Procesamiento de Espectros RMN con MestRe-C 3.4.

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Gua bsica para principiantes

Elaborada por: Julio Roberto Pinzn Joya Laboratorio de Resonancia Magntica Nuclear Universidad Nacional de Colombia 2004

Introduccin
El procesamiento Off-line de los datos de los experimentos RMN es la tendencia actual en el mundo porque ofrece varias ventajas. Primero el computador que controla el equipo puede dedicarse a su labor principal el registro de espectros, lo que contribuye a un mayor nmero de muestras procesadas por unidad de tiempo evitando prdidas de tiempo en procesamiento de datos o por bloqueo del sistema; adicionalmente el Qumico o la persona que analiza los espectros cuenta con una serie de herramientas que le proporciona el Software que facilita considerablemente su tarea disponiendo del tiempo que requiera, ampliaciones, etc. Vale la pena aclarar que para procesar los espectros con cualquier Software debemos tener algunos conocimientos bsicos de la tcnica de Resonancia Magntica Nuclear. Esta gua solo pretende poner al alcance de los usuarios los procedimientos elementales para el procesamiento de las FIDs utilizando el programa MestRe-C versin 3.4.0, un software gratuito desarrollado por la Universidad Santiago de Compostela para el tratamiento de los datos obtenidos por los equipos de RMN. Para obtener informacin detallada de las capacidades del programa, recomendamos leer la gua que acompaa el Software al igual que los archivos de ayuda.

Procesamiento de Espectros Unidimensionales utilizando MestRe-C

Diagrama de flujo recomendado para el procesamiento de espectros unidimensionales
Importar Datos de la FID

Zero Filling

Linear Prediction Filling

Apodization

Transformada de Fourier

Correccin de Fase

Correccin de linea base

Calibracin

Peak Picking

Integracin

El primer paso es abrir el archivo que contiene los archivos con los datos adquiridos por el equipo. Para hacerlo, buscamos File/Import (Ctrl + I) o presionamos el botn de la esquina superior izquierda. A continuacin aparecer el dilogo de bsqueda tpico de las aplicaciones bajo Windows, en l buscaremos el archivo que contiene la FID. Si sus datos estn en un CD la ruta sera D:\Nombre\nmero\fid. En donde D:\ es el nombre de la unidad que contiene los datos, en su caso puede ser otra letra; Nombre es el nombre de la carpeta que contiene los datos de todos los experimentos y puede ser el mismo nombre del usuario o el nombre de la muestra. nmero es el nombre de la carpeta que contiene el experimento (existirn tantas carpetas numeradas como experimentos hayan sido realizados a la muestra). Por ejemplo la carpeta nmero 1 puede contener los datos del espectro RMN1H, la carpeta 2 los datos del espectro RMN13C y as sucesivamente. Las carpetas que contienen datos de experimentos unidimensionales se diferencian porque en su interior se encuentra un archivo denominado fid; para determinar el tipo de

Lo anterior es aplicable nicamente para espectros registrados en equipos Bruker Avance.

experimento podemos abrir el archivo pulseprogram que se encuentra en la misma carpeta utilizando un programa como Wordpad o Microsoft Word. En las primeras lneas encontraremos ;zg30 para los experimentos RMN1H, ;zgpg30 para los experimentos RMN13C mientras que para los dems experimentos aparecer el nombre convencional. Para el ejemplo al importar los datos de un espectro RMN1H de una muestra de 1,3dinitrobenceno observaremos en la pantalla lo siguiente:

Una FID (Free Induction Decay) es la suma de todas las seales resonantes emitidas por el ncleo activo en el dominio del tiempo despus de ser excitado por el pulso de radiofrecuencia; pero las seales de radio son seales continuas por lo que el equipo durante la adquisicin realiza una conversin anlogo a digital utilizando un nmero

finito de puntos (una potencia de 2) y lo que observamos en realidad es una grfica de intensidad vs tiempo. La herramienta que nos permite obtener las frecuencias de las seales que estn dentro de la FID es la transformada de Fourier y la grfica que obtenemos de intensidad de seal vs frecuencia es lo que denominamos espectro. El programa MestRe-C nos ofrece 2 posibilidades para aplicar la transformada de Fourier a la FID, la primera consiste simplemente en seleccionar en el men Process FullFT o presionar la combinacin de (Ctrl. + K).

