un substrato sin color. La ventaja ante las tcnicas de fluorescencia son el equipo necesario y que se puede aplicar en material incluido en parafina. Para eata prueba tambin hace falta mucha experiencia para su correcta interpretacin. 11- Test de neutralizacin de virus Este mtodo utiliza la habilidad de los anticuerpos de anular la accin biolgica de un virus o de una toxina. Esto se aplica en algunas pruebas para la neutralizacin de toxinas bacterianas (prueba de Nagler para Clostridium perfringens) y sobre todo para un gran nmero de virus. El mtodo consiste en la infeccin de un cultivo celular receptivo con un virus que causa lesiones visibles en este cultivo. La concentracin del virus es conocido mientras que los sueros a analizarse diluyen en pasos de dos en dos. Si el suero contiene anticuerpos especficos estos inhiben la infeccin de las celulas por el virus en cuestin y con ello la aparicin de lesiones en el cultivo celular. Para muchos virus de importancia para los animales domsticos el test de neutralizacin de virus constituye el "gold standard" por su especifidad y sensibilidad. Sin embargo tambin es el anlisis mas costoso y que ms tiempo requiere debido a la necesidad de trabajar con cultivos celulares o huevos embrionados. 12- Test de proteccin

Este mtodo funciona segn el mismo principio que el test de neutralisacin de virus, pero se realiza en vivo. Se aplica por ejemplo para la deteccin de txinas producidas por Clostridium botulinum. 13- Tcnicas nuevas Algunos laboratorios de diagnstico clnico ya disponen de tcnologa moderna aplicada de momento prioritariamente a medicina humana, que principalmente aplica alguna de las tcnicas anteriormente marcadas de forma automatizada (VIDAS). Anlisis de inters para la fauna silvestre mediante estos aparatos incluyen la deteccin de Salmonella spp. y Clamydiophila. Mtodos moleculares como la Polymerase Chain Reaction (PCR) estn encaminados a la deteccin de antgeno en una muestra determinada.

4- ESPECIFIDAD Y SENSIBILIDAD
La validez de una prueba diagnstica en cuanto a una enfermedad infectocontagiosa depende de su especifidad (capacidad de distinguir el material (anticuerpo, antgeno) objetivo de la prueba de otro parecido) y de su sensibildad (capacidad de detectar cantidades pequeas del material objetivo de la prueba). El deal sera una prueba que al mismo tiempo garantizara la mxima especifidad (sin falsos positivos) y la mxima sensibilidad (sin falsos negativos) y que la mismo tiempo diera resultados rpidos. Cada prueba tiene una sensibilidad determinada (tabla 1). Tabla 1. Sensibilidad relativa de diferentes pruebas serolgicas (segn Tizard, 1992 y Ritchie et al., 2000)

Tipo de prueba
Inmunodifusin Inmunofluorescencia Fijacin de complemento Aglutinacin Inhibicin de la Hemaglutinacin ELISA Neutralizacin de virus

Concentracin de protenas que puede detectar (g/ml)

