Liberacin de Calcio Inducida por extensin del Msculo Liso Abstracto Las clulas musculares lisas se someten a aumentos

sustanciales de longitud, el estiramiento pasivo durante los aumentos en la presin intraluminal en vasos y rganos huecos. Respuestas contrctiles activas para contrarrestar aumentos transmurales de presin fueron descritas por primera vez hace casi un siglo y varios mecanismos han avanzado para explicar este fenmeno. Presentamos aqu que la elongacin de las clulas musculares lisas resulta en el receptor de rianodina mediado por Ca 2+ liberado, en miocitos individuales. El alargamiento mecnico de los miocitos aislados e individuales de la vejiga urinaria a un 120% aproximadamente de su longitud laxa, llev a la liberacin de Ca2+ de los almacenes intracelulares en forma de chispas individuales de Ca2+ o propagaciones de olas de Ca2+. La liberacin de Ca2+ no se debi por la liberacin de calcio inducida por calcio, como se observa en la solucin extracelular libre de Ca2+, y cuando los iones de Ca2+ libres en el citoplasma fueron fuertemente tamponados para evitar aumentos en la concentracin de Ca2+. La liberacin de calcio inducida por estiramiento (SiCr), no se vio afectada por la inhibicin de la liberacin de Ca2+ mediada por el InsP3R, pero fue completamente bloqueada por rianodina. La liberacin se produjo en ausencia de corrientes activadas por estiramiento, reportadas previamente; de todas maneras, SiCr gener corrientes de cloruro activadas por calcio en forma de corrientes transitorias hacia el interior, lo que sugiere un mecanismo de regulacin para la generacin de corrientes espontneas en el msculo liso. Tambin se observ SiCr en los miocitos individuales durante el estiramiento de la vejiga urinaria en segmentos de musculatura lisa intactas. Por lo tanto, el estiramiento longitudinal de las clulas del msculo liso induce la liberacin de Ca2 +, a travs del gating de RYR. SiCr puede ser un componente importante de la respuesta fisiolgica a los aumentos en la presin luminal en los tejidos del msculo liso.

Introduccin La liberacin de calcio desde el retculo sarcoplsmico (SR) del msculo es un proceso muy desarrollado que implica el acoplamiento de las seales en el sarcolema a la compuerta de canales SR de liberacin de Ca2. Por lo tanto, en el msculo esqueltico y cardiaco, la despolarizacin del sarcolema desencadena la apertura de receptores de rianodina (RyRs), ya sea a travs de una asociacin fsica entre el canal de tipo L de Ca2 y RYR1, o un aumento en la [Ca2]i en el microdominio del canal tipo L, que es detectada por RYR2 resultando en la liberacin de calcio inducida por calcio (CICR). En el msculo liso, el acoplamiento bioqumico entre los receptores de fosfolipasa C-enlazados y InSP3 receptor (InsP3R) de canales de Ca2 sobre el SR, sirve como una funcin anloga en el acoplamiento excitacin-contraccin. Sin embargo, a pesar de la presencia de un InsP3 acoplado bien desarrollado, sistema de liberacin Ca2; la liberacin de Ca2 RYR mediada ha sido demostrada en varias formas en el msculo liso. Este proceso de liberacin toma la forma de espontneas chispas de Ca2 en nonspiking miocitos y CICR en miocitos de la vejiga urinaria. De hecho, ambos procesos implican probable CIcR, en que la probabilidad de apertura de los canales RYR es una funcin de [Ca2]i. Por lo tanto, en los miocitos enriquecidos, la apertura de canales de tipo L de Ca2 durante el potencial de accin resultan en un aumento de la [Ca2]i, lo que aumenta la probabilidad de liberacin en forma de chispas de Ca2. Tal proceso es anlogo a los eventos de liberacin de calcio espontneos observados en el msculo del sarcmero. En muchos tejidos del msculo liso, miocitos individuales estn expuestos a esfuerzos mecnicos considerables y cambios asociados en longitud de la clula, y desde hace tiempo se ha sabido que los aumentos en la tensin pasiva evocan contraccin del msculo liso. Un proceso por el cual el estrs mecnico puede acoplar la activacin celular es a travs de la apertura mecnica o de estiramiento sensible de los canales inicos. Canales catinicos activados por estiramiento se han reportado en el msculo liso y pueden promover el acoplamiento CE mediante la despolarizacin de miocitos y por mediacin de Ca2 de suficiente flujo para efectuar la contraccin. Por otra parte, el flujo de Ca2 a travs de estos canales se puede amplificar a travs de CIcR. Hemos razonado que las alteraciones de la longitud de la clula podra desencadenar CIcR en el msculo liso a travs de la activacin de canales catinicos activados por estiramiento y experimentos diseados para examinar esta posibilidad. Aqu se demuestra que los aumentos de la longitud de la clula en la compuerta de RYR y la liberacin de Ca2 de la SR en forma de chispas de Ca2, o de propagacin de ondas de Ca2, dependen del grado de estiramiento celular. Sin embargo, este proceso no requiere un flujo de iones extracelulares de Ca2, activacin de corrientes inicas, o incluso un aumento de la [Ca2] i. Por lo tanto, la liberacin de calcio inducido por el estiramiento (SiCr) puede constituir una forma adicional de acoplamiento entre el sarcolema y el SR.

