CREACIN DE UNA ESTRATEGIA OFENSIVA: COMBATIR VASCULACIN TUMORAL MEDIANTE VIRUS ONCOLTICOS.

LA

El suministro de sangre permite el progreso de un tumor y finalmente la metstasis. Muchas terapias contra el cncer tienen como diana la basculacin tumoral, pero su efectividad individual est limitada porque inducen indirectamente la muerte de clulas. Agentes que interrumpan una basculacin tumoral incipiente o establecida y a la vez maten las clulas cancerosas tendrn sin duda un mayor impacto. La viroterapia oncolgica utiliza virus atenuados que se replican especficamente en tumores. Estos inducen citotoxicidad a travs de una combinacin de lisis celular directa, estimulacin inmune antitumoral y, recientemente descubiertos, efectos vasculares antitumorales. Esta revisin resume las nuevas evidencias preclnicas y clnicas sobre los efectos vasculares antitumorales de los virus oncolticos, que incluyen la infeccin y la lisis de clulas tumorales endoteliales, propiedades antiangiognicas naturales o genticamente ingeniadas, y una terapia de combinacin clnicamente aprobada con agentes antivasculares.
Vasculacin tumoral como diana. Durante la tumorignesis, las clulas cancerosas inicialmente obtienen los nutrientes y el oxgeno de tejido normal vecino, pero cuando los tumores alcanzan ~ 1-2 mm de dimetro aparecen rpidamente deficiencias en el suministro. En consecuencia la evolucin clonal selecciona las subpoblaciones de clulas cancerosas que resisten la apoptosis y provoca el cambio angiognico, momento crucial en el que los tumores son capaces de inducir angiognesis. Interesantemente, los tumores tienen adems desarrollados mecanismos adicionales, a saber, cooptacin vasal, vasculognesis, intususcepcin, y mimetismo vasculognico, mediante el cual se asegura el suplemento sanguneo. En esencia, todas las maneras de establecer el suplemento sanguneo con el estroma tumoral conducirn a su progresin y eventualmente permitirn la metstasis. La vasculatura tumoral se erradica teraputicamente de dos maneras: (1) antiangiognesis, proceso en el que componentes clave necesarios para el desarrollo de nuevos vasos son inhibidos, y (2) rotura vascular, donde los vasos ya establecidos son especficamente reconocidos y destruidos. Un nmero limitado de agentes son usados clnicamente, y estn lejos de ser ptimos. La efectividad limitada se debe a muchos factores: (1) la muerte de las clulas cancerosas ocurre a travs de mecanismos de accin indirectos que inducen citotaxis e isquemia o de otros agentes citotxicos directos; (2) mecanismos adaptativos intrnsecos de resistencia, que incluyen la revascularizacin por seales angiognicas alternativas y estimulacin de la metstasis y cooptacin; y (3) penetracin y distribucin limitada de las molculas en los tumores. Efectivamente, una terapia capaz de prevenir y erradicar la vasculacin tumoral y que a su vez mate directamente las clulas cancerosas tendra grandes efectos antitumorales. Un beneficio adicional de esta terapia sera su accin sinrgica cuando se usan otras estrategias combinadas. Los virus oncolticos (OVs) demuestran su especificidad tumoral para la replicacin y la citotoxicidad. Resultados especficos para las propiedades innatas o ingeniadas genticamente suponen una ventaja al daar los mecanismos de defensa antivirales del tumor. En las dos dcadas pasadas, OVs ha mostrado una eficacia antitumoral consistente en un amplio rango de tumores modelo preclnicos, antes de su investigacin clnica. El conocimiento de los mecanismos por los que OVs causan la muerte de clulas cancerosas ha generado un inters significativo, y las propiedades antivasculares de los OVs identificadas recientemente, que inhiben la perfusin y progresin del tumor, han sido el tema central de mltiples estudios preclnicos y clnicos. OVs pueden infectar la vasculatura tumoral en desarrollo o establecida sin afectar a la vasculatura normal. Los mecanismos exactos que gobiernan este tropismo estn bajo investigacin; sin embargo, existe la hiptesis de que esta especificidad est atribuida en parte al estado proviral establecido en las clulas endoteliales (ECs) por el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), de manera similar a lo que se observa en las clulas cancerosas Ras-activadas.