Un procedimiento ms adecuado es seleccionar en el mismo men la opcin Fourier Transform... con lo que nos aparecer un dilogo con algunas opciones adicionales para procesar la FID de manera simultnea con la transformada de Fourier.

La transformada de Fourier, tambin est disponible en la barra de herramientas Process.

Estas opciones tienen por objeto mejorar la resolucin digital, al introducir nuevos puntos con valor cero o con el valor calculado por una funcin o mejorar la relacin S/N (Signal Noise) seal a ruido al multiplicar el conjunto de datos de la FID por una funcin o una combinacin de funciones. Size (Tamao) Es el tamao de la FID o la cantidad de puntos complejos que registra el equipo en la conversin anlogo-digital, incluyendo el zero filling y la truncacin. Si el valor no es una potencia de 2 el programa incrementa el valor hasta igualarlo con la potencia de 2 ms cercana. Para el procesamiento de espectros unidimensionales se recomienda cambiar el valor de Size por uno 4 veces mayor, el mnimo recomendado es el doble. Este procedimiento causa el mismo efecto que la funcin zero filling (llenado con ceros) y sirve para incrementar la resolucin digital del espectro, que a su vez hace que los valores calculados ms adelante para las integrales tengan menos porcentaje de error. Linear Prediction filling (Llenado por prediccin lineal) Es un llenado con nuevos puntos obtenidos por prediccin lineal que es mejor que el llenado nicamente con ceros. Cuando se selecciona la opcin LP filling debemos dar clic sobre LP options para definir los parmetros del llenado por prediccin lineal; estos a su vez son: Coefficients: (Coeficientes) Corresponde al nmero terico de trminos sinusoidales utilizado durante el clculo, en el caso ideal corresponde al nmero de picos encontrados dentro del FID. MestRe-C ajusta este valor a puntos en el espectro / 16, utilizando

La resolucin digital no tiene nada que ver con la resolucin del espectro, esta depende del equipo, del tiempo de adquisicin y otros parmetros experimentales.

como mximo valor 16, si introducimos un valor mayor, el programa ajusta este valor automticamente a 16. Basis points: (Puntos base) Corresponde al nmero de buenos puntos experimentales que van a ser tenidos en cuenta dentro del clculo, debe ser al menos 2 o 3 veces mayor que el nmero de coeficientes. El programa ajusta este valor automticamente. Debemos tener en cuenta que el tiempo requerido para este proceso depende del valor de Cm (Coefficients); es comn bloquear los computadores cuando en este parmetro se introducen valores mayores a 8; un valor adecuado para la mayora de los espectros es 4.

En la imagen anterior se observa a la izquierda la FID original, en el centro la misma FID despus de hacer zero filling hasta obtener el doble de datos (Cambiar Size al doble) y a la derecha la misma FID despus de hacer LP filling con 8 coeficientes. Apodization (Recoleccin de puntos) Es un procedimiento en el que las FIDs son multiplicadas por funciones envolventes, con el propsito de mejorar la resolucin o la sensibilidad. Tenemos la opcin de realizar este procedimiento de forma interactiva Interactive Apodization (explicado ms adelante), o efectuarlo de forma manual (recomendado). En los espectros bidimensionales es imprescindible realizar el procedimiento de forma manual.

Interactive Apodization (Apodization Interactiva) Es el procedimiento ms sencillo para aplicar el proceso de apodization a la FID, sin embargo si se efecta de forma simultnea con la transformada de Fourier no podremos apreciar claramente los cambios producidos en el espectro al variar los parmetros de cada una de las funciones debido a los problemas de fase que se presentan en la mayora de los experimentos de RMN. Por esta razn si queremos utilizar la opcin Interactive Apodization debemos desactivar la opcin de Apodization antes de efectuar la transformada de Fourier, de tal forma que podamos aplicar el procedimiento ms adelante una vez tengamos corregida la fase de los espectros y de esta forma tambin evitar aplicar el mismo procedimiento 2 o ms veces. Para seleccionar alguna de las funciones de apodization disponibles en MestRe-C debemos dar clic en el botn Set Functions con lo que nos aparecer un nuevo cuadro de dilogo, en donde podremos seleccionar la funcin y establecer los parmetros de la misma. Es de notar que podemos escoger una sola funcin o una combinacin de las mismas, en cuyo caso la FID es multiplicada por el producto de las funciones seleccionadas.

