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MINISTERIO DE DESARROLLO AGROPECUARIO






DIRECCIN NACIONAL DE SANIDAD VEGETAL

DEPARTAMENTO DE DIAGNOSTICO FITOSANITARIO





LABORATORIO DE VIROLOGIA






INFORME DE EVALUACIN DE LA SEMILLA DE PIA
DORADA PARA SU CERTIFICACIN




PREPARADO
POR

AMED A ARCIA T.



2005


INFORME DE EVALUACIN DE LA SEMILLA DE PIA DORADA
PARA SU CERTIFICACIN


ANTEDENTES

La semilla de pia Dorada fue importada a Panam, por la empresa Ganadera Castillo
Propiedad del Sr. Cstulo Castillo en febrero del ao 2000, y posteriormente en el 2004 una
empresa desconocida, esta informacin fue recogida de la Seccin de Requisito Fitosanitario
del Departamento de Vigilancia Fitosanitaria, esta semilla fue sembrada en la comunidad de
la Arenosa en la Chorrera.

Esta primera semilla importada por la empresa Ganadera Castillo, entro al pas con los
requisitos fitosanitarios exigidos por la Direccin Nacional de Sanidad Vegetal.

El principal problema fitopatolgico de la pia es la marchitez asociada a la cochinilla
harinosa (Dysmicoccus brevipes), que tiene distribucin mundial. Los sntomas tpicos
incluyen enrojecimiento de las hojas, marchitez, muerte descendente de las hojas a partir del
pice y desarrollo de pocas races.

Investigadores de Australia y Hawai, lograron identificar y purificar dos agentes virales de la
pia: un closterovirus (PMWaV), encontrado tanto en cochinillas harinosas, como en plantas
de pia, y un badnavirus, detectado en plantas de pia (Hu et al., 1997; Thomson et al.,
1996 y Wakman et al., 1995).

En el rea piera de La Chorrera - Panam, se detect el virus baciliforme de la pia (PBV),
perteneciente a los Badnavirus, en extractos de plantas con sntomas de marchitez y tambin
en cochinillas harinosas, con un porcentaje de 94.2 % y 63% respectivamente (Arcia y
colaboradores, 2001; Arcia, 2001, resultados en fase de publicacin). Adems estudios
realizados en colaboracin con OIRSA-VIFINEX, se pudo detectar la presencia de los
Closterovirus (PMWaV-1 y PMWaV-2).

Los sntomas de la marchitez se han asociado a la infestacin de cochinilla en presencia de
PMWaV-2. Cuando el badnavirus (PBV) y el otro Closterovirus (PMWaV-1) estn presentes
no se observan sntomas (Sether y Hu, 2000).

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A pesar de que PMWaV-1 no produce sntomas, la infeccin con este virus produce una
reduccin del rendimiento de 15% en la cosecha proveniente de la semilla de primer hijo
(Sether y Hu, 2001).

En Brasil se encontr que el insecto produce una reduccin significativa en la altura de la
planta y del peso fresco de la raz y del follaje. Sin embargo, no se encontraron diferencias
significativas en el peso de los frutos evaluados en funcin del aumento de la densidad de
poblacin de las cochinillas (Ferreira et al. 2001).

PROCEDIMIENTO

Protocolo del muestreo de la semilla de pia dorada (MD2) en campo
Se realizaron los muestreos a 10 productores de semilla de pia dorada (MD2) debidamente
registrados con expedientes en la agencia del MIDA y la Coordinacin de Sanidad Vegetal
Regional.

En cada parcela se realizo la Geo-referenciacin de las Parcelas de semilla de pia de cada
productor con el equipo GPS (ver Mapa).

