Electroforesis de protenas y de cidos nucleicos

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Definicin
La mayora de las biomolculas poseen una carga elctrica, cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran. Como consecuencia, se desplazan cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se denomina electroforesis a la tcnica mediante la cual se separan las biomolculas en disolucin cuando se ven sometidas a un campo elctrico. Se trata de una tcnica fundamentalmente analtica, aunque tambin se puede realizar con fines preparativos. Cada molcula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rpidamente una velocidad constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo elctrico) con la resistencia al avance (fuerza de friccin o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza. Fuerza del campo elctrico = Fuerza de friccin

q = carga (C) E = intensidad del campo

(V/m = N/C)

q E = f v f = coeficiente de friccin
(CVs / m2 = kg/s) v = velocidad de la molcula (m/s)

El coeficiente de friccin mide la resistencia intrnseca debida a las caractersticas de cada molcula, esencialmente su forma y su tamao. As, por ejemplo, las molculas grandes y asimtricas poseen un mayor coeficiente de friccin que las pequeas y compactas.

La velocidad por unidad de campo recibe el nombre de movilidad electrofortica,

vE==qf=Zef
(Z = nmero entero; e = carga del electrn) En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente movilidad de cada molcula define su separacin en el espacio; al ir transcurriendo el tiempo, se van separando progresivamente unas de otras. Al ser el medio de soporte a su vez un polielectrolito, est constituido por iones, que son atrados y as recubren los iones de la muestra, lo que altera el comportamiento de stos en el campo. Todo ello hace que el tratamiento terico cuantitativo de la electroforesis sea muy difcil y que esta tcnica resulte poco til para obtener informacin precisa sobre la estructura de las molculas. Sin embargo, es enormemente til como tcnica analtica y preparativa. Se suele hablar de 3 tipos de electroforesis: 1. De frente mvil: los componentes de la muestra estn presentes en toda la disolucin y se determina pticamente la posicin del frente de avance o frontera con el disolvente. 2. Zonal: la muestra se aplica como una mancha o banda y sus componentes migran a travs de un disolvente, utilizando adems un medio que soporta a ste. En este caso no se determina la movilidad, sino que el nico objetivo de la tcnica es separar los componentes de la muestra. 3. Continua: la muestra se aplica tambin en una zona, pero se suministra continuamente a lo largo del proceso (para ms informacin, vanse las pp.250-2 de Freifelder, 1999). Estudiaremos nicamente la electroforesis zonal, de uso ms extendido.

Finalmente, debe sealarse que, aunque es menos frecuente, tambin se puede aplicar la electroforesis para la separacin de clulas.

Medios de soporte para realizar la electroforesis

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar perturbaciones mecnicas y corrientes de conveccin durante la separacin. En algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo largo de ella, con escasa friccin, por lo que el mecanismo principal de separacin es la magnitud de la cargade cada componente de la muestra. Otros medios de soporte (geles, medios semislidos o gelatinosos) estn formados por polmeros que forman una malla, matriz o red tridimensional a travs de la cual deben avanzar las molculas de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electrofortico. Como consecuencia, la friccin es notable y los factores de forma y tamao adquieren una alta relevancia en la separacin. Medios de baja friccin papel acetato de celulosa separacin principalmente por carga Medios de elevada friccin gel de almidn gel de agarosa gel de poliacrilamida gel de agarosa+poliacrilamida

separacin por carga, tamao y forma

Papel: sencillo, pero con elevada adsorcin debido a los grupos hidroxilo de la celulosa. Acetato de celulosa: los grupos OH estn acetilados, lo que reduce la adsorcin; baja tincin de fondo; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar los componentes separados.

Almidn: pasta de almidn cuyos granos se han disgregado en un tampn caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida. Agarosa: polisacrido, producto purificado de algas (composicin similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (5060C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad. Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa. acrilamida : (forma polmeros lineales)

N,Nmetilenobis(acrilam ida):

(introduce uniones cruzadas entre cadenas de poliacrilamida)

poliacrilam ida: (vista parcial)

Agarosa+poliacrilamida: porosidad intermedia. Poliacrilamida con SDS: el dodecilsulfato sdico (Sodium Dodecyl Sulphate) es un detergente aninico que se une a las protenas, desnaturalizndolas en una conformacin extendida recubierta de molculas de SDS. Como consecuencia, el tamao de la molcula de protena es directamente proporcional a su longitud en aminocidos y su carga queda enmascarada por la mayor carga del SDS que la recubre, que es tambin proporcional a la longitud. Por lo tanto, la movilidad electrofortica de la protena depende exclusivamente de su masa molecular.