Funcin exponencial [ f(t) = e-Rt ] Despus de seleccionarla, ajustamos el valor del parmetro R en la casilla de la derecha. Un valor positivo mejora la relacin seal a ruido, pero incrementa el ancho de banda lo que conduce a una prdida de resolucin. Un valor negativo causa justo el efecto contrario; para mejorar la relacin seal a ruido el valor para el parmetro R se recomienda que sea similar al valor de la resolucin digital que aparece en la parte superior del cuadro de dilogo. En caso de utilizar un valor negativo se recomienda que no sea inferior a -0.10 Hz. Funcin Gausiana [ f(t) = e-Rt2 ] Es una funcin muy similar a la anterior, la principal diferencia es que incrementa la sensibilidad con una menor prdida de resolucin. Esta funcin acepta un parmetro adicional Shift (Desplazamiento) que est dado en porcentaje, en cuyo caso la funcin es [ f(t) = e-R(t-St)2 ] el parmetro S causa un desplazamiento del mximo de la funcin sobre la coordenada tiempo de adquisicin. Es decir que si ajustamos a S al 50 % hacemos que el mximo de la funcin se desplace sobre la mitad del tiempo de adquisicin. Esta funcin es la que utiliza por default el software de Bruker X-winNMR con un valor para S tambin llamado LB (Line broadening) de 0.10 Hz. Lorentz to Gauss [ f(t) = e-Ret * e-Rgt2 ] No se presenta en el cuadro directamente pero es el producto de la combinacin de las funciones exponencial y gausiana, en este caso utilizamos un valor negativo de R (entre 0.15 y 0) en la funcin exponencial para mejorar la resolucin y un valor positivo de R cercano a la resolucin digital en la funcin gausiana para mejorar la sensibilidad. Campana sinusoidal [ f(t) = sen (D + (180 D)*t / T ) ] con T = Tiempo de adquisicin. No es til para el procesamiento de espectros unidimensionales porque disminuye apreciablemente la seal. Solo es aplicable a espectros de magnitud como el COSY porque disminuye la dispersin; tampoco es recomendable utilizarla en experimentos

bidimensionales sensibles a fase como el NOESY, ROESY y algunos casos especiales del HMQC. El parmetro que se vara es D y est dado en grados sexagesimales. Campana sinusoidal al cuadrado [ f(t) = sen2 (D + (180 D)*t / T ) ] con T = Tiempo de adquisicin. Se utiliza de forma similar a la funcin anterior, pero presenta la ventaja que esta funcin se concentra ms sobre el mximo. Cuando esta funcin est desfasada 90 es equivalente a la funcin Campana de coseno al cuadrado muy til para el procesamiento de espectros bidimensionales sensibles a fase. First Point (Primer Punto) Esta opcin satisface el teorema que la integral sobre todo el espectro es igual al valor del primer punto de la FID. El valor del parmetro para esta funcin siempre ser 0.5. Cuando seleccionamos el botn More>> el cuadro de dilogo se ampla permitindonos utilizar otras funciones, que producen efectos muy similares a las anteriores. Las opciones Protocol, Invert, Quadrature, Real, Hyperphase e Inverse estn

directamente relacionadas con los parmetros de adquisicin del espectro. El programa identifica automticamente las opciones adecuadas para el procesamiento del espectro, por lo que aqu no hay que hacer ninguna modificacin, al alterar estos parmetros pueden obtenerse resultados inesperados. Drift Correction Es un factor de correccin que se utiliza para suprimir una seal invertida que puede aparecer a frecuencia cero cuando la integral total de la FID no es igual a cero. Esta opcin solo est disponible para los espectros unidimensionales. Magnitude Si esta casilla est seleccionada el espectro se observa nicamente sobre el eje positivo porque el programa grafica el valor absoluto del espectro. Si no es seleccionada el programa grafica la parte real.

Corresponde a la frecuencia de la seal portadora, normalmente se encuentra cerca de la mitad del espectro.