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En presencia del responsable del semillero, se toma una hoja central mas o menos la 4
ta
de
la corona, se rotula con el nombre del productor, #de bloque y se introduce en bolsas
plsticas individuales, las hojas se mantienen en fro introducindolas en una termo con hielo.
Las muestras una ves en el laboratorio se preservaron a -85 C hasta la extraccin de ARN.
El muestreo alcanzo a 10 productores de semilla. ( Ver Cuadro)


Cuadro del muestreo por Productor

Productor rea Has Altura
(m.s.n.m)
Extracciones por
productores
Brunis Tropical La Arenosa 6 61 2
Castulo Castillo La Arenosa 5 59 4
Gatn Continente La Arenosa 8.7 56 4
Anana Corporacin La Arenosa 6 41 2
Gino Spadafora La Arenosa 4 58 4
Ubaldo Chapman Ro Congo 5 91 5
Ral Holner Zanguenga 5 91 4
Carlos Herrera Zanguenga 2 109 2
Golden West Zanguenga 10 108 4
J acinto Daz Zanguenga 10 114 4



Extraccin de ARN.
Para la extraccin de Closterovirus se utiliz el protocolo recomendado para el producto
RNApure (GenHunter). En total se extrajeron 35 aislados de ARN + 2 ARNs
correspondientes a la muestras N 114 del productor Cstulo Castillo.

Pruebas moleculares.
Para las pruebas de Closterovirus se utilizaron controles positivo y de agua (una planta que
presenta sntomas de marchitez roja de la pia (PMWaV), como control positivo), esta ltima
como control de contaminacin. Se utilizaron 6l de ARN total y se sometieron a la tcnica
de RT PCR, con iniciadores especficos para cada cepa del virus (Sether, et al 2001).


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Anlisis del producto de RT-PCR.
Una vez terminado el proceso de RT-PCR, los productos de la amplificacin fueron corridos
en una electroforesis en un gel de agarosa al 1%. La talla de los productos esperados eran
de 589 y 609 pares de bases (pb) para el PMWaV-1 y PMWaV-2 respectivamente.

RESULTADOS

Durante el muestreo no se observ sntomas notables de la enfermedad en los campos,
adems de la ausencia de cochinilla harinosa (Dysmicocus sp).

Resultados de la presencia de Closterovirus (PMWaV-1, PMWaV-2)
en los campos de semilla (MD2)

Productor N de aislados PMWaV-1 PMWaV-2 % de infeccin de
virus
Brunis Tropical 2 0 0 0
Castulo Castillo 4 3 0 75
Gatn Continente 4 0 0 0
Anana Corporacin 2 0 0 0
Gino Spadafora 4 1 0 25
Ubaldo Chapman 5 5 0 100
Ral Holner 4 0 0 0
Carlos Herrera 2 0 0 0
Golden West 4 0 0 0
J acinto Daz 4 1 0 25
Muestra N 114 2 1 0 50

De las 10 parcelas visitadas (20 y 24/02/05), 4 parcelas resultaron positivas a la presencia
del Closterovirus PMWaV-1, con un porcentaje de infeccin que varia de 25 al 100 %. No se
detecto la presencia del Closterovirus PMWaV-2. Adems podemos agregar que los 2
aislados de la muestra (N 114), perteneciente al seor

Cstulo Castillo ingresaron al Laboratorio (14/02/05) previo al muestreo de las 10 parcelas, y
mostr un porcentaje de 50% de infeccin al Closterovirus PMWaV-1.
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Electrofresis de los productos de RT-PCR para la deteccin de Closterovirus















3000

2000
1500

1000

500
M =Marcadores de peso molecular; 1 8 , 14 = Muestras Negativas; 9 13, 15 =Muestras Positivas
16 =Control con Agua.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M


























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RECOMENDACIONES.

Debern ser utilizadas parcelas vrgenes para el establecimiento de semilleros de Pia, a su
vez con un adecuado manejo de las cochinillas harinosa (Dysmicocus sp).

Ampliar el estudio en general, con la deteccin de Badnavirus, ya que en estudios anteriores
de las zona Piera se ha detectado un alto porcentaje de presencia de este virus, adems del
seguimiento evaluativo, en un nivel mas detallado a las parcelas vecinas (origen y destino de
los materiales producidos) destinadas a la produccin de semilla.

