Sntesis de potenciales antimalricos a travs de reacciones de Diels-Alder

M. Sc. Daniela Gamenara

Trabajo de tesis para la obtencin del ttulo de

Doctor en Qumica
Facultad de Qumica Universidad de la Repblica Montevideo, Octubre de 2005

Dra. Gloria Serra

Dr. Gustavo Seoane

Dr. Adolfo Iribarren

Dr. Patrick Moyna Director

Dr. Horacio Heinzen Director

A veces esperando las oportunidades no se ven, y se tira todo a la marchanta Mirando las golondrinas en el cielo, no se ven otras golondrinas al alcance de la mano Es cuando la estupidez gana por afano a la suerte que nunca llega si la estamos esperando Cmo?, cundo? y por qu? Son demasiadas preguntas para hacerle al destino A veces estamos finos y otras veces nada que ver, pues hay que caminar antes de empezar a correr La culpa es un invento muy poco generoso y el tiempo, tremendo invento sabandija Ser que ser suficiente con que uno elija porque si no, la buena fortuna pasa de largo . Las oportunidades, Andrs Calamaro

A Santiago. Por su apoyo siempre, y por su amor de todos los das. A Sofa y a Cecilia. Mis dos soles. Lo ms importante que tengo.

Agradecimientos: A las instituciones que de un modo u otro, hicieron posible este trabajo: Facultad de Qumica en primer lugar, por haber ofrecido la infraestructura y los medios econmicos que dan el marco imprescindible para la realizacin de una tesis de doctorado. PEDECIBA por el otorgamiento de la beca de doctorado y la financiacin de pasantas, cursos y congresos que complementaron mi formacin. CSIC por la financiacin parcial de mi pasanta en la Universidad Complutense de Madrid. AECI por el otorgamiento de la beca de investigacin en la Universidad Complutense de Madrid. SAIQO por el apoyo para la asistencia a congresos en los cuales fueron expuestos resultados parciales de este trabajo de tesis. Departamento de Enfermedades Infecciosas y Tropicales del London School of Hygiene and Tropical Medicine, Londres, Reino Unido, por las pruebas de actividad biolgica. Laboratorio de Experimentacin Animal (LEA) de esta facultad, por las pruebas de actividad biolgica. A mis directores de tesis Dr. Patrick Moyna y Dr. Horacio Heinzen. A las personas que de algn modo tuvieron participacin directa en este trabajo: Horacio Pezzaroglo por los espectros de RMN. Por su paciencia cuasi-infinita. Por todas las ampliaciones. Y por todas las que vendrn. Andrs Gonzlez y Carmen Rossini por haber puesto a mi disposicin su acceso la biblioteca de Cornell University. Por haberme permitido el uso de su cromatgrafo de gases. Por haberme enseado a usarlo. Paula Rodrguez, por las maanas de GC. Luca Otero por los anlisis elementales. Eleuterio Umpierrez por los espectros infrarrojos y de masas. Noel Ulibarri por la sntesis de los dienfilos de ltimo momento. Por sus ganas de trabajar.

Jenny Saldaa por los ensayos de actividad antihelmntica. Por el apuro del ltimo tiempo. Por no haber enloquecido cuando la ltima semana encontr tres productos que me haba olvidado de evaluar. Gabriel Gonzlez por su colaboracin con la impresin de esta tesis. Gabriela Garca. La mejor de las secres. Por el apoyo de siempre en todos los asuntos administrativos. Por el apoyo de siempre. A las personas que siempre estuvieron ah: Gustavo Seoane. Siempre estuvo ah. Por haber estado siempre dispuesto a dar una idea, a mirar un espectro, a buscar una alternativa, a dar un consejo. Porque es un referente. Valeria Schapiro. Otra que siempre est ah!. Por haberse digerido enterita la masa de esta tesis. Por sus correcciones, sus opiniones, y por haberme tirado para arriba en tanta oportunidades. Patricia Saenz. Porque da gusto tener una amiga tan sabioncita!! Porque me ley y me explico, y me volvi a leer, y me volvi a explicar lo que es un orbital molecular de frontera y un diagrama de correlacin. Porque la masa entera se la digiri de onda, sin que yo se lo pidiera. Por todos los clculos tericos. Porque me dedic su tiempo cuando es seguro que no lo tena. Porque todava no me olvid de la tarde en que aprendimos juntas a armar una bola de decantacin. Por todas las cosas que pasaron despus. Las que quedaron, y las que se convirtieron en humo. Enrique Pandolfi. Por sus correcciones como evaluador de los informes de renovacin de beca de doctorado. Porque despus de tantos aos Quique sigue estando ah. Porque sigue siendo alguien con quien se puede contar. David Gonzlez. Por el apoyo en los momentos de desnorte acadmico. Las brujas de pura cepa. Mariela, Gaby, Laura y Patricia. Si, las quem. Ahora se sabe de quin son las escobas. Porque estn, porque constituimos el mejor de los aquelarres. Porque son mis amigas. A Mariela claro, porque nos queremos an por encima de tantos gritos. Andrs y Carmen. Por las horas dedicadas a arreglar el DQO, la facultad, la academia, la ciencia, yo que s! Por todo lo que hemos compartido. Porque son mis amigos. Silvia Onetto tambin est siempre ah. Calladita (a veces), discreta, ecunime. Silvia es un sol dentro de la ctedra de qumica orgnica. Margarita Brovetto. Por su apoyo, por su solidaridad, por su amistad, por su ejemplo. Porque a Margarita le vi dar las mejores clases. Porque fue una experiencia

fundamental haber compartido un grupo de prctico con Marga. Porque su rigurosidad y la dedicacin a su trabajo son un ejemplo para todos. A los compaeros del Departamento con los cuales hemos compartido mil cosas en todos estos aos: Todos los compaeros del Laboratorio de Farmacognosia, especialmente aquellos con quienes compart la mayor parte de las horas de laboratorio: Paula Rodrguez, Claudia Daz, Eduardo Das, Daniel Paz, Adriana Lloret. A Pilar Menndez, y a Eduardo Dellacassa. Los compaeros de la Ctedra de Qumica Orgnica y el LSO. Ana Bellomo, por su buena onda, porque es una dulce, definitivamente. A toda la savia nueva, que en definitiva es la que mueve (y a veces sacude) al LSO. Maitia, por supuesto en primer lugar. Nacho, Jorge, Vicky y la zanahoria, Viviana, Helen, Silvana, Noel, Aline. Los compaeros de la Ctedra de Qumica Farmacutica, hermanos en todo esto de la sntesis orgnica. A todos los compaeros del Departamento de Qumica Orgnica.

Indices

Indice general
Pg. 1.2.Introduccin Antecedentes 2.1.Aspectos farmacolgicos 2.1.1.- Ciclo vital de los plasmodios causantes de malaria 2.1.2.- Quimioterapia de la malaria a) Clasificacin de los frmacos antimalricos i) Esquizonticidas tisulares utilizados en profilaxis ii) Esquizonticidas tisulares utilizados para evitar recadas iii) Esquizonticidas hemticos utilizados en la curacin clnica y supresin iv) Gametocidas v) Esporonticidas b) Drogas utilizadas en el tratamiento de la enfermedad i) ii) Drogas tradicionales Drogas actualmente establecidas iii) iv) v) 4-aminoquinolinas y arilaminoalcoholes Antifolatos Derivados de artemisinina Antibiticos Lumefantrina-artemter Atovacuona-proguanil Cloroproguanil-dapsona Pironaridina Tafenoquina Fosmidomicina Nuevos inhibidores de la polimerizacin 11 11 12 12 12 16 16 20 22 24 25 25 26 27 27 28 29 31 33 1 5 5 5 8 10 10 10

Nuevas drogas en uso clnico

Drogas en desarrollo clnico

Drogas en desarrollo preclnico

Indices del hemo vi) 2.2.Aspectos qumicos 2.2.1.- Consideraciones tericas generales i) Estereoqumica de la reaccin ii) a) b) c) La regla cis La regla endo Nuevos derivados de artemisinina y otros perxidos Inhibidores de proteasas Inhibidores de la sntesis de cidos grasos Inhibidores de farnesil transferasa Inhibidores de la gliclisis 36 39 41 42 43 44 46 46 49 49 51 53 57 57 58 61 61 64 70 72 72 72 72 73 79 80 80 Sntesis de tetrametilpurpurogalina Sntesis de eucarvona y derivados Sntesis de derivados de (1R,2S)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol 4.1.2.- Sntesis de dienfilos Sntesis de 4-nitrosobenzaldehdo 33

Estructuras lderes an ms novedosas

Regioqumica de la reaccin Dienfilos Dienos Reacciones de Diels-Alder que involucran heterotomos Aspectos sintticos de las cicloadiciones con compuestos nitroso como dienfilos Compuestos arilnitroso y acilnitroso como dienfilos en cicloadiciones [4+2]

2.2.2.- Aspectos particulares

3.4.-

Objetivos Resultados y discusin 4.1.Sntesis 4.1.1.- Sntesis de dienos y precursores a) b) c)

Indices Sntesis de 4-cloronitrosobenceno Sntesis de 4-nitrosotolueno Aductos de Diels-Alder sintetizados a partir de tetrametilpurpurogalina como dieno Aductos de Diels-Alder sintetizados a partir de eucarvona y derivados como dieno Aductos de Diels-Alder sintetizados a partir de derivados sustitudos en posicin 6 de (1R,2S)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol como dieno 4.2.- Actividad biolgica 5.6.Conclusiones Parte experimental 6.1.6.2.Materiales y equipos Procedimientos de sntesis 6.2.1.- Procedimientos generales PGS 2: Procedimiento general de sntesis de aductos de Diels-Alder con TMPG como dieno PGS 3: Procedimiento general de sntesis de aductos de Diels-Alder con eucarvona y derivados como dieno PGS 4: Procedimiento general de sntesis de aductos de Diels-Alder con derivados de (1R,2S)-ciclohexa-3,5-dien-1,2-diol como dieno 142 PGS 5: Procedimiento general de proteccin de dioles con dimetoxipropano PGS 6: Procedimiento general de desproteccin acetnidos Ensayos de actividad biolgica 6.2.2.- Descripcin de los experimentos a) b) c) 7.Sntesis de dienos y precursores Sntesis de dienfilos Sntesis de aductos de Diels-Alder 143 143 143 144 144 148 151 179 142 142 114 119 135 140 140 141 141 100 85 82 83 85

4.1.3.- Sntesis de aductos de Diels-Alder

PGS 1: Procedimiento general de reduccin de compuestos nitro a nitroso 141

Referencias bibliogrficas

Indices

Indice de Figuras
Pg. Figura 1: Figura 2: Figura 3: Figura 4: Figura 5: Figura 6: Figura 7: Figura 8: Figura 9: Figura 10: Figura 11: Figura 12: Incidencia mundial de la malaria. Estructuras de artemisinina y yingzaosu A. Perxidos derivados de tropolonas y benzotropolonas. Oxazina producto de cicloadicin de eucarvona y nitrosobenceno. Dienos utilizados en las reacciones de Diels-Alder. Dienfilos utilizados en las reacciones de Diels-Alder. Ciclo vital de protozoarios del gnero Plasmodium. Estructuras de cloroquina, primaquina y proguanil. Estructuras de quinina, mefloquina, halofantrina y artemisinina. Estructuras de azul de metileno, pamauina y mepacrina. Estructura de pirimetamina y cloroguanida Estructura de artemisinina. Representacin esquemtica de un eritrocito infectado con P.falciparum, que indica la localizacin subcelular de los diferentes potenciales blancos de drogas. Figura 13: Figura 14: Figura 15: Figura 16: Figura 17: Figura 18: Figura 19: Figura 20: Figura 21: Figura 22: Figura 23: Figura 24: Estructura de amodiaquina. Estructuras de sulfadoxina y pirimetamina. Conversin de proguanil en su metabolito activo cicloguanil. Artemisinina y sus derivados de uso clnico. Mecanismo hipottico propuesto par la alquilacin del grupo hemo por artemisinina. Antibiticos usados en el tratamiento de la Malaria. Estructuras de lumefantrina y artemter. Atovacuona, proguanil y ubiquinona, el transportador natural de electrones. Estructuras de cloroproguanil y dapsona. Estructura de pironaridina. Drogas con estructura de 8-aminoquinolinas. Fosfidomicina y derivados. 27 27 29 29 31 24 25 26 17 18 20 22 23 3 4 4 7 10 11 13 14 14 1 2

Indices Figura 25: Figura 26: Figura 27: Figura 28: Figura 29: Figura 30: Figura 31: Figura 32: Figura 33: Figura 34: Figura 35: Figura 36: Figura 37: Figura 38: Figura 39: Figura 40: Figura 41: Figura 42: Figura 43: Figura 44: Figura 45: Figura 46: Figura 47: Biosntesis de isoprenoides. Mecanismo propuesto para la conversin catalizada por DOXP reducto reducto isomerasa de DOXP en MEP. Nuevos inhibidores de polimerizacin del grupo hemo. Nuevos derivados de artemisinina con potencial actividad antimalrica. Yingzaosu A y su derivado sinttico artefleno. Estructuras relacionadas con los endoperxidos, con potencial actividad antimalrica. Inhibidores de proteasas. Inhibidores de sntesis de cidos grasos. Inhibidores de farnesil transferasa. Inhibidores de gliclisis. Compuestos lderes para nuevas drogas. Disposicin espacial del dieno y el dienfilo durante el transcurso de la reaccin de cicloadicin. Representacin de los orbitales moleculares enlazante y * del etileno Representacin de la distribucin electrnica de los orbitales moleculares del 1,3-butadieno. Interaccin entre el HOMO del 1,3-butadieno y el LUMO del etileno en la reaccin de cicloadicin de Diels-Alder. Interacciones de los OMF en las reacciones de Diels-Alder. Efecto de sustituyentes atrayentes de electrones en el dienfilo, sobre la energa del LUMO. Efecto de sustituyentes dadores de electrones en el dieno, sobre la energa del HOMO. Interacciones estricas entre sustituyentes del dieno. HOMO de un dienfilo nitroso y butadieno. Diagrama ORTEP del compuesto 2. Avance de la reaccin de esterificacin del compuesto 5 con acetato de vinilo, catalizada por lipasa de C.antarctica A. Diagrama ORTEP del compuesto 14. Espectro 1H RMN del compuesto 14. 78 86 88 59 60 64 73 57 49 54 48 47 48 38 40 41 43 45 36 37 33 34 32

Indices Figura 48: Figura 49: Figura 50: Figura 51: Figura 52: Figura 53: Figura 54: Figura 55: Figura 56: Figura 57: Figura 58: Figura 59: Figura 60: Figura 61: Espectro 1H RMN del compuesto 3. Espectro 1H RMN tomado al inicio de la reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14. Espectro 1H RMN tomado a los 60 minutos de reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14. Espectro 1H RMN tomado a las 2 horas de reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14. Espectro 1H RMN tomado a las 48 horas de reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14. log (velocidad inicial) vs. (concentracin inicial). Ln(concentracin aducto) vs. (tiempo). Ln (k1) vs. (1/T). Ln (Keq) vs. (1/T). Consideraciones sobre los coeficientes de contribucin a los Orbitales Moleculares de Frontera de los tomos del dieno y del dienfilo. Regioqumica de la reaccin de Diels-Alder entre tetrametilpurpurogalina y derivados de nitrosobenceno. Espectro 1H RMN del compuesto 4. Espectro 1H RMN del compuesto 19. Efecto de los sustituyentes de la eucarvona sobre el coeficiente de contribucin de los carbonos C-1 y C-4 del dieno al HOMO, y coeficiente de contribucin al LUMO de los tomos del dienfilo. Figura 62: Figura 63: Figura 64: Figura 65: Eucarvona optimizada por AM1. Espectro 1H RMN del compuesto 24 anti. Espectro 1H RMN del compuesto 24 syn. Efecto de los sustituyentes de 5 sobre el coeficiente de contribucin de los carbonos C1 y C4 del dieno al HOMO, y contribucin al LUMO de los tomos del dienfilo Figura 66: Figura 67: Figura 68: Regioqumica de la reaccin de Diels-Alder entre el alcohol 5 y derivados de nitrosobenceno. Espectro 1H RMN del compuesto 28. Compuesto 6 optimizado por AM1. 111 112 113 110 104 105 107 108 100 102 103 99 93 94 94 95 96 92 91 90 89

Indices Figura 69: Regioqumica esperada para la reaccin de Diels-Alder entre (1R,2S)-3-metilciclohexa-3,5-dien-1,2-diol y derivados de nitrosobenceno. Figura 70: Figura 71: Figura 72: Figura 73: Figura 74: Figura 75: Figura 76: Figura 77: Figura 78: Figura 79: Actividad in vitro contra Leishmania donovani. Indice teraputico para Leishmania donovani. Actividad in vitro contra Trypanosoma cruzi. Indice teraputico para Trypanosoma cruzi. Actividad in vitro contra Trypanosoma brucei rhodesiense. Indice teraputico para Trypanosoma brucei rhodesiense. Actividad in vitro contra Plasmodium falciparum. Indice teraputico para Plasmodium falciparum. Actividad in vitro contra Nippostrongylus brasiliensis. Indice teraputico para Nippostrongylus brasiliensis. 114 122 122 125 125 128 128 131 131 134 134

Indices

Indice de Tablas
Pg. Tabla 1: Tabla 2: Tabla 3: Tabla 4: Tabla 5: Tabla 6: Reduccin estereoselectiva de cetonas proquirales con Daucus carota. Condiciones de reaccin para la reduccin estereoselectiva de eucarvona y tetrametilpurpurogalina con Daucus carota. Acetilacin de eucarvol catalizada por lipasas de microorganismos. Condiciones de reaccin para la reduccin de compuestos nitro a nitroso. Velocidades iniciales en funcin de concentraciones iniciales de aducto, para la reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14. Constantes de equilibrio (Keq), constantes de velocidad de las reacciones directa en inversa (k1 y k-1), G y S para la reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14. Tabla 7: Tabla 8: Tabla 9: Tabla 10: Tabla 11: Tabla 12: Tabla 13: Tabla 14: Comparacin de los espectros 1H RMN de los compuestos 4 y 19. 97 101 94 76 77 84 76

Comparacin de los espectros 1H RMN de los compuestos 24 syn y anti. 109 Comparacin de los espectros 1H RMN de los compuestos 26 syn y anti. 109 Datos de actividad contra Leishmania donovani y citotoxicidad. Datos de actividad contra Trypanosoma cruzi y citotoxicidad. Datos de actividad contra Trypanosoma brucei rhodesiense y citotoxicidad. Datos de actividad contra Plasmodium falciparum y citotoxicidad. Datos de actividad contra Nippostrongylus brasiliensis y citotoxicidad. 127 130 133 121 124

Tabla de abreviaturas

Tabla de abreviaturas
Ac AcOEt AcOH ADN Anh. ArCH3 ArH ARN CE50 Ci cm conc. d dd ddd DL50 DMAP DMP EDTA Et EtOH eV Exp. g GC HMG HOMO Hz IE IR acetilo acetato de etilo Acido actico Acido desoxiribonucleico anhidro metilo aromtico hidrgeno aromtico Acido ribonucleico Concentracin efectiva 50 concentracin inicial centmetros Concentrado doblete doble doblete doble doble doblete Dosis letal 50 dimetilaminopiridina dimetoxipropano Acido etilendiaminotetraactico etilo etanol electrn volt Experimental gramo cromatografa de gases hidroximetilglutaril-CoA Highest Occupied Molecular Orbital Hertz Impacto electrnico Infrarrojo

Tabla de abreviaturas J Keq Kg KJ L LUMO M m MeOH mg MHz mL mM mmHg mmol MS N nM NOPh C OMF ORTEP P.F. PGS Ph PM ppm p-TsOH Py RMN s t Constante de acoplamiento constante de equilibrio kilogramo kilo Joule litro Lowest Unoccupied Molecular Orbital molar multiplete metanol miligramo mega Hertz mililitro milimolar milmetros de mercurio milimoles espectroscopa de masas Normal nanomolar nitrosobenceno grados Celsius Orbitales Moleculares de Frontera Oak Ridge Thermal Ellipsoid Program Punto de fusin Procedimiento general de sntesis fenilo peso molecular partes por milln Acido p-toluensulfnico piridina Resonancia Magntica Nuclear singulete triplete

Tabla de abreviaturas T. amb. Teo. THF TMPG TMS g M Temperatura ambiente terico tetrahidrofurano tetrametilpurpurogalina tetrametilsilano microgramo micromolar

1.- Introduccin

Introduccin

Las infecciones parasitarias causadas por protozoarios patgenos afectan a ms de 3000 millones de personas a nivel mundial, y constituyen una enorme carga para la salud y la economa, particularmente de pases subdesarrollados en que son ms prevalentes. Entre los factores que favorecen la aparicin de estas parasitosis, se encuentran las deficiencias sanitarias, gran densidad poblacional, controles inadecuados de vectores parsitos y la resistencia a los frmacos utilizados en quimioterapia y en el control de los vectores. Dentro de las parasitosis causadas por protozoarios, las de mayor incidencia son la malaria, las tripanosomiasis, la leishmaniasis, la amibiasis, la tricomoniasis, y la toxoplasmosis.1 La malaria, causada principalmente por la infeccin con Plasmodium falciparum, y transmitida a travs de la picadura de mosquitos del gnero Anopheles, ha acaparado la atencin porque sin tratamiento causan morbilidad y mortalidad extraordinarias. La enfermedad se extiende mayoritariamente en pases tropicales. En la Figura 1 se muestra un mapa en donde se representan las zonas de mayor incidencia de la enfermedad.

Figura 1

El uso intensivo y extensivo de drogas para combatir la malaria, ha permitido la seleccin de parsitos resistentes. Esto ha frustrado los intentos de erradicar la enfermedad por medio de quimioterapia, y amenaza con volver obsoletas las drogas actualmente utilizadas.2 Se identifican actualmente cepas de P. falciparum resistentes en casi todas las zonas afectadas. La prevalencia cada vez mayor de resistencia a mltiples frmacos ilustra la necesidad ininterrumpida de contar con nuevas drogas activas.

Introduccin

En la dcada de 1980 se retom el estudio de endo-perxidos naturales extrados de plantas utilizadas en la medicina china tradicional. De Artemisia annua L. (Asteraceae) (qinghzosu), se extrajo el metabolito activo artemisinina (Figura 2), producto novedoso con estructura de lactona sesquiterpnica, por completo diferente a los alcaloides del la quina utilizados hasta entonces.3,4 El yingzhaosu A (Figura 2), un perxido natural de estructura diferente a la de la artemisinina, aislado de la planta Artabotrys uncinatus, L. (Annonaceae) y utilizado en la medicina tradicional china, tambin es activo frente a la malaria.5 O H HO H O O O O OH

O O O

yingzaosu A

artemisinina

Figura 2

Los estudios farmacolgicos han establecido que el grupo endo-perxido es imprescindible para la actividad. La interaccin del enlace peroxdico con especies de FeII presentes en la vacuola alimenticia del protozoario, catalizara la generacin de radicales libres citotxicos que seran las especies activas.3,6,7 Si bien esto no est definitivamente demostrado, la hiptesis est slidamente basada en resultados obtenidos a partir de estudios biomimticos.8-10 La actividad derivada del enlace peroxdico de estos perxidos naturales, hace que sea interesante estudiar las propiedades antimalricas de otros perxidos orgnicos y compuestos estructuralmente relacionados. A partir de dienos con estructura de tropolonas como la eucarvona, y benzotropolonas como la tetrametilpurpurogalina, se han sintetizado travs de reacciones de Diels-Alder, perxidos como los compuestos A y B de la Figura 3.11-13 Est ampliamente descrito en la literatura, que dienfilos polares como los compuestos nitroso, dan cicloadiciones similares (compuesto C, Figura 3).14-17
2

Introduccin

O OCH3O H3CO O O H3CO O OCH3 O N O O

(A)

(B)

(C)

Figura 3

Las energas estndar de disociacin de los enlaces peroxdicos (-O-O-) y de los enlaces nitroso (-N-O-), son de 33.2 y 35.8 kcal/mol respectivamente.18 A pesar de que la energa de disociacin de los enlaces puede variar cuando stos forman parte de molculas ms complejas, stos son muy lbiles, y podran ser propensos a sufrir rupturas homolticas. De este modo, las oxazinas podran seguir estos patrones de reaccin (ruptura del enlace -N-O- y generacin de radicales libres) resultando una actividad biolgica del tipo de la de los endoperxidos. Se propuso entonces la sntesis de nuevos compuestos, potenciales antimalricos, tomando como farmacforo gua el grupo perxido y sustituyndolo por su isstero -N-O-, mediante el empleo de reacciones de Diels-Alder. El antecedente directo de este trabajo fue publicado en 2001, en colaboracin de nuestro grupo de trabajo con un grupo de la Universidad de Filadelfia. En l se describe el diseo, sntesis y actividad antimalrica de 12 oxazinas obtenidas por cicloadicin de nitrosobenceno con tri-O-metilpurpurogalina.16 En este trabajo de tesis, se utilizaron como dienos en las reacciones de Diels-Alder tetrametilpurpurogalina (TMPG) (3), eucarvona (4) y sus derivados reducido (5) y acetilado (6), y derivados de (1R,2S)-ciclohexa-3,5-dien-1,2-diol sustituidos en la posicin 6 con metilo, cloro y bromo (Figura 4). Los dienfilos utilizados fueron nitrosobenceno y sus derivados sustituidos en la posicin 4 del anillo aromtico con grupos aldehdo (10), cloro (12) y metilo (13) (Figura 5).

Introduccin

H3CO H3CO H3CO O OCH3 O OH O

OH

Cl OH

Br OH

OH

OH

OH

Figura 4

N O N O N O N O

CHO Cl

10

Figura 5

12

13

Una vez sintetizados los aductos de Diels-Alder, determinada su estructura por espectroscopa de resonancia magntica nuclear de protn y carbono 13, y confirmada por espectroscopa infrarroja, espectrometra de masas, y en algunos casos por difraccin de Rayos X, se realizaron las pruebas de actividad biolgica in vitro. Adems de la evaluacin biolgica de los compuestos como antimalricos contra Plasmodium falciparum, se realizaron pruebas de actividad contra los siguientes protozoarios: Leishmania donovani, Trypanosoma cruzi, y Trypanosoma brucei rhodesiense. Estos ensayos biolgicos se hicieron en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Tropicales del London School of Hygiene and Tropical Medicine, en Londres, Reino Unido. Los compuestos sintetizados fueron evaluados tambin como antihelmnticos, en el Laboratorio de Experimentacin Animal (LEA) de la Facultad de Qumica, Universidad de la Repblica, Montevideo. Estos ensayos se hicieron in vitro con el nematodo Nippostrongylus brasiliensis.
4

2.- Fundamentacin y antecedentes

Fundamentacin y antecedentes

2.1.- Aspectos farmacolgicos

La malaria o paludismo es hoy en da la enfermedad infecciosa ms devastadora que afecta a los seres humanos. Aproximadamente el 40 % de la poblacin mundial vive en reas tropicales de riesgo de malaria. Cada ao, entre 300 y 500 millones de personas sufren ataques agudos de la enfermedad, y entre 500.000 y 3 millones mueren.1,19,20 Si bien es una enfermedad global, la mayor incidencia la tiene el Africa subsahariana.21 Gran parte de la mortalidad se debe a la infeccin por Plasmodium falciparum, que impone el mximo riesgo a sujetos no inmunes y en nios menores de 5 aos.22 Pese a que la malaria ha sido erradicada en muchas partes del mundo, el nmero total de enfermos sigue aumentando. La razn ms importante de esta alarmante situacin es la rpida propagacin de parsitos resistentes a drogas antimalricas disponibles, especialmente a la cloroquina (Figura 7), por lejos la ms frecuentemente utilizada. La resistencia se observ por primera vez en P. falciparum, la especie de plasmodio que causa la malaria humana ms virulenta. Tomando en cuenta el aumento de la resistencia a los antimalricos disponibles, hay gran consenso en que se necesita desarrollar nuevas drogas para combatir la enfermedad.23 Sin embargo este hecho ha sido descuidado a partir de la dcada de 1970, debido a que los mercados potenciales sufren restricciones econmicas importantes. Recin en los ltimos aos, en parte financiado por programas de fondos pblicos, se ha retomado el desarrollo de nuevas drogas antimalricas. La disponibilidad de nuevos datos, gracias a la secuenciacin del genoma del P. falciparum, y a la aplicacin de mtodos modernos de diseo de drogas, promete un significativo avance en la lucha contra la enfermedad.19

2.1.1.- Ciclo vital de los plasmodios causantes de malaria

La malaria en seres humanos es causada por cuatro especies de protozoarios intracelulares del gnero Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale).1 El parsito puede transmitirse por transfusin de sangre infectada, pero la infeccin en seres humanos se da principalmente por la picadura de la hembra de mosquitos del gnero Anopheles. Luego de la picadura de un mosquito infectado, los esporozotos ingresan a la sangre humana (1) (Figura 6). Los parsitos salen rpidamente de la circulacin y se localizan en las clulas hepticas (hepatocitos). All tiene lugar la divisin celular, en la cual se
5

Fundamentacin y antecedentes

multiplican por un factor de entre 10.000 y 30.000. Esto provoca la produccin de miles de merozotos (2) o esquizontes tisulares. Esta etapa de la infeccin es asintomtica, y constituye un perodo de incubacin que se extiende por una semana. Transcurrido este tiempo, se liberan los merozotos de las clulas hepticas e infectan a los eritrocitos en el torrente sanguneo (3). En las especies P. vivax y P. ovale pueden quedar esporozotos remanentes (hipnozotos) en las clulas hepticas. Dentro de los eritrocitos tiene lugar la reproduccin asexuada, que ocurre en ciclos de 48 horas. Los parsitos se desarrollan a travs de estadios anulares (4), tropozotos (5) y esquizontes (6). En el estadio 7, cada esquizonte se divide entre 6 y 24 merozotos eritrocticos (dependiendo de la especie de plasmodio) que se liberan por lisis de los eritrocitos para invadir inmediatamente nuevos glbulos rojos (8). Inducidos por factores de stress, una pequea proporcin de estos estadios sanguneos sufre diferenciacin en gametocitos femeninos (9) y masculinos (10), que son capaces de infectar a un nuevo mosquito, cuando ste ingiere la sangre infectada (11). En el intestino medio del mosquito, los gametocitos femeninos se convierten en macrogametos (12), y los masculinos se dividen en cuatro u ocho microgametos flagelados (13). Los gametos masculino y femenino se fusionan y forman el cigoto (14). Este se transforma en un cigoto mvil (15), penetra en la pared intestinal (16), y se convierte en oocisto, localizndose debajo de la membrana externa del intestino medio (17). El oocisto se divide y produce miles de esporozotos, que se liberan (18) y migran a las glndulas salivales del mosquito (19) para producir una nueva infeccin.24 Una vez que se rompen los esquizontes tisulares en las infecciones por P. falciparum y P. malariae, en el hgado no quedan formas del parsito. Sin embargo, en las infecciones por P. vivax o P. ovale persisten algunos hipnozotos, que pueden producir recadas de la infeccin eritroctica meses o aos despus del ataque primario. La liberacin de los merozotos eritrocticos es la que ocasiona el ataque febril caracterstico de la enfermedad. La periodicidad de las manifestaciones febriles depende y vara segn la especie de parsito infectante. En los casos de P. falciparum, P. vivax y P. ovale se necesitan 48 horas para completar el ciclo de esquizogonia eritroctica. La rotura sincrnica de los eritrocitos infectados y la liberacin de los merozotos en la circulacin ocasionan los ataques febriles en los das 1 y 3, razn por la cual se ha llamado tercianas a estas formas de malaria. En la infeccin por P. malariae, la ezquizogonia necesita casi 72 horas, con lo cual los ataques se producen en los das 1 y 4. Es por esto que a esta infeccin se la conoce como malaria en cuartanas.
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Fundamentacin y antecedentes

Figura 6: Ciclo vital de protozoarios del gnero Plasmodium.25

Fundamentacin y antecedentes Cada especie de Plasmodium posee sus propias caractersticas morfolgicas visibles en un frotis de sangre. La enfermedad causada por cada especie tambin es diferente. P. falciparum causa malaria en tercianas malignas, que es la forma ms peligrosa de la enfermedad en seres humanos. Al invadir los eritrocitos, esta especie genera una parasitemia abrumadora y una infeccin fulminante en individuos no inmunes, quienes sin un tratamiento inmediato, pueden morir. El parsito produce protenas especficas que se incrustan en la membrana celular del eritrocito infectado. Como consecuencia de esta modificacin, los eritrocitos se adhieren a las paredes de capilares pre-venosos, y causan la obstruccin de los vasos. En la malaria cerebral, una complicacin de la enfermedad excepcionalmente peligrosa, la adhesin de los eritrocitos infectados a los vasos sanguneos del cerebro puede causar prdida de conciencia, y es letal si no se trata en forma inmediata. La terapia tarda luego de demostrar la parasitemia, puede culminar en un estado irreversible, y el sujeto puede morir an cuando la sangre perifrica ya no tenga parsitos. Si el tratamiento se emprende en forma temprana, la infeccin suele reaccionar en el trmino de 48 horas a la administracin de antipaldicos adecuados. No obstante, si la terapia es inadecuada, puede recrudecer la infeccin como consecuencia de la multiplicacin de los parsitos que subsistan en la sangre. P. vivax causa malaria en tercianas benignas y produce ataques clnicos menos intensos que los ocasionados por P. falciparum. La infeccin conlleva una cifra menor de mortalidad en adultos no tratados, y se caracteriza por recadas a intervalos irregulares, causadas por las formas hsticas latentes (hipnozotos). P. ovale genera una infeccin poco frecuente cuya periodicidad y recadas son semejantes a las de P. vivax, pero es ms benigna y ms fcilmente curable. P. malariae causa malaria en cuartanas. La infeccin es frecuente en reas tropicales. Las manifestaciones clnicas pueden surgir aos despus de la infeccin, pero son menos frecuentes que luego de la infeccin por P. vivax

2.1.2.- Quimioterapia de la malaria

El abordaje de este tema, se plantear en base a dos aspectos fundamentales: a) b) Clasificacin de los frmacos antimalricos en base al estadio del parsito en el que actan, y de la meta clnica que persigan, y Drogas utilizadas en el tratamiento de la enfermedad.
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Fundamentacin y antecedentes Estos aspectos, se discutirn de acuerdo al siguiente esquema:

a) Clasificacin de los frmacos antimalricos

Esquizonticidas tisulares: Utilizados en profilaxis Utilizados para evitar recadas Esquizonticidas hemticos utilizados en la curacin clnica y de supresin Gametocidas Esporonticidas

b) Drogas utilizadas en el tratamiento de la enfermedad

i) ii) Drogas tradicionales Drogas actualmente establecidas

4-aminoquinolinas y arilaminoalcoholes Antifolatos Derivados de artemisinina Antibiticos Lumefantrina-artemter Atovacuona-proguanil Cloroproguanil-dapsona Pironaridina Tafenoquina Fosfidomicina Nuevos inhibidores de la polimerizacin del hemo Nuevos derivados de artemisinina y otros perxidos Inhibidores de proteasas Inhibidores de la sntesis de cidos grasos Inhibidores de farnesil transferasa Inhibidores de la gliclisis

iii)

Nuevas drogas en uso clnico

iv)

Drogas en desarrollo clnico

v)

Drogas en desarrollo preclnico

vi)

Estructuras lderes an ms novedosas

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Fundamentacin y antecedentes

a) Clasificacin de los frmacos antimalricos

i) Esquizonticidas tisulares utilizados en profilaxis Actan contra las formas hsticas primarias de plasmodios en clulas hepticas, que en el trmino de un mes o menos, iniciaran la etapa eritroctica de la infeccin. Evitan la invasin de los glbulos rojos y as la transmisin de la infeccin. Un ejemplo de droga utilizada para la profilaxis de la malaria por P. falciparum es la cloroguanida (proguanil) (Figura 7). Si bien la primaquina (Figura 7) posee la misma actividad contra P. falciparum, es un frmaco potencialmente txico que se reserva para otras aplicaciones clnicas.

O HN N N NH2 Cl N HN HN HN

NH HN Cl

cloroquina

primaquina
Figura 7

cloroguanida (proguanil)

ii) Esquizonticidas tisulares utilizados para evitar recadas Este tipo de esquizonticidas actan sobre las formas hsticas latentes de P. vivax y P. ovale, que persisten despus de que las formas hepticas primarias pasaron al torrente sanguneo. Los hipnozotos que finalmente maduran, invaden la circulacin, y producen ataques o recadas, meses o aos despus de la infeccin inicial. Este tipo de esquizonticidas se utilizan en la profilaxis terminal, o para la cura radical de infecciones recidivantes. La primaquina es el frmaco prototipo que se utiliza para evitar recadas (trmino reservado para especificar la infeccin eritroctica repetitiva causada por plasmodios tisulares latentes). En la profilaxis terminal se inicia el tratamiento (con un frmaco de este tipo), poco antes o despus de que el individuo salga de un rea endmica. Para una cura radical, se consume el frmaco durante el perodo largo de latencia de la infeccin, o durante un ataque agudo. Se administra conjuntamente con un esquizonticida hemtico (por ejemplo cloroquina), con el objeto de erradicar tambin las etapas eritrocticas.
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Fundamentacin y antecedentes iii) Esquizonticidas hemticos utilizados en la curacin clnica y supresin Los esquizonticidas hemticos actan en las etapas eritrocticas asexuadas de los parsitos, para interrumpir la esquizogonia y terminar as las manifestaciones clnicas (cura clnica). Tambin producen la cura supresiva, que implica la eliminacin completa de los parsitos del cuerpo, por medio de una terapia ininterrumpida. La teraputica inadecuada a base de esquizonticidas sanguneos, puede ocasionar la recrudescencia de la infeccin por esquizogonia eritroctica. Con la excepcin de la primaquina, prcticamente todos los antimalricos utilizados en seres humanos fueron sintetizados por su actividad esquizonticida en sangre. Los medicamentos en cuestin pueden dividirse en dos grupos:

Los de accin rpida, que incluyen los alcaloides como la quinina, mefloquina, halofantrina, (Figura 8) y cloroquina, y los endoperxidos, como la artemisinina (Figura 8) y sus derivados.

Los de accin lenta y por lo tanto, menos eficaces. Entre ellos estn los antifolatos y los antibiticos antipaldicos. Estas drogas se utilizan en general combinadas con otras de accin rpida.

H HO HO O N N CF3 CF3 F 3C Cl N N H H HO N O O O O O H H

quinina

mefloquina

artemisinina
Cl

halofantrina

Figura 8

iv) Gametocidas Los gametocidas actan contra las formas eritrocticas sexuadas de los plasmodios, y as evitan la transmisin a nuevos mosquitos. La cloroquina y la quinina poseen actividad gametocida contra P. vivax, P. malariae y P. ovale, en tanto que la primaquina posee
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Fundamentacin y antecedentes actividad especialmente potente contra P. falciparum. Sin embargo, rara vez se utilizan en seres humanos, antimalricos por su accin gametocida. v) Esporonticidas Los esporonticidas evitan la transmisin de la enfermedad al inhibir la formacin de oocistos y esporozoitos en mosquitos infectados. A pesar de que la cloroquina bloquea el desarrollo normal de plasmodios dentro del moquito, ni ella ni otros antimalricos, se utilizan con este fin en seres humanos.

b) Drogas utilizadas en el tratamiento de la enfermedad i) Drogas tradicionales

La malaria fue de las enfermedades mejor estudiadas en la medicina clsica, hasta mediados del Siglo XX. Hasta ese momento la enfermedad era endmica tambin en algunas regiones de Europa y de Amrica del Norte. La primera tentativa de un tratamiento especfico de la malaria data de principios del Siglo XVIII, y haca uso de la corteza del rbol de la cinchona (Cinchona officinalis), originario de las regiones altas de los Andes en Amrica del Sur. Esta droga, conocida tambin como corteza peruana, de los jesuitas o del cardenal, haba sido utilizada en el tratamiento de fiebres desde principios del Siglo XVII.19 En 1633, un monje agustino llamado Calancha, en Lima, Per, describi por primera vez que el polvo de cinchona administrado en bebidas, curaba las fiebres y las tercianas. Los jesuitas introdujeron la droga en Europa hacia 1640. En publicaciones mdicas de 1643 se menciona por primera vez que el producto se utilizaba para combatir las fiebres. Su aceptacin mdica fue lenta, y el reconocimiento oficial de su actividad se dio recin en 1677, ao en que fue incluida en la farmacopea londinense como Cortex peruanus. Durante casi 2 siglos, esta corteza se utiliz en medicina en forma de polvo, extracto o infusin. En 1820, Pelletier y Caventou aislaron de la corteza, la quinina (Figura 8), compuesto activo en el tratamiento de la malaria, que reemplaz al extracto crudo utilizado hasta el momento. La malaria fue as, la primera enfermedad que se trat con un compuesto qumico puro. En 1891, basado en la observacin de que el azul de metileno (Figura 9) era
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Fundamentacin y antecedentes selectivamente absorbido por parsitos, Paul Ehrlich cur a dos pacientes de malaria con ese colorante. Esta fue la primera vez que una droga sinttica se utiliz en humanos.26 Actualmente se sabe que el azul de metileno inhibe la glutatin reductasa, distorsionando la homeostasis redox del parsito.27,28 En 1925 se sintetiz la pamaquina (Figura 9), por modificacin de la estructura del azul de metileno. Esta 8-aminoquinolina fue la primera droga capaz de prevenir las recadas en la malaria causada por P. vivax.29 En 1932 se desarroll la mepacrina (Figura 9), que result activa frente los estadios eritrocticos de P. falciparum. Ambas drogas fueron extensamente utilizadas durante la 2 Guerra Mundial, especialmente en el Pacfico Sudoccidental.