Podemos resumir todo lo anterior y comprenderlo ms fcilmente, ilustrndolo con el procesamiento de un espectro:

El paso final es oprimir el botn Apply along t1 tras lo cual observaremos el espectro, aunque con un aspecto extrao porque se encuentra desfasado. La correccin de fase es el proceso en el cual se mezclan las partes real e imaginaria del espectro para que el espectro tome la forma convencional. La correccin esta compuesta por 2 componentes; una correccin de orden cero (0) independiente de la frecuencia y una correccin de primer orden (1) dependiente de la frecuencia. El procedimiento en s consiste en multiplicar cada punto espectral n por el nmero complejo ei(0+(n-j)1/N).

Para corregir la fase de un espectro unidimensional, existen 2 alternativas. La ms sencilla es seleccionar alguna de las 4 opciones de correccin automtica de fase preferiblemente Automatic Phase Correction (Simplex Method) o Automatic Phase Correction (Genetic Algorithm) en el men Process Phase Correction. La otra alternativa es efectuar la correccin de fase manual, este procedimiento es ms flexible y nos permite ver lo que est ocurriendo. Podemos acceder a esta funcin a travs del men Process Phase Correction Phase Correction.... o seleccionndola en la barra de herramientas Process. En la mayora de los casos la correccin de fase automtica es adecuada, pero existen casos en donde necesariamente tendremos que recurrir al procedimiento manual.

Ahora debemos ajustar los valores para la correccin de orden cero y la correccin de primer orden. Podemos hacerlo con los controles que aparecen debajo de cada uno de los relojes o de una forma ms rpida simplemente haciendo clic con el botn izquierdo dentro del interior del cuadro de dilogo, mantener oprimido el botn y arrastrar el mouse con lo que ajustaremos el valor para la correccin de orden cero. El aspecto del espectro va cambiando, de tal forma que podremos observar lo que est ocurriendo y detenernos cuando todas las seales son simtricas y se encuentran en la posicin correcta. Por el mismo procedimiento, pero utilizando el botn derecho del mouse podemos cambiar el valor para la correccin de fase de primer orden.

El siguiente proceso consiste en realizar la correccin de lnea base, aunque MestRe-C nos ofrece varias posibilidades la correccin automtica de lnea base funciona bien en la mayora de los espectros; para lograrlo solo tenemos que seleccionar en el men Process Baseline Full Auto. Debe tener en cuenta que una vez aplicada la correccin de lnea base es descartada la parte imaginaria del espectro, por tal razn s necesita corregir la fase necesitar reconstruir antes la parte imaginaria del espectro; esto se efecta con la Transformada de Hilbert disponible en el men Process o presionando la combinacin (Ctrl + H). MestRe-C puede hacer correccin polinomial de lnea base en el que por un procedimiento automtico el programa selecciona determinados puntos dentro del espectro, luego los ajusta a un polinomio hasta de sptimo grado y la funcin resultante es restada del espectro. Para los espectros unidimensionales las funciones de segundo y tercer orden producen buenos resultados; para los espectros bidimensionales es conveniente utilizar polinomios de mayor orden o funciones trigonomtricas. No se recomienda utilizar las funciones trigonomtricas en experimentos unidimensionales.

Cuando seleccionamos la opcin de correccin avanzada de lnea base, encontramos unas opciones adicionales que nos van a permitir seleccionar el mtodo de muestreo para los puntos que van a ser utilizados para ajustar la funcin. El mtodo de la derivada es el mismo mtodo utilizado por la correccin polinomial de lnea base; mientras que el mtodo de promediado de espectro utiliza un espectro suavizado obtenido por circunvolucin del espectro con una funcin rectangular de ancho definido por el usuario. Esta opcin tiene 2 parmetros, Noise factor (Factor ruido) utilizado para discriminar los puntos de la lnea base de las seales y el parmetro Box Half (Mitad de la caja) que corresponde a la mitad del ancho en puntos de la caja rectangular utilizada para el reconocimiento de la lnea base. Una vez hemos seleccionado el mtodo para el reconocimiento de puntos, debemos seleccionar el tipo de funcin a la que van a ser ajustados estos puntos, de la misma forma que en la correccin polinomial de lnea base. En este punto nuestro espectro de ejemplo lucir de la siguiente forma:

La operacin de circunvolucin entre las funciones f(t) y g(t) es

Para cada t, obtenemos el valor de la operacin calculando el rea bajo el producto entre la funcin f y una versin circunvolucionada de g, desplazada por t unidades hacia la derecha en el eje de lambda.