Las propiedades antivasculares han sido estudiadas principalmente en OVs genticamente atenuados, con deleciones en genes virales que incrementan la especificidad tumoral y disminuyen la toxicidad. Estos virus desarmados no tienen modificaciones especficas para la destruccin de la vasculatura del tumor y por lo tanto pueden ser considerados como innatamente antivasculares. Adicionalmente, se han creado OVs armados que codifican molculas antivasculares, que disminuyen las protenas angiognicas y citoquinas o actan como factores antiangiognicos. Esta revisin resume el cuerpo de una nueva evidencia que describe las propiedades antiangiognicas y de rotura vascular de los OVs. Los OVs antivasculares innatos y los que han sido armados con agentes antivasculares se ponen en discusin. Estudios que combinan la terapia OV con agentes antivasculares clnicamente aprobados son tambin revisados. Nosotros resaltamos la evidencia clnica emergente sobre el impacto de los OVs en pacientes con tumores altamente vascularizados, y, finalmente, discutimos cuestiones clave a considerar con el fin de elucidar el papel de los OVs en la terapia antivascular. Propiedades antivasculares innatas de los virus oncolticos: Hay evidencias que sugieren que hay tres mecanismos inherentes por los que los OVs afectan a la vasculatura tumoral: (1) infeccin directa de las ECs tumorales; (2) induccin de una respuesta inmune mediada por virus, que causa la acumulacin celular y una disminucin de la perfusin del tumor; y (3) la expresin de protenas virales con propiedades antiangiognicas. Estos mecanismos no se excluyen mutuamente necesariamente, dado que una infeccin directa de EC puede derivar en la estimulacin de una respuesta inmune fuerte, que es responsable a su vez del dao vascular. En las siguientes secciones, resumiremos varias clases virales que estn siendo investigadas por sus propiedades antivasculares inherentes. Adenovirus: En ocasiones los adenovirus replicativos son considerados verdaderamente antiangiognicos porque la protena E1A interacciona con protenas angiognicas celulares como p300 disminuyendo el VEGF. Un adenovirus oncoltico que expresa una E1A mutante, carente del sitio de unin p300, tiene significativamente daada su habilidad de inhibir la expresin de VEGF en clulas pancreticas cancerosas y permite el incremento de la densidad de vasos en el tumor, en comparacin con el mismo adenovirus que expresa una E1A silvestre. OBP-301, con los genes E1 intactos bajo el control del promotor de la transcriptasa inversa de una telomerasa humana (hTERT), reduce la tincin CD31-positiva de EC tumorales de cncer de colon subcutneo en un modelo inmunocompetente de murino (subfamilia de roedores). Un adenovirus deficiente en replicacin muestra una infiltracin mnima y no cambia la tincin CD31, lo que sugiere que la prdida de EC es dependiente de la replicacin vrica. La reducida tincin CD31 no fue observada en el modelo tumoral equivalente inmunosuprimido tratado con OBP-301. Cuando se agota la respuesta interferon- (INF-) de los ratones inmunocompetentes antes y durante la viroterapia, la reduccin en la densidad vasal mencionada est parcialmente suprimida en relacin al virus solo, lo que sugiere la importancia del sistema inmune en la respuesta antivascular. Vaccinia virus (VV): VV oncolticos infectan especficamente ECs tumorales CD31 positivas a las 24 h despus de la liberacin intravenosa, permitiendo una prdida de densidad vascular a las 48 h en tumores pero no en tejidos normales. VV oncolticos [VV doble suprimidos (vvDD)] colocaliza con ECs tumorales CD31 positivas a las 24 h y sube hasta 6 das despus de una liberacin intraperitoneal (Figura 1). En cncer colorectal intraperitoneal infectado por virus se observa una prdida de ECs tumorales CD31 positivas, en tumores 6 das tras la infeccin. VV tambin puede permitir la muerte de clulas tumorales isqumicas como resultado de la acumulacin de neutrfilos inducida por virus y la subsecuente prdida de perfusin. Aunque est demostrado que los OVs infectan y matan ECs in vitro, no est claro qu proceso ocurre in vivo. Generalmente, se asume que los OVs infectan ECs de la membrana luminal para migrar dentro del tumor.

Sin embargo, esto evidencia que VV infecta preferentemente la membrana basal de ECs polarizadas, sugiriendo que la infeccin de EC podra ocurrir de manera secundaria a la infeccin tumoral. No est claro si los OVs lisan ECs tumorales tras la infeccin in vivo o si la infeccin es permanente. Tambin es posible que los nuevos vasos sanguneos tumorales sean diferencialmente susceptibles a la infeccin, en relacin con el establecimiento de vasos sanguneos tumorales. Estas reas estn actualmente bajo investigacin.

Cuadro 1. Angiognesis tumoral: La angiognesis es un proceso de muchos pasos dirigido por estimuladores endgenos como VEGF y FGF y por inhibidores (pptidos, metabolitos hormonales y moduladores apoptticos). Una realimentacin constante, tambin conocida como reciprocidad dinmica, entre ECs y la matriz extracelular garantiza que las molculas proangiognicas y antiangiognicas favorezcan un estado de reposo. Bajo ajustes fisiolgicos (cicatrizacin de heridas, reproduccin y organognesis) o patolgicos (cncer, enfermedades oculares y soriasis), el tejido abandona su estado de reposo para satisfacer sus necesidades metablicas mediante la induccin de angiognesis. Los tumores utilizan los mismos moduladores endgenos angiognicos que los tejidos normales, pero su patrn de crecimiento exponencial y la desregulacin del balance entre estimuladores e inhibidores desembocan en una rpida proliferacin y migracin de los componentes de los vasos sanguneos. Adems, muchas clulas cancerosas estn programadas para estimular la angiognesis permanentemente. El supresor humano de tumores p53, que est mutado en aproximadamente el 50 % de los tumores, tiene propiedades antiangiognicas significativas. Al final, los tumores suponen un riesgo de mala distribucin y disfuncin de la red vascular, compuesta por vasos sanguneos con paredes de estabilidad mnima, derivacin irregular, cambios bruscos en el dimetro, extremos ciegos, brotes de fugas y compresin vascular. A pesar de que estas caractersticas anormales contribuyen sustancialmente a la ineficacia de muchos tratamientos citotxicos estndares, la vasculatura tumoral de por s es una diana importante para nuevas terapias contra el cncer. Cuadro 2. Principios de la terapia antivascular: La vasculatura tumoral se puede erradicar por dos estrategias diferentes: antiangiognesis y disrupcin vascular, que difieren en (1) sus mecanismos de accin, (2) el tipo de muerte celular que inducen, (3) el tipo de tejido susceptible, y (4) la duracin de la administracin que se requiere para que haya eficacia (Figura 1). La antiangiognesis, proceso por el que son inhibidos los componentes clave para la formacin de nuevos vasos sanguneos, es llevado a cabo antagonizando las rutas de sealizacin angiognicas entre las clulas, tumorales, endoteliales y estromales, o mediante el impedimento de la proliferacin, la diferenciacin y la migracin de EC (Figura 1A). Mediante la prevencin de la liberacin de oxgeno y nutrientes desde el principio, estos agentes inducen la citotaxis de clulas cancerosas, lo que no solo previene la progresin del tumor sino que tambin limite el potencial para la metstasis. La funcin vascular se normaliza tambin porque se restaura la presin intersticial y el grosor de la membrana basal; en consecuencia se puede optimizar la liberacin intravascular de agentes quimioteraputicos. Debido a que los tumores inicialmente desarrollan vasculatura en la periferia, es ms probable que los agentes antiangiognicos tengan xito si se administran de manera temprana, ante pequeos escenarios, o frente a metstasis asintomtica (Figura 1A). En la prctica, este tipo de terapia requiere una administracin crnica debido a que los tumores estimulan angiognesis persistentemente. Alternativamente, la disrupcin vascular destruye selectivamente la vasculatura tumoral bien establecida por las caractersticas del tejido diana, como la presencia de cierto citoesqueleto o las protenas de superficie de membrana, que lo diferencian del tejido homlogo (Figura 1B). Agentes que destruyen la vasculatura una extensiva necrosis isqumica de las clulas tumorales por induccin de la apoptosis de EC con la

subsecuente agregacin plaquetaria y vasoconstriccin o por inhibicin directa del flujo sanguneo tumoral. Tras la administracin, el crecimiento tumoral y el potencial para la metstasis quedan reducidos, gracias a la buena extensin del agente antiangiognico. Los vasos sanguneos tumorales estn mejor establecidos en el centro; por lo tanto, los agentes disruptores vasculares parecen ser ideales para tumores avanzados o grandes (Figura 1B). A pesar del tratamiento, una delgada capa perifrica de clulas cancerosas viables permanece ilesa como el tejido normal cercano y los vasos sanguneos suplementan oxgeno y nutrientes. Dado que los efectos de estos agentes son inmediatos, el tratamiento suele ser agudo.