H-(CH2)12-SO4

Modos de disposicin del soporte

Horizontal

En papel, para aminocidos u otras molculas pequeas, y en soportes similares (especialmente, acetato de celulosa), para protenas. En gel de almidn o de agarosa, para protenas y especialmente para cidos nucleicos. Casi siempre el tampn cubre el gel (para evitar que se seque debido al calentamiento sufrido al pasar la corriente), denominndose por ello electroforesis submarina. Soporte impregnado de disolucin tampn por capilaridad, disuelve la muestra y mantiene el contacto elctrico. Se aplica la muestra depositndola (pipeta o aplicador especfico) como una gota sobre el soporte (papel, acetato de celulosa) o dentro de un pocillo creado en el gel.

Vertical
Casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (ms resistente fsicamente, no se desliza), para protenas o para cidos nucleicos de pequeo tamao. El gel puede rellenar tubos de vidrio (cada vez se usa menos) o estar contenido entre 2 placas rectangulares.

Contacto elctrico y disolvente gracias al tampn que embebe el gel y llena las cubetas o compartimentos del nodo y ctodo. La muestra se deposita con micropipeta llenando un pocillo creado al polimerizar el gel. En cuanto a la composicin del gel hay dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composicin ligeramente diferente).

Ejemplos de separacin electrofortica

Separacin de protenas por SDS-PAGE discontinua vertical

SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sdico. Gel de poliacrilamida, en placa, vertical. Separacin de acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con la longitud de la cadena polipeptdica). La muestra se trata con SDS (a mayor concentracin que en la composicin del gel) y se calienta brevemente a 90-100C, para provocar la desnaturalizacin. Se suele aadir tambin mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando as las subunidades de la protena y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS. En la preparacin del gel se mezclan:

un tampn de pH (comnmente Tris-HCl) acrilamida y bisacrilamida un agente iniciador de la polimerizacin, como el persulfato amnico (genera radicales libres) un agente catalizador de la polimerizacin, como el TEMED (N,N,N,N-tetrametiletilenodiamina) SDS

Permite obtener una estimacin de la masa molecular de las protenas separadas. Para ello es preciso analizar en la misma electroforesis unas protenas patrn, de tamao conocido, con las que se construye una curva de calibrado, representando movilidad frente a logaritmo de masa molecular.

Para controlar el avance del frente de electroforesis (posicin de mxima movilidad) se aade a la muestra un colorante marcador (tracking dye), molcula cargada y de pequeo tamao que avanza ms que cualquier componente de la muestra; el ms habitual es el azul de bromofenol. Para mejorar la resolucin (obteniendo bandas ms compactas) se suele emplear electroforesisdiscontinua:

En la parte superior, un gel acumulador o concentrador (stacking gel), que tiene como efecto concentrar la muestra en una banda estrecha. Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el que tiene lugar la separacin de los componentes.

El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador combinada con una diferente composicin de los tampones de cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-HCl) y distinto pH para ambos geles. Nota: Tris es tris(hidroximetil)aminometano, una sustancia habitual para preparar disoluciones tampn de pH prximo a 7.

Separacin de DNA en geles de agarosa, electroforesis horizontal submarina

composicin del gel % de acrilamida 20 15 12 8 5 3,5 2 1,5 1,2 0,9 0,7 0,6 0,3 % de agarosa resolucin conseguida: tamao de DNA (kb) 0,006 - 0,10 0,025 - 0,15 0,04 - 0,2 0,06 - 0,4 0,08 - 0,5 1-2 0,1 - 2 0,2 - 3 0,4 - 6 0,5 - 7 0,8 - 10 1 - 20 5 - 60

Las molculas de DNA de las clulas son excesivamente grandes para avanzar a travs de un gel de electroforesis normal, pero pueden analizarse si previamente se han fragmentado de forma controlada. Se suelen emplear geles de agarosa (concentracin entre 0,3% y 2%), ms porosos que los de poliacrilamida. Las caractersticas mecnicas de estos geles hacen aconsejable la realizacin de la electroforesis en horizontal, habitualmente submarina. Las muestras se aplican en pocillos practicados dentro del gel. Una de las formas ms comunes de fragmentar el DNA es el empleo de endonucleasas de restriccin, que cortan en secuencias diana caractersticas.

La carga elctrica de una molcula de DNA depende de sus grupos fosfato, y el nmero de stos es igual al doble del nmero de pares de bases. La forma de todas las molculas de DNA es esencialmente la misma. En consecuencia, resulta que la movilidad en electroforesis depende exclusivamente de la longitud de la molcula (medida habitualmente como nmero de pares de bases, pb): la electroforesis separa los fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud en pb. De forma similar al caso de protenas en SDS-PAGE, se suelen aplicar patrones en uno de los pocillos para hacer una curva de calibrado de tamaos. El avance del frente de electroforesis se observa gracias a colorantes como azul de bromofenol y xileno cianol, aadidos a la muestra. Cuando los fragmentos de cido nucleico analizados son de tamao muy pequeo se utilizan geles de poliacrilamida, o de mezclas de agarosa y poliacrilamida cuando el tamao es intermedio.