Materiales y Mtodos Aislamiento de clulas Los conejos y ratones fueron anestesiados y sacrificados de acuerdo a un protocolo aprobado de animales de laboratorio. Las clulas individuales de conejo se prepararon como se describi anteriormente. En pocas palabras, se retiraron de la vejiga urinaria, se diseccionaron en una solucin salina fisiolgica oxigenada, enfriada con hielo picado, y se suspendi en modificado con 1,5 mg/ml de colagenasa tipo II, 1 mg / ml de proteasa tipo XIV, y 5 mg / ml de suero bovino de albmina a 37 C durante 35 a 40 min. Miocitos de la vejiga de ratn se aislaron mediante la reduccin de la vejiga en trozos pequeos, que luego se incubaron durante 20 min en 1 mg / ml papana, 1 mg / ml ditioeritritol, y 1 mg / ml de albmina de suero bovino Ca2 - solucin libre (ver ms abajo). Los fragmentos fueron transferidos a continuacin a 1 mg / ml de colagenasa tipo II y una solucin de 100 M de Ca2 suplementado con 1 mg / ml de albmina de suero bovino y se incubaron durante 10 min, despus se tritur con una amplia - pipeta Pasteur de boquilla, y pasado a travs de 125 - m malla de nylon. Las clulas se concentraron por centrifugacin a baja velocidad, se lavaron con medio fresco, se resuspendieron, y se almacenaron a 4 C. Preparacin del tejido Para la formacin de imgenes de tejidos de la vejiga aislada, la vejiga del ratn se retir y las capas fibrosal y de mucosa fueron disecadas en una solucin enfriada con hielo libre de Ca2. Segmentos musculares, 2-3 mm de largo y 100-200 m de dimetro, se cortaron con unas tijeras de diseccin. Cada extremo de la tira fue ajustado, envuelto en clips de aluminio en forma de T, y se digiri con suavidad en 0,5 mg / ml de colagenasa tipo II con 1 mg / ml de albmina de suero bovino durante 5 min a 32C. Medicin de fluorescencia de Ca2 Miocitos individuales fueron incubados con 10 M de Fluo -4 AM (Sondas moleculares) durante 10 min a temperatura ambiente en una cmara de grabacin montada en un microscopio invertido (TE300, Nikon) y se perfundieron con solucin salina fisiolgica extracelular durante 40 min a temperatura ambiente. La solucin extracelular era (mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, CaCl2 1,8, MgCl2 1,2, HEPES 10, y 10 de glucosa (pH 7,4, ajustado con NaOH). Para la solucin extracelular de Ca2 - libre, CaCl2 fue omitido de la solucin por encima o 3 mM de EGTA y 1 mM de CaCl2 se utiliz para sujetar [Ca2] libre a 100 nM, como se indica. Las soluciones se cambiaron con un peso por sistema fusin para facilitar el intercambio de solucin completa dentro de los 30 s. Tramo celular se lleva a cabo utilizando dos pipetas de parche unidas a los manipuladores separados, y la punta cargado con Fluo- 4 pentapotas sal de potasio para facilitar la deteccin del grado de estiramiento. Las pipetas fueron selladas a las clulas ya sea por succin para formar un sello de alta resistencia, o por recubrimiento de la punta de la pipeta con espuma de

poliuretano. Las clulas se estiran moviendo las pipetas a lo largo del eje longitudinal de la clula; tramo de longitud de holgura (L1) a una nueva longitud (L2) se presenta como el porcentaje de incremento en la longitud de la clula, o (L2 L1) / L1. Para los experimentos en los segmentos de tejido, las preparaciones se incubaron con Fluo -4 am (10M) y 0,05 % de cido plurnico durante 1h y se transfiere a travs de una varilla de vidrio fino a un 60 microlitros de solucin, montados en el microscopio invertido. El T- clips se colocaron sobre los ganchos de alambre fino para suspender la preparacin y los segmentos se redujeron al fondo de la cubeta, que estaba hecho de un cubreobjetos de cuarzo fino. La tira se estira inicialmente en un pequeo porcentaje en toda la longitud de holgura aproximada de longitud de reposo. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente. Fluo-4 fluorescencia se registr utilizando el lser confocal de barrido cabeza, unido a un microscopio invertido (TE- 300, Nikon) con un objetivo de inmersin en agua 60 plan-apo (1,2 na, Nikon). Las clulas se excitaron con 488 nm de luz con un lser de kriptn / argn y linescan o xy imgenes grabadas utilizando software Lasersharp (Bio -Rad Laboratories). Linescans se obtuvieron en un intervalo de 1,33 o 0,833 ms por lnea, las imgenes xy (128 pxeles 30 o 40 lneas) se registraron a una tasa promedio de 37.5 - frame, 44 - , o 57,3 ms, entre vals. Las imgenes se analizaron usando la versin 4.2 del software LaserPix (BioRad Laboratories). Perfiles de fluorescencia se construyeron a partir de lneas xy y -can imgenes utilizando LaserPix o software personalizado desarrollado. Para las imgenes xy una intensidad de fluorescencia media basal (F0) se obtuvo promediando una zona de reposo de la clula (cuatro o cinco pxeles de dimetro) durante los primeros 20 imgenes. Un rea de dimetro de tres pxeles de inters se centra en una chispa Ca2 y el valor promedio (F) de esa rea dividida por F0 en forma de cuadro por cuadro. Para im - edades LineScan , F0 se obtuvo promediando la fluorescencia para cada pxel ( x dimensin ) para un perodo anterior a la activacin de una chispa de Ca2 , y la fluorescencia de todos los pxeles ( F) se divide por F0 . Perfiles se construyeron por un promedio de tres pxeles de biseccin una chispa de Ca2 para cada punto de tiempo en la exploracin. Grabacin por Patch -Clamp Las corrientes de membrana fueron registradas durante un estiramiento de una sola clula utilizando mtodos de fijacin de voltaje de clulas enteras. En estos experimentos, uno de las dos pipetas de estiramiento tambin servicios ved como una pipeta de grabacin y se llen con solucin intracelular; despus se formaron sellos en ambos extremos, el parche de la membrana fue roto en la pipeta de grabacin y alargamiento celular se logr moviendo la pipeta no grabada. La solucin intracelular fue (mM): 130 CsCl, 1 MgCl2, 10 Hepes, 0,075 EGTA , 1 Mg - ATP (pH 7,2, ajustado con CsOH), y un sello formado en el mediados de DLE de la clula. En algunos experimentos se utilizan altas concentraciones de tampn de calcio mvil para sujetar [Ca2] i, en estos experimentos la solucin anterior contena 17 mM EGTA con CaCl2 ajustado para fijar [Ca2] i en cualquiera de 100 nM (7 mM CaCl2) o 10 nM (CaCl2 1 mM), segn se determina usando el programa WINCMAXC. La solucin