O HN Cl N S N HN N N Cl N O

azul de metileno

pamaquina

mepacrina

Figura 9

La cloroquina (Figura 7) fue sintetizada recin en 1934 en Alemania, pero no se la utiliz en forma inmediata por ser considerada muy txica. Desde 1943, y como parte de programas de lucha antimalrica en Estados Unidos, se sintetizaron y probaron miles de compuestos de estructura similar, pero la cloroquina mostr la actividad ms promisoria. A partir de esa fecha, se puso a prueba la droga en estudios de campo. Se convirti en el ms efectivo e importante antimalrico, siendo la droga de eleccin en muchos programas que apuntaron a la erradicacin global de la enfermedad. En la tentativa de distribuirla en forma generalizada como profilctico, la cloroquina fue utilizada en Amrica del Sur, Africa y Asia. Posiblemente como resultado de estos programas, a finales de la dcada de 1950 aparecieron los primeros casos de parsitos resistentes a cloroquina. Actualmente, cepas de P. falciparum resistentes a cloroquina (y en algunos lugares tambin P. vivax), son comunes en todas las zonas en que la enfermedad es endmica. Durante la 2 Guerra Mundial, cientficos ingleses

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Fundamentacin y antecedentes desarrollaron la cloroguanida (proguanil), compuesto lder para el posterior desarrollo de pirimetamina (Figura 10) en 1950. NH HN HN

HN

HN

Cl

N H 2N N NH2 Cl

cloroguanida (proguanil)

pirimetamina

Figura 10

De cara a las grandes prdidas causadas por la malaria resistente a cloroquina durante la guerra de Vietnam, el ejrcito norteamericano alent el desarrollo de nuevas drogas, y esto result en el desarrollo de la mefloquina y la halofantrina (Figura 8). A partir de la medicina tradicional china se desarroll un grupo completamente diferente de drogas. La hierba aromtica Artemisia annua L. (Asteraceae) fue utilizada en China durante por lo menos 2000 aos originalmente para el tratamiento de hemorroides, pero desde 1600 tambin en el tratamiento de fiebres. En 1972, el endoperxido artemisinina (qinghaozu, Figura 11), metabolito secundario de la planta, con estructura de lactona sesquiterpnica,30 fue aislado como compuesto activo y demostr tener una potente actividad antimalrica.31 Su estructura y estereoqumica absoluta fueron determinadas, y su sntesis llevada a cabo por Zhou et al. y Xu et al. en 1986,32,33 pero su ruta biosinttica y sus mecanismos de regulacin an no se conocen. Actualmente, se administran derivados de artemisinina para el tratamiento de la malaria, en particular en el Sudeste Asitico.
H H

- -

O O O O

artemisinina
Figura 11

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Fundamentacin y antecedentes Desde 1920 se realizan ensayos biolgicos de rutina para drogas antimalricas en canarios infectados con el parsito de aves P. relictum.34 En 1935, P. relictum se reemplaz por P. gallinaceum, que infecta pollos de pocos das de vida. Desde el descubrimiento del parsito de roedores P. berghei se utilizan modelos de malaria murina en forma ms frecuente, y actualmente representan los ms importantes sistemas de tests in vivo para nuevas drogas.19 Los estudios in vivo con modelos de animales contra especies de plasmodios que infectan a humanos, slo se pueden llevar a cabo en monos, y por esto son de acceso limitado. El primer cultivo in vitro del parsito humano P. falciparum se obtuvo 1976 en un medio de cultivo nutritivo suplementado con eritrocitos humanos. Este adelanto se convirti en una metodologa requerida para la evaluacin de la actividad antimalrica de un gran nmero de compuestos.35 Tambin se han aplicado metodologas de biologa molecular en la investigacin de terapias contra la malaria, algunas veces con dificultades, como consecuencia del contenido excepcionalmente alto de las bases adenina y timina de los residuos de ADN del P. falciparum. En particular, la expresin de genes recombinantes de P. falciparum en E. coli ofrece frecuentemente dificultades. No obstante, recientemente se ha secuenciado el genoma completo de P. falciparum.36 Se estima que estos datos sern tiles para la identificacin de nuevos blancos para nuevas drogas. La alta incidencia de la resistencia a cloroquina y a las combinaciones anti-folato de uso frecuente, es la principal razn de la progresiva generalizacin de la malaria. La actual quimioterapia alternativa es prcticamente inabordable para los pases ms seriamente afectados. Entre los factores adicionales que contribuyen al deterioro de la situacin de la malaria, hay que mencionar el colapso de los programas de control (la resistencia del mosquito Anopheles al DDT -diclorodifenil tricloroetano-), la migracin de las poblaciones, y los cambios climticos y ambientales.37 Adems, el inters industrial y militar en el desarrollo de nuevas drogas antimalricas comenz a disminuir a partir de mediados de la dcada de 1970. A pesar de las actividades de investigacin que estn actualmente en curso, no se dispondr en un futuro cercano de una efectiva vacunacin contra la malaria.19 Por lo tanto, el desarrollo quimioterpicos contra la enfermedad, que sean efectivos, seguros y econmicamente accesibles, constituye una necesidad urgente.
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Fundamentacin y antecedentes

ii) Drogas actualmente establecidas

4-aminoquinolinas y arilaminoalcoholes Las 4-aminoquinolinas son estructuras derivadas de la quinina. A pesar de su eficacia y tolerancia relativamente bajas, la quinina an juega un rol importante en el tratamiento de malarias multirresistentes. Si bien se ha logrado la sntesis de la quinina,38-43 la misma es compleja, por lo cual hasta el da de hoy ste y otros alcaloides relacionados se obtienen de las fuentes naturales. La cinchona contiene una mezcla de ms de 20 alcaloides, de los cuales los ms importantes son dos pares de ismeros pticos: quinina - quinidina y cinconina cinconidina. La quinina y la quinidina difieren en la configuracin del carbono que soporta al grupo hidroxilo. Esta estereoqumica tiene escasa importancia en la relacin estructura-actividad del compuesto. La quinidina es ms potente como antimalrico, y ms txico que la quinina.1 Los alcaloides naturales relacionados con la quinina, y los productos semisintticos derivados de ella, difieren entre s ms que nada en la naturaleza de los sustituyentes de la cadena lateral. Cada modificacin en la estructura qumica de la quinina ocasiona cambios cuantitativos pero no cualitativos, en las acciones farmacolgicas de los compuestos resultantes. La mefloquina es un ejemplo de droga ms activa y menos txica, producto de modificaciones estructurales a la quinina. La droga acta fundamentalmente como esquizonticida eritroctico y tiene poco efecto en los esporozotos o en las formas preeritrocticas de los parsitos. Tambin es gametocida contra cepas de P. vivax y P. malariae, pero no contra P. falciparum. Debido a este espectro de actividad, la droga no se utiliza como profilctico. Como frmaco supresor y teraputico es ms txico y menos eficaz que la cloroquina para los parsitos sensibles a ambas drogas. Por su parte, la quinina es especialmente til en el tratamiento de la enfermedad grave causada por cepas de P. falciparum resistentes a cloroquina y mltiples frmacos. Debido en particular a su alta solubilidad, se la usa en formulaciones intravenosas en malaria severa, cuando el paciente no es capaz de tolerar medicacin oral. A pesar de su posible toxicidad, sigue siendo el esquizonticida eritroctico prototpico para el tratamiento supresor y para la cura la malaria por P. falciparum resistente a cloroquina y mltiples frmacos. El mecanismo de accin de la quinina es similar al de otros antimalricos quinolnicos; En general se acepta que la actividad antimalrica de estas droga est estrechamente ligada al
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Fundamentacin y antecedentes metabolismo del grupo hemo en el parsito. Las mismas interfieren con la detoxificacin del hemo libre, que se genera durante la degradacin de la hemoglobina.44,45 Predominantemente en tropozotos y en estadios esquizontes tempranos, el parsito ingiere la hemoglobina con el citoplasma de los eritrocitos del husped, por un mecanismo similar a la fagocitosis, y la transporta al centro de su vacuola alimenticia (Figura 12).
Membrana eritroctica

Vacuola alimenticia
Polimerizacin de hemo Degradacin de hemoglobina

Mitocondria
Transporte de electrones

Apicoplasto Citoplasma
Metabolismo del folato Farnesilacin de protenas Gliclisis Sntesis de isoprenoides Sntesis de cidos grasos

Figura 12: Representacin esquemtica de un eritrocito infectado con P. falciparum, que indica la localizacin subcelular de los diferentes potenciales blancos de drogas.

Dentro de la vacuola, la hemoglobina se degrada a molculas pequeas que son transportadas al citoplasma del parsito. La molcula de hemo liberada durante la degradacin de la hemoglobina se oxida rpidamente de FeII a FeIII, para dar ferriprotoporfirina IX. Esta ferriprotoporfirina IX, potencialmente txica para el parsito, inhibe la actividad de varias enzimas y tiene propiedades membranolticas, desestabilizando las membranas por facilitar intercambios inicos a travs de ellas.44,45 Para la detoxificacin del grupo hemo, el parsito ha desarrollado dos estrategias: una es la conversin de ste a hemozona, pigmento cristalino inerte e insoluble, y la otra es su descomposicin. Actualmente se sabe que la hemozona es una forma cristalina, sin embargo el mecanismo por el cual se forma se conoce como polimerizacin del hemo. Estudios recientes sugieren que las dos rutas operan en forma simultnea, pero difieren en la eficiencia.46-48 Se estima que entre el 25 y el 30 % del hemo liberado se convierte en hemozona, y el resto se degrada. En esta degradacin, es hemo es destruido por glutatin reducido, dentro del citoplasma del parsito.46 Si estos mecanismos de detoxificacin son inhibidos, el hemo txico se acumula, y la droga se enlaza a l con una estequiometra de 1:2, formando complejos droga-hemo que se adhieren a las membranas.47,48 Hay datos convincentes de que ambas, la polimerizacin y la degradacin oxidativa del hemo
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Fundamentacin y antecedentes dependiente de glutatin, son inhibidas por las 4-aminoquinolinas. Est menos claro que ste tambin pueda ser el mecanismo de accin de los arilaminoalcoholes.49 Famin et al. sostienen que hay evidencia de que la mefloquina y la quinina inhiben la captura de la hemoglobina de las clulas del husped.50 La cloroquina es una 4-aminoquinolina sinttica, altamente efectiva contra parsitos sensibles, y generalmente bien tolerada. Es la droga antimalrica ms frecuentemente utilizada actualmente debido a sus muy bajos costos de produccin. Sus dos enantimeros tienen igual potencia contra la malaria en aves, pero en mamferos, el ismero (+) es menos txico que el (-). El cloro en posicin 7 del anillo quinolnico confiere la mxima actividad al compuesto. La cloroquina es muy eficaz contra las formas eritrocticas de P. vivax, P. malariae, P. ovale y cepas de P. falciparum sensibles e ella. Ejerce actividad contra gametocitos en las primeras 3 especies de plasmodios, pero no contra los de P. falciparum. El frmaco es inactivo frente a las formas tisulares latentes de P. vivax y P. ovale, por lo que no elimina infecciones por dichas especies. La amodiaquina (Figura 13), relacionada estructuralmente con la cloroquina, ha tenido un uso limitado desde mediados de la dcada de 1980, luego de que se la asociara con ocasionales casos de agranulocitosis en viajeros que la tomaban como profilctico. A pesar de eso, por mantener un alto grado de eficacia contra casi todos los parsitos resistentes a cloroquina, su uso se ha visto recientemente incrementado.23 HN

OH N

Cl

amodiaquina

Figura 13

La mefloquina y la halofantrina (Figura 8) son arilaminoalcoholes, estructuralmente muy similares a la quinina. La mefloquina es considerada un agente teraputico estndar para malaria resistente a cloroquina. Es semejante estructuralmente a la quinina. Surge en 1963 como un frmaco prometedor para combatir cepas de P. falciparum resistentes a cloroquina.

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Fundamentacin y antecedentes Mostr actividad antimalrica en modelos de animales y en estudios clnicos en seres humanos, se advirti que la droga era un producto inocuo y altamente eficaz contra cepas de P. falciparum multirresistentes.51 Existe como una mezcla de 4 ismeros pticos que tienen todos casi la misma potencia antimalriaca. Es muy eficaz como esquizonticida eritroctico, en particular contra tropozotos maduros y formas esquizontes. No posee actividad en las etapas hepticas tempranas, contra gametocitos maduros de P. falciparum, ni contra formas tisulares latentes de P. vivax. Tiene una moderada actividad esporozonticida pero no se utiliza en seres humanos para este fin. Su mecanismo exacto de accin se desconoce. Como esquizonticida eritroctico se comporta igual la quinina en muchos aspectos, pero no se intercala en el ADN del parsito.52 Ambos compuestos generan cambios morfolgicos semejantes en las etapas anulares eritrocticas tempranas de P. falciparum y P. vivax. La principal anormalidad ultra estructural producida por la droga en el parsito, es la turgencia de las vacuolas alimenticias.1 A semejanza de cloroquina, en pequeas concentraciones aumenta el pH intravacuolar de los plasmodios, lo que sugiere que la droga, de caractersticas bsicas, se concentra en la vacuola alimenticia. A diferencia de la cloroquina y la quinina, esta droga no inhibe la polimerizacin del hemo (a pesar de que posee gran afinidad por el hemo libre),53,54 sino que formara con ste complejos txicos que se adhieren a las membranas del parsito, y que interactan con otros componentes intracelulares.55 Algunas cepas de P. falciparum muestran resistencia a mefloquina. Por este motivo, la droga se recomienda actualmente para su uso en forma exclusiva en profilaxis y quimioterapia de la malaria por P. falciparum resistente a cloroquina y a mltiples frmacos. La droga se suministra por va oral, lo que constituye una desventaja importante en enfermos agudos. De todos modos, su uso est limitado por su alto costo y por la aparicin de algunos efectos secundarios neurosiquitricos.56 La halofantrina surge en la dcada de 1960, en respuesta a la urgencia de combatir la malaria frmaco-resistente, convirtindose en la droga ms prometedora de la serie de metanoles fenantrnicos.1 Es ms efectiva que la mefloquina, y se utiliza como alternativa a sta y a la quinina para combatir ataques agudos causados por P. falciparum resistentes a mltiples frmacos. Los dos enantimeros de halofantrina son igualmente activos frente a infecciones por P. berghei en ratones,57 y contra P. falciparum in vitro.58 El racemato acta slo en fases eritrocticas asexuadas. Su espectro incluye cepas de P. falciparum sensibles a cloroquina, y resistentes a sta y a mltiples frmacos. Los parsitos ms maduros son
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Fundamentacin y antecedentes particularmente vulnerables a esta droga. No ataca a las formas tisulares latentes de P. vivax ni a los gametocitos de ninguna especie de plasmodio. En cuanto a su mecanismo de accin an no se conoce exactamente.1 En la actualidad, su utilizacin ha sido fuertemente restringida debido a su potencial induccin de arritmia cardaca.59 Adems, muestra resistencia cruzada con la mefloquina. Antifolatos Junto con la cloroquina, la combinacin antifolato sulfadoxina-pirimetamina (Fansidar) son las medicaciones ms frecuentemente utilizadas contra la malaria (Figura 14).59 O O S O H N N O N H 2N N NH2 N Cl

sulfadoxina

pirimetamina

Figura 14

Por su capacidad conocida de antagonizar a los cidos flico y folnico durante el crecimiento de Lactobacillus casei, fueron evaluadas diversas diaminopirimidinas contra varios microorganismos patgenos.1 Varias 2,4-diaminopirimidinas, incluida la pirimetamina, mostraron una notable actividad antipaldica en modelos animales. Ms tarde se observ que la pirimetamina era especialmente eficaz contra plasmodios que afectan a seres humanos. La combinacin antifolato pirimetamina-sulfadoxina se ha utilizado ampliamente en profilaxis y supresin la malaria en humanos, sobre todo en infecciones causadas por cepas de P. falciparum resistentes a cloroquina. La pirimetamina inhibe la dihidrofolato reductasa, mientras que el componente sulfonamida, la sulfadoxina, inhibe la dihidropteroato sintasa, una enzima adicional del metabolismo del folato. La combinacin acta como esquizonticida de la fase eritroctica. Si bien lo hace en forma lenta, es una droga potente porque acta directamente en los parsitos y tiene una vida media prolongada. Sin embargo, esta combinacin de drogas no muestra una notable eficacia contra las formas hepticas de
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Fundamentacin y antecedentes P. falciparum. A dosis teraputicas no erradica las formas tisulares latentes de P. vivax ni los gametocitos de ninguna de las especies. En la dcada de 1960 se describi que las 2,4-diaminopirimidinas inhiben la dihidrofolato reductasa de los plasmodios a concentraciones inferiores a las necesarias para producir una inhibicin similar de las enzimas de mamferos.60 Tambin se supo que la dihidrofolato reductasa de los plasmodios, difiere de las de los mamferos, en que posee adems, actividad de timidato sintasa. La sinergia entre las pirimetaminas y las sulfonas se explica por la inhibicin de las dos fases de esta ruta metablica esencial.61 Estas dos fases son la utilizacin del cido dihidropteroico, que es bloqueado por las sulfonamidas y la reduccin del dihidrofolato a tetrahidrofolato, a su vez inhibida por la pirimetamina. El bloqueo generado por los antifolatos se manifiesta tardamente en el ciclo vital del parsito porque no permite la divisin nuclear en el momento de la formacin de esquizontes en eritrocitos o el hgado del husped. El mecanismo en cuestin es compatible con la lenta accin de este tipo de drogas, en comparacin con los antipaldicos quinolnicos. Cuando esta combinacin se utiliza en forma excesiva, los parsitos desarrollan rpidamente resistencia a la droga. Esta resistencia surgi en Indochina, y se ha diseminado rpidamente, excepto en zonas de Africa en donde la poblacin local la utiliza solamente para suprimir ataques de malaria por cepas resistentes a cloroquina, y no como profilctico. Puede aparecer hipersensibilidad al componente sulfonamida cuando se la utiliza en regmenes profilcticos, por lo que la aprobacin de su uso ha sido negada en varios pases industrializados. Otra droga de uso frecuente, sintetizada en 1945 en Inglaterra, es la cloroguanida (Proguanil), que se transforma en su metabolito activo cclico cicloguanil, potente triazina inhibidora de dihidrofolato reductasa a travs de una reaccin dependiente de citocromo P 450 (Figura 15). Esta droga es bien tolerada, pero no es muy eficaz cuando se la utiliza como monoterpico. Posee actividad profilctica y supresiva en la malaria por P. falciparum. Controla el ataque agudo y suele erradicar la infeccin. Suprime los ataques agudos de paludismo por P. vivax, pero como no ataca las formas exoeritrocticas de dicho parsito, poco despus de interrumpido el tratamiento, suelen surgir las formas eritrocticas. La administracin de la droga no destruye la fase eritroctica del parsito, pero impide el desarrollo normal de los gametos fecundados y enquistados en el intestino del mosquito.

21

Fundamentacin y antecedentes El metabolito activo triazina inhibe selectivamente la timidato sintasa de los plasmodios sensibles, con lo que bloquea la sntesis de ADN. Este mecanismo explica la accin ms lenta de estos antifolatos comparados con los antimalricos quinolnicos. Es frecuente la administracin del proguanil en combinacin con la cloroquina.56 NH HN NH2 N HN HN Cl

HN

citocromo P 450

H2N N

Cl

cloroguanida (proguanil)

cicloguanil

Figura 15: Conversin de proguanil en su metabolito activo cicloguanil

Esta combinacin constituye una alternativa inocua en la profilaxis de la malaria por P. falciparum. En zonas en que se usa en forma extensiva, surgen rpidamente cepas resistentes a la cloroquina, aunque pueden haber tambin brotes infecciosos por una ineficiente conversin de la cloroguanida en su metabolito activo.62 Derivados de artemisinina Adems de la artemisinina, los derivados semisintticos dihidroartemisinina, artemter (ter metlico), arteter (ter etlico) y artesunato (hemisuccinato) (Figura 16), han sido utilizados como antimalricos en forma creciente en los ltimos 20 aos.63-65 Estas drogas se metabolizan a dihidroartemisinina, el compuesto biolgicamente ms activo de la serie. Los derivados de artemisinina actan ms rpidamente que otros antimalricos, con un tiempo de despeje de parsitos y fiebre de aproximadamente 32 horas, en contraste con los 2 3 das que necesitan otros para resolver la sintomatologa.66 Adems, las artemisininas son activas frente a los estadios parasitarios sexuados (gametocitos), que son los responsables de la infeccin de mosquitos Anopheles, y as, de la transmisin de la enfermedad. Por ser de corta vida media en plasma, con estas drogas se necesita un tratamiento de 5 a 7 das para la eliminacin total de los parsitos. Con el fin de acortar la duracin de estos tratamientos para impedir el desarrollo de resistencia, las artemisininas se combinan habitualmente con otras drogas de vida media ms
22

Fundamentacin y antecedentes prolongada. En algunas partes de Tailandia, por ejemplo, se recomienda como terapia habitual una combinacin de mefloquina con artesunato.23 Tambin ha aumentado la importancia de la aplicacin rectal de artesunato en nios pequeos con malaria severa, cuando la aplicacin intravenosa de quinina no es viable por razones mala infraestructura mdica. Sin tener en cuenta los efectos neurotxicos y embriotxicos que se han registrado en experimentos con animales a altas dosis, la aplicacin de artemisininas en seres humanos parece ser muy segura. En 2.000.000 de pacientes tratados hasta el momento, solamente se han descrito 2 casos de reacciones de hipersensibilidad severas.67
H H

O O O O HO

H H

O O O O O H

O O O O H H O

COOH O

dihidroartemisinina

artesunato

O O O O O

artemisinina

O O O O O

H H

artemter
Figura 16: Artemisinina y sus derivados de uso clnico.

arteter

El mecanismo de accin de las artemisininas ha sido centro de debate durante las dos ltimas dcadas.68-71 Una de las opciones propuestas es que la actividad de estos endo-perxidos se basa en la ruptura del enlace peroxdico luego del contacto con el complejo hemo-FeII en el interior de la vacuola alimenticia del parsito (Figura 12). De este modo, se generan radicales libres capaces de alquilar la molcula de hemo.7,68-71 A travs de este mecanismo, la detoxificacin del hemo libre se puede inhibir de modo similar al proceso asumido para las 4-aminoquinolinas (Figura 17).72 Adems, la alquilacin de protenas esenciales para el parsito puede contribuir a la actividad antimalrica.73

23

Fundamentacin y antecedentes

FeIII O O O O O H H hemo FeII O O O O O H H O H2 C O HO O O H NH H hemo N HN O O HO O O HOOC COOH N H H

artemisinina

Figura 17: Mecanismo hipottico propuesto para la alquilacin radicalaria del grupo hemo por artemisinina.

Antibiticos Muchos antibiticos, conocidos por su actividad antibacteriana, exhiben tambin actividad antimalrica. Su modo de accin se basa en el hecho de que los parsitos de la malaria, similares a otros del gnero Apicomplexa, poseen un inusual organelo de tipo plasto, denominado apicoplasto (Figura 12).74 En el curso de la Evolucin, parece haber sido adquirido por endosimbiosis con un alga unicelular. El cloroplasto del alga perdi su actividad fotosinttica para cumplir funciones metablicas diferentes, como la sntesis de isoprenoides y de cidos grasos.75 Este apicoplasto contiene un genoma residual que codifica ARNt, ARNr, ARN polimerasas, y protenas ribosomales. Por esta razn, el genoma del apicoplasto es totalmente responsable de la autorreplicacin del organelo. Todas las enzimas involucradas en los procesos metablicos que ocurren dentro del apicoplasto son codificadas por el genoma nuclear, y transportadas al apicoplasto por medio de una secuencia especfica de reconocimiento amino-terminal. Los antibiticos actan mediante de la inhibicin de la sntesis de ARN (rifampicina) y de protenas (tetraciclinas, macrlidos, lincosaminas) (Figura 18) en el interior del apicoplasto.76 Adems, se sabe que las tetraciclinas tambin inhiben la sntesis de protenas mitocondriales del parsito.76 Las funciones metablicas del apicoplasto no se ven afectadas inmediatamente luego de la administracin estos antibiticos, sino que impiden que se siga replicando el organelo. Como consecuencia de esto, los parsitos mueren, con un caracterstico retardo de los patrones cinticos del segundo ciclo de replicacin, luego de la exposicin a la droga. No se observa la disminucin de los sntomas hasta 4 das de comenzado el tratamiento con el antibitico.77 Debido a su efecto lento, los antibiticos solamente se aplican en profilaxis o en combinacin con otras drogas de accin rpida.
24

Fundamentacin y antecedentes

O O O

HO OH O NH N O OH N OH O OH O O NH2 N N H H

OH

OH

O O

OH

OH

doxiciclina rifampicina
N N Cl HO OH OH O O S OH OH O OH O HO O O O N

H N O

OH

clindamicina

azitromicina

Figura 18: Antibiticos utilizados en el tratamiento de la Malaria.

En la prctica, la doxiciclina (Figura 18) es el antibitico ms frecuentemente utilizado como terapia antimalrica, tanto solo en profilaxis, como en combinacin (habitualmente con quinina o artesunato) para el tratamiento de casos de multiresistencia.56 Debido a que la doxiciclina est contraindicada en nios pequeos y mujeres embarazadas por su potencial responsabilidad en reacciones de fotosensibilizacin, la clindamicina (Figura 18), representa una alternativa efectiva.78 Tambin se encontr que la azitromicina (Figura 18) es un profilctico efectivo contra la malaria causada por P. vivax.

iii) Nuevas drogas en uso clnico

Lumefantrina-artemter Recientemente se incorpor al mercado la combinacin lumefantrina-artemter (Figura 19) para el tratamiento de malaria sin complicaciones causada por P. falciparum.19 La estructura de lumenfantrina, incluye un arilaminoalcohol, y es similar a la de la halofantrina. La lumefantrina fue desarrollada hace 20 aos por parte del ejrcito chino, y no existen datos clnicos sobre su eficacia como monoterpico. Es menos efectiva que la halofantrina, pero
25

Fundamentacin y antecedentes como contrapartida no induce efectos cardiotxicos como esta ltima.79 Tampoco se observan efectos secundarios neurolgicos con la combinacin, a pesar de ser esperables, por los efectos colaterales conocidos del artemter. El efecto sinrgico de la combinacin est potencialmente causado por la interferencia de
80

ambos

componentes

con

la

hemo-detoxificacin dentro de la vacuola alimenticia.

La eficacia de estas dos drogas

utilizadas en forma combinada parece debilitarse por resistencia cruzada con mefloquina. Por lo tanto, la dosificacin adecuada no est clara, an en reas de complicada resistencia.81
HO Cl Cl

N O O O O O Cl H H

artemter
Figura 19

lumefantrina

Atovacuona-proguanil Otra droga que recientemente ha sido aprobada para el tratamiento y profilaxis de la malaria sin complicaciones causada por P. falciparum, es la Malarona, una combinacin de atovacuona (Figura 20) y proguanil.82 La dihidronaftoquinona atovacuona (Figura 20), inhibe el transporte de electrones en la mitocondria, a travs del complejo citocromo c reductasa.83 Cuando la atovacuona se utiliza sola, la resistencia emerge rpidamente, debido a una mutacin del gen citocromo b localizado en el genoma mitocondrial.84 El problema se solucion combinando la droga con cloroguanida. Aparentemente, la droga responsable del notable efecto sinrgico de esta combinacin no es el cicloguanil sino la cloroguanida, pese a que la actividad antimalrica de la droga sin metabolizar es muy baja.85 Se sabe muy poco sobre el mecanismo intrnseco de esta interaccin sinrgica. Srivastava y Vaidya sugieren que el proguanil provoca la cada del potencial de la membrana mitocondrial que ya fue inducido por la atovacuona.86

26

Fundamentacin y antecedentes

O O H 10 O O Cl

ubiquinona
NH HN HN HN HN Cl

OH O

cloroguanida (proguanil)

atovacuona
Figura 20: Atovacuona, proguanil y ubiquinona, el transportador natural de electrones.

El uso de esta combinacin contra los estadios hepticos, es particularmente ventajosa como profilctico, dado que el parsito muere antes de que se haya establecido la infeccin eritroctica.87 A pesar de ello, su eficacia a largo plazo parece estar limitada, ya que se han documentado casos de fallas del tratamiento por mutacin del gen citocromo b.88

iv) Drogas en desarrollo clnico

Cloroproguanil-dapsona Se est desarrollando una combinacin de cloroproguanil con dapsona (Figura 21), como reemplazo de sulfadoxina-pirimetamina.89
NH HN HN HN Cl HN Cl H 2N O S O NH2

cloroproguanil
Figura 21

dapsona

El cloroproguanil se transforma en clorocicloguanil, un inhibidor de la dihidrofolato reductasa del parsito, del mismo modo en que la cloroguanida se transforma en cicloguanil. La dapsona, que se utiliza para el tratamiento de la lepra desde 1943, acta en forma similar a
27

Fundamentacin y antecedentes la sulfadoxina, como inhibidor de la dihidropteroato sintasa. Ambos componentes son de bajo costo, y estn relativamente bien estudiados. Una potencial ventaja de esta combinacin es la corta vida media en plasma de ambas drogas. De este modo, los parsitos estn expuestos a concentraciones subteraputicas de la droga slo por poco tiempo, desterrando as la emergencia de parsitos resistentes. Estudios clnicos mostraron que la resistencia a esta combinacin se genera mucho ms lentamente que la resistencia a pirimetaminasulfadoxina.90,91 Estudios realizados en Tanzania y Malawi, demostraron que en la mayora de los casos, esta combinacin es efectiva contra parsitos resistentes a sulfadoxinapirimetamina.92 Por el contrario, en estudios clnicos en Tailandia, se vio que la eficacia de la combinacin fue muy baja.93 El motivo fue la aparicin de especies de parsitos con una mutacin en la dihidrofolato reductasa, que gener resistencia al cloroproguanil en el Sudeste Asitico. Adems de la aprobacin de la combinacin cloroproguanil-dapsona en un futuro cercano, se est desarrollando una combinacin cloroproguanil-dapsona-artesunato como alternativa para disminuir el desarrollo de resistencia.94 Pironaridina La 9-anilinoacridina pironaridina (Figura 22), es similar estructuralmente a la mepacrina, la cloroquina y la amodiaquina. La droga fue desarrollada en China, y se registr en ese pas en la dcada de 1980. Es claramente la ms activa de las drogas con estructura de 4-aminoquinolina, y adems es eficiente frente a parsitos resistentes a la cloroquina. Acta a inhibiendo de la polimerizacin del hemo, en forma similar a otras 4-aminoquinolinas. La eficacia de la pironaridina ha sido probada en estudios clnicos llevados a cabo en Camern y Tailandia. En Camern, un tratamiento de 3 das dio como resultado una cura del 100 % en adultos y nios.95 A modo de comparacin, la cloroquina fue empleada como droga competidora, y fue efectiva nicamente en un 44 % de los adultos y en un 40 % de los nios. Trabajos recientes apuntan al desarrollo de una combinacin de pironaridina con artesunato. Los resultados in vitro demuestran un efecto sinrgico de pironaridina con derivados de la artemisinina.19

28

Fundamentacin y antecedentes

N OH

HN N O

Cl

pironaridina

Figura 22

Tafenoquina La tafenoquina es un derivado de las 8-aminoquinolinas primaquina y pamaquina (Figura 23), producto de una optimizacin racional de sus estructuras.
CF3 O O N HN NH2 HN

O O

N N

N HN

O NH2

primaquina

pamaquina

tafenoquina
Figura 23: Drogas con estructura de 8-aminoquinolinas.

La primaquina fue el primer antimalrico 8-aminoquinolnicos utilizado en seres humanos, sintetizado en base a la actividad y estructura del azul de metileno.1 Se la utiliza desde 1940 para la erradicacin de los estadios hepticos de P. vivax y P. ovale.96 Es por ello que posee gran utilidad clnica en la cura radical de malarias recidivantes. Como consecuencia de su actividad, tambin se la puede utilizar como profilctico. Adems, inhibe la maduracin de los gametocitos frtiles. El frmaco por s solo no suprime los ataques agudos por P. vivax, a pesar de ser activo frente a sus etapas eritrocticas. Tiene actividad en las etapas hepticas de
29

Fundamentacin y antecedentes P. falciparum, pero es ineficaz en dosis viables en los estadios eritrocticos del parsito. Por este motivo no se la utiliza para combatir la enfermedad causada por dicha especie. Las 8-aminoquinolinas poseen un importante efecto gametocida contra las cuatro especies de plasmodios que infectan al ser humano, y en particular sobre P. falciparum. No se cuenta todava con mtodos para conservar in vitro cepas de P. vivax, y es por esto que se conoce poco sobre el mecanismo de accin de las 8-aminoquinolinas, dado que son mucho ms activas contra las formas tisulares y los gametos que contra las formas eritrocticas asexuadas de los parsitos. La primaquina se reserva para la profilaxis y para la cura radical de las malarias recidivantes de P. vivax y P. ovale, dada su actividad preponderante contra formas tisulares latentes de estos plasmodios. Algunas cepas de P. vivax muestran resistencia parcial a la primaquina, lo cual obliga a reconocer la necesidad de la sntesis de nuevos frmacos con propiedades diferentes. El problema de la toxicidad ha llevado tambin a usar la primaquina en forma restringida. La optimizacin racional de su estructura condujo a la sntesis de la tafenoquina, que es en general menos txica y tiene una mayor vida media en plasma (aproximadamente 2 3 semanas).19 Tambin es activa frente a los estadios sanguneos del parsito y contra cepas multirresistentes, y en particular, contra las resistentes a la cloroquina. El mecanismo de accin de las 8-aminoquinolinas no es conocido. La actividad de la tafenoquina contra estadios eritrocticos, posiblemente resida en la inhibicin de la polimerizacin del hemo, por un mecanismo similar al de las 4-aminoquinolinas. Para la actividad contra los estadios hepticos y gametocticos, parece haber un mecanismo alternativo. Potencialmente, los procesos mitocondriales son afectados por la generacin de metabolitos txicos.19 En varios estudios clnicos fue demostrada la actividad profilctica de la tafenoquina, as como la eliminacin de hipnozotos de clulas hepticas para la cura radical de infecciones por P. vivax.97,98 La mayor desventaja de las 8-aminoquinolinas es la induccin de la anemia hemoltica en sujetos con deficiencia de Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD). La incidencia de esta anomala gentica es particularmente alta en zonas en donde la malaria ha sido endmica por aos. El riesgo de anemia hemoltica con primaquina en pacientes con deficiencia de G6PD est bien establecido. Tambin se observ una respuesta hemoltica en 2 pacientes con
30

Fundamentacin y antecedentes deficiencia de G6PD, que accidentalmente recibieron tafenoquina, uno de los cuales necesit transfusin sangunea.19 Fosmidomicina La fosmidomicina (Figura 24), es un inhibidor de 1-Desoxi-D-xylulosa-5-fosfato (DOXP) ismero reductasa. Esta es una enzima del parsito recientemente descrita, que resulta clave en una ruta biosinttica de isoprenoides independiente de mevalonato, tambin utilizada por bacterias y plantas superiores (ruta DOXP, ruta MEP o ruta Rohmer) (Figura 25). Las enzimas de esta ruta metablica estn localizadas dentro del apicoplasto del parsito.99,100
OH N O O P O OH O OH Na N O P O OH

Na

fosmidomicina

FR900098

OH N O

O P O O O O

OH N

O P O O O O

O O

prodroga FR900098

prodroga FR900098

Figura 24: Fosfidomicina y derivados

En animales y seres humanos, la sntesis de isoprenoides se da a travs de la ruta del mevalonato. Para la conversin de 1-desoxi-D-xylulosa-5-fosfato (DOXP) en 2-C-metil-D-eritritol4-fosfato (MEP) catalizada por la ismero reductasa, y su bloqueo por el inhibidor fosfidomicina, se propone el siguiente mecanismo: el carbonilo y el grupo hidroxilo vecinal de DOXP forman un complejo con un in metlico divalente (M), que puede ser Mg+2 o Mn+2, en el sitio activo de la enzima, antes de que DOXP se transforme en MEP por un rearreglo intramolecular, y la concomitante reduccin con NADPH (Figura 26).
31

Fundamentacin y antecedentes La fosmidomicina se aisl como un antibitico natural de Streptomyces lavendulae en la dcada de 1970. Posteriormente se evalu en estudios de Fase II para el manejo de infecciones bacterianas, y luego se abandon su desarrollo.101 El hecho de que la fosfidomicina fuera un inhibidor competitivo de la DOXP, se conoci en 1998.99,102,103 La droga demostr ser bien tolerada, con la aparicin de leves efectos colaterales de tipo gastrointestinal, posiblemente relacionados con su actividad antibacteriana.104

Humanos Ruta del mevalonato acetil-CoA

P. falciparum Ruta DOXP Piruvato + GA3P

HMG-CoA

DOXP Fosfidomicina: Inhibidor de DOXP ismero reductasa

mevalonato

MEP
Sntesis de isoprenoides a travs de las rutas del mevalonato y de DOXP. En todos los organismos, los isoprenoides son sintetizados a partir de unidades C5 derivadas de isopentenil difosfato (IPP). En humanos y otros organismos superiores que usan la ruta de mevalonato, IPP es sintetizado a partir de acetil CoA. De modo alternativo, algunos organismos, incluido P. falciparum, IPP se sintetiza a partir de piruvato y gliceraldehdo-3fosfato (GA3P) a travs de la ruta DOXP.

Isopentenil difosfato (IPP)

Isoprenoides

Figura 25: Biosntesis de isoprenoides.

Tambin se observaron algunos casos de recrudescencia de la enfermedad en tratamientos con fosmidomicina como agente monoteraputico. Es por ello que se estn haciendo estudios que apuntan a la bsqueda de una droga con la que puedan llevarse a cabo terapias combinadas.105

32

Fundamentacin y antecedentes

OH

O P O O

M O

H O O P O OH O O OH OH O O N O P O OH OH O P O OH OH O NADPH OH O P O O

OH

DOXP

M O O N O P O

MEP

fosfidomicina

Figura 26: Mecanismo propuesto para la conversin de DOXP en MEP, catalizada por DOXP reducto isomerasa.

Una

de

las

principales

ventajas

de

la

droga

es

su

baja

toxicidad

[DL50 (en ratas) = 12g/Kg], y su buena actividad contra parsitos multirresistentes.99 Una limitante es su corta vida media en plasma (aprox. 2,5 horas), y su baja lipofilia.101

v) Drogas en desarrollo preclnico

Nuevos inhibidores de la polimerizacin del hemo Mientras que la aparicin de parsitos resistentes a cloroquina es bastante frecuente, el desarrollo de resistencia a otras 4-aminoquinolinas y a compuestos relacionados es extremadamente raro. El surgimiento de cepas resistentes a la cloroquina posiblemente hubiera ocurrido en casos puntuales, pero se propag a todo el mundo como consecuencia de su uso excesivo.106 La causa de esto puede estar en que la polimerizacin del hemo, que segn se cree est inhibida por la cloroquina, parece no depender de enzimas.45 Por lo tanto la resistencia no puede desarrollarse por una simple mutacin. A pesar de que el mecanismo exacto todava no est claro, muchos datos sugieren que la resistencia a la cloroquina est ligada a mltiples factores, dentro de los cuales estn incluidos cambios en el transporte de protenas.19 En este contexto, es que hay mucho inters en esta clase de compuestos para el desarrollo de nuevas drogas antimalricas. El desarrollo de derivados de la cloroquina con una cadena lateral modificada, as como de bisquinolinas en las cuales dos ncleos quinolnicos estn conectados por varios enlaces, es el motivo de muchos trabajos de investigacin.107-109 Se ha probado que muchos de estos compuestos son activos frente a parsitos resistentes a la cloroquina. La actividad de las 4-aminoquinolinas depende de la presencia del
33

Fundamentacin y antecedentes grupo amino. La droga, que tiene propiedades bsicas, se concentra en la vacuola alimenticia cida, y su forma protonada no puede atravesar nuevamente la membrana. Esto se conoce como efecto bsico dbil.110 Con la sntesis del N-desbutil derivado de la halofantrina, conocido como un metabolito activo de esta droga, se pudo eliminar el efecto secundario cardiotxico, sin alterar su actividad antimalrica.111,112 Adems, la N-desbutilhalofantrina es mucho ms activa in vitro que la lumefantrina.113 La dihidroacridindiona WR243251 es un derivado de la floxacrina (Figura 27) y fue desarrollado a partir del compuesto lder mepacrina. La droga fue muy activa contra cepas de P. falciparum resistentes a cloroquina en monos Autus,114 y adems, inhibi el desarrollo de esporozotos de P. vivax en mosquitos.115

O Cl

O H N H N

N H Cl Cl N N H

Br

WR243251
Br O Cl O

N N H

2,7-dibromocriptoleptina
O

criptoleptina
NH O

N OH CF3

floxacrina

HN

O O

Cl

Figura 27: Nuevos inhibidores de polimerizacin del grupo hemo.

Se ha demostrado que la droga inhibe la polimerizacin del hemo, pero esto slo claramente no representa el mecanismo de su actividad.116 A pesar de que su molcula blanco probablemente difiera de la de la atovacuona, al igual que sta, inhibe la respiracin celular del parsito.117 Posiblemente esta sea la razn de la aparicin de una moderada resistencia cruzada de WR243251 con atovacuona. El alcaloide indoloquinolnico criptoleptina (Figura 27), fue aislado de las races de Cryptolepis sanguinolenta en el oeste de Africa. Se usaba en la medicina tradicional para el
34

Fundamentacin y antecedentes tratamiento de la malaria y de otras enfermedades. La droga mostr una moderada actividad antimalrica in vitro y tambin en ratones infectados con P. berghei. Su actividad depende probablemente de la polimerizacin del grupo hemo.118 De todas maneras, como resultado de su capacidad de intercalarse en el ADN, la criptoleptina es citotxica.119 Entre los diferentes derivados sintticos, la 2,7-dibromocriptoleptina (Figura 27) es la ms activa, con una actividad aproximadamente 10 veces mayor que la criptoleptina; una citotoxicidad apenas un poco mayor contra clulas cancergenas, y baja toxicidad en ratones. 118 Tambin compuestos como el A de la Figura 27, que originalmente fueran desarrollados como inhibidores de proteasas, han resultado ser potentes inhibidores de la polimerizacin del grupo hemo.120 En series de compuestos relacionados, existe una clara correlacin entre la actividad antimalrica in vitro y la inhibicin de la polimerizacin del hemo. El futuro potencial de esta clase de compuestos puede cuestionarse por su aparente resistencia cruzada con la cloroquina. Por ejemplo, los valores de CE50 del compuesto A estuvieron entre 7 y 11 nM contra parsitos sensibles a cloroquina, mientras que contra cepas de P. falciparum resistentes a cloroquina, fueron del orden de los 70 nM.19 La estrategia para superar la resistencia frente a 4-aminoquinolinas, involucra la sntesis de prodrogas que consistan en una 4-aminoquinolina de conocida actividad antimalrica y en un inhibidor de la glutatin reductasa.121 Ambos compuestos estaran unidos por medio de un enlace ster metablicamente lbil. La prodroga B (Figura 27) exhibe actividad in vitro frente a cepas de P. falciparum resistentes a 4-aminoquinolinas. El compuesto mostr una significativa actividad luego de administrarse en forma oral (40 mg/Kg) a ratones infectados con P. berghei. Como la detoxificacin del hemo no depende solamente de la polimerizacin del hemo, sino adems, de su degradacin oxidativa mediada por glutatin, se ha sugerido que un aumento de la concentracin de glutatin reducido intracelular, (como consecuencia del aumento de la actividad de glutatin reductasa) juega un papel crucial en la resistencia a cloroquina.45 De este modo, la sensibilidad a la cloroquina puede reconstruirse por inhibidores de glutatin reductasa. Adems, muchos inhibidores de glutatin reductasa poseen actividad antimalrica por s mismos.28

35

Fundamentacin y antecedentes Nuevos derivados de artemisinina y otros perxidos En cuanto a su rapidez de accin, los derivados de la artemisinina son superiores a cualquier otra droga antimalrica. Adems, no se han descrito casos clnicos de resistencia a la artemisinina. Al igual que lo discutido para 4-aminoquinolinas, la razn para esto puede ser que su mecanismo de accin no dependa de enzimas blanco especficas. Las artemisininas semisintticas actualmente disponibles, tienen una vida media corta, por hidrolizarse fcilmente a dihidroartemisininas potencialmente txicas. En virtud de ello, se ha hecho un esfuerzo importante en la obtencin de derivados ms estables que mejoren su biodisponibilidad. En particular, enfocado al tratamiento intravenoso de malaria severa se ha desarrollado el cido artenlico (Figura 28), que es significativamente ms estable que el artesunato y adems, altamente soluble en agua.19

O O O O R

H H O O O O H H H H

O O O

R = OCH2-p-C6H4COOH, Ac. artenlico R = OCH2CH2N(CH3)2, C R = O-p-C6H4(CF3), D N R= ,G

N CF3

artemisinina
N

H H O F O O O O O O O O H

O O O O H

F
O O

Figura 28: Nuevos derivados de artemisinina con potencial actividad antimalrica.

En compuestos como por ejemplo el derivado C del cido artenlico (Figura 28), la solubilidad en agua se ha conseguido mediante la introduccin de un grupo amino en la cadena lateral.122 Se ha probado que el derivado p-trifluorometilfenoxi D (Figura 28), es ms eficaz que el artesunato luego de aplicarse en forma oral a ratones infectados de malaria murnica.123 Introduciendo un enlace no acetlico en la cadena lateral del ncleo de
36

Fundamentacin y antecedentes artemisinina, se obtuvieron otros derivados ms activos por administracin oral, como el compuesto E (Figura 28).124 Mediante el uso de tcnicas de diseo racional, se ha propuesto que un anillo de piperazina en la cadena lateral podra llevar a un enriquecimiento en la droga en el interior de la vacuola alimenticia debido a sus caractersticas dbilmente bsicas. De este modo, el compuesto G (Figura 28) fue dos veces ms activo que el artemter en ratones infectados con P. berghei.125 Tambin se sintetizaron dmeros de artemisinina con una unidad central.126,127 El compuesto dimrico F (Figura 28) exhibe un valor de CE50 = 1.3 nM contra P. falciparum in vitro, mientras que artemisinina presenta un CE50 = 9.7 nM, en las mismas condiciones.126 La simplificacin del ncleo de artemisinina lleva a 3-ariltrioxanos sintticos (H, Figura 28).128 En una aplicacin oral a un modelo murnico, el compuesto H fue dos veces ms activo que la artemisinina en 48 horas.128 Basndose en la hiptesis de que el mecanismo de accin de las artemisininas depende de la generacin de radicales libres por ruptura de la funcin perxido, puede asumirse que otros perxidos no relacionados estructuralmente con artemisinina, tambin pueden exhibir actividad antimalrica. El yingzhaosu A, un perxido natural de estructura diferente a la artemisinina, que fuera aislado de la planta Artabotrys uncinatus, L. (Annonaceae), y utilizado en la medicina tradicional china, as como su derivado sinttico artefleno (Figura 29), tambin son activos frente a la malaria.5 Sin embargo, su pobre eficacia clnica y la dificultad de su sntesis, hacen difcil la continuacin de su desarrollo. F 3C HO OH O O O O F 3C O O

yingzaosu A

artefleno

Figura 29: Yingzaosu A y su derivado sinttico artefleno

Ms accesibles son los 1,2,4,5-tetraoxanos del tipo del compuesto I (Figura 30), que difieren estructuralmente en forma significativa de la artemisinina. Luego de su aplicacin en ratones infectados con P. berghei, el compuesto I fue levemente ms activo que artemisinina, pero menos que el arteter.
37

Fundamentacin y antecedentes Tambin se sintetizaron diferentes oxazinas como drogas potencialmente activas (J, Figura 30). La energa estndar de disociacin del enlace -N-O- (35.8 Kcal/mol), es similar a la del enlace O-O- (33.2 Kcal/mol).18 El enlace -N-O- podra entonces ser propenso a sufrir una ruptura homoltica, dando lugar tambin a la generacin de radicales, y as presentar una actividad biolgica relacionada a la de los endoperxidos. Como era de esperar, algunos de estos compuestos tambin exhibieron actividad antimalrica in vitro contra P. falciparum. Los compuestos ensayados son obtenidos por reacciones de Diels-Alder utilizando como dienos, derivados acilados de tri-O-metil purpurogalina, y como dienfilo nitrosobenceno. As se obtiene una serie de 12 compuestos de modo tal que, eligiendo patrones de sustitucin adecuados, se logr una toxicidad relativamente baja.16 El crecimiento de P. falciparum fue inhibido por el compuesto J con CE50 = 3.2 M. Fue testada tambin su actividad frente a Trypanosoma cruzi, mostrando una CE50 > 63.9 M. Su toxicidad fue ensayada en clulas KB con CE50 = 128 M. Esto demuestra una interesante especificidad del compuesto hacia P. falciparum.