3 a 30 0,1 a 1 0,1 a 0,05 0,05 a 0,001 0,01 a 0,005 0,01 a 0,0005 0,00005

5- APLICACIONES PARA LA SEROLOGA EN LA FAUNA SILVESTRE

Ante todo hay que tener en cuenta que la gran mayora de la tcnicas serolgicas existentes han sido desarrollados para su uso con animales domsticos, bien de produccin o bien de compaa. Esto significa que muchas de las tcnicas existentes no han sido validadas para las especies silvestres para los que nosotros necesitamos efectuar un diagnstico. Adems algunas de estas tcnicas, especialmente las ELISAS necesitan disponer de reactivos (por ejemplo anticuerpos anti IgG) especificos de la especie a analizar. Por estas razones hay que seleccionar con mucha prudencia los tests que se vayan a utilizar en funcin de la especie y de la enfermedad que se quiere investigar. Principalmente hay dos posibles campos de utilidad para la serologa: a) El diagnstico de un proceso infeccioso en curso Si se utiliza con este fin hay que observar una serie de requerimientos muy concretos: La deteccin de anticuerpos (inmunoglobulinas G) frente a un antgeno especfico significa que el animal ha sido recientemente expuesto a este antgeno y que se ha producido una infeccin. Para poder determinar que hay una infeccin en curso e incluso que una enfermedad clnica este relacionado con el patgeno en cuestin hace falta el examen de muestras seriadas es decir al mnimo dos muestras en una distancia de 10 das en las que se demostrara un aumento del ttulo de anticuerpos cuatro veces la primera cifra. En algunas infecciones, que producen inmunidad persistente la deteccin de anticuerpos en una sola muestra si puede ser diagnstica (Herpesvirus, HIV). Las tcnicas existentes de deteccin de anticuerpos generalmente no pueden distinguir entre anticuerpos procedentes de una infeccin o de una vacunacin Para la deteccin de anticuerpos es necesario que el animal infectado tenga un sistema inmune funcional que produce anticuerpos. Los anticuerpos producidos con respuesta a una infeccin desaparecen con el tiempo de la circulacin sangunea, y en algunos individuos o especies la respuesta a un infeccin determinada es muy dbil. Por estas dos razones la ausencia de anticuerpos no necesariamente significa la ausencia de una infeccin. Algunos anticuerpos producidos contra un antgeno pueden tener reacciones cruzadas con otro antgeno y producir resultados falsos positivos (APMV-1 y aPMV-3) En el caso del diagnstico clnico en general es mejor la deteccin del patgeno o de su ADN que la presencia de anticuerpos frente a el.

b) La monitorizacin de la presencia y prevalencia/la exposicin a un patgeno en concreto en un individuo o en una poblacin; por ejemplo en chequeos previos a una translocacin o reintroduccin. Una de las grandes utilidades de la serologa es la imagen momentan que se puede obtener sobre la presencia y prevalencia de un patgeno en un apoblacin o en grupo determinado de individuos. Esto es especialmente verdad en relacin con proyectos de reproduccin ex situ, en translocaciones de animales, y en situaciones de reintroducciones de individuos en una poblacin salvaje. Aunque el papel de las enfermedades como factor influyente en el xito de este tipo de actuaciones solo se ha reconocido recientemente existen ya documentos elaborados por organismos de reconocida autoridad en la conservacin de especies amenazadas como la IUCN en las que se hacen recomendaciones sobre la monitorizacin de enfermedades y anlisis previos a translocaciones, etc. La serologa permite tambin un paso previo con la monitorizacin del estado sanitario de poblaciones y la determinacin de este modo, por ejemplo, de que patgenos pueden ser de importancia al convertirse una poblacin determinada en receptora de individuos reintroducidos, o de nuevos ejemplares (stock de cra).

6- QUE MTODO ELEGIR?

En muchas ocasiones existen varios tipos de pruebas serolgicas diferentes para detectar anticuerpos frente a un antgeno determinado, pero segn la informacin que se quiere obtener, la especie con la que se trabaja o la situacin es preciso elegir la prueba mas adecuada. Dado que las diferentes pruebas existentes varan tambin frecuentemente en su especfidad y sensibilidad (ver tabla 1) la OIE (office internationale des epizooties) ha editado un manual de estandard para las pruebas diagnosticas para las enfermedades infectocontagiosas mas importantes de los animales domsticos en los que define los gold standard la prueba referencia o mejor y hace recomendaciones sobre que mtodos a emplear. En muchos casos esta informacin es tambin aplicable a las especies de fauna silvestre, mientras que en otros no, siendo otro factor de importancia el coste de las pruebas. La siguiente tabla 2 resume las enfermedades infectocontagiosas mas importantes y las pruebas serolgicas u otras, mas recomendadas:

Tabla 2. Anlisis mas adecuadas para diferentes enfermedades infectocontagiosas de interes en avifauna silvestre

Enfermedad
Enfermedad Newcastle Influenza aviar ??Enteritis etc. Gumboro

Agente etiolgico

Especies afectadas

Prueba serolgica recomendada

HAI HAI, AGID (ELISA para galliformes) NT NT, AGID NT

de Paramyxovirus aviar Aves 1 (aPMV-1) Influenzavirus Aves Aves Aves (gallina) Rapaces, palomas Aves

Adenovirus Infectious Bursal Disease Virus Inclusion Body Herpesvirus (FHV, Disease (IBDV) OHV, PHV) Viruela aviar Poxviridae