La funcin rectangular est definida por: (|x|>a) (|y|>b) para f(x,y) = 0 (|x|a) (|y|b) para f(x,y) = 1

Los desplazamientos qumicos de las seales de un experimento RMN siempre son relativos a la seal de un compuesto utilizado como referencia, generalmente el TMS o la seal del solvente; el procedimiento para calibrar un espectro en MestRe-C frente a una seal de referencia es uno de los ms sencillos y de igual forma lo vamos a ilustrar con un ejemplo. El espectro del ejemplo fue registrado en CDCl3 pero se le adicion TMS como referencia, seleccionamos el comando Reference en el men herramientas o damos clic en el botn TMS de la barra de herramientas, con lo que el cursor se convierte en una cruz y damos clic sobre la seal que queremos utilizar como referencia (el programa selecciona automticamente el pico ms alto), con lo que nos aparece un cuadro de dilogo de donde podemos seleccionar directamente la seal del compuesto que vamos a utilizar como referencia o ingresar el valor manualmente. Despus de seleccionar la

seal de referencia damos clic en OK con lo cual todos los desplazamientos de las seales restantes sern calculados en base a esta seal de referencia.

Dentro de MestRe-C tenemos disponibles una serie de controles que nos permiten manipular grficamente el espectro. Es decir aumentar o decrecer la intensidad de las seales, ampliar una regin determinada, cambiar las unidades de los ejes, desplazarse sobre el espectro, etc. Es conveniente revisar primero estas funciones y familiarizarnos con ellas antes de efectuar los procedimientos finales del procesamiento. Podemos acceder fcilmente a estas funciones a travs de los botones de la barra de herramientas. Al colocar el mouse sobre los mismos aparece una descripcin de la funcin que realiza, ninguno de ellos es complicado de manejar por lo que los describiremos detalladamente.

El peak-picking es el procedimiento que nos permite ver el desplazamiento de las seales. Existen 2 procedimientos en MestRe-C; uno semiautomtico que marca todos los picos encontrados dentro de una regin determinada que superen un umbral o threshold y un procedimiento manual en que vamos seleccionando las seales de inters una por una. Sin importar el procedimiento que sigamos es recomendable ampliar suficientemente las seales y el espectro por regiones para ver claramente lo que estamos haciendo. Para hacer el peak picking semiautomtico, simplemente seleccionamos la opcin peak picking en el men Tools / Peak Picking / o dando clic en el botn Peak Picking de la barra de herramientas y marcando la regin de inters haciendo clic con el mouse en la parte inicial y arrastrndolo diagonalmente para formar una caja, teniendo en cuenta que la parte inferior de la misma determina el umbral que toma el programa para el proceso. En espectros muy limpios y con poco ruido el procedimiento

semiautomtico funciona bastante bien, pero en espectros ricos en seales es recomendable tomar ampliaciones y realizar el peak picking de forma manual. El peak picking manual se realiza seleccionando la opcin peak by peak en el men Tools / Peak Picking, luego desplazamos el mouse a travs del espectro y cuando la seal de inters se encuentre resaltada damos un clic para que aparezca el valor del desplazamiento calculado y para aadirla a la tabla de seales.

El paso final para el procesamiento de algunos experimentos RMN es la integracin. En los experimentos RMN1H el rea bajo la curva de una seal est relacionada con el nmero de protones asociados a esta seal; mientras que en los experimentos NOESY o ROESY el valor de la integral est relacionado con la distancia entre los tomos de una molcula. El programa MestRe-C calcula estas reas como la sumatoria de todas las intensidades digitales dentro de unos lmites especificados por el usuario.