O O O O O O O O N O O O

O O

I
O HN O O

Cl

DU-1102

J
Figura 30: Estructuras relacionadas con los endoperxidos, con potencial actividad antimalrica.

El desarrollo de las denominadas trioxaquinas, intenta combinar las ventajas farmacolgicas de los perxidos con las de entidades 4-aminoquinolnicas. Los residuos 4-aminoquinolnicos deberan facilitar el transporte a la vacuola alimenticia, donde el FeII-hemo liberado durante la digestin de la hemoglobina active la unidad trioxano. La trioxaquinolina ms activa sintetizada hasta el momento es DU-1102 (Figura 30). Es altamente eficiente contra cepas de P. falciparum resistentes a cloroquina.129 Posiblemente, como consecuencia de su modo de accin inespecfico, algunos de los perxidos mencionados
38

Fundamentacin y antecedentes exhiban actividades farmacolgicas adicionales. En particular, a menudo se describe la actividad antiproliferativa y antitumoral de los perxidos, y esto atrae tambin el inters en el uso de anlogos de artemisinina en terapias anticncer. Pese a ello, estos efectos pleiotrpicos pueden implicar una posible limitacin en la terapia antimalrica de estas drogas.19 Inhibidores de proteasas Como se ha explicado anteriormente, el parsito digiere la mayor parte de la hemoglobina del husped durante su crecimiento intraeritroctico. La degradacin de la hemoglobina en la vacuola alimenticia, se cataliza en forma dirigida por una serie de proteasas que estn parcialmente caracterizadas y disponibles como protenas recombinantes. La ruptura inicial de la hemoglobina est mediada por las proteasas asprticas plasmepsina I, II y IV.130 Otras proteasas como la cistena proteasa falciparina-2, la metaloproteasa falcilisina, y la inusual proteasa histoasprtica (HAP), catalizan la posterior degradacin a pptidos pequeos, los que son finalmente transportados dentro del citoplasma del parsito y degradados hasta aminocidos simples.131 La HAP est estrechamente relacionada con las plasmepsinas, en las que uno de los dos residuos catalticos aspartato estn sustituidos por histidina. Los inhibidores especficos de las enzimas involucradas en la degradacin de la hemoglobina, representan entonces una nueva clase de potenciales antimalricos. Los inhibidores especficos de plasmepsina II fueron obtenidos mediante la modificacin de los inhibidores de catepsina D disponibles. La catepsina D es una proteasa liposomal de las clulas de mamferos.132 Se dise en forma racional una biblioteca de compuestos, a partir de la cual, se sintetiz el compuesto K (Figura 31), que present CE50 = 4.3 nM contra plasmepsina II, y 63 nM contra catepsina D. La alta selectividad de estos inhibidores de plasmepsina sobre catepsina D es de particular importancia, ya que la catepsina D se ubica en clulas de mamferos, y entonces es esperable que su inhibicin conlleve efectos adversos severos en el husped. El conocimiento de la estructura de plasmepsina II a travs de Rayos X, permiti el diseo de novo de inhibidores del tipo de L (Figura 31).133 El compuesto L result inactivo virtualmente frente a la renina, homloga de plasmepsina II, pero fue altamente eficaz contra
39

Fundamentacin y antecedentes esta ltima. La selectividad contra catepsina D y catepsina E, por el contrario, fue menos pronunciada.133 Algunos compuestos como M (Figura 31), originalmente descrito como inhibidor de plasmepsina II, exhiben entre 18 y 80 veces ms actividad contra plasmepsina IV.19 Diferentes peptidilfluorometilcetonas y peptidilvinilsulfonas (P y Q respectivamente, Figura 31) resultaron ser altamente potentes como inhibidores de falciparina-2. Estos inhibidores provocan la acumulacin de hemoglobina sin degradar en la vacuola alimenticia, lo que bloquea el desarrollo del parsito.134 Los valores de CE50 de P y Q contra el crecimiento de P. falciparum in vitro fueron 4 nM y 0.4 nM, respectivamente. La sobrevivencia de ratones infectados con P. vinckei result significativamente prolongada luego de la administracin oral de ambos compuestos (100-200 mg/Kg 2 veces al da).

HN O

Cl

Cl OH N O Cl NH

S N S N O

Cl

O O

H N

K
O O O O O H N

O Cl S

H N OH NH O

N H

O N O N H

H N O

O F N HN

O N H

H N O

O S O

Figura 31: Inhibidores de proteasas.

La degradacin por hidrlisis enzimtica de las peptidasas del parsito, es una limitante al uso de estos inhibidores peptdicos desde un punto de vista terico. Tambin lo
40

Fundamentacin y antecedentes son su relativamente baja selectividad y su modo de accin irreversible, que llevan a modificaciones covalentes de las enzimas blanco. No obstante, la sntesis de estos compuestos con valores de toxicidad y perfiles farmacocinticos aceptables, promete ser una lnea de investigacin viable en la bsqueda de nuevas drogas antimalricas.135 Inhibidores de la sntesis de cidos grasos La sntesis de cidos grasos en mamferos, hongos y ciertas bacterias, est catalizada por protenas multifuncionales constituidas por diferentes regiones, en las que cada una de ellas cataliza una reaccin diferente. Son las llamadas cido graso sintetasas tipo I (FAS-I).136 Por su parte, en las plantas y la mayora de las bacterias ocurre lo contrario. Contienen un sistema tipo II de sntesis de cidos grasos (FAS-II), en el que cada reaccin est catalizada por una enzima diferente. En los parsitos de la malaria, ha sido demostrada la existencia de un sistema tipo II.19 En este caso, las enzimas individuales estn localizadas en el interior del apicoplasto (Figura 12) y son similares a las involucradas en la sntesis de isoprenoides. El antibitico natural tiolactomicina (Figura 32) inhibe las enzimas Fab B, Fab F y Fab H, que catalizan las distintas etapas de condensacin en la sntesis de cidos grasos en P. falciparum. El compuesto es activo contra el crecimiento in vivo de P. falciparum (CE50 = 50 M).19
OH O HO Cl O Cl Cl OH

H N

OH O Cl

Cl

Cl

Cl

OH

tiolactomicina

triclosan

Figura 32: Inhibidores de sntesis de cidos grasos.

El triclosan (Figura 32) es significativamente ms activo que la tiolactomicina frente a P. falciparum. Es un inhibidor de la trans-2-enoil-ACP-reductasa, Fab I (CE50 = 1 M in vitro). Adems, se demostr su eficacia en ratones infectados con P. berghei. Los correspondientes valores de CE50 y LD90 luego de inyecciones subcutneas, fueron 3 y 30 mg/Kg respectivamente.137 El triclosan activo frente a un amplio espectro de bacterias, por lo que se utiliza como conservante en varios productos de uso domstico, pero no est aconsejado para el tratamiento por va oral. Se testaron varios derivados de triclosan en cuanto a su actividad antimalrica. Los compuestos R y S (Figura 32) fueron significativamente
41

Fundamentacin y antecedentes activos contra la enzima recombinante y el crecimiento in vitro de P. falciparum, pero fueron menos activos que triclosan.138 La protena recombinante Fab I de P. falciparum fue cristalizada y su estructura fue resuelta como un complejo binario con el cofactor NADH, y como un complejo ternario con NAD+ y triclosan, o los derivados R y S.138 Inhibidores de farnesil transferasa La farnesiltransferasa es una protena heterodimrica que cataliza la transferencia de un residuo farnesil desde farnesilpirofosfato hacia una cistena de una cadena lateral cercana al extremo carboxiterminal de algunas protenas. En los ltimos aos, se desarrollaron inhibidores de farnesiltransferasa como potenciales drogas en terapias anticncer. Al igual que algunas protenas, stos son activos slo cuando estn anclados a la membrana por un residuo farnesil.139,140 La mayora de los inhibidores de farnesiltransferasa disponibles son pptido mimticos diseados para el reconocimiento de la secuencia CaaX (C = cistena, aa = aminocidos con cadena lateral aliftica, X = serina o metionina) del extremo carboxiterminal de protenas farnesiladas. La farnesilacin proteica ha sido demostrada en protozoarios parsitos de los gneros Trypanosoma, Leishmania y Plasmodium.141,142 A pesar de que se pudieron identificar en el genoma de P. falciparum las secuencias que codifican para las dos subunidades de farnesiltransferasa, el intento de producir una protena recombinante por expresin heterognea de esas secuencias todava no se ha podido lograr.143 Varios inhibidores de farnesiltransferasas, han impedido el crecimiento in vitro de P. falciparum.140-142 En las series de inhibidores de farnesiltransferasas desarrolladas por Sebti, Hamilton y colaboradores, el derivado bifenlico FTI-2153 (Figura 33) exhibi una alta actividad antimalrica in vitro (CE50 = 4.4 M).144 Por un diseo de novo, se desarrollaron otros inhibidores de farnesiltransferasa ms activos, basados en una estructura de benzofenonas, usando farnesil transferasa de ratas como modelo.145,146 Dentro de esta serie, el compuesto Schl-4116 (Figura 33) result tener actividad in vitro contra P. falciparum (CE50 = 75 nM).147

42

Fundamentacin y antecedentes

N HN O HN HN

S O 2N O O H N O O

O NH O

FTI-2153

Schl-4116

Figura 33: Inhibidores de farnesiltransferasa

Inhibidores de la gliclisis El ciclo funcional del cido ctrico est ausente en los parsitos de la malaria, y por lo tanto, su energa metablica depende mayoritariamente de la gliclisis anaerobia.148 El NAD+ debe ser regenerado por reduccin de piruvato a lactato. La lactato deshidrogenasa de P. falciparum ha sido producida como una protena recombinante, y se ha hecho un anlisis cristalogrfico de alta resolucin de ella.19 Se est utilizando una combinacin de mtodos de evaluacin biolgica de alto rendimiento y diferentes tcnicas de diseo racional con el fin de identificar inhibidores especficos que no afecten a la lactato deshidrogenasa humana.19 Esto debera ser factible debido a las importantes diferencias estructurales que hay entre las enzimas de mamferos y las del parsito.149 El disesquiterpeno Gossipol (Figura 34), aislado de semillas de algodn, inhibe la lactato deshidrogenasa de P. falciparum, y presenta una moderada actividad antimalrica in vitro (CE50 = 15-29 M).150 Sin embargo, an deben disearse derivados menos txicos para poder llevar adelante su desarrollo futuro. Tambin se resolvi la estructura cristalina de otras dos enzimas glicolticas de P. falciparum (fructosa-1,6-difosfato aldolasa y triosa fosfato isomerasa).151 En ambos casos, las diferencias estructurales entre las enzimas de mamferos y las del parsito resultan evidentes y por lo tanto pueden proveer una base para el diseo racional de inhibidores especficos.

43

Fundamentacin y antecedentes

vi) Estructuras lderes an ms novedosas

Est descrito que los -metoxiacrilatos, compuestos que se utilizan habitualmente como fungicidas agrcolas, tienen un mecanismo de accin similar al de la atovacuona, consistente en la inhibicin de la transferencia de electrones al complejo citocromo c reductasa en la mitocondria. Por lo tanto, se ensay la actividad antimalrica de una serie de derivados de -metoxiacrilato.152 El compuesto T (Figura 34) fue activo in vitro contra cepas de P. falciparum sensibles y resistentes a cloroquina (CE50 = 0.06 y 0.13 nM respectivamente). Estos valores de CE50 estn entre los ms bajos que se hayan registrado para drogas antimalricas.19 En ratones infectados con P. berghei, el compuesto T tuvo una actividad antimalrica 5 veces superior a la de la cloroquina. Un rpido desarrollo de resistencia fue observado en estos compuestos, lo cual es una importante limitante.23 En varios pases de Africa y Asia se han aplicado en la medicina tradicional para el tratamiento de malaria y otras enfermedades, lianas tropicales de las familias Dioncophyllaceae y Ancistrocladaceae. Los alcaloides naftilisoquinolnicos (dioncofilinas, Figura 34) aislados de estas plantas, han demostrado una potente actividad antimalrica.153 Luego de la administracin oral de 50 mg/Kg de dioncofilina C (Figura 34), los ratones infectados con P. berghei resultaron completamente curados. La febrifugina (Figura 34), componente activo de la planta medicinal china Dichosa febrfuga, demostr actividad antimalrica in vitro e in vivo (CE50 = 0.7 nM). Su uso clnico, sin embargo, se ve dificultado por sus muy severos efectos adversos. La 3-cetofebrifugina (Figura 34), presumiblemente un metabolito natural de la febrifugina, fue menos txico que sta, y levemente ms activo que la cloroquina en ratones infectados con P. berghei luego de inyeccin intraperitoneal.154 El modo de accin de las dioncofilinas y febrifuginas an es desconocido. El compuesto WR182693 (Figura 34), es formalmente un derivado de cloroproguanil que no puede ciclarse a un inhibidor dihidrofolato reductasa. Al igual que las 8-aminoquinolinas primaquina y pamaquina, es un compuesto activo contra estadios parasitarios hepticos, pero no lo es contra estadios sanguneos.155 Tiene actividad profilctica, y se prob su capacidad de prevenir recadas, en monos infectados con P. cynomolgi luego de una inyeccin intramuscular de 31 mg/Kg durante 3 das.156

44

Fundamentacin y antecedentes

OH OH OH O

O HO

HO OH O O O CF3 NH

HO

gossypol
CF3 OH

T
O N N O HN N OH O N O HN Cl Cl Na OH OH O P OH H 2N O P O O P OH OH HN O

dioncofilina C
O HN N N NH O

febrifugina
Na O O P P OH OH

3"-febrifugina
Na O O P

WR182393

OH

OH

alendronato Figura 34: Inhibidores de gliclisis. Compuestos lderes para nuevas drogas.

OH

OH

OH

Los bifosfonatos, como los que comnmente se usan en tratamientos de osteoporosis, pueden ser una clase importante de nuevas drogas antimalricas. En series de bifosfonatos con diferentes cadenas laterales, algunos de ellos demostraron tener actividad contra protozoarios parsitos de los gneros Trypanosoma, Leishmania, Toxoplasma y Plasmodium.157 Mediante estudios de relacin estructura-actividad, se demostr que la presencia de nitrgeno en la cadena lateral disminuye la actividad antimalrica. Los valores de CE50 in vitro de U y V (Figura 34) son 5.1 y 7.7 M respectivamente. En contraste, el alendronato (Figura 34) fue inactivo frente a P. falciparum a las ms altas concentraciones testadas (200 M). Se asume que la actividad antiparasitaria de los bifosfonatos est asociada a la inhibicin de la farnesil pirofosfato sintasa.19

45

Fundamentacin y antecedentes

2.2.- Aspectos qumicos

2.2.1.- Consideraciones tericas generales
Las reacciones de Diels-Alder, cuyo valor sinttico es ampliamente reconocido, forman parte de un grupo de reacciones denominadas reacciones pericclicas. Estas no involucran intermedios de reaccin inicos ni radicalarios, sino que el proceso transcurre en un nico paso, en el cual la ruptura y formacin de enlaces contribuyen ambos a la estructura de un estado de transicin. A estos procesos se les llama concertados.158 Las reacciones pericclicas son un grupo muy importante dentro de las reacciones concertadas.159 Estas se caracterizan por un cambio en la estructuracin de los enlaces, causado por una reorganizacin concertada de electrones. Para que pueda darse este flujo continuo de electrones a travs de los enlaces, la reaccin debe ocurrir a travs de un estado de transicin cclico. Este estado de transicin corresponde a un ordenamiento de los orbitales involucrados, tal que los tomos reaccionantes puedan mantener entre ellos interacciones de enlace. Estos requerimientos hacen que las reacciones sean predecibles en cuanto a su factibilidad, reactividad, y regio- y estereoselectividad. Esta posibilidad de prediccin se basa en la teora de Woodward y Hoffmann que establece que la va a travs de la cual estas reacciones ocurren est determinada por las propiedades de simetra de los orbitales directamente involucrados.160 La simetra de cada orbital participante debe conservarse durante el proceso de reaccin. Dentro de los diferentes tipos de reacciones pericclicas (reacciones electrocclicas, rearreglos sigmatrpicos, cicloadiciones, etc.) en las que los factores de simetra de los orbitales juegan un papel determinante en la reactividad y estereoqumica de las mismas, esta tesis se ocupar en particular de las cicloadiciones, y dentro de stas, de las reacciones de Diels-Alder. En las reacciones de Diels-Alder un 1,3 dieno reacciona con un dienfilo para formar un ciclohexeno, que se conoce como aducto de Diels-Alder. En la reaccin se forman dos nuevos enlaces a expensas de los dos enlaces del dieno de partida.161,162 La reaccin se conoce como cicloadicin [4+2], dado que en los cambios de enlaces estn involucrados cuatro electrones del dieno y dos electrones del dienfilo. El principio de la conservacin de la simetra de los orbitales se aplica tanto a la reaccin de Diels-Alder como a su reaccin inversa, o retro-Diels-Alder.
46

Fundamentacin y antecedentes Los requerimientos de simetra orbital de las cicloadiciones [4+2] que se explicarn a travs de un diagrama de orbitales para la adicin de butadieno y etileno para dar ciclohexeno. En primer lugar, para que la reaccin concertada ocurra, el dieno debe adoptar una conformacin s-cis. Cuando el dieno tiene una conformacin s-trans, los orbitales p de los tomos de los extremos del dieno estn demasiado lejos como para solaparse con los orbitales p del dienfilo. Los electrones involucrados, tanto del dieno como del dienfilo, son los electrones . Existe un plano de simetra perpendicular a los planos de las molculas de los reactivos durante el curso de la reaccin (Figura 35).

H H H

H H

H H

Figura 35: Disposicin espacial del dieno y el dienfilo durante el transcurso de la reaccin de cicloadicin.

La cicloadicin de Diels-Alder puede estudiarse desde la perspectiva de la Teora de los Orbitales Moleculares de Frontera (OMF). Estos son el orbital molecular ocupado de ms alta energa (HOMO, Highest Occupied Molecular Orbital), y el orbital molecular desocupado de ms baja energa (LUMO, Lowest Unoccupied Molecular Orbital). El hecho de que los grupos atrayentes de electrones como sustituyentes en el dienfilo aumenten su reactividad, y los grupos dadores de electrones como sustituyentes en el dieno aumenten su dienofilia, sugiere que en el transcurso de la reaccin los electrones fluyen del dieno al dienfilo. De este modo, los orbitales que deben considerarse para explicar la reaccin, son el HOMO del dieno y el LUMO del dienfilo.158 En el caso del etileno, los orbitales 2p de los carbonos adyacentes se solapan para dar un orbital enlazante y uno antienlazante * (Figura 36).

47

Fundamentacin y antecedentes

(LUMO)

.
(HOMO)

Figura 36: Representacin de los orbitales moleculares enlazante y * antienlazante del etileno

El solapamiento de los cuatro orbitales atmicos 2p del 1,3-butadieno conduce a la formacin de cuatro orbitales moleculares , dos enlazantes (1 y 2) y dos antienlazantes (3* y 4*) (Figura 37).
Orbital de mayor energa

Orbitales moleculares * antienlazantes

. 3

LUMO

2 Orbitales moleculares enlazantes

HOMO

. 1

Orbital de menor energa

Figura 37: Representacin de la distribucin electrnica de los orbitales moleculares del 1,3-butadieno

De acuerdo a las representaciones anteriores, las propiedades de simetra del HOMO del dieno y del LUMO del dienfilo, permiten la formacin de un enlace entre las dos molculas, debido a que ambos orbitales moleculares tienen la misma fase. (Figura 38).

48

Fundamentacin y antecedentes

HOMO del 1,3-butadieno (2)

H H H

.
H H H

.
H

LUMO del etileno (*) H H

Figura 38: Interaccin entre el HOMO del 1,3-butadieno y el LUMO del etileno en la reaccin de cicloadicin de Diels-Alder.

En los casos en que la simetra de los OMF no permite su solapamiento, la reaccin de cicloadicin no tiene lugar. Son casos de reacciones prohibidas por simetra.158

i) Estereoqumica de la reaccin
La importancia sinttica de la reaccin de Diels-Alder no slo radica en que es una metodologa sencilla y eficiente para obtener compuestos cclicos de 6 miembros, sino en que adems es una reaccin estereoselectiva. Esta caracterstica la convierte en una herramienta muy til en la sntesis de compuestos estructuralmente complejos.161 La estereoqumica de los aductos obtenidos en la reaccin de Diels-Alder puede predecirse en base a dos reglas empricas bsicas formuladas por Alder y Stein en 1937: la regla cis y la regla endo.161 La regla cis De acuerdo a la Regla cis, la estereoqumica relativa de los sustituyentes en el dieno y en el dienfilo se mantiene en el aducto. Un dienfilo que tiene sus sustituyentes con estereoqumica trans da como producto un aducto en el cual la configuracin trans se mantiene. Un dienfilo cis disustituido forma un aducto en el cual esos sustituyentes estn cis uno respecto al otro. Por ejemplo, en la reaccin de ciclopentadieno con maleato de dimetilo, se obtienen los aductos cis A y B, mientras que en la reaccin con fumarato de dimetilo, la configuracin trans de los grupos ster se mantiene en el aducto C (Esquema 1).
49

Fundamentacin y antecedentes

O H

+
H O

OCH3 OCH3

H COOCH3

+
B
H

COOCH3 H COOCH3

A
O

COOCH3

OCH3 H

H3CO O

COOCH3 H

C
Esquema 1

COOCH3

Del mismo modo, la configuracin relativa de los sustituyentes del dieno en posiciones 1 y 4, se mantienen en el aducto. Un dieno trans,trans-disustituido lleva a la formacin de un aducto en el cual los sustituyentes estn cis uno respecto al otro, mientras que a partir de un dieno cis,trans-disustituido se obtiene un aducto con los sustituyentes en trans (Esquema 2). R R

+ R' R'

R R

R'

+
R'

Esquema 2

La reaccin de Diels-Alder es una adicin estereoespecfica syn (suprafacial) con respecto a ambos, dienfilo y dieno. El mecanismo mediante el cual se producira la cicloadicin con estereoselectividad variable implicara un proceso no sincrnico de ruptura y formacin de enlaces. Se reconoce que en el caso de dienos o dienfilos asimtricos, la formacin de uno de los enlaces a partir
50

Fundamentacin y antecedentes de uno de los enlaces del dieno puede no darse al mismo tiempo que la formacin del enlace en el otro extremo del dieno.158,163 La prdida de estereoselectividad podra darse solamente si existiera un intermedio de la reaccin, en el cual uno de los enlaces se hubiera formado, mientras que el otro no, de modo de que pudiera existir rotacin del enlace del extremo (Esquema 3).
B

A B C D X

H C

X H X

H D X X H

+
X

* *
D

* *
C

X D

Producto de adicin selectiva (suprafacial)

Producto de adicin no estereoselectiva

Esquema 3

El hecho de que las reacciones de Diels-Alder sean estereoespecficas implica que en caso de existir un intermedio, ste no existe por tiempo suficiente como para permitir la rotacin del enlace, o inversin de configuracin. Entonces, se entiende que en la mayora de los casos, estos son procesos concertados. Los clculos tericos desarrollados en este aspecto, coinciden con este postulado.164,165 La regla endo Segn la Regla endo, o Regla de Alder, el producto mayoritario que se forma es el que deriva del estado de transicin en el que los grupos insaturados en el dienfilo adoptan una orientacin syn con respecto al dieno (estado de transicin endo). Las fuerzas de atraccin intermoleculares entre el sistema del dieno y los grupos insaturados del dienfilo (X), estabilizan el estado de transicin endo por sobre el exo. (Esquema 4).

51

Fundamentacin y antecedentes

R H

H X

X R R

X H R H

adicin endo

Estado de transicin endo

R R H X R R X R H R H X

adicin exo
H

Estado de transicin exo

Esquema 4: Estados de transicin endo y exo para dienos y dienfilos sustituidos

Por ejemplo, en la adicin de dienfilos a ciclopentadieno, se ve favorecido el estereoismero endo, an cuando ste fuera el producto estricamente ms congestionado (Esquema 5).
R O R H

O O R O

Producto endo Esquema 5

Esta preferencia por la estereoqumica endo no est restringida a dienos cclicos como

el ciclopentadieno. Stephenson et al. describen que, utilizando compuestos marcados con deuterio, la adicin de anhdrido maleico a 1,3-butadieno lleva en un 85 % a la formacin del estado de transicin endo.(Esquema 6).166

52

Fundamentacin y antecedentes

H D H O O O H D H D O O O D H O O O

H D

H D

O O

H H

H D

Producto endo

Estado de transicin endo

-H D H O O

H D H H O

H O

H D

Producto exo

Estado de transicin exo

Esquema 6

ii) Regioqumica de la reaccin

Las interacciones orbitales importantes son las que ocurren entre el HOMO de un reactivo y el LUMO del otro. Las posibles combinaciones son HOMO dieno-LUMO dienfilo en reacciones de Diels-Alder de demanda normal de electrones, y LUMO dieno-HOMO dienfilo en reacciones de Diels-Alder de demanda inversa de electrones. Cul tipo de interaccin es dominante depende de las diferencias de energa entre los correspondientes pares de orbitales. Cuanto menor es la diferencia de energa entre los orbitales que interaccionan, ms importante es la interaccin y la reaccin transcurre ms rpido. La interaccin que tiene lugar es la que tiene una menor diferencia de energa HOMO-LUMO. En sistemas sin sustituir, la diferencia de energa HOMO-LUMO para ambas combinaciones es similar, y por lo tanto ambas pueden ocurrir. Este sera el caso de butadieno y etileno (caso 1, Figura 39). En las reacciones de demanda normal de electrones, interaccionan un dieno rico en electrones y un dieno deficiente en electrones. Un sustituyente dador de electrones en el dieno tiene el efecto de incrementar la energa de sus orbitales moleculares afectando en mayor medida al HOMO. De manera anloga, un grupo aceptor de electrones en el dienfilo disminuye la energa de sus orbitales moleculares ejerciendo un efecto ms importante sobre el LUMO. Como consecuencia, la menor diferencia de energa la brinda el par HOMO dieno53

Fundamentacin y antecedentes LUMO dienfilo. Esta es la interaccin dominante en una reaccin de Diels-Alder de demanda normal de electrones (caso 2, Figura 39).
dieno dienfilo dieno dienfilo

dieno

dienfilo

LUMO LUMO LUMO LUMO LUMO HOMO HOMO HOMO HOMO HOMO LUMO HOMO

1) Sistema sin perturbaciones

2) Reacciones tipo A y B HOMO del dieno, LUMO del dienfilo

3) Reacciones tipo C y D Homo del dienfilo, LUMO del dieno

Figura 39: Interacciones de los OMF en las reacciones de Diels-Alder

Cuando consideramos las cicloadiciones de demanda inversa de electrones, la interaccin ms favorable ocurre entre el HOMO del dienfilo y el LUMO del dieno. Esto se explica mediante el efecto que ejercen los sustituyentes sobre los correspondientes orbitales moleculares. Un grupo atrayente de electrones en el dieno disminuye la energa de sus orbitales moleculares (afectando en mayor medida al LUMO), mientras que un sustituyente dador de electrones en el dienfilo ocasiona que la energa de sus orbitales moleculares aumente. As, de las dos posibilidades, la que brinda una menor diferencia de energa es la interaccin HOMO dienfilo-LUMO dieno (caso 3, Figura 39). Las reacciones de Diels-Alder son regioselectivas. Esta regioselectividad es sensible a la naturaleza de los sustituyentes en el dieno y en el dienfilo. Son reacciones particularmente eficientes cuando involucran dienos que contienen grupos dadores de electrones, y dienfilos sustituidos con grupos atrayentes de electrones. Las reacciones de Diels-Alder de demanda inversa de electrones son otra estrategia de gran utilidad desde el punto de vista sinttico. Los efectos de los sustituyentes en el dieno y el dienfilo, sobre la orientacin que estos adoptan en estado de transicin, y por ende, en el producto final, se ha podido racionalizar en la dcada de 1970 utilizando la Teora de Orbitales Moleculares de Frontera (OMF).167,168 La combinacin de un grupo dador de electrones en el dieno y un grupo atrayente de electrones en el dienfilo, lleva a dos posibles orientaciones, A y B, dependiendo de la
54

Fundamentacin y antecedentes posicin del sustituyente del dieno. Las orientaciones preferentes se muestran en el Esquema 7. En los casos de reacciones de demanda inversa de electrones, las orientaciones preferentes son las identificadas como C y D, dependiendo tambin de la posicin de sustitucin en el dieno. Los casos en que el dieno y el dienfilo tienen sustituyentes de las mismas caractersticas tienen una reactividad muy pobre.
Tipo A

Tipo B

GDE
C2 C1 C1

GDE GAE GAE

GDE
C2 C3

C1 C2

GDE

+
C2 C4

+
C1 C4

C3

GAE

GAE

Tipo C
GAE
C2 C1 C1

Tipo D
GAE GDE GDE GAE
C2 C3 C2 C4 C4 C1 C2

GAE GDE

+
C3

+
C1

GDE

GDE: Grupo dador de electrones GAE: Grupo atrayente de electrones

Esquema 7: Regioqumica de la reaccin de Diels-Alder.

La regioqumica mostrada en el esquema anterior puede explicarse considerando los coeficientes de contribucin de los orbitales atmicos de cada tomo al orbital molecular de frontera. Los tomos con mayores coeficientes en la combinacin lineal estn marcados con esferas ms grandes, y los que menos contribuyen al orbital molecular correspondiente son los marcados con esferas pequeas. Esta regioqumica puede predecirse a partir de la generalizacin de que la interaccin ms favorable ocurre entre los tomos que tienen mayores coeficientes de contribucin al orbital molecular de frontera. Tanto en las reacciones tipo A como tipo B, la interaccin ms favorable es entre el HOMO del dieno y el LUMO del dienfilo. Para dienfilos con sustituyentes atrayentes de electrones en C-1, el tomo que ms contribuye al LUMO es el carbono C-2. En dienos sustituidos en posicin 1 con grupos dadores de electrones, el tomo de carbono C-4 es el que tiene mayores coeficientes, por ser el tomo en donde est localizada la mayor densidad de electrones . Es el caso que se indica como Tipo A en el Esquema 7. Puede predecirse que la regioqumica de la reaccin ser tal que el carbono C-2 del dienfilo tendr su interaccin ms favorable con el carbono C-4 del
55

Fundamentacin y antecedentes dieno. Puede hacerse un anlisis similar para cada uno de los otros casos mostrados. Si el sustituyente de dador de electrones del dieno est en la posicin 2, el tomo de mayor coeficiente es el C-1. Esto es porque la mayor densidad de electrones est localizada sobre l, por lo que es el tomo que ms contribuye al HOMO. En este caso, la regioqumica de la reaccin se debe a que la interaccin ms favorable se da entre el C-1 del dieno y el C-2 del dienfilo. Es el caso ejemplificado como Tipo B. En las cicloadiciones de demanda inversa de electrones, la interaccin ms favorable ocurre entre el HOMO del dienfilo y el LUMO del dieno. Si el dieno est sustituido con grupos atrayentes de electrones en el C-1, el C-4 es el ms deficiente en electrones, y por lo tanto, el que tiene mayores coeficientes de contribucin al LUMO. En el dienfilo, el sustituyente dador de electrones influye de modo que el carbono con mayor densidad electrnica sea el C-2. En este caso la regioqumica de Tipo C se debe a que la mayor interaccin se da entre el carbono C-4 del dieno y el carbono C-2 del dienfilo. Si el sustituyente atrayente de electrones del dieno est ubicado en la posicin 2, el carbono C-1 es el que ms contribuye al LUMO del dieno, por lo que interaccionar con el C-2 del dienfilo. Es interesante notar que en los casos A y C, los productos formados son los estricamente ms congestionados, ya que son ciclohexenos 1,2-sustituidos. El concepto de OMF tambin explica el efecto cataltico de los cidos de Lewis en algunas reacciones de Diels-Alder.158 Una gran variedad de estos compuestos tienen efectos catalticos, entre ellos SnCl4, ZnCl2, AlCl3 y derivados, como por ejemplo, el (C2H5)2AlCl. Los tipos de dienfilos que pueden ser afectados por estos catalizadores son los que tienen grupos carbonilo conjugados. Los cidos de Lewis forman complejos con el oxgeno del carbonilo, y esto aumenta la capacidad de atraer electrones del sustituyente del dienfilo, resultando en un efecto atrayente de electrones ms pronunciado. Como consecuencia, disminuye la energa del LUMO del dienfilo, haciendo menor la separacin HOMO dienoLUMO dienfilo, y favoreciendo la reaccin. Esto no solamente tiene efecto sobre la reactividad, sino que mejora la regioselectividad de la reaccin.169,170

56

Fundamentacin y antecedentes

2.2.2.- Aspectos particulares

a) Dienfilos
En las reacciones de Diels-Alder pueden tomar parte diferentes tipos de dienfilos. Estos pueden ser derivados del etileno, del acetileno, o ser heterodienfilos, en los que uno o los dos tomos de carbono del enlace mltiple se sustituyen por heterotomos.171 Su reactividad depende estrechamente de su estructura. Las reacciones de Diels-Alder estn determinadas por el grado de interaccin entre el HOMO de uno de los reactivos y el LUMO del otro. Cuanto menor sea la diferencia de energa entre estos orbitales, mayor ser la velocidad de la reaccin. En las reacciones entre un dienfilo deficiente en electrones y un dieno rico en electrones, la interaccin ms favorable es entre el HOMO del dieno y el LUMO del dienfilo. Los sustituyentes atrayentes de electrones en el dienfilo facilitan la reaccin, disminuyendo la energa del LUMO, con lo que disminuye la diferencia de energa con el HOMO de un dieno dado (Figura 40).

dieno

dienfilo

dieno

dienfilo

LUMO

LUMO

LUMO LUMO

HOMO

HOMO

HOMO

HOMO

1) Sistema sin perturbaciones

2) Sustituyentes atrayentes de electrones en el dienfilo disminuyen la energa del LUMO

Figura 40: Efecto de sustituyentes atrayentes de electrones en el dienfilo, sobre la energa del LUMO.

Son comnmente utilizados aldehdos, cetonas, steres, nitrilos, grupos nitro y nitroso en conjugacin con el doble o triple enlace del dienfilo, para aumentar su reactividad. Por otro lado, los sustituyentes alqulicos pueden reducir la reactividad del dienfilo por efectos electrnicos, y en caso de ser voluminosos, tambin por efectos estricos. Las olefinas como
57

Fundamentacin y antecedentes alcohol allico y sus steres, y los haluros de alilo, son relativamente poco reactivos a pesar de que, en algunos casos, bajo condiciones enrgicas de reaccin, pueden ser inducidos a reaccionar con dienos.162 En reacciones de Diels-Alder de demanda inversa de electrones, participan steres vinlicos y enaminas en los que el dienfilo est sustituido con grupos dadores de electrones. Estos reaccionan con dienos sustituidos con grupos atrayentes de electrones, es decir, con dienos deficientes en electrones, como por ejemplo, compuestos carbonlicos ,-insaturados. Como ejemplos de reacciones de demanda inversa de electrones, en un paso clave en la sntesis de la secologanina, un aldehdo ,-insaturado reacciona con un enol ter para dar el aducto correspondiente.172 La sntesis del alcaloide ()-minovina involucra un paso de cicloadicin entre una enamina cclica y un ster indolacrlico.173 (Esquema 8)
H O O CHO O H OMe H O CHO H CHO MeOOC H OGlc H O O O secologanina

OMe

5C 48 %

Ph N Ph N N

N H

+
COOMe

MeOH reflujo 60 %

COOMe

N minovina

COOMe

Esquema 8

b) Dienos
Un amplio espectro de dienos, que incluye tanto dienos cclicos como de cadena abierta, puede participar en reacciones de Diels-Alder. Los heterodienos con uno o ms heterotomos tambin son usados en sntesis orgnica con buenos resultados.174 La condicin fundamental que deben cumplir es ser capaces de adoptar una conformacin cisoide, con el fin de establecer una interaccin adecuada con el dienfilo en el estado de transicin.

58

Fundamentacin y antecedentes Cuando se utilizan dienos conjugados de cadena abierta, generalmente las reacciones transcurren rpidamente y en forma prcticamente cuantitativa. Por ejemplo, el butadieno reacciona cuantitativamente con anhdrido maleico en benceno a 100 C (en 5 horas o ms lentamente a temperatura ambiente), para dar anhdrido cis-1,2,3,6-tetrahidroftlico.162 Los sustituyentes en el dieno influyen en la reaccin, tanto por sus caractersticas electrnicas, como por sus efectos estricos en la conformacin de equilibrio. Como ya se ha visto, la reaccin frecuentemente se ve favorecida por sustituyentes dadores de electrones en el dieno, como por ejemplo aminas, teres o grupos alquilo. Estos aumentan la energa del HOMO, de modo que disminuye la diferencia de energa con el LUMO del dienfilo (Figura 41).
dieno dienfilo

dieno

dienfilo

LUMO

LUMO

LUMO LUMO HOMO

HOMO

HOMO

HOMO

1) Sistema sin perturbaciones

2) Sustituyentes dadores de electrones en el dieno aumentan la energa del HOMO

Figura 41: Efecto de sustituyentes dadores de electrones en el dieno, sobre la energa del HOMO

Sin embargo, sustituyentes muy voluminosos que impidan al dieno adoptar la conformacin cisoide, dificultan la reaccin. Por ejemplo, mientras el 2-metil, el 2,3-dimetil y el 2-t-butilbutadieno reaccionan con anhdrido maleico, el 2,3-di-t-butilbutadieno no reacciona. Aparentemente este ltimo dieno no puede adoptar la conformacin imprescindible para el acercamiento con el dienfilo en el estado de transicin debido a los efectos estricos de los dos sustituyentes t-butilo. En contraste con esto, el 1,3-di-t-butilbutadieno, en el cual los sustituyentes no interfieren entre s an en la forma cisoide, reacciona sin dificultades con anhdrido maleico.161

59

Fundamentacin y antecedentes La sustitucin por grupos voluminosos en la posicin 1 del dieno, tambin afecta la reactividad debido a las interacciones no enlazantes en los ismeros (Z) con el hidrgeno o el sustituyente en la posicin . De acuerdo a esto, el (Z)-1,3-pentadieno reacciona con un dienfilo mucho ms lentamente que su ismero (E) (Figura 42).
CH3 CH3 H H H H H

Ismero (Z)

Ismero (E)

Figura 42: Interacciones estricas entre sustituyentes del dieno

Desde la dcada de 1960 se han descrito numerosas aplicaciones de reacciones de Diels-Alder con butadienos aril- o alquil- sustituidos.161 Posteriormente se comenzaron a utilizar derivados de hidroxibutadieno. Por ejemplo, los 2-alcoxi- y 2-sililoxibutadienos reaccionan con dienfilos para formar aductos enolteres, que fcilmente se hidrolizan a derivados de ciclohexanona (Esquema 9).24
.
COOCH3 H3O+ (H3C)3SiO O

ClSi(CH3)3 O (C2H5)3N (H3C)3SiO

COOCH3

COOCH3

.
Esquema 9

Uno de los dienos de este tipo ms ampliamente usado en sntesis de productos naturales, es el 1-metoxi-3-trimetilsililoxibutadieno, conocido como dieno de Danishefsky.175 En el Esquema 10 puede observarse cmo, modificando las condiciones de reaccin, pueden sintetizarse ciclohexenonas y derivados de benceno a partir de dicho dieno.

60

Fundamentacin y antecedentes

OCH3 CHO (H3C)3SiO benceno, reflujo (H3C)3SiO

OCH3 CHO CH3 O H3O+

CHO CH3

OCH3 COCH3

OCH3 tolueno reflujo (H3C)3SiO COOCH3 CH3 SOC6H5 THF, HCl 1% HO COCH3 CH3

+
(H3C)3SiO SOC6H5

Esquema 10

En el primer ejemplo, la reaccin del dieno de Danishefsky con 2-metilpropenal da como producto final 4-formil-4-metilciclohexenona, luego de la hidrlisis del aducto de Diels-Alder. El segundo ejemplo muestra una ruta eficiente para la sntesis de p-acilfenoles a partir del mismo dieno y compuestos carbonlicos -fenilsulfinil--insaturados.176

c) Reacciones de Diels-Alder que involucran heterotomos

Como se ha mencionado anteriormente, en las cicloadiciones de Diels-Alder tanto los dienos como los dienfilos pueden contener uno o ms heterotomos. En esta tesis se discutirn los aspectos sintticos de las reacciones con heterodienfilos, y, en particular, con nitrosocompuestos. Aspectos sintticos de las cicloadiciones con compuestos nitroso como dienfilos La importancia de la utilizacin de dienfilos en los que uno o los dos tomos sean heterotomos, radica en que su cicloadicin con dienos conjugados permite la sntesis de una gran variedad de compuestos heterocclicos de 6 miembros. En particular, son un instrumento fundamental porque permiten crear hasta cuatro centros quirales contiguos en un solo paso de sntesis. Esto puede lograrse con diferentes estrategias sintticas, desde la utilizacin de catalizadores quirales, con dienos y dienfilos aquirales, hasta auxiliares quirales en el dieno, el dienfilo, o en ambos.14

61

Fundamentacin y antecedentes La primera reaccin hetero Diels-Alder de nitroso compuestos fue descrita en 1947 por Wichterle.177 A partir de ese momento, se ha prestado mucha atencin a las generalidades, mecanismo y aplicaciones de estas reacciones en sntesis orgnica.163 Los nitrosocompuestos son dienfilos muy reactivos, y si bien suelen exhibir regioselectividades predecibles, estn descritas en la literatura algunas excepciones. Kresze y Firl encontraron que dos dienos, uno con un grupo atrayente de electrones y otro con un grupo dador de electrones, daban el mismo regioismero como producto de cicloadicin con p-cloronitrosobenceno (Esquema 11).178
R O

+
A: R = NMe2 B: R = COOMe Cl

Cl

Esquema 11

Para el mecanismo de estas reacciones se han propuesto varias posibilidades. La ms simple es la de una cicloadicin concertada [4+2], o reaccin de Diels-Alder, que transcurre a travs de un estado de transicin cclico (a). Sin embargo, hay otras dos alternativas a este mecanismo: una, es que transcurra a travs de un di-radical intermedio (b); la otra, es que este intermedio sea de tipo zwitterin (c) (Esquema 12).163

O N (a) O N R (b) R

O N O R N R

O N (c) R

Esquema 12

62

Fundamentacin y antecedentes Cualquiera de estas dos rutas alternativas tienen caractersticas que hacen razonable su consideracin. El di-radical involucra un radical nitrosilo y un radical alilo en el intermedio de reaccin. Ambos son radicales estabilizados, y esta estabilizacin podra repercutir en una baja energa del intermedio. De modo similar, el zwitterin involucra un catin allico y un anin nitrosilo. De nuevo, esto tendra como consecuencia una baja energa del intermedio. La clave de cualquier mecanismo propuesto es que debe explicar la regioqumica de las reacciones de nitroso compuestos con dienos sustituidos. Algunos autores han propuesto mtodos para predecir esta regioselectividad, con mayor o menor grado de acierto. Kresze, basndose en datos experimentales de regioselectividades, sugiere que la existencia de un mecanismo concertado con un estado de transicin no polar, o un intermedio zwitterinico, depende de la naturaleza de los reactivos.179 A partir de clculos B3LYP/6-31G*, Leach y Houk concluyen que el mecanismo de estas reacciones es concertado, pero no sincronizado, transcurriendo a travs de un estado de transicin apolar. Los autores sostienen que la preferencia por un estado de transicin endo se debe a una interaccin desfavorable entre el par de electrones libres del nitrgeno, y los electrones del dieno, en un estado de transicin exo.163 Este efecto par de electrones libres exo deriva de la preferencia del par de electrones libres del nitrgeno por situarse exo al dieno, y se debe a su fuerte repulsin electrosttica con los electrones del dieno. Una racionalizacin alternativa pero complementaria de este efecto se obtiene considerando las interacciones de los OMF. En una reaccin de Diels-Alder estndar de demanda normal de electrones, la interaccin ms importante es entre el HOMO del dieno y el LUMO del dienfilo, ya que la interaccin entre el HOMO del dieno y el HOMO del dienfilo, es prohibida por simetra. Pero el HOMO de un dienfilo nitroso es la combinacin antienlazante de los pares de electrones libres de los tomos de N y O. Este orbital molecular del dienfilo tienen la simetra adecuada para que exista un solapamiento con el HOMO del dieno (Figura 43). En este solapamiento se generan repulsiones electrostticas entre los cuatro electrones del dieno y el par de electrones libres del nitrgeno. En un estado de transicin endo, estas repulsiones se minimizan.

