ANLISIS ECOMTRICO

Caicedo Marcela; Hernndez Deissy; Torres Erika Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Bsicas, Departamento de Microbiologa Aseguramiento de la Calidad Pamplona/ Dic. 06 del 2013

Resumen: La composicin qumica de un medio de cultivo debe proveer los requerimientos nutricionales bsicos para el crecimiento de los microorganismos, sin embargo un medio de cultivo debe cumplir con dos caractersticas importantes; reproductividad y selectividad. Para evaluar la efectividad de seis medios de cultivo (EMB, Salado Manitol Normal y Vencido, Medio mnimo, Medio nutritivo y Casoy) por medio de estos dos parmetros, se aplic un anlisis ecomtrico. Mediante el crecimiento correspondiente a Sthaphylococcus aureus en cada uno de los medios evaluados se determin la reproductividad y selectividad de estos, estableciendo que todos los medios fueron altamente reproductivos y que solo el medio Salado Manitol fue altamente selectivo, tanto el medio normal como el vencido, pues es ideal para el desarrollo de S.aureus. Ya que el empleo de medios de cultivo en el laboratorio es recurrente, es evidente que su calidad incidir directamente en los resultados de un determinado anlisis, por ello la evaluacin y control de estos es de gran relevancia. Palabras claves: Anlisis, Crecimiento, Selectividad, Medio de Cultivo, Productividad. INTRODUCCIN. En cada bacteria que se desee cultivar para cualquier propsito es necesario proveer el ambiente bioqumico y biofsico apropiado. El ambiente bioqumico (nutricional) se hace disponible como medio de cultivo. Los medios de cultivo son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y tambin son utilizados para la identificacin de bacterias de acuerdo a sus propiedades bioqumicas y fisiolgicas. En los laboratorios de microbiologa se manejan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida y son utilizados frecuentemente para el anlisis microbiolgico. 1 Ya que la calidad de los insumos empleados en un anlisis de laboratorio puede influir en los resultados acertados que se obtengan a partir de este. Se debe llevar a cabo la verificacin constante del estado de utilidad de los materiales en cuanto a su confiabilidad para que estos no repercutan en los procedimientos que se lleven a cabo. Por medio de un anlisis ecomtrico se puede evaluar la calidad de los medios de cultivo a ser usados en un anlisis microbiolgico.2

El anlisis ecomtrico establece la eficiencia con la cual un medio de cultivo sirve para recuperar una cepa o mejor an inducir a su crecimiento y desarrollo, mediante la comparacin que se realiza entre un microorganismo que crece fcilmente en el medio (prueba o referente) y un microorganismo que no crece en el medio (interferente). As mismo este mtodo permite establecer qu porcentaje de recuperacin se puede obtener de un microorganismo en un medio de cultivo. Como parte del control de calidad sirve para determinar la productividad y selectividad de los medios de cultivo. La productividad hace referencia a la formulacin bsica del medio, de tal forma que favorezca el crecimiento de los microorganismos con las caractersticas macroscpicas y microscpicas esperadas. La selectividad hace referencia a la formulacin del medio respecto a su capacidad de eliminar o excluir microorganismos acompaantes e indeseables que puedan de un modo u otro interferir en el crecimiento de los microorganismos objeto de anlisis. La metodologa del anlisis ecomtrico, permite cuantificar tanto la productividad como la selectividad del medio teniendo en cuenta el crecimiento en caja. 4 El crecimiento microbiano es el incremento de clulas individuales, est normalmente limitado por el agotamiento de nutrientes o por la acumulacin de productos del mismo metabolismo microbiano, que les son

txicos a la poblacin. La consecuencia es que el crecimiento al cabo de un cierto tiempo llega a disminuir hasta detenerse. 3 Luego del proceso de incubacin en un anlisis ecomtrico, se debe observar el crecimiento en cada una de las lneas sembradas. Se considera valida cualquier estra que crezca ms del 25% de la lnea. Cada estra tiene un valor de 0,2 y la estra central un valor de 1 es decir, que el crecimiento mximo que se puede presentar es de 5, por lo que se debe multiplicar el nmero de estras que presenten crecimiento por 0,2 y sumar 1 en caso de que se haya presentado crecimiento en la estra central, obtenindose as, el ndice de crecimiento absoluto (ICA). El ICA va a determinar el grado de selectividad y productividad del medio segn el caso. El ICA resultado del medio prueba va a determinar la productividad del medio: medios altamente productivos (ICA = 4.5 5), medios medianamente productivos (ICA = 2.5 4.5), medios poco productivos (ICA 2.5), medios no productivos (ICA = 0). El ICA resultado del interferente evala la selectividad por lo que a mayor selectividad menor el ICA: medios altamente selectivos (ICA = 0), medios medianamente selectivos (ICA = 0 -2.5), medios no selectivos (ICA 2.5). 4 Staphylococcus aureus, son cocos Gram positivos, no esporulados, inmviles que producen numerosas enzimas: proteasas, lipasa, coagulasa, etc. Producen tambin un pigmento, un carotenoide que confiere a las