MestRe-C posee un comando automtico para la integracin de los espectros pero que recomendamos no utilizarlo, porque solo funciona bien en espectros muy limpios y bien resueltos adems porque el procedimiento manual es interactivo y muy sencillo. Como sabemos los valores de las integrales son valores relativos, el programa toma coma referencia el valor del rea de la primera seal que integremos y le asigna automticamente el valor 1. Para efectuar la integracin de una seal en MestRe-C basta con seleccionar el comando Integrate disponible en el men Tools / Integration o en la barra de herramientas el botn Integration. Una vez seleccionada la opcin, ampliamos el pico que queremos tomar como referencia damos clic a un lado y manteniendo oprimido el botn izquierdo del mouse arrastramos hasta sombrearlo por completo y soltamos nuevamente. Debemos luego desplazarnos para visualizar las otras seales y por el mismo procedimiento, terminamos con el proceso de integracin. Al dar clic derecho sobre cualquiera de las integrales, se desplegar un men contextual que nos ofrece una serie de herramientas para trabajar con las integrales. All podremos acceder al Integration Manager un cuadro de dilogo que nos permite cambiar el valor de referencia, los lmites de integracin, desplazarnos entre las diversas integrales o aplicar correcciones.

Al terminar el proceso de integracin nuestro espectro de ejemplo lucir de la siguiente forma:

Podemos acceder a otras opciones relacionadas con el formato a travs del men Options.

En Settings es conveniente sealar las opciones Rulers y Printable Area para visualizar el rea disponible para la impresin y las mrgenes, especialmente para ajustar el tamao del espectro dentro de estos lmites y no tener problemas con las impresiones. El tamao del espectro puede ajustarse como cualquier imagen desde cualquiera de los cuadrados pequeos que aparecen en las esquinas. El tamao del papel y la orientacin se ajusta en File Print Setup y las mrgenes en File Margins.... Antes de imprimir cualquier espectro es mejor observarlo en la vista preliminar Print Preview. En Preferences el usuario puede crear su propio estilo de acuerdo con las preferencias para cada uno de los campos, solo debe tener en cuenta detalles como que si en Settings Paper Color es azul y en Preferences Spectrum Lines tambin selecciona azul no podr ver el espectro. Lo mejor es crear nuevos estilos sin modificar el estilo preferences.xml para poder volver a las opciones predeterminadas si tiene problemas con estilos nuevos. Otras funciones bastante tiles que estn relacionadas con la presentacin de los espectros se encuentran en la barra de herramientas Layout, que encontramos en la parte inferior izquierda de la ventana del programa. Con estas funciones podemos crear copias del espectro (expansiones), que posteriormente podemos cambiarles de tamao y

manipularlas de forma individual con las opciones de la barra de herramientas Tools y Process. Como la presentacin final depende del usuario y del espectro que se quiere presentar, no entraremos en detalles para explicar cada una de las herramientas de manipulacin grfica, adems porque son bastante intuitivas para cualquier usuario de programas bajo windows.

Procesamiento de Espectros Bidimensionales utilizando MestRe-C

La diferencia entre el procesamiento de un espectro unidimensional y uno bidimensional es esencialmente que todas las operaciones ahora deben realizarse doble vez. Si usted ya puede procesar un espectro unidimensional, no va a encontrar ninguna dificultad para procesar los experimentos bidimensionales.
Diagrama de flujo para el procesamiento de espectros bidimensionales
Importar Datos de la FID

Zero Filling (direccin t2)

Zero Filling (direccin t1)

Transformada de Fourier (direccin t2)

Apodization (direccin t2)

Transformada de Fourier (direccin t1)

Apodization (direccin t1)

Correccin de Fase (direccin t1 y t2)

Correccin de linea base (direccin t1 y t2)

Instalacin de los espectros unidimensionales (direccin t1 y t2)

Calibracin (direccin t1 y t2)

Al igual que en el procesamiento de los experimentos unidimensionales el primer paso consiste en importar los datos de la FID. Estos los encontramos en el archivo llamado ser ubicado en D:\Nombre\nmero\ser; que como ya se explic anteriormente D:\ es el nombre de la unidad de CD (puede ser otro), Nombre corresponde al nombre de una carpeta que contiene los datos de todos los experimentos para cada muestra (nombre del usuario o nombre de la muestra) y nmero es el nmero de la carpeta que contiene los datos del experimento. El tipo de experimento lo podemos ver al abrir el archivo pulseprogram que se encuentra en D:\Nombre\nmero\pulseprogram con un programa editor de texto como Wordpad o Microsoft Word. Despus de importar los datos de la fid, en la pantalla observaremos algo muy similar a la siguiente imagen:

Luego en el men Process seleccionamos la opcin Fourier Transform.... y en el cuadro de dilogo de la transformada de Fourier, cambiamos el valor de Size a un valor mayor se recomienda el doble, dejamos sin marcar la opcin LP Filling porque retarda demasiado el clculo. La opcin Apodize est marcada por default y en Set Functions... aparecer marcada la funcin Sinebell, que es apropiada para la mayora de los experimentos bidimensionales (COSY, HMQC y HMBC), excepto aquellos que son sensibles a fase (Algunos casos del HMQC, NOESY, ROESY y otros); en estos casos se recomienda utilizar la funcin SineSquare (Seno cuadrado) utilizando como parmetro 90, para que sea equivalente a la funcin CosineSquare (Coseno cuadrado). Finalmente damos clic en el botn Apply along t2.

En este punto observaremos en la pantalla algo muy similar a la siguiente imagen:

Hasta aqu hemos procesado el espectro a lo largo de la coordenada de tiempo t2, ahora volvemos a seleccionar la opcin Fourier Transform... y repetimos el procedimiento anterior; es decir cambiamos Size a un valor mayor, dejamos lo dems como est y damos clic en el botn Apply along t1. Terminada la transformada de Fourier ya podremos visualizar el espectro. La correccin de fase solo necesitaremos utilizarla en aquellos espectros sensibles a fase (NOESY, ROESY, etc.) y lo observaremos fcilmente, porque al aplicar la transformada de Fourier el espectro tendr un aspecto muy similar al siguiente:

El procedimiento utilizado para corregir la fase de un experimento bidimensional es un poco ms complicado que en los experimentos unidimensionales. El primer paso es visualizar traces que son cortes en las direcciones t1 y/o t2 con planos perpendiculares al espectro. Para eso seleccionamos la opcin Show 1D slices en la barra de herramientas 2D que normalmente aparece en la parte izquierda de la pantalla. En el nuevo men que aparece seleccionamos la opcin Show traces. Estos cortes del espectro son el equivalente a espectros unidimensionales en las direcciones f1 y f2; que para el caso utilizamos para observar el proceso de correccin de fase de la misma forma que se observa en los espectros unidimensionales.

Ahora seleccionamos la opcin Phase Correction de la barra de herramientas Process con lo que aparece el cuadro de dilogo de correccin de fase que ya conocemos, pero adicionalmente est activado el botn f2 que aparece en la parte superior del cuadro de dilogo. Con los botones f1 y f2 podemos alternar entre las direcciones f1 y f2 para efectuar la correccin de fase en la direccin deseada; los dems controles sirven para lo mismo que en la correccin de fase de los experimentos unidimensionales. Como la mayora de los experimentos bidimensionales no son sensibles a fase, no entraremos en ms detalles de este procedimiento.

El siguiente paso es la correccin de lnea base, el algoritmo automtico de correccin de lnea base produce buenos resultados y el procedimiento para aplicarlo es igual al del procesamiento de espectros unidimensionales solo que ahora debemos realizarlo primero en la direccin f1 y luego en la direccin f2 seleccionando la opcin Along f2 en el cuadro de dilogo Polynomial Baseline Correction. El siguiente paso es uno de los procedimientos que ms nos interesa, visualizar los espectros unidimensionales a cada lado del espectro bidimensional con el propsito de facilitar el anlisis. Es necesario tener en cuenta que debemos primero procesar los espectros unidimensionales que queremos visualizar y guardarlos en el formato de MestRe-C. Para instalarlos utilizamos la opcin Show 1D slices en la barra de herramientas 2D y en el men que aparece seleccionamos la opcin Setup 1D traces. En este cuadro de dilogo damos clic sobre el botn de la opcin Load from Disk de cada una de las direcciones (Horizontal trace; Vertical trace) con lo que aparece un cuadro de bsqueda en donde podremos seleccionar los espectros que queremos visualizar. Estos espectros se pueden desplazar, aumentarles o disminuirles la intensidad con las diferentes opciones del men 2D. Otra de las opciones bastante tiles de este men es la opcin 2D Plotting mode que nos permite cambiar la forma de visualizacin del espectro; la vista en contornos es la utilizada tradicionalmente y tiene varias ventajas, pero tiene el inconveniente que consume ms recursos del sistema, por lo que la manipulacin grfica puede tornarse un

