Aceast lucrare reprezint o traducere actualizat i mbuntit a lucrrii Reactive Oxygen Species, Oxidative Damage, and Antioxidative Defense

ec!anism in plants under Stressful "onditions# ,$allavi S!arma et al%, &inda'i $ublis!ing "orporation, (urnal of )otany, volume *+,*, din care este folosit cu precdere informaia legat de antioxidanii enzimatici%

Efectele stresului biotic la plante asupra enzimelor antioxidante

Masterand: Neculai (Galani) Daniela

Cuprins
Cuprins................................................................................................................... 2 ntroducere............................................................................................................. 2 !specte "enerale pri#ind antioxidan$ii..................................................................% !ntioxidan$i enzimatici........................................................................................... & %.2 Catalaza........................................................................................................ ' %.% Guaiacol peroxidaza...................................................................................... ' %.( Enzimele ciclului !cid ascorbic )Glutation ....................................................' !cti#itatea enzimelor antioxidante *n condi$ii de stres biotic.................................+ ,iblio"rafie........................................................................................................... 1-

Introducere
Factorii de stres biotic determin la nivelul unei plante o cascad de evenimente, care ncepe cu perceperea stresului de ctre recetorii specializai si sfrete cu expresia unei baterii de gene int. Stresul biotic produce efecte asupra metabolismului primar i asupra metabolismului secundar, reflectndu-se n modificarea activitii unor enzime, avnd n vedere c toate procesele chimice sunt catalizate de enzime. Rspunsul plantelor la stresul abiotic este determinat de mai mul i factori, cum sunt genotipul !i stadiul lor de dezvoltare, ca !i durata, intensitatea, periodicitatea !i efectele aditive"sinergice ale stresurilor multiple. La plante, stresul declaneaz o gam variat de rspunsuri, de la modificarea expresiei genelor i a metabolismului celular la schimbri
2

ale ratei de cretere i ale produciei. Planta moare atunci cnd nu poate face fa stresurilor foarte severe#. Speciile reactive de oxigen sunt un produs normal la metabolismului celular al plantelor. $ varietate de stresuri din mediul ncon%urtor duc la producerea n exces a R$S, care cauzeaz daune oxidative i ntr-un final pot cauza moartea celular. &e lng activitatea lor distructiv, ele sunt de asemenea descrise ca mesageri secundari n diverse procese celulare, inclusiv n creterea toleranei plantelor la stresul biotic i abiotic. 'n funcie de echilibrul delicat dintre producerea i eliminarea de R$S, acestea pot servi ca molecule semnal sau pot cauza daune oxidative. (liminarea eficient a R$S produse datorit stresului plantei, necesit intervenia unor antioxidani prezeni n esuturi, att nonenzimatici ct i enzimatici. )ele mai comune specii reactive de oxigen sunt * +$, , $, --, .,$,, -$.. R$S sunt produse att n celule supuse la stres ct i n cele care nu sunt supuse nici unui factor de stres, n cteva locaii* n cloroplast, mitocondrii, plasmalema/plasma membranes0, peroxizom, apoplast, reticulul endoplasmatic, i n pereii celulari. R$S se formeaz datorit unor scurgeri inveitabile de electroni ctre $,, din activitile de transport ale cloroplastului, mitocondriei, i membranelor plasmatice sau ca un produs secundar a unor cai metabolice localizate n diferite compartimente celulare. 'n continuare, lucrarea va detalia mecanismul de aprare din celule pentru eliminarea R$S produse n exces, cu a%utorul antioxidanilor nonenzimatici, punnd accentul ns, pe enzimele antioxidante.