63

Fundamentacin y antecedentes

O N R

Figura 43: HOMO de un dienfilo nitroso y butadieno

Como dienfilos en reacciones de Diels-Alder se utilizan una gran variedad de nitrosocompuestos, por ejemplo, -cloronitroso (a), cianonitroso (b), nitroso derivados de azcares (c), vinilnitroso (d), iminonitroso (e), arilnitroso (f) y acilnitroso compuestos (g) (Esquema 13).14
.
O Cl R R N NC O N Azcar O N O N RN O N Ar O N R O O N

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

.
Esquema 13

En este trabajo se profundizar en las caractersticas y aplicaciones sintticas de estos dos ltimos grupos de dienfilos. Compuestos arilnitroso y acilnitroso como dienfilos en cicloadiciones [4+2] Las cicloadiciones que involucran dienfilos nitroso proporcionan un eficiente mtodo para la sntesis de una gran variedad de compuestos heterocclicos.171 Con esta metodologa pueden obtenerse aductos a partir del los cuales se pueden sintetizar un gran nmero de molculas biolgicamente activas, as como productos naturales de inters.14,15,180-192 Los dienfilos arilnitroso son generalmente compuestos estables, menos reactivos en reacciones hetero Diels-Alder que los compuestos acilnitroso. Estos ltimos son muy inestables, y normalmente se generan in situ a partir del correspondiente cido hidroxmico o de otros precursores.14 Cuando se generan en presencia de un 1,3-dieno apropiado, se obtiene el
64

Fundamentacin y antecedentes correspondiente cicloaducto con buenos rendimientos. Una ventaja comparativa importante de los compuestos arilnitroso frente a los acilnitrosos, es que, cuando reaccionan lo hacen regioselectivamente con la mayora de los 1,3-dienos. Por ejemplo, el nitrosobenceno reacciona con un derivado de la 1,2-dihidropiridina dando exclusivamente, y con buenos rendimientos el aducto mostrado en el Esquema 14. Esto es til desde el punto de vista sinttico debido a que, con un diseo adecuado de la ruta sinttica, pueden obtenerse selectivamente productos con regioqumica definida. En cambio, cuando el dieno reacciona con un acilnitroso compuesto se obtiene una mezcla los dos regioismeros.14 La pobre regioselectividad exhibida en cicloadiciones con dienfilos nitroso N-acilados y dienos asimtricos ha restringido las aplicaciones sintticas de estos dienfilos.163,193-198 .
N Ph Ph O

N O PhHN HO N COOMe

OH N

COOMe

COOMe

OH

.
Esquema 14

McClure y Danishefsky generan in situ los compuestos arilnitroso a partir de aminas aromticas debidamente funcionalizadas.199 En trabajos ms recientes, los autores describen la sntesis de FR 900482, una aziridina con potentes propiedades antitumorales.200 El paso clave en esta sntesis es la cicloadicin de Diels-Alder entre un dienfilo arilnitroso y un dieno oxigenado (Esquema 15). En todos los casos obtienen la misma regioselectividad en la cicloadicin.
OCONH2 OH OH H O O NH

OMe I MeO O O

OMe

OMe I MeO O O

OH OMe

HO

FR 900482

Esquema 15

Dado que las oxazinolactamas son intermedios claves en la sntesis de compuestos heterocclicos, Sparks et al. consideran el estudio de reacciones de Diels-Alder
65

Fundamentacin y antecedentes intramoleculares de Tipo B (Esquema 7) de compuestos N-acilnitroso como forma de controlar la regioselectividad de la cicloadicin. Esto adems permite la formacin de oxazinolactamas bicclicas, que incorporan anillos de mediano tamao, en un solo paso de reaccin a partir de precursores acclicos.201 La reaccin de cicloadicin intramolecular involucra cidos hidroxmicos de longitud de cadena variable como sustituyentes en la posicin 2 de un 1,3-dieno. Los acilnitroso compuestos se generan in situ por oxidacin del correspondiente cido hidroxmico (Esquema 16). .
n ( )

O Et4NIO4, CHCl3 NH OH 0 C n = 1: 75 % n = 2: 80 %

n ( )

O N O

.
Esquema 16

En la sntesis de (-)-Lepadina B, Kibayashi et al. tambin utilizan la cicloadicin intramolecular como estrategia para controlar la regioselectividad de la reaccin de un compuesto N-acilnitroso como dienfilo.202 La etapa de cicloadicin involucra, en primera instancia, la formacin del cido hidroxmico precursor del dienfilo. Este se forma con hidroxilamina en medio bsico, a partir del ster debidamente funcionalizado. La variante interesante que propone el trabajo es el uso de un medio acuoso para dirigir la estereoselectividad de la reaccin de Diels-Alder intramolecular. El tratamiento del cido hidroxmico con Pr4NIO4 a 0 C en una solucin de agua-DMF 50:1 lleva a la cicloadicin intramolecular, va el compuesto acilnitroso generado in situ. En estas condiciones se obtienen dos diasteremeros. El diasteroismero trans (con respecto a C-4a y C-5) es el compuesto mayoritario, que se obtiene en una proporcin trans:cis 6.6:1, frente a la proporcin 1.7:1 obtenida por los autores en trabajos anteriores, utilizando cloroformo como disolvente (Esquema 17).203-205

66

Fundamentacin y antecedentes

BnO OMOM OBn R O 90 % N O OMOM O

BnO H

BnO 5 4a N O OMOM 6.6:1 H O

N O

R = OMe i R = NHOH

OMOM

i) NH2OH HCl, KOH, MeOH, 0 C ii) Pr4NIO4, H2O-DMF 50:1, 0 C H OH Lepadina B N H H OCH3

Esquema 17

La estereoqumica absoluta de la (-)-epibatidina, potente analgsico no opiceo extrado de la rana venenosa Epipedobates tricolor,206 fue determinada en 1994.207 Kibayashi et al. describen en 1998 una sntesis de (-)-epibatidina en la que la metodologa general involucra la reaccin de hetero Diels-Alder asimtrica de 2-cloro-5-(1,5ciclohexadienil)piridina con el dienfilo acilnitroso derivado de (1S)-8-(2-naftil)-mentol, utilizado como auxiliar quiral.193 Con esta reaccin los autores obtienen una mezcla de los dos regioismeros posibles en relacin 2:1. Cabanal-Duvillard y colaboradores describen, en 2000, la sntesis de la (-)-epibatidina basando su estrategia sinttica en la reaccin de Diels-Alder del sililoxiciclohexadieno con un compuesto acilnitroso derivado de la canforsultama, generado in situ. (Esquema 18).208 Esta reaccin resulta ser regio- y estereoselectiva.
O HO HN O S O NH O N O S O S*

ii

N O N O S O O

H N N

Cl

(-)-epibatidina
S* = (+)-camforsultama

i) Trifosgeno i-PrEtN3, Et2O, NH2OH.HCl, K2CO3, H2O; 85 %. ii) Et4N+IO4-, CH2Cl2, sililoxiciclohexadieno, -78 C - T. amb.

Esquema 18

La reaccin hetero Diels-Alder con compuestos acilnitroso tambin ha sido utilizada para la sntesis de dos compuestos liberadores de nitrosilos (HNO).209 Los aductos obtenidos por cicloadicin de N-hidroxiureas y 9,10-dimetilantraceno (9,10-DMA), a travs de una reaccin retro-Diels-Alder y posterior hidrlisis del acilnitroso compuesto obtenido, son
67

Fundamentacin y antecedentes capaces de liberar HNO, especie sobre la cual hay cada vez ms evidencias de su importancia biolgica.210-212 Los cicloaductos A y B se obtienen a partir de los derivados de N-hidroxiureas correspondientes. A partir de stas, y en presencia del dieno 9,10-DMA, se obtienen los aductos de Diels-Alder. Por descomposicin trmica, en una mezcla de agua-acetonitrilo 1:1 a 40 C, se produce la retro-Diels-Alder y la hidrlisis del compuesto acilnitroso que libera HNO (Esquema 19).
O OEt

COOEt

NH2OH

HOHN O

H N

C
O BnO O H2, Pd/C NH OBn BnO N H NH OH

HO

1) NaH, BnCl NH2 2) O 2N O O N O 1) Bu4N IO4

+ -

NHOBn O NHR

N H

D
O

retro-Diels-Alder

EtO O

CoD

N H

N O

H2O

HNO

2) 9,10-DMA A: R = -CH2COOEt B: R = -CH2CH2OH

Esquema 19

El cido meso-diaminopimlico (DAP) es un importante constituyente de la pared celular de bacterias Gram-negativas. Su sntesis involucra un primer paso de sntesis de un aducto de Diels-Alder, en condiciones de oxidacin de Swern,213,214 entre un acilnitroso compuesto que se genera in situ a partir de un derivado del cido hidroxmico, y cicloheptatrieno. La reaccin, con 79 % de rendimiento global, da como productos una mezcla diasteromrica 3:1. La relacin llega a ser 50:1 luego de recristalizarse, y es punto de partida para los siguientes pasos de reaccin (Esquema 20).215

BocHN

i
NH OH

BocHN O

BocN O HO

O OH NH2 NH2

i)1) (COCl)2, DMSO; 2) -78 C, Piridina, 3 das. 79 %.

meso-DAP

Esquema 20 68

Fundamentacin y antecedentes En la sntesis de (+)-licoricidina, Hudlicky et al. utilizan la cicloadicin de compuestos acilnitroso generados in situ y derivados halogenados de cis-ciclohexadiendioles quirales obtenidos por oxidacin microbiana de compuestos aromticos (Esquema 21).216 Esta reaccin result ser tanto regio- como estereoespecfica, lo que es imprescindible en esta estrategia sinttica, en la que debi encontrarse una metodologa que permitiera la incorporacin de nitrgeno de un modo regio- y estero- controlado.
OH X i) X OH ii) OH X = Cl, Br O R X O iii) X O N O O Licoricidina i) P. putida F/39D ii) DMP/Acetona/p-TsOH iii) RONHOH (R = CBz -bromopiperonil), Bu4N+IO4-, CH2Cl2 O O O NH OH

OH

Esquema 21

Las nitrosoamidinas son heterodienfilos estructuralmente equivalentes a los compuestos acilnitroso, y fueron utilizadas por Miller et al. en la sntesis de cicloaductos precursores de guanidinas funcionalizadas.217 Los autores realizaron un exhaustivo estudio de su reactividad y de la regioqumica de sus reacciones de Diels-Alder de demanda normal de electrones con dienos sustituidos en posiciones 1 y 2. Sus conclusiones fueron que, a pesar de que las nitrosoamidinas son menos reactivas frente a la cicloadicin que los acilnitroso derivados, esta dificultad poda superarse utilizando grupos fuertemente dadores de electrones en el dieno. En estas condiciones, la regioqumica observada fue consistente con la de dienfilos nitroso, y el uso de las nitrosoamidinas proporciona la funcionalizacin adecuada para la sntesis de diversas guanidinas de importancia biolgica (Esquema 22).218 R2 R3 R4 BocHN R4 R3 NBoc N O R1 R2 NBoc BocHN N H OH R1

Bu4NIO4, CH2Cl2

Esquema 22

69

3.- Objetivos

Objetivos La aparicin de parsitos resistentes a una o ms clases de drogas ha frustrado los intentos de erradicar la malaria por medio de quimioterapia, y amenaza con volver obsoletas las drogas actualmente utilizadas. Si bien se han descrito cepas de P. vivax resistentes a cloroquina,219 la resistencia a medicamentos constituye un problema clnico grave slo en el caso de P. falciparum, que causa ms del 85 % de los casos de malaria humana, y gran parte de las muertes por ese origen. La prevalencia cada vez mayor de resistencia a mltiples frmacos ilustra la necesidad ininterrumpida de contar con nuevas drogas activas. Estructuras que incluyen el grupo perxido como farmacforo han mostrado actividad para los casos de resistencia a cloroquina y sus derivados. El compuesto lder de esta serie, la artemisinina, es un endoperxido sequiterpenoide. Asimismo el yingzaosu A, otro endoperxido terpnico, ha sido usado durante mucho tiempo como antiparasitario.5,220 Aparece interesante entonces, estudiar la variacin de la actividad antiparasitaria y antimalrica en particular, cuando el grupo -O-Oes cambiado por el grupo N-O-, aprovechando el isosterismo entre el oxgeno y el nitrgeno. Esta sustitucin significara adems, un cambio sutil en las propiedades de los compuestos, ya que la energa de disociacin del enlace -N-O- es apenas 3 kcal mayor que la del enlace -O-O-.18 Suponiendo un mecanismo de accin que involucra la ruptura del enlace entre los heterotomos por accin del Fe+2, podran generarse nuevos radicales de distinta reactividad, y por lo tanto de toxicidad diferencial para el parsito. Para probar esta hiptesis se sintetizarn distintas oxazinas empleando la reaccin de Diels Alder. Dada la plasticidad del sistema dieno-dienfilo que posee esta reaccin, se intentar evaluar la incidencia de la estructura del dieno y el dienfilo en las propiedades farmacolgicas. En ese contexto, se estudiarn las caractersticas de los compuestos derivados de tres sistemas dinicos diferentes, con 4 compuestos nitroso actuando como dienfilos. Se plantea el uso de un sistema aromtico plano con el que nuestro grupo posee cierta experiencia, que es el derivado tetrametilado de la purpurogalina.16,221 Este posee el sistema dinico en un anillo de siete miembros. Otras estructuras modelo interesantes son los sistemas terpnicos, ya que los dos perxidos antiparasitarios antes mencionados, poseen una estructura de este tipo. Para esta serie de compuestos, se emplearn dienos derivados del rearreglo en medio cido de la carvona, terpeno natural muy abundante. Por ltimo, ya que el yingzaosu A, posee, adems del grupo perxido en un anillo de seis tomos, un sistema ,-dihidroxilado, se utilizarn los
70

Objetivos dienos derivados de la dihidroxilacin microbiana de compuestos aromticos, cuya utilizacin en reacciones de Diels-Alder est ampliamente descrita en la literatura.183-185,216,222,223 En el Departamento de Qumica Orgnica de la Facultad de Qumica, existe gran experiencia en la obtencin de estos dioles. Un objetivo paralelo de este trabajo es la optimizacin de la sntesis de los compuesto arilnitrosos, ya que los mtodos descritos en la literatura no parecen ser muy eficientes.224 A todos los compuestos sintetizados se les realizarn ensayos de actividad biolgica in vitro, evalundolos no solamente contra P. falciparum, sino tambin contra otros protozoarios (T. cruzi, T. brucei rhodesiense y L. donovani), y contra helmintos (N. brasiliensis).

71

4.- Resultados y discusin

Resultados y discusin

4.1.- Sntesis
4.1.1.- Sntesis de dienos y precursores
a) Sntesis de tetrametilpurpurogalina
Para la sntesis de tetrametilpurpurogalina se sigui la tcnica original de Barltrop,225 que utiliza pirogalol como reactivo de partida. En una primera etapa, el pirogalol se oxid a purpurogalina (1) con una solucin acuosa 8 % en iodato de potasio y a 0 C.225 Posteriormente, 1 se permetil en dos etapas sucesivas (Esquema 23). En la primera se utiliz NaOH como base y sulfato de dimetilo como agente metilante. Se obtuvo tri-O-metilpurpurogalina (2) con un rendimiento del 70 %, como cristales amarillos que se recristalizaron de etanol (Esquema 23).

OH OH KIO3 / 0 C 75 % HO HO

OH (CH3)2SO4 NaOH 70 % H3CO H3CO

OH

OCH3

HO

HO

Esquema 23

Su estructura se determin por espectroscopa de 1H RMN y 13 C RMN, y se confirm por difraccin de Rayos X. En la Figura 44 se muestra el diagrama ORTEP del compuesto 2.

72

Resultados y discusin

Figura 44: Diagrama ORTEP del compuesto 2

En la segunda etapa de metilacin se utiliz el mismo agente metilante, y como base se utiliz KOH. La tetrametilpurpurogalina (TMPG) 3 se obtuvo con un rendimiento global de 45 %, como cristales color amarillo que se recristalizaron de metanol (Esquema 24). OH H3CO H3CO O OCH3 (CH3)2SO4 KOH / 86 % H3CO OCH3O H3CO OCH3

Esquema 24

b) Sntesis de eucarvona y derivados

El terpenoide eucarvona (4), que fue preparado por primera vez por Baeyer en 1894,226 se sintetiz a partir de carvona, con bromuro de hidrgeno en cido actico glacial, segn la tcnica descrita por Corey y Burke (Esquema 25).227 El producto, obtenido con un 70% de rendimiento, es un lquido amarillo plido que destil a 123-125 C a 50 mmHg.
73

Resultados y discusin

O O 1) HBr / HAc / -30 C 2) KOH / MeOH / 70 %

4
Esquema 25

Para obtener el eucarvol (5), el grupo carbonilo de (4) se redujo con borohidruro de sodio en metanol y a temperatura ambiente, para dar un aceite amarillo plido con un rendimiento del 95 %. (Esquema 26). Una seal ancha e intensa a 3350 cm-1 en el espectro infrarrojo denot la reduccin a alcohol del grupo carbonilo. O OH NaBH4 / MeOH T. Amb. 95 %

Esquema 26

Como 5 se obtiene como una mezcla racmica, se intent su separacin por cromatografa de gases quiral, pero la mezcla de enantimeros no pudo resolverse. La mezcla racmica de alcoholes se acetil con anhdrido actico en piridina utilizando DMAP como catalizador. La reaccin transcurri en 30 minutos a temperatura ambiente, y se obtuvo la mezcla racmica de acetatos con un rendimiento de 55 %. (Esquema 27). OH O Ac2O / Py / DMAP T. amb. 55%

Esquema 27

74

Resultados y discusin Del mismo modo que con los alcoholes, la mezcla racmica de acetatos se intent resolver por cromatografa de gases quiral, sin lograr la separacin esperada. Debido a las dificultades que plante la separacin de estas mezclas racmicas, se dise una sntesis que permitiera la obtencin de cada uno de los enantimeros por separado. Para sto, se busc un biocatalizador especfico que permitiera reducir selectivamente la eucarvona, y obtener uno solo de los enantimeros. Los alcoholes quirales pueden ser obtenidos por reduccin asimtrica a partir de las correspondientes cetonas proquirales. Existen descritos en la literatura numerosos mtodos de reduccin asimtrica de cetonas, tanto qumicos228,229 como biocatalticos.230-234 Los mtodos qumicos usualmente involucran el uso de reactivos quirales caros, o de metales pesados perjudiciales para el medio ambiente. Los mtodos biocatalticos incluyen el uso tanto de enzimas como de clulas enteras. Generalmente las reducciones de grupos carbonilo con xido-reductasas requieren cofactores (NADH, NADPH), y por lo tanto una de las condiciones para que sean activas, es la regeneracin de los cofactores oxidados. Por esto el uso de clulas enteras que no necesitan el agregado de cofactores, se ha incrementado notoriamente durante la ltima dcada. La levadura de panificacin (Saccharomyces cereviseae) es el microorganismo ms frecuentemente utilizado para la reduccin de cetonas proquirales, obtenindose los correspondientes alcoholes pticamente activos con muy buena enantioselectividad. Sin embargo, la recuperacin de los productos de reaccin suele no ser sencilla.235 Baldesarre et al.,236 describieron por primera vez el uso de clulas enteras de plantas, usando por ejemplo, races de Daucus carota (zanahoria) para la reduccin asimtrica de cetonas proquirales. El comportamiento general de este tipo de reducciones sigue la regla de Prelog, que predice que la transferencia del hidrgeno a la cetona proquiral siempre ocurre por la cara Re-.237 Se decidi intentar la reduccin de eucarvona con trozos de raz de D. carota, con el fin de obtener exclusivamente uno de los enantimeros de 5 en lugar de la mezcla racmica. A fin de poner a punto la tcnica, se utilizaron como sustrato dos compuestos disponibles comercialmente. Uno fue acetofenona, de cuya reduccin por este mtodo hay datos en la literatura,237 y el otro fue benzofuran-2-il-metilcetona.238 Los experimentos se hicieron de acuerdo a la tcnica de Yadav et al.,237 y los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1.

75

Resultados y discusin

Sustrato
O

Tiempo de reaccin 48 hs.

O

Producto
OH

Conversin 70 %
OH

ee 92 %

2 hs.
O

85 %
O

95 %

Tabla 1

A partir de estos resultados se decidi intentar la reduccin con D. carota de eucarvona y tambin de TMPG, cuya reduccin asimtrica podra mostrar inters, a fin de utilizar los alcoholes enantiomricamente puros como dienos de Diels-Alder. Las condiciones de reaccin, se muestran en la Tabla 2.
Sustrato
O

Disolvente Agua Etanol Agua-etanol (9:1)

Tiempo de reaccin 120 hs. 120 hs. 120 hs. 120 hs. 120 hs. 120 hs.

OCHO 3 H3CO H3CO

OCH3

Agua Etanol Agua-etanol (9:1) Tabla 2

En ninguno de los casos se observ conversin del sustrato. En el caso de la TMPG, la no conversin pudo relacionarse con la presencia de grupos dadores de electrones en el anillo aromtico en posicin al grupo carbonilo a reducir, que disminuyen la velocidad de la reaccin.237 En este caso, los tres grupos metoxilo en el anillo aromtico justifican que la reaccin no haya tenido lugar. En el caso de la eucarvona, por el contrario, era de esperar que la reduccin se diera con buenos rendimientos, dado que en la literatura se describen reacciones con sustratos de estructura similar, con buenos resultados.236,237 Otra metodologa utilizada para resolver el problema de obtener enzimticamente los enantimeros por separado, fue el uso de un biocatalizador enantioselectivo para la esterificacin del alcohol con un agente dador de acilo. De este modo, se acetilara slo uno de los dos enantimeros y no la mezcla de ambos. Luego de aislado, el otro enantimero se acetilara por mtodos qumicos convencionales. El alcohol acetilado de este modo, podra
76

Resultados y discusin hidrolizarse tambin por mtodos qumicos, y se dispondra de los dos alcoholes y de los dos acetatos por separado. Se realiz entonces la esterificacin de 5 con acetato de vinilo como agente acilante, y se utilizaron lipasas de varios microorganismos como biocatalizadores. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 3
Lipasa Conversin 24 hs C. antarctica A (Chirazime L5 Lyo) C. antarctica B (Novozym 435) R. miehei C. rugosa (Sigma) M. javanicus P. cepacia (Nat.) P. cepacia (Inm.) Tabla 3 35 % --8% -5% 12 % 48 hs 48 % --12 % -8% 16 %

Con Novozym 435, lipasa de R. miehei y lipasa de M. javanicus, no se obtuvo esterificacin del alcohol. Con lipasas de C. rugosa y de P. cepacia natural e inmovilizada, los porcentajes de conversin fueron muy bajos al trmino de 48 horas de reaccin. En cambio, con la lipasa de C. antarctica A se obtuvo una conversin cercana al 50 % en 48 horas. El hecho de que la mayora de las lipasas muestren la misma preferencia estereoqumica para steres de alcoholes secundarios, se conoce como Regla de Kazlauskas.239 De acuerdo a sta, el ismero esterificado es el que posee configuracin (R) en el carbono del alcohol.240 Se midieron los []20D del alcohol no esterificado por la lipasa y del acetato obtenido, obtenindose valores de []20D = +32 para el primero, y []20D = -20 para el segundo. Las mediciones fueron hechas en cloroformo como disolvente. El acetato obtenido por esterificacin catalizada por la lipasa se desprotegi con K2CO3 en metanol, y se midi nuevamente el []20D del alcohol. El valor obtenido fue []20D = -31. A su vez, al acetilar qumicamente el alcohol que no fue sustrato de la lipasa, y medir su rotacin ptica, se obtuvo un valor de []20D = +21 (Esquema 28).

77

Resultados y discusin

OH

O O CHIRAZIME L5 Lyo 30 C. R = 48 %

OH +

OAc

5
[]20D = +32 Ac2O/Py/DMAP T. amb. 55 % OAc +

[]20D = -20 K2CO3/MeOH T. amb 80 % OH

5
[]20D = +21 []20D = -31

Esquema 28

Estos resultados sugirieron que la lipasa de C. antarctica A era capaz de resolver la mezcla racmica de alcoholes, o que por lo menos, tena un alto grado de selectividad. Estas conclusiones primarias no pudieron afirmarse en virtud de que no pudieron separarse los enantimeros ni de los alcoholes, ni de sus productos de acetilacin. Se decidi hacer el seguimiento de la reaccin por cromatografa de gases utilizando una columna Carbowax, de modo de ver el avance de la reaccin a tiempos ms prolongados. Se observ que la reaccin se enlenteca notoriamente a partir de las 48 horas de reaccin, tiempo en el que la conversin era aproximadamente del 50 %, y en 30 das, la conversin lleg al 85 %. Este comportamiento concuerda con el de una reaccin que involucra la utilizacin de un catalizador selectivo, ya que claramente tienen lugar dos reacciones con cinticas diferentes. En la Figura 45, se muestra el avance de la reaccin, seguida por cromatografa de gases.

Esterificacin de 5 catalizada por lipasa de Candida antarctica A Conversin (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800

Tiempo de reaccin (horas)

Figura 45: Avance de la reaccin de esterificacin del compuesto 5 con acetato de vinilo, catalizada por lipasa de C. antarctica A. 78

Resultados y discusin La esterificacin de alcoholes catalizada por lipasas, y en particular la acetilacin de eucarvol, result una metodologa eficiente para la resolucin de la mezcla racmica. Adems, es una alternativa a la acetilacin qumica que resulta vlida, dado que involucra una metodologa sustentable.

c) Sntesis de derivados de (1S, 2R)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol

Los derivados de (1S,2R)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol utilizados como dienos en las reacciones de Diels-Alder, fueron (1S,2R)-1,2-dihidroxi-3-metil-3,5-ciclohexadieno, y (1S,2S)-3-bromo-1,2-dihidroxi-3,5(1S,2S)-3-cloro-1,2-dihidroxi-3,5-ciclohexadieno,

ciclohexadieno, y sus derivados protegidos como acetnido. Los cis-ciclohexadiendioles se obtuvieron por oxidacin microbiana de compuestos aromticos (tolueno, clorobenceno y bromobenceno respectivamente) con una cepa mutante de Pseudomonas, la P. putida F/39D.241 El proceso de fermentacin se realiz en el CUBBA (Centro Uruguayo de Biotransformaciones y Biocatlisis Aplicada), por parte de un grupo de trabajo que produce estos sintones quirales altamente funcionalizados, como punto de partida para varios grupos de investigacin en el Departamento de Qumica Orgnica. La proteccin de los dioles como acetnido fue una reaccin rpida y prcticamente cuantitativa, en la que se utiliz acetona como disolvente, 4 equivalentes de DMP por cada equivalente de diol, y cido p-toluensulfnico como catalizador (Esquema 29). R R Ps. putida F/39D OH DMP / p-TsOH Acetona / T. amb. 95 % R O

R = CH3, Cl, Br

O 7: R = CH3 8: R = Cl 9: R = Br

OH

Esquema 29

El inters en utilizar como dienos los dioles protegidos, surgi como forma de introducir un factor que diera estereoespecificidad a la reaccin de Diels-Alder. De acuerdo a datos de literatura, en estas condiciones, el ismero obtenido es el producto de cicloadicin anti.216,241
79

Resultados y discusin

4.1.2.- Sntesis de dienfilos

Para la sntesis de compuestos arilnitroso, se intent primero la oxidacin de las correspondientes aminas. Se parti de 3-nitroanilina, y se oxid con perxido de hidrgeno en metanol en presencia de tungstato de sodio dihidratado y EDTA (Esquema 30).242 NH2 N NaWO4.2H2O / EDTA / H2O2 NO2 MeOH / 15 C NO2

Esquema 30

En estas condiciones no se obtuvo el producto de inters, sino una mezcla de 1,3-dinitrobenceno y un polmero insoluble de color rojo intenso, en cuyo espectro de masas se observ un pico m/z = 288 correspondiente a una fragmentacin en una unidad dimrica del producto de polimerizacin de 3-amino nitrobenceno. La reaccin se repiti disminuyendo la cantidad de agente oxidante (H2O2), con el fin de evitar la sobreoxidacin de la amina y la polimerizacin del compuesto nitroso formado. Esto no se consigui, por lo que se cambi la estrategia sinttica para obtener los compuestos nitroso, intentando realizar reducciones de grupo nitro en vez de oxidaciones de aminas. Sntesis de 4-nitrosobenzaldehdo Para esta sntesis parti de 4-nitrobenzaldehdo, y se sigui la tcnica que describe Vogel para la obtencin de nitrosobenceno a partir de nitrobenceno.243 En la primera etapa se obtuvo la hidroxilamina correspondiente por reduccin con Zn del grupo nitro. La hidroxilamina se separ del medio de reaccin por filtracin y lavado del ZnO formado. La etapa de oxidacin de la hidroxilamina a nitroso se hizo en fro, agregando una mezcla previamente enfriada de H2SO4 conc. y solucin de Na2Cr2O7. Se obtuvo un slido rojo insoluble, producto de condensacin de p-hidroxilaminobenzaldehdo y p-azoxibenzaldehdo, formados en la etapa de oxidacin de la hidroxilamina. A partir de este resultado, se decidi utilizar la tcnica de Alway,244 que si bien es una tcnica muy antigua, plantea condiciones
80

Resultados y discusin menos enrgicas para la oxidacin de la hidroxilamina. Esta metodologa fue utilizada tanto en la etapa de oxidacin, como en la de reduccin. La reduccin se llev a cabo con Zn en polvo en etanol absoluto y cido actico glacial. Para la oxidacin, la solucin de hidroxilamina se hizo gotear sobre una solucin de Na2Cr2O7 en H2SO4 diluido. El precipitado formado se filtr rpidamente y se destil por arrastre con vapor. Se obtuvo mayoritariamente el producto de polimerizacin de p-hidroxilaminobenzaldehdo y p-azoxibenzaldehdo, al igual que con la tcnica de Vogel. Finalmente se hizo la reduccin segn la tcnica de Vogel, y la oxidacin volcando la hidroxilamina sobre la solucin de Na2Cr2O7 en H2SO4 diluido, de acuerdo a la tcnica de Alway. De esta forma, con una posterior filtracin del slido formado y destilacin con arrastre con vapor, se obtuvo 10 con 40 % de rendimiento. Otra alternativa que se ensay fue realizar la etapa de reduccin en las condiciones descritas por Fletcher et al..245 Los autores utilizan acetona como disolvente, y agregan agua en pequeas porciones, sin dejar subir la temperatura a ms de 10 C. La hidroxilamina filtrada se recogi en fro, y la oxidacin se realiz en bao de hielo-sal. La separacin del producto del medio de reaccin se hizo por destilacin por arrastre con vapor, y recogiendo el destilado en un Erlenmeyer sumergido en bao de hielo, de acuerdo a una variante descrita por Coleman.246 Esto mejora el rendimiento, debido a la alta presin de vapor a temperatura ambiente de los compuestos nitroso. Adems, a menores temperaturas su solubilidad en agua es menor, por lo que el producto solidifica, evitando una posterior etapa de extraccin. En estas condiciones, el producto 10 se obtuvo con 60 % de rendimiento (Esquema 31). NO2 NHOH Zn / NH4Cl Acetona / Agua 10 C CHO Na2Cr2O7 H2SO4 10 % / -5 C CHO R = 60 % CHO N O

10

Esquema 31

81

Resultados y discusin Sntesis de 4-cloronitrosobenceno El reactivo de partida 4-cloronitrobenceno (11), se obtuvo con buenos rendimientos por nitracin de clorobenceno. Para la sntesis de 4-cloronitrosobenceno se trabaj a partir de los resultados obtenidos en la sntesis de 10. La reduccin de 11 con Zn, utilizando agua como disolvente y a temperatura ambiente, result en una mezcla de 4-cloronitrosobenceno y 4-cloronitrobenceno. Esto demostr que esta reaccin no fue completa. Se repiti la misma tcnica, aumentando la temperatura, y se observ la aparicin de xido de zinc, lo que mostr la efectividad la reduccin. Cuando la oxidacin se hizo a temperatura ambiente, se form el polmero de p-hidroxilaminoclorobenceno y p-azoxiclorobenceno. Se intent volcar la solucin de hidroxilamina de una vez, y no por goteo, y filtrar el slido inmediatamente. De este modo, luego de destilarlo por arrastre con vapor, se obtuvo el producto 12, con un rendimiento de 30 %. Haciendo la reduccin en condiciones de Fletcher, y la oxidacin en fro recogiendo el destilado en bao de hielo, se obtuvo 12 con un 43 % de rendimiento (Esquema 32). NO2 NHOH Zn / NH4Cl Acetona / Agua 10 C Cl Cl R = 43 % Na2Cr2O7 H2SO4 10 % / -5 C Cl N O

Cl

HNO3 cc H2SO4 cc 90 %

12

11

Esquema 32

Fletcher y colaboradores, manejaron otra alternativa para la etapa de oxidacin de la hidroxilamina.245 Utilizaron una solucin acuosa de FeCl3 a -5 C como agente oxidante. Esta variante se ensay en la sntesis de 12, pero el producto se obtuvo con en un 41 % de rendimiento, no mostrando ventajas respecto a la tcnica anterior.

82

Resultados y discusin Sntesis de 4-nitrosotolueno Para la obtencin del 4-nitrosotolueno se siguieron varias rutas sintticas alternativas con el fin de optimizar los resultados. La reduccin en agua y a 60 C se dio en forma rpida, pero en la etapa de oxidacin a temperatura ambiente no se form el slido esperado, sino que se obtuvo una solucin rojiza. Se prob la oxidacin en bao de hielo-sal filtrndose inmediatamente el slido formado, y se destil el producto por arrastre con vapor. De este modo el producto 13 se obtuvo con 25 % de rendimiento. Cuando tanto la etapa de reduccin como la de oxidacin se realizaron segn la tcnica de Fletcher, el producto se obtuvo con un 45 % de rendimiento (Esquema 33). NO2 NHOH Zn / NH4Cl Acetona / Agua 10 C FeCl3 H2O / - 5 C N O

R = 45 %

13

Esquema 33

Para la sntesis de 4-metoxinitrosobenceno se intent la misma tcnica que para 13, pero en la oxidacin la polimerizacin se dio en forma instantnea. Se intent a -5, -10 y -20 C, no obtenindose en ninguno de los casos el producto deseado. Teniendo en cuenta que los compuestos nitroso se sintetizaron para ser utilizados como dienfilos en las reacciones de Diels-Alder, a lo largo de todo el trabajo fue una preocupacin optimizar las tcnicas con el fin de mejorar los rendimientos. En 2004, Gowenlock y Richter-Addo publicaron una revisin bibliogrfica en la que hacen referencia a las tcnicas utilizadas en este trabajo, pero no aportan alternativas que mejoren los resultados obtenidos.224 En la Tabla 4 se resumen las condiciones utilizadas para la sntesis de los compuestos nitroso, y los resultados obtenidos.

83

Resultados y discusin

Dienfilo

Reduccin (NO2 a NHOH) con Zn / NH4Cl

Condiciones Oxidacin (NHOH a N=O)

Na2Cr2O7 / H2SO4 cc sobre hidroxilamina / T. amb. Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 cc / T. amb. Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 cc / T. amb. Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % / T. amb. Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % / -5 C Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % (Filtrado instantneamente) Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % / -5 C FeCl3 / H2O / -5 C Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % / -5 C (Filtrado instantneamente) Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % / -10 C (Filtrado instantneamente) Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % / -20 C (Filtrado instantneamente) Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % (Filtrado instantneamente) Hidroxilamina sobre Na2Cr2O7 / H2SO4 10 % / -5 C (Filtrado instantneamente) FeCl3 / H2O / -5 C

Rendimiento

H2O / T. amb. Ac. Actico glacial / EtOH / T. amb. H2O / T. amb.

Polmero p-azoxibenzaldehdo p-hidroxilaminobenzaldehdo Polmero p-azoxibenzaldehdo p-hidroxilaminobenzaldehdo Polmero p-azoxibenzaldehdo p-hidroxilaminobenzaldehdo 40 % 60 % 4-cloronitrosobenceno (21 %) 4-cloronitrobenceno (50 %) Formacin de compuesto diazoxi 30 % 43 % 41 % Formacin de compuesto diazoxi Formacin de compuesto diazoxi Formacin de compuesto diazoxi Formacin de compuesto diazoxi 25 % 45 %

CHO

H2O / T. amb. Acetona-H2O / 10 C H2O / T. amb. H2O / 60 C H2O / 60 C

Cl

Acetona-H2O / 10 C Acetona-H2O / 10 C
O

H2O / 60 C H2O / 60 C

OCH3

H2O / 60 C H2O / 60 C H2O / 60 C Acetona-H2O / 10 C

Tabla 4: Condiciones de reaccin para la reduccin de grupos nitro a nitroso.

84

Resultados y discusin

4.1.3.- Sntesis de aductos de Diels-Alder

Una vez sintetizados los dienos (tetrametilpurpurogalina, eucarvona y sus derivados reducido y acetilado, y derivados de (1S,2R)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol sustituidos en posicin 3), y los dienfilos (derivados de nitrosobenceno sustituidos en posicin 4), se comenz a trabajar en la sntesis de los aductos de Diels Alder. Aductos de Diels-Alder sintetizados a partir de tetrametilpurpurogalina como dieno Las sntesis de los aductos de Diels-Alder con TMPG como dieno se realizaron de acuerdo al Esquema 34, obteniendo en todos los casos la mezcla racmica resultado del acercamiento del dienfilo por una y otra cara del dieno. H3CO H3CO OCH3O N OCH3 O T. amb. H3CO H3CO R R = H, CHO, Cl, CH3, N(CH3)2 R 14: R = H: 40 hs., 94 %, (Hexano) 15: R = CHO: 12 hs., 96 % (Tolueno) 16: R = Cl: 15 hs., 93 % (Tolueno) 17: R = CH3: 20 % (Tolueno), 48 hs., 92 % (Hexano) 18: R = N(CH3)2 N OCH3O OCH3 O

+
3

Esquema 34

La reaccin de Diels-Alder entre TMPG y nitrosobenceno se hizo a temperatura ambiente, y en distintos disolventes (ter etlico, diclorometano, metanol, tolueno). En este caso, la descomposicin trmica 14 en el medio de reaccin va retro Diels-Alder, y la consiguiente coexistencia del producto y los reactivos en equilibrio, no permitieron su sntesis eficaz.221 Cuando la reaccin se hizo en hexano (disolvente en el cual 14 es insoluble) el desplazamiento del equilibrio hacia la formacin del producto se vio favorecido por su precipitacin en el medio de reaccin. El aducto formado se separ por filtracin, y se purific por recristalizacin de etanol. El compuesto 14, obtenido de este modo con un rendimiento del 94 %, se caracteriz por espectroscopa de resonancia magntica nuclear
1

H RMN y 13C RMN, y su estructura se confirm por difraccin de Rayos X. En la Figura 46

85

Resultados y discusin se muestra el diagrama ORTEP del compuesto 14.247 De este modo, tambin se confirm la regioqumica de la reaccin, dado que de las dos orientaciones posibles del puente -N-O-, solamente se observ una de ellas.

Figura 46: Diagrama ORTEP del compuesto 14.

Segn est descrito en la literatura, el perxido de tetra-O-metilpurpurogalina es trmicamente inestable, y la ruptura del enlace peroxdico resulta en productos de rearreglos moleculares.11,12 En el caso del enlace -N-O-, el comportamiento trmico es diferente. La descomposicin a temperatura ambiente de aductos de Diels-Alder obtenidos por reaccin de diversos dienos con derivados de nitrosobenceno fue descrita ya en 1979 por Kirby et al.248 Aductos formados con tebana como dieno y nitrosoarenos como dienfilos mostraron diferentes grados de disociacin, dependiendo de las caractersticas electrnicas de los sustituyentes situados en posicin para- al grupo nitroso en los nitrosoarenos. La descomposicin trmica de 14 en solucin de CHCl3 se produjo va una reaccin retro Diels Alder (Esquema 35), como lo demostraron los experimentos de 1H-RMN realizados, en los que se demuestra la coexistencia en el equilibrio de las tres especies involucradas en la reaccin.221 Este hecho resulta por dems interesante, dado que los
86

Resultados y discusin compuestos capaces de liberar nitrosilo, o compuestos que puedan hidrolizarse a stos, han cobrado en los ltimos aos cada vez ms importancia biolgica.209-212 Por este motivo se decidi estudiar los aspectos fisicoqumicos de esta reaccin de descomposicin. Los experimentos realizados muestran que utilizando 10 mg/mL como concentracin inicial del aducto, la disociacin del mismo fue del 60 % a 30 C, 78 % a 40 C y 86 % a 50 C. OCH3O k1 k-1 H3CO H3CO OCH3 N O

OCH3O H3CO H3CO N

OCH3 O

+
3

14 H1

Esquema 35

H9

Para establecer los parmetros cinticos de la reaccin retro-Diels-Alder, se estudi la intensidad de la variacin de las seales en el 1H RMN, de hidrgenos especficos (H-1 en el compuesto 14 y H-9 en TMPG). El hidrgeno 9 de 3 aparece con un desplazamiento = 6.88 ppm como un doblete de J = 11.7 Hz, que acopla con el hidrgeno vinlico en el carbono 8. La intensidad de esta seal se incrementa a medida que se produce la descomposicin del aducto. Del mismo modo, la seal correspondiente al hidrgeno 1, cabeza de puente en 14, se ve con un desplazamiento = 5.18 ppm como un doblete que acopla con el hidrgeno vinlico 12 (J = 6.6 Hz), y desaparece con el transcurso de la descomposicin. En las siguientes figuras, se muestran el espectro de protn de 14 (Figura 47) y de 3 (Figura 48).

87

Resultados y discusin

OCHO 3 H3CO

OCH3 O

H3CO

H1 ( = 5.18 ppm)

Figura 47: Espectro 1H RMN del compuesto 14

88

Resultados y discusin

OCHO 3 H3CO OCH3

H3CO

3 H9 ( = 6.88 ppm)

Figura 48: Espectro 1H RMN del compuesto 3

89

Resultados y discusin Los experimentos se hicieron en CDCl3 como disolvente, a 30 y 50 C, con una concentracin inicial del aducto (Ci) de 10 mg/mL, y a 40 C con Ci = 5, 10 y 15 mg/mL. En las Figuras 49 a 52 se muestra el avance de la reaccin retro Diels-Alder, tomando espectros de 1H RMN al inicio de la reaccin, a los 60 y 120 minutos, y a las 48 horas. Estos espectros fueron tomados en la reaccin a 40 C, que parti de una concentracin inicial de 14 de 10 mg/mL. OCH3O k1 k-1 H3CO H3CO OCH3 N O

OCH3O H3CO H3CO N

OCH3 O

+
3

14 H1 ( = 5.18 ppm)

H9 ( = 6.8 ppm)

Figura 49: Espectro 1H RMN tomado al inicio de la reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14 90

Resultados y discusin

OCH3O H3CO H3CO N

OCH3 O

OCH3O k1 k-1 H3CO H3CO OCH3 N O

+
3

14 H1 ( = 5.18 ppm)

H9 ( = 6.8 ppm)

Figura 50: Espectro 1H RMN tomado a los 60 minutos de reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14

91

Resultados y discusin

OCH3O H3CO H3CO N

OCH3 O

OCH3O k1 k-1 H3CO H3CO OCH3 N O

+
3

14 H1 ( = 5.18 ppm)

H9 ( = 6.8 ppm)

Figura 51: Espectro 1H RMN tomado a las 2 horas de reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14

92

Resultados y discusin

OCH3O H3CO H3CO N

OCH3 O

OCH3O k1 k-1 H3CO H3CO OCH3 N O

+
3

14 H1 ( = 5.18 ppm)

H9 ( = 6.8 ppm)

Figura 52: Espectro 1H RMN tomado a las 48 horas de reaccin retro-Diels-Alder del compuesto 14

93

Resultados y discusin La ley de velocidad a 40 C (Figuras 53 y 54) y la energa de activacin (Ea) (Figura 55) se determinaron utilizando el mtodo diferencial, estudiando el sistema al inicio de la reaccin.158 (Tabla 5).
Concentracin inicial del aducto (Ci) (mol L ) 1.3055 10-2 2.611 10-2 3.916 10-2
-1

Velocidad inicial (Vo) (mol L-1 min.-1) 1 10-4 2 10-4 3 10-4

Tabla 5: Concentracin inicial de aducto vs. velocidad inicial (Vo).

lo g C i
-1 -4 ,1 -4 -3 ,9 -3 ,8 -3 ,7 -3 ,6 -3 ,5 -1 ,1 -1 ,2 -3 ,4

P e n d ie n t e =

y = x + 2 ,1 1 6 R2 = 1

-1 ,3 -1 ,4 -1 ,5 -1 ,6 -1 ,7 -1 ,8 -1 ,9 -2

lo g V o

Figura 53: log (velocidad inicial) vs. (concentracin inicial)

T ie m p o (m in u to s )
-3 ,4 0 -3 ,6 5 10 15 20 25 30 35

y = -0 ,0 0 2 4 x - 3 ,6 9 3 R 2 = 0 ,9 8 7 8

L n [A d u c to

-3 ,8 y = -0 ,0 0 8 2 x - 3 ,7 9 7 4 R 2 = 0 ,9 9 9 2 -4

-4 ,2

P e n d ie n te = -k
-4 ,4

y = -0 ,0 2 7 2 x - 3 ,7 2 7 5 R 2 = 0 ,9 9 8 3

-4 ,6

T = 3 0 C .