(PBFD solo Avian Polyomavirus Aves, psitacidas) rapaces Diferentes procesos Circovirus aviar Aves (hasta la No hay serologa vlida : fecha en PCR psitacidas, palomas, gaviotas, paseriformes) Ornitosis Chlamydiophila Aves Antigen ELISA. (IgM: infeccin actual y clnica, IgG exposicin en el pasado inmunolgico), mejor cultivo Spirochaetosis Borrelia anserina Acuaticas y AGID galliformes Micoplasmosis Micoplasma spp. Aves Aggl. en porta con validez limitada (ausencia), es necesario aislar o detectar el germen por PCR Salmonellosis Salmonella spp. Aves Aggl. en porta puede dar primera aprox para alguna cuestin (tambin de yema de huevo ) pero mejor es cultivar Aspergilosis A. fumigatus, niger, Aves ELISA de anticuerpos o etc. antgeno idealmente ambos al mismo tiempo. Resultado depende de la calidad de la muestra

inmunodifusin en gel o NT en huevos, histologa y cultivo mejor incl. NT o PCR

7- QUE UTILIZAR? COMO TOMAR Y CONSERVAR LA MUESTRA?

Para la deteccin de anticuerpos se utiliza generalmente plasma o suero obtenido de forma estril, o, en ocasiones suero extrado de leche o de yema de huevo. Idealmente las pruebas se realizan con suero, obtenido tras la extraccin de sangre de forma estril en un tubo estril sin anticoagulante. Tras la coagulacin de la sangre a temperatura ambiente la sangre se centrifuga y el sobrenadante se separa en por ejemplo de tubos eppendorf de tamao adecuado y se guarda congelado (a -20 o -80 C). Las inmunoglobulinas, especialmente las IgG que se miden en la gran mayora de las pruebas serolgicas (excepcin IgM para Clamidiofila) son relativamente estables y aguantan varios ciclos de congelacin y descongelacin. Sin embargo por seguridad y cuando se quieren realizar varias pruebas distintas (pre-translocacin/-reintroduccin, estudios) es recomendable guardar varias copias de la misma muestra. Si la extraccin de sangre se realiza con el fin de realizar varias pruebas al mismo tiempo (bioqumica..etc.) y/o no hay disponibilidad de tubos estriles sin anticoagulante, se puede obtener plasma tras la centrifugacin de sangre obtenida en heparina ltio. Antes de analizar muestras de plasma sanguneo sin embargo es imprescindible realizar una inactivacin a 56 C durante media hora. Para serologa de antigenos adems de suero o plasma sanguneo se pueden emplear otros liquidos como exudados, saliva, synovia etc.. Es muy importante tener encuenta que un anlisis slo puede ser tan bueno como la muestra tomada, es decir hay que observar mucho tomar una muestra de forma que sea representativa y que no se midan contaminantes.

8- CONCLUSIONES
La serologa es un instrumento versatil y de gran inters para el tarbajo de conservacin y de los centros de recuperacin. Como prueba diagnstica, mtodo de monitorizacin e instrumento para la evaluacin de riesgos su validez depende de la correcta seleccin, aplicacin e interpretacin de la prueba a utilizar.

9- BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
1- OIE (Office Internationale des Epizooties). Manual of standards for diagnostic tests and vaccines, 4th edition, 2000. 2- Ritchie, B.W., Harrison, G.J., Harrison, L.R. (Eds): Avian Medicine: Principles and Applications, Winger's Publishing, Inc., Lake Worth, Florida, 1994. 3- Quinn, PJ; Carter, ME; Markey, B.; Carter, G.R. Clinical Veterinary Microbiology. Mosby-Year Book Europe Limited. 1994.

4- Swayne, D.E., Glisson, J.R., Jackwood, M.W., Pearson, J.E. and Reed, W.M. (editorial committee). A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens. 4th edition, American Association of Avian Pathologists Inc., Kennett Square, Pennsylvania. 1998. 5- Tizard, I. Veterinary Immunology. 4th ed. Philadelphia PA, WB Saunders, 1992. 6- Woodford, M.H. (ed.). 2001. Quarantine and health screening protocols for wildlife translocation and release into the wild. OIE, EAZWV, IUCN, Care for the Wild International. 99 pp.