Determinacin de la Ig E Especfica en el Laboratorio

Carlos Artaza lvarez MIR 1 F.H.Alcorcn

INTRODUCCION

 El sistema inmunolgico se caracteriza por reconocer sustancias extraas (Ag) y generar una respuesta para eliminarlas. En las alergias esta respuesta es excesiva y finalmente produce dao en los tejidos. Intervienen elementos genticos, celulares y moleculares

SISTEMA INMUNOLOGICO

 Contacto inicial con el alergeno en un individuo predispuesto: produccin de IgE que se fija a mastocitos y basfilos (sensibilizacin). Un segundo contacto con alergeno produce degranulacin y liberacin de sustancias vasoactivas

REACCIN DE HIPERSENSIBILIDAD TIPO I

1 EXPOSICIN A UN ALERGENO PREDISPOSICIN GENETICA PRODUCCIN DE GRAN CANTIDAD DE IgE ESPECIFICA FIJACIN A RECEPTORES DE MEMBRANA DE MASTOCITO 2 EXPOSICIN A ALERGENO UNIN DE ALERGENO A IgE ESPECIFICA EN LA SUPERFICIE DEL MASTOCITO

LIBERACIN DE HISTAMINA Y OTROS MEDIADORES

MANIFESTACIONES CLNICAS

Diagnstico de la Alergia mediada por IgE . HISTORIACLINICA

- Exploracin fsica

. Pruebas objetivas de sensibilidad a la IgE:

- Pruebas cutneas - Determinacin SIgE

Peculiaridades de la IgE
-Permite detectar la sensibilizacin de un paciente frente a un alergeno determinado -Baja concentracin srica: aguja en un pajar

Propiedades Inmunolgicas de las Inmunoglobulinas

IgG Concentracin Srica (mg/dl) Cantidad sintetizada (mg/Kg/da) Vida Media (das) IgA IgM IgE IgD

820

170

90

0,05

0,05

33 21

24 6

6,7 5

0,002 2

0,4 2

Deteccin de IgE: ensayo ptimo Capacidad de detectar bajas concentraciones (UI = 2.4 ng)

- Ausencia de reactividad cruzada: ni con otras Igs (IgG, IgM, IgA,) ni con otros alergenos no homlogos - No interferencia con bilirrubina, Hb, lpidos - Calibracin estable, con amplio rango de medida - Precisin: CV intras. <10%, CV inters. <15%

Deteccin de IgE: ensayo ptimo

Altamente Sensible: Detectar pacientes con niveles IgE Altamente Especifico: Excluir los no sensibilizados Calidad analtica: fiabilidad, estabilidad, reproducibilidad Estandarizacin (OMS) Reproducible (baja variacin en la repeticin de una medida) Automatizacin: flexible, fcil manipulacin.

Amplio men de alergenos

INMUNOENSAYOS

Inmunoensayo: reaccin Ag-Ac

Alergeno

IgE

Pilar del diagnstico in vitro en el laboratorio de alergia: deteccin de IgE especfica.

INMUNOENSAYOS:CONCEPTOS BASICOS
Complejo Ag-Ac: Sistema en equilibrio Ag + Ac Ag-Ac Afinidad Heterogeneidad de la respuesta Avidez Reactividad cruzada

INMUNOENSAYOS MARCADOS: GENERALIDADES

Inmunoensayos en los que el Ag o Ac estn marcados Rpidos, menos de 24 h. Alta sensibilidad, de microgramos a nanogramos. Automatizables, aplicaciones Clasificacin:
Homogneos Heterogneos Competitivos No competitivos

Inmunoensayos Marcados Tipos

Inmunoensayos Marcados
Conjugado marcado*: RIA Fase slida Alergeno IgE EIA FIA QIA

RADIOINMUNOENSAYOS
Inmunoensayo marcaje radiactivo
Radiacion beta: Tritio, carbono 14, etc. Radiacin gamma: Iodo 125, Iodo 135, etc.