Figura 1. Terapia antivascular para el cncer. Ejemplos de antiangiognesis (A) y disrupcin vascular (B). Cualquier agente dado puede poseer cualquiera de las propiedades, o una combinacin de ambas. (A) En este panel, se ilustran los efectos globales antitumorales de muchos compuestos, incluyendo los frmacos antiangiognicos (bevacizumab, erlotinib, sorafenib, y TSA, as como factores endgenos con propiedades antiangiognicas, como endostatina, canstatina, angiostatina, PF4, arresten, TSP-1, INF, y IL). Los factores endgenos tienen particular importancia en la terapia OV ya que son usados como transgenes teraputicos en muchos virus armados. Estas citoquinas median su efecto antiangiognico a travs mecanismos INF-dependientes (IL-12, IL-24, IL-18, IP-10, y MIG) e independientes (GM-CSF, IL-18, y PF4). La inhibicin de la formacin de nuevos vasos por agentes antiangiognicos desemboca en citotaxis en la superficie del

tumor pero deja el ncleo viable. (B) Ejemplos de la terapia vascular disruptiva incluyen agentes de unin a integrina (pptido cRGD) y PDT. La disrupcin vascular provoca necrosis en el ncleo de tumores grandes dejando un borde mnimo residual viable. Abreviaciones: ATP, adenosin trifosfato; CD36, grupo de diferenciacin 36; cRGD, pptido cclico Arg-Gly-Asp; ECM, matriz extracelular; EGF, factor de crecimiento epidrmico; EGFR, receptor epidrmico del factor de crecimiento; FGF, factor de crecimiento fibroblstico; GM-CSF, factor de estimulacin colonial de macrfagos y granulocitos; IFN, interferon; IL, interleucina; IP-10, protena-10 interferon -inducida; MIG, monoquina inducida por interferon-; mTOR, diana mecnica de la rapamicina (previamente conocida como diana mamfera de la rapamicina); PDT, terapia fotodinmica; PF4, factor plaquetario 4; sVEGFR, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular soluble; TSA, tricostatina A; TSP-1, trombospondina-1; VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular; VEGFR, receptor del factor de crecimiento endotelial vascular.

Figura 1.

Propiedades antivasculares y de ataque a clulas endoteliales de los virus oncolticos. (A) Inhibicin indirecta de clulas cancerosas por adenovirus oncolticos (OBP-301) que median angiognesis in vivo. Imgenes representativas de lneas celulares de carcinoma colorectal humano (SW620), induccin de angiognesis en ausencia de tratamiento (arriba) y en presencia de sobrenadante de clulas infectadas por OBP-301 muestra el efecto angiognico indirecto (mediado por interferon) del virus. Se ven microvasos ondulados (flechas blancas). (B) Virus de vacuna oncolticos (vvDD) infectan la vasculatura tumoral en ratones C57B1/6 portadores de carcinomatosis en el colon. Los ratones fueron tratados intraperitonealmente con vvDD y los tumores fueron recogidos 6 das despus. Varias secciones inmunohistolgicas representativas muestran tincin CD31 del endotelio de vasos sanguneos (arriba) e infeccin VV de la misma estructura (abajo). Ampliacin original 20x. La barra representa 100 micrmetros. (C) Infeccin del virus estomatitis vesicular (VSV) y perfusin tumoral restringida a la superficie de tumores de colon CT-26. Ratones BALB/c portadores de tumores CT-26 fueron tratados por va intravenosa con VSV 24 h antes de la perfusin con microesferas fluorescentes. Modelos tridimensionales enteros (arriba) y partidos (abajo) revelan que las superficies, de tumores tratados con VSV y con solucin de tampn fosfato (PBS), son perfundidas. Modelos partidos revelan que el ncleo tumoral tratado con VSV ha perdido dramticamente la perfusin en comparacin con el tratado con PBS. (D) Virus simplex herpes oncoltico (G207) infecta clulas endoteliales de xenoinjertos del rabdomiosarcoma alveolar humano (KFR). Anlisis de la ultraestructura 24 h despus del tratamiento revelaron que partculas virales envueltas son frecuentemente encerradas en vacuolas (flechas) en el citoplasma de clulas endoteliales (mirar recuadro, mirar inserciones). Abreviaturas: EC, clula endotelial; TC, clula tumoral; n, ncleo; c, citoplasma. Virus de la estomatitis vesicular (VSV)