Aspecte generale privind antioxidanii

1eoarece aceste specii de oxigen sunt foarte reactive, afectnd principalele componente celulare, plantele i-au creat mecanisme de eliminare a lor. olul principal !n aprarea de stresul oxidativ !l au enzimele antioxidante, superoxid dismutazele "#$%&, apoi ascorbat peroxidazele "'P(&, peroxidazele "P$%&, catalazele i moleculele antioxidante cu greutate molecular mic "acidul ascorbic, glutationul i compui fenolici&., &lantele posed un sistem complex de aprare mpotriva stresului oxidativ, compus din componente enzimatice i nonenzimatice de detoxifiere a R$S. 'n celulele plantelor, sistemele de producere ct i de detoxifiere a R$S se gsesc n diferite organite celulare, cum
1

http*""222.infoomg.ro",3#4"35"speciile-reactive-de-oxigen-reactive-ox)gen-species-ros

http*""222.infoomg.ro",3#4"35"speciile-reactive-de-oxigen-reactive-ox)gen-species-ros
%

sunt cloroplastul, mitocondria i peroxizomul. 'n condiii normale, metabolii ai oxigenului potenial toxici sunt generai n cantiti mici, i prin urmare exist o echilibrare ntre producia i reducerea/6uenching0 R$S. (chilibrul dintre producia i reducerea de R$S poate fi perturbat de diveri factori, ducnd la creterea rapid a nivelului R$S intracelular, ceea ce poate duce la daune oxidative lipidelor, proteinelor i acizilor nucleici. &entru a evita daunele oxidative, plantele superioare i mbuntesc sistemul natural de aprare antioxidativ. Antioxidanii neenzimatici 7ntioxidanii nonenzimatici includ principalele , tampoane celulare reductoare * ascorbat/7s70 i glutation/8-glutam9l-c9stein9l-gl9cine ,:S.0, dar i tocoferoli, carotenoizi i compui polifenolici. 7cetia interacioneaz cu numeroase componente celulare, i pe lng rolul lor de aprare i de cofactori enzimatici, aceti antioxidani influeneaz creterea i dezvoltarea plantelor, prin modularea proceselor de la mitoz i alungirea celulei, pn la mbtrnire i moarte celular.

2.1 Acidul ascorbic /7s70; este cel mai frecvent antioxidant cu greutate
molecular mic, care are un rol cheie n aprarea mpotriva stresului oxidativ cauzat de creterea nivelului de R$S. 7s7 este considerat un antioxidant foarte puternic datorit capacitii sale de a dona electroni n multe reacii enzimatice i neenzimatice. 7s7 a fost dovedit a %uca un rol important n cteva procese fiziologice la plante, inclusiv n cretere, difereniere i metabolism. )ea mai mare parte din acidul ascorbic, mai mult de <3=, este localizat n citoplasma, dar spre deosebire de ali antioxidani solubili, o mare parte este exportat ctre apoplast, unde este prezent n concentraii milimolare. 7cidul ascorbic apoplastic este considerat prima redut de aprare mpotriva oxidanilor externi potenial nocivi. $fer protecie membranei prin reacia direct cu $,--, .,$, i prin regenerarea >tocoferolului din radicalul tocoferoxil i prote%area activitii enzimelor care conim ioni metalici pentru tranziia protetic.

2.2 Glutationul ; glutationul tripeptidic /8-glutam9l-c9stein9l-gl9cine, :S.0 ; este

una dintre nonproteinele cu greutate molecular mic cele mai importante, %ucnd un rol important n aprarea intracelular mpotriva daunelor oxidative datorate R$S. 7 fost detectat n aproape toate componentele celulare cum ar fi citosolul, cloroplastul, reticulul endoplasmatic, vacuole, i mitocondrii. (chilibrul ntre :S. i forma sa oxidat :SS: este foarte important n meninerea strii redox a celulei. 1atorit capacitilor sale reductoare, :S. %oac un rol important n diverse proceze biologice, inclusiv cretere"diviziunea celular, reglementarea transportului sulfatului, transducia de semnal, con%ugare de metabolii, reglementare enzimatic, sinteza unor proteine i acizi nucleici, sinteza de fitochelatine pentru chelarea metalelor, detoxificare xenobioticelor, i expresia genelor care recepteaz stresul.