Ensayos esencialmente competitivos

Ensayos secunciales Ensayos en equilibrio

Contadores

FLUOROINMUNOENSAYO
Determinacin de protenas, drogas y hormonas. Ac se une covalentemente a una molcula fluorescente. Absorben la luz de baja longitud de onda (200 a 400 nm) Emisin a longitud de onda mayor (400-700 nm) Mtodo directo:
Ac marcado directamente proporcional al Ag presente

Mtodo indirecto:
Menor Ac fluorescente fijado, mayor ser el Ag presente

Fluoroinmunoensayo
Primer Paso

Incubacin 37C
Eliminacin por lavado

Ac. Fase Slida

Ag a medir del paciente

Ag del paciente ligado al Ac

Fluoroinmunoensayo
Segundo Paso

37C

Incubacin

Reactivo anti-Ag fluorescente

Medicin de la fluorescencia relativa sobre la fase slida

ENZIMOINMUNOENSAYO
Ensayo marcado por una enzima. Heterogneos. Paso intermedio o separacin:
Competitivo. Ag Marcado No competitivo (Sndwich). Ac marcado Indirecto. Medicin niveles de Ac

Homogneos. No paso intermedio Enzimas

Bajo coste, alto nivel de pureza y interferencia

METODOLOGIAS

UniCap (Pharmacia)

Advia Centaur (Bayer)

Immulite 2000 (DPC)

Sistema UniCAP (Phadia)

Alta capacidad de fijacin del alergeno sobre una matriz. Gran versatilidad, panel ms amplio de alergenos (ms de 450), y permite un cribado mltiple de alergenos (Phadiatop, que combina los neumoalergenos, o los alimentos ms frecuentes encontrados en clnica), e investigar aquellos pacientes con resultado positivo (> 0.35 kU/L). Diseo : se trata de un Fluoroenzimoinmunoensayo clsico de tipo sandwich, alergeno fijado a fase slida (matriz) y la anti-IgE marcada con enzima beta-galactosidasa que hidroliza la 4-metilumbeliferil-beta-D-galactosa, liberando el producto fluorescente, la 4-metil-umbeliferona. Curva de calibracin obtenida con 6 calibradores de IgE total. Vlida durante un mes en el que se controla con 2 puntos. Tiempo de realizacin del ensayo : 2.5 horas.

ImmunoCAP 250 (Phadia)

Fluoro-Inmunoanlisis: -galactosidasa libera 4 metil-umbeliferona fluorescente.
Curva 6 IgE total totalmente automatizado 60 test/hora Tcnica de referencia en la deteccin in vitro de IgE especfica. > 450 alergenos.

Sistema AlaSTAT - Immulite 2000 (Diagnostic Products Corporation)

Incorpora la tecnologa de alergenos en fase lquida, estn fijados a polmeros solubles. La unin a la fase slida a travs de la elevada afinidad de la biotina (fijada tambin al polmero que porta al alergeno) por la estreptavidina (que recubre la bola de poliestireno). Tecnologa de lavado patentada por centrifugacin a 10.000 rpm : mnimas uniones inespecficas debido a la ptima separacin entre las fases ligada y no ligada. Diseo : Se trata de un enzimo-quimioinmunoanlisis. Conjugado anti-IgE marcado con fosfatasa alcalina y sustrato es el ester fosfato de admantil-dioxetano que origina un producto luminiscente. Velocidad de trabajo del analizador : 100 determinaciones/hora. Con un tiempo para el primer resultado de 65 minutos.

Immulite 2000 (DPC): sistema

AlaSTAT
Enzimo-quimioinmunoanlisis

Luminiscencia, CPS
Sustrato: Ester fosfato de adamantil-dioxetano (seal prolongada)

Bola de poliestireno recubierta de Estreptavidina

Biotina

Sustrato

IgE Alergeno

Enzima ALP Anti-IgE

Alergeno en fase lquida unido a un polmero soluble que tambin lleva fijado biotina.

IMMULITE 2000 - EL TUBO DE REACCIN

Un elemento esencial es el tubo de Reaccin, que junto con la bola recubierta de estreptavidina, esta diseado especialmente para llevar a cabo 1. La reaccin inmunolgica 2. El lavado por centrifugacin 3. El desarrollo de la seal quimioluminiscente

LA SEAL QUIMIOLUMINISCENTE

Mediante esta tecnologa se genera una seal prolongada permitiendo aumentar el rango y por tanto el nmero de lecturas precisas (12, separando las 2 extremas) frente a la quimioluminiscencia tradicional.