T = 4 0 C .

T = 5 0 C .

Figura 54: Ln(concentracin aducto) vs. (tiempo) 94

Resultados y discusin

Orden de reaccin = = 1; R2 = 1

Vo = k1[Aducto] Las constantes fueron obtenidas a partir de las concentraciones de equilibrio (ecuacin 1). La constante de velocidad de la reaccin inversa k-1 se determin por combinacin de las ecuaciones (1) y (2). Keq = [TMPG][NOPh] / ([Aducto]) (1)

Keq = k1 / k-1

(2)

La energa de activacin (Ea) se calcul utilizando la ecuacin de Arrhenius (Figura 55). k1 = A e-Ea/RT

1 /T
0 0 ,0 0 3 0 5 -1 0 ,0 0 3 1 0 ,0 0 3 1 5 0 ,0 0 3 2 0 ,0 0 3 2 5 0 ,0 0 3 3 0 ,0 0 3 3 5

-2

-3

P e n d ie n te = -E a /R
-4

-5

y = -1 1 8 7 8 x + 3 3 ,1 6 R 2 = 0 ,9 9 9 9

-6

Ln k

-7
1

Figura 55: Ln (k1) vs. (1/T)

Ea = 23.6 KJ mol L-1; R2 = 0.9999

95

Resultados y discusin El equilibrio de la reaccin retro-Diels-Alder de 14 se caracteriz a partir de la determinacin de las constantes termodinmicas H (Figura 56), G y S, obtenidas de las ecuaciones (3), (4) y (5).249 Ln(Keq) / (1/T) = - H / R (3)

La ecuacin (3) indica que graficando Ln (Keq) en funcin de 1/T, la pendiente de la grfica representa -H / R. Como a intervalos pequeos de temperatura el H de la reaccin es aproximadamente constante, dicha grfica suele ser lineal (Figura 56).249

0 0,00305 -0,5 -1 -1,5 -2 -2,5 -3 -3,5 -4

1/T
0,0031 0,00315 0,0032 0,00325 0,0033 0,00335

Pendiente = - H/R

y = -6882x + 18,952 R2 = 0,9972

Ln Keq

Figura 56: Ln (Keq) vs. (1/T)

H = 13.7 KJ mol L-1; R2 = 0.9972 G = - RTln Keq

(4)

G = H - T S

(5)

Los experimentos realizados muestran que el S no depende de la temperatura.

96

Resultados y discusin
Keq (mol L-1) 2.28 10-2 5.02 10-2 9.29 10-2 K1 (min.-1); R2 2.4 10-3; 0.9878 8.2 10-3; 0.9992 27 10-3; 0.9983 K-1 (min.-1); 1.05 10-1 1.63 10-1 2.93 10-1 Tabla 6 G (KJ mol-1) 2.3 1.9 1.5

T (C) 30 40 50

S (u.e.) 37.6 37.7 37.6

El valor determinado para G, de aproximadamente 2 KJ/mol (0.48 Kcal/mol) es lo suficientemente bajo como para permitir controlar la direccin de la reaccin, hacia la formacin o descomposicin del aducto, simplemente por el retiro del producto de la solucin, o la eliminacin de uno de los reactivos de la mezcla.158,221 El aducto se descompone fcilmente en solucin debido a la liberacin de energa que se produce al recomponer el carcter aromtico del anillo de tropolona, a pesar de que el valor de H para la reaccin (aproximadamente 14 KJ/mol, 3.35 Kcal/mol)), indica que el aducto es estable una vez formado (Esquema 36).
OCH3O H3CO H3CO OCH3 OCH3O H3CO H3CO OCH3 OCH3O H3CO H3CO OCH3 OCH3O H3CO H3CO OCH3

Formas resonantes aromticas de 3

-Esquema 36

Una vez estudiado el comportamiento del compuesto 14 en reacciones de retro-DielsAlder, se procedi a la sntesis de los compuestos 15 a 17 (Esquema 37), variando el patrn de sustitucin en cuanto a sus caractersticas electrnicas en la posicin para- del anillo aromtico del nitrosoareno. El compuesto 15 se obtuvo en 12 horas de reaccin en tolueno como disolvente. El producto, insoluble en el disolvente de reaccin, precipit en el medio con un rendimiento del 96 %. En el caso del compuesto 16, la sntesis se realiz tambin en tolueno, y luego de 15 horas se destil a presin reducida la mitad del disolvente, y el producto precipit en el medio de reaccin. Tanto el compuesto 15 como 16, demostraron ser estables en solucin, no observndose descomposicin.

97

Resultados y discusin

OCHO 3 H3CO + H3CO OCH3 N O T. amb. H3CO O H3CO N OCHO 3 OCH3

R R = H, CHO, Cl, CH3, N(CH3)2 R 14: R = H: 40 hs., 94 %, (Hexano) 15: R = CHO: 12 hs., 96 % (Tolueno) 16: R = Cl: 15 hs., 93 % (Tolueno) 17: R = CH3: 20 % (Tolueno), 48 hs., 92 % (Hexano) 18: R = N(CH3)2

Esquema 37

El producto 17 se obtuvo en tolueno con un 20 % de rendimiento. El efecto dador de electrones del metilo en posicin para- favorece la descomposicin del aducto en solucin va retro Diels-Alder, mientras que en el caso de los compuestos 15 y 16, los sustituyentes atrayentes de electrones (CHO y Cl), hacen menos favorable la reaccin inversa. Este efecto fue descrito por Kirby et al. en la sntesis de aductos de tebana con nitrosoarenos sustituidos en posicin para por grupos dadores y atrayentes de electrones.248 En base a esto, se intent la sntesis de 17 utilizando hexano como disolvente. En este medio en el que el aducto es insoluble, se favoreci la reaccin directa, desplazndose el equilibrio por precipitacin del producto. En estas condiciones, en 48 horas se obtuvo 17 con un 92 % de rendimiento. El aducto 18, producto de reaccin de TMPG con p-N,N-dimetilaminonitrosobenceno no se obtuvo en las condiciones de reaccin de los dems compuestos de la serie. Se intent modificar estas condiciones, elevando la temperatura a 60 C por 24 horas, y luego calentando la reaccin a reflujo en tolueno por 48 horas ms. De este modo tampoco hubo avance de la reaccin. Se intent utilizar cidos de Lewis (AlCl3 y TiCl4) como catalizadores, no obtenindose resultados. Esto se atribuy a que el grupo N,N-dimetilamino es un fuerte dador de electrones, convirtiendo al grupo nitroso en un muy mal dienfilo, por lo que la reaccin de Diels-Alder no tuvo lugar. La regioqumica de las reacciones de Diels-Alder entre TMPG y derivados de nitrosobenceno puede explicarse en base a las consideraciones de la teora de los OMF. En el caso de dienfilos arilnitroso utilizados en reacciones de Diels-Alder de demanda normal de electrones, es el nitrgeno el tomo que tiene un mayor coeficiente de

98

Resultados y discusin contribucin al LUMO, por ser menos electronegativo que el oxgeno. Es el tomo ms deficiente en electrones . En el caso del dieno tetrametilpurpurogalina, no es tan claro cul de los tomos es el que ms contribuye el HOMO. Analizando su estructura, se ve que si bien el dieno est sustituido en el carbono C-1 con un grupo fuertemente dador de electrones, como lo es el grupo metoxilo, tambin tiene un sustituyente atrayente de electrones como lo es el carbonilo de la cetona en C-1, conjugado con el dieno. Los efectos de ambos sustituyentes del dieno se contraponen. El grupo carbonilo en C-1 hace que el tomo de mayores coeficientes en la combinacin lineal sea C-1, y el sustituyente metoxilo en C-1 hace que el carbono de mayores coeficientes sea C-4 (Figura 57). C2

C1

O R
C4

OCH3O H3CO H3CO TMPG

C1

OCH3
C2 C3 C4

OCH3

C3

- trayente

Efecto del grupo carbonilo de electrones, sustitudo en C1 del dieno. O N

Efecto del grupo metoxilo, dador de electrones, sustitudo en el C1 del dieno.

Mayor contribucin del tomo de nitrgeno, al LUMO del dienfilo.

O N

Figura 57: Consideraciones sobre los coeficientes de contribucin a los Orbitales Moleculares de Frontera de los tomos del dieno y del dienfilo.

A partir del anlisis de los espectros de RMN y de la orientacin del enlace N-O- que se muestra en el diagrama ORTEP del compuesto 14, puede afirmarse que la regioqumica de la reaccin es tal que el carbono C-4 del dieno se une al tomo de nitrgeno del dienfilo, y el tomo de oxgeno del dienfilo se une al carbono C-1 del dieno (Figura 58).

99

Resultados y discusin

OCHO 3 H3CO OCH3

H3CO

O N

Figura 58: Regioqumica de la reaccin de Diels-Alder entre tetrametilpurpurogalina, y derivados de nitrosobenceno.

En cuanto a la estereoqumica de la reaccin, debido a que la tetrametilpurpurogalina es una molcula plana, el acercamiento del dienfilo puede darse igualmente por ambos lados del plano del dieno. Como se ha mencionado en el captulo de antecedentes, las reacciones con nitrosocompuestos cumplen la regla de Alder, dando lugar al aducto endo. Esto se debe no solamente a la mayor estabilizacin del estado de transicin por las interacciones del sistema del dieno y del anillo aromtico, sino tambin a que un estado de transicin exo sera muy inestable debido a las interacciones entre los electrones del dieno y el par de electrones libres del nitrgeno.163 Aductos de Diels-Alder sintetizados a partir de eucarvona y derivados como dienos Los aductos de Diels-Alder utilizando eucarvona como dieno se obtuvieron a temperatura ambiente y con THF como disolvente. En el Esquema 38 se muestran los tiempos de reaccin, y los rendimientos obtenidos en cada uno de los casos. O N + O THF seco T. amb. R R = H; CHO; Cl; CH3; N(CH3)2 R O O N 19: R = H: 12 hs., 98 % 20: R = CHO: 10 hs., 95 % 21: R = Cl: 15 hs., 87 % 22: R = CH3: 24 hs., 90 % 23: R = N(CH3)2

Esquema 38 100

Resultados y discusin Los compuestos 19 a 22 se obtuvieron como mezclas racmicas y con buenos rendimientos, y a diferencia de los aductos de TMPG, no precipitaron en el medio de reaccin. Como contrapartida, fueron estables en solucin. No se observ reversin de la reaccin, permitiendo su purificacin por cromatografa en columna. El hecho de que el dieno no tenga carcter aromtico, como en el caso de TMPG, hace que la reaccin retro-DielsAlder no se vea favorecida desde el punto de vista energtico. Para confirmar las estructuras de los productos obtenidos, se realizaron espectros de RMN tanto mono- como bidimensionales, as como IR y espectrometra de masas. A modo de ejemplo, en la Figura 59 se muestra el espectro de 1H RMN del dieno eucarvona, y en la Figura 60, el espectro 1H RMN del compuesto 19, producto de Diels-Alder entre sta y nitrosobenceno. Comparando ambas figuras se puede observar la aparicin de las seales de los hidrgenos aromticos del nitrosobenceno, la desaparicin de las seales de los 3 hidrgenos vinlicos del dieno, y la aparicin de las seales de los 2 hidrgenos vinlicos de 19, la aparicin a = 3.98 ppm de la seal correspondiente al hidrgeno 5, cabeza de puente de 19 y la diferenciacin de los hidrgenos gem en posicin 3, debido a la nueva disposicin geomtrica que hace que estos hidrgenos sientan en forma diferente los efectos del carbonilo adyacente y del doble enlace espacialmente prximo (Tabla 7).

Compuesto 4

6.13 (dd; J1 = 8.1 Hz, J2 = 1.5 Hz, 1H, vinlico) 5.62 (dd; J1 = 11.6 Hz, J2 = 1.4 Hz, 1H, vinlico) 5.43 (dd; J1 = 11.6 Hz, J2 = 8.1 Hz, 1H, vinlico) 2.64 (s; 2H, gem)

Compuesto 19 7.24 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 7.4 Hz, 2H, ArH) 7.00 (d ancho; J = 8.4 Hz, 2H, ArH) 6.95 (t ancho; J = 7.3 Hz, 1H, ArH) 6.15 (dd; J1 = 9.1 Hz, J2 = 7.4 Hz, 1H, vinlico) 6.03 (d; J = 9.1 Hz, 1H, vinlico) 3.98 (d; J = 7.4 Hz, 1H, cabeza de puente) 3.41 (d; J = 13.4 Hz, 1H, gem) 2.27 (d; J = 13.4 Hz, 1H, gem)

Tabla 7

101

Resultados y discusin

Figura 59: Espectro 1H RMN del compuesto 4.

102

Resultados y discusin

O O N

19

Figura 60: Espectro 1H RMN del compuesto 19.

103

Resultados y discusin El producto 23 no se obtuvo en 72 horas de reaccin, an en las condiciones ms drsticas en cuanto a temperatura (T. amb., 60 C, reflujo en tolueno), presin, y uso de cidos de Lewis como catalizadores (TiCl4 y AlCl3). Esto se atribuy, al igual que en los casos anteriores, a que la amina en la posicin para del anillo aromtico convierte al grupo nitroso en un mal dienfilo. Como contrapartida, en los casos de los otros compuestos nitroso utilizados como dienfilos para reaccionar con eucarvona, los sustituyentes no demostraron tener gran influencia sobre conversin y velocidad de la cicloadicin. Si bien las diferencias en los tiempos de reaccin estaran de acuerdo con una influencia positiva de los grupos atrayentes de electrones y negativa de los dadores, los rendimientos de las cuatro reacciones fueron comparables y muy buenos. La regioqumica de las reacciones de Diels-Alder entre los dienfilos nitroso y eucarvona como dieno, tambin merece discusin. El dieno eucarvona tiene sustituyentes que producen efectos opuestos, en cuanto al coeficiente de contribucin de sus carbonos C-1 y C-4 al HOMO, del mismo modo que en el caso de la TMPG (Figura 61). -

O N Eucarvona
C1 C2 C1 C2 C3 C4 C4 C2 C3 C4 C1

O N

O R

C3

Mayor contribucin del tomo de nitrgeno, al LUMO del dienfilo.

Efectos opuestos de los dos grupos dadores de electrones sustituidos en C1 y C4 del dieno, y efecto del grupo atrayente de electrones, sustituido en el carbono C1.

Figura 61: Efecto de los sustituyentes de la eucarvona sobre el coeficiente de contribucin de los carbonos C-1 y C-4 del dieno al HOMO, y coeficiente de contribucin al LUMO de los tomos del dienfilo.

El dieno tiene dos grupos alquilo dadores de electrones, sustituidos en los carbonos C-1 y C-4. Adems, posee un grupo carbonilo atrayente de electrones conjugado con el dieno, como sustituyente en el carbono C-1.
104

Resultados y discusin Pese a las influencias opuestas de los sustituyentes del dieno en la eucarvona, la reaccin transcurre con una regioqumica definida. El aducto de Diels-Alder de eucarvona y nitrosobenceno fue sintetizado anteriormente en varias oportunidades. En 1979, Hart y colaboradores propusieron que esta reaccin era regioselectiva, y que era el tomo de oxgeno el que se una al carbono C-1 del dieno. En esta oportunidad, los autores desarrollaron su hiptesis mediante experimentos de espectroscopa de 1H RMN, y luego la corroboraron por medio de una secuencia sinttica que les llev a la obtencin de un compuesto de estructura inequvoca.17 Posteriormente, la estructura de este aducto de Diels-Alder, y por lo tanto la regioqumica de la reaccin, se confirmaron en nuestro grupo de trabajo por cristalografa de Rayos X.250 En cuanto a la estereoqumica de la reaccin, es razonable que el acercamiento del nitrosobenceno al dieno se d tanto por una cara de la molcula como por la otra. Pero la eucarvona no es plana, sino que sus ngulos de enlace hacen que haya una de las caras que se vea un poco ms impedida que la otra, debido a la ubicacin tanto del grupo carbonilo como de uno de los metilos en gem. En la Figura 62 se muestra una imagen de la molcula de eucarvona, optimizada utilizando mtodos semiempricos (Hamiltoniano AM1).251 Como puede verse, las dos caras del dieno no son equivalentes, pudiendo existir selectividad facial.

Figura 62: Eucarvona optimizada por AM1

105

Resultados y discusin Otro dieno utilizado en las reacciones de Diels-Alder fue el eucarvol, producto de reduccin de la eucarvona. Todas las reacciones se hicieron a temperatura ambiente y en THF como disolvente. Las condiciones de reaccin y los resultados obtenidos se muestran en el Esquema 39.
OH N O THF T. amb.

OH O N 24: R = H: 24 hs., 92 %; [anti/syn] = 9/1 25: R = CHO: 24 hs., 95 %; anti 26: R = Cl: 24 hs., 95 %; [anti/syn] = 9/1 27: R = CH3: 72 hs., 70 %; anti

+
R R = H; CHO; Cl; CH3

Esquema 39

La cicloadicin de 5 con nitrosobenceno dio una mezcla de los ismeros anti y syn, en una relacin 9:1 del aducto en el cual el puente N-O- est en posicin anti respecto al OH, respecto al que est en posicin syn. En los trabajos de Hart y colaboradores se estudi la estereoqumica de las reacciones de Diels-Alder entre derivados de 2,2-dimetil-3,5ciclohexadien-1-ol y nitrosobenceno.17 En todos los casos, esta cicloadicin fue 100 % estereoselectiva, obtenindose nicamente el aducto en el cual el enlace N-O- est syn respecto al alcohol. Los autores lo explicaron por la mayor estabilidad de este compuesto al ser posible formar un enlace de hidrgeno entre el oxgeno proveniente del dienfilo, y el hidrgeno del alcohol. Como dieno derivado de cicloheptatrieno los autores utilizaron la eucarvona. Una vez obtenido el aducto de Diels-Alder con nitrosobenceno, redujeron la cetona a alcohol, obteniendo una mezcla 1:1 de los dos estereoismeros syn y anti. Las estructuras de ambos compuestos las caracterizaron por mtodos espectroscpicos, y las corroboraron por mtodos qumicos. La estructura de los compuestos sintetizados en este trabajo de tesis fue asignada por espectroscopa de resonancia magntica de protn, comparando los datos obtenidos con los de literatura.17 En base a estos resultados se puede afirmar que la reaccin no es 100 % estereoselectiva. En los casos en que se obtuvo un solo producto, ste fue el ismero anti. En los casos en que se obtuvieron los dos estereoismeros, el aducto anti se obtuvo como producto mayoritario. Estos resultados se contraponen con los obtenidos por Hart para los
106

Resultados y discusin aductos de nitrosobenceno derivados de 2,2-dimetil-3,5-ciclohexadien-1-ol como dieno. Esto puede explicarse, dado que la mayor flexibilidad de los aductos derivados de eucarvol en comparacin con los derivados del dieno utilizado por Hart, dificulta la formacin del enlace de hidrgeno entre el tomo de hidrgeno del alcohol y el tomo de oxgeno del puente N-O. En las Figuras 63 y 64, se muestran los espectros de 1H RMN de los dos aductos obtenidos. HO H O N

24

Figura 63: Espectro 1H RMN del compuesto 24 anti 107

Resultados y discusin

H OH O N

24

Figura 64: Espectro 1H RMN del compuesto 24 syn

108

Resultados y discusin Una de las diferencias fundamentales entre los espectros de 1H RMN del aducto anti y el aducto syn son las seales de los hidrgenos vinlicos, que en el compuesto anti se ven claras y diferenciadas, y en el compuesto syn se confunden. El hidrgeno 8 se ve como un doble doblete a = 6.21 ppm, que acopla con el otro hidrgeno vinlico (9) y con el hidrgeno cabeza de puente (1), con constantes de acoplamiento J1 = 9.4 Hz y J2 = 6.7 Hz respectivamente. El hidrgeno 9 se ve como un doble doblete, a = 5.95 ppm acoplando con 8 y con 1 (J = 1.0 Hz). En el aducto syn los hidrgenos vinlicos se ven juntos, como un multiplete en = 6.14-6.08 ppm. Otras seales que se diferencian claramente en uno y otro espectro son las correspondientes a los hidrgenos en gem en el carbono 3. En el aducto anti, stos aparecen con desplazamientos diferentes, vindose uno de ellos a = 1.81 ppm y el otro a = 1.21 ppm. Los dos se ven como un doble doblete, acoplando entre ellos con una J = 13.5 Hz., y con el hidrgeno adyacente al alcohol con diferentes constantes de acoplamiento (J = 5.6 Hz y J = 9.4 Hz respectivamente). En el aducto syn, los dos hidrgenos se ven como una nica seal, un doblete a = 1.70 ppm, con una constante de acoplamiento con el hidrgeno adyacente al alcohol de J = 4.0 Hz (Tabla 8). Estos datos espectroscpicos, al igual que los puntos de fusin medidos a cada uno de los dos diastermeros, son concordantes con los descritos en la literatura.17
Compuesto 24 (anti) 6.21 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 1H, vinlico) 5.95 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 1.0 Hz, 1H, vinlico) 1.81 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 5.6 Hz, 1H, gem) 1.21 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 9.4 Hz, 1H, gem) Tabla 8 Compuesto 24 (syn) 6.14 6.08 (m; 2H, vinlicos) 1.70 (d; J = 4.0 Hz, 2H, gem)

En el caso del compuesto 26, tambin se obtuvo la mezcla de diastermeros en la misma proporcin que en el caso de 24. Las diferencias en los espectros 1H RMN de ambos ismeros, son semejantes a las discutidas para el caso del compuesto 24 (Tabla 9).
Compuesto 26 (anti) 6.22 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 1H, vinlico) 5.95 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 1.0 Hz, 1H, vinlico) 1.81 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 5.7 Hz, 1H, gem) 1.25 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 9.5 Hz, 1H, gem) Tabla 9 Compuesto 26 (syn) 6.14 6.06 (m; 2H, vinlicos) 1.70 (d; J = 4.3 Hz, 2H, gem)

109

Resultados y discusin Los compuestos 25 y 27 se obtienen como nicos productos de reaccin, en ambos casos el aducto anti. La estereoqumica de estos compuestos se determin por experimentos de 1H RMN. El compuesto 27 se obtuvo con un rendimiento menor que sus anlogos, y la reaccin fue considerablemente ms lenta. Esto puede atribuirse a que la influencia del grupo metilo en posicin para en el anillo, hace que el 4-nitrosotolueno sea el peor dienfilo de los 4, pero no puede afirmarse, dado que en las otras series de compuestos sta diferencia no fue notoria. La regioselectividad de todas las reacciones que involucraron este dieno, tambin pudo racionalizarse utilizando las aproximaciones de la teora de orbitales moleculares de frontera. De acuerdo a sta, las interacciones ms favorables se dan entre el HOMO del alcohol, y el LUMO del compuesto nitroso. De acuerdo a los datos espectroscpicos obtenidos, en todos los casos la cicloadicin fue regioselectiva, a pesar de que el dieno tiene dos sustituyentes alquilo dadores de electrones (uno en el carbono C-1 y otro en el carbono C-4) que imponen en l, efectos contrapuestos. El grupo metilo dador de electrones en el carbono C-1, convierte al carbono C-4 en el tomo con mayores coeficientes de contribucin al orbital molecular del dieno. Por otro lado, el sustituyente alqulico en el carbono C-4, hace que el tomo que ms contribuya al orbital molecular, sea el carbono C-1 (Figura 65). -

OH

O Eucarvol (5)
C1 C2 C1 C2 C3 C4 C4

O N

C3

Mayor contribucin del tomo de nitrgeno, al LUMO del dienfilo.

Efectos opuestos los dos grupos dadores de electrones sustituidos en C1 y C4 del dieno.

Figura 65: Efecto de los sustituyentes de 5 sobre el coeficiente de contribucin de los carbonos C1 y C4 del dieno al HOMO, y contribucin al LUMO de los tomos del dienfilo.

La cicloadicin se da entre el C-4 del dieno, y el tomo de nitrgeno del dienfilo, y entre el tomo de oxgeno de ste, y el carbono C-1 del dieno (Figura 66).
110

Resultados y discusin

HO

O
C1 C2 C3 C4

Figura 66: Regioqumica de la reaccin de Diels-Alder entre el alcohol 5 y derivados de nitrosobenceno.

Con el compuesto 6 (derivado acetilado del alcohol 5) como dieno en la reaccin de Diels-Alder, y los mismos dienfilos, se obtuvieron los aductos 28 a 31 (Esquema 40). O O O N O THF T. amb.

H O N 28: R = H: 24 hs., 95 % 29: R = CHO: 24 hs., 95 % 30: R = Cl: 72 hs., 80 % 31: R = CH3: 170 hs., 65 %

+
R R = H; CHO; Cl; CH3

Esquema 40

Las sntesis se hicieron todas a temperatura ambiente y en tetrahidrofurano como disolvente. Los compuestos 28 y 29 se obtuvieron con buenos rendimientos, y en un tiempo similar al de obtencin de los aductos usando eucarvona o su alcohol derivado como dienos. Los productos 30 y 31, en cambio, se obtuvieron con menor rendimiento y se necesit ms tiempo de reaccin. La diferencia de los espectros de protn de estos compuestos, con los de los correspondientes alcoholes, es el desplazamiento hacia campos menores del hidrgeno adyacente al acetato, en comparacin con el hidrgeno adyacente al alcohol de los aductos sintetizados a partir de 5. Esto se debe al mayor desblindaje que le impone el grupo acetato a este hidrgeno. La seal correspondiente a este hidrgeno se presenta, en los derivados del dieno 6, con un desplazamiento en el entorno de 5 ppm, mientras en los derivados de

111

Resultados y discusin alcoholes se presentan alrededor de 4 ppm. En la Figura 67 se muestra el espectro 1H RMN del compuesto 28. O O H

O N

28

Figura 67: Espectro 1H RMN del compuesto 28

112

Resultados y discusin Las consideraciones en base a la teora de orbitales moleculares de la regioqumica de estas reacciones, es similar a las discutidas para el caso del dieno 5. En cuanto a la estereoqumica, en todas las reacciones se obtuvo solamente el producto anti. Esto se concluy a partir del estudio de los espectros 1H RMN, que mantienen los mismos patrones que los correspondientes a los aductos anti de la serie sintetizada a partir del dieno 5. Estos aductos derivados del dieno 6 no tienen la posibilidad de formar enlaces de hidrgeno, como s la tienen los derivados del eucarvol. Analizando una imagen de 6, optimizada por mtodos semiempricos (Hamiltoniano AM1), se observa que el grupo acetato impone un impedimento estrico sobre una de las caras del dieno. Esto tambin podra justificar la estereoselectividad de la reaccin. (Figura 68).

Figura 68: Compuesto 6 optimizado por AM1.

113

Resultados y discusin Aductos de Diels-Alder sintetizados a partir de derivados sustituidos en posicin 3 de (1S,2R)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol como dieno Otra serie de compuestos que se utilizaron como dienos fueron los derivados de (1R,2S)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol sustituidos en la posicin 3. Analizando el dieno (1S,2R)-3-metilciclohexa-3,5-dien-1,2-diol desde el punto de vista de la teora de orbitales moleculares de frontera, se puede predecir que el tomo de carbono con mayor coeficiente de contribucin al HOMO ser el carbono C-4, dado que el dieno tiene en C-1 un sustituyente dador de electrones como el grupo metilo. En el caso de los dienfilos, al igual que en los casos anteriores, ser el tomo de nitrgeno el que tenga la mayor interaccin con el tomo de carbono C-4 del dieno, y el tomo de oxgeno el que se una al tomo de carbono C-1 en la cicloadicin (Figura 69).
C2 C1 C3 C4

OH

O OH N

Figura 69: Regioqumica esperada para la reaccin de Diels-Alder entre (1R,2S)-3-metilciclohexa-3,5-dien-1,2-diol y derivados de nitrosobenceno.

Las sntesis de los aductos de Diels-Alder utilizando (1S,2SR)-3-metilciclohexa-3,5dien-1,2-diol como dieno se hicieron a temperatura ambiente y en tetrahidrofurano seco como disolvente. En todos los casos, las reacciones dieron dos productos, los aductos syn y anti (Esquema 41).
N OH O R THF T. amb. R R = H; CHO; Cl; CH3 N O OH OH Aducto syn (a) O

OH OH 32: R = H: 20 hs., 78 %; (a)/(b) = 1.4 33: R = CHO: 15 hs., 80 %; (a)/(b) = 1.2 34: R = Cl: 24 hs., 75 %, (a)/(b) = 1 35: R = CH3: 48 hs., 60 %; (a)/(b) = 1.6

+
OH

Aducto anti (b)

Esquema 41

114

Resultados y discusin Los ismeros se separaron por cromatografa en columna de Slica gel utilizando como fase mvil una mezcla hexanos:acetato de etilo 1:1. El ismero anti fue, en todos los casos, el ms retenido de los dos productos, por la fase estacionaria. El aducto syn fue el compuesto mayoritario, a pesar de ser el ms impedido estricamente, salvo en el caso en que el dienfilo fue 4-cloronitrosobenceno, en el que se obtuvo una mezcla equimolecular de cada estereoismero. Una explicacin para ambas observaciones sera la capacidad del aducto syn de formar un enlace de hidrgeno entre el oxgeno del puente N-O y el hidrgeno del alcohol en el carbono 2. Esta posibilidad no existe para el aducto anti. Est descrito en la literatura que la reaccin de Diels-Alder con el diol previamente protegido como acetnido actuando como dieno, da como nico producto el aducto anti.183,241 Para la identificacin de los ismeros, se protegieron los aductos con DMP, y por mtodos espectroscpicos de resonancia magntica nuclear, se compararon sus estructuras con la del aducto obtenido a partir del diol previamente protegido. Como los aductos con el diol sin proteger son inestables y se descomponen al cabo de pocas horas de haber sido sintetizados, la proteccin de los aductos se hizo in situ. Una vez que la reaccin de Diels-Alder fue completa, se destil el disolvente a presin reducida, el residuo se tom en acetona, se agregaron 4 equivalentes de DMP por equivalente de diol y un cristal de cido p-toluensulfnico. En estas condiciones, la proteccin de los aductos se llev a cabo con buenos rendimientos. Paralelamente, se protegi el diol como acetnido, y se hizo la cicloadicin utilizndolo como dieno (Esquema 42).
N OH O R THF T. amb. N

O OH OH Aducto syn (a)

OH OH R N O Aducto syn (a) O N O O O

O O

+
OH

DMP/p-TsOH acetona/T. amb.

R R = H; CHO; Cl; CH3 DMP/p-TsOH acetona/T. amb. 30 min. 90 % N O O

Aducto anti (b)

THF T. amb.

36: R = H: 22 hs., 70 % 37: R = CHO: 16 hs.,75 % 38: R = Cl: 26 hs., 70 % 39: R = CH3: 48 hs., 55 %

R Aducto anti (b)

+
R R = H; CHO; Cl; CH3

36: R = H: 18 hs., 85 % 37: R = CHO: 15 hs., 90 % 38: R = Cl: 24 hs., 85 % 39: R = CH3: 40 hs., 70 %

Esquema 42

115

Resultados y discusin Los aductos protegidos in situ luego de la reaccin de Diels-Alder se separaron por cromatografa en columna de Slica-gel con una mezcla hexano:acetato de etilo 8:2 como fase mvil. Una vez aislados, se determin su estructura por mtodos espectroscpicos. Los espectros de resonancia magntica nuclear fueron comparados con los de los aductos sintetizados a partir del diol previamente protegido. A partir de esta comparacin, se asignaron las configuraciones syn y anti a cada uno de los compuestos. Para determinar la estereoqumica de los compuestos 32 a 35, se desprotegieron los acetnidos 36 a 39 con resina cida en una mezcla 1:1 de metanol y agua a temperatura ambiente, y se compararon sus espectros con los de los aductos obtenidos directamente a partir de los dioles sin proteger. De esta manera, fueron asignadas las configuraciones syn y anti de todos los compuestos (Esquema 43). O R N O Aducto syn (a) 36: R = H 37: R = CHO 38: R = Cl 39: R = CH3 O O O O R Resina Dowex - 50 N MeOH, H20, T. amb N OH O OH OH Aducto syn (a) OH O N

Aducto anti (b)

32: R = H: 20 hs., 85 % 33: R = CHO: 22 hs., 87 % 34: R = Cl: 24 hs., 80 % 35: R = CH3: 20 hs., 82 %

R Aducto anti (b)

Esquema 43

Es de esperar, teniendo en cuenta la teora de orbitales moleculares de frontera, y los datos de literatura,183,216 que las cicloadiciones que involucran derivados halogenados de 3,5-ciclohexadien-1,2-diol como dienos, tengan la misma regioqumica que las que utilizan como dieno (1S,2R)-3-metilciclohexa-3,5-dien-1,2-diol. El tomo de nitrgeno del dienfilo debe unirse al carbono C-4 del dieno, y el tomo de oxgeno, al tomo de carbono C-1. Los aductos de Diels-Alder que involucran (1S,2S)-3-bromociclohexa-3,5-dien-1,2diol y (1S,2S)-3-clorociclohexa-3,5-dien-1,2-diol como dienos, son inestables. Los aductos con los dioles sin proteger se descomponen rpidamente en el medio de reaccin. El nico aducto que pudo aislarse fue el obtenido a partir de (1S,2S)-3-bromociclohexa-3,5-dien-1,2diol como dieno y 4-cloronitrosobenceno como dienfilo. Pudo verse su formacin por cromatografa en capa fina. Las funciones diol se protegieron in situ con DMP, y as la mezcla
116

Resultados y discusin de aductos pudo aislarse y determinar la estructura de cada uno de los compuestos (Esquema 44).
N O

Cl R OH R THF/T. amb R = H; CHO; Cl; CH3 N O Cl OH OH OH

Cl O

OH OH N

Aducto syn (a) R Aducto anti (b)

Br O Br OH OH OH O N N

Br

R OH R THF/T. amb R = H; CHO; CH3

OH OH Aducto syn (a)

Br OH OH O OH Cl N DMP/p-TsOH acetona/T. amb. 30 min.

Aducto anti (b)

Br N OH O Cl THF T. amb. Cl

O N Br

Br O Br O Aducto syn (a) O

O O

+
OH

O N

OH Aducto syn (a) Cl

Cl Aducto anti (b) 42: 24 hs., 68 %; (a)/(b) = 1.1

Aducto anti (b)

Esquema 44

En virtud de la inestabilidad de la mayora de los aductos con los dioles sin proteger, se protegi primero el diol como acetnido, y luego se hizo la reaccin de Diels-Alder (Esquema 45).

117

Resultados y discusin

N O X X OH X DMP/p-TsOH O O O O R THF/T. amb R = H; CHO; Cl; CH3 N 40: X = Br; R = H: 24 hs., 90 % 41: X = Br; R = CHO: 20 hs.,90 % 42: X = Br; R = Cl: 24 hs., 85 % 43: X = Br; R = CH3: 30 hs., 70 % 44: X = Cl; R = H: 24 hs., 80 % 45: X = Cl; R = CHO: 22 hs.75 % 46: X = Cl; R = Cl: 24 hs., 75 % 47: X = Cl; R = CH3: 72 hs., 70 %, (hexano)

acetona/T. amb. OH 30 min. 90 %

X = Br, Cl

R Aducto anti

Esquema 45

De este modo, se obtuvieron con buenos rendimientos los compuestos 40 a 43, a partir de (1S,2S)-3-bromociclohexa-3,5-dien-1,2-diol como dieno. Se observ que al introducir el grupo metilos en la posicin 4 del anillo aromtico del dienfilo, el producto de cicloadicin se obtena con rendimientos ms bajos que con los otros dienfilos y la reaccin transcurri ms lentamente. La estereoqumica del compuesto 42, se determin comparando los datos espectroscpicos de los aductos protegidos luego de la cicloadicin, con los datos del aducto obtenido por reaccin del dieno previamente protegido como acetnido. De este modo, se asignaron para este compuesto las configuraciones syn y anti. En las reacciones de obtencin de los compuestos 44 a 47, que involucran (1S,2S)-3-clorociclohexa-3,5-dien-1,2-diol como dieno tambin se observan diferencias de reactividad en funcin de las caractersticas electrnicas de los sustituyentes del anillo aromtico. El compuesto 47, producto de reaccin con 4-nitrosotolueno, no se obtuvo cuando la reaccin se llev a cabo en disolventes en los que el compuesto es soluble (THF, CH2Cl2, metanol, tolueno). En estos casos, el producto, o bien se descompuso en el medio de reaccin, o bien al destilar el disolvente. Cuando la reaccin se hizo en hexano se obtuvo el aducto que precipit en el medio de reaccin a las 72 horas. El slido se filtr y se recristaliz de dos disolventes (Hexano:AcOEt). En estas condiciones se obtuvo 47 con un 70 % de rendimiento. Debido a que el cloro es el ms electronegativo de los sustituyentes en la posicin 3 de los derivados de (1R,2S)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol utilizados, el dieno es el menos reactivo, y esto puede ser la causa de los rendimientos comparativamente inferiores obtenidos para esta serie de aductos. Esto, sumado a que el 4-nitrosotolueno es tambin el peor dienfilo de la serie, fue probablemente la causa de las mayores dificultades en la sntesis del compuesto 47.
118

Resultados y discusin

4.2.- Actividad biolgica

Se realizaron pruebas de actividad biolgica in vitro, no solamente contra Plasmodium falciparum, sino tambin contra otros protozoarios, a saber: Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei rhodesiense, y Leishmania donovani. Estos ensayos biolgicos fueron hechos en el Departamento de Enfermedades Infecciosas y Tropicales del London School of Hygiene and Tropical Medicine, en Londres, Reino Unido. Los compuestos sintetizados fueron evaluados tambin como antihelmnticos en el Laboratorio de Experimentacin Animal (LEA) de la Facultad de Qumica, Universidad de la Repblica, Montevideo, Uruguay. Los compuestos sintetizados a partir de dienos derivados de (1S,2R)-3-metilciclohexa3,5-dien-1,2-diol, con la funcin diol sin proteger (32, 33, 34 y 35), no pudieron ser evaluados, debido a su inestabilidad. Por el mismo motivo, tampoco fueron evaluados aductos sintetizados a partir de (1S,2S)-3-clorociclohexa-3,5-dien-1,2-diol y (1S,2S)-3-bromociclohexa-3,5-dien-1,2-diol. De los aductos de Diels-Alder derivados de los dioles protegidos como acetnido, se evaluaron los compuestos con estereoqumica anti. Del mismo modo, de los aductos derivados del dieno 5, producto de reduccin de la eucarvona, fueron evaluados los compuestos con estereoqumica anti del alcohol respecto al puente -N-O-. Los resultados de las evaluaciones de actividad biolgica realizadas a los compuestos 14 y 17 no son concluyentes, debido a que no fue estudiada su estabilidad en dimetilsulfxido, disolvente utilizado en los ensayos. Como se discuti anteriormente, estos compuestos son propensos a descomponerse en solucin por un mecanismo retro Diels-Alder. La actividad antimalrica de los compuestos se fue evaluada in vitro de acuerdo a los protocolos descritos por Desjardins.252 La actividad biolgica contra L. donovani se ensay en el estado amastigota, y estas formas fueron cultivadas en macrfagos. La actividad frente a T. cruzi fue evaluada de acuerdo a las metodologas descritas por Buckner.253 Los ensayos con T. b. rhodesiense se realizaron con la forma sangunea extracelular trypomastigota. La actividad antihelmntica fue evaluada con el nematodo N. brasiliensis en su estadio parasitante L4,254 utilizando un modelo que es modificacin del protocolo descrito por Jenkins.255

119

Resultados y discusin Como ensayos positivos de control se us pentamidina para T. b. rhodesiense, benznidazol para T. cruzi, pentostam para L. donovani, cloroquina para P. falciparum y albendazol para N. brasiliensis. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron con la lnea de clulas de carcinoma KB con podofilotoxina como control positivo. Los resultados obtenidos en los ensayos contra L. donovani se muestran en la Tabla 10 y las Figuras 70 y 71. Estos ensayos muestran que ninguno de los aductos obtenidos a partir de eucarvona y el alcohol producto de su reduccin (dienos 4 y 5) es activo. De los aductos derivados del dieno 6 (producto de acetilacin de 5), solamente el compuesto 31 mostr actividad. En este dieno el anillo aromtico est sustituido con un grupo metilo en posicin 4. Su actividad es del orden de la del pentostam, droga utilizada como control positivo, pero su ndice teraputico (DL50/CE50) es menor que la unidad, lo que indica que a la CE50 el compuesto es txico. De la serie de aductos obtenidos a partir del dieno (1S,2R)-3-metilciclohexa-3,5-dien1,2-diol, los compuestos sustituidos en el anillo aromtico, no son activos. El compuesto 36, producto de cicloadicin entre este dieno y nitrosobenceno, mostr una actividad del orden de la del pentostam, y su ndice teraputico indica que la concentracin citotxica es casi 3 veces mayor que la concentracin efectiva media. De los aductos sintetizados a partir de TMPG como dieno, mostraron actividad los compuestos 14 y 17. El primero sin sustituyentes en el anillo aromtico, y el segundo sustituido en la posicin 4 con un grupo metilo. En el caso de 14, si bien su actividad es comparable a la del control positivo, presenta una toxicidad similar, mostrando un ndice teraputico prximo a la unidad. En el caso del compuesto 17, los patrones de actividad biolgica y de citotoxicidad tambin son similares. Los compuestos 15 y 16, con sustituyentes atrayentes de electrones en el anillo no mostraron actividad. En ninguno de los casos resultaron activos frente a L. donovani, los compuestos sustituidos con grupos atrayentes de electrones en el anillo aromtico.

120

Resultados y discusin

Compuesto Pentostam 14 15 16 17 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39

PM (g/mol) 383.4 411.4 417.8 397.4 257.3 285.3 291.8 271.4 259.3 287.4 293.8 273.4 301.4 329.4 335.8 315.4 275.3 303.4 309.8 289.4

CE50 (mM) 2.26 10-2 3.03 10-2 ----6.01 10-2 ----------------------8.52 10-2 6.72 10-2 -------

CE50 (g/mL) 11.6 > 30 > 30 23.9 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 > 30 26.9 18.5 > 30 > 30 > 30

DL50 (mM) 2.92 10-2 0.24 0.16 7.65 10-2 0.11 0.31 0.12 0.60 0.74 0.25 0.18 0.45 0.45 0.22 0.11 4.22 10-2 0.18 0.26 0.53 0.28

DL50/CE50 0.96 ----1.27 ----------------------0.49 2.68 -------

Tabla 10: Datos de actividad contra Leishmania donovani y citotoxicidad

121

Resultados y discusin

Actividad contra Leishmania donovani

1-l og[C E50(m M )] 3

2, 5

1, 5

0, 5

Com puesto

Figura 70: Actividad in vitro contra Leishmania donovani

Relacin LD50/CE50 Leishmania donovani

LD 50/ C E 50 3 2, 5 2 1 , 5 1 0, 5 0 1 4 1 5 1 6 1 7 1 9 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39

Compuesto

Figura 71: Indice teraputico para Leishmania donovani

122

Resultados y discusin Los resultados obtenidos en los ensayos contra T. cruzi se muestran en la Tabla 11 y las Figuras 72 y 73. En los aductos derivados de TMPG como dieno, la actividad de las oxazinas 14 y 15 se mantiene dentro del mismo orden, y en un orden de potencia menor que la actividad del control positivo. Los compuestos 16 y 17 no fueron activos. En la serie de aductos sintetizados a partir de eucarvona como dieno, los compuestos con sustituyentes atrayentes de electrones en el anillo aromtico no fueron activos. El compuesto 19 mostr una actividad 100 veces menor que la del benznidazol, y una citotoxicidad comparable con sta. En cambio el compuesto 22, sintetizado a partir de 4-nitrosotolueno como dienfilo, mostr ser activo frente a T. cruzi y no citotxico, con un ndice teraputico cercano a 20. Si bien su actividad es 10 veces menor que la droga utilizada como control, el ensayo con este compuesto se repiti, y el compuesto 22 se seleccion para realizar ensayos in vivo en una etapa ms avanzada. De los aductos obtenidos a partir del dieno 5, fueron activos los que tienen sustituyentes en el anillo aromtico. Los compuestos 25, 26 y 27 mostraron actividades comparables con las de 22, pero fueron ms txicos. En la serie de aductos derivados del dieno 6, no fue activo el compuesto en el que el anillo aromtico est sustituido con un grupo aldehdo en posicin 4. Si bien tanto el compuesto 28, sin sustituyentes el anillo, como los sustituidos con cloro o metilo, mostraron actividades comparables, la presencia de estos sustituyentes disminuye notoriamente el ndice teraputico de los compuestos. Para el compuesto 31, el ndice teraputico tiene un valor cercano a la unidad. Dentro de la serie de aductos derivados del dieno 7, las actividades son del mismo orden, salvo en el caso de la oxazina 39 que no presenta actividad. En cuanto a la toxicidad, el compuesto 36, con el anillo aromtico sin sustituyentes, mostr un bajo ndice teraputico, mientras que al funcionalizar este anillo, el ndice teraputico aumenta hasta valores cercanos a 10.