colonias una coloracin amarilla o naranja, de intensidad muy variable segn el tipo de cepa. Se multiplica ms fcilmente en aerobiosis que en anaerobiosis, es mesofilo, la presencia de flora competitiva constante inhibe su crecimiento. La presencia y persistencia de S.aureus en mltiples ambientes es posible gracias a su versatilidad metablica que lo capacitan para permanecer y/o reproducirse en circunstancias muy disimiles. Crece en un rango amplio de temperatura, pH, facultativo, con resistencia relativa a antispticos y desinfectantes. 3 METODOLOGA Para llevar a cabo el anlisis ecomtrico se utilizaron los siguientes medios: medio mnimo, agar nutritivo, agar salado manitol normal y vencido, agar EMB y agar Casoy. A partir de una cepa de S. aureus se tom un inoculo el cual se sembr en cada uno de los medios anteriormente mencionados. Ya que la siembra se realiza por estras paralelas se fracciono la base de las cajas en 4 secciones, las cuales se enumeraron secuencialmente. En cada una de estas fracciones se sembraron 5 estras lineales paralelas y por ultimo una lnea central (en la interseccin de las 4 secciones). La siembra se realiz en cada seccin sin esterilizar el asa, hacia una misma direccin y siguiendo la secuencia establecida (de 1 a 4). Solo se esterilizo el asa antes de tomar el inoculo de la cepa para sembrar en cada medio de cultivo. Las cajas se invirtieron e incubaron a 37C

(temperatura de crecimiento de S. aureus) por 48 horas. RESULTADOS Y DISCUSIN Tabla 1. Evaluacin de Productividad y Selectividad de medios de cultivo estudiados para S. aureus. Medio de Cultivo EMB CASOY Agar Nutritivo Medio Mnimo Salado Manitol Normal Salado Manitol Vencido Cepa S .aureus C 4 4 4 4 4 L 21 21 21 21 21 ICAR 100% 100% 100% 100% 100% 0% ICAS 100%

21

100%

0%

C: cuadrante, L: lneas.

ICAR = (20 x 0,2) + 1 = 5 = 100% Todos los medios de cultivo en estudio presentaron crecimiento, las cinco estras paralelas que se realizaron se observaban completamente al igual que la lnea central; En medio EMB el crecimiento fue de color negro. El crecimiento en medio mnimo fue translucido, mientras que en medio nutritivo y Casoy el crecimiento fue de carcter cremoso. El medio Salado manitol tanto normal como vencido present viraje de su indicador de pH. Para el medio Salado manitol vencido el viraje fue de rojo a amarillo claro y para el medio normal fue de rojo a un amarillo intenso.

El medio agar nutritivo analizado es un medio altamente reproductivo y selectivo, pues su ICA fue del 100%, esto se debe a que es un medio simple que posee los requisitos nutricionales mnimos para permitir el desarrollo bacteriano en general. En el caso de S. aureus, esta se considera una bacteria no fastidiosa, es decir que crece relativamente bien en medios de cultivo sencillos como lo es el agar nutritivo, ya que es metablicamente muy activa no requiere de medios con nutrientes especficos. 5 El medio CASOY (soya tripticaseina), se considera tambin un medio simple, pues no contiene sustancias inhibitorias e indicadores por lo que permite el desarrollo de microorganismos tanto aerobios como anaerobios. Su diferencia con el medio nutritivo radica en las peptonas que cada uno contiene, las peptonas son protenas hidrolizadas que pueden derivar de protenas vegetales y animales proporcionado una fuente efectiva de nitrgeno y carbono. El medio Casoy contiene peptonas de origen vegetal (peptona de soya) mientras que el medio nutritivo contiene peptonas de origen animal (extracto de carne y pluripectona).6 Ya que su ICAR fue del 100% se clasifica como un medio altamente reproductivo. EL medio mnimo presento un ICAR del 100%, este es un medio de cultivo que contiene una cantidad mnima de nutrientes (solo una fuente de carbono y nitrgeno) capaz de permitir el desarrollo de microrganismos como S.aureus que no es

tan altamente exigente, desde el punto de vista nutricional. Aun as, como el medio mnimo evaluado solo contena 1% de glucosa, 1% de peptona y 0,1% de NaCl, se present crecimiento pero este no fue tan pronunciado como en medio nutritivo o Casoy.7 Estos medios tambin contienen sales (NaCl) en concentraciones bajas, lo que favorece an ms el desarrollo de S.aureus en ellos, pues aunque esta bacteria crece en elevadas concentraciones de sal (hasta 15%), su crecimiento ptimo se da en presencia de 0% de este componente. 2 Ya que estos tres medios no contienen indicadores ni inhibidores no puede determinarse su selectividad pues son considerados medios bsicos. El medio EMB (Eosina- Azul de Metileno) es un medio selectivo y diferencial para bacterias gram-negativas no exigentes. Los colorantes contenidos en el medio inhiben el crecimiento de las bacterias grampositivas, excepto de enterococos. El ICAR de este medio fue del 100%, pero debido a que S.aureus en una bacteria gram-positiva, su crecimiento debi haber sido inhibido, o muy pobre por los colorantes Eusina y azul de metileno contenidos en el medio, ya que es sensible a estos, pues afectan su metabolismo enzimatico.5 Aunque pocas y raras veces puede crecer originando crecimiento incoloro, al no fermentar la lactosa contenida en el medio. La coloracin del crecimiento en el medio fue de color negro, lo que indica que este medio adems de ser un medio no selectivo, se encuentra vencido o est mal preparado, pudiendo