extracelular que se utiliz en la grabacin actual de membrana fue el mismo que el descrito anteriormente. 100 mM de NaCl fue sustituido por una cantidad equimolar de glutamato de sodio para examinar actual selectividad. Las corrientes se registran en la configuracin de clula entera, las clulas se fijaron a 60 mV y protocolos de voltaje impuestos por ING, un amplificador Axopatch 200 B y el software pCLAMP . El potencial de inversin de corriente se mide por una rampa (80 a 80 mV) protocolo de despolarizacin; corrientes no se corrigieron para fugas. Resultados Estiramiento induce chispas de Ca2 y ondas de Ca2 individuales Las clulas del msculo liso de la vejiga urinaria Para examinar el efecto de la longitud de la clula sobre la liberacin de Ca2 intracelular, se examin la fluorescencia de Fluo - 4 en los miocitos individuales por microscopa confocal durante y despus de los cambios en la longitud de la clula obtenidos moviendo una pipeta unida a un extremo de la clula a lo largo del eje largo de la clula. Como se muestra en la figura. 1 A, la elongacin de miocitos (de conejo) de la vejiga urinaria en un 20 % de la longitud en reposo tpicamente evocaba una serie de chispas de Ca2 observadas en una serie de tiempo (xy) de las imgenes obtenidas cada 40 ms. En 47 experimentos de este tipo (26 de conejo y 21 ratones, miocitos de vejiga), chispas u ondas de Ca2 fueron observadas en 35 (75%) clulas. Unitariamente las chispas de Ca2 fueron similares en amplitud y tiempo del curso a los informes anteriores (Tabla I) y chispas de Ca2 ocurridas repetidamente en la misma rea de la celda o zonas (Fig. 1 a), los llamados sitios de descarga frecuentes que han sido reportados para espontneas chispas de Ca2.

Figura 1. Estiramiento induce chispas de Ca2 en miocitos de la vejiga urinaria de conejo. (A) Arriba, secuencia de imgenes obtenidas durante una chispa de Ca2 espontnea (Superior) y despus del estiramiento inducido por chispas de Ca2 despus del estiramiento secuencial a 19.5 y 22% de la longitud de la clula. Tenga en cuenta que las chispas de Ca2 inician desde la misma zona de la clula y son de tiempo similar y amplitud. La posicin de la clula cambia despus de cada alargamiento. Las imgenes se obtuvieron en Intervalos de 57,3 ms (tamao de pxel 0.30 M). La barra de color en la derecha indica el pseudocolor, representacin de los valores mnimos y mximos de los pixeles. Las casillas de la primera imagen indican la zona en el que los valores de los pxeles fueron promedio de todas las imgenes del perfil de fluorescencia (por debajo). A continuacin, la fluorescencia perfil (f/f0) indica la generacin de mltiples chispas de Ca2 en la misma zona (Caja blanca), mientras que hay un aumento se detecta en otra regin de la clula (caja gris). Las imgenes de arriba

corresponden a las primeras hispas espontaneas de Ca2 despus de cada estiramiento. El perfil de fluorescencia se obtuvo dividiendo los pxeles en el rea que se muestra por la media fluorescencia celular bajo condiciones de reposo (sin chispas de Ca2). Delta L indica el grado de estiramiento [(L2 -Ls) / Ls], donde Ls es la longitud de holgura de la clula. (B) imagen Linescan obtenida antes y durante el estiramiento de un miocito; muestra dos chispas de Ca2 que surgen desde la misma ubicacin poco despus de que se estira la clula (flecha). La imagen fue obtenida en un intervalo de 1,33 ms / lnea (tamao de pxel 0.50 M). El perfil de fluorescencia a partir del Linescan se muestra a continuacin.