poco lenta. Sin embargo se recomienda cambiar el modo de visualizacin a Contour plot. Para mejorar an ms la presentacin de los espectros en el modo Contour plot podemos incrementar el nmero de contornos que podemos observar, eso lo podemos cambiar con la opcin Edit Contour Levels.... que se encuentra en el men Edit. En este men podemos establecer el nmero de niveles positivos hasta 20 que es el valor mximo, el nmero de niveles negativos tambin tiene un valor mximo de 20 pero normalmente los contornos negativos no son de inters por lo que podemos ajustarlo a un valor pequeo y el valor de la opcin Scaling factor (Factor de escalado) que determina el factor de intensidad entre niveles consecutivos se recomienda ajustarlo a 1.20; adicionalmente se recomienda marcar la casilla Set As Default para que el programa utilice estos valores para todos los espectros bidimensionales presentados en la vista Contour plot. El valor del Threshold controla el nivel de contornos que queremos visualizar, por lo que cambiar este valor es equivalente a las opciones Increase Intensity... o Decrease Intensity... del men View. Las manipulaciones grficas bsicas son las mismas de los espectros unidimensionales, solo se hace una recomendacin adicional que consiste en utilizar la opcin Set Limits para hacer las ampliaciones del espectro. Ya que especialmente en los espectros COSY es conveniente igualar los

lmites en los 2 ejes para observar el espectro de forma simtrica. El ltimo procedimiento es la calibracin del espectro, no debemos olvidar este procedimiento porque frecuentemente los espectros bidimensionales aparecen desplazados incluso en varias ppms. La forma ms sencilla de efectuar esta calibracin es localizar los cross points del compuesto de referencia o del solvente pero en algunos no se alcanzan a observar.

El procedimiento ms adecuado para la mayora de los casos consiste en calibrar el espectro bidimensional contra una de las seales de los espectros unidimensionales. Por ejemplo en el espectro que aparece en la imagen anterior se observa que la seal de protnica est desplazada con respecto al cross point. Para calibrar este espectro simplemente

seleccionamos la opcin Reference... de la barra de herramientas Tools, cuando el cursor cambie de forma a una cruz de color amarillo damos clic sobre el espectro y manteniendo oprimido el botn izquierdo

del mouse nos ubicamos en el centro del cross point que queremos referenciar y soltamos. En el cuadro de dilogo que aparece introducimos los nuevos valores para las seales tomados de los espectros unidimensionales. Ahora aunque se observa que el cross point que hemos utilizado para la calibracin se ha desplazado a los nuevos valores, los espectros unidimensionales an aparecen desplazados. Para que estos se ubiquen en la posicin correcta debemos repetir el procedimiento con el que instalamos los espectros unidimensionales, tras lo cual observaremos el espectro correctamente.

Observaciones adicionales Al copiar los espectros como metafiles se producen algunos cambios el formato, pero que si los manejamos convenientemente, podemos pegar los espectros como imgenes directamente en Microsoft Word u otro programa. Al copiar los espectros como mapas de bits, se copia tal cual lo observamos en la pantalla incluido el color, por lo que se recomienda crear nuevos estilos que no atenten contra la tinta de color de las impresoras antes de utilizar este mtodo para exportar grficas. El mejor mtodo par incluir los espectros en trabajos, tesis, etc. Consiste en imprimir primero las pginas en el editor de texto (Microsoft Word u otro) con la paginacin, marcos etc. y luego en las hojas formateadas imprimir los espectros. No es conveniente utilizar el comando deshacer, porque no funciona para muchas de las opciones, especialmente en las de manipulacin grfica y casi siempre deshace operaciones matemticas como la transformada, el fasado o la correccin de lnea base. Recordar el programa es una distribucin gratuita hasta la versin 3.4; la nueva versin 3.5 es un demo que aunque funciona ligeramente mejor expira tras 90 das de uso, por lo que no le podemos pedir que funcione completamente bien.