incidir otros errores como materiales contaminados utilizados en su preparacin, el sobrecalentamiento, que pudo alterar la estructura de los colorantes que actan como inhibidores, o a fallas en el control de esterilidad.2 Para el Salado Manitol, tanto vencido como el normal, el ICAR fue del 100% y el ICAS fue del 0% es decir que los medios fueron altamente selectivos para S.aureus y altamente reproductivos. Lo anterior es debido a que el agar salado manitol es un medio selectivo con una concentracin alta de sal (10%) que selecciona las bacterias que la toleran, como es el caso de S.aureus. Adems contiene manitol como carbohidrato fermentable y rojo fenol como indicador de pH. En este medio S.aureus, que como se haba dicho previamente puede crecer en presencia de concentraciones altas de sal y fermentar el manitol, produce colonias rodeadas por un halo amarillo que indica la produccin de cido a partir del manitol detectada por medio del viraje del indicador de pH de rosado a amarillo. 8 En cuanto al crecimiento que se present en el medio vencido, lo nico que se diferenci de este con respecto al medio normal, fue que el viraje del color del medio vencido fue menos intenso que el viraje del medio salado manitol normal, debido que los medios vencidos tienden a perder la intensidad en su color a medida que pasa el tiempo. La caducidad indica hasta que perodo puede ser usado en ptimas condiciones el medio, a partir de la fecha

estipulada los medios no sern de ptima calidad, en este caso la calidad del medio solo se vio afectada en su coloracin ya que sigue siendo altamente selectivo, esto puede ser debido a que el medio se ha mantenido en adecuadas condiciones de almacenamiento.9 CONCLUSIONES En los laboratorios de microbiologa es de gran importancia el control que se aplica a los medios de cultivos, tanto bsicos como selectivos y diferenciales, ya que de estos depende una mejor precisin de los resultados que se obtengan en un anlisis microbiolgico. En los medios selectivosdiferenciales, como es el caso del Salado manitol y el EMB, es indispensable que en la preparacin de estos medios se empleen adecuadamente los componentes inhibidores para que el medio sea adecuado solo para los microorganismos que se necesiten ser aislados y no se obtengan contaminaciones en el medio, que afecten la eficiencia de un determinado anlisis. La selectividad y la reproductividad son los parmetros ms relevantes al evaluar la susceptibilidad entre el crecimiento y aislamiento de determinados microorganismos y la

resistencia de la flora bacteriana competitiva en un medio de cultivo. Por medio de la determinacin de la selectividad y reproductividad de un medio de cultivo al aplicar un anlisis ecomtrico se puede establecer la eficiencia y eficacia de un medio de cultivo, as este se considere vencido, favoreciendo la reserva de estos insumos en los laboratorios. BIBLIOGRAFA 1. Tortora, G. Funke, B. Case, C. Introduccin a la Microbiologa. 9a ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenas Aires- Argentina, 2007. p. 168-176. 2. Durango, L. Gonzlez, Y. Guerra, K. Herazo, I. Mizger, M. Tcnica de Ecometra. Laboratorio de Microbiologa de Alimentos. Universidad de Crdoba. Berastegui, 2004. 3. Benintende, Silvia y Snchez, Cecilia. Crecimiento Bacteriano. Catedra Microbiologa Agrcola. Universidad Nacional de Entre Ros. Argentina, 2006. p. 1. 4. Jenny Paola Soler Len. Validacin Secundaria del Mtodo de Numero Ms Probable y Recuento en Placa Profunda para Coliformes Totales y Fecales en Muestras de Alimentos basada en la Norma ISO NTC 17025.

Pontificia Universidad Javeriana. Bogot, D.C. Junio, 2006. p. 50-52. 5. Prats, Guillem. Microbiologa Clnica. 1a ed. Editorial Mdica Panamericana. Argentina, 2007. p. 30 6. DiBICO. Agar de Soya y Trioticaseina (Agar CASOY). Medio de Cultivo. Bacteriologa General. Catalogo 1303. Dibico. S.A. de C.V. Mxico, D.F. Disponible en: www.dibico.com 7. Vanessa Garca Daz. Medios de Cultivo. Laboratorio de Microbiologa I. Universidad Nacional Federico Villareal. Per, 2009. 8. Forbes, B. Sahm, D. Weissfeld, A. Diagnostico Microbiolgico. 12a ed. Editorial Mdica Panamericana. Argentina, 2009. p. 557. 9. Laboratorios Conda. Indicaciones Generales de Uso. [pgina de Internet]. Revisin abril de 2010. (Consulta 30 Nov 2013). Disponible en: http://www.condalab.com.