Aunque espontneas chispas de Ca2 son bastante poco frecuentes en los miocitos reposados de la vejiga urinaria, ocasionalmente como se muestra en la figura. 1 A, espontneas chispas de Ca2 y estiramientos inducidos por chispas de Ca2, pueden ser observados en la misma celda, lo que nos permite observar que se inicien a partir de la misma regin subcelular. Se observaron chispas de Ca2 que ocurran varias veces en clulas alargadas, mientras las clulas estaban en la nueva longitud (10 s), si bien un deterioro importante en la actividad se produjo durante este tiempo (ver ms abajo); siguiendo el retorno a la longitud de reposo, la frecuencia de la chispa de Ca2 volvi a lnea de base. El fenmeno de estiramiento inducido por chispas de Ca2, era bastante repetible. En algunas clulas de la prueba, el estiramiento celular evoca ondas de Ca2 que se propagan por toda la clula ; las ondas de Ca2 inducidas por el estiramiento se propagan a una velocidad similar a las previamente reportadas, ondas de Ca2 evocadas por CIcR. Como se observ anteriormente, el curso temporal de las chispas de Ca2 vari sustancialmente, basndose en el tamao del evento de liberacin subyacente, es decir, grandes eventos a nivel local se propagaron como ondas de Ca2 que tenan un deterioro de medio tiempo, considerablemente ms largos que los ms pequeos, los eventos no se propagan.

Chispas de Ca2, tambin se midieron en el modo de barrido lineal (xt), para determinar con mayor precisin la cintica de las chispas de Ca2 activadas por el estiramiento, y para evaluar el retardo promedio de tiempo entre el inicio del estiramiento y la liberacin de Ca2 (Fig. 1 B). Al igual que en las mediciones de series de tiempo, la elongacin celular dio lugar a una o ms chispas de Ca2. En estos experimentos, en los que las clulas fueron estiradas de manera individual por un breve movimiento del manipulador, el retraso entre el inicio del estiramiento mecnico y la primera chispa de Ca2 fue de 2.15 +/- 0.48 s (n=11). Los parmetros de media de las chispas de Ca2 observadas en las mediciones Linescan se enumeran en la Tabla I. Tambin se examin el patrn de liberacin de Ca2 durante la elongacin celular. Los aumentos de paso de longitud celular fueron impuestas para determinar si la liberacin de Ca2 se mantiene o se acomoda, y si la liberacin de Ca2 podra ser obtenida repetidamente con los cambios posteriormente impuestos en la longitud de la clula. Figura. 2 muestra los perfiles de fluorescencia de varios experimentos de este tipo en el que el grado y la duracin de los cambios de longitud variaron. Estos experimentos demostraron que la liberacin de Ca2 no se mantuvo en el tiempo, pero que se acomoda gradualmente durante el estiramiento sostenido de clulas (A y B). Este proceso no se tradujo en una prdida de Ca2 del SR o en una inactivacin completa del proceso de la liberacin subyacente, sin embargo, desde los aumentos posteriores de la longitud celular, siempre resultaron en la liberacin adicional de Ca2. Dos posibilidades podran explicar este patrn. En primer lugar, el parmetro mecnico detectado puede ser el cambio en la longitud de la clula, en lugar de la tensin absoluta, lo que resulta en gating de liberacin, slo durante la fase inicial de un cambio de paso en la longitud. El considerable retraso en algunos eventos de liberacin en relacin con el cambio de longitud, sin embargo, parece argumentar en contra de ese mecanismo. Por otra parte, el aumento de la liberacin de Ca2 con aumentos adicionales en la longitud de la clulas observadas en algunos experimentos (por ejemplo, B y C) sugieren que la cantidad de liberacin de Ca2 est relacionada con la tensin de la pared. Una explicacin alternativa para la desensibilizacin observada prominente es que la probabilidad gating de Ca2 en cuanto a su liberacin es una funcin de la longitud de la clula y no es un proceso de inactivacin inherente para los canales cerrados, de tal manera que una fraccin de los canales disponibles son cerrados por el tramo inicial (que inactivan) y otros por el consiguiente aumento de la longitud de la clula, lo que resulta en un acomodamiento de la liberacin de Ca2 en cualquier longitud dada.

Figura 2. Patrn de liberacin de Ca2 durante repetidos y sostenidos estiramientos celulares. A-C muestra perfiles fluorescentes de xy confocal de imgenes tomadas a intervalos de 37,5 ms; miocitos de ratones fueron progresivamente extendidos desde la longitud flcida como se muestra. (A) Un tramo inicial provoca una rfaga de chispas de Ca2 individuales de la misma rea de una clula; las chispas no se mantienen, a pesar de que se mantuvo el estiramiento. Adems el alargamiento de la clula provoca una chispa adicional, lo que indica que la desensibilizacin del proceso no refleja una prdida del Ca2 SR. (B) Los resultados del estiramiento inicial de una chispa de Ca2 individual. Un estiramiento adicional no activ una chispa, pero la remota elongacin causa mltiples chispas de Ca2 que disminuyen su amplitud en el mismo lugar. (C) Una extensin grande sostenida causa una onda de Ca2 que se propaga a travs de la clula, causando un aumento sostenido del perfil local de Ca2.

Las chispas de Ca2 inducidas por estiramiento son independientes de la entrada de Ca2 Nuestros experimentos anteriores indican que los canales de tipo L de Ca2 estn dbilmente acoplados a RyRs a travs de un aumento global de la [Ca2], resultando en una forma modificada de CIcR en el msculo liso. Supusimos que aumentos pasivos de la longitud de la clula causan un aumento de la [Ca2] i y CICR. As, a pesar del hecho que las medidas de [Ca2] i global no indicaron una subida de [Ca2] i, pensamos que es probable que los pequeos aumentos del [Ca2] i estn asociados con la apertura de los canales de Ca2

