INFORME DE EVALUACIN DE LA SEMILLA DE PIA DORADA PARA SU CERTIFICACIN
PREPARADO POR
AMED A ARCIA T.
2005
INFORME DE EVALUACIN DE LA SEMILLA DE PIA DORADA PARA SU CERTIFICACIN
ANTEDENTES
La semilla de pia Dorada fue importada a Panam, por la empresa Ganadera Castillo Propiedad del Sr. Cstulo Castillo en febrero del ao 2000, y posteriormente en el 2004 una empresa desconocida, esta informacin fue recogida de la Seccin de Requisito Fitosanitario del Departamento de Vigilancia Fitosanitaria, esta semilla fue sembrada en la comunidad de la Arenosa en la Chorrera.
Esta primera semilla importada por la empresa Ganadera Castillo, entro al pas con los requisitos fitosanitarios exigidos por la Direccin Nacional de Sanidad Vegetal.
El principal problema fitopatolgico de la pia es la marchitez asociada a la cochinilla harinosa (Dysmicoccus brevipes), que tiene distribucin mundial. Los sntomas tpicos incluyen enrojecimiento de las hojas, marchitez, muerte descendente de las hojas a partir del pice y desarrollo de pocas races.
Investigadores de Australia y Hawai, lograron identificar y purificar dos agentes virales de la pia: un closterovirus (PMWaV), encontrado tanto en cochinillas harinosas, como en plantas de pia, y un badnavirus, detectado en plantas de pia (Hu et al., 1997; Thomson et al., 1996 y Wakman et al., 1995).
En el rea piera de La Chorrera - Panam, se detect el virus baciliforme de la pia (PBV), perteneciente a los Badnavirus, en extractos de plantas con sntomas de marchitez y tambin en cochinillas harinosas, con un porcentaje de 94.2 % y 63% respectivamente (Arcia y colaboradores, 2001; Arcia, 2001, resultados en fase de publicacin). Adems estudios realizados en colaboracin con OIRSA-VIFINEX, se pudo detectar la presencia de los Closterovirus (PMWaV-1 y PMWaV-2).
Los sntomas de la marchitez se han asociado a la infestacin de cochinilla en presencia de PMWaV-2. Cuando el badnavirus (PBV) y el otro Closterovirus (PMWaV-1) estn presentes no se observan sntomas (Sether y Hu, 2000).
2
A pesar de que PMWaV-1 no produce sntomas, la infeccin con este virus produce una reduccin del rendimiento de 15% en la cosecha proveniente de la semilla de primer hijo (Sether y Hu, 2001).
En Brasil se encontr que el insecto produce una reduccin significativa en la altura de la planta y del peso fresco de la raz y del follaje. Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el peso de los frutos evaluados en funcin del aumento de la densidad de poblacin de las cochinillas (Ferreira et al. 2001).
PROCEDIMIENTO
Protocolo del muestreo de la semilla de pia dorada (MD2) en campo Se realizaron los muestreos a 10 productores de semilla de pia dorada (MD2) debidamente registrados con expedientes en la agencia del MIDA y la Coordinacin de Sanidad Vegetal Regional.
En cada parcela se realizo la Geo-referenciacin de las Parcelas de semilla de pia de cada productor con el equipo GPS (ver Mapa).
3
En presencia del responsable del semillero, se toma una hoja central mas o menos la 4 ta de la corona, se rotula con el nombre del productor, #de bloque y se introduce en bolsas plsticas individuales, las hojas se mantienen en fro introducindolas en una termo con hielo. Las muestras una ves en el laboratorio se preservaron a -85 C hasta la extraccin de ARN. El muestreo alcanzo a 10 productores de semilla. ( Ver Cuadro)
Cuadro del muestreo por Productor
Productor rea Has Altura (m.s.n.m) Extracciones por productores Brunis Tropical La Arenosa 6 61 2 Castulo Castillo La Arenosa 5 59 4 Gatn Continente La Arenosa 8.7 56 4 Anana Corporacin La Arenosa 6 41 2 Gino Spadafora La Arenosa 4 58 4 Ubaldo Chapman Ro Congo 5 91 5 Ral Holner Zanguenga 5 91 4 Carlos Herrera Zanguenga 2 109 2 Golden West Zanguenga 10 108 4 J acinto Daz Zanguenga 10 114 4
Extraccin de ARN. Para la extraccin de Closterovirus se utiliz el protocolo recomendado para el producto RNApure (GenHunter). En total se extrajeron 35 aislados de ARN + 2 ARNs correspondientes a la muestras N 114 del productor Cstulo Castillo.
Pruebas moleculares. Para las pruebas de Closterovirus se utilizaron controles positivo y de agua (una planta que presenta sntomas de marchitez roja de la pia (PMWaV), como control positivo), esta ltima como control de contaminacin. Se utilizaron 6l de ARN total y se sometieron a la tcnica de RT PCR, con iniciadores especficos para cada cepa del virus (Sether, et al 2001).
4
Anlisis del producto de RT-PCR. Una vez terminado el proceso de RT-PCR, los productos de la amplificacin fueron corridos en una electroforesis en un gel de agarosa al 1%. La talla de los productos esperados eran de 589 y 609 pares de bases (pb) para el PMWaV-1 y PMWaV-2 respectivamente.
RESULTADOS
Durante el muestreo no se observ sntomas notables de la enfermedad en los campos, adems de la ausencia de cochinilla harinosa (Dysmicocus sp).