Revelado o deteccin
Tincin de protenas y de cidos nucleicos

Bromuro de etidio: Agente intercalante, se introduce entre las bases apiladas del DNA, abre un poco la doble hlice, provoca un desenrollamiento local. Su fluorescencia (color naranja al iluminar con UV) aumenta mucho cuando se une al DNA: mtodo de tincin o revelado del DNA, especialmente usado en electroforesis y en centrifugacin.

Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se unan a las protenas o los cidos nucleicos. En el primer caso suelen ser colorantes orgnicos que interaccionan con las protenas de forma poco selectiva, principalmente electrosttica. Ejemplos: azul brillante de Coomassie, negro amido, rojo Ponceau. Para los cidos nucleicos se usa el azul de metileno o, ms frecuentemente, compuestos fluorescentes e intercalantes, como el bromuro de etidio (vase figura). Un compuesto intercalante es aqul que se introduce entre los pares de bases apilados del DNA. Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una disolucin del colorante y se espera a que aqul se impregne y as el colorante se una a las molculas separadas en el gel. Tras lavar el gel para eliminar el exceso de tincin no unida especficamente, se observa, fotografa o cuantifica mediante densitometra.

deteccin por tincin con un agente fluorescente y observacin bajo luz ultravioleta

deteccin por autorradiografa

Ensayo enzimtico
Si entre las molculas separadas hay una enzima, se puede detectar aadiendo sus sustratos (naturales o sintticos) y sus cofactores, y detectando la aparicin del producto, generalmente coloreado.

Autorradiografa
Tanto protenas como cidos nucleicos pueden marcarse isotpicamente previamente a la electroforesis, en cuyo caso la deteccin se hace mediante autorradiografa del gel (vase figura).

Inmunoensayo (Western)

En caso de disponer de ellos, los anticuerpos permiten la deteccin selectiva del componente de inters (protena o grupo marcador unido qumicamente a la protena o al cido nucleico antes de la electroforesis). La permeabilidad de los geles para el acceso del anticuerpo es limitada, por lo que se hace una transferencia de las molculas separadas en el gel hacia una membrana de nitrocelulosa o de nailon, la cual se somete luego a la disolucin que contiene el anticuerpo. Los detalles de esta tcnica de inmunotransferencia o ensayo Western blot se tratarn en un tema posterior.

Deteccin de cidos nucleicos con sondas (Southern y Northern)

Las molculas con una secuencia determinada de nucletidos se pueden detectar mediante hibridacin con sondas especficas, pequeas molculas de cido nucleico monocatenario (oligonucletidos) con la secuencia complementaria a la buscada y marcadas con un istopo radiactivo, un grupo fluorescente, etc. Para llevar a cabo con xito la hibridacin se requiere tambin la transferencia desde el gel a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Los detalles de estos ensayos (Southern blot para DNA y Northern blot para RNA) se estudian en un tema posterior.

Tcnicas especiales
Isoelectroenfoque
(Tambin se llama enfoque isoelctrico o IEF, de isoelectrofocusing). Se trata de una variante de electroforesis en la que el gel (poliacrilamida) posee un gradiente de pH fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en su preparacin molculas ionizables con valores de pK diferentes. Como consecuencia, al avanzar los componentes de la muestra a lo largo del gel se encuentran en entornos de pH diferente, y eventualmente alcanzan una regin en la cual el pH es igual al punto isoelctrico de la molcula muestra y, en consecuencia,

sta detiene su avance. Se alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separacin de los componentes de la muestra de acuerdo con su punto isoelctrico, que adems se puede medir, pues se conoce el gradiente de pH del gel.

Electroforesis bidimensional
Tras realizar una primera separacin su resultado se somete a otra de diferente mecanismo en direccin perpendicular. Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel cilndrico estrecho que luego se coloca como muestra para una SDS-PAGE. Se obtienen as mapas complejos de bandas, muy caractersticos de cada muestra, cuya utilidad principal es la comparacin con el obtenido de otra muestra similar pero conocida.