activados por estiramiento, podran no ser detectados en los experimentos de Ca2 de la imagen. Hemos diseado varios experimentos para probar esta hiptesis (Fig. 3). En primer lugar, se examinaron las clulas en solucin extracelular libre de Ca2 para determinar la dependencia del proceso de flujo de Ca2 extracelular. Las chispas de Ca2 han sido provocadas por el estiramiento celular, incluso en ausencia de Ca2 extracelular en 16 clulas (11 conejo, 5 ratn), lo que indica que el estmulo para la liberacin, probablemente no era por flujo de Ca2 a travs de canales de cationes activados por estiramiento. Por otra parte, se obtuvieron resultados similares con el Ca2 libre en el bao extracelular sujeto a 100 nM usando EGTA en siete experimentos (cuatro conejos, tres ratones), como se muestra en la figura. 3 A. En segundo lugar, los experimentos se realizaron en presencia de Gd3, que se ha demostrado que puede bloquear estos canales. Chispas de Ca2 fueron activadas por el estiramiento celular en la presencia de Gd3 y no se observ ninguna diferencia en la probabilidad de liberacin de Ca2 activado por estiramiento (ver fig. 5A). SiCr se observ en cinco de los ocho experimentos (3/5 ratn y 2/3 de conejo). En tercer lugar, se realizaron experimentos de voltaje-clamp e imgenes simultneas para determinar si las corrientes no selectivas fueron activadas por el estiramiento celular. No hay corrientes inicas precedidas por chispas u ondas de Ca2 activadas por estiramiento, aunque calcio inducido por corrientes de cloruro fue observado durante estos eventos (Fig. 3 B, ver ms abajo). No se observ ninguna de las corrientes catinicas inducidas por el estiramiento en los experimentos con miocitos de conejo o ratn, lo que puede indicar una diferencia con respecto a los informes anteriores de estas corrientes de las especies en el msculo liso de la vejiga. Finalmente, una serie de experimentos fueron realizados bajo condiciones tamponantes de Ca2 intracelular que interrumpen a CICR. Nosotros razonamos que un aumento de [Ca2] i puede ocurrir por uno de varios mecanismos, cuando se estiran las clulas, lo que resulta en una forma modificada del CICR . Sin embargo, la prevencin de tal aumento en el [Ca2] i por dilisis con solucin de alta capacidad de amortiguacin (17 mM EGTA, [Ca2] i sujeto en 100 nM) no inhibe la liberacin Ca2 inducido por estiramiento (Fig. 3 B). En estos experimentos, el estiramiento se inici 30 s despus de la rotura del parche de membrana para evitar agotamiento de SR donde se almacena Ca2; dilisis con EGTA evit un aumento global [Ca2] i, pero el exceso de tampn de Ca2 no almacen completamente los incrementos locales de Ca2 cerca de los sitios de liberacin, permitiendo la deteccin mediante el indicador de Ca2. Aunque el [Ca2] i no es completamente sujetado en estas condiciones (brevemente, se observaron aumentos espacialmente restringidos), este experimento imita a los cuales interrumpen el acoplamiento entre una perturbacin entre Ica y la liberacin de Ca2, indicando adems que la liberacin Ca2 activado por estiramiento es independiente al flujo de Ca2 extracelular, no requiriendo un aumento global de [Ca2] i. En experimentos adicionales (datos no publicados), observamos clulas SiCr dializadas con solucin 17 mM de EGTA interno y [Ca2] i sujetado a 5 nM. Estos ltimos experimentos sugieren que SiCr no es probable que se produzca a travs de un aumento en la sensibilidad del sistema de CIcR de Ca2, desde tamponante [Ca2] i a muy bajos valores que no inhibieron la liberacin de Ca2.

Figura 3. La liberacin de Ca2 inducido por estiramiento, no requiere ingreso de Ca2, o un aumento de la [Ca2] i. (A) Perfil de fluorescencia de una serie confocal de imgenes de un miocito de ratn, indica los resultados del estiramiento en olas de Ca2 en una celda de perfusin con una solucin extracelular libre de Ca2. (B) Chispas/olas de Ca2 inducidas por estiramiento provocan corrientes hacia el interior en la presencia de 50 M GdCl3 en un miocito de ratn, que bloquea los canales de cationes no selectivos activados por estiramiento. La celda fue estirada poco antes de la activacin de las corrientes hacia el interior, que son calcio activado por corrientes de cloruro de calcio activados e indicar Ca2 la liberacin de Ca2 (ver fig. 5). (C) Perfil de fluorescencia obtenido a partir de una clula de ratn dializada con una solucin de 17 mM EGTA interna ([Ca2] i sujeta por100 nM). Repeticiones de liberacin de Ca2 se observaron tras estiramientos de clulas en presencia de 17 mM de Ca2 mvil tampn. Resultados equivalentes fueron obtenidos con [Ca2] i fijado a 5 nM.

La liberacin de Ca2 inducida por estiramiento est asociada con el Gating RYR La liberacin de Ca2 del SR en el msculo liso est mediada por dos canales de calcio intracelulares: inositol trifosfato receptor (InsP3R) y los canales RYR. Ambos canales tetramricos son sensibles al Ca2 y pueden soportar locales (chispas y soplos de Ca2) y transmisiones espaciales (olas de Ca2) de sealizacin. Para determinar si SiCr est asociado con el gating de InsP3R o RYR, utilizamos inhibidores de cada receptor y determinamos si SiCr estaba presente. Figura 4 B muestra un ejemplo de un total de 15 experimentos (nueve de conejo, seis de ratn) que demuestran que tras la incubacin de los miocitos con 10M rianodina durante 30 min, el estiramiento de clulas no induce chispas de Ca2, aunque la exposicin de las clulas a Mach resultan en liberacin de Ca2. Por el contrario, SiCr no fue inhibido por la incubacin de clulas con 2 -APB (20 o 100 M durante 1 h), y un receptor - InsP3 antagonista selectivo (Fig. 4 C). Resultados equivalentes se obtuvieron en miocitos de 11 conejos y 4ratones, mientras que 2 -APB inhibi completamente la liberacin de Ca2 muscarnico (Fig. 4 C). Estos datos, as como la amplitud y la cintica de chispas de Ca2 inducidas por estiramiento (Tabla I), indican que el estiramiento de miocitos resulta en un gating de RYR y en la produccin de chispas de Ca2 similares a eventos espontneos o activados por SICR.