2.3 Tocoferolii />,?,8 i @0 reprezint un grup de antioxidani lipofilici implicai n

detoxifierea radicalilor liberi de oxigen, radicalilor peroxil lipidici i a +$ , . >- tocoferolul cu cei trei metil substitueni ai si, are cea mai mare activitate antioxidant dintre tocoferoli. Aocoferolii sunt sintetizai doar de organisme fotosintetice i sunt prezeni doar n prile verzi
(

ale plantei. Aocoferolii prote%eaz lipidele i alte componente ale membranei prin bariera fizic dar i reacionnd chimic cu $, n cloroplast, n acest fel prote%nd structura i funcionarea &SBB. Aocoferolii previn propagarea n lan din autooxidarea lipidelor fiind astfel o capcan eficient pentru radicalii liberi. 7cumularea de tocoferoli s-a dovedit a induce toleran la frig, la deficit de ap i la salinitate la diferite specii de plante.

2.4 Carotenoizii ; aparin de asemenea grupului de antioxidani lipofilici i sunt n

stare s detoxifice diferite forme de R$S. Sunt pigmeni organici ce se gsesc n cloroplastul i cromoplastul plantelor ,dar i n alte organisme fotosintetizatoare ca algele, unele bacterii i unele ciuperci. Ca plante, carotenoizii absorb lumina n regiunea dintre 533-DD3 nm din spectrul vizibil i trec energia capturat ctre )hl. )a antioxidant, ei neutralizeaz +$, pentru a preveni daunele oxidative i pentru a prote%a aparatul fotosintetic. )arotenoizii pot fi i precursori ai moleculelor semnal care influeneaz dezvoltarea plantelor i rspunsul la stresul biotic i abiotic.

2.5 Compuii fenolici ; sunt diveri metabolii secundari /flavonoizi, tanini,

lignina etc0 care posed proprieti antioxidante. Sunt gsii n abunden n esuturile plantelor. S-au dovedit a depi antioxidani cunoscui ca acidul ascorbic i >-tocoferolul n anumite teste n vitro datorit capacitii foarte mari de a dona electroni sau atomi de hidrogen. (xist de asemnea dovezi ale inducerii metabolice de fenoli de ctre plante ca rspuns la stresuri multiple.

Antioxidani enzimatici
)omponentele enzimatice ale sistemului de aprare antioxidativ sunt superoxid dismutaza/S$10, catalaza/)7A0, guaiacol peroxidaza/:&E0, i enzime ale ciclului acid ascorbic-glutation/7s7- :S.0, ca* ascorbat peroxidaza/7&E0, monodehidroascorbat reductaza/F1.7R0, dehidroascorbat reductaza/1.7R0 i glutation reductaza/:R0. 7ceste enzime funcioneaz n diferite compartimente subcelulare i rspund corespunztor atunci cnd celulele sunt expuse la stres oxidativ.

3.1 Superoxid dismutaza%

Superoxid dismutaza %oac un rol important n aprarea mpotriva stresului oxidativ la toate organismele aerobe. (nzima S$1 aparine grupului de metaloenzime i catalizeaz dismutarea $, n $, i .,$,. (ste prezent n ma%oritatea compartimentelor celulare care genereaz oxigen activat . Ca plante s-au gsit 4 izoenzime ale S$1 * )u"Gn-S$1, Fn-S$1, !i Fe-S$1./#HI,#HH0. FnS$1 se gse!te n mitocondrie, n timp ce FeS$1 este localizat n cloroplast. )u"Gn-S$1 este prezent n trei izoforme, care pot fi gsite n citosol, cloroplast, peroxizom !i mitocondrie. 7ctivitatea S$1 s-a observat a fi n cre!tere n plantele expuse la
&

diferite forme de stres, incluznd seceta !i toxicitate metalic. 1e asemenea cre!terea activit ii S$1 poate fi corelat cu cre!terea toleran ei plantelor la stresul biotic !i abiotic.