En la evaluacin de las parcelas productoras de pia, se detecto nicamente la presencia del
closterovirus (PMWaV-1), el cual provoca la reduccin de un 15% en la cosecha proveniente
de las semillas del primer hijo, motivo por el cual es de especial inters, el manejo adecuado
de dicho agente viral.

En los resultados obtenidos son de especial atencin los de la Parcela del Productor
Chapman, por su alto ndice de infestacin, adems de su ubicacin alejada de los otros
campos productores de semilla, lo que nos indica que se debe de tener un mayor control
(Cuarentenario y de Vigilancia Fitosanitaria) para la movilizacin de material de siembra y la
certificacin de los campos de produccin, por parte del Comit Nacional de Semilla (CNS)
en colaboracin con el Laboratorio de Diagnstico Fitosanitario.

Deber llevarse a cabo un programa de capacitacin y divulgacin para concienciar al resto
de las autoridades y a los productores sobre la presencia de la cepa de Closterovirus
(PMWaV-1) en los campos productores de semilla y llevar a cabo una adecuacin de la
norma de produccin de semillas de pia en el pas, ya que en el documento (Norma
especifica de certificacin para la produccin, procesamiento y comercializacin de semilla
de rubros no tradicionales de exportacin, Papa y Granos Bsicos MIDA Divisa), no se
contemplan tcnicas diagnsticas adecuadas e ndices y tolerancias para la certificacin y
manejo de plantaciones de semilla de Pia.



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BIBLIOGRAFA


ARCIA A. 2001. Identificacin de Virus Relacionados a la Marchitez de la Pia en el Distrito
de La Chorrera. Tesis de Grado. Universidad de Panam . Facultad de Ciencias
Agropecuarias. David- Chiriqui. Panam. P. 47.

ARCIA, A. A.; RAMOS, C. W.; FERNANDEZ, O. 2001. Deteccin del virus baciliforme de la
pia (PBV) mediante PCR en La Chorrera, Panam. En: PCCMCA (Programa
Cooperativo Centroamericano para el Mejoramiento de Cultivos y Animales). 2001.
Resmenes de la XLVII Reunin Anual del PCCMCA. Direccin de Investigaciones
Agropecuarias, Ministerio de Agricultura y Ganadera. San J os, Costa Rica. P.33.

FERREIRA, K G; MORAES J . C. SANTACECILIA, L. V. C.; BENETTI FILHO, R. Z.;
CARNEVALE,A.B. 2001. Determinacao de Injusrias e danos da Cochonilha
Pulverulenta Dysmicoccus brevipes. Ciencia Agrotec. 25:525 532.

HU, J .S.; SETHER, D.M.; WANG, M.; LEE, F.; ULLMAN, D.E. 1997. Use of a tissue blotting
inmuno assay to examine the distribution of pineapple closterovirus in Hawaii. Plant
Disease 81: 1150-1154.

SETHER, D. M.; HU J . S. 2000. A Closterovirus and Mealybug Exposure are Both Necessary
Components for Mealybug Wilt of Pineapple Symptom Induction. Phytopathology 90:
S71

SETHER, D. M.; HU J . S. 2001. The Impact of Pineapple Mealybug Wilt-Associated Virus 1
and Reduced Irrigation on Pineapple Yield. Australasian Plant Pathology 30:31 36

SETHER, D. M.; KARASEV A.; OKUMURA C.; ZEE E.; KISLAN M. M; BUSTO J . L and HU J .
S. 2001. Differentiation, Distribution, and Elimination of Two Different Pineapple
Mealybug wilt-associated Viruses Found in Pineapple. Plant Disease 85: 856 864

THOMSON, K.G.; DIETZGEN, R.G.; THOMAS, J .E.; TEAKLE, D.S. 1996. Detection of
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Biology 129:57-69.

WAKMAN, W.; TEAKLE, D.S.; THOMAS, J .E.; DIETZGEN, R.G. 1995. Presence of a
clostero-like virus and bacilliform virus in pineapple plants in Australia. Australian
J ournal of Agricultural Research 46: 947-958.

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