Figura 4. Liberacin de Ca2 inducida por estiramiento ocurre a travs de Gating RYR. (A) Experimento control demostrando una ola de Ca2 activada por estiramiento, despus de un estiramiento celular. Imgenes muestran el antes, durante, y despus, el segundo estiramiento de un miocito de vejiga de ratn. El perfil de fluorescencia de la regin de la iniciacin de la ola de Ca2 se muestra para todo el experimento a continuacin. Tamao del pxel 0.95 M. (B) En un experimento similar en clulas de ratn incubadas con 2-APB (100 M) para inhibir InsP3R, demuestra SiCr en forma de chispas de Ca2, a pesar del bloqueo completo de liberacin de Ca2 por metacolina (Mach, 50 M), lo que indica un bloqueo suficiente de InsP3R. (C) Incubacin con rianodina (10M) suprimi SiCr en miocitos de conejo y este efecto no se debi al agotamiento SR, ya que la metacolina fue capaz de liberar Ca2.

SiCr Activa STIC y corrientes de cloruro activadas por calcio microscpico Chispas de Ca2 se acoplan para la activacin del sarcolema, corrientes de cloruro y potasio activadas por Ca2, y olas de Ca2 generan corrientes macroscpicas asociadas. A continuacin se examin las corrientes de cloruro activadas por calcio en experimentos, utilizando registros simultneos de las corrientes de membrana y fluorescencia confocal en estiramiento, y voltaje-clamp de miocitos. En estos experimentos, una pipeta parche se inclin llenando con fluo-4 y sellando al extremo de la clula para su uso como la pipeta y un segundo tramo, de grabacin, la pipeta se sell cerca del centro de la celda y se utiliz en el modo de clulas enteras. El estiramiento celular consiste en evocar corrientes hacia el interior con un curso de tiempo equivalente a la liberacin de Ca2 observada; variacin de las corrientes fue muy corta, corrientes transitorias similares a las corrientes hacia el interior espontneo (STIC), a las corrientes ms duraderas con un transcurso de tiempo equivalente a las olas de Ca2 subyacentes. STICs activados por estiramiento fueron observados en 6 de 11 clulas de ratn y 6 de cada 10 clulas de conejo. Figura 5 A muestra la magnitud de fluorescencia en el rea de una celda en la que una chispa de se registr, y la corriente transitoria registrada simultneamente, lo que demuestra la superposicin de estos eventos. Por otra parte, como se muestra en la figura 5, un estiramiento activado por corrientes de cloruro eran equivalentes en la presencia de 50 microM Gd3+, que bloquea estas corrientes de los miocitos de la vejiga urinaria de los conejillos de indias. Se observaron STIC en cuatro de los ocho experimentos (3/5 conejo y 1/3 clulas de ratn). Por otra parte, en este experimento Gd3+ estuvo presente para bloquear la activacin de las corrientes inducidas por el estiramiento. En algunos experimentos, se observaron STIC antes y despus de los eventos de estiramiento, y la frecuencia de los STIC equivalentes aument notablemente durante el estiramiento celular. Como se muestra en la Figura 5 B, la amplitud y la cintica de las corrientes provocadas por el aumento de longitud de la clula fueron equivalentes a eventos espontneos observaron antes de estiramiento celular. Rampas de tensin y protocolos de paso empleados durante la activacin de la corriente indican que el potencial de inversin en solucin salina fisiolgica fue de 0 mV (n=7). El reemplazo parcial de cloruro con iones de glutamato (100 mM de NaGlutamate sustituido por NaCl) desplaz la inversin del potencial de 18 +/- 3,2 mV (n =7; Fig. 5 C), cerca del potencial terico de reversin del cloruro de 24 mV, lo que indica que las corrientes eran

anin selectiva. Usando aumentos de longitud de la clula a un 20%, no observamos las corrientes de cationes activadas por estiramiento en clulas enteras de miocitos de vejiga de conejo o ratn y el potencial de inversin de la corriente de cloruro activada por estiramiento no se alter por la inclusin de Gd3?+ en la solucin externa. Chispas y olas de Ca2 inducidas por estiramiento en el tejido muscular liso intacto Si SiCr es un componente fisiolgico de la regulacin de Ca2 en el msculo liso, debe observarse el fenmeno en preparaciones multicelulares. Tal demostracin tambin descarta la posibilidad de que SiCr es un epifenmeno asociado con miocitos individuales y posibles daos asociados con la disociacin enzimtica. Por lo tanto, nuestro estudio SiCr en orina de ratn intacta a partir de segmentos de la vejiga suspendidos entre en forma de Tclips de aluminio en un micromanipulador. La carga de Fluo-4 fue facilitada por la breve (5 minutos) incubacin del tejido con colagenasa (ver materiales y mtodos). Un ejemplo de un experimento tpico en el que un segmento del msculo se extenda de la longitud de reposo se muestra en. Figura 6. Confocal de imgenes en serie de alta velocidad revelan chispas y olas de Ca2 en la mayora de las clulas en los segmentos musculares despus del estiramiento pasivo del tejido. Olas de Ca2 eran observadas para propagar intracelularmente, pero no intercelularmente en estos experimentos.