Immulite 2000 (DPC)

Velocidad de trabajo del autoanalizador: 100 det/h (1 en 65) Plataforma que permite determinar otros analitos

Curva master de calibracin: 7 puntos IgE total (cdigos de barra del reactivo) En la prctica con 2 puntos se adapta a cada ensayo

Sistema ADVIA-Centaur (Bayer)

Diseo de sandwich invertido : Es la Anti-IgE (y no el alergeno) la que est fijada a la fase slida (partculas paramagnticas) capturando slo la totalidad de IgE que presenta el especmen del paciente. Es el alergeno el que va a portar el marcaje luminiscente, pero no de forma directa, sino a travs de la interaccin biotinaestreptavidina. El ester de acridinio sometido a un cambio de pH emite luminiscencia. Curva de calibracin empleando IgE especfica frente a una protena recombinante del alergeno de abedul (r Bet v 1) Velocidad de trabajo del analizador : 120 determinaciones/hora. Con un tiempo para el primer resultado de 47 minutos.

Advia-Centaur (Bayer)
Diseo sandwich invertido: la Anti-IgE es la que se fija a la fase slida y el que lleva el marcaje es el alergeno, pero no de forma directa. IgE
pH: ac. ntrico y sosa

Anti-IgE
unida a partculas paramagnticas

Alergeno Ester de acridinio unido a unido a

biotina

Estreptavidina

Quimioluminiscencia, RLU

Advia-Centaur (Bayer)
Velocidad de trabajo del autoanalizador: 120 det/h (1 en 47) Flexibilidad analtica: hormonas, serologa, marcadores

Curva master de calibracin: 6 puntos s-IgE rbet

En la prctica con 2 puntos se adapta a cada ensayo

Interpretacin resultados resultados IgE IgE especficos especficos Interpretacin Resultados cuantitativos KUA/L < 0.35 0.35-<0.7 0.7-3.5 3.5-17.5 17.5-<50 50-<100 100 o + Nivel de Ac. SIgE Resultados semicuantitativos Clases

Ausente Bajo Moderado Alto Muy Alto Muy Alto Muy Alto

o 1 2 3 4 5 6

IgE especfica y citometra de flujo

Fundamento Citometra de flujo

Tcnica de anlisis celular multiparamtrico Flujo laminar suspensin de partculas (generalmente clulas) por delante de un haz de lser focalizado. El impacto de cada clula produce seales (dispersin y fluorescencia) que son recogidos por distintos detectores y digitalizadas para la medida simultnea de varios parmetros Permite el anlisis de un gran nmero de clulas en poco tiempo (5000 partculas / segundo).

Se trata de una tcnica cualitativa y CUANTITATIVA.

Principales componentes CMF

* Fludica:
Flujo laminar.

* Sistema ptico
- Fuente de radiacin monocromtica - Seleccin de la radiacin - Deteccin de las distintas seales

* Sistema de recogida y anlisis de datos

Esquema Citmetro de flujo

IgE especfica y citometra de flujo

Anti-IgE marcada IgE srica FLUJO LAMINAR lolium olivo fila de partculas Cada partcula porta una especificidad Un lser identifica la partcula alergnica por su espectro rojo-naranja. El otro cuantifica el marcaje con fluorescena (verde). gato

2 LASER

Tecnologa Multiplex

En un mismo pocillo de reaccin, para una muestra determinada, realizamos mltiples micro-inmunoensayos simultneamente.

Para cada paciente: mltiples microensayos simultneos

Bajos CV < 10%

analiza 50-200 esferas de cada especificidad

Los Acs siguen siendo la clave

CONJUGADO (marcado con fluorocromo) contra la molcula a analizar (contra un eptopo distinto al del 1 anticuerpo) Marcador tumoral Hormona Antgeno

SUERO DEL PACIENTE

ANTICUERPO fijado a la esfera (soporte) (contra la molcula a analizar)

Ventajas de CMF
- Volumen de muestra mnimo. - Mayor precisin frente a las tcnicas manuales: IFI - Cuantifica: mayor rango analtico que EIA - Homogeniza las mltiples pruebas existentes - Anlisis mltiple simultneo (mismo conjugado) - Disminuye drsticamente el tiempo de respuesta - Ahorro de mano de obra

Tendencias en las pruebas de deteccin de sIgE

Consolidar el mayor nmero de determinaciones en un solo tubo y una sola estacin de trabajo plataforma analtica multifuncional.

Utilizacin de metodologa de alta sensibilidad, precisin, garanta de no contaminacin,

Amplio men de alergenos, amplio panel de alergenos recombinantes.