123

Resultados y discusin

Compuesto Benznidazol 14 15 16 17 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39

PM (g/mol) 383.4 411.4 417.8 397.4 257.3 285.3 291.8 271.4 259.3 287.4 293.8 273.4 301.4 329.4 335.8 315.4 275.3 303.4 309.8 289.4

CE50 (mM) 4.7 10-3 1.12 10-2 3.09 10-2 ----11.27 10-2 ----3.17 10-2 --6.23 10-2 2.83 10-2 3.95 10-2 7.73 10-2 --3.78 10-2 4.25 10-2 10.89 10-2 2.37 10-2 5.23 10-2 ---

CE50 (g/mL) DL50 (mM) DL50/CE50 4.3 12.7 > 30 > 30 29 > 30 > 30 8.6 > 30 17.9 8.3 10.8 23.3 > 30 12.7 13.4 30.0 7.2 16.1 > 30 2.92 10-2 0.24 0.16 7.65 10-2 0.11 0.31 0.12 0.6 0.74 0.25 0.18 0.45 0.45 0.22 0.11 4.22 10-2 0.18 0.26 0.53 0.28 2.61 7.77 ----0.97 ----18.9 --4.01 6.36 11.39 5.82 --2.91 0.99 1.65 10.97 10.13 ---

Tabla 11: Datos de actividad contra Trypanosoma cruzi y citotoxicidad

124

Resultados y discusin

1 l og[ C E 50( mM ) ] 3, 5 3 2, 5 2 1 , 5 1 0, 5 0

Actividad contra Trypanosoma cruzi

Compuesto

Figura 72: Actividad in vitro contra Trypanosoma cruzi

Relacin LD50/CE50 Trypanosoma cruzi

LD 50/ C E50 20 1 8 1 6 1 4 1 2 1 0 8 6 4 2 0 1 4 1 5 1 6 1 7 1 9 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39

Compuesto

Figura 73: Indice teraputico para Trypanosoma cruzi

125

Resultados y discusin Los resultados obtenidos en los ensayos contra T. b. rhodesiense se muestran en la Tabla 12 y las Figuras 74 y 75. En los casos de los compuestos que presentaron actividad los valores de CE50 fueron del orden de 10 veces menores que la de pentamidina. De la serie de aductos derivados de TMPG, no tuvieron actividad los compuestos 15 y 16, con sustituyentes atrayentes de electrones en el anillo aromtico. Tanto en el caso de 14 como de 17, los valores de ndice teraputico fueron bajos, mostrando valores de actividad y toxicidad comparables. Todos los compuestos de la serie de eucarvona mostraron valores de actividad del mismo orden. Los compuestos con sustituyentes atrayentes de electrones en el anillo aromtico presentaron ndices teraputicos ms bajos, mientras que el compuesto 22, sustituido en la posicin 4 del anillo con un grupo metilo, tuvo un ndice teraputico cercano a 10. Los compuestos 24 y 25, derivados del dieno 5, y 37 y 39, derivados del dieno 7, no fueron activos. Todos los dems, de las series de aductos derivados de los dienos 5, 6 y 7, presentaron valores de concentracin efectiva media similares, pero los valores de ndice teraputico fueron bajos, salvo en el caso de los compuestos 28 y 38. En stos, los valores de DL50 son del orden de 20 veces mayores que los valores de CE50.

126

Resultados y discusin

Compuesto Pentamidina 14 15 16 17 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39

PM (g/mol) 383.4 411.4 417.8 397.4 257.3 285.3 291.8 271.4 259.3 287.4 293.8 273.4 301.4 329.4 335.8 315.4 275.3 303.4 309.8 289.4

CE50 (mM) 1.68 10-3 1.09 10-2 ----3.65 10-2 1.39 10-2 10.3 10-2 7.30 10-2 5.38 10-2 ----5.92 10-2 9.47 10-2 2.39 10-2 5.22 10-2 1.97 10-2 3.20 10-2 3.52 10-2 --2.63 10-2 ---

CE50 (g/mL) DL50 (mM) DL50/CE50 4.2 > 30 > 30 14.5 3.6 29.4 21.3 14.6 > 30 > 30 17.4 25.9 7.2 17.2 6.6 10.1 9.7 > 30 8.16 > 30 2.92 10-2 0.24 0.16 7.65 10-2 0.11 0.31 0.12 0.6 0.74 0.25 0.18 0.45 0.45 0.22 0.11 4.22 10-2 0.18 0.26 0.53 0.28 2.68 ----2.10 7.91 3.01 1.64 11.15 ----3.04 4.75 18.82 4.21 5.58 1.32 5.11 --20.15 ---

Tabla 12: Datos de actividad contra Trypanosoma brucei rhodesiense y citotoxicidad

127

Resultados y discusin

1 l og[ C E 50( mM ) ]

Actividad contra Trypanosoma brucei rhodesiense

4 3, 5 3 2, 5 2 1 , 5 1 0, 5 0

Compuesto

Figura 74: Actividad in vitro contra Trypanosoma brucei rhodesiense

LD 50/ C E 50

Relacin LD50/CE50 Trypanosoma brucei rhodesiense

25

20

1 5

1 0

0 1 4 1 5 1 6 1 7 1 9 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39

Compuesto

Figura 75: Indice teraputico para Trypanosoma brucei rhodesiense

128

Resultados y discusin Los resultados obtenidos en los ensayos contra P. falciparum se muestran en la Tabla 13 y las Figuras 76 y 77. En ninguno de los casos, los compuestos que presentaron actividad contra P. falciparum, tuvieron valores de CE50 comparables a la cloroquina. En la serie de derivados de TMPG, el compuesto 16 que tiene un tomo de Cl como sustituyente en posicin para en el anillo aromtico, no mostr actividad. La actividad de los otros 3 compuestos de la serie fue comparable, pero en todos los casos los valores de ndice teraputico fueron bajos. En particular, el compuesto 17, con un sustituyente metilo en el anillo aromtico, presenta una actividad en un orden de potencia mayor que la de los dems compuestos de la serie, pero su citotoxicidad hace que el compuesto tenga un ndice teraputico del menor que 10. Considerando los compuestos sintetizados a partir de eucarvona y sus derivados 5 (producto de reduccin) y 6 (producto de acetilacin del alcohol), en ningn caso fueron activos los compuestos sin sustituyentes en el anillo aromtico o con un grupo aldehdo sustituido en la posicin 4. De estas series de dienos, los compuestos que presentaron alguna actividad, mostraron valores de CE50 del orden de 10-2 mM. De los derivados del dieno 7 se destaca el compuesto 37, que tiene un grupo aldehdo como sustituyente en la posicin 4 del anillo aromtico, con una CE50 del orden de 10-3 mM.. Este compuesto present una DL50 con un valor de 0.26 mM, lo que hace que tenga un ndice teraputico cercano a 40. Estos datos de actividad y citotoxicidad, hacen que este compuesto, sea el que presenta una relacin citotoxicidad/actividad ms favorable.

129

Resultados y discusin

Compuesto Cloroquina 14 15 16 17 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39

PM (g/mol) 383.4 411.4 417.8 397.4 257.3 285.3 291.8 271.4 259.3 287.4 293.8 273.4 301.4 329.4 335.8 315.4 275.3 303.4 309.8 289.4

CE50 (mM) 3.0 10-7 1.40 10-2 6.95 10-2 --9.56 10-3 ------4.39 10-2 ----9.95 10-2 --------7.29 10-2 --8.24 10-3 4.23 10-2 8.50 10-2

CE50 (g/mL) DL50 (mM) DL50/CE50 5.4 28.6 > 30 3.8 > 30 > 30 > 30 11.3 > 30 > 30 29.2 > 30 > 30 > 30 > 30 23.0 > 30 2.5 13.1 24.6 2.92 10-2 0.24 0.16 7.65 10-2 0.11 0.31 0.12 0.6 0.74 0.25 0.18 0.45 0.45 0.22 0.11 4.22 10-2 0.18 0.26 0.53 0.28 2.08 3.45 --8.00 ------13.66 ----1.81 --------0.58 --31.5 12.53 3.29

Tabla 13: Datos de actividad contra Plasmodium falciparum y citotoxicidad

130

Resultados y discusin

1 l og[ C E 50( mM ) ] 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Actividad contra Plasmodium falciparum

Compuesto

Figura 76: Actividad in vitro contra Plasmodium falciparum

LD 50/ C E50

Relacin LD50/CE50 Plasmodium falciparum

35 30 25 20 1 5 1 0 5 0 1 4 1 5 1 6 1 7 1 9 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39

Compuesto
Figura 77: Indice teraputico para Plasmodium falciparum

131

Resultados y discusin La actividad biolgica de los compuestos no slo fue evaluada contra protozoarios, sino tambin como antihelmnticos. Los resultados obtenidos en los ensayos contra Nippostrongylus brasiliensis se muestran en la Tabla 14 y las Figuras 78 y 79. De la serie de derivados de TMPG, el compuesto con un tomo de Cl como sustituyente del anillo aromtico, no fue activo. Los compuestos 14 y 15 presentaron actividades similares, en el orden de CE50 de 10-2 nM, frente al albendazol cuya CE50 es del orden de 10-4 mM.. La CE50 del compuesto 17, con un grupo metilo dador de electrones en el anillo aromtico fue el del orden de 10-3 mM. y su ndice teraputico fue cercano a 10. De los restantes compuestos ensayados, se destaca que los compuestos 24, y 29 - 37 no mostraron prcticamente actividad, mientras que el compuesto 25 present una CE50 de 1.0 10-2 mM, y un ndice teraputico de 25. Compuesto Albendazol 14 15 16 17 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 31 36 37 38 39 PM (g/mol) 383.4 411.4 417.8 397.4 257.3 285.3 291.8 271.4 259.3 287.4 293.8 273.4 301.4 329.4 335.8 315.4 275.3 303.4 307.8 287.4 CE50 (mM) 3.0 10-4 6.0 10-2 9.0 10-2 7.6 9.0 10-3 7.4 10-2 0.15 0.2 5.0 10-2 0.57 1.0 10-2 3.0 10-2 8.0 10-2 9.0 10-2 0.7 2.1 0.6 0.12 2.54 4.3 10-2 2.0 10-2 DL50 (mM) 2.92 10-2 0.24 0.16 7.65 10-2 0.11 0.31 0.12 0.6 0.74 0.25 0.18 0.45 0.45 0.22 0.11 4.22 10-2 0.18 0.26 0.53 0.28 DL50/CE50 0.49 2.67 2.1 10-2 8.5 1.49 2.07 0.6 12 1.29 25 6 5.6 5.0 0.31 5.2 10-2 7.0 10-2 0.4 0.1 12.3 14

Tabla 14: Datos de actividad contra Nippostrongylus brasiliensis y citotoxicidad

132

Resultados y discusin

1 l og[ C E 50( mM ) ]

Actividad contra Nippostrongylus brasiliensis

5 4, 5 4 3, 5 3 2, 5 2 1 , 5 1 0, 5 0

Compuesto

Figura 78: Actividad in vitro contra Nippostrongylus brasiliensis

LD 50/ C E 50
30

Relacin LD50/CE50 Nippostrongylus brasiliensis

25

20

1 5

1 0

Compuesto
Figura 79: Indice teraputico para Nippostrongylus brasiliensis

133

5.- Conclusiones y perspectivas

Conclusiones y perspectivas A partir de la hiptesis de trabajo, fundamentada en el isosterismo entre el enlace -O-O- y el enlace -N-O-, se sintetizaron, utilizando protocolos hetero-Diels-Alder, 43 oxazinas, 40 de las cuales no estn descritas en la literatura. Estos compuestos son estructuras modelo que poseen actividad antimalrica y antiparasitaria en general, a partir de las cuales se abre la posibilidad de modular su actividad, en la bsqueda de nuevas drogas activas. Para llevar a cabo la sntesis de estas oxazinas, fue necesario actualizar y optimizar los mtodos de obtencin de los reactivos, descritos dcadas atrs. En ese contexto, se optimizaron las metodologas descritas en la literatura para la sntesis de arilnitroso. compuestos

NO2

NHOH Red. Ox.

O 10: R = CHO, 60 % 12: R = Cl, 43 % 13: R = CH3, 45 %

A partir de los dienfilos sintetizados y tres series de dienos estructuralmente diferentes, se sintetizaron las oxazinas correspondientes, utilizando protocolos de Diels-Alder. Estas se obtuvieron con rendimientos de muy buenos, en torno al 70 %, (compuestos 27, 30 38, 43, 45 - 47) a excelentes, en torno al 90 % y superiores (compuestos 14 - 17, 19 - 22, 24 26, 28, 40 - 42). En el caso del dieno aromtico TMPG, el rendimiento de las reacciones de Diels-Alder depende de las condiciones de reaccin, que debieron ajustarse de modo de minimizar la reaccin retro-Diels-Alder. En el caso de los aductos obtenidos por la cicloadicin de TMPG con nitrosobenceno, y de TMPG con 13, se observ la descomposicin de los mismos en solucin. Para maximizar el rendimiento de estas reacciones, se desplaz el equilibrio hacia la formacin del aducto quitando el producto del medio de reaccin.

134

Conclusiones y perspectivas

OCH3O H3CO H3CO OCH3 N O T. amb. H3CO H3CO N OCH3O OCH3 O R R = H, CHO, Cl, CH3 R 14: R = H: 40 hs., 94 %, (Hexano) 15: R = CHO: 12 hs., 96 % (Tolueno) 16: R = Cl: 15 hs., 93 % (Tolueno)17: R = CH3: 20 % (Tolueno), 48 hs., 92 % (Hexano)

+
3

Esta inestabilidad en solucin de los aductos 14 y 17, puede ser la causante de que estos dos compuestos sean los ms citotxicos de la serie de derivados de TMPG, ya que en su descomposicin liberan nitrosobenceno. Dado que no existen en la literatura datos que ayuden a caracterizar la reaccin de descomposicin va retro-Diels-Alder de este tipo de compuestos, se estudi la descomposicin de 14, producto de cicloadicin entre TMPG y nitrosobenceno. Se determinaron los parmetros cinticos (ley de velocidad y energa de activacin) y termodinmicos (H, G y S) de la reaccin. La recuperacin del carcter aromtico del dieno es la fuerza impulsora de la reaccin inversa a la formacin del aducto.

OCH3O H3CO H3CO N

OCH3 O

OCH3O k1 k-1 H3CO H3CO OCH3 N O

+
3

14

En el caso de los dienos terpnicos, las reacciones se dan con buenos rendimientos, no observndose descomposicin de los aductos en solucin. La elevada proporcin de aductos con estereoqumica anti en los derivados de eucarvol, sugiere que la estabilizacin, tanto del estado de transicin como del producto, por formacin de un enlace de hidrogeno no es crtica.

135

Conclusiones y perspectivas

O N + O THF seco T. amb. R R = H; CHO; Cl; CH3

O O N 19: R = H: 12 hs., 98 % 20: R = CHO: 10 hs., 95 % 21: R = Cl: 15 hs., 87 % 22: R = CH3: 24 hs., 90 %

R1 O N 24: R1 = OH; R = H: 24 hs., 92 %; [anti/syn] = 9/1 25: R1 = OH; R = CHO: 24 hs., 95 %; anti 26: R1 = OH; R = Cl: 24 hs., 95 %; [anti/syn] = 9/1 27: R1 = OH; R = CH3: 72 hs., 70 %; anti 28: R1 = OAc; R = H: 24 hs., 95 % 29: R1 = OAc; R = CHO: 24 hs., 95 % 30: R1 = OAc; R = Cl: 72 hs., 80 % 31: R1 = OAc; R = CH3: 170 hs., 65 %

R1

O THF T. amb.

+
R1 = OH; OAc R

R = H; CHO; Cl; CH3

En el caso aductos sintetizados a partir de (1S,2R)-3,5-ciclohexadien-1,2-diol sin embargo, el efecto orientador de la estereoqumica de la reaccin, que ejerce la posibilidad de formacin de un enlace de hidrogeno entre el oxgeno del dienfilo y el hidrgeno del alcohol en posicin 2 del dieno, s resulta importante, pues prevalecen los productos syn sobre los anti. Cuando se emplean los dioles protegidos como acetnido, la reaccin se da exclusivamente con estereoqumica anti, debido a factores estricos. En el caso del compuesto 47, debido a que es producto de la cicloadicin del dieno ms deficiente en electrones de la serie, con el dienfilo ms rico en electrones, el compuesto result inestable en solucin, al igual que los compuestos 14 y 17. Por este motivo debi utilizarse una estrategia sinttica similar a la descrita para estos casos. El producto fue sintetizado en un disolvente en el que es insoluble.

136

Conclusiones y perspectivas

137

Conclusiones y perspectivas

N O R THF T. amb. R R = H; CHO; Cl; CH3 N OH O OH OH Aducto syn (a) Aducto anti (b) O

OH OH R N O Aducto syn (a) O O O O O

+
OH

DMP/ -p-TsOH acetona/T. amb.

R Aducto anti (b) 36: R = H: 22 hs., 70 % 37: R = CHO: 16 hs.,75 % 38: R = Cl: 26 hs., 70 % 39: R = CH3: 48 hs., 55 % Br Cl O Br O Aducto syn (a) O O O O N

32: R =-H: 20 hs., 78 %; (a)/(b) = 1.4 33: R = CHO: 15 hs., 80 %; (a)/(b) = 1.2 34: R = Cl: 24 hs., 75 %, (a)/(b) = 1 35: R = CH3: 48 hs., 60 %; (a)/(b) = 1.6

Br N OH O Cl THF T. amb. Cl

O N Br

Br O OH

OH OH

+
OH

OH Aducto syn (a) Cl

DMP/p-TsOH acetona/T. amb. 30 min.

Cl Aducto anti (b) 42: 24 hs., 68 %; (a)/(b) = 1.1

Aducto anti (b) O X

O O O 40: X = Br; R = H: 24 hs., 90 % 41: X = Br; R = CHO: 20 hs.,90 % 42: X = Br; R = Cl: 24 hs., 85 % 43: X = Br; R = CH3: 30 hs., 70 % 44: X = Cl; R = H: 24 hs., 80 % 45: X = Cl; R = CHO: 22 hs.75 % 46: X = Cl; R = Cl: 24 hs., 75 % 47: X = Cl; R = CH3: 72 hs., 70 %, (hexano)

X OH

X DMP/p-TsOH O

acetona/T. amb. OH 30 min. 90 %

R THF/T. amb R = H; CHO; Cl; CH3

X = Br, Cl

R Aducto anti

Los ensayos de actividad biolgica se realizaron in vitro contra los protozoarios P. falciparum, T. cruzi, T. b. rhodesiense y L. donovani, y contra el nematodo N. brasiliensis, para 20 de las oxazinas sintetizadas. En general se observ una actividad menor a la de los controles positivos, pero que puede optimizarse, debido a que la misma vara en funcin de los patrones de sustitucin de los dienfilos. En el caso de los dienos terpnicos, en que tambin la funcionalizacin de stos fue una variable, la actividad biolgica mostr tambin dependencia de esta funcionalizacin. En cuanto a la actividad antimalrica, el compuesto 37 result ser el ms activo de los compuestos ensayados contra P. falciparum, y adems fue el compuesto que present mejor ndice teraputico.
138

Conclusiones y perspectivas En los ensayos biolgicos con T. cruzi se destac el compuesto 22. Si bien la mayora de los compuestos ensayados mostraron actividad tripanosomicida, con una CE50 menor que la del control positivo en un orden de magnitud, el compuesto 22 adems present un ndice teraputico alto. Por este motivo, fue seleccionado para continuar realizando con l pruebas in vivo. En la actividad antihelmntica, se destacaron el compuesto 17 como el ms activo y con un ndice teraputico del orden de 10, y el compuesto 25, con una actividad similar a la de ste, y un ndice teraputico casi 3 veces mayor. Ambos compuestos presentaron una CE50 mayor en un orden de magnitud que la de los dems compuestos ensayados, y en un orden inferior a la del albendazol. El protocolo de Diels-Alder ha mostrado versatilidad y aplicabilidad para generar en forma eficiente compuestos modelo para estudiar la tendencia de la actividad antiparasitaria. Los resultados obtenidos en estos ensayos preliminares de actividad biolgica, alientan a continuar trabajando en el mejoramiento de la actividad y el estudio de la influencia de la estructura de los compuestos en la misma, y en particular de la estereoqumica. Para sto, las prximas etapas se plantean en dos lneas de investigacin paralelas y complementarias: La ampliacin del espectro de compuestos a sintetizar, por ejemplo empleando compuestos nitroso no aromticos y la realizacin de estudios tericos de relacin estructura-actividad, que permitan un diseo racional de los frmacos de modo de optimizar los resultados obtenidos.

139

6.- Parte experimental

Parte experimental

6.1.- Materiales y equipos

Los puntos de fusin se determinaron con un equipo Gallenkamp y los valores no fueron corregidos. Los espectros de resonancia magntica nuclear de protn y de carbono 13 de los compuestos, se realizaron en un equipo Bruker Avance DPX 400 MHz. Los experimentos se hicieron a 30 C cuando no se indica otra temperatura. Se utiliz CDCl3 como disolvente y TMS como standard interno. Los espectros de infrarrojo se realizaron en un espectrofotmetro FT-IR Shimadzu modelo DR-8100, en pastillas de bromuro de potasio previamente preparadas, o en film sobre pastillas de bromuro de potasio comerciales. Las frecuencias de absorcin se expresan en cm-1. Los espectros de masa se realizaron en espectrmetro de masas Shimadzu GC-MS QP 1100 EX, y en un cromatgrafo de gases Hewlett Packard 5980II acoplado a un espectrmetro de masas Hewlett Packard 5971. La ionizacin de las muestras se realiz por impacto electrnico (70 eV). Las medidas de rotacin ptica fueron hechas en un polarmetro Perkin-Elmer 241, utilizando una celda de 7 mL. Los anlisis de cromatografa gaseosa se realizaron en un equipo Hewlett Packard QP 5890. Las columnas utilizadas fueron Carbowax 20M, 25 m, 0.32 mm, y Elite-Cyclodex / B, 30 m, 0.25 mm. Las muestras para inyeccin se disolvieron en CH2Cl2. El programa de temperatura utilizado fue: 60 C (4 min.)-170 C (3 C/min.)- 230 C (15 C / min.), Temp. detector: 250 C, Temp. inyector: 250 C. Para las cromatografas en placa fina se utilizaron placas de Slica-gel (Kieselgel HF254), de la firma Macherey-Nagel. Para las cromatografas de columna se utiliz Slica gel (tamao 0.063 hasta 0.2 mm) de la empresa Baker. Los disolventes se purificaron y secaron en vidrio, previa su utilizacin, por mtodos convencionales.

139

Parte experimental

6.2.- Procedimientos de sntesis

6.2.1.- Procedimientos generales de sntesis
PGS 1: Procedimiento general de reduccin de compuestos nitro a nitroso Mtodo A. 243 0.49 moles del nitrocompuesto y una solucin de 30 g (0.56 mol) de NH4Cl en 1 L de agua, se ponen a reaccionar en un baln de fondo redondo de 2 L. La mezcla de reaccin se agita vigorosamente y se agregan 75 g (1.15 mol) de polvo de Zn (90 % de pureza), en pequeas porciones durante 5 minutos. La reaccin comienza aproximadamente 5 minutos despus del agregado, con aumento de temperatura. Cuando la temperatura alcanza aproximadamente los 65 C, se comienza a agregar hielo suficiente para que la temperatura se mantenga en 50-55 C, siempre con buena agitacin. La solucin se filtra por Buchner aproximadamente 20 minutos despus de agregada la primera porcin de Zn. El residuo de ZnO se lava con 600-700 mL de agua hirviendo. El filtrado y los lavados se transfieren a un vaso de bohemia de 4 L, y se enfra inmediatamente a 0 C por adicin de hielo picado (por lo menos 250 g sin fundir). Inmediatamente se agrega con agitacin una solucin de 150 mL de H2SO4 conc., a la que se le agrega suficiente hielo para disminuir la temperatura a -5 C. Se aade inmediatamente una solucin de Na2Cr2O7 en 125 mL de agua, enfriando con hielo y agitando en forma permanente. Luego de 2-3 minutos, se filtra con Buchner el precipitado y se lava con 200 mL de agua. Se destila inmediatamente el compuesto nitroso por arrastre con vapor. Mtodo B.244 Se suspenden 26.5 mmol de compuesto nitro y 1.62 g (30.3 mmol) de NH4Cl, en 50 mL de EtOH absoluto y 6 mL de cido actico glacial. Se agregan 4 g de polvo de Zn (90 % de pureza) en pequeas porciones, enfriando con bao de hielo. Se filtra el precipitado de ZnO. La solucin alcohlica se gotea sobre una solucin de 1.84 g (7.02 mmol) de Na2Cr2O7 y 8 mL de H2SO4 10 %. El precipitado formado se filtra rpidamente y se destila por arrastre con vapor, separndose el compuesto nitroso.

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Parte experimental Mtodo C.245 En un baln de fondo redondo se suspenden 2.027 moles del compuesto nitro, 2 g (0.037 moles) de NH4Cl y 5 g de polvo de Zn en 20 mL de acetona, con agitacin magntica y en bao de hielo. Se agregan lentamente y gota a gota 20 mL de agua, cuidando que la temperatura se mantenga por debajo de 10 C. Una vez completada la reaccin, se filtra a vaco el slido y se lava con 20 mL de agua hirviendo. El filtrado obtenido se enfra en bao de hielo, y se agrega una solucin de 10 g FeCl3 en 10 mL de agua fra. Transcurridos 5 minutos de reaccin, el precipitado formado se filtra a vaco, se seca a vaco y el producto sublima. PGS 2: Procedimiento general de sntesis de aductos de Diels Alder con TMPG como dieno En un baln de 25 mL se ponen a reaccionar 0.1 g (0.36 mmol) de TMPG y 0.39 mmol del compuesto nitroso en 10 mL de tolueno seco. Se agita a temperatura ambiente en ausencia de luz, hasta la consumicin total del dieno. Una vez que el producto precipita en el medio de reaccin, se filtra y se lava el residuo con hexano fro. PGS 3: Procedimiento general de sntesis de aductos de Diels Alder con eucarvona y derivados como dieno En un baln de 25 mL se ponen a reaccionar 0.67 mmol de dieno y 0.74 mmol del compuesto nitroso, en 10 mL de THF seco. Se agita a temperatura ambiente en ausencia de luz hasta la consumicin total del dieno. Se destila el disolvente a presin reducida. La purificacin se lleva a cabo por columna cromatogrfica de Slica-gel, utilizando en cada uno de los casos, diferentes mezclas de disolventes como fase mvil. PGS 4: Procedimiento general de sntesis de aductos de Diels Alder con derivados de (1R,2S)-ciclohexa-3,5-dien-1,2-diol como dieno En un baln de 25 mL se ponen a reaccionar 0.79 mmol de dieno y 0.87 mmol del compuesto nitroso, en 10 mL de THF seco. Se agita a temperatura ambiente y en ausencia de luz hasta la consumicin total del dieno. Se destila el disolvente a presin reducida. El residuo se purifica por columna de Slica-gel.
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Parte experimental PGS 5: Procedimiento general de proteccin de dioles con 2,2-dimetoxipropano.222 En un baln de fondo redondo se ponen a reaccionar a temperatura ambiente, 1 eq. de diol y 4 eq. de DMP disueltos en acetona. Se agrega un cristal de cido p-toluensulfnico (p-TsOH) y se agita a temperatura ambiente hasta que la reaccin sea completa. Se diluye con ter etlico, se lava la capa orgnica una vez con solucin acuosa diluida de NaHCO3, y luego con solucin acuosa saturada de NaCl (1 2 mL). Se seca la fase orgnica con MgSO4 anh. y se destila el disolvente a presin reducida. El producto se purifica por cromatografa en columna de Slica-gel. PGS 6: Procedimiento general de desproteccin acetnidos Se disuelve el acetnido en una mezcla MeOH:H2O 1:1, y se agrega una punta de esptula de resina cida (DOWEX 50 WX8-200). Se agita a temperatura ambiente hasta que la reaccin se completa. Se filtra la resina y se destila el agua a presin reducida en presencia de AcOEt. El producto se purifica por cromatografa en columna de Slica-gel. Rendimiento: 80 95 %. Ensayos de actividad biolgica La actividad biolgica in vitro de los compuestos se ensay con el tests de L. donovani en el estadio amastigote. Estas formas amastigotes fueron cultivadas en macrfagos. Los ensayos contra T. cruzi fueron realizados de acuerdo a las metodologas descritas por Buckner.253 Los ensayos con T. b. rhodesiense se realizaron con la forma sangunea extracelular trypomastigote. La actividad antimalrica fue evaluada in vitro contra cepas de P. falciparum.252 La actividad antihelmntica fue evaluada con el nematodo N. brasiliensis en su estadio parasitante L4,254 utilizando un modelo que es modificacin del protocolo descrito por Jenkins.255 Como ensayos positivos de control se us pentamidina para T. b. rhodesiense, benznidazol para T. cruzi, pentostam para L. donovani, cloroquina para P. falciparum y albendazol para N. brasiliensis. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron con la lnea de clulas de carcinoma KB con podofilotoxina como control positivo.
142

Parte experimental

6.2.2.- Descripcin de los experimentos

a) Sntesis de dienos y precursores
2,3,4,6-tetrahidroxi-benzociclohepten-5-ona (1). 225 190 g (1.5 mol) de pirogalol disueltos en 500 mL de agua se agregaron lentamente y con agitacin continua sobre 2 L de solucin de KIO3 8 %. La mezcla de reaccin tom color marrn-rojizo. Luego de agregados 50 mL de solucin se suspendi el goteo hasta que apareci un precipitado naranja. Se termin el agregado y el slido formado se lav con agua fra hasta que las aguas de lavado fueron lmpidas. Se lav el slido con MeOH y finalmente con ter etlico fro. Rendimiento 85 %. Slido amorfo naranja. P. F.: 265-267 C (descompone). 4-hidroxi-2,3,6-trimetoxi-benzociclohepten-5-ona (2) 28 g (0.7 mol) de NaOH en 200 mL de agua se agregaron con agitacin continua sobre una mezcla de 45 g (0.2 mol) de purpurogalina (1), 100 g de hielo picado y 60 mL (0.63 mol) de sulfato de dimetilo. La mezcla se agit por 12 horas. El slido precipitado se lav exhaustivamente con agua y se recristaliz de EtOH. Rendimiento 83 %. Cristales amarillos. P. F.: 169-171 C. IR (KBr): (cm-1) = 2934, 1607, 1584, 1557, 1522, 1464, 1412, 1358, 1287, 1250, 1213, 1186, 1152, 1113, 1071, 1049, 1005, 889, 826, 777, 668.
1

H RMN: (ppm) = 7.17 (d; J = 11.2 Hz, 9), 6.67 (dd; J1 = 11.2 Hz, J2 = 9.3 Hz, 8), 6.67 (s; 1), C RMN: (ppm) = 186.34 (C=O), 159.77 (C-OCH3), 158.67 (C-OCH3), 157.28 (C-OCH3),

6.60 (d; J = 9.3 Hz, 7), 4.00 (s; 3H, OCH3), 3.97 (s; 3H, OCH3), 3.91 (s; 3H, OCH3).
13

136.52 (C-OCH3), 134.82 (9), 123.96 (8), 112.74 (7), 106.07 (1), 61.11 (OCH3), 56.99 (OCH3), 56.49 (OCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 262 (M+, 100 %), 247 (30 %), 233 (22 %), 219 (32 %), 201 (15 %), 191 (19 %), 173 (19 %), 147 (15 %), 131 (9 %), 105 (23 %), 89 (13 %), 77 (14 %), 63 (11 %), 51 (13 %).

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Parte experimental 2,3,4,6-tetrametoxi-benzociclohepten-5-ona (3). 225 5 g (0.02 mol) de tri-O-metilpurpurogalina (2) y una solucin de 32.5 g (0.58 mol) de KOH se agitaron hasta obtener una mezcla homognea. Se agregaron de una vez 10 mL (0.11 mol) de sulfato de dimetilo. La mezcla se refluj por 30 minutos. Se enfri a temperatura ambiente y se lav el slido exhaustivamente con agua. Se sec y se extrajo con ter etlico. La solucin etrea se sec sobre MgSO4 anh. y se destil el disolvente a presin reducida. El producto se recristaliz de MeOH. Rendimiento 65 %. Cristales amarillos. P. F.: 92-93 C. IR (KBr): (cm-1) = 2944, 1647, 1620, 1588, 1572, 1530, 1489, 1466, 1450, 1395, 1350, 1279, 1252, 1215, 1179, 1096, 1044, 1015, 982, 952, 870, 808, 787, 772, 749, 720, 648.
1

H RMN: (ppm) = 6.88 (d; J = 11.7 Hz, 9) 6.75 (s; 1), 6.51 (dd; J1 = 11.7 Hz, J2 = 8.7 Hz,

8), 6.15 (d; J = 8.7 Hz, 7) 4.04 (s; 3H, OCH3), 3.97 (s; 3H, OCH3), 3.93 (s; 3H, OCH3), 3.83 (s; 3H, OCH3).
13

C RMN: (ppm) = 185.11 (C=O), 159.21 (C-OCH3), 155.57 (C-OCH3), 153.34 (C-OCH3),

143.95 (C-OCH3), 133.06, 129.27 (9), 126.01, 123.69 (8), 107.17 (1), 105.25 (7), 62.95 (OCH3), 61.37 (OCH3), 56.36 (OCH3), 56.35 (OCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 276 (M+, 100 %), 261 (19 %), 248 (29 %), 244 (31 %), 233 (22 %), 218 (62 %), 205 (20 %), 190 (16 %), 173 (13 %), 161 (15 %), 147 (13 %), 131 (21 %), 119 (17 %), 115 (13 %), 89 (12 %), 76 (17 %). 2,6,6-trimetil-ciclohepta-2,4-dien-1-ona (4).227 30 g (0.2 mol) de carvona destilada se agregaron a una solucin de 44.5 g (0.55 mol) de bromuro de hidrgeno en cido actico glacial, con agitacin mecnica y a 30 C. El agregado tom unos 30 minutos. Al finalizar el agregado se quit el bao y se continu agitando por 15 minutos ms. La solucin resultante se volc sobre 300 mL de agua, se separ la capa inferior acuosa, y se extrajo con ter etlico (3 150 mL). Se juntaron las fases orgnicas, se lav con agua (2 100 mL) y luego con solucin saturada de KHSO4 hasta pH neutro. Se sec con MgSO4 anh. y se gote sobre una solucin fra y enrgicamente agitada de 21.8 g (0.39 mol) de KOH en 80 mL de MeOH. La suspensin se refluj 15 minutos y se volc sobre 60 mL de H2SO4 concentrado en 600 g de hielo, hasta que se separ la eucarvona de la fase acuosa, como un aceite amarillo. La fase acuosa se extrajo con ter dietlico
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Parte experimental (3 20 mL). Se juntaron las fases orgnicas, se sec sobre MgSO4 anh. y se destil el disolvente a presin reducida. Se purific por destilacin a vaco. Rendimiento 70 %. Lquido amarillo plido. P. E.: 123 125 C (50 mmHg). IR (film): (cm-1) = 3019, 2961, 1655, 1597, 1470, 1451, 1420, 1387, 1364, 1310, 1271, 1239, 1210, 1159, 1136, 1086, 1061, 1040, 1017, 970, 947, 889, 828, 731, 631.
1

H RMN: (ppm) = 6.13 (dd; J1 =8.1, J2 =1.5 Hz, 3), 5.62 (dd; J1 = 11.6 Hz, J2 = 1.4 Hz, 5),

5.43 (dd; J1 =11.6 Hz, J2 = 8.1 Hz, 4), 2.64 (s; 2H, 7 gem), 1.91 (s; CH3), 1.06 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 199.72 (1), 148.79 (5), 138.21 (2), 133.98 (3), 122.38 (4), 54.15 (7),

33.00 (6), 26.84 2 (CH3 gem); 20.23 (CH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 150 (M+; 56 %), 135 (100 %), 121 (11 %), 108 (21 %), 107 (42 %), 91 (33 %), 77 (18 %), 57 (16 %), 55 (17 %). 2,6,6-trimetil-ciclohepta-2,4-dienol (5) Mtodo A: 0.05 g (0.33 mmol) de eucarvona (4)227 y 0.05 g (1.32 mmol) de NaBH4 se pusieron a reaccionar en 2 mL de MeOH por 24 horas. Una vez finalizada la reaccin se destil el disolvente a presin reducida. El residuo se tom en 5 mL de agua, y se extrajo con CH2Cl2 (3 5 mL). La fase orgnica se sec sobre MgSO4 anh. Se destil el diclorometano a presin reducida. El residuo se purific por columna de Slica-gel utilizando mezcla Hexano:AcOEt 8:2. Rendimiento 95 %. Mtodo B:256 Se lav una zanahoria sucesivamente con 100 mL de agua, 100 mL de solucin 5 % de hipoclorito de sodio, 100 mL de EtOH 95 % y finalmente con 100 mL de agua destilada. Se quit la cscara, y se troz en cubos de 5 5 milmetros. Se agregaron 20 mg (0.13 m mol) de eucarvona, a un Erlenmeyer conteniendo aproximadamente 24 g de la zanahoria trozada y 75 mL de agua destilada. La reaccin se mantuvo a 28 C con agitacin orbital por 120 horas. Aceite amarillo plido.

145

Parte experimental Mtodo C: 0.3g (1.54 mmol) de eucarvol (5) con 0.235 g (1.70 mmol) de K2CO3 se pusieron a reaccionar en 5 mL de MeOH seco. La reaccin se complet a las 3 horas. Se destil el disolvente a presin reducida. El residuo se tom en 5 mL de agua, y se extrajo con AcOEt (3 5 mL). La fase orgnica se sec sobre MgSO4 anh. Se destil el disolvente a presin reducida. El residuo se purific por columna de Slica-gel utilizando mezcla Hexano:AcOEt 8:2. Rendimiento 80 %. IR (film): (cm-1) = 3350, 3004, 2863, 2726, 1453, 1376, 1360, 1306, 1248, 1163, 1130, 1075, 1048, 1003, 982, 963, 918, 893, 747, 727, 608.
1

H RMN: (ppm) = 5.52 (d; J = 10.8 Hz, 5), 5.49 (d; J = 7.1 Hz, 3), 5.44 (dd; J1 = 10.8 Hz,

J2 = 7.1 Hz, 4), 4.34 (d ancho; J = 10.1 Hz, 1), 2.03 (dd; J1 = 13.1 Hz, J2 = 10.1 Hz, 7a), 1.91 (s: 3H, CH3), 1.77 (d ancho; J = 13.1 Hz, 7b), 1.11 (s; 3H, CH3 gem), 1.07 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 144.82 (2), 141.89 (4), 121.18 (3), 119.20 (5), 71.10 (1), 50.21 (7),

36.24 (6), 31.22 (CH3 gem), 30.16 (CH3 gem), 21.83 (CH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 152 (M+; 19 %), 137 (26 %), 136 (49 %), 135 (100 %), 134 (52 %), 121 (43 %), 119 (97 %), 109 (37 %), 107 (48 %), 105 (21 %), 94 (24 %), 93 (80 %), 91 (44 %), 81 (24 %), 79 (27 %), 77 (28 %), 55 (20 %), 43 (43 %). Etanoato de 2,6,6-trimetil-ciclohepta-2,4-dienilo (6) Mtodo A. 50 mg (0.33 mmol) de eucarvol (5), 0.5 mL (0.49 g, 6.6 mmol) de piridina (d = 0.978 g/mL), y 0.3 mL (0.3 g, 3.3 mmol) de anhdrido actico (d = 1.082 g/mL), y una punta de esptula de DMAP (p-N,N-dimetilaminopiridina) se pusieron a reaccionar en un baln de fondo redondo a temperatura ambiente, durante 30 minutos. Una vez terminada la reaccin, se agregaron 10 mL de ter etlico, se lav con solucin saturada de NaHCO3 (3 3 mL), con solucin saturada de CuSO4 (3 3 mL) y con solucin saturada de NaCl (2 3 mL). Se sec la fase orgnica con MgSO4 anh. y se destil el disolvente a presin reducida. El residuo se purific por columna de Slica-gel utilizando mezcla Hexano:AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 55 %.

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Parte experimental Mtodo B. 0.2 g (1.32 mmol) de 5, y 0.04 g de lipasa de C. antarctica A liofilizada (Chirazime L5 Lyo), se pusieron a reaccionar en 5 mL de acetato de vinilo. Una vez completada la reaccin, se filtr la enzima, y se destil el disolvente a presin reducida y el residuo se purific por columna de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexanos:AcOEt 8:2. Rendimiento: 48 %, 48 hs; 85 %, 30 das. []D20 (48 horas) = -20 Aceite amarillo plido. IR (film): (cm-1) = 3009, 2961, 2926, 2869, 1740, 1651, 1620, 1471, 1450, 1372, 1242, 1219, 1142, 1030, 918, 750, 610, 569.
1

H RMN: (ppm) = 5.61 (d ancho; J = 6.8 Hz, 3), 5.57-5.48 (m; 3H, 4, 5, 1), 2.11

(s; 3H, CH3COO-), 2.03 (dd; J1 = 13.1 Hz, J2 = 10.0 Hz, 7 gem), 1.80 (s; 3H, CH3), 1.76 (d ancho; J = 13.1 Hz, 7 gem), 1.17 (s; 3H, CH3 gem), 1.08 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 170.25 (O-CO-CH3), 142.10 (4), 140.71 (2), 120.56 (3), 120.28 (5),

72.80 (1), 45.88 (7), 36.02 (6), 30.50 (CH3 gem), 29.64 (CH3 gem), 21.36 (CH3), 21.15 (CH3COO). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 194 (M+; 10 %), 167 (13 %), 153 (15 %), 152 (48 %), 151 (13 %), 150 (27 %), 149 (79 %), 137 (44 %), 136 (35 %), 135 (51 %), 134 (21 %), 123 (21 %), 121 (23 %), 119 (53 %), 111 (18 %), 109 (54 %), 107 (28 %), 105 (20 %), 97 (21 %), 95 (24 %), 93 (23 %), 91 (31 %), 81 (22 %), 57 (38 %), 43 (100 %).

b) Sntesis de dienfilos
Oxidacin de 3-nitroanilina 10.0 g (72.5 mmol) de 3-nitroanilina disueltos en 22 mL de MeOH, una solucin de 0.22 g (0.51 mmol) de sal tetrasdica del cido etilendiaminotetraactico (EDTA) y 0.45 g (1.39 mmol) de NaWO4.2H20 (tungstato de sodio dihidratado) en 16.2 mL de agua se pusieron a reaccionar en un baln de 3 bocas equipado con ecualizador, agitador mecnico y termmetro. Se enfri la mezcla de reaccin en bao de hielo y se agreg H2O2 (65.4 mL de solucin 16 %, 0.308 mol) en un perodo de 5 horas. La reaccin se torn azul, se agit por 16 horas a temperatura ambiente. El producto se extrajo con ter de petrleo (3 10 mL). El exceso de amina se elimin lavando con 2 porciones de 10 mL de HCl 2N. La capa orgnica
147

Parte experimental (azul), se lav con solucin saturada de NaCl y se sec sobre MgSO4 anh. Se destil el disolvente a presin reducida. 4-nitrosobenzaldehdo (10) 4 g (26.5 mmol) de 4-nitrobenzaldehdo se pusieron a reaccionar con 1.62 g (30.3 mmol) de NH4Cl y 4.05 g de polvo de Zn en 20 mL de acetona-20 mL de agua, segn PGS 1, Mtodo C.245 El precipitado de ZnO se lav con 20 mL de agua hirviendo. La solucin se enfri a temperatura ambiente y se volc sobre una solucin de 1.84 g de Na2Cr2O7 y 8 mL de H2SO4 10 % en 8 mL de agua previamente enfriada, de acuerdo a PGS 1, Mtodo B. El producto se destil por arrastre con vapor, recogiendo el destilado sobre un Erlenmeyer en bao de hielo. Rendimiento 60 %. Cristales amarillos. P.F.: 128-129 C. IR (KBr): (cm-1) = 3002, 2861, 1935, 1690, 1597, 1458, 1427, 1389, 1312, 1294, 1262, 1202, 1177, 1154, 1100, 1011, 872, 843, 830, 791, 712, 625.
1

H RMN: (ppm) = 10.21 (s; 1H, CHO), 8.17 (d; J = 8.4 Hz, 2, 6), 8.04 (d; J = 8.4 Hz, 3, 5). C RMN: (ppm) = 191.24 (CHO), 163.81 (1), 139.51 (4), 131.07 (2, 6), 121.08 (3, 5).