Resultados de la presencia de Closterovirus (PMWaV-1, PMWaV-2) en los campos de semilla (MD2)
Productor N de aislados PMWaV-1 PMWaV-2 % de infeccin de virus Brunis Tropical 2 0 0 0 Castulo Castillo 4 3 0 75 Gatn Continente 4 0 0 0 Anana Corporacin 2 0 0 0 Gino Spadafora 4 1 0 25 Ubaldo Chapman 5 5 0 100 Ral Holner 4 0 0 0 Carlos Herrera 2 0 0 0 Golden West 4 0 0 0 J acinto Daz 4 1 0 25 Muestra N 114 2 1 0 50
De las 10 parcelas visitadas (20 y 24/02/05), 4 parcelas resultaron positivas a la presencia del Closterovirus PMWaV-1, con un porcentaje de infeccin que varia de 25 al 100 %. No se detecto la presencia del Closterovirus PMWaV-2. Adems podemos agregar que los 2 aislados de la muestra (N 114), perteneciente al seor
Cstulo Castillo ingresaron al Laboratorio (14/02/05) previo al muestreo de las 10 parcelas, y mostr un porcentaje de 50% de infeccin al Closterovirus PMWaV-1. 5
Electrofresis de los productos de RT-PCR para la deteccin de Closterovirus
3000
2000 1500
1000
500 M =Marcadores de peso molecular; 1 8 , 14 = Muestras Negativas; 9 13, 15 =Muestras Positivas 16 =Control con Agua. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M
6
RECOMENDACIONES.
Debern ser utilizadas parcelas vrgenes para el establecimiento de semilleros de Pia, a su vez con un adecuado manejo de las cochinillas harinosa (Dysmicocus sp).
Ampliar el estudio en general, con la deteccin de Badnavirus, ya que en estudios anteriores de las zona Piera se ha detectado un alto porcentaje de presencia de este virus, adems del seguimiento evaluativo, en un nivel mas detallado a las parcelas vecinas (origen y destino de los materiales producidos) destinadas a la produccin de semilla.
En la evaluacin de las parcelas productoras de pia, se detecto nicamente la presencia del closterovirus (PMWaV-1), el cual provoca la reduccin de un 15% en la cosecha proveniente de las semillas del primer hijo, motivo por el cual es de especial inters, el manejo adecuado de dicho agente viral.
En los resultados obtenidos son de especial atencin los de la Parcela del Productor Chapman, por su alto ndice de infestacin, adems de su ubicacin alejada de los otros campos productores de semilla, lo que nos indica que se debe de tener un mayor control (Cuarentenario y de Vigilancia Fitosanitaria) para la movilizacin de material de siembra y la certificacin de los campos de produccin, por parte del Comit Nacional de Semilla (CNS) en colaboracin con el Laboratorio de Diagnstico Fitosanitario.
Deber llevarse a cabo un programa de capacitacin y divulgacin para concienciar al resto de las autoridades y a los productores sobre la presencia de la cepa de Closterovirus (PMWaV-1) en los campos productores de semilla y llevar a cabo una adecuacin de la norma de produccin de semillas de pia en el pas, ya que en el documento (Norma especifica de certificacin para la produccin, procesamiento y comercializacin de semilla de rubros no tradicionales de exportacin, Papa y Granos Bsicos MIDA Divisa), no se contemplan tcnicas diagnsticas adecuadas e ndices y tolerancias para la certificacin y manejo de plantaciones de semilla de Pia.
7
BIBLIOGRAFA
ARCIA A. 2001. Identificacin de Virus Relacionados a la Marchitez de la Pia en el Distrito de La Chorrera. Tesis de Grado. Universidad de Panam . Facultad de Ciencias Agropecuarias. David- Chiriqui. Panam. P. 47.
ARCIA, A. A.; RAMOS, C. W.; FERNANDEZ, O. 2001. Deteccin del virus baciliforme de la pia (PBV) mediante PCR en La Chorrera, Panam. En: PCCMCA (Programa Cooperativo Centroamericano para el Mejoramiento de Cultivos y Animales). 2001. Resmenes de la XLVII Reunin Anual del PCCMCA. Direccin de Investigaciones Agropecuarias, Ministerio de Agricultura y Ganadera. San J os, Costa Rica. P.33.
FERREIRA, K G; MORAES J . C. SANTACECILIA, L. V. C.; BENETTI FILHO, R. Z.; CARNEVALE,A.B. 2001. Determinacao de Injusrias e danos da Cochonilha Pulverulenta Dysmicoccus brevipes. Ciencia Agrotec. 25:525 532.
HU, J .S.; SETHER, D.M.; WANG, M.; LEE, F.; ULLMAN, D.E. 1997. Use of a tissue blotting inmuno assay to examine the distribution of pineapple closterovirus in Hawaii. Plant Disease 81: 1150-1154.
SETHER, D. M.; HU J . S. 2000. A Closterovirus and Mealybug Exposure are Both Necessary Components for Mealybug Wilt of Pineapple Symptom Induction. Phytopathology 90: S71
SETHER, D. M.; HU J . S. 2001. The Impact of Pineapple Mealybug Wilt-Associated Virus 1 and Reduced Irrigation on Pineapple Yield. Australasian Plant Pathology 30:31 36
SETHER, D. M.; KARASEV A.; OKUMURA C.; ZEE E.; KISLAN M. M; BUSTO J . L and HU J . S. 2001. Differentiation, Distribution, and Elimination of Two Different Pineapple Mealybug wilt-associated Viruses Found in Pineapple. Plant Disease 85: 856 864
THOMSON, K.G.; DIETZGEN, R.G.; THOMAS, J .E.; TEAKLE, D.S. 1996. Detection of pineapple bacilliform virus using the polymerase chain reaction. Annals of Applied Biology 129:57-69.
WAKMAN, W.; TEAKLE, D.S.; THOMAS, J .E.; DIETZGEN, R.G. 1995. Presence of a clostero-like virus and bacilliform virus in pineapple plants in Australia. Australian J ournal of Agricultural Research 46: 947-958.