Figura 5. Liberacin de Ca2 inducida por estiramiento activa STICs y corrientes de cloruro activadas por Ca2 microscpico. (A) Combinacin de Confocal con grabacin patch-clamp de un miocito de conejo, muestra que SiCr activa corrientes hacia el interior de manera temporal y cuantitativamente vinculadas a la liberacin de Ca2. El experimento fue realizado en presencia de Gd3+ (50 microM), que bloquea corrientes de cationes activadas por estiramiento. Los nmeros anteriores de cada imagen indican el tiempo de adquisicin relativo, comenzando justo antes del estiramiento al 21 %. Las imgenes fueron obtenidas cada 44 ms. Tamao del pixel=1microM. (B) Corrientes transitorias hacia adentro asociadas a los canales de gating de cloruro activados por calcio. Las corrientes a la izquierda se produjeron de forma espontnea, mientras que las corrientes de la derecha fueron evocadas siguiendo el tramo celular. Notar que la amplitud y la cintica son ms o menos similares. (C) La curva I- V obtenida a partir de una rampa de -80 a 80 mV a partir de un potencial sostenido de 60 mV durante el estiramiento. Corrientes de fuga desde la rampa obtenida antes del estiramiento se han restado. En solucin salina fisiolgica (izquierda), el estiramiento induce una corriente lineal con un potencial de inversin de 0, el potencial de equilibrio de Cl. Reemplazando parcialmente el cloruro con el anin menos permeante de glutamato, desplaz el potencial de reversin a 18 mV, cerca del potencial de inversin terico del cloro de 24 mV (a la derecha).

Figura 6. Olas de Ca2 inducidas por estiramiento en el tejido muscular liso intacto de la vejiga urinaria de ratn. Por encima, las imgenes de una serie de tiempo confocal obtenidas a intervalos de 57.3 ms. reas de clulas en cajas individuales identificaron las regiones para los perfiles fluorescentes que se muestran a continuacin. Un artefacto de movimiento identifica el punto de estiramiento del tejido en los perfiles fluorescentes. Note la ola de calcio evocado en las clulas individuales cuando se estira el tejido. La serie de tiempo completo indic que las olas evocadas de Ca dentro de las clulas individuales no se transmiten a las clulas vecinas. Tamao del pxel = 2.35 microM. Discusin La liberacin del Ca2+ libre del retculo sarcoplsmico es un evento fundamental en la contraccin del musculo liso, y una serie de mecanismos bioqumicos han evolucionado para ligar el Ca2+ intracelular a canales de liberacin mediante seales extracelulares transducidas en el sarcolema. A diferencia de los msculos sarcomricos, los que responden a un relativamente limitado conjunto de entradas, el musculo liso subtiende diversas funciones y, naturalmente, el tejido presenta un complejo de matriz correspondiente a los procesos de movilizacin del Ca2+. Por lo tanto, un sistema de receptor InSP3 altamente desarrollado media una lenta y sostenida liberacin del Ca2+ despus de la unin de hormonas autocoides a receptores cognados. Los canales inicos del sarcolema permeables al Ca2+, que son a la vez de voltage y ligando, permiten el flujo directo de Ca2+ al citosol, y RyRs, que desempea un papel dominante en el acoplamiento excitacin-contraccin del musculo sarcomricos, son activados espontneamente en muchos msculos lisos y son activados tras la apertura de canales de Ca2+ tipo L durante el potencial de accin. Aqu hemos ampliado el conjunto de seales conocidas por desencadenar la inclusin de Ca2+ en un tramo del sarcolema, dando lugar a SiCr. Hemos demostrado que estos estmulos mecnicos resultan en la apertura de RyR en una manera que es independiente de la apertura de los canales activados por estiramiento o aumento en la concentracin de Ca2+; que el proceso resulta en la liberacin de chispas unitarias de Ca2+ en regiones predecibles dentro de una clula, conocidas como sitios frecuentes de descargas, o conduce a la liberacin de una ola de Ca2+ que se transmite a travs del citosol y est acoplado a la activacin de los canales inicos activados por el calcio de la membrana; hay una desensibilizacin intrnseca al proceso, resultando en una prominente acomodacin a cambios de la longitud de la clula; y el proceso ocurre en el msculo liso en stiu (fig, 6). Estas demostraciones deberan ser vistas en el contexto de las demostraciones recientes de aumentos en la concentracin de Ca2+ inducida mecnicamente en clulas. Usando partculas de magnetita cubiertas con colgeno, demostraron un aumento en la concentracin de Ca2+ en los astrocitos, clulas endoteliales y clulas gla en cultivos de tejidos. En varios, pero no en todos los experimentos, esta liberacin de Ca2+ se produjo en ausencia de Ca2+ extracelular, similar a nuestros hallazgos. Interesantemente, la liberacin de Ca2+ fue inhibida en algunas clulas por xestospongin, sugiriendo la activacin de un