3.2 Catalaza
1intre enzimele antioxidante, catalaza /)7A0, a fost prima enzim descoperit !i caracterizat. (ste o enzim con intoare de Fe omniprezent, care catalizeaz dismutarea a dou molecule de .,$, n .,$ !i $,. 7re o mare specificitate pentru .,$,, dar activitate sczut n ceea ce prive!te peroxizii organici. &lantele con in mai multe tipuri de enzime reductoare de .,$, , dar catalazele sunt unice deoarece nu au nevoie de echivaleni reductori celulari. &eroxizomii sunt componentele celulare unde se produce cel mai mult .,$,. )atalaza elimin .,$, produs n aceste organite n timpul oxidrii fotorespiratorii, ?oxidrii acizilor gra!i, !i a altor enzime ca E$1 cuplat cu S$1. 1e!i se poate ntlni catalaz !i n citosol, cloroplast, !i mitocondrii, prezen a acesteia aici este mai pu in probabil. 1e exemplu, n plantele transgenice de tutun, avnd #3= din genotipul slbatic, activitatea catalazei ne arat acumulare de :SS:/glutation oxidat0 !i o descre!tere de 5 ori a 7s7, indicnd faptul c enzima )7A este vital pentru men inerea echilibrului redox n timpul stresului oxidativ.

3.3 Guaiacol peroxidaza

:uaiacol peroxidaza /:&E0, o protein ce con ine gruparea hem, oxideaz donori aromatici de electroni, ca guaiacolul !i piragalolul, cu consum de . ,$,. (ste foarte des ntlnit la animale, plante !i microbi. :&E este asociat cu multe procese biosintetice, ca lignificarea pere ilor celulari, degradarea B77, biosinteza etilenei, vindecarea rnilor, !i aprarea mpotriva stresului biotic !i abiotic. :&E au fost asimilate ca Jenzime de stresK .

3.4

nzimele ciclului Acid ascorbic !Glutation

Shimbarea raporturilor 7cid ascorbic la 1.7 !i :S./glutation0 la :SS:/glutation oxidat0 este vital pentru ca celulele s perceap stresul oxidativ !i s rspund corespunztor. )iclul 7cid ascorbic ;:lutation implic oxidri !i reduceri succesive ale 7s7, :S. !i L71&. catalizat de enzimele 7&E, F1.7R, 1.7R !i :R. 7cest ciclu este prezent n cel pu in patru loca ii subcelulare, incluznd citosolul, cloroplastul, mitocondria !i peroxizomul. )iclul 7s7 ; :S. %oac un rol important n combaterea stresului oxidativ indus de stresul biotic !i abiotic.

3.4.1 Ascorbat peroxidaza /7&E0 este o component important a

ciclului 7s7 ; :S., !i %oac un rol esen ial n inerea sub control a nivelului intracelular a R$S. 7&E folosete dou molecule de 7cid ascorbic pentru a transforma . ,$, n ap, genernd n acelai timp dou molecule de F1.7. Ca plantele superioare au fost gsite cinci izoforme de 7&E n diferite localizri subcelulare* n citosol, stroma, tilacoid, mitocondrie i peroxizom. 7&E gsit n organitele celulare reduce .,$, produs n organite, n timp ce 7&E din citosol elimin .,$, din citosol, apoplast !i care difuzeaz din organite.

'

3.4.2 Monodehidroascorbat reductaza. Radicalul F1.7 rezultat

n urma reaciei de catalizare a 7&E are o durat de via foarte scurt, i dac nu este rapid redus, se descompune n 7cid ascorbic i 1.7. Fonodehidroascorbat reductaza/F1.7R0 este o enzim ce catalizeaz regenerarea 7cidului ascorbic din radicalul F1.7, folosind L71/&0. ca donor de electroni. (ste singura enzim cunoscut care folosete un radical organic/F170 ca baz"substrat, i este de asemenea n stare s reduc radicali de fenoxil, care sunt generai de peroxidaza din hrean, cu . ,$,. Bzoenzimele F1.7R s-au gsit n cteva componente celulare cum ar fi cloroplastul, citosolul i mitocondria i peroxizomii. 'n clorplast, F1.7R ar putea avea dou funcii fiziologice* regenerarea 7cidului ascorbic din F1.7 i medierea fotoreducerii dioxigenului n $, -- atunci cnd este absent F1.7 ca substrat. )aracterizarea polipeptidelor membranare din peroxizomii frunzelor de mazre, a artat c F1.7R poate fi implicat i n generarea de $,--. Fai multe studii au demonstrat creterea activitii F1.7R n plantele supuse stresului biotic i abiotic. Supraexpresia genei F1.7R din 7rabidopsis thaliana la tutun, arat o cretere a toleranei la stresul provocat de mediul srat i glicol polietilen. Supraexpresia F1.7R cloroplastic de la Solanum l9copersicum n 7rabidopsis i-a crescut tolerana la stresuri de tipul temperaturii extreme i cel mediat de metil viologen.