Se realizaron reconstrucciones tridimensionales de tumores subcutneoss de colon usando aproximadamente 1000 secciones histolgicas continuas. Estas han ayudado a visualizar la distribucin de la perfusin, virus, y proliferacin de las clulas tumorales 24h despus del tratamiento intravenoso VSV (28) (figura 1). VSV infect directamente tumores ECs, y a pesar de que la infeccin estuvo limitada primero al borde tumoral, result en una dramtica prdida de perfusin y muerte de clulas tumorales extensivas a lo largo del corazn del tumor (figura1). Similar a VV, la infeccin de VSV en el tumor caus una infiltracin masiva de neutrfilos, destacando una prdida de perfusin y un incremento de apoptosis tumoral secuandaria a isquemia. Inhibicin de la heparina de VSV indujo la formacin de cogulo anul la prdida de la perfusin respecto a lo visto con el tratamiento virus solo. Junto a la evidencia de que el reclutamiento de neutrfilos es crtico para la formacin coagular, los datos apoyan un nuevo mecanismo de VSV como inductor de la interrupcin vascular. No est claro si otros OVs utilizan este mecanismo. HSV HSVs han sido mostrados para infectar directamente endotelio tumoral in vivo y disminuir significativamente la media de densidad del vaso de tumores en el ovario, glioma, y rabdomiosarcoma [2931] (Figura 1). El virus no se detect en condiciones normales de tejidos endoteliales por inmunohistoqumica (IHC) siguiendo la administracin intravenosa de HSV1716, lo que demuestra especificidad virus de endotelio tumoral [29]. Cultivo Ex vivo de ECs cosechadas de los ratones portadores de tumor demostr un aumento de las tasas de proliferacin en ECs derivadas de tumores, con relacin a las normales ECs derivadas de corazn. Las diferentes tasas de proliferacin pueden contribuir al aumento de la sensibilidad de ECs tumorales para la replicacin viral relativa al endotelio normal. HSV1716 tambin fue citotxico en cultivo de flujo ordenados ex vivo de tumorales ECs de ovario obtenidas a partir de muestras de pacientes [29]. HSV tambin inhibe especficamente la ciclina D1 y la produccin de VEGF por ECs activadas y clulas tumorales (la protena viral responsable an no ha sido identificado) [32]. Virus oncolticos armados con factores antiangiognicos VO han sido diseados genticamente para transportar genes antiangiognicos que (i) (ii) ofrecen unos factores antiangiognicos [33-49] o (ii) dirigen la expresin o funcin de las protenas angiognicos o citocinas [50-57] (Tabla 2). El armado de OVs mejora potencialmente la seguridad en comparacin con las terapias antiangiognicas estndar porque da lugar a la expresin localizada de factores antiangiognicos, contingentes en la especificidad tumoral del virus. Orientacin de factores angiognicos Las protenas angiognicos , VEGF y del receptor de factor de crecimiento endotelial vascular ( VEGFR ) [ 50-52,54,55 ] , factor de crecimiento de fibroblastos ( FGF ) [ 53 ] , y la interleucina ( IL ) -8 [ 57 ] , todos han sido abordado(targeted) con xito por diferentes VOs en una variedad de modelos . VEGF y VEGFR son los objetivos (targets) ms ampliamente estudiados , y varios estudios recientes han investigado formas de reducir o eliminar la actividad de VEGF . Un VV oncoltico que codifica una protena de fusin VEGFR - 1 Ig soluble que se une a VEGF humano y murino, redujo significativamente la densidad media del vaso y el volumen del tumor en el carcinoma de clulas renales (CCR ) despus de la administracin intravenosa [ 51 ] . Oncoltico VVs ( GLV - 1h - 107 , -108 , y -109 ) que expresa glaf - 1 , un anticuerpo anti VEGF de cadena simple, disminuy significativamente la densidad media del vaso y el volumen de tumores de pulmn humano y los tumores de pncreas en comparacin con la de sus padres GLV - 1H - 68 virus [ 50 ] . En otro enfoque, un adenovirus de replicacin deficiente ( Ad- Flk1 - Fc ) que expresan VEGFR soluble , coinfectados con un virus competente ' ayudante 'de replicacin , inhibi significativamente la progresin del tumor de prstata humano en ratones y la reduccin de tincin con CD31 , en relacin con cualquiera de los virus tratados solos.

Antiangiogenesis tambin ha sido documentada en un modelo de xenoinjerto de cncer de colon murino siguiendo (despus del) el tratamiento con un adenovirus expresando humana soluble VEGFR (hVEGFr) [56]. Dos adenovirus Ad-E1-Kox y Ad-B7-KOX, se han construido para expresar el VEGF-A represor transcripcional F435-KOX [52] o una horquilla corta de RNA dirigida al VEGF [55], con diana en VEGF a nivel de la transcripcin o de traduccin, respectivamente. Despus de la infeccin con cada virus, in vivo la expresin de VEGF y la tincin del tumor con CD31, fueron significativamente debilitadas en relacin con virus parentales. La liberacin viral de los inhibidores VEGF-sealizados puede superar algunos de los problemas de distribucin (liberacin, reparto etc) que se han encontrado con inmunoterapias anti-VEGF tradicionales. Aunque menos estudiado, otras dianas (objetivos targets) han sido probadas satisfactoriamente en estudios preclnicos y garantiza una mayor investigacin. El HSV oncoltico bG47D-dnFGFR expresa un receptor dominante negativo factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) que dimeriza con FGFR endgeno sin estimular de sealizacin aguas abajo [53]. Este virus es citotxico para las ECs humanas in vitro y redujo significativamente el crecimiento del tumor en relacin con bG47D en modelos murinos de tumor maligno de la vaina del nervio perifrico y de glioblastoma humano. Un adenovirus oncoltico que expresa un una horquilla corta especfica al ARNm que codifica la citoquina IL-8 reducijo d la produccin de IL-8 por parte de clulas tumorales in vitro [57]. Los medios acondicionados, para (a partir de, proveniente) clulas tumorales infectadas, inhibieron la EC formacin (en el) tubo y la migracin, y en el glioma, pulmn, y modelos metastsico de xenoinjertos de tumor de mama reducen el crecimiento del tumor as como la expresin de IL-8, CD31, y VEGF desde el tumor. Entrega de factores antiangiognicos Agentes antiangiognicos endgenos , tales como endostatina , canstatin , kringle 5 del plasmingeno , vasculostatin , Arresten , trombospondina ( TSP ) , angiostatina , e ILS (vase la Figura I en el Recuadro 2 ), tambin han sido explotados como transgenes teraputicos en una variedad de OVs . La infeccin por HSV expresando endostatina redujo significativamente el volumen del tumor [ 40,46,58 ] y la tincin CD31 [ 40,58 ] con respecto al virus parentales y mejoras similares se observaron despus del tratamiento con adenovirus que expresaban endostatina [ 37,42 ] . Armar HSV para expresar TSP- 1 aument su eficacia por encima del virus parental, como se muestra por una disminucin de la carga tumoral secundaria a la disminucin de la densidad media de los vasos [ 59 ] . La angiostatina - armado HSV administrado de forma simultnea con bevacizumab aument la distribucin de virus y la inhibicin de la expresin de VEGF mediada por angiostatina, que aument la supervivencia de los animales mediante la inhibicin de la angiognesis y la disminucin de la invasin del tumor [ 60 ] . Adenovirus presenta (entrega de) genes que codifican otros potentes inhibidores de la angiognesis que se sabe que inducen la apoptosis CE [ 61,62 ] , tales como canstatin [ 36 ] y kringle 5 del plasmingeno [ 34 ] , tambin inhiben de forma eficaz la angiognesis tumoral in vivo y mejoran las respuestas tumorales en relacin con los virus parentales . Se observ una significativa apoptosis de las clulas del cncer y una reduccin de la densidad media del vaso cuando un vector adenoviral de replicacin condicional AD5/11D24 fue doblemente armado con TRAIL y Arresten [ 63 ] , sugiriendo el beneficio de armar virus con mltiples transgenes que se dirigen a diferentes vas . Un adenovirus armado con inhibidor de crecimiento vascular EC (VEGI - 251 ) revel beneficios secundarios [ 45 ] cuando se descubri que inducia niveles de apoptosis de las clulas tumorales in vitro que superaban los inducidos por el virus parental . Mediante la modulacin de la caspasa - 8 y la induccin de la va apopttica mitocondrial , el VEGI - 251 secretado aument la apoptosis de clulas tumorales adems de limitar la angiognesis . RAMBO , un HSV oncoltico que codifica vasculostatina, redujo de manera eficiente en el tumor in vivo la densidad mediade los vasos y la perfusin en los modelos de glioma [ 35 ] . La segunda generacin de este virus ( 34.5ENVE ) , que codifica el factor de neurovirulencia ICP34.5 bajo el control de un promotor de nestina glioma - especfico , mostr una eficacia teraputica superior comparado con RAMBO [ 47 ] . NV1042 , un HSV que expresan IL - 12,redujo el crecimiento del tumor de prstata in vivo con una eficacia mayor que su contraparte NV1034 que expresa factor estimulante de colonias de

granulocitos y macrfagos ( GM-CSF ) [ 43 ] . NV1042 estimul significativamente ms CD4+ y CD8+ de clulas T y la infiltracin de macrfagos y redujo el crecimiento de tumores contralaterales no inyectados . IL - 12 estimulacin (estimul) de dos mediadores antiangiognesis , monoquina inducida por el interfern g ( MIG ) y la interfern g inducida protena - 10 ( IP - 10 ) , disminuy significativamente la vasculatura del tumor [ 43,44 ] . En los modelos de melanoma humano [ 48 ] y RCC [ 49 ] , el adenovirus ZD55 - IL - 18 no slo reducijo el volumen del tumor, si no que tambin disminuy la CD34 y la expresin de VEGF , en comparacin con un control que expresan GFP . L a expresin de factor plaquetario 4 ( PF4 ) por HSV oncoltico aument significativamente la citotoxicidad in vitro en ECs humana inhibiendo su migracin en comparacin con el virus parental [ 38 ] . Adems, la distribucin de PF4 por parte del virus redujo la densidad media del vaso y la mejora de la supervivencia en dos modelos de xenoinjerto de glioma [38]. Del mismo modo, la administracin de adenovirus oncoltico que expresan IL-24 retrocedi completamente los tumores de prstata subcutneos en ratones y redujo significativamente la densidad media del vaso en relacin con el virus parental [33]. VO dirigidos al endotelio vascular del tumor Especificidad de focalizacin (diana) superior para ECS tumor puede ser obtenido usando VO modificados genticamente para interactuar con las combinaciones de subunidades de integrina sobreexpresadas que encuentran en la superficie de estas clulas. Por ejemplo, el virus del sarampin (MV) que muestra una forma mutada de la protena de unin a integrinas equistatina en su envoltura (MV-ERV) infect selectivamente los vasos sanguneos establecidos en el ensayo de la membrana corioalantoidea (CAM) [64] y la reduccin de la carga tumoral en comparacin con la MV parental tras la inyeccin intratumoral en un modelo humano de xenoinjertos de mieloma subcutneos. Un segundo estudio confirm que MV expresando echistatin wildtype infect la neovasculatura en dos modelos in vivo de angiognesis [65]. La combinacin de VO con antivascular teraputica La combinacin de VO con agentes antivasculares clnicamente aprobados ( Cuadro 2 ) se ha convertido en una estrategia interesante para reducir drsticamente el crecimiento del tumor . Uno de los retos en la evaluacin de la eficacia de las terapias de combinacin es la amplia variacin en el diseo del estudio, en particular con respecto a los programas de tratamiento y la seleccin de drogas . Inicialmente , la administracin simultnea de bevacizumab , un anticuerpo monoclonal humanizado , y adenovirus ( Ad5 / 3 - 24 , A5 - 24RG , y Ad5.pK7 - 24 ) no mejor la supervivencia en ratones [ 66 ] . Sin embargo, un estudio posterior utilizando un adenovirus diferente ( dl922 -947 ) inform que acondicionar los ratones con bevacizumab antes de la viroterapia mejor significativamente la distribucin viral dentro de los tumores y redujo el crecimiento del tumor con respecto a la monoterapia [ 67 ] . En contraste con los resultados con adenovirus , precondicionar con bevacizumab antes del tratamiento con el VHS no mejor la distribucin del virus en el tumor [ 68 ] , pero la administracin de bevacizumab 13 das post- GLV - 1h - 68 ( Lister cepa VV ) infeccin inhibieron significativamente el crecimiento del tumor en comparacin con la monoterapia [ 50 ] . Del mismo modo , cuando la infeccin por HSV fue seguido por el tratamiento con bevacizumab mejor las tasas de supervivencia de los ratones portadores del sarcoma de Ewing humano , un hallazgo que era probable debido a los continuos efectos antiangiognicos una vez que el virus fue eliminado por el sistema inmune [ 68 ] . Combinando el receptor del factor de crecimiento epidrmico ( EGFR ), molcula pequea inhibidora de erlotinib con virus del herpes simple oncolticos ( G207 y hrR3 ) no di lugar a efectos sinrgicos , a pesar del hecho de que cada agente tiene efectos antiangiognicos en los mismos modelos y erlotinib no afecta a la replicacin in vitro [ 69 ] . La administracin simultnea de sorafenib con JX - 594 does inhibit la replicacin viral in vitro , sin embargo , la terapia secuencial ( OV seguido de sorafenib ) fue superior a la monoterapia en modelos murinos [ 17 ] . El pretratamiento con una dosis nica de pptido Arg - Gly - Asp ( cRGD ) cclico antes de la administracin de HSV - 1 hrR3 redujo la permeabilidad vascular del tumor , infiltracin de leucocitos , y los niveles de IFN - g , mientras que aumentaban (increasing) los ttulos virales en el tejido del tumor , por consiguiente, la

prolongacin de las supervivencia media en relacin con monoterapia [ 70 ] . Dado el papel de IFN - g en la respuesta inmune antiviral es probable que la reduccin de IFN - g inducida por cRGD fue significativa en mejorar la distribucin (delivery) OV y la eficacia. El mecanismo con diana de (target) rapamicina ( mTOR ) inhibidor RAD001 ( everolimus ) se ha demostrado que prolonga la supervivencia de ratones portadores de tumor cuando se administra en combinacin con adenovirus oncoltico [ 71 ] . RAD001 se retuvo el da antes y el da de la administracin del virus para crear una rfaga de VEGF en el momento de la inyeccin, y se utiliz un modelo inmunodeficiente para el control de las contribuciones potenciales de efectos inmunosupresores conocidos por ser el resultado de la terapia de everolimus . A diferencia de en los ratones tratados con monoterapia, en los ratones tratados con la terapia de combinacin el anlisis histolgico revel un colapso en la vasculatura del tumor con necrosis central extensa. La administracin simultnea de HSV oncoltico ( G47 ) y tricostatina A ( TSA ) tambin potenci antiangiognico y la eficacia antitumoral [ 32 ] . Sinergia dependi de la replicacin viral , pero no dependa de la secuencia de dosificacin , alteraciones genticas virales , infectividad , o cintica de replicacin . Ambos tratamientos redujeron de forma individual ciclina D1 a travs de diferentes mecanismos, por consiguiente, la inhibicin de la proliferacin celular y la secrecin de VEGF . La sinergia observada se piensa que es dependiente de ciclina D porque las clulas con bajos niveles de ciclina D o de los tratados con anticuerpo anti - ciclina D eran menos susceptibles a la terapia de combinacin. El cobre es un cofactor importante para muchas protenas angiognicos (por ejemplo , VEGF ) . La combinacin de un agente quelante del cobre antiangiognico ( ATN - 224 ) con otro VHS oncoltico ( rQnestin34.5 ) disminuy la densidad media del vaso y la mejora de la propagacin de virus en los tumores de glioma intracraneal [ 72 ] . Curiosamente, ATN - 224 se vio que tambin aument la estabilidad en suero del virus. Combinando VV oncoltico con la terapia fotodinmica ( PDT ) mejor la supervivencia en ratones desnudos portadores de neuroblastoma o de cabeza y xenoinjertos de clulas escamosas de carcinoma de cuello en comparacin con ratones tratados slo con virus [ 73 ] . Disminucin en tamao del tumor y aumento en los ttulos virales en el tumor fueron observados en los ratones tratados con la terapia de combinacin, en comparacin con la monoterapia. Estos resultados se atribuyeron a la capacidad de la PDT para causar disfuncin de la barrera endotelial, que aumenta la permeabilidad y la entrega de virus. Un enfoque innovador para la terapia de combinacin utiliz la estimulacin de VEGF para activar el endotelio del tumor con el fin de apoyar(supporting) la replicacin viral. Preacondicionar el endotelio del tumor con la exposicin transitoria (fugaz) a VEGF apoy (mantuvo supported) reovirus oncoltico o la replicacin de VSV [ 20 ] . Preacondicionamiento fue generada ya sea mediante la administracin de VEGF a los tumores que carecen de la expresin de VEGF o mediante la induccin de una rfaga de VEGF a travs de la administracin y la retirada de bevacizumab a los tumores que expresan VEGF - . Se plante la hiptesis que la sealizacin VEGF- VEGFR2 intracelular estableciera un estado proliferativo proviral similar a la de las clulas tumorales - Ras activados [ 20 ] . Se plante la hiptesis de que este estado activado permitiera a OVs replicarse en lneas pobremente susceptibles de EC in vitro. La estimulacin de VEGF en ratones inmunocompetentes desencaden un colapso vascular innato inmuno-mediado, la regresin substancial del tumor, y tumores establecidos finalmente curados en los ratones inmunocompetentes [ 20 ] . Este estado proviral tambin ha sido inducido por la exposicin del endotelio a paclitaxel [ 74 ] . La exposicin prolongada o dosis elevadas pueden poner en peligro (compromise) el suministro de frmacos a los tumores y aumentar las zonas de mala perfusin, pH bajo, y la presin intersticial alta, todos los cuales hacen tumores particularmente resistentes a las terapias citotxicas estndar [ 9 ] . Debido a que muchos OVs se reproducen en ambientes de hipoxia y cidas sin perder eficacia (por ejemplo , VV y HSV) [ 75-78 ], estos candidatos virales pueden ser ideales para combinar con agentes antiangiognicos , que conduce a la sinergia sostenida despus del perodo de normalizacin.

Frmacos antiangiognicos tambin pueden tener efectos inmunomoduladores que podran mejorar sinrgicamente la terapia de combinacin con OVs. Proangiognicos factores como VEGF y FGF contribuyen al estado ' inmunoprivilegiado "tpico de los tumores mediante la regulacin negativa de las molculas de adhesin en ECs y en consecuencia limitar la extravasacin de leucocitos [ 79 ] . Otros agentes antiangiognicos se han mostrado para mejorar la extravasacin de leucocitos [ 79 ] y el reclutamiento de leucocitos y otros mediadores inmunes en los tumores(into) . En el entorno de la inflamacin local creado por OVs, estos leucocitos pueden llegar a ser estimulados para inducir respuestas inmunes antitumorales . Virus proangiognicos Algunos virus han evolucionado para inducir un estado proangiognico mediante la codificacin o aumentando la expresin de factores angiognicos, tales como el parapoxvirus ORF que codifica un homlogo de VEGF [80], o mediante la inhibicin de la expresin de las protenas antiangiognicas TSP-1 y TSP-2, como en el caso de ciertos recombinantes HSV [81]. Esto aumenta la vascularizacin del tumor y puede conducir al crecimiento del tumor, que es una clara desventaja al utilizar estos virus como agentes oncolticos. Por consiguiente, cuando estos virus fueron diseados como agentes oncolticos, se hicieron deleciones para contrarrestar esta caracterstica En algunos casos, el tiempo de anlisis puede conducir a la conclusin de la estimulacin angiognica. Por ejemplo, GLV-1h-68 (VV) fue demostrado que disminuye la densidad media del vaso en xenoinjertos de tumores de prstata tempranos despus de la infeccin (7 das despus de la infeccin) [84], sin embargo, no tienen ningn efecto sobre la densidad medio del vaso en xenoinjertos de tumor de mama tardos despus de la infeccin (42 das despus de la infeccin) [85]. Del mismo modo, G207 (HSV) ha mostrado aumentar la vascularizacin en un modelo de glioma tarde despus de la infeccin (27 das despus de la infeccin) [81], pero tuvo efectos antivasculares in vitro y principios de despus del tratamiento en un modelo de rabdomiosarcoma (8 das despus de la infeccin) [30]. En un estudio clnico, se observ aumento de la vascularizacin tardo (CD31) (14 das despus de la infeccin en ndulos de cncer de mama tratados con HF10 (HSV) en comparacin con ndulos inyectados con solucin salina en el mismo paciente. Datos clnicos Hasta la fecha, slo JX-594, un VV oncoltico que expresa GM-CSF (vase la Figura I en el cuadro 2), se ha informado que tienen propiedades antivasculares en los seres humanos. En una dosis de ensayo clnico de fase I / II de escalada, JX-594 se administr por va intratumoral a intervalos de 3 semanas a los pacientes con carcinoma hepatocelular primario (CHC) o con metstasis en el hgado [41]. De 14 pacientes tratados; 3 con HCC, un tumor hipervascular y rico en VEGF, se estudiaron posteriormente como un subgrupo y se discuten en otro estudio [39]. Por primera vez en seres humanos, un OV se confirm por causar un cierre vascular objetivo tal como se muestra por una disminucin de 43% en la perfusin del tumor respecto al valor basal 6 das post-tratamiento en la tomografa equipo de perfusin. Tambin se observaron niveles significativamente reducidos de VEGF circulante (28-45% hasta 192 h post-tratamiento) y la induccin de citoquinas antivasculares, especficamente el TNF-a e IFN-g [39]. El suministro intratumoral de JX-594 seguido de sorafenib en tres pacientes con HCC se asoci con una disminucin significativa en la perfusin del tumor con posterior necrosis (tasa: 50-100%), a partir de las 2,5 semanas de tratamiento post-sorafenib [17] (Figura 2). Los autores tambin reportaron un caso de un paciente con RCC metastsico que tuvieron una respuesta completa del tumor despus del tratamiento combinado con JX-594 y sunitinib [17]. Cuatro aos despus del tratamiento se inform al paciente de estar vivo. IHC realizado en biopsias de pacientes con CCR, carcinoma de ovario, leiomiosarcoma, y cncer de clulas no pequeas de pulmn inscrito en un ensayo de fase I [87] documentado dosis-dependiente de la infeccin CE 7 das despus de una sola infusin intravenosa de JX-594. Una resonancia magntica dinmica de serie de 16 pacientes de un ensayo de fase II para el CHC y CRC demostr que JX-594 induce la interrupcin vascular progresiva y duradera con la prdida de la perfusin de partida 5 das despus del tratamiento y con duracin de hasta 8 semanas [87]. Este fenmeno se observ no slo en los tumores inyectados por va

intravenosa o por va intratumoral, sino tambin en los tumores no inyectados, lo que sugiere un efecto de asistencia inmunolgica. Los sitios de curacin de heridas no se vieron afectados por el tratamiento.

Figura 2 Tratamiento de JX - 594 en los pacientes con carcinoma hepatocelular avanzado puede sensibilizar a la terapia sorafenib posterior [17]. Se muestran en (A) y (B) dos pacientes con carcinoma hepatocelular, fueron tratados con cada JX - 594 (dosis: unidad de formacin de placas 109 (ufp) intratumoral] cada 2 semanas durante tres tratamientos. Sorafenib se inici en las semanas 8 y 13 para los pacientes A y B, respectivamente. La respuesta se evalu por formacin de imgenes por resonancia magntica dinmica (IRM) al inicio del estudio, despus de un tratamiento con solo JX - 594, y despus de la iniciacin sorafenib. (A) Los valos rojos indican las zonas de tumor no inyectados con JX -594. Estas imgenes demuestran actividad antitumoral en las lesiones no inyectadas similar a la observada en las lesiones inyectadas en la imagen (B). Se observa progresivamente el desarrollo de necrosis dentro de los tumores no inyectados se observa solo despus de la terapia JX - 594 y luego de la iniciacin de sorafenib; un fenmeno que es consistente con la propagacin de JX - 594 a los tumores no inyectados a travs del torrente sanguneo . (B) Los crculos rojos indican los tumores de destino. Se observa cantidad leve de necrosis en el tumor ms grande al inicio del estudio. La necrosis aumenta un poco despus de solo JX 594, pero se identifica necrosis significativa despus de la terapia con sorafenib. Observaciones finales y perspectivas futuras Un nmero creciente de estudios demuestran que las propiedades antivasculares de muchos VO contribuyen de manera significativa a su eficacia general antitumoral (Figura 3). La orientacin de la angiognesis por s sola no va a superar el carcter multifactico de la vasculatura del tumor, por lo tanto, la explotacin de VO con propiedades de alteracin vascular y el uso de VO en combinacin con agentes antivasculares representan estrategias prometedoras. Para hacer avanzar VO como teraputico antivascular, la investigacin futura debera centrarse en la comprensin de los mecanismos especficos de accin del VO individuales y cmo stas influyen en el rgimen de tratamiento ptimo y combinaciones potenciales de la droga. Es fundamental lleva a cabo estudios diseados adecuadamente para establecer el papel de VO como agentes antivasculares. Dos aspectos del diseo del estudio deben ser considerados: (I) los puntos de tiempo apropiados para medir los efectos de la infeccin OV en la vasculatura, y (II) medidas informativas de la infeccin y la vascularizacin. El punto de tiempo despus del tratamiento en el que se cuantifica la

infeccin podra afectar o no se observan los efectos antivasculares de VO. Los estudios han demostrado efectos antivasculares inmediatos despus de la administracin OV [ 26,28 ] , y datos clnicos han demostrado efectos antivasculares rpidos, tales como una disminucin en los niveles de VEGF, ya en 1 h de tratamiento post- OV [ 39 ] . En los casos en que la angiognesis se mide en un punto ms adelante en relacin con el momento de mxima respuesta antitumoral, la ausencia de una respuesta antiangiognica o un aparente aumento de la angiognesis puede llevar a los investigadores a pasar por alto el potencial antivascular de su virus. En segundo lugar, la IHC para los marcadores endoteliales proporciona un " tiro rpido " de dos dimensiones de la estructura de la vasculatura del tumor sin proporcionar informacin funcional. Sobre la base de los mtodos publicados para la deteccin de la angiognesis en los tumores slidos , la tincin de CD31 o CD34 puede ser ms informativa cuando se combina con otras manchas , tales como anti - Ki - 67 o una actina de msculo liso [ 88 ] . Para obtener informacin ms funcional, podra ser empleado un medidor de la perfusin dentro de todo el tumor, como se hizo por Breitbach et al. [28]. Otra opcin es utilizar la tomografa computarizada de perfusin de primer paso, un enfoque no invasivo novedoso para la cuantificacin de la perfusin tisular que monitorea los cambios en la perfusin durante el curso del tratamiento [89]. Adems del tiempo y los mtodos de evaluacin de los efectos VO en la vasculatura del tumor, las diferencias inherentes en los modelos, tales como su dependencia de la vascularizacin, tambin podran afectar si se observa que un virus dado posee propiedades antivasculares. Es importante destacar que dentro de las especies virales, las diferencias en la capsula viral pueden afectar a las propiedades antivasculares de un OV. Mientras los investigadores se esfuerzan por mejorar los efectos antivasculares de VO, ya sea a travs de armar gentica o terapia combinada, que sera prudente para trabajar con virus que son inherentemente antivascular (por ejemplo, los adenovirus con expresin troncal de E1A a diferencia de los mutantes E1A). La secuencia optima. el momento de la terapia de combinacin y los aspectos bsicos para establecer que regmenes son sinrgicos todava no se ha determinado. Idealmente, los programas de dosificacin deben estar diseados con una comprensin de los mecanismos de accin para cada terapia individual. Por desgracia, estas acciones no siempre son totalmente entendidas, especialmente para los VO, que suelen tener mltiples, complejos mecanismos antitumorales. Sern necesarios estudios clnicos que comparan mltiples combinaciones y secuencias. Sin embargo, parece probable que los frmacos que mejoran la entrega y mejorar la absorcin del virus por los tumores sern ms eficaces cuando se administran antes de la viroterapia oncoltica, mientras que el tiempo ideal de agentes con propiedades inmunomoduladoras depender del efecto del agente especfico en la respuesta antiviral y la respuesta inmune antitumoral inducida por el virus. La investigacin intensiva sobre el papel de VO como agentes antivasculares ha dado lugar a varias conclusiones importantes. En general, VO tienen una serie de ventajas distintivas sobre otros agentes antivasculares: (I) especificidad para mltiples componentes tumorales (tumor y EC), (II) la lisis tumoral directa; (III) independientes de los mecanismos de accin de VEGF, que son particularmente tiles porque los agentes antiangiognicos tradicionales (por ejemplo, bevacizumab) a menudo van mal en las poblaciones de clulas tumorales heterogneas con patrones fluctuantes de la expresin gnica angiognica; (IV) la capacidad de transportar y entregar las molculas especficamente antiangiognicos, y (V) la induccin de una respuesta inmune antitumoral. A medida que desarrollamos una comprensin ms amplia de la interaccin de VO con la vasculatura tumoral, seremos capaces de combinarlos estratgicamente con agentes antivasculares para optimizar sus propiedades perjudiciales sinrgicas, antiangiognica y vascular.

Figura 3 Propiedades antivasculares de virus oncolticos y terapias antivasculares. Varios virus oncolticos (VO) tienen propiedades antivasculares inherentes que se pueden clasificar como los que interrumpen a nivel antiangiognico o a nivel vascular. La infeccin directa de las clulas endoteliales (EC) por el virus de la estomatitis vesicular (VSV) conduce a una cascada de respuestas inflamatorias, formacin de cogulo, prdida de la perfusin, y la posterior muerte de clulas tumorales isqumica [26]. El virus vaccinia (VV) tambin infecta a tumores de ECs resultando en una prdida de la perfusin del tumor (el mecanismo exacto es desconocido) [26]. Adenovirus ejerce un efecto antiangiognico directo a travs de su protena E1A (ver recuadro) [22,23]. E1A interacciona con el p300 celular, un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que es cofactor de la transcripcin, para inhibir la transcripcin de VEGF resultando en una disminucin de la migracin de ECs, la proliferacin y la supervivencia. VO pueden combinarse eficazmente con terapias antiangiognicas tradicionales mediante el aprovechamiento de sus propiedades de normalizacin vasculares. Durante viroterapia oncoltica, los vasos con fugas permiten a las clulas inmunes infiltrarse fcilmente en lechos tumorales infectados por virus circulantes y, potencialmente, detener la progresin de la infeccin. Uniendo Arg - Gly Asp cclicos (cRGD) o terapias anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab) contra la CE puede dar lugar a la normalizacin vascular que conduce a la disminucin de la infiltracin de clulas inmunes y la produccin de citoquinas antivirales [70], as como el aumento de los ttulos de virus en los tumores [67,70], como se ha hecho con adenovirus y virus del herpes simple (VHS) .