Electroforesis de campo pulsante

Las molculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 2040 kb no se pueden resolver (separar) empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se debe, en primer lugar, a la dificultad de manejo de los geles preparados con las bajas concentraciones de agarosa que requeriran (inferior al 0,4%). Adems, las molculas de DNA, que adoptan una conformacin ms o menos globular, poseen un tamao excesivamente grande para atravesar los poros del gel y no se separan en funcin de su tamao. Para solventar este problema se ha ideado una modificacin de la tcnica, conocida como electroforesis de campo pulsante (o pulsado, pulsedfield gel electrophoresis , PFGE). Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera peridicamente la orientacin del campo elctrico aplicado, activando alternativamente dos pares de electrodos. El frecuente cambio de direccin del campo elctrico

consigue que las molculas se desplieguen y avancen a travs de los poros en conformacin extendida. A mayor tamao, se reorientan con ms dificultad, por lo que avanzan ms despacio.

As se consigue separar fragmentos de DNA de hasta varias megabases, lo que supone un avance significativo pero an no sirve para estudiar los cromosomas humanos enteros (de 50 a 250 Mb cada uno). S se han podido analizar as los cromosomas de levadura (figura derecha). Las muestras han de contener el DNA sin fragmentar, por lo se requiere una preparacin especial (al purificar el DNA por los mtodos habituales se fragmenta por debajo de 100 kb). Para obtener preparaciones con los cromosomas intactos se mezclan las clulas con agarosa caliente (37C) y se vierte en pequeos

moldes de unos milmetros, de forma que al solidificarse la agarosa (4C) forma bloques (insertos) que incluyen las clulas intactas. En stos se realiza la lisis celular y la digestin de las protenas (p.ej., con EDTA, SDS y proteinasa K, que difunden a travs de los poros del gel) sin que se alteren las grandes molculas de DNA. Tras una dilisis para eliminar los restos de la digestin, se consigue un bloque de agarosa con el DNA intacto en su interior, y se deposita el bloque entero en un pocillo del gel de electroforesis.

Electroforesis preparativa
Se han desarrollado variantes preparativas, es decir, que permiten la obtencin de cantidades significativas de los componentes de la muestra por separado. No se detallarn aqu (vase Freifelder 1991, pp.256-7)

Inmunoelectroforesis
Combina una separacin electrofortica con una deteccin por inmunodifusin.

Aplicaciones
Determinacin de la masa molecular
Como se ha indicado, se puede obtener una estimacin de la masa molecular (en kDa) de protenas empleando SDS-PAGE, y de fragmentos de DNA (en pb) empleando electroforesis en agarosa. En ambos casos, en uno de los pocillos del gel se carga una mezcla de molculas patrn de tamao conocido, con el fin de poder trazar la curva de calibrado. Para las protenas, la validez del dato obtenido depende de que la desnaturalizacin con SDS haya sido completa y de que se hayan separado las subunidades gracias a la reduccin con mercaptoetanol; adems, la presencia de oligosacridos en las glicoprotenas altera la movilidad, que ya no proporciona valores de masa molecular fiables.

Se aplica en uno de los pocillos del gel una mezcla de fragmentos de DNA de tamao conocido, denominados patrones, marcadores de masa molecular o escalera de DNA (DNA ladder). Tras su separacin en la electroforesis , se revelan y se representa para todas las bandas la movilidad (distancia avanzada o, mejor, cociente entre sta y el avance del frente de electroforesis ) frente al logaritmo del tamao (longitud en pb). Sobre la recta ajustada se interpolan las distancias de avance de las muestras problema, calculando

as su tamao en pb. En este ejemplo, los patrones empleados son fragmentos bien conocidos, aquellos obtenidos a partir del DNA del virus por la accin de las endonucleasa s de restriccin Ec oRI e HindIII.

Determinacin del punto isoelctrico

Como se ha indicado, mediante isoelectroenfoque se obtiene una medida del punto isoelctrico de las protenas (pHI o pI).

Isoenzimas
Las variantes de una enzima, con pequeas diferencias en su estructura y en su actividad enzimtica, se analizan rutinariamente mediante electroforesis o, en especial, mediante isoelectroenfoque. De hecho, los nombres de las isoenzimas derivan a veces de su movilidad electrofortica. Se puede aplicar anlogamente a las isoformas de protenas no enzimticas.

Mapas de restriccin

Una de las formas de estudiar la secuencia de los cidos nucleicos, en especial el DNA, consiste en tratarlo con distintas enzimas de restriccin, analizar mediante electroforesis en gel de agarosa los fragmentos resultantes e intentar reconstruir la secuencia de la molcula original formando sumapa de restriccin, uno de los tipos de mapa fsico.

Secuenciacin de cidos nucleicos

La obtencin de la secuencia completa, nucletido a nucletido, tambin depende del anlisis electrofortico de fragmentos de DNA, tanto en el mtodo qumico de Maxam y Gilbert como en el mtodo enzimtico de Sanger. Se utilizan en este caso geles de poliacrilamida, debido al tamao pequeo de los fragmentos, pudindose resolver fragmentos que se diferencian en un solo nucletido.