canal InSP3 mediado por la liberacin de Ca2+. La liberacin de calcio dependiente del estiramiento tambin ha sido recientemente demostrada en el msculo cardiaco. En este estudio se observ el aumento de frecuencia de chispas de Ca2+ espontneas en miocitos ventriculares luego de la elongacin mecnica. As como en el msculo liso, el aumento cardiaco de chispas Ca2+ no fue asociado al flujo de iones activado por estiramiento, pero fue demostrada su implicacin en la generacin de xido ntrico. Juntos, estos estudios suponen que la liberacin de Ca2+ inducida por mltiples estiramientos, puede tener ms vas y dan soporte a la demostracin de un mecanismo SiCr que es independiente de un aumento en la concentracin del Ca2+. Un problema importante sin resolver en el msculo liso es la naturaleza del proceso o procesos que regulan la llamada liberacin espontnea del Ca2+. nuestros estudios sugieren que un elemento en esta regulacin podra ser el grado de estiramiento de la membrana del miocito: pequeos aumentos en la longitud de miocito dentro de los msculos podra resultar en una transitoria liberacin de Ca2+. Aunque la liberacin de Ca2+ parece desencibilizar a travs del tiempo, en cualquier nivel dado a lo largo de la clula, el paso adicional de cambios en la longitud resulta en mayor liberacin de Ca2+. Esto podra resultar en el acoplamiento entre dos miocitos dentro de un tejido contrado: se esperara que el enlace mecnico entre miocitos dentro de un msculo resultara en la contraccin de una regin del msculo, causando un aumento en la longitud de clulas vecinas, con un aumento en la liberacin de Ca2+. Dependiendo en la expresin de canales de cloro activados por potasio y calcio, y el potencial de membrana celular, el resultado podra ser estmulos hiperpolarizante o despolarizantes. Similarmente, se esperara que aumentos o decrecimientos en la longitud celular, asociados con la presin luminal en vasos y rganos huecos afectan la liberacin de Ca2+ y resultan en cambios coordinados en la actividad elctrica. Datos recientes, en los cuales la presin vascular y la concentracin de Ca2+ que han sido registrados simultneamente son en general consistentes con la liberacin de concentraciones de Ca2+ durante aumentos en la presin transmural. En ese estudio, elevaciones de la presin vascular aumentaron la frecuencia de la liberacin de chispas de Ca2+ y olas de Ca2+. Aunque estos efectos fueron suprimidos por diltiazem e interpretados como resultado de la apertura de canales de Ca2+ inducida por presin, los datos tambin son consistentes con la apertura de RYR inducida por presin, lo que resulta en la depolarizacin de conductos sensibles al calcio y activacin de canales tipo L. Este mecanismo en el cual los canales RYR son abiertos por estiramiento aun no esta claro. A pesar de informes anteriores de las corrientes catinicas inducidas por el estiramiento en los miocitos de las vejigas urinarias de cobayas, no hemos podido observar estas corrientes de cationes en miocitos de ratones o conejos, y la liberacin de Ca2+ ocurri bajo condiciones en las cuales dichas corrientes no hubieran sido activadas( soluciones externas de Ca2+ o Gd3+). An ms, nuestros datos indican que un aumento en la concentracin de Ca2+ no es requerida en este proceso, as aumentando la posibilidad de que SiCr ocurriera

por un mecanismo algo separado del CICR y tal vez anlogo a la apertura alostrica de RYR tipo 1 en el msculo esqueltico. Esto podra contemplarse como una interaccin entre los elementos estructurales dentro del sarcoplasma y RYR. De todas maneras, una atractiva alternativa de hiptesis es que un aumento en la longitud celular resulta en una disposicin del RYR ms favorable, de tal manera que la liberacin de Ca2+ estosttico del retculo sarcoplsmico resulte en la activacin de RYR suficiente para generar chispas de Ca2+ resolubles, mientras que la ausencia de uniones estrechas entre RYR, tales eventos estostticos se mantienen por debajo del umbral de resolucin. Sera difcill descartar estas hiptesis experimentalmente, no se esperara la adicin de tampn mvil para interrumpir dicho acoplamiento local.HAy evidencia experimental, tanto para la apertura de uniones de RYR, como tal proceso en el msculo estriado, y de la importancia de la influencia del orden espacial de los elementos individuales dentro de las "unidades de liberacin de calcio" en la longitud del msculo en el retculo sarcoplsmico. Es difcil imaginarse que este modelo podra explicar adecuadamente los datos en la figura 2, de todas maneras, donde ocurre SiCr con una elongacin adicional, despus de la desencibilizacin del SiCr luego de un estiramiento previo. Ms bien , mientras los dos mecanismos previos no necesiten ser mutuamente exclusivos (Aumentos en la longitud celular que podran resultar en la apertura de RYR, los cuales podrian ser mas eficientes a longitudes sobre de la longitud de holgura), pareciera ser que el mecanismo ms probable que subyace al SiCr es a travs de un efecto sobre la apertura de RYR. Adems, parece que se requiere ya sea un proceso intrnseco de inactivacin del canal, o una adaptacin al estmulo mecnico, para explicar la desensibilizacin prominente que se produce a una longitud dada. En suma, hemos identificado un proceso de SiCr desde RYR. En clulas de la musculatura lisa, SiCr aparece para liberar Ca2+ reiteradamente desde los mismos sitios, y estos parecen ser idnticos a esos que producen chispas de Ca2+ espontneas. Los procesos no requieren la apertura de un canal inico en el sarcolema, ni un aumento en la concentracin de Ca2+ detectable. Ser interesante determinar la medida en que este proceso ocurre en otras clulas y tejidos, y el sistema de acoplamiento entre el estiramiento del sarcolema y la apertura de RYR.