3.4.3

ehidroascorbat !eductaza. 1.7R catalizeaz reducerea

1.7 n 7cid ascorbic folosind :S. ca substrat de reducere i astfel %oac un rol important n meninerea 7cidului ascorbic n forma sa redus. 1ei exist posibilitatea regenerrii enzimatice i neenzimatice a 7scorbatului direct din F1.7, ntotdeauna oxidarea 7scorbatului n frunze i alte esuturi produce ceva 1.7. 7cesta, o substan chimic cu via scurt, poate fi hidrolizat ireversibil n ,,4-acid diMetogulonic sau reciclat n 7cid ascorbic de ctre 1.7R. Supraexpresia 1.7R n frunzele de tutun, porumb i cartof s-a dovedit a crete coninutul de 7cid ascorbic, sugernd c 1.7R %oac un rol important n determinarea cantitii de 7cid ascorbic. 1.7R este o enzim ce se gsete n abunden n seminele uscate, rdcini i mugurii verzi precum i n cei etiolai. Stresurile abiotice ca seceta, toxicitatea metalic i ngheul, au crescut cantitatea de 1.7R n plante.

3.4.4 "lutation !eductaza/:R0. 7tunci cnd se comport ca un

antioxidant participnd la ciclurile de oxidare-reducere enzimatice i neenzimatice, :S. este oxidat n :SS:. 'n ciclul 7scorbat-:lutation, :S. este oxidat ntr-o reacie catalizat de 1.7R. :R, fiind o enzim dependent de L71/&0., catazileaz reducerea :SS: n :S., i prin aceasta menine un raport celular mare al :S.":SS:. 1ei se gasete att n cloroplast, ct i n citosol, mitocondrii i peroxizomi, cea mai mare parte a activitii :R n esuturile fotosintetice se datoreaz izoformelor specifice cloroplastului. 'n cloroplast, :S. i :R sunt implicate n detoxifierea .,$, generate de reacia Fehler. Fai muli autori au observat creterea activitii :R n condiii de stres de mediu. &astori i Arippi au observat o corelaie ntre rezistena la stresul oidativ cauzat de ierbicidul para6uat sau de .,$, ar putea stimula sinteza de novo a :R. Supraexpresia :R n L. Aabacum i plante &opulus a dus la creterea nivelului de 7cid ascorbic foliar, i a mrit toleran a la stresul oxidativ.
.

Fai multe studii au demonstrat c supraexpresia unei combinaii de enzime antioxidante n plantele transgenice are efecte sinergice asupra toleranei la stres oxidativ a plantelor.

Activitatea enzimelor antioxidante #n condiii de stres biotic

Nnul dintre primele rspunsuri celulare ce urmeaz dup recunoaterea cu succes a patogenilor este arderea oxidativ cu producere de R$S. Recunoaterea unei varieti de patogeni duce la generarea de $, , sau produsul de dismutaie al acestuia .,$, n apoplast. Reglementarea diferit a enzimelor antioxidante, n parte mediat de S7/acidul salicilic0, poate contribui la creterea producerii R$S i activarea aprrii mpotriva infeciei. 1e exemplu* Ca plantele de tutun hiper receptive la patogeni, s-a observat o reducere a activitii )7A i 7&E. )reteri semnificative ale )7A i &$1/peroxidaza0 au fost observate la rndurile de in afectat de finare. )reterea activitii &$1 a fost mult mai pronunat la plantele tolerante dect la cele susceptibile. )reterea activitii &$1, )7A, 7&E i S$1 a fost observat n frunzele de Oicia faba infectate cu virusul mozaicul galben al fasolei, indicnd faptul c sistemele de
+

eliminare a R$S, au un rol important n a ine sub control R$S generate ca rspuns la patogeni. 7ctivitatea peroxidazei a crescut pe parcursul evoluiei bolii cauzate de (r2inia 7m9lovora, constatndu-se producerea unor substane implicate n rspunsul defensiv/flavonoizi, lignine0 /PecM i al, ,33,04Q :rasMova i al./,3350 au constatat la cartof dou mecanisme ale activrii peroxidazei n timpul patogenezei. Nnul l-a constituit sinteza de novo a enzimei/caracteristic soiului susceptibil la patogen0, iar cel de-al doilea, caracteristic soiului rezistent, a indus nu doar sinteza enzimei ci i activarea moleculelor enzimatice preexistente. Aotodat, infecia bacterian i exoplizaharidele secretate de patogen au indus modificarea &$1 intra i extracelulare la soiul susceptibil, fr ns a se constata modificri la soiul rezistent5. S-a nregistrat de asemenea o cretere seminficativ a activitii peroxidazei, ascorbat peroxidazei, catalazei i superoxid dismutazei, ca rspuns la infecia orezul cu ciuperca Rhizoctonia solani /&arandhiharan i al., ,3340. &eroxidazele solubile din frunze/&$E0, folosesc peroxidul de hidrogen pentru a oxida fenolii i alte substraturi, contribuind la rspunsul de aprare /$stengard i al., ,3330D. Suno2ar i al. /,33D0 studiind rolul ascorbat peroxidazei pe tutunul transgenic folosind gena )7&$7# de la )apsicum anuum au constatat nivele ridicate ale expresiei genei n planteletransgenice, cu o dublare a activitii totale a peroxidazeiI. Ra9al i Geller /,3350 precizeaz c intensificarea activitii peroxidazei i chitinazei s-a corelat cu restricia colonizrii cu bacteria (r2inia am9lovora la portaltoiul de mr F,IH. &at9MovsMi i NrbaneM /,33D0, comparnd coninutul de . ,$, i acid ascorbic, precum i activitile peroxidazei i catalazei n frunzele mai puin susceptibile/ cv. &erMoz0i mai susceptibile /cv. )orindo0, dup infecia cu R. )inerea, au nregistrat o cretere n fracia citosolic a activitii peroxidazei, dup 5S de ore de la infecie n ambele cultivaruri, dar mai evident la soiul &erMoz. 7ctivitatea peroxidazei la nivelul fraciei apoplastice a nregistrat o cretere mai timpurie la cv. &erMoz dect la cv. )orindo.

-iziologia Stresului biotic la plante, (lena 1elian, (d. )artea Nniversitar, ,33I, p.#H<
dem 1. dem 1.

&

'

-iziologia Stresului biotic la plante, (lena 1elian, (d. )artea Nniversitar, ,33I, p.#S3

dem (

&rin aceste studii s-a demonstrat c fortificarea peretelui celular mediat de peroxidaza apoplastic reprezint un factor cheie responsabil pentru rezistena acestor soiuri de tomate, la infecia cu R. cinereaS. 7ctivitatea enzimelor antioxidante este n cretere n condiii de stres biotic conform cercetrilor menionate mai sus, acest fapt artnd importana detectrii i cuantificrii activitii acestor enzime pentru pentru cunoaterea mai aprofundat a fiziopatologiei plantelor i crearea soluiilor i tehnicilor de protecie a plantelor n condiii de cultur.

$ibliogra%ie
#. -iziologia Stresului biotic la plante, (lena 1elian, (d. )artea Nniversitar, ,33IQ ,. http*""222.infoomg.ro",3#4"35"speciile-reactive-de-oxigen-reactive-ox9gen-speciesros" 4. Reactive Oxygen Species, Oxidative Damage, and Antioxidative Defense ec!anism in plants under Stressful "onditions ,&allavi Sharma et al., .inda2i &ublishing )orporation, Turnal of Rotan9, volume ,3#,, 7rticle B1 ,#H34HQ

dem (.

1-