13

MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 135 (M+, 100 %), 105 (CHOPh+, 29 %), 77 (59 %), 51 (60 %). 4-cloronitrobenceno (11) 28.5 g (20 mL) de HNO3 conc. y 37 g (20 mL) de H2SO4 conc. se mezclaron en un baln de fondo redondo de 250 mL y se dej enfriar la mezcla a temperatura ambiente. Se agregaron 11.3 g (0.1 mol, 10.2 mL) de clorobenceno en porciones de 2-3 mL en 15 minutos. Se agit vigorosamente no dejando subir la temperatura a ms de 50-60 C, enfriando en bao de agua. Cuando la temperatura ya no subi ms, se calent en bao de agua a ebullicin por 30 minutos. Se dej volver a temperatura ambiente y se volc la reaccin sobre 200 mL de agua helada. Se filtr el cloronitrobenceno con Buchner y se lav rpidamente con agua fra. Se recristaliz de EtOH. Rendimiento 90 %. Cristales amarillo plido. P. F.: 83-84 C. IR (KBr): (cm-1) = 3104, 2361, 1919, 1605, 1578, 1518, 1476, 1422, 1402, 1343, 1281, 1173, 1107, 1092, 1013, 855, 741, 675.
1

H RMN: (ppm) = 8.20 (d; J = 9.0 Hz, 2, 6), 7.54 (d; J = 9.0 Hz, 3, 5).
148

Parte experimental
13

C RMN: (ppm) = 146.98 (1), 141.76 (4), 129.97 (3, 5), 125.32 (2, 6).

MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 159 (M+ +2, 8 %), 157 (M+, 22 %), 141 (1 %), 129 (3 %), 127 (7 %), 113 (6 %), 111 (ClPh+, 19 %), 101 (2 %), 99 (6 %), 85 (3 %), 75 (17 %), 57 (4 %). 4-cloronitrosobenceno (12) 4.2 g (26.5 mmol) de 4-cloronitrobenceno se pusieron a reaccionar con 1.62 g (30.3 mmol) de NH4Cl y 4.05 g de polvo de Zn en 40 mL de acetona-agua 1:1, segn PGS 1, Mtodo C.245 El precipitado de ZnO se lav con 20 mL de agua hirviendo. La solucin se enfri y se volc sobre una solucin de 1.84 g de Na2Cr2O7 y 8 mL de H2SO4 10 % en 8 mL de agua previamente enfriada, de acuerdo a PGS 1, Mtodo B. El producto se destil por arrastre con vapor, recogiendo el destilado sobre un Erlenmeyer en bao de hielo. Rendimiento 43 %. Cristales amarillos. P.F.: 92-93 C IR (KBr): (cm-1) = 3098, 1580, 1482, 1404, 1291, 1258, 1186, 1159, 1107, 1090, 1015, 857, 820, 810, 714, 677, 629.
1

H RMN: (ppm) = 7.85 (d; J = 8.7 Hz, 2, 6), 7.59 (d; J = 8.7 Hz, 3, 5). C RMN: (ppm) = 163.80 (1),142.49 (4), 129.71 (3, 5), 122.18 (2, 6).

13

MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 143 (M+ +2, 1 %), 141 (M+, 3 %), 127 (3 %), 111 (ClPh+,14 %), 97 (2%), 83 (3 %), 75 (6 %), 56 (5 %). 4-nitrosotolueno (13) 3.63 g (26.5 mmol) de 4-nitrotolueno se pusieron a reaccionar con 1.62 g (30.3 mmol) de NH4Cl y 4.05 g de polvo de Zn en 20 mL de acetona-20 mL de agua, segn PGS 1, Mtodo C.245 El precipitado de ZnO se lav con 20 mL de agua hirviendo. La solucin se enfri y se volc sobre ella, con agitacin, una solucin de 3.0 g de FeCl3 en 10 mL de agua. (PGS 1, Mtodo C). Luego de 5 minutos de reaccin, el precipitado se filtr y se destil por arrastre con vapor recogiendo el destilado sobre un Erlenmeyer en bao de hielo. Rendimiento 45 %. Cristales amarillos. P.F.: 47-48 C.

149

Parte experimental IR (KBr): (cm-1) = 1599, 1520, 1456, 1410, 1345, 1296, 1253, 1184, 1165, 1119, 1044, 1017, 858, 824, 760, 737.
1

H RMN: (ppm) = 7.80 (d; J = 8.1 Hz, 2, 6), 7.39 (d; J = 8.1 Hz, 3, 5), 2.44 (s; 3H, CH3). C RMN: (ppm) = 165.65 (1), 147.19 (4), 129.76 (3, 5), 121.30 (2, 6), 21.96 (CH3).

13

MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 121 (M+, 18 %), 111 (37 %), 109 (32 %), 105 (29 %), 97 (58 %), 95 (45 %), 91 (CH3Ph+, 100 %), 85 (46 %), 83 (56 %), 71 (56 %), 69 (55 %), 55 (57 %).

c) Sntesis de aductos de Diels Alder

()-4,5,6,9-Tetrametoxi-11-fenil-10-oxa-11-aza-triciclo[7.2.2.02,7]trideca-2,4,6,12tetraen-8-ona (14) 1.1 g (4 mmol) de tetra-O-metilpurpurogalina (TMPG) (3) y 0.52 g (4.8 mmol) de nitrosobenceno se suspendieron en 50 mL de hexano. La mezcla de reaccin se agit a temperatura ambiente por 40 horas, y el precipitado formado se filtr, se lav con hexano, y se recristaliz de MeOH. Rendimiento 94 %. Cristales amarillo plido. P. F.: 114-115 C. Teo.: C: 65.8 %; H: 5.5 %; N: 3.7 %; Exp.: C: 65.8 %; H: 5.8 %; N: 3.7 %.257 IR (KBr): (cm-1) = 3004, 2982, 2944, 1694, 1590, 1491, 1456, 1402, 1356, 1325, 1283, 1258, 1215, 1198, 1134, 1107, 1088, 1049, 1032, 988, 955, 918, 899, 878, 841, 806, 764, 695, 656.
1

H RMN: (ppm) = 7.21 (dd; J1 = 7.8 Hz, J2 = 7.3 Hz, 2 H, ArH), 7.09 (d; J = 7.8 Hz, 2 H,

ArH), 6.93 (d; J = 7.3 Hz, 1H, ArH), 6.62 (s; 1H, 3), 6.55 (dd; J1 = 9.2 Hz, J2 = 6.6 Hz, 12), 6.12 (d; J = 9.2 Hz, 13), 5.18 (d; J = 6.6 Hz, 1), 3.87 (s; 3H, OCH3), 3.84 (s; 3H, OCH3), 3.79 (s; 3H, OCH3,), 3.63 (s; 3H, OCH3).
13

C RMN: (ppm) = 190.17 (8), 157.85 (4), 156.74 (6), 150.86 (Aromtico), 144.16 (5),

136.71 (12), 135.83 (2), 129.28 (2C Aromticos), 127.71 (13), 123.40 (Aromtico), 120.45 (7), 118.30 (2C Aromticos), 109.36 (3), 102.73 (9), 69.46 (1), 62.17 (OCH3), 61.44 (OCH3), 56.61 (OCH3), 53.30 (OCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 276 (83 %), 261 (17 %), 248 (32 %), 233 (24 %), 218 (65 %) 205 (20 %), 190 (15 %), 173 (11 %), 161 (14 %), 147 (9 %), 131 (7 %), 115 (10 %), 107 (PhNO+, 62 %), 77 (Ph+, 100 %), 51 (52 %).
150

Parte experimental ()-4-(4,5,6,9-tetrametoxi-8-oxo-10-oxa-11-aza-triciclo[7.2.2.02,7]trideca-2,4,6,12-tetraen11-il)-benzaldehdo (15) 0.1 g (0.36 mmol) de TMPG (3) y 0.054 g (0.39 mmol) de 4-nitrosobenzaldehdo (10) se pusieron a reaccionar segn PGS 2. La reaccin se complet a las 12 horas. Rendimiento 96 %. Cristales blancos. P.F.: 154-155 C. Teo.: C: 64.23 %; H: 5.14 %; N: 3.40 %; Exp.: C: 63.88 %; H: 5.22 %; N: 3.41 %. IR (KBr): (cm-1) = 2980, 2810, 2800, 2726, 1820, 1780, 1597, 1566, 1499, 1460, 1420, 1387, 1306, 1316, 1177, 1161, 1115, 1096, 1080, 1044, 1019, 967, 949, 893, 855, 833, 803, 718, 695, 650.
1

H RMN: (ppm) = 9.90 (s; 1H, CHO), 7.82 (d; J = 8.5 Hz, 2 H, ArH), 7.29 (d; J = 8.5 Hz, 2 H,

ArH), 6.75 (s; 3), 6.69 (dd; J1 = 9.2 Hz, J2 = 6.7 Hz, 12), 6.19 (d; J = 9.2 Hz, 13), 5.43 (d; J = 6.7 Hz, 1), 1H), 3.97 (s; 3H, OCH3), 3.93 (s; 3H, OCH3), 3.88 (s; 3H, OCH3), 3.74 (s; 3H, OCH3).
13

C RMN: (ppm) = 191.14 (CHO), 189.46 (8), 158.02 (4), 156.85 (6), 156.11 (Aromtico),

144.48 (5), 136.75 (12), 134.71 (2), 131.74 (Aromtico), 131.60 (2C Aromticos), 127.86 (13), 120.45 (7), 117.69 (2C Aromticos), 109.23 (3), 103.34 (9), 68.64 (1), 62.21 (OCH3), 61.47 (OCH3), 56.66 (OCH3), 53.58 (OCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 276 (100 %), 261 (20 %), 248 (32 %), 244 (33 %), 243 (21 %), 233 (24 %), 218 (70 %), 205 (21 %), 190 (16 %), 175 (12 %), 173 (13 %), 161 (14 %), 147 (12%), 145 (11 %), 135 (82 %), 119 (16 %), 105 (26 %), 89 %12 %), 77 (Ph+, 71 %), 63 (13 %), 51 (75 %). ()-11-(4-clorofenil)-4,5,6,9-tetrametoxi-10-oxa-11-aza-triciclo[7.2.2.0 2,7]trideca2,4,6,12,-tetraen-8-ona (16) 0.1 g (0.36 mmol) de TMPG (3) y 0.056 g (0.39 mmol) de 4-cloronitrosobenceno (12) en 10 mL de tolueno seco, se pusieron a reaccionar segn PGS 2. La reaccin se complet a las 15 horas. Se destil a presin reducida el 50 % del disolvente y el producto precipit en el medio de reaccin. Rendimiento 93 %. Cristales amarillo plido. P.F.: 131-132 C. Teo.: C: 60.36 %; H: 4.82 %; N: 3.35 %; Exp.: C: 59.97 %; H: 5.20 %; N: 3.21 %.
151

Parte experimental IR (KBr): (cm-1) = 3000, 2942, 1694, 1590, 1487, 1402, 1358, 1327, 1258, 1204, 1136, 1082, 1055, 1003, 961, 949, 901, 885, 843, 816, 795, 750, 710.
1

H RMN: (ppm) = 7.25 (d; J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 7.09 (d; J = 8.8 Hz, 2 H, ArH), 6.71 (s; 3),

6.62 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 12), 6.20 (d; J = 9.4 Hz, 13), 5.21 (d; J = 6.7 Hz, 1), 3.95 (s; 3H, OCH3), 3.92 (s; 3H, OCH3), 3.87 (s; 3H, OCH3), 3.69 (s; 3H, OCH3).
13

C RMN: (ppm) = 189.04 (8), 157.60 (4), 156.43 (6), 149.15 (Aromtico), 144.42 (5),

135.91 (12), 134.99 (2), 129.71 (Aromtico), 128.95 (2C Aromticos), 127.56 (13), 123.34 (7), 119.33 (2C Aromticos), 108.86 (3), 102.45 (9), 69.37 (1), 61.09 (OCH3), 56.25 (OCH3), 55.99 (OCH3), 53.05 (OCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 276 (100 %), 161 (17 %), 259 (11 %), 248 (26 %), 247 (11 %), 245 (13 %), 244 (26 %), 243 (17 %), 233 (19 %), 218 (56 %), 205 (17 %), 190 (13 %), 175 (10 %), 173 (10 %), 161 (11 %), 147 (10 %), 143 (20 %), 141 (52 %), 131 (19 %), 130 (13 %), 119 (14 %), 115 (10 %), 113 (27 %), 111 (77 %), 76 (23 %), 75 (56 %), 74 (17 %), 63 (11 %), 51 (13 %), 50 (28 %). ()-4,5,6,9-tetrametoxi-11-p-toluil-10-oxa-11-aza-triciclo[7.2.2.02,7]trideca-2,4,6,12tetraen-8-ona (17) 0.1 g (0.36 mmol) de TMPG (3) y 0.048 g (0.39 mmol) de 4-nitrosotolueno (13) en 10 mL de hexano se pusieron a reaccionar a temperatura ambiente. La reaccin se complet a las 48 horas. El precipitado formado se filtr a vaco y se lav con hexano fro. Rendimiento 92 %. Cristales blancos. P.F.: 122-123 C. Teo.: C: 66.49 %; H: 5.83 %; N: 3.52 %; Exp.: C: 66.81 %; H: 5.69 %; N: 3.58 %. IR (KBr): (cm-1) = 3000, 2938, 1680, 1590, 1505, 1489, 1402, 1356, 1327, 1258, 1136, 1103, 1082, 1055, 1003, 950, 901, 885, 849, 841, 818, 803, 783, 756, 725.
1

H RMN: (ppm) = 7.10-7.04 (m; 4 H, ArH), 6.71 (s; 3), 6.61 (dd; J1 = 9.2 Hz, J2 = 6.7 Hz, 12),

6.20 (d; J = 9.2 Hz, 13), 5.22 (d; J = 6.7 Hz, 1), 3.95 (s; 3H, OCH3), 3.91 (s; 3H, OCH3), 3.86 (s; 3H, OCH3), 3.69 (s; 3H, OCH3), 2.29 (s; 3H, ArCH3).
13

C RMN: (ppm) = 190.21 (8), 157.92 (4), 156.69 (6), 148.48 (Aromtico), 144.17 (5),

136.47 (12), 135.93 (2), 132.95 (2), 129.84 (Aromtico), 127.85 (2C Aromticos), 123.70 (13),

152

Parte experimental 120.50 (7), 118.37 (2C Aromticos), 109.25 (3), 102.61 (9), 69.73 (1), 62.16 (OCH3), 61.45 (OCH3), 56.59 (OCH3), 53.31 (OCH3), 21.01 (ArCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 276 (100 %), 261 (18 %), 248 (29 %), 244 30 %), 233 (20 %), 218 (60 %), 205 (19 %), 190 (14 %), 175 (11 %), 173 (11 %), 161 (13 %), 147 (11 %), 145 (9 %), 130 (13 %), 121 (57 %), 91 (68 %), 76 (14 %), 65 (52 %). Reaccin de Diels-Alder entre (3) y p-N,N-dimetilaminonitrosobenceno 0.1 g (0.36 mmol) de tetra-O-metilpurpurogalina (3) y 0.06 g (0.39 mmol) de p-N,N-dimetilaminonitrosobenceno en 10 mL de hexano, se pusieron a reaccionar segn PGS 2. Se agit 24 horas a temperatura ambiente en ausencia de luz. Se elev la temperatura a 60 C, y se agit por 24 horas ms. Se puso el sistema a reflujo y se agit por 48 horas. Se agreg una punta de esptula de cido de Lewis como catalizador (En un caso AlCl3 y en otro TiCl4). ()-1,4,4-Trimetil-9-fenil-8-oxa-9-azabiciclo[3.2.2]non-6-en-2-ona (19) 17 0.1 g (0.67 mmol) de eucarvona (4)227 y 0.08 g (0.73 mmol) de nitrosobenceno en 10 mL de THF seco, se pusieron a reaccionar segn PGS 3. La reaccin se complet a las 12 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 95:5 como fase mvil. Rendimiento 98 %. Cristales amarillo plido. P.F.: 56-57 C. Teo.: C: 74.68 %; H: 7.44 %; N: 5.44 %; Exp.: C: 74.86 %; H: 7.60 %; N: 5.55 %. 17 IR (KBr): (cm-1) = 3075, 2955, 2850, 1711, 1593, 1485, 1235, 1196, 1177, 1082, 1028, 1011, 963, 941, 903, 853, 762, 743, 698, 628.
1

H RMN: (ppm) = 7.24 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 7.4 Hz, 2H, ArH), 7.00 (d ancho; J = 8.4 Hz,

2H, ArH), 6.95 (t ancho; J = 7.3 Hz, 1H, ArH), 6.15 (dd; J1 = 9.1 Hz, J2 = 7.4 Hz, 6), 6.03 (d; J = 9.1 Hz, 7) 3.98 (d; J = 7.4 Hz, 5) 3.41 (d; J = 13.4 Hz, 3 gem), 2.27 (d; J = 13.4 Hz, 3 gem) 1.63 (s; 3H, CH3 puente), 1.46 (s; 3H, CH3 gem), 1.07 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 206.81 (2), 153.19 (Aromtico), 133.00 (6), 129.54 (7), 129.00

(2C Aromticos), 122.61 (Aromtico), 117.76 (2C Aromticos), 83.06 (1), 71.89 (5), 54.19 (3), 39.95 (4), 30.35 (CH3 gem), 26.69 (CH3 gem), 20.35 (CH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 257 (M+, 89 %), 214 (37 %), 174 (64 %); 172 (43 %); 130 (89 %), 107 (PhNO+, 100 %), 95 (72 %), 77 (Ph+, 89 %).
153

Parte experimental ()-4-(2,2,5-trimetil-4-oxo-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-7-il)-benzaldehdo (20) 0.1 g (0.67 mmol) de eucarvona (4)227 y 0.1 g (0.73 mmol) de 4-nitrosobenzaldehdo (10) en 10 mL de THF seco, se pusieron a reaccionar segn PGS 3. La reaccin se complet a las 10 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 95:5 como fase mvil. Rendimiento 95 %. Cristales amarillo plido. P.F.: 97-98 C. Teo.: C: 71.56 %; H: 6.71 %; N: 4.91 %; Exp.: C: 71.72 %; H: 6.67 %; N: 5.29 %. IR (KBr): (cm-1) = 3007, 2940, 2737, 1705, 1680, 1590, 1505, 1491, 1455, 1435, 1422, 1404, 1366, 1325, 1260, 1171, 1142, 1118, 1086, 1065, 1017, 990, 951, 901, 885, 853, 833, 820, 787, 750, 720, 689.
1

H RMN: (ppm) = 9.85 (s; 1H, CHO), 7.76 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.11 (d; J = 8.7 Hz, 2H,

ArH), 6.24 (dd; J1 = 9.0 Hz, J2 = 7.4 Hz, 8), 6.02 (d; J = 9.0 Hz, 9), 4.19 (d; J = 7.4 Hz, 1), 3.35 (d; J = 13.6 Hz, 3 gem), 2.33 (d, J = 13.6 Hz, 3 gem), 1.65 (s; 3H, CH3 puente), 1.44 (s; 3H, CH3 gem), 1.11 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 205.49 (4), 191.02 (CHO), 158.21 (Aromtico), 133.29 (8), 131.44

(2C Aromticos), 130.64 (Aromtico),129.46 (9), 116.75 (2C Aromticos), 83.93 (5), 70.71 (1), 54.04 (3), 39.79 (2), 30.24 (CH3 gem), 26.69 (CH3 gem), 20.39 (CH3 puente). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 285 (M+, 100 %), 242 (31 %), 228 (10 %), 214 (17 %), 200 (39 %), 185 (14 %), 172 (15 %), 158 (79 %), 135 (30 %), 132 (36 %), 121 (19 %), 107 (PhNO+, 57 %), 105 (56 %), 95 (44 %), 83 (84 %), 77 (Ph+, 79 %), 55 (47 %), 51 (50 %), 43 (65 %). ()-7-(clorofenil)-2,2,5-trimetil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ona (21) 0.1 g (0.67 mmol) de eucarvona (4)227 y 0.1 g (0.73 mmol) de 4-cloronitrosobenceno (12) en 10 mL de THF seco, se pusieron a reaccionar segn PGS 3. La reaccin se complet a las 15 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 95:5 como fase mvil. Rendimiento 87 %. Cristales amarillo plido. P.F.: 98-99 C. Teo.: C: 65.86 %; H: 6.22 %; N: 4.80 %; Exp.: C: 65.54 %; H: 6.45 %; N: 4.89 %. IR (KBr): (cm-1) = 3044, 2951, 2867, 1713, 1588, 1485, 1422, 1379, 1366, 1331, 1314, 1264, 1237, 1200, 1171, 1111, 1092, 1040, 1019, 965, 943, 889, 857, 830, 804, 702, 660.
154

Parte experimental
1

H RMN: (ppm) = 7.19 (d; J = 8.8 Hz, 2H, ArH), 6.93 (d; J = 8.8 Hz, 2H, ArH),

6.14 (dd; J1 = 9.1 Hz, J2 = 7.3 Hz, 8), 6.03 (d; J = 9.1 Hz, 9), 3.92 (d; J = 7.3 Hz, 1), 3.39 (d; J = 13.4 Hz, 3 gem), 2.27 (d; J = 13.4 Hz, 3 gem), 1.61 (s; 3H, CH3 puente), 1.44 (s; 3H, CH3 gem), 1.07 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 206.01 (4), 151.46 (Aromtico), 132.45 (8), 129.27 (9),

128.63 (2C Aromticos), 127.31 (Aromtico), 118.70 (2C Aromticos), 82.87 (5), 71.61 (1), 53.75 (3), 39.56 (2), 29.96 (CH3 gem), 26.26 (CH3 gem), 20.01 (CH3 puente). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 293 (M+ +2, 29 %), 291 (M+, 85 %), 250 (10 %), 248 (28 %), 210 (19 %), 208 (68 %), 206 (34 %), 191 12 %), 166 (36 %), 164 (70 %), 143 (17 %), 141 (46 %), 138 (36 %), 154 (13 %), 113 (31 %), 111 (100 %), 107 (PhNO+, 71 %), 95 (54 %), 83 (73 %), 77 (Ph+, 22 %), 75 (52 %), 55 (46 %), 43 (70 %). ()-2,2,5-trimetil-7-p-toluil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ona (22) 0.1 g (0.67 mmol) de eucarvona (4)227 y 0.09 g (0.73 mmol) de 4-nitrosotolueno (13) en 10 mL de THF seco, se pusieron a reaccionar segn PGS 3. La reaccin se complet a las 24 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 95:5 como fase mvil. Rendimiento 90 %. Cristales amarillo plido. P.F.: 71-72 C. Teo.: C: 75.25 %; H: 7.80 %; N: 5.16 %; Exp.: C: 75.71 %; H: 7.98 %; N: 5.09 %. IR (KBr): (cm-1) = 3029, 2870, 1720, 1611, 1578, 1505, 1468, 1422, 1387, 1368, 1318, 1267, 1240, 1200, 1177, 1096, 1080, 1042, 1019, 999, 967, 945, 891, 858, 812, 785, 710, 687, 637.
1

H RMN: (ppm) = 7.04 (d; J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.89 (d; J = 8.3Hz, 2H, ArH), 6.14 (dd;

J1 = 9.1 Hz, J2 = 7.2 Hz, 8), 6.04 (d; J = 9.1 Hz, 9), 3.92 (d; J = 7.2 Hz, 1), 3.41 (d; J = 13.3 Hz, 3 gem), 2.28 (s; 3H, ArCH3), 2.26 (d; J = 13.3 Hz, 3 gem), 1.62 (s; 3H, CH3 puente), 1.45 (s; 3H, CH3 gem), 1.06 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 206.63 (4), 150.47 (Aromtico), 132.70 (8), 131.71 (9),

130.90 (Aromtico), 129.19 (2C Aromticos), 117.45 (2C Aromticos), 82.58 (5), 71.60 (1), 53.83 (3), 39.60 (2), 29.99 (CH3 gem), 26.34 (CH3 gem), 20.59 (ArCH3), 20.01 (CH3 puente).

155

Parte experimental MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 271 (M+, 72 %), 228 (27 %), 214 (8 %), 200 (17 %), 188 (53 %), 186 (25 %), 171 (11 %), 158 (8 %), 144 (56 %), 130 (10 %), 121 (100 %), 107 (PhNO+, 44 %), 91 (99 %), 83 (16 %), 77 (Ph+, 14 %), 65 (42 %), 43 (29 %). Reaccin de Diels-Alder entre (4) y p-N,N-dimetilaminonitrosobenceno 0.1 g (0.67 mmol) de eucarvona (4) y 0.11 g (0.73 mmol) de

p-N,N-dimetilaminonitrosobenceno se pusieron a reaccionar en 10 mL de tolueno seco. Se agit 24 horas a temperatura ambiente. Se elev la temperatura a 60 C, y se agit por 24 horas ms. Se puso el sistema a reflujo y se dej 48 horas agitando. Se agreg una punta de esptula de cido de Lewis como catalizador (En un caso AlCl3 y en otro TiCl4). 2,2,5-trimetil-7-fenil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ol. (24) 0.1 g (0.66 mmol) de eucarvol (5) y 0.08 g (0.72 mmol) de nitrosobenceno se pusieron a reaccionar en 5 mL de THF seco, segn PGS 3. La reaccin se complet a las 24 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano:AcOEt 9:1 como fase mvil. Rendimiento global 92 %. Relacin molar anti/syn = 9/1. Teo.: C: 74.10 %; H: 8.16 %; N: 5.40 %; Exp.: C: 74.52 %; H: 8.25 %; N: 5.29 %. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 259 (M+; 87 %), 242 (52 %), 186 (21 %), 174 (23 %), 151 (44 %), 146 (54 %), 145 (26 %), 132 (30 %), 130 (37 %), 123 (25 %), 119 (24 %), 118 (23 %), 109 (52 %), 104 (45 %), 95 (42 %), 93 (37 %), 91 (23 %), 83 (24 %), 77 (Ph+, 100 %), 55 (29 %), 51 (34 %), 43 (80 %). Mezcla racmica de aductos anti Cristales blancos. P.F.: 159-160 C. IR (KBr): (cm-1) = 3279, 3042, 2982, 2950, 1599, 1489, 1472, 1451, 1370, 1327, 1275, 1225, 1136, 1094, 1080, 1044, 1024, 1011, 992, 961, 918, 897, 837, 752, 695, 625.
1

H RMN: (ppm) = 7.19 (dd; J1 = 8.7 Hz, J2 = 7.3 Hz, 2H, ArH), 6.94 (d; J = 8.7 Hz, 2H,

ArH), 6.86 (t ancho; J1 = 7.3 Hz 2, 1H, ArH), 6.21 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 8), 5.95 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 1.0 Hz, 9), 3.93 (dd; J1 = 6.7 Hz, J2 = 1.0 Hz, 1), 3.70 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 5.6 Hz, 4), 1.81 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 5.6 Hz, 3 gem), 1.62 (s; 3H,

156

Parte experimental CH3 puente), 1.29 (s; 3H, CH3 gem), 1.21 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 9.4 Hz, 3 gem), 1.06 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 153.18 (Aromtico), 130.51 (8), 129.52 (9), 128.89 (2C Aromticos),

121.51 (Aromtico), 117.17 (2C Aromticos), 78.91 (5), 74.57 (4), 69.02 (1), 45.41 (3), 33.08 (2), 32.07 (CH3 gem), 26.18 (CH3 gem), 23.65 (CH3 puente). Mezcla racmica de aductos syn Cristales amarillos. P.F.: 78-79 C. IR (KBr): (cm-1) = 3440, 3250, 3042, 2982, 2950, 1600, 1490, 1230, 1080, 1055, 1035, 1011, 850, 760.
1

H RMN: (ppm) = 7.21 (dd; J1 = 8.7 Hz, J2 = 7.3 Hz, 2H, ArH), 6.98 (d; J = 8.7 Hz, 2H,

ArH), 6.90 (t ancho; J = 7.3 Hz 2, 1H, ArH), 6.14 6.08 (m; 2H, 8,9), 3.87 (dd; J1 = 6.6 Hz, J2 = 1.3 Hz, 1), 3.65 (m; 1H, 4), 2.69 (d ancho; J = 9.5 Hz, OH), 1.70 (d; 2H, J = 4 Hz, 3 gem), 1.58 (s; 3H, CH3 puente), 1.40 (s; 3H, CH3 gem), 0.99 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 152.81 (Aromtico), 132.32 (8), 129.21 (9), 128.50 (2C Aromticos),

121.73 (Aromtico), 117.40 (2C Aromticos), 77.63 (5), 73.70 (4), 70.35 (1), 44.53 (3), 35.73 (2), 30.83 (CH3 gem), 28.55 (CH3 gem), 23.79 (CH3 puente). ()-4-(4-hidroxi-2,2,5-trimetil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-7-il)-benzaldehdo (25) 0.1 g (0.66 mmol) de 5 y 0.1 g (0.74 mmol) de 4-nitrosobenzaldehdo (10) se pusieron a reaccionar en 5 mL de THF seco, segn PGS 3. La reaccin se complet a las 24 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 9:1 como fase mvil. Rendimiento 95 %. Aceite amarillo. IR (film): (cm-1) = 3430, 3046, 2957, 2735, 1736, 1680, 1593, 1566, 1505, 1468, 1372, 1304, 1163, 1048, 939, 916, 898, 831, 748, 704, 656, 619.
1

H RMN: (ppm) = 9.80 (s; 1H, CHO), 7.72 (d; J = 8.6 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d; J = 8.6 Hz, 2H,

ArH), 6.34 (dd; J1 = 9.2 Hz, J2 = 6.7 Hz, 8), 5.94 (dd; J1 = 9.2 Hz, J2 = 0.9 Hz, 9), 4.17-4.12 (m; 1), 3.74 (dd; J1 = 9.5 Hz, J2 = 5.6 Hz, 4), 1.84 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 5.6 Hz, 3 gem), 1.67 (s; 3H, CH3 puente), 1.27 (s; 3H, CH3 gem), 1.26 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 9.5 Hz, 3 gem), 1.10 (s; 3H, CH3 gem).

157

Parte experimental
13

C RMN: (ppm) = 191.22 (CHO), 158.08 (Aromtico), 131.61 (2C Aromticos), 130.92 (8),

129.71 (Aromtico), 129.56 (9), 115.87 (2C Aromticos), 80.52 (5), 74.09 (4), 67.57 (1), 45.12 (3), 33.05 (2), 32.04 (CH3 gem), 25.90 (CH3 gem), 23.71 (CH3 puente). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 287 (M+; 100 %), 270 (81 %), 214 (22 %), 203 (28 %), 186 (16 %), 174 (40 %), 173 (20 %), 160 (18 %), 158 (23 %), 151 (52 %), 146 (30 %), 132 (35 %), 123 (24 %), 121 (21 %), 109 (36 %), 105 (24 %), 95 (29 %), 83 (18 %), 77 (Ph+, 32 %). 7-(4-cloro-fenil)-2,2,5-trimetil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ol (26) 0.1 g (0.66 mmol) de 5 y 0.1 g (0.72 mmol) de 4-cloronitrosobenceno (12) se pusieron a reaccionar en 5 mL de THF seco, segn PGS 3. La reaccin se complet a las 24 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 9:1 como fase mvil. Rendimiento global 95 %. Relacin anti/syn = 9/1. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 295 (M+ +2, 35 %), 294 (M+ +1, 20 %), 293 (M+, 100 %), 278 (23 %), 276 (60 %), 222 (21 %), 220 (24 %), 208 (36 %), 206 (10 %), 180 (70 %), 179 (38 %), 166 (32 %), 164 (34 %), 151 (83 %), 139 (53 %), 138 (48 %), 137 (28 %), 127 (30 %), 111 (ClPh+, 84 %), 109 (72 %), 95 (62 %), 81 (36 %), 71 (40 %), 57 (41 %), 55 (44 %), 43 (66 %). Mezcla racmica de aductos anti Aceite amarillo IR (film): (cm-1) = 3410, 3046, 2955, 2930, 2869, 1590, 1487, 1468, 1451, 1400, 1389, 1366, 1300, 1225, 1190, 1167, 1138, 1094, 1044, 1010, 992, 959, 939, 897, 830, 812, 736, 702, 658, 623, 604.
1

H RMN: (ppm) = 7.14 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.87 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.20

(dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 8), 5.95 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 1.0 Hz, 9), 3.86 (dd; J1 = 6.7 Hz, J2 = 1.0 Hz, 1), 3.69 (dd; J1 = 9.5 Hz, J2 = 5.7 Hz, 4), 1.81 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 5.7 Hz, 3 gem), 1.62 (s; 3H, CH3 puente), 1.29 (s; 3H, CH3 gem), 1.25 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 9.5 Hz, 3 gem), 1.07 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 152.05 (Aromtico), 130.31 (8), 129.64 (9), 128.83 (2C Aromticos),

126.05 (Aromtico), 118.47 (2C Aromticos), 79.15 (5), 74.44 (4), 69.11 (1), 45.33 (3), 33.09 (2), 32.01 (CH3 gem), 30.08 (CH3 gem), 23.66 (CH3 puente). Mezcla racmica de aductos syn
158

Parte experimental Aceite amarillo IR (film): (cm-1) = 3400, 2984, 2961, 2930, 2874, 2257, 1734, 1508, 1395, 1375, 1300, 1248, 1138, 1096, 1046, 1005, 912, 735, 650, 635, 552.
1

H RMN: (ppm) = 7.16 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.92 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.14 6.06

(m; 2H, 8,9), 3.81 (d ancho; J = 6.6 Hz, 1), 3.68-3.63 (m; 1H, 4), 2.60 (d ancho; J = 10.5 Hz, OH), 1.70 (d; J = 4.3 Hz, 2H, 3 gem), 1.57 (s; 3H, CH3 puente), 1.43 (s; 3H, CH3 gem), 0.98 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 152.00 (Aromtico), 132.40 (8), 129.10 (9), 128.47 (2C Aromticos),

126.15 (Aromtico), 118.68 (2C Aromticos), 77.95 (5), 73.58 (4), 70.43 (1), 44.53 (3), 35.77 (2), 30.72 (CH3 gem), 28.56 (CH3 gem), 23.81 (CH3 puente). ()- (1R,4S,5S)-2,2,5-trimetil-7-p-toluil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ol (27) 0.1 g (0.66 mmol) de 5 y 0.09 g (0.74 mmol) de 4-nitrosotolueno (13) se pusieron a reaccionar en 5 mL de THF seco, segn PGS 3. La reaccin se complet a las 72 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 9:1 como fase mvil. Rendimiento 70 %. Aceite amarillo. IR (film): (cm-1) = 3405, 3044, 3024, 2955, 2920, 2867, 1610, 1507, 1466, 1458, 1366, 1298, 1221, 1163, 1138, 1124, 1092, 1044, 1013, 994, 959, 939, 928, 907, 888, 825, 812, 787, 733, 679.
1

H RMN: (ppm) = 6.99 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.84 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.20

(dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 8), 5.96 (d; J = 9.4 Hz, 9), 3.91 (d; J = 6.7 Hz, 1), 3.69 (dd; J1 = 9.5 Hz, J2 = 5.6 Hz, 4), 2.28 (s; 3H, ArCH3), 1.81 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 5.6 Hz, 3 gem), 1.61 (s; 3H, CH3 puente), 1.29 (s; 3H, CH3 gem), 1.25 (dd; J1 = 13.5 Hz, J2 = 9.5 Hz, 3 gem), 1.07 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 150.86 (Aromtico), 130.81 (Aromtico), 130.46 (8), 129.56 (9),

129.44 (2C Aromticos), 117.22 (2C Aromticos), 78.74 (5), 74.57 (4), 69.14 (1), 45.41 (3), 33.07 (2), 32.07 (CH3 gem), 30.08 (CH3 gem), 23.66 (CH3 puente), 20.87 (ArCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 273 (M+; 100 %), 256 (36 %), 200 (17 %), 188 (24 %), 160 (41 %), 151 (32 %), 146 (21 %), 144 (31 %), 139 (24 %), 132 (20 %), 123 (43 %), 118 (34 %), 109 (40 %), 107 (31 %), 95 (35 %), 91 (56 %), 83 (15 %), 81 (14 %), 43 (26 %).
159

Parte experimental ()-Etanoato de 2,2,5-trimetil-7-fenil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ilo. (28) 0.033 g (0.17 mmol) de 6 y 0.02 g (0.19 mmol) de nitrosobenceno se pusieron a reaccionar en 2 mL de THF seco, segn PGS 3. La reaccin se complet a las 24 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 95 %. Cristales blancos. P.F.: 92-93 C. Teo.: C: 71.73 %; H: 7.69 %; N: 4.65 %; Exp.: C: 71.50 %; H: 7.53 %; N: 4.76 %. IR (KBr): (cm-1) = 3092, 3058, 2980, 2957, 2869, 1736, 1597, 1489, 1408, 1450, 1370, 1327, 1287, 1240, 1210, 1138, 1082, 1042, 1028, 981, 979, 837, 756, 692, 650..
1

H RMN: (ppm) = 7.20 (dd; J1 = 8.7 Hz, J2 = 7.3 Hz, 2H, ArH), 6.97 (dd; J1 = 8.7 Hz,

J2 = 1.0 Hz, 2H, ArH), 6.88 (dd; J1 = 7.3 Hz, J2 = 1.0 Hz, 1H, ArH), 6.23 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 8), 5.96 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 1.0 Hz, 9), 4.93 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 5.8 Hz, 4), 3.97 (dd; J1 = 6.7 Hz, J2 = 1.0 Hz, 1), 2.04 (s; 3H, CH3-COO-), 1.86 (dd; J1 = 13.7 Hz, J2 = 5.8 Hz, 3 gem), 1.52 (s; 3H, CH3 puente), 1.33 (s; 3H, CH3 gem), 1.25 (dd; J1 = 13.7 Hz, J2 = 9.4 Hz, 3 gem), 1.07 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 170.29 (O-CO-CH3), 146.61 (Aromtico), 130.50 (8), 129.47 (9),

128.92 (2C Aromticos), 121.64 (Aromtico), 117.17 (2C Aromticos), 78.78 (5), 75.68 (4), 69.05 (1), 41.30 (3), 33.12 (2), 31.76 (CH3 gem), 26.31 (CH3 gem), 23.69 (CH3 puente), 21.60 (CH3COO). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 301 (M+; 37 %), 242 (26 %), 186 (11 %), 174 (11 %), 150 (24 %), 146 (19 %), 145 (13 %), 130 (16 %), 123 (12 %), 119 (44 %), 109 (16 %), 104 (16 %), 95 (17 %), 93 (13 %), 91 (14 %), 77 (Ph+, 41 %), 55 (12 %), 51 (13 %), 43 (100 %). ()-Etanoato de 7-(4-formil-fenil)-2,2,5-trimetil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ilo. (29) 0.1 g (0.51 mmol) de 6 y 0.076 g (0.57 mmol) de 4-nitrosobenzaldehdo (10) se pusieron a reaccionar en 5 mL de THF seco, segn PGS 3. La reaccin se complet a las 24 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano:AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 95 %. Cristales blancos. P. F.: 108-109 C.
160

Parte experimental Teo.: C: 69.28 %; H: 7.04 %; N: 4.25 %; Exp.: C: 69.21 %; H: 6.86 %; N: 4.65 %. IR (KBr): (cm-1) = 3440, 2977, 2836, 1732, 1597, 1506, 1464, 1370, 1242, 1173, 1119, 1078, 1049, 943, 884, 831, 802, 760, 691, 652, 640, 625, 600, 540.
1

H RMN: (ppm) = 9.82 (s; 1H, CHO), 7.72 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d; J = 8.7 Hz, 2H,

ArH), 6.35 (dd; J1 = 9.3 Hz, J2 = 6.7 Hz, 8), 5.94 (d ancho; J = 9.4 Hz, 9), 4.95 (dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 5.9 Hz, 4), 4.14 (d ancho; J = 6.7 Hz, 1), 2.04 (s; 3H, CH3COO-), 1.86 (dd; J1 = 13.8 Hz, J2 = 5.9 Hz, 3 gem), 1.55 (s; 3H, CH3 puente), 1.32 (s; 3H, CH3 gem), 1.27 (dd; J1 = 13.8 Hz, J2 = 9.4 Hz, 3 gem), 1.11 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 190.64 (CHO), 169.85 (O-CO-CH3), 157.51 (Aromtico), 131.16

(2C Aromticos), 130.64 (8), 129.63 (Aromtico), 129.17 (9), 115.58 (2C Aromticos), 78.42 (5), 74.77 (4), 67.36 (1), 40.77 (3), 32.75 (2), 31.37 (CH3 gem), 25.69 (CH3 gem), 23.34 (CH3 puente), 21.18 (CH3COO-). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 330 (M+ +1; 24 %), 329 (M+; 100 %), 270 (99 %), 254 (28 %), 214 (38 %), 174 (32 %), 158 (27 %), 151 (81 %), 146 (26 %), 123 (25 %), 119 (77 %), 105 (42 %), 77 (Ph+; 26 %), 43 (32 %). ()-Etanoato de 7-(4-cloro-fenil)-2,2,5-timetil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ilo. (30) 0.1 g (0.5 mmol) de 6 y 0.08 g (0.57 mmol) de 4-cloronitrosobenceno (12) se pusieron a reaccionar en 5 mL de THF seco, segn PGS 3. La reaccin se complet a las 72 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 80%. Cristales blancos. P. F.: 93-94 C. Teo.: C: 64.38 %; H: 6.60 %; N: 4.17 %; Exp.: C: 64.28 %; H: 6.87 %; N: 4.10 %. IR (KBr): (cm-1) = 3440, 2986, 2953, 2865, 1730,1636, 1590, 1487, 1466, 1404, 1387, 1379, 1366, 1290, 1252, 1205, 1196, 1169, 1144, 1119, 1092, 1043, 994, 982, 914, 841, 799, 718, 625, 602, 534.
1

H RMN: (ppm) = 7.17 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.90 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.24

(dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 8), 5.97 (d ancho; J = 9.4 Hz, 9), 4.93 (dd; J1 = 9.2 Hz, J2 = 5.8 Hz, 4), 3.92 (d ancho; J = 6.7 Hz, 1), 2.06 (s; 3H, CH3COO-), 1.87 (dd; J1 = 13.6 Hz, J2 = 5.8 Hz,

161

Parte experimental 3 gem), 1.51 (s; 3H, CH3 puente), 1.32 (s; 3H, CH3 gem), 1.28 (dd; J1 = 13.6 Hz, J2 = 9.2 Hz, 3 gem), 1.07 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 170.02 (O-CO-CH3), 151.32 (Aromtico), 129.98 (8), 129.21 (9),

128.50 (2C Aromticos), 125.95 (Aromtico), 118.12 (2C Aromticos), 77.34 (5), 75.13 (4), 68.78 (1), 40.85 (3), 32.77 (2), 31.33 (CH3 gem), 25.90 (CH3 gem), 23.35 (CH3 puente), 21.21 (CH3COO-). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 337 (M+ + 2; 23 %), 335 (M+; 63 %), 278 (14 %), 276 (44 %), 262 (4 %), 260 (14 %), 222 (10 %), 220 (26 %), 208 (26 %), 192 (16 %), 181 (19 %), 180 (32 %), 179 (31 %), 166 (18 %), 164 (36 %), 152 (22 %), 151 (73 %), 140 (16 %), 139 (18 %), 138 (30 %), 134 (15 %), 133 (16 %), 127 (14 %), 123 (30 %), 119 (100 %), 113 (19 %), 111 (59 %), 109 (24 %), 95 (24 %), 91 (23 %), 77 (Ph+; 112 %), 75 (19 %), 43 (93 %). ()-Etanoato de 2,2,5-trimetil-7-p-toluil-6-oxa-7-aza-biciclo[3.2.2]non-8-en-4-ilo. (31) 0.1 g ( 0.51 mmol) de 6 y 0.07 g ( 0.57 mmol) de 4-nitrosotolueno (13) se pusieron a reaccionar en 5 mL de THF seco, segn PGS 3. La reaccin se complet a las 170 horas. El residuo se purific por columna cromatogrfica de Slica-gel utilizando una mezcla de Hexano: AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 65%. Aceite amarillo. Teo.: C: 72.35 %; H: 7.99 %; N: 4.44 %; Exp.: C: 72.76 %; H: 7.92 %; N: 4.64 %. IR (film): (cm-1) = 3098, 3044, 3024, 2980, 2953, 2934, 2868, 1736, 1611, 1578, 1507, 1468, 1453, 1370, 1287, 1240, 1208, 1183, 1138, 1119, 1078, 1042, 1020, 1016, 989, 978, 957, 949, 837, 820, 793, 749, 681.
1

H RMN: (ppm) = 7.00 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.84 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.22

(dd; J1 = 9.4 Hz, J2 = 6.7 Hz, 8), 5.95 (d ancho; J = 9.4 Hz, 9), 4.97 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 5.7 Hz, 4), 3.91 (d ancho; J = 6.7 Hz, 1), 2.24 (s; 3H, CH3-Ar), 2.03 (s; 3H, CH3COO-), 1.87 (dd; J1 = 13.6 Hz, J2 = 5.7 Hz, 3 gem), 1.49 (s; 3H, CH3 puente), 1.32 (s; 3H, CH3 gem), 1.26 (dd; J1 = 13.6 Hz, J2 = 8.4 Hz, 3 gem), 1.05 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 169.90 (O-CO-CH3), 150.30 (Aromtico), 130.59 (8), 130.13 (9), 129.10

(2C Aromticos), 130.80 (Aromtico), 116.85 (2C Aromticos), 77.34 (5), 75.35 (4),

162

Parte experimental 68.78 (1), 40.94 (3), 32.74 (2), 31.38 (CH3 gem), 25.96 (CH3 gem), 23.34 (CH3 puente), 21.22 (CH3COO-), 20.52 (ArCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 315 (M+; 92 %), 256 (35 %), 200 (22 %), 188 (24 %), 160 (34 %), 159 (30 %), 151 (45 %), 144 (25 %), 134 (21 %), 133 (26 %), 123 (36 %), 119 (100 %), 118 (28 %), 109 (22 %), 107 (28 %), 95 (24 %), 91 (46 %), 43 (99 %). (5R,6S)-1-metil-3-fenil-2-oxa-3-aza-biciclo[2.2.2]oct-7-en-5,6-diol (32) 0.2 g (1.58 mmol) de (1R,2S)-3-metilciclohexa-3,5-dien-1,2-diol y 0.19 g (1.74 mmol) de nitrosobenceno se pusieron a reaccionar en un baln de 25 mL segn PGS 4. La reaccin se complet a las 20 horas. Rendimiento 78 %. Relacin aducto syn:aducto anti = 1.4:1 IR (film): (cm-1) = 3400, 3060, 2980, 2932, 1736, 1593, 1489, 1451, 1377, 1235, 1200, 1169, 1130, 1084, 1053, 976, 918, 855, 835, 758, 696. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 233 (M+; 4 %), 173 (6 %), 156 (3 %), 107 (15 %), 104 (4 %), 97 (4 %), 93 (9 %), 77 (Ph+, 29 %), 55 (5 %), 51 (17 %), 44 (100 %), 43 (15 %), 40 (30 %). Aducto syn Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 7.24 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 7.6 Hz, 2H, ArH), 7.02 (d; J = 8.2 Hz, 2H, ArH),

6.97 (d; J = 7.6 Hz, 1H, ArH), 6.31 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.2 Hz, 7), 6.02 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 5.8 Hz, 8), 4.48-4.45 (m; 4), 3.91 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 3.5 Hz, 5), 3.38 (d; J = 8.2 Hz, 6), 1.55 (s; 3H, CH3).
13

C RMN: (ppm) = 150.66 (Aromtico), 134.17 (7), 128.50 (2C Aromticos), 128.08 (8),

123.03 (Aromtico), 117.80 (2C Aromticos), 77.38 (1), 66.13 (6), 62.72 (4), 62.06 (5), 18.63 (CH3). Aducto anti Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 7.20 (dd; J1 = 8.8 Hz, J2 = 7.3 Hz, 2H, ArH), 6.97 (d; J = 8.8 Hz, 2H, ArH),

6.93 (d; J = 7.3 Hz, 1H, ArH), 6.29 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 1.7 Hz, 7), 6.16 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 5.6 Hz, 8), 4.58-4.55 (m; 4), 3.97-3.94 (m; 5), 3.38 (d; J = 8.1 Hz, 6), 2.91 (s ancho; OH), 2.73 (s ancho, OH), 1.63 (s; 3H, CH3).

163

Parte experimental
13

C RMN: (ppm) = 151.02 (Aromtico), 134.20 (7), 129.82 (8), 128.09 (2C Aromticos),

122.43 (Aromtico), 117.84 (2C Aromticos), 75.48 (1), 71.37 (6), 67.08 (5), 61.92 (4), 19.89 (CH3). (7R,8S)-4-(7,8-dihidroxi-1-metil-2-oxa-3-aza-biciclo[2.2.2]oct-5-en-3-il)-benzaldehdo. (33) 0.1 g (0.79 mmol) de (1R,2S)-3-metilciclohexa-3,5-dien-1,2-diol y 0.12 g (0.87 mmol) de 4-nitrosobenzaldehdo (10) se pusieron a reaccionar en un baln de 25 mL segn PGS 4. La reaccin se complet a las 15 horas. Rendimiento 80 %. Relacin aducto syn:aducto anti = 1.2:1 IR (film): (cm-1) = 3400, 2977, 2932, 2741, 1680, 1597, 1570, 1505, 1424, 1379, 1306, 1221, 1165, 1132, 1088, 1055, 999, 976, 924, 857, 841, 766, 706, 687, 614. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 261 (M+; 51 %), 202 (27 %), 201 (59 %), 200 (23 %), 172 (16 %), 158 (70 %), 150 (23 %), 137 (40 %), 136 (12 %), 135 (47 %), 132 (20 %), 130 (16 %), 126 (16 %), 125 (33 %), 121 (18 %), 120 (18 %), 108 (80 %), 107 (39 %), 105 (42 %), 97 (45 %), 95 (21 %), 81 (33 %), 80 (97 %), 79 (63 %), 77 (100 %), 65 (24 %), 55 (33 %), 43 (66 %). Aducto syn Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 9.84 (s; 1H, CHO), 7.74 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.07 (d; J = 8.7 Hz, 2H,

ArH), 6.30-6.24 (m; 5,6), 4.76-4.74 (m; 4), 4.51-4.48 (m; 8), 4.02-3.99 (m; 7), 2.92 (s ancho; OH), 2.72 (s ancho; OH), 1.67 (s; 3H, CH3).
13

C RMN: (ppm) = 191.04 (CHO), 156.49 (Aromtico), 134.22 (6), 131.02

(2C Aromticos), 130.21 (5), 129.40 (Aromtico), 116.40 (2C Aromticos), 76.44 (1), 71.20 (7), 66.80 (8), 60.13 (4), 19.84 (CH3). Aducto anti Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 9.86 (s; 1H, CHO), 7.75 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.13 (d; J = 8.7 Hz, 2H,

ArH), 6.31 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.6 Hz, 6), 6.12 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 5.8 Hz, 5), 4.66 (ddd; J1 = 5.8 Hz, J2 = 3.6 Hz, J3 = 1.6 Hz, 4), 3.95-3.92 (m; 8), 3.60 (d; J = 8.5 Hz, OH), 3.43 (dd; J1 = 7.8 Hz, J2 = 7.6 Hz, 7), 3.29 (d; J = 7.6 Hz, OH), 1.59 (s; 3H, CH3).
164

Parte experimental
13

C RMN: (ppm) = 190.87 (CHO), 156.56 (Aromtico), 136.31 (6), 131.25 (5) 130.85

(2C Aromticos), 128.34 (Aromtico), 116.94 (2C Aromticos), 78.70 (1), 65.96 (7), 62.18 (8), 61.93 (4), 18.61 (CH3). (5R,6S)-3-(4-clorofenil)-1-metil-2-oxa-3-aza-biciclo[2.2.2]oct-7-en-5,6-diol. (34) 0.1 g (0.79 mmol) de (1R,2S)-3-metilciclohexa-3,5-dien-1,2-diol y 0.12 g (0.87 mmol) de 4-cloronitrosobenceno (12) se pusieron a reaccionar en un baln de 25 mL segn PGS 4. La reaccin se complet a las 24 horas. Rendimiento 75 %. Relacin aducto syn:aducto anti = 1:1 IR (film): (cm-1) = 3380, 2930, 1592, 1487, 1404, 1379, 1240, 1169, 1092, 1055, 1007, 978, 920, 826, 714, 627. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 269 (M+ +2; 35 %), 267 (M+; 98 %), 209 (20 %), 208 (29 %), 207 (47 %), 206 (19 %), 178 (15 %), 166 (24 %), 164 (61 %), 156 (19 %), 145 (23 %), 144 (12 %), 143 (74 %), 141 (31 %), 138 (19 %), 129 (14 %), 128 (10 %), 127 (34 %), 113 (17 %), 111 (48 %), 109 /14 %), 108 (100 %), 107 (67 %), 97 (51 %), 95 (18 %), 82 (17 %), 81 (29 %), 80 (84 %), 79 (41 %), 77 (13 %), 75 (10 %), 69 (12 %), 55 (21 %), 43 (47 %). Aducto syn Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 7.17 (d; J = 8.6 Hz, 2H, ArH), 6.89 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.33

(dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.5 Hz, 7), 6.04 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 5.8 Hz, 8), 4.43-4.40 (m; 4), 3.90 (dd; J1 = 8.1 Hz, J2 = 3.6 Hz, 5), 3.37 (d; J = 8.1 Hz, 6), 1.55 (s; 3H, CH3).
13

C RMN: (ppm) = 149.62 (Aromtico), 136.51 (7), 128.62 (2C Aromticos), 127.89 (8),

125.82 (Aromtico), 118.70 (2C Aromticos), 75.63 (1), 65.95 (6), 62.85 (4), 62.17 (5), 19.85 (CH3). Aducto anti Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 7.19 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.94 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.28 (d ancho;

J = 8.2 Hz, 7), 6.15 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 5.5 Hz, 8), 4.52-4.49 (m; 4), 3.94 (d; J = 7.2 Hz, 1H), 3.37 (d; J = 8.1 Hz, 6), 1.62 (s; 3H, CH3).

165

Parte experimental
13

C RMN: (ppm) = 149.26 (Aromtico), 134.28 (7), 129.75 (8), 128.62 (2C Aromticos),

125.82 (Aromtico), 119.15 (2C Aromticos), 78.03 (1), 71.29 (5), 65.95 (6), 61.48 (4), 18.61 (CH3). (5R,6S)-1-metil- 3-p-toluil-2-oxa-3-aza-biciclo[2.2.2]oct-7-en-5,6-diol. (35) 0.1 g (0.79 mmol) de (1R,2S)-3-metilciclohexa-3,5-dien-1,2-diol y 0.11 g (0.87 mmol) de 4-nitrosotolueno (13) se pusieron a reaccionar en un baln de 25 mL segn PGS 4. La reaccin se complet a las 48 horas. Rendimiento 60 %. Relacin aducto syn/aducto anti = 1.6:1 IR (film): (cm-1) = 3400, 3027, 2976, 2930, 1721, 1611, 1582, 1507, 1445, 1377, 1235, 1198, 1169, 1130, 1088, 1055, 1015, 976, 918, 857, 837, 818, 760, 752, 704, 633. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 231 (17 %), 226 (22 %), 213 (5 %), 202 (6 %), 197 (6 %), 183 (13 %), 170 (23 %), 144 (5 %), 133 (8 %), 120 (12 %), 119 (10 %), 107 (34 %), 106 (21 %), 105 (18 %), 104 (18 %), 92 (10 %), 91 (100 %), 79 (32 %), 78 (27 %), 77 (42 %), 65 (51 %), 63 (14 %). Aducto syn Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 7.01 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.85 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.32

(dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.5 Hz, 7), 6.03 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 5.8 Hz, 8), 4.43-4.40 (m; 4), 3.94-3.90 (m; 2H, 5, OH), 3.36-3.34 (m; 2H, 6, OH), 2.27 (s; 3H, ArCH3), 1.54 (s; 3H, CH3).
13

C RMN: (ppm) = 148.56 (Aromtico), 136.58 (7), 129.26 (2C Aromticos), 129.11 (8),

124.67 (Aromtico), 117.50 (2C Aromticos), 75.32 (1), 66.17 (6), 62.78 (4), 62.15 (5), 20.61 (ArCH3), 18.63 (CH3). Aducto anti Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 7.03 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.91 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.28

(d; J = 8.1 Hz, 7), 6.14 (dd; J1 = 8.1 Hz, J2 = 5.6 Hz, 8), 4.51-4.48 (m; 4), 3.94-3.90 (m; 2H, 5, OH), 3.36-3.34 (m; 2H, 6, OH), 2.26 (s; 3H, ArCH3), 1.61 (s; 3H, CH3).
13

C RMN: (ppm) = 148.04 (Aromtico), 134.26 (7), 129.93 (8), 129.26 (2C Aromticos),

124.67 (Aromtico), 117.94 (2C Aromticos), 77.74 (1), 71.45 (5), 66.17 (6), 61.62 (4), 20.61 (ArCH3), 19.91 (CH3).
166

Parte experimental (2S,6R)-4,4,7-Trimetil-9-fenil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.02,6]undec-10-eno (36) 0.15 g (0.55 mmol) de la mezcla de 32 syn y anti se disolvieron en 5 mL de acetona, se agregaron 1.5 mL de DMP, y una punta de esptula de p-TsOH. La reaccin se llev a cabo segn PGS 5, y se complet a las 22 horas. Rendimiento 70 %. Teo.: C: 70.31 %; H: 7.01 %; N: 5.12 %; Exp.: C: 70.17 %; 6.96 H: %; 5.15 N: %. IR (KBr): (cm-1) = 2980, 2932, 1595, 1489, 1453, 1379, 1258, 1202, 1165, 1130, 1086, 1063, 1030, 999, 976, 924, 884, 855, 810, 762, 710, 696, 654. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 166 (3 %), 151 (7 %), 110 (8 %), 109 (100 %), 108 (76 %), 107 (50 %), 91 (30 %), 81 (14 %), 80 (76 %), 79 (80 %), 78 (11 %), 77 (81 %), 65 (15 %). Aducto syn Cristales amarillo plido. P.F.: 108-109 C.
1

H RMN: (ppm) = 7.22 (dd; J1 = 7.8 Hz, J2 = 7.3 Hz, 2H, ArH), 7.04 (d; J = 7.8 Hz, 2H,

ArH), 6.92 (t; J = 7.3 Hz, 1H, ArH), 6.25 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 1.3 Hz, 11), 6.05 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 5.8 Hz, 10), 4.66 (ddd; J1 = 5.8 Hz, J2 = 3.4 Hz, J3 = 1.4 Hz, 1), 4.40 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 3.4 Hz, 2), 3.97 (d; J = 8.4 Hz, 6), 1.69 (s; 3H, CH3 gem), 1.58 (s; 3H, CH3 gem), 1.40 (s; 3H, CH3).
13

C RMN: (ppm) = 152.31 (Aromtico), 135.03 (11), 129.52 (10), 128.74 (2C Aromticos),

122.09 (Aromtico), 117.41 (2C Aromticos), 114.84 (4), 76.73 (6), 76.30 (7), 73.78 (2), 60.47 (1), 27.08 (CH3 gem), 26.65 (CH3), 19.28 (CH3 gem). Aducto anti Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 7.25 (dd; J1 = 7.8 Hz, J2 = 7.3 Hz, 2H, ArH), 7.03 (d; J = 7.8 Hz, 2H,

ArH), 6.97 (t; J = 7.3 Hz, 1H, ArH), 6.22 (ddd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 1.3 Hz, J3 = 0.8 Hz, 11), 6.06 (ddd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 5.7 Hz, J3 = 0.7 Hz, 10), 4.78 (ddd; J1 = 7.2 Hz, J2 = 4.1 Hz, J3 = 0.7 Hz, 2), 4.70 (ddd; J1 = 5.7 Hz, J2 = 4.1 Hz, J3 = 1.3 Hz, 1), 4.28 (dd; J1 = 7.2 Hz, J2 = 0.8 Hz, 6), 1.66 (s; 3H, CH3), 1.37 (s; 3H, CH3 gem), 1.35 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 151.41 (Aromtico), 133.85 (11), 128.93 (2C Aromticos), 128.60 (10),

122.96 (Aromtico), 118.00 (2C Aromticos), 110.80 (4), 79.33 (6), 75.46 (7), 75.22 (2), 60.53 (1), 26.14 (CH3 gem), 25.84 (CH3 gem), 20.84 (CH3).

167

Parte experimental (2S,6R)-4-(4,4,7-trimetil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.0 2,6]undec-10-en-9-il)benzaldehdo. (37) 0.125 g (0.48 mmol) de la mezcla de 33 syn y anti se disolvieron en 5 mL de acetona, se agregaron 1.5 mL de DMP, y una punta de esptula de p-TsOH. La reaccin se llev a cabo segn PGS 5, y fue completa a las 16 horas. Rendimiento 75 %. Teo.: C: 67.76 %; H: 6.36 %; N: 4.65 %; Exp.: C: 67.48 %; H: 6.59 %; N: 4.67 %. IR (KBr): (cm-1) = 2992, 2977, 2832, 2745, 1698, 1595, 1499, 1458, 1420, 1385, 1374, 1267, 1237, 1213, 1183, 1167, 1084, 1059, 990, 924, 872, 857, 838, 735, 675, 633. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 301 (M+, 37 %), 201 (31 %), 200 (16 %), 158 (20 %), 151 (13 %), 146 (7 %), 135 (20 %), 132 (15 %), 121 (6 %), 120 (5 %), 109 (100 %), 108 (92 %), 107 (16 %), 100 (32 %), 95 (18 %), 91 (14 %), 85 (24 %), 82 (15 %), 81 (14 %), 80 (52 %), 79 (33 %), 77 (40 %), 65 (11 %), 51 (32 %), 43 (62 %). Aducto syn Aceite amarillo plido.
1

H RMN: (ppm) = 9.82 (s; CHO), 7.72 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.09 (d; J = 8.7 Hz,

2H, ArH), 6.24 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 1.4.Hz, 11), 6.17 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 5.6 Hz, 10), 4.81 (ddd; J1 = 5.6 Hz, J2 = 3.7 Hz, J3 = 1.4 Hz, 1), 4.39 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 3.7 Hz, 2), 3.98 (d; J = 8.4 Hz, 6), 1.58 (s; 6H, CH3 gem), 1.40 (s; 3H, CH3).
13

C RMN: (ppm) = 190.80 (CHO), 157.08 (Aromtico), 134.99 (11), 130.91 (2C

Aromticos), 129.90 (Aromtico), 129.52 (10), 115.65 (2C Aromticos), 114.66 (4), 76.83 (7), 76.13 (6), 72.57 (2), 58.66 (1), 26.54 (CH3 gem), 26.06 (CH3), 18.78 (CH3 gem). Aducto anti Cristales amarillo plido. P.F.: 155-156 C.
1

H RMN: (ppm) = 9.85 (s; CHO), 7.75 (d; J = 8.6 Hz, 2H, ArH), 7.09 (d; J = 8.6 Hz, 2H,

ArH), 6.19 (dd; J = 8.2 Hz, 11), 6.11 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 5.7 Hz, 10), 4.82-4.85 (m; 1), 4.72 (dd; J1 = 6.7 Hz, J2 = 4.1 Hz, 2), 4.27 (d; J = 6.7 Hz, 6), 1.66 (s; 3H, CH3), 1.33 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 190.83 (CHO), 156.43 (Aromtico), 133.51 (11), 130.95 (2C

Aromticos), 130.71 (Aromtico), 128.43 (10), 116.53 (2C Aromticos), 110.63 (4), 78.72 (6), 75.82 (7), 74.28 (2), 58.85 (1), 25.73 (CH3 gem), 25.47 (CH3 gem), 20.41 (CH3).

168

Parte experimental (2S,6R)-9-(4-clorofenil)-4,4,7-trimetil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.0 eno. (38) 0.125 g (0.47 mmol) de la mezcla de 34 syn y anti se disolvieron en 5 mL de acetona, se agregaron 1.5 mL de DMP, y una punta de esptula de p-TsOH. La reaccin se llev a cabo siguiendo PGS 5, y se complet a las 26 horas. Rendimiento 70 %. Teo.: C: 62.44 %; H: 5.89 %; N: 4.55 %; Exp.: C: 62.79 %; H: 5.96 %; N: 4.87 %. IR (KBr): (cm-1) = 3058, 2979, 2932, 1736, 1592, 1487, 1456, 1404, 1264, 1210, 1179, 1163, 1684, 1063, 1007, 972, 918, 876, 853, 828, 812, 729, 714. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 309 (M+ +2; 11 %), 307 (M+; 31 %), 207 (20 %), 206 (10 %), 164 (16 %), 151 (12 %), 141 (23 %), 138 (14 %), 113 (15 %), 111 (48 %), 110 (11 %), 109 (85 %), 108 (100 %), 107 (15 %), 100 (19 %), 95 (15 %), 85 (19 %), 80 (46 %), 79 (26 %), 77 (11 %), 75 (26 %), 43 (51 %). Aducto syn Aceite amarillo plido.
1

2,6]undec-10-

H RMN: (ppm) = 7.14 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.93 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.22

(d; J = 8.1 Hz, 11), 6.02 (dd; J1 = 8.1 Hz, J2 = 5.8 Hz, 10), 4.59-4.56 (m; 1), 4.36 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 3.6 Hz, 2), 3.93 (d; J = 8.4 Hz, 6), 1.69 (s; 3H, CH3 gem), 1.54 (s; 3H, CH3), 1.40 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 150.57 (Aromtico), 134.76 (11), 129.19 (10), 128.35 (2C Aromticos),

126.71 (Aromtico), 118.33 (2C Aromticos), 114.49 (4), 77.60 (7), 76.16 (6), 72.82 (2), 60.13 (1), 26.64 (CH3 gem), 26.16 (CH3 gem), 18.86 (CH3). Aducto anti Cristales amarillo plido. P.F.: 91-92 C.
1

H RMN: (ppm) = 7.17 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.92 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.19 (ddd;

J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.6 Hz, J3 = 0.8 Hz, 11) , 6.00 (ddd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 5.7 Hz, J3 = 0.7 Hz, 10), 4.72 (ddd; J1 = 7.2 Hz, J2 = 4.1 Hz, J3 = 0.7 Hz, 2), 4.61 (ddd; J1 = 5.7 Hz, J2 = 4.1 Hz, J3 = 1.6 Hz, 1), 4.24 (dd; J1 = 7.2 Hz, J2 = 0.8 Hz, 6), 1.61 (s; 3H, CH3), 1.32 (s; 3H, CH3 gem), 1.31 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 149.72 (Aromtico), 133.55 (11), 128.59 (2C Aromticos), 128.01 (10),

127.59 (Aromtico), 118.87 (2C Aromticos), 110.41 (4), 78.82 (6), 75.02 (7), 74.61 (2), 60.24 (1), 25.73 (CH3 gem), 25.45 (CH3 gem), 20.43 (CH3).
169

Parte experimental (2S,6R)-4,4,7-trimetil-9-p-toluil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.0 2,6]undec-10-eno. (39) 0.125 g (0.51 mmol) de la mezcla de 35 syn y anti se disolvieron en 5 mL de acetona, se agregaron 1.5 mL de DMP, y una punta de esptula de p-TsOH. La reaccin se hizo siguiendo PGS 5, y se complet a las 48 horas de reaccin. Rendimiento 55 %. Teo.: C: 71.06 %; H: 7.37 %; N: 4.87 %; Exp.: C: 71.31 %; H: 7.44 %; N: 4.79 %. IR (KBr): (cm-1) = 2980, 2932, 1736, 1611, 1578, 1507, 1456, 1375, 1242, 1198, 1163, 1130, 1084, 1001, 976, 943, 922, 884, 855, 820, 758, 708, 646. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 288 (M+ +1; 10 %), 287 (M+; 51 %), 229 (2 %), 187 (51 %), 186 (17 %), 144 (30 %), 122 (18 %), 121 (100 %), 118 (34 %), 109 (45 %), 108 (42 %), 107 (23 %), 100 (16 %), 95 (16 %), 91 (68 %), 85 (18 %), 80 (29 %), 79 (20 %), 77 (13 %), 65 (29 %), 43 (49 %). Aducto syn Aceite amarillo.
1

H RMN: (ppm) = 6.99 (d; J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.90 (d; J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.22 (dd;

J1 = 8.2 Hz, J2 = 1.4 Hz, 11), 6.02 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 5.8 Hz, 10), 4.59 (ddd; J1 = 5.8 Hz, J2 = 3.7 Hz, J3 = 1.4 Hz, 1), 4.36 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 3.7 Hz, 2), 3.93 (d; J = 8.4 Hz, 6), 2.24 (s; 3H, ArCH3), 1.66 (s; 3H, CH3 gem), 1.54 (s; 3H, CH3), 1.33 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 149.49 (Aromtico), 134.66 (11), 131.11 (Aromtico), 129.49 (10),

129.41 (2C Aromticos), 117.11 (2C Aromticos), 114.43 (4), 76.37 (6), 75.78 (7), 73.05 (2), 60.21 (1), 26.70 (CH3 gem), 26.27 (CH3 gem), 20.59 (ArCH3), 18.94 (CH3). Aducto anti Cristales amarillo plido. P.F.: 75-76 C.
1

H RMN: (ppm) = 7.02 (d; J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.89 (d; J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.19 (d;

J = 8.2 Hz, 11), 6.02 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 5.8 Hz, 10), 4.74 (dd; J1 = 6.9 Hz, J2 = 4.0 Hz, 2), 4.63-4.60 (m; 1), 4.24 (d; J = 6.9 Hz, 6), 2.26 (s; 3H, ArCH3), 1.61 (s; 3H, CH3), 1.33 (s; 3H, CH3 gem), 1.32 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 148.64 (Aromtico), 133.49 (11), 132.03 (Aromtico), 129.11 (2C

Aromticos), 128.22 (10), 117.69 (2C Aromticos), 110.23 (4), 78.79 (6), 74.77 (2), 74.65 (7), 60.28 (1), 25.75 (CH3 gem), 25.46 (CH3 gem), 20.63 (ArCH3), 20.49 (CH3).

170

Parte experimental (2S,6S)-7-Bromo-4,4-dimetil-9-fenil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.0 (40) 0.3 g (1.30 mmol) del dieno 9, y 0.16 g (1.43 mmol) de nitrosobenceno, se pusieron a reaccionar a temperatura ambiente en 25 mL de THF seco. La reaccin se complet a las 24 horas. Se destil el disolvente a presin reducida, y el residuo se purific por cromatografa en columna de Slica-gel con una mezcla Hexano:AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 90 %. Cristales blancos. PF: 89-90 (descompone) Teo.: C: 53.27 %; H: 4.77 %; N: 4.14 %; Exp.: C: 53.20 %; H: 5.12 %; N: 4.09 %. IR (KBr): (cm-1) = 3083, 3017, 2996, 2926, 1594, 1489, 1453, 1387, 1874, 1335, 1298, 1252, 1219, 1161, 1127, 1093, 1036, 974, 947, 897, 851, 812, 764, 747, 710, 696.
1

2,6]undec-10-eno

H RMN: (ppm) = 7.27 (dd; J1 = 8.2 Hz, J2 = 7.4 Hz, 2H, ArH), 7.03 (d; J = 8.02 Hz,

2H, ArH), 6.90 (t; J = 7.4 Hz, 1H, ArH), 6.57 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 1.5 Hz, 11), 6.02 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 5.5 Hz, 10), 4.85 (ddd; J1 = 5.5 Hz, J2 = 4.1 Hz, J3 = 1.5 Hz, 1), 4.76 (dd; J1 = 7.0 Hz, J2 = 4.1 Hz, 2), 4.75 (d; J = 7.0 Hz, 6), 1.42 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 150.40 (Aromtico), 134.29 (11), 130.24 (10), 129.75 (2C Aromticos),

123.83 (Aromtico), 118.07 (2C Aromticos), 110.95 (4), 88.31 (7), 82.21 (6), 75.86 (2), 60.42 (1), 26.07 (CH3 gem), 25.84 (CH3 gem). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 175 (44 %), 174 (32 %), 173 (44 %), 172 (28 %), 158 (5 %), 156 (5%), 146 (16 %), 144 (16 %), 119 (3%), 117 (3%), 94 (71 %), 93 (17 %), 65 (100 %), 64 (10 %), 63 (24 %). 4-(7-Bromo-4,4-dimetil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.02,6]undec-10-en-9ilo)benzaldehdo (41) 0.3 g (1.30 mmol) del dieno 9, y 0.19 g (1.43 mmol) de 4-nitrosobenzaldehdo (10) se pusieron a reaccionar a temperatura ambiente en 25 mL de THF seco. La reaccin se complet a las 20 horas. Se destil el disolvente a presin reducida, y el residuo se purific por cromatografa en columna de Slica-gel con una mezcla Hexano:AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 90 %. Cristales blancos. P.F.: 140 C (Descompone) Teo.: C: 52.48 %; H: 4.40 %; N: 3.82 %; Exp.: C: 52.82 %; H: 4.53 %; N: 3.63 %.
171

Parte experimental IR (KBr): (cm-1) = 3013, 1705, 1590, 1499, 1487, 1404, 1374, 1320, 1267, 1213, 1161, 1080, 1036, 1011, 972, 943, 899, 849, 833, 799, 706, 639, 550, 515.
1

H RMN: (ppm) = 9.91 (s; CHO), 7.80 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.15 (d; J = 8.7 Hz, 2H,

ArH), 6.57 (dd; J1 = 8.6 Hz, J2 = 1.5.Hz, 11), 6.07 (dd; J1 = 8.6 Hz, J2 = 5.6 Hz, 10), 4.91 (ddd; J1 = 5.6 Hz, J2 = 4.0 Hz, J3 = 1.5 Hz, 1), 4.84 (dd; J1 = 7.0 Hz, J2 = 4.0 Hz, 2), 4.76 (d; J = 7.0 Hz, 6), 1.40 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 190.78 (CHO), 155.40 (Aromtico), 133.92 (11), 131.69 (Aromtico),

130.99 (2C Aromticos), 129.97 (10), 117.03 (2C Aromticos), 111.59 (4), 87.71 (7), 81.69 (6), 75.11 (2), 59.07 (1), 25.67 (CH3 gem), 25.47 (CH3 gem). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 346 (7 %), 344 (7%), 328 (5 %), 302 (5 %), 267 (7 %), 265 (7 %), 250 (12 %), 248 (13 %), 237 (5 %), 221 (8 %), 219 (8 %), 198 (6 %), 187 (13 %), 186 (87 %), 185 (16 %), 175 (34 %), 174 (33 %), 173 (37 %), 172 (30 %), 169 (15 %), 168 (26 %), 158 (26 %), 157 (34 %), 146 (10 %), 144 (15 %), 141 (24 %), 140 (12 %), 139 (14 %), 130 (16 %), 129 (63 %), 128 (87 %), 127 (34 %), 117 (8 %), 116 (15 %), 115 (55 %), 103 (10 %), 102 (16 %), 101 (18 %), 100 (59 %), 94 (85 %), 91 (30 %), 85 (56 %), 78 (15 %), 77 (57 %), 65 (100 %). (2S,6S)-7-Bromo-9-(4-clorofenil)-4,4-dimetil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.0 2,6]undec10-eno (42) 0.07 g (0.37 mmol) de (1S,2S)-3-bromociclohexa-3,5-dien-1,2-diol y 0.057 g (0.40 mmol) de 4-cloronitrosobenceno (12) se disolvieron en 5 mL THF seco. La reaccin se complet en 24 horas, se evapor el disolvente a presin reducida, se tom el residuo en 5 mL acetona y 1.5 mL de DMP, y se agreg punta de esptula de p-TsOH, segn PGS 5. La reaccin se complet a los 30 minutos. Rendimiento global 68 %. Relacin aducto syn/aducto anti = 1:1 IR (KBr): (cm-1) = 3089, 2938, 2800, 1696, 1597, 1499, 1456, 1378, 1343, 1267, 1213, 1171, 1119, 1082, 1040, 972, 948, 903, 857, 831, 806, 746, 716, 633, 561, 513. MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 373 (M+; 8 %), 371 (25 %), 315 (7 %), 313 (7 %), 286 (20 %), 284 (20 %), 271 (10 %), 269 (10 %), 244 (18 %), 242 (13 %), 218 (8 %), 216 (8 %), 207 (10 %), 205 (9 %), 179 (8 %), 177 (8 %), 164 (28 %), 151 (6 %), 128 (9 %), 125 (13 %), 109 (23 %), 85 (22 %), 81 (100 %), 77 (18 %), 63 (23 %).
172

Parte experimental Aducto syn Aceite amarillo plido

1

H RMN: (ppm) = 7.22 (d; J = 8.6 Hz, 2H, ArH), 6.97 (d; J = 8.6 Hz, 2H, ArH), 6.65 (d;

J = 8.4 Hz, 11), 6.06 (dd; J1 = 8.4 Hz, J2 = 5.7 Hz, 10), 4.68 4.66 (m; 1), 4.50 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 3.6 Hz, 2), 4.38 (d; J = 8.3 Hz, 6), 1.73 (s; 3H, CH3 gem), 1.48 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 149.44 (Aromtico), 135.46 (11), 130.56 (10), 128.64 (2C Aromticos),

128.00 (Aromtico), 118.57 (2C Aromticos), 115.57 (4), 87.76 (7), 78.70 (6), 73.69 (2), 60.25 (1), 26.52 (CH3 gem), 26.28 (CH3 gem). Aducto anti Cristales blancos. P. F.: 80 C (Descompone)
1

H RMN: (ppm) = 7.26 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.97 (d; J = 8.9 Hz, 2H, ArH), 6.58 (dd;

J1 = 8.6 Hz, J2 = 1.5 Hz, 11), 6.01 (ddd; J1 = 8.6 Hz, J2 = 5.6 Hz, J3 = 1.0 Hz, 10), 4.84 (ddd; J1 = 7.1 Hz, J2 = 4.1 Hz, J3 = 1.0 Hz, 2), 4.72 (dd; J1 = 7.1 Hz, J2 = 1.0 Hz, 6), 4.70 (ddd; J1 = 5.6 Hz, J2 = 4.1 Hz, J3 = 1.5 Hz, 1), 1.41 (s; 3H, CH3 gem), 1.40 (s; 3H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 148.67 (Aromtico), 134.04 (11), 129.70 (10), 128.79 (2C Aromticos),

128.69 (Aromtico), 119.04 (2C Aromtico), 111.39 (4), 87.76 (7), 81.72 (6), 75.36 (2), 60.14 (1), 25.68 (CH3 gem), 25.45 (CH3 gem). (2S,6S)-7-Bromo-4,4-dimetil-9-p-toluil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.0 eno (43) 0.3 g (1.30 mmol) del dieno 9, y 0.18 g (1.43 mmol) de 4-nitrosotolueno (13), se pusieron a reaccionar a temperatura ambiente en 25 mL de THF seco. La reaccin se complet a las 30 horas. Se destil el disolvente a presin reducida, y el residuo se purific por cromatografa en columna de Slica-gel con una mezcla Hexano:AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 70 %. Aceite amarillo plido. IR (film): (cm-1) = 3033, 2988, 2934, 2926,1689, 1610, 1514, 1452, 1398, 1388, 1375, 1312, 1271, 1242, 1229, 1159, 1075, 1047, 1036, 999, 967, 911, 858, 814, 733, 672.
1

2,6]undec-10-

H RMN: (ppm) = 7.05 (d; J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.90 (d; J = 8.3 Hz, 2H, ArH), 6.73 (dd;

J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.5 Hz, 11), 6.21 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 5.7 Hz, 10), 4.56 (ddd; J1 = 5.7 Hz,
173

Parte experimental J2 = 4.0 Hz, J3 = 1.5 Hz, 1), 4.46 (dd; J1 = 7.0 Hz, J2 = 4.0 Hz, 2), 4.24 (d; J = 7.0 Hz, 6), 2.26 (s; 3H, ArCH3), 1.41 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 153.20 (Aromtico), 138.02 (11), 133.70 (Aromtico), 129.74 (2C

Aromticos), 129.45 (10), 117.03 (2C Aromticos), 112.38 (4), 87.74 (7), 81.70 (6), 75.22 (2), 60.15 (1), 27.43 (CH3 gem), 25.89 (CH3 gem), 20.04 (ArCH3). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 353 (M+(Br 81); 12 %), 351 (M+(Br 79); 11 %), 295 (31 %), 295 (31 %), 278 (5 %), 276 (5 %), 266 (38 %), 264 (38 %), 253 (13 %), 251 (14 %), 224 (36 %), 222 (28 %), 199 (53 %), 187 (19 %), 186 (26 %), 185 (24 %), 184 (23 %), 172 (33 %), 157 (14 %), 144 (100 %), 143 (29 %), 142 (17 %), 130 (15 %), 128 (11 %), 115 (23 %), 106 (15 %), 105 (19 %), 104 (25 %), 91 (21 %), 90 (25 %), 89 (31 %), 85 (22 %), 81 (86 %), 78 (33 %), 77 (37 %), 63 (24 %). (2S,6S)-7-Cloro-4,4-dimetil-9-fenil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.0 (44) 0.2 g (1.07 mmol) del dieno 8, y 0.126 g (1.18 mmol) de nitrosobenceno, se pusieron a reaccionar a temperatura ambiente en 25 mL de THF seco. La reaccin se complet a las 24 horas. Se destil el disolvente a presin reducida, y el residuo se purific por cromatografa en columna de Slica-gel con una mezcla Hexano:AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 80 %. Aceite amarillo plido. IR (film): (cm-1) = 2990, 2940, 1692, 1595, 1489, 1375, 1266, 1211, 1161, 1117, 1084, 1051, 974, 949, 858, 766, 696, 511.
1

2,6]undec-10-eno

H RMN: (ppm) = 7.28 (dd; J1 = 8.7 Hz, J2 = 7.3 Hz, 2H, ArH), 7.05-7.02 (m; 3H, ArH),

6.45 (dd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 1.5 Hz, 11), 6.10 (ddd; J1 = 8.3 Hz, J2 = 5.6 Hz, J3 = 1.0 Hz, 10), 4.89 (ddd; J1 = 7.1 Hz, J2 = 4.0 Hz, J3 = 1.0 Hz, 2), 4.75 (ddd; J1 = 5.6 Hz, J2 = 4.0 Hz, J3 = 1.5 Hz, 1), 4.62 (dd; J1 = 7.1 Hz, J2 = 1.1 Hz, 6), 1.40 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 150.02 (Aromtico), 132.71 (11), 129.96 (10), 128.75 (2C Aromticos),

123.42 (Aromtico), 117.65 (2C Aromticos), 111.45 (4), 94.65 (7), 80.92 (6), 75.47 (2), 60.40 (1), 25.47 (CH3 gem), 25.31 (CH3 gem). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 295 (20 %), 293 (44 %), 255 (16 %), 237 (11 %), 236 (29 %), 235 (55 %), 218 (19 %), 208 (39 %), 206 (100 %), 200 (24 %), 195 (18 %), 193 (55 %),
174

Parte experimental 190 (14 %), 172 (10 %), 167 (13 %), 166 (95 %), 164 (100 %), 158 (40 %), 143 (17 %), 140 (15 %), 138 (29 %), 130 (68 %), 128 (11 %), 127 (45 %), 115 (14 %), 111 (23 %), 109 (21 %), 99 (19 %), 85 (17 %), 81 (89 %), 77 (17 %), 75 (20 %). (2S,6S)-4-(7-Cloro-4,4-dimetil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.02,6]undec-10-en-9-ilo)benzaldehdo (45) 0.2 g (1.07 mmol) del dieno 8, y 0.16 g (1.18 mmol) de 4-nitrosobenzaldehdo (10), se pusieron a reaccionar a temperatura ambiente en 25 mL de THF seco. La reaccin se complet a las 22 horas. Se destil el disolvente a presin reducida, y el residuo se purific por cromatografa en columna de Slica-gel con una mezcla Hexano:AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 75 %. Cristales blancos. P.F.: 174-175 C Teo.: C: 59.73 %; H: 5.01 %; N: 4.35 %; Exp.: C: 59.88 %; H:5.21 %; N: 4.40 %. IR (KBr): (cm-1) = 3093, 2992, 2977, 2937, 2832, 2803, 2745, 1697, 1597, 1578, 1501, 1458, 1426, 1383, 1375, 1343, 1311, 1306, 1267, 1213, 1163, 1119, 1086, 1051, 1005, 974, 949, 911, 862, 833, 808, 750,739, 718, 691, 677, 658, 633, 615.
1

H RMN: (ppm) = 9.91 (s; CHO), 7.80 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 7.15 (d; J = 8.7 Hz,

2H, ArH), 6.43 (ddd; J1 = 8.6 Hz, J2 = 1.5 Hz, J3 = 1.2 Hz, 11), 6.16 (ddd; J1 = 8.6 Hz, J2 = 5.6 Hz, J3 = 1.2 Hz, 10), 4.91 (ddd; J1 = 5.6 Hz, J2 = 4.0 Hz, J3 = 1.5 Hz, 1), 4.87 (ddd; J1 = 7.0 Hz, J2 = 4.0 Hz, J3 = 1.2 Hz, 2), 4.63 (dd; J1 = 7.0 Hz, J2 = 1.2 Hz, 6), 1.40 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 190.77 (CHO), 155.39 (Aromtico), 132.71 (11), 131.67 (Aromtico),

130.97 (2C Aromticos), 130.08 (10), 116.97 (2C Aromticos), 111.78 (4), 94.80 (7), 80.77 (6), 75.10 (2), 59.42 (1), 25.66 (CH3 gem), 25.48 (CH3 gem). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 188 (1 %), 186 (4 %), 173 (5 %), 171 (13 %), 135 (49 %), 131 (32 %), 130 (20 %), 129 (100 %), 128 (40 %), 114 (5 %), 112 (14 %), 105 (15 %), 102 (25 %), 100 (71 %), 94 (13 %), 93 (20 %), 77 (97 %), 65 (88 %), 63 (34 %).

175

Parte experimental (2S,6S)-7-Cloro-9-(4-clorofenil)-4,4-dimetil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.02,6]undec10-eno (46) 0.3 g (1.61 mmol) del dieno 8, y 0.25 g (1.77 mmol) de 4-cloronitrosobenceno (12), se pusieron a reaccionar a temperatura ambiente en 25 mL de THF seco. La reaccin se complet a las 24 horas. Se destil el disolvente a presin reducida, y el residuo se purific por cromatografa en columna de Slica-gel con una mezcla Hexano:AcOEt 8:2 como fase mvil. Rendimiento 75 %. Cristales amarillo plido. P.F.: 99-100 C Teo.: C: 54.90 %; H: 4.61 %; N: 4.27 %; Exp.: C: 54.52 %; H: 5.02 %; N: 4.22 %. IR (KBr): (cm-1) = 2992, 2936, 1589, 1487, 1404, 1375, 1339, 1265, 1211, 1161, 1117, 1086, 1051, 1009, 974, 951, 907, 858, 829, 810, 712, 559.
1

H RMN: (ppm) = 7.23 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.97 (d; J = 8.7 Hz, 2H, ArH), 6.43 (d;

J = 8.6 Hz, 11), 6.08 (dd; J1 = 8.6 Hz, J2 = 5.6 Hz, 10), 4.86 (dd; J1 = 7.0 Hz, J2 = 4.0 Hz, 2), 4.69 (ddd; J1 = 5.6 Hz, J2 = 4.0 Hz, 1), 4.59 (dd; J = 7.0 Hz, 6), 1.39 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 148.66 (Aromtico), 132.79 (11), 129.79 (10), 128.62 (2C Aromticos),

128.54 (Aromtico), 118.87 (2C Aromticos), 111.55 (4), 94.63 (7), 80.76 (6), 75.66 (2), 60.19 (1), 25.45 (CH3 gem), 25.30 (CH3 gem). MS (IE; 70 eV, 25 C): m/z = 237 (33 %), 236 (5%), 235 (100 %), 200 (61 %), 199 (39 %), 172 (26 %), 154 (7 %), 144 (6 %), 124 (8 %), 100 (13 %), 96 (21 %), 95 (17 %), 77 (11 %), 75 (15 %), 69 (12 %), 68 (10 %), 63 (10 %). (2S,6S)-7-Cloro-4,4-dimetil-9-p-toluil-3,5,8-trioxa-9-aza-triciclo[5.2.2.02,6]undec-10-eno (47) 0.3 g (1.61 mmol) del dieno 8, y 0.22 g (1.77 mmol) de 4-nitrosotolueno (13), se pusieron a reaccionar a temperatura ambiente en 25 mL de hexano. La reaccin se complet a las 72 horas. El slido formado se filtr con hexano fro, y se recristaliz de dos disolventes, hexano-AcOEt. Rendimiento 70 %. Cristales blancos. P.F.: 95 - 96 C IR (KBr): (cm-1) = 2915, 1574, 1558, 1377, 1337, 1260, 1200, 1165, 1086, 1036, 988, 930, 880, 790, 774, 677.
176

Parte experimental
1

H RMN: (ppm) = 7.08 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.89 (d; J = 8.4 Hz, 2H, ArH), 6.40 (dd;

J1 = 8.5 Hz, J2 = 1.5 Hz, 11), 6.08 (dd; J1 = 8.5 Hz, J2 = 5.6 Hz, 10), 4.51 (dd; J1 = 7.0 Hz, J2 = 4.0 Hz, 2), 4.30 (ddd; J1 = 5.6 Hz, J2 = 4.0 Hz, J3 = 1.5 Hz, 1), 4.24 (d ancho; J = 7.0 Hz, 6), 2.30 (s; 3H, ArCH3), 1.42 (s; 6H, CH3 gem).
13

C RMN: (ppm) = 150.20 (Aromtico), 132.36 (11), 133.20 (Aromtico), 130.01 (2C

Aromticos), 129.19 (10), 117.15 (2C Aromticos), 111.30 (4), 95.02 (7), 81.10 (6), 75.60 (2), 60.30 (1), 25.48 (CH3 gem), 25.21 (CH3 gem), 20.10 (ArCH3).

177

7.- Referencias